骨植入物
阅读：232发布：2020-05-12
专利汇可以提供骨植入物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种包含多孔体和厚度为10μm-200μm的膜的 骨 植入物 ，所述多孔体包含粒度为至少500μm的 生物 活性玻璃的颗粒，其中所述生物活性玻璃的组成为45-59重量％的SiO2、18-25重量％的Na2O、17-25重量％的CaO和0.1-6重量％的P2O5，所述膜由 生物相容性 聚合物 制成并且至少部分地布置在多孔体周围。，下面是骨植入物专利的具体信息内容。
1.一种骨植入物，其包括
-多孔体，其包含粒度为至少500μm的生物活性玻璃的颗粒，其中生物活性玻璃的组成包含45-59重量％的SiO2、18-25重量％的Na2O、17-25重量％的CaO和0.1-6重量％的P2O5，和-厚度为10μm-200μm的膜，其由生物相容的聚合物制成并且至少部分地布置在多孔体周围。
2.根据权利要求1所述的骨植入物，其中所述膜围绕多孔体进行布置，以使得植入物植入骨中时膜覆盖多孔体与肌肉、筋膜或骨膜接触的部分。
3.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述聚合物选自聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯-co-乙醇酸交酯)、聚己内酯、天然胶原聚合物及其与聚乙二醇的混合物。
4.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中生物活性玻璃的颗粒的粒度为500-
3150μm。
5.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述膜的厚度为100-200μm。
6.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述膜包括生物活性玻璃。
7.根据权利要求6所述的骨植入物，其中所述膜的生物活性玻璃为平均粒度小于45μm的粉末形式。
8.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述生物活性玻璃的组成为45-54重量％的SiO2、22-25重量％的Na2O、19-25重量％的CaO和3.5-6重量％的P2O5。
9.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述生物活性玻璃的组成为53重量％的SiO2、23重量％的Na2O、20重量％的CaO和4重量％的P2O5。
10.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述多孔体为盘的形式，并且所述膜围绕盘的侧面布置。
11.根据前述权利要求任一项所述的骨植入物，其中所述多孔体为烧结的生物活性玻璃颗粒的形式。
12.根据权利要求1-9任一项所述的骨植入物，其中所述多孔体是由生物可降解聚合物保持在一起的生物活性玻璃颗粒的形式。
13.根据权利要求12所述的骨植入物，其中所述可生物降解的聚合物选自聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯-co乙醇酸交酯)、聚己内酯、聚乙二醇、胶原及其混合物。
14.一种制造权利要求1-13任一项所述的骨植入物的方法，包括形成包含生物活性玻璃的颗粒的多孔体，将由生物相容性聚合物制成的膜至少部分地布置在多孔体周围，并将所述组合加热至所述生物相容性聚合物的玻璃转化温度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用烧结与聚合物结合材料之一以及模具制造包含生物活性玻璃的颗粒的多孔体。
骨植入物
技术领域
[0001] 本发明涉及骨植入物。更具体地，本发明涉及用于替换骨的一个完整部分的骨植入物。
背景技术
[0002] 大段骨缺损和不连接的治疗是具有挑战性的问题，通常需要移植自体骨。尽管自体移植骨是最常移植的组织之一，但它具有诸如供应有限的缺点，特别是对于儿童和老年患者。骨的收获还导致供体部位疼痛并且可能导致其他问题，例如收获部位的感染和收获部位的骨再形成问题。有多种骨替代物可供选择，包括合成材料，如生物活性玻璃(BAG)和基于硫酸钙和磷酸钙的材料。这些替代物在成骨、骨促进(osteopromoting)和骨引导(osteoconducting)性质以及它们影响骨形成和生长的能力方面不同。
[0003] 骨干骨缺损中骨的功能恢复和再生仍然是一个主要的临床挑战。2000年，Masquelet及其同事介绍了一种治疗骨干骨缺损的两阶段技术，该技术将诱导的膜技术与自体松质骨移植技术的使用相结合。现在，这被称为Masquelet技术。
[0004] 在Masquelet技术的第一个程序中，将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)间隔物插入骨缺损中。插入后，随后在间隔物周围形成假滑膜。在第二次手术中，移除间隔物并使用自体松质骨移植物重建缺损。尽管已知诱导的膜增加了例如血管内皮生长因子(VEGF)的分泌，已观察到诱导能力随时间不断减少。此外，该技术虽然是骨再形成的一种有效技术，但需要对患者进行两次手术。
[0005] 在骨组织工程领域中，可降解的、生物相容的复合材料，其由合成聚合物例如聚丙交酯(polylactide,PLA)、聚乙醇酸交酯(polyglycolid acid,PGA)或聚(丙交酯-co乙醇酸交酯)(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)，或由作为动物来源聚合物的胶原制成，与磷酸钙陶瓷或生物活性玻璃(BAG)的组合的研究越来越多。
[0006] 一些BAG适合用作骨替代物，因为它们具有骨引导和骨刺激性质。这些特性依赖于玻璃表面的溶解过程，该过程在植入后立即开始。反应开始于快速的钠氢离子交换，随后是二氧化硅的溶解和再聚合，然后是磷酸钙在玻璃表面成核并结晶成羟基磷灰石。表面反应导致pH升高和渗透压增加，这解释了观察到的抗菌性能，例如对于BAG-S53P4(其组成将在下文指出)。
[0007] 聚(α-羟基酯)的降解产物是酸性的，随后在植入的材料附近pH降低。酸性或其他类型的降解产物可在周围组织中引起炎症反应。然而，许多可降解聚合物缺乏成骨和血管生成活性。
[0008] 包括来自预先存在的血管的血管生长在内的血管生成是骨形成的先决条件。这是一个复杂现象，涉及氧和几种细胞类型，例如成熟内皮细胞和内皮细胞祖细胞、白细胞和血小板，以及生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)，其是一种多任务细胞因子，已知在血液形成过程中具有重要作用。
[0009] 文献US2014/0277578提出了一种用于在承重应用中修复缺陷的可生物降解的复合支架。它包括由聚合物层包围的通常共同排列的(co-aligned)可生物降解的玻璃纤维的芯。纤维可以用粒度为40-425μm的可生物降解的玻璃颗粒代替。
[0010] 定义
[0011] 如果没有另外定义，则本申请中使用的术语是1986年生物材料共识会议上商定的术语，见Williams,DF(编辑):Definitions in biomaterials:Proceedings of a consensus conference of the European Society for Biomaterials,Chester,英格兰.三月3-5日,1986。Elsevier,Amsterdam 1987,以及Williams DF,Black J,Doherty
PJ.Second consensus conference on definitions in biomaterials.In:Doherty PJ,Williams RL,Williams DF,Lee AJ(编辑).Biomaterial-Tissue Interfaces.Amsterdam:
Elsevier,1992。
PJ.Second consensus conference on definitions in biomaterials.In:Doherty PJ,Williams RL,Williams DF,Lee AJ(编辑).Biomaterial-Tissue Interfaces.Amsterdam:
Elsevier,1992。
[0013] 在该上下文中，术语“可吸收的”是指，当插入哺乳动物体内以及与生理环境接触时，材料在长时间植入时被瓦解，即分解。特别地，术语“可吸收玻璃”是指，当与生理环境接触时在其表面上不形成羟基-碳酸盐磷灰石层的富含二氧化硅的玻璃。可吸收的玻璃通过吸收从体内消失，并且在其分解/溶解过程中不会显著激活细胞或细胞生长。
[0014] “生物材料”是指旨在与生物系统通过界面接合(interface)以评估、治疗、增强或替换身体的任何组织、器官或功能的材料。“生物相容性”是指，在医疗装置中使用的材料能够通过在特定位置引起适当的宿主反应而安全且充分地执行的能力。“吸收”是指生物材料的分解。“复合材料”是指包含至少两种不同成分的材料，例如聚合物和陶瓷材料，例如玻璃。
[0015] 术语“颗粒”(particle)是指具有不规则形状并具有一定尺寸的实体。颗粒与纤维不同，其中纤维被定义为具有长度和直径，直径是纤维横向于其长度的最大尺寸。因此，纤维的纵向尺寸至少是纤维直径的约10倍。术语“粒度”是指颗粒的最大尺寸。“颗粒体”(granules)是指具有任何规则或不规则形状的颗粒。
[0017] 发明目的和概述
[0018] 本发明的一个目的是至少部分地解决上述问题。例如，本发明的目的在于提供一种不需要使用自体骨的骨植入物材料，从而避免收获骨、与骨收获相关的并发症以及术后疼痛的问题。另一个目的是提供一种不需要如目前已知的Masquelet技术所需的第二次手术的材料。实际上，目的是提供一种下述的骨植入物材料：其使用容易且安全，仅需要一次外科手术并且对患者造成较少的疼痛和不适，同时还降低了风险，例如，与手术操作有关的术后感染并发症及其他由抗菌作用产生的并发症。
[0019] 本发明涉及一种骨植入物，其包含
[0020] -包含粒度为至少500μm的生物活性玻璃的颗粒的多孔体，其中所述生物活性玻璃的组成包含45-59重量％的SiO2、18-25重量％的Na2O、17-25重量％的CaO和0.1-6重量％的P2O5，以及
[0021] -厚度为10μm-200μm的膜，其由生物相容性聚合物制成并且至少部分地围绕多孔体布置。
[0022] 本发明还涉及如上所述的骨植入物的制造方法，包括形成包含生物活性玻璃的颗粒的多孔体，将由生物相容性聚合物制成的膜至少部分地布置在多孔体周围并将所述组合加热至生物相容性聚合物的玻璃转化温度。附图说明
[0023] 图1示意性地示出了植入骨中时一个实施方案的骨植入物。
[0024] 图2A-2C示意性地示出了根据另一实施方案的骨植入物。
[0025] 图3A-3B示意性地示出了根据一个实施方案的骨植入物的实际使用。
[0026] 图4A-4B示意性地示出了根据另一实施方案的骨植入物的另一实际使用。
[0027] 图5示出了根据一个实施方案的骨植入物的进一步实际使用。
具体实施方式
[0028] 本发明涉及一种骨植入物，其包含
[0029] -包含粒度为至少500μm的生物活性玻璃的颗粒的多孔体，其中生物活性玻璃的组成包含45-59重量％的SiO2、18-25重量％的Na2O、17-25重量％的CaO和0.1-6重量％的P2O5，以及
[0030] -厚度为10μm-200μm的膜，其由生物相容性聚合物制成并且至少部分地围绕多孔体布置。
[0031] 因此，本发明提供了一种骨植入物，其结合了生物活性玻璃和聚合物膜。具有低膜厚度(低于200μm)的聚合物膜和高粒度(高于500μm)的组合导致协同效应。实际上，聚合物膜足够薄以允许足够快速的吸收和随后的组织向内生长。对于使用本发明植入物的大段缺损，需要大颗粒。实际上，小颗粒具有太高的反应性并且有刺激周围组织的风险，因此颗粒需要相当大。根据一个实施方案，至少大部分颗粒的粒度大于1000μm(1mm)。例如，超过70、80、90或95重量％的颗粒总量具有高于1000μm的粒度。在本申请中，大段缺损是指尺寸为
10cc(立方厘米)或更大的缺损。该缺损可以例如具有20cc或更大的尺寸，或甚至更大。
10cc(立方厘米)或更大的缺损。该缺损可以例如具有20cc或更大的尺寸，或甚至更大。
[0032] 骨植入物特别适合以与Masquelet技术中的材料类似地使用。实际上，BAG本身产生一定量的阳性刺激，这是形成假滑膜所必需的，并且这种效果通过聚合物材料进一步增强。因此选择BAG和聚合物材料，使得当植入骨植入物时它们都对假滑膜的形成都有影响。骨植入物用于植入骨缺损中，其中骨缺损可以由事故、手术引起，或者它可以是在受试者生长期间形成的骨缺损。实际上，骨缺损可能是由例如严重事故引起的，其中骨的一部分被压碎而必须被移除，或者归因于需要移除一部分骨的诸如癌症的疾病。
[0033] 在诱导的膜Masquelet技术中，第二次手术通常在四到八周之间进行。诱导的膜具有促进骨生成的作用，然而，其随着时间的推移似乎会降低。据推测，进行第二阶段手术的最佳时间可能在植入异物后六周内。根据本发明的结果(见下文实验部分)，PMMA对VEGF表达的诱导能力似乎在8周时是最低的，这是进行大多数手术的时间。因此，本发明的骨植入物提供的材料可以以与Masquelet技术中传统使用的方式相同的方式使用，但不需要第二次手术。这显著改善了最终结果，因为由于不需要第二次手术而基本上简单地避免了基本一半的感染和伤口并发症的风险。此外，由于BAG通常具有抗菌性质，因此降低了甚至第一次手术即植入骨植入物后的感染风险。因此，总体成本显著降低并且可以认为增加了患者满意度。
[0034] 实际上，通过在研究中使用可降解聚合物聚(D,L-丙交酯-co-乙醇酸交酯)(PLGA)涂覆BAG(如下文实验部分所述)，，目的是延迟BAG与周围组织的反应直到形成诱导的膜，从而防止BAG的吸收。观察到聚合物被吸收，并且剩下的是围绕BAG的诱导的膜，在来自诱导的膜的生长因子分泌最高时引发BAG的有利反应。这也意味着Masquelet开发的两阶段手术技术现在被简化为单阶段手术，如上所述。
[0036] 由BAG制成的多孔体是多孔的。通过微计算机断层扫描测量，孔隙率可以是例如10-90％或10-70％。该方法描述于文章Quantitative characterization of porous
commercial and experimental bone graft substitutes with microcomputed
tomography, A,Moritz N,Turco G,Paoletti S,Aro HT,J Biomed
Mater Res B Appl Biomater.2013Nov；101(8):1538-48.doi:10.1002/jbm.b.32975。BAG的典型孔隙率为约24-36％并且孔隙率在这里是指多孔体不是完全的实体，而是体液可以进入多孔体的核心。因此，多孔体具有互连的多孔性。这增强了植入物孔内新骨的形成和血管化。多孔体的孔隙率可以是例如从10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80或
85％至15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85或90％。
commercial and experimental bone graft substitutes with microcomputed
tomography, A,Moritz N,Turco G,Paoletti S,Aro HT,J Biomed
Mater Res B Appl Biomater.2013Nov；101(8):1538-48.doi:10.1002/jbm.b.32975。BAG的典型孔隙率为约24-36％并且孔隙率在这里是指多孔体不是完全的实体，而是体液可以进入多孔体的核心。因此，多孔体具有互连的多孔性。这增强了植入物孔内新骨的形成和血管化。多孔体的孔隙率可以是例如从10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80或
85％至15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85或90％。
[0037] 多孔体内BAG的粒度为至少500μm。通常，BAG的粒度为500-3150μm。例如，粒度可以是从500、550、600、650、700、800、850、900、1000、1200、1400、1500、1800、2000、2200、2500、2800或3000μm至550、600，650、700、800、850、900、1000、1200、1400、1500、1800、2000、2200、
2500、2800、3000或3150μm。
2500、2800、3000或3150μm。
[0038] 由BAG制成的多孔体至少部分地被聚合物膜覆盖。聚合物膜也可以完全覆盖多孔体。根据一个实施方案，当植入物植入骨中时，膜围绕多孔体布置，以覆盖多孔体与肌肉、筋膜或骨膜接触的部分。根据另一个实施方案，多孔体是盘的形式，并且膜围绕盘的侧面布置。例如，当植入物是具有一定厚度的盘、圆柱体或立方体的形式时，膜可以布置在盘、圆柱体或立方体的侧面上，并且可选地，部分地布置在盘的顶部和底部表面上。膜也可以仅部分地布置在侧面上或仅布置在顶部或底部表面中的一个上。植入物还可以具有楔形物或球体的一部分(例如球体的一半)的形式，其中一旦植入物就位，膜优选地至少布置在将与软组织接触的表面上。如果需要，本发明的植入物也可以以任何合适的形式制备。
[0039] 聚合物膜可以由任何合适的生物相容性聚合物制成。如上所讨论的，“合适的”在本文是指，当植入物植入骨缺损时能够诱导假滑膜形成的聚合物。实际上，使用的聚合物是生物相容的聚合物。它也优选是可生物降解的，并且可以例如是聚(α-酯)，例如聚丙交酯(PLA)，聚乙醇酸交酯(PGA)，聚(丙交酯-co-乙醇酸交酯)(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚二恶烷酮(PDS)，聚(三亚甲基碳酸酯)(PTMC)，聚羟基烷酸酯，例如聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)，聚(富马酸丙烯酸酯)，以及芳族和脂族聚酯的共聚物。它也可以是聚氨酯或聚(醚)，例如聚(乙二醇)(PEG)，聚(丙二醇)(PPG)。一些其它合适的聚合物是多元醇，例聚(乙烯醇)(PVA)，聚缩醛，聚碳酸酯，聚(酯酰胺)，聚(原酸酯)，聚酸酐，聚酰胺，聚(氨基酸)，聚(烷基氰基丙烯酸酯)，聚磷腈，聚磷酸酯，聚(天冬氨酸)，聚硅氧烷或蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、白蛋白或纤维蛋白。它还可以是多糖，例如纤维素、硫酸软骨素、甲壳质、壳聚糖、海藻酸或透明质酸。也可以使用上面列出的聚合物的各种混合物、复合物、共聚物和改性物(modifications)。
[0040] 根据一个实施方案，聚合物选自由以下组成的组：聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯-co-乙醇酸交酯)、聚已内酯、其混合物及其与聚乙二醇的混合物。当使用聚乙二醇(PEG)时，其分子量可以例如是1000-50000g/mol，例如约3000g/mol或35000g/mol。PEG的分子量可以例如是从1000、2000、3000、4500、5000、7000、10000、15000、20000、27000、30000、35000或40000g/mol至2000、3000、4500、5000、7000、10000、15000、20000、27000、30000、
35000、40000、45000或50000g/mol。“聚合物的混合物”是指用于制备聚合物的单体的混合物和共聚物。聚合物膜也可以在骨植入物的制造过程中形成，即，多孔体可以被单体或单体混合物覆盖，然后聚合。在这种情况下，膜也将存在于多孔体内，距离多孔体的外表面一定距离。
35000、40000、45000或50000g/mol。“聚合物的混合物”是指用于制备聚合物的单体的混合物和共聚物。聚合物膜也可以在骨植入物的制造过程中形成，即，多孔体可以被单体或单体混合物覆盖，然后聚合。在这种情况下，膜也将存在于多孔体内，距离多孔体的外表面一定距离。
[0041] 膜的厚度为10-200μm，例如100-200μm。实际上，膜的厚度可以是从10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180μm至20、30、40、50、60、70、80、
90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm。
90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm。
[0042] 在一个实施方案中，膜包含生物活性玻璃。优选地，生物活性玻璃是粉末形式，即，它的平均粒度低于45μm。使用的BAG可以与多孔体内使用的BAG相同或不同，并且它也可以是两种或更多种不同BAG的混合物。BAG的量可以例如是BAG与膜的总重量的1-40重量％。该量可以例如是从1、2、3、4、5、10、15、20、25、30或35重量％至2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或40重量％。粉末可以例如通过压碎玻璃块或玻璃颗粒体来制备。
[0043] 生物活性玻璃的组成如上所述。在这些范围内，生物活性玻璃的组成的一个优选子范围是45-54重量％的SiO2、22-25重量％的Na2O、19-25重量％的CaO和3.5-6重量％的P2O5。另一种优选的生物活性玻璃组成是53重量％的SiO2、23重量％的Na2O、20重量％的CaO和4重量％的P2O5。该玻璃也称为S53P4玻璃，并以商品名 销售。
[0044] 更优选的生物活性玻璃的组成是45重量％的SiO2、24.5重量％的Na2O、24.5重量％的CaO和6重量％的P2O5，也称为Hench玻璃，并以商品名 出售。多孔体内使用的BAG也可以是如上所述的两种或更多种不同BAG的混合物。
[0045] 多孔体可以是烧结的生物活性玻璃颗粒的形式，或者多孔体可以是由可生物降解的聚合物保持在一起的生物活性玻璃颗粒的形式。在后一实施方案中，可生物降解的聚合物可选自由以下组成的组：聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚(丙交酯co-乙醇酸交酯)、聚己内酯、聚乙二醇、天然胶原聚合物及其混合物。
[0046] 本发明的骨植入物可以以各种方式制造，对其中两个进行更详细地解释。实际上，由BAG制成的多孔体可以通过将BAG颗粒布置在模具中，添加液体形式(例如在溶液中)的聚合物，然后冷冻干燥(即，从聚合物溶液蒸发液体)来制备。此后，将单独制备的聚合物膜布置在如此形成的多孔体周围并加热至大约聚合物的Tg，以使膜稍微软化，使其与BAG制成的多孔体良好粘合。
[0047] 在另一个实施方案中，通过烧结制造多孔体，即，将BAG颗粒布置在模具中，然后将其加热至高温，使得颗粒彼此附着，即，被烧结。温度通常为约500-700℃。此后，如上所述，聚合物膜布置在多孔体周围。
[0048] 附图的详细描述
[0049] 图1示出了植入骨中时根据一个实施方案的骨植入物。该图显示了骨骼的皮层1以及下面的松质骨2。骨植入物3已植入骨中的缺损中。骨植入物3具有由圆柱形的烧结的生物活性玻璃颗粒制成的多孔体4，并且多孔体4的一端由聚合物膜5覆盖。膜5布置成使得当植入物就位时多孔体4的与皮层1接触的部分被膜5覆盖。
[0050] 图2A-2C示出了根据另一实施方案的骨植入物。图2A示出了具有侧面6和顶表面7a的盘。底表面在图2A中不可见，但它基本上平行于顶表面7。该盘形成植入物的多孔体，并且它由生物活性玻璃颗粒制成。图2B示出了由膜8部分覆盖的相同盘的局部俯视图，并且图2C示出了部分覆盖的盘的侧视图。从侧视图可以看出，侧表面已被膜8覆盖，并且底表面7b和顶表面7a的一部分也被覆盖。
[0051] 图3A和3B示出了根据一个实施方案的骨植入物的实际使用。在该实施方案中，骨植入物与外部固定装置一起使用。骨10、11包含缺损，如此处，缺失了在骨的整个横截面上延伸的部分。骨植入物14(此处显示为横截面)由形成多孔体的三个盘12制成。最外侧的盘包括延伸部，该延伸部布置成将骨植入物固定到骨中，并且可以在骨部分10、11的端部处形成相应的凹部。多孔体的侧表面被聚合物膜13覆盖。在图3B中，骨植入物14显示为布置在骨部分10和11之间。骨部分已经用外部固定装置15固定就位，外部固定装置15本身对于本领域技术人员而言是已知的。
[0052] 图4A和4B示出了根据另一个实施方案的骨植入物的另一种实际使用，用于髓内固定。在该实施方案中，骨植入物16还包括布置在彼此顶部的三个盘17，每个盘17包括从顶部表面到底部表面贯穿其的孔18。膜19布置成围绕盘，其在一个点处被切开(用附图标记23示出)，以使它们更容易围绕钉放置(如下所述)。
[0053] 在图4B中，骨植入物16显示在两个骨部分20、21之间并用钉系统22固定，其中钉系统的一部分经由孔穿过骨植入物。
[0054] 图5示出了根据一个实施方案的骨植入物的进一步实际使用。在该实施方案中，骨24需要楔形截骨。切口楔可以用根据本说明书制成的楔形植入物25代替。植入物的末端26覆盖有膜。
[0055] 实验部分
[0056] 该实验部分的目的是评估体内诱导的膜的兔模型中，与未涂覆BAG、PMMA间隔物或创伤(对照)相比，PLGA涂覆的BAG如何影响膜诱导的VEGF表达。由于人和兔之间的显著尺寸差异，多孔体的BAG颗粒的粒度小于500μm。然而，据信结果可转移到人和更大的粒度，即尽管粒度较小，但试验显示出协同效应。
[0057] 材料和方法
[0058] 生物活性玻璃
[0059] 生物活性玻璃S53P4，其重量％组成为53％的SiO2、23％的NaO、20％的CaO和4％的P2O5，由用于SiO2的Belgian砂和分析级Na2CO3、CaCO3和CaHPO4·2H2O的混合物制成。将玻璃在铂坩埚中在1360℃下熔化3小时。在预热的石墨模具中浇铸后，将玻璃粉碎并重新熔化以进行均质化。将退火的玻璃块压碎并筛分至300-500μm的尺寸范围级。将玻璃颗粒在石墨模具中在720℃氮气氛中烧结90分钟，得到长15mm、直径5mm的圆柱棒。
[0060] 聚合物涂层
[0061] 使用名称为PDLG5002A、具有50/50的DL-丙交酯和乙交酯比例的酸封端的聚(DL-丙交酯-co-乙醇酸交酯)(PLGA)(Corbion，Gorinchem，荷兰)涂布烧结的BAG棒的一端。通过将约2mm的BAG植入物的末端浸入含有20重量％的PLGA的二氯甲烷溶液中进行涂布。然后将部分涂布的S53P4+PLGA植入物在空气和真空中干燥。植入物用25kGy的剂量进行γ-灭菌。生物活性玻璃表面上的聚合物涂层的厚度由通过植入物的横截面的扫描电子显微镜(SEM)获得的图像确定。测量是从25个随机选择的涂层点进行的。平均涂层厚度为84μm，标准偏差为55μm。各个涂层厚度测量值的变化范围为17μm至192μm。由于用于进行测量的图像分辨率，每个单独测量的误差容限约为7μm。
[0062] 聚(甲基丙烯酸甲酯)，PMMA
[0063] 根据制造商的说明书混合可商购的PMMA骨水泥Palacos+G(Heraeus Medical GmbH，Wehrheim，德国)。在无菌条件下制备长度为15mm且直径为5mm的PMMA棒，并在动物手术前在高压釜炉中灭菌。
[0064] 动物和手术
[0065] 使用36只骨骼成熟的兔子(NZW，Harlan Laboratories)。该动物研究得到芬兰动物实验委员会(ESAVI/440/04.10.07/2014)的批准，严格遵循赫尔辛基大学实验动物护理原则。
[0066] 手术在使用皮下美托咪定盐酸盐和盐酸氯胺酮的全身麻醉下进行。通过从股骨的远端干骺端区域的外侧到中间部分钻出6mm水平孔来执行骨缺损。将一个5×15mm的S53P4、S53P4+PLGA或PMMA的棒植入所产生的骨缺损中。植入S53P4+PLGA棒，将涂布的末端置于骨的对着软组织的皮层区域中。针对棒和时间点的每种组合，使用三个平行实验。每个时间点的三个缺损留空以作为对照。术后给予头孢呋辛、丁丙诺啡和卡洛芬3天，以预防感染和缓解疼痛。术后第2、4和8周，用过量戊巴比妥对动物实施安乐死。收集在植入物末端以及对照钻孔位点诱导的膜。为了进行组织化学，将样品在10％福尔马林中储存过夜，然后洗涤并储存在70％乙醇中以进一步处理。将用于实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析的样品在4℃下在RNA后期溶液(AM7020)中储存过夜，然后储存在-80℃的无菌管中以等待进一步处理。
[0067] 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
[0068] 使用Ultra-Turrax匀浆器在Trizol溶液(Invitrogen/Life Technologies Paisley，UK)中匀浆30-50mg诱导的膜组织样品。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)根据制造商的说明书分离总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad，
Hercules，CA，USA)从600ng分离的RNA合成cDNA，并用无RNA水1：3稀释。从相同的总RNA样品分别进行两次cDNA合成，并使用iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad)对两个样品进行两次qPCR。
qRTPCR的反应混合物是10μl的iQ SYBR green、7μl的水、2μl的cDNA(20ng)和1μl的5μM引物。引物序列如下：VEGF(247bp；Acc no.AY196796)：有义5'-CACCCATGGCAGAAGAAGGA-3'，反义5'-ATCCGCATGATCTGCATGGT-3',和TNF(281bp；Acc no.NM_001082263)：有义5'-
GAGTCCCCAAACAACCTCCA-3'，反义5'–TGAGTGAGGAGCA CGTAGGA-3'。作为参考基因，使用以下列序列的GAPDH(207bp；Acc no.NM_001082253)：有义5'-CGAGCTGAACGGGAAACTCA-3'，反义
5'-TGGGTGGCACTGTTGAAGTC-3'。使用用于微软Excel的基因表达宏1.1版(BioRad)计算结果。
Hercules，CA，USA)从600ng分离的RNA合成cDNA，并用无RNA水1：3稀释。从相同的总RNA样品分别进行两次cDNA合成，并使用iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad)对两个样品进行两次qPCR。
qRTPCR的反应混合物是10μl的iQ SYBR green、7μl的水、2μl的cDNA(20ng)和1μl的5μM引物。引物序列如下：VEGF(247bp；Acc no.AY196796)：有义5'-CACCCATGGCAGAAGAAGGA-3'，反义5'-ATCCGCATGATCTGCATGGT-3',和TNF(281bp；Acc no.NM_001082263)：有义5'-
GAGTCCCCAAACAACCTCCA-3'，反义5'–TGAGTGAGGAGCA CGTAGGA-3'。作为参考基因，使用以下列序列的GAPDH(207bp；Acc no.NM_001082253)：有义5'-CGAGCTGAACGGGAAACTCA-3'，反义
5'-TGGGTGGCACTGTTGAAGTC-3'。使用用于微软Excel的基因表达宏1.1版(BioRad)计算结果。
[0069] 苏木精和伊红染色
[0070] 收获后，将诱导的膜样品固定在福尔马林中，用于苏木精和伊红(H&E)染色。将样品包埋在石蜡中并切成3μm切片。将切片脱石蜡并H&E染色。
[0071] 使用连接到数码相机的莱卡DM6000B/M光学显微镜(DFC420和DFC365FX；Leica Microsystems，Wetzlar，德国)评估H&E染色切片的毛细血管床的存在。放大10倍的标准化区域中的毛细血管床的数量由两位作者(RB和GS)以3分制盲法评分：1-低密度毛细血管床，2-中等密度的毛细血管床，3-高密度的毛细血管床。
[0072] 统计分析
[0073] 一只兔子在手术程序后3天因原因不明的腹泻而死亡，导致2周时，与S53P4和S53P4+PLGA的一式三份相比，PMMA仅有一式两份的样本。
[0074] 使用单向ANOVA分析和随后的Sidak多重比较测试，使用Prism软件(版本7.0a，GraphPad Software，Inc。)计算统计学差异。选择P<0.05作为统计学显著性的阈值。
[0075] 结果
[0076] 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
[0077] 在第2周观察到对照膜的VEGF高表达，但表达水平迅速下降，不适用于8周时的分析。这与PMMA处理组形成对比，PMMA处理组中VEGF的表达保持恒定长达4周。相对于PMMA组，未涂布的S53P4诱导的膜的VEGF表达在前2周和中间4周时间点高度上调，但在后8周的时间点下降至PMMA的水平。有趣的是，PLGA涂布的S53P4(S53P4+PLGA)改变了VEGF表达的模式，而不是随着时间的推移而下降，可以观察到在8周时间内从低到高VEGF表达的稳定增加。与8周时的PMMA相比，PLGA涂布的S53P4观察到的高水平的VEGF表达是显著的(p<0.05)。结果列于表1中。
[0078]VEGF 2周 4周 8周
S53P4+PLGA 5.7 8.9 16.8
S53P4 14.3 22.4 5.0
PMMA 6.9 7.0 5.3
对照钻孔 13.1 1.4 0.0
S53P4+PLGA 5.7 8.9 16.8
S53P4 14.3 22.4 5.0
PMMA 6.9 7.0 5.3
对照钻孔 13.1 1.4 0.0
[0079] 表1
[0080] 在整个追踪观察期间，对照钻孔样品的TNF表达低，不足以在8周时进行分析。PMMA的TNF表达在2周时达到峰值，在追踪观察结束时呈下降趋势。未涂布的S53P4样品在4周时显示出TNF表达的峰值。这与PLGA涂布的S53P4形成对比，后者在整个追踪观察过程中观察到与PLGA涂布的S53P4的VEGF表达模式一致的TNF表达的增加(表2)。然而，在不同的植入物或时间点之间没有看到统计学上显著的差异。
[0081]TNF-α 2周 4周 8周
S53P4+PLGA 3.3 7.8 17.8
S53P4 2.9 13.7 2.5
PMMA 11.2 4.5 4.2
对照钻孔 3.4 1.8 0
S53P4+PLGA 3.3 7.8 17.8
S53P4 2.9 13.7 2.5
PMMA 11.2 4.5 4.2
对照钻孔 3.4 1.8 0
[0082] 表2
[0083] 组织学
[0084] 在对照钻孔膜样品中在2周时观察到相对高的毛细血管床存在。追踪观察期间数量下降，且8周时仅观察到少量毛细血管床。PMMA诱导的膜显示出类似的模式，但在8周时观察到小幅高于对照钻孔的毛细血管密度。
[0085] 与PMMA组相比，BAG诱导的膜中存在的毛细血管床在4周和8周时更加充足。未涂布的S53P4在不同的时间间隔内显示出非常稳定的高毛细血管床存在。与S53P4相比，PLGA涂布的S53P4诱导的膜显示出同样高的毛细血管密度，除了4周时，此时S53P4+PLGA的毛细血管床数量甚至更高(表3，显示了三个平行样品的平均值)。
[0086]毛细血管床 2周 4周 8周
S53P4+PLGA 2.3 2.7 2.3
S53P4 2.3 2.3 2.3
PMMA 2.0 1.7 1.7
对照钻孔 2.0 1.7 1.3
S53P4+PLGA 2.3 2.7 2.3
S53P4 2.3 2.3 2.3
PMMA 2.0 1.7 1.7
对照钻孔 2.0 1.7 1.3
[0087] 表3
[0088] 毛细血管床的分级如下。
[0089] 0＝无毛细血管
[0090] 1＝少量的毛细血管
[0091] 2＝中等的毛细血管
[0092] 3＝丰富的毛细血管
[0093] 讨论
[0094] 我们评估了与PMMA相比在S53P4和PLGA涂布的S53P4(S53P4+LGA)棒的软组织界面上形成的诱导的膜中随VEGF表达的促血管生成活性，PMMA是在撰写本说明书时在两阶段诱导的膜技术中使用的标准材料。在所测试材料的组合中，仅S53P4+PLGA诱导的膜显示VEGF表达的连续增加，观察到其在8周时处于最高水平。据我们所知，之前尚未报道VEGF表达的类似持续增加。在相同的时间段内，PMMA诱导的膜的VEGF表达不断降低，与人体中的可比研究以及兔体内研究中的观察结果一致。
[0095] 我们观察到的BAG的促血管生成潜力，即VEGF表达的增加，与先前的几项体外和体内研究一致。已显示生物活性玻璃45S5颗粒的颗粒以尺寸和浓度依赖性方式增加人成纤维细胞的VEGF分泌。从科学出版物中已知用生物活性玻璃45S5颗粒刺激的成纤维细胞增加了人皮肤微血管内皮细胞的增殖并增强新血管形成。还发现45S5增加可降解聚合物的促血管生成特性。已经证明含有10％(w/v)45S5颗粒的PLGA球体刺激成纤维细胞增加VEGF。与纯聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)相比，向PDLLA基质中添加BAG也通过以剂量依赖性方式增加VEGF分泌而刺激了成纤维细胞中血管生成信号传导。
[0096] 尚不清楚BAG的PLGA涂层如何影响诱导的膜中的VEGF表达。然而，一般而言，已知用可生物降解的聚合物涂布BAG会降低玻璃的溶解速率。诱导的膜中的表达模式可以解释如下：根据PLGA涂布的S53P4表面的预期化学反应，聚合物将降解，随后增加BAG的血管生成潜力。在聚合物降解的同时，BAG的表面反应将发生，因为已经证明在植入后从溶液中的BAG连续释放Ca、Na、P和Si，从而使观察到的BAG的VEGF表达的增加继续。
[0097] 与S53P4+PLGA诱导的膜相比，S53P4诱导的膜在两周时的较高VEFG表达表明，从S53P4释放的离子对VEGF表达产生正向影响，并且该聚合物有效地减慢了离子释放和基因表达。这种延迟效应可依赖于聚合物屏障防止与S53P4支架的未涂布部分接触，或聚合物降解产物能够中和界面溶液并因此减慢玻璃的离子释放速率。在延长的植入时，聚合物将部分降解，从而允许从基于S53P4的结构释放更高的离子。这意味着，与未涂布的支架相比，部分聚合物涂布的支架能够在更长的时间段内连续释放离子，其浓度足够高以支持VEGF表达。
[0098] 已知Ca2+离子在VEGF调节的多功能信号传导途径中起重要作用，已知其影响Ca2+的流通。在血管生成中重要的骨髓衍生的祖细胞已经被证明也通过钙敏感受体对细胞外钙的变化作出反应。S53P4和S53P4+PLGA的高VEGF表达可能依赖于Ca2+的离子释放，其发生在玻璃表面。具有掺入的BAG的支架也已被证明可刺激新血管形成。机制尚不清楚，但认为它2+
们依赖于玻璃表面的Ca 离子释放。由S53P4诱导的人成纤维细胞的VEGF分泌增加也已经证明依赖于反应的玻璃颗粒体的大小，较小的颗粒更有利。这可以通过以下来解释：从具有更高表面积与溶液体积比的更小颗粒释放的更高浓度的离子影响玻璃的溶解过程。
们依赖于玻璃表面的Ca 离子释放。由S53P4诱导的人成纤维细胞的VEGF分泌增加也已经证明依赖于反应的玻璃颗粒体的大小，较小的颗粒更有利。这可以通过以下来解释：从具有更高表面积与溶液体积比的更小颗粒释放的更高浓度的离子影响玻璃的溶解过程。
[0099] 在诱导的膜技术中，第二次手术通常在第一次手术后的4到8周之间进行，但据推测，进行第二阶段手术的最佳时间可能在植入PMMA后一个月内。这是基于组织学观察，其显示PMMA诱导的膜中的血管形成在一个月龄的样品中是充足的，并且在三个月龄的样品中降低至小于60％。这一发现得到了我们研究的支持，因为PMMA对VEGF表达的诱导能力似乎在8周时是最低的，该时间是进行许多手术的时间。在我们的研究中，PMMA诱导的膜和对照钻孔的膜在两周时显示其最高的毛细血管密度，与BAG诱导的膜相比，其在追踪观察期间呈下降趋势，而BAG诱导的膜在整个追踪观察期间显示出高的毛细血管密度。
[0100] 骨折愈合和骨再生是复杂的过程，涉及先天免疫系统细胞和各种骨祖细胞之间的协调相互作用。骨折愈合由急性炎症引发，其特征在于产生促炎细胞因子，例如TNF，TNF调节间充质干细胞沿软骨形成谱系和成骨谱系的募集和分化。实际上，短期的TNF产生对骨再生至关重要。在骨折愈合的随后状态中，脉管系统向骨折部位的向内生长对骨再生至关重要。这种血管生成由生长因子如VEGF介导。因此，已显示TNF和VEGF都在骨再生的各个阶段中起关键作用。
[0101] 在8周的期间内，PMMA的TNF表达持续降低，与先前描述的PMMA的VEGF表达低的观察结果一致。对于S53P4，其在临床上已知是良好耐受的骨替代物且没有观察到的炎症反应，在4周时观察到TNF表达的增加。
[0102] 总之，我们的研究揭示，未涂布的和涂布的多孔S53P4植入物均积极地影响VEGF和TNF的表达，导致组织学样本中观察到的更高数量的毛细血管床，而在对照和PMMA样品中仅观察到较低的VEGF表达和较少的毛细血管床。
[0103] 已知PMMA的诱导的膜具有改善血管生成特性，然而，其似乎随着时间的推移而降低。在PLGA涂布的S53P4的诱导膜中，我们观察到VEGF的诱导表达随时间增加。在第8周时，涂布的S53P4的VEGF表达显著高于PMMA(p<0.05)。
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