治疗骨疾病、病症和/或损伤的方法以及用于所述方法的试剂
阅读：527发布：2022-02-04
专利汇可以提供治疗骨疾病、病症和/或损伤的方法以及用于所述方法的试剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及用于 治疗 骨病症和/或增加骨愈合的方法和 试剂 。具体地，本公开涉及结合至中期因子(下文中称为“MK”)并抑制或降低所述中期因子的功能的分离或重组的 蛋白质 诸如 抗体 在治疗骨病症中和/或用于增加骨愈合的用途。，下面是治疗骨疾病、病症和/或损伤的方法以及用于所述方法的试剂专利的具体信息内容。
1.一种促进受试者中骨形成和/或促进骨愈合和/或增加骨矿密度(BMD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含特异性结合至中期因子(MK)蛋白的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者选自由以下组成的组：
(i)具有骨折的受试者；
(ii)已经历或将经历手术程序以创建骨的受试者；
(iii)已经历或将经历手术程序以促进骨科植入物或硬件与相邻骨整合的受试者；以及
(iv)罹患或易患骨质疏松症的受试者。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质的施用在所述受试者中加速骨愈合和/或增强成骨细胞活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质特异性结合至位于MK的N结构域内的表位并抑制或降低MK的功能。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质所结合的所述表位位于如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61所限定的所述MK的N结构域内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61处的高静电势簇的至少一部分。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的构象表位，其中所述表位包括选自由以下组成的组的至少两个残基：18W、20W、34F、35R、36E、38T、43T、45R、47R和49R。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表位由以下残基限定：
(i)18W、20W、35R和49R；
(ii)18W、20W、36E、38T、43T和45R；或
(iii)18W、20W、34F、36E、45R和47R。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含：
(i)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
(ii)包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
(iii)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH，和包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
(iv)包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或(v)SEQ ID NO:2中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ ID NO:3中所列出序列内包含的三个CDR。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含：
(i)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
(ii)包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
(iii)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH，和包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
(iv)包含分别含有SEQ ID NO:12、13和14中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:15、16和17中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或(v)SEQ ID NO:10中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ ID NO:11中所列出序列内包含的三个CDR。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含：
(i)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
(ii)包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
(iii)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH，和包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
(iv)包含分别含有SEQ ID NO:21、22和23中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:24、25和26中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或(v)SEQ ID NO:18中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ ID NO:19或20中所列出的序列内包含的三个CDR。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质特异性结合至位于MK的C结构域内的表位并抑制或降低MK的功能。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质所结合的所述表位位于如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104所限定的所述MK的C结构域内。
14.根据权利要求1至3或12或13中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质所结合的所述表位位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基64-73和氨基酸残基78-
101内。
15.根据权利要求1至3或12至14中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基64至66、氨基酸残基64至67、氨基酸残基
64至69、氨基酸残基64至73、氨基酸残基84至96或氨基酸残基87至96处的表位的至少一部分。
16.根据权利要求1至3或12至15中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中所述表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：64Y 65K、66F、67E、69W、73D、84T、86K、87K90Y和96E。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述表位是构象表位。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述构象表位是反平行的β-折叠表位。
19.根据权利要求1至3或12或权利要求13中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104处的高静电势簇的至少一部分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质识别选自由以下组成的组的至少一个氨基酸：SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-64、66、68-70、72、79、
81、85-89、102和103。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中所述表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：63K、79K、81R 86K、87K、89R和102K。
22.根据权利要求1至3或12至21中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含：
(i)包含分别含有SEQ ID NO:27、28和29中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
(ii)包含分别含有SEQ ID NO:30、31和32中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
23.根据权利要求1至3或12至21中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含：
(i)包含分别含有SEQ ID NO:33、34和35中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
(ii)包含分别含有SEQ ID NO:36、37和38中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
25.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述VH和所述VL处于单一多肽链中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质是：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚体scFv(di-scFv)；或
(iii)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)和/或(ii)中的至少一者。
27.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述VL和所述VH处于单独的多肽链中。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质是：
(i)双体抗体；
(ii)三体抗体；
(iii)四体抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；或
(iv)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(iii)之一。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质是嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgA组成的组的人或非人灵长类重链免疫球蛋白恒定区。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述分离或重组的蛋白质与化合物缀合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的组：放射性同位素、可检测的标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加所述蛋白质在受试者中的半衰期的化合物及其混合物。
治疗骨疾病、病症和/或损伤的方法以及用于所述方法的试剂
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求于2016年3月1日提交的澳大利亚临时申请号2016900755的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及用于治疗骨病症和/或增加骨愈合的方法和试剂。具体地，本公开涉及结合至中期因子(midkine)(下文中称为“MK”)并抑制或降低所述中期因子的功能的分离或重组的蛋白质(诸如抗体)在治疗骨病症中和/或用于增加骨愈合的用途。
背景技术
[0004] 中期因子(下文中称为“MK”)是一种肝素结合生长/分化因子，其最初是作为在视黄酸诱导的胚胎性癌(EC)细胞分化过程中瞬时表达的基因的产物而发现的，并且是富含碱性氨基酸和半胱氨酸、分子量为13kDa的多肽(Kadomatsu.等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.,1511312-1318；Tomokura等人(1999)J.Biol.Chem,265:
10765-10770)。
10765-10770)。
[0005] 已知MK具有各种生物活性。例如，已知MK表达在许多不同的人癌细胞中是增加的(Muramatsu(2002)J.Biochem.132:359-371)，并且已发现其表达促进癌细胞的存活和迁移、促进血管生成，并有助于癌症进展。
[0006] 还已知MK在炎症过程中起重要作用。例如，已知在MK基因缺陷型敲除小鼠中，血管损伤后的新内膜形成和肾脏缺血性损伤期间的肾炎发作受到抑制。此外，还已知在这种敲除小鼠中，风湿性损伤模型和术后粘连受到显著抑制(WO2000/010608；WO2004/078210)。因此，已知MK参与炎性疾病，诸如关节炎、自身免疫疾病、风湿性关节炎(类风湿性关节炎(RA)或骨关节炎(OA))、多发性硬化症、术后粘连、炎性肠病、牛皮癣、狼疮、哮喘和中性粒细胞功能障碍。此外，已知MK促进炎性细胞(诸如巨噬细胞或中性粒细胞)的运动(迁移)。它还涉及破骨细胞分化。
[0007] MK的三维结构已通过NMR测定并报道(Iwasaki等人(1997)EMBO J.16:6936-6946)。MK由以下构成：N末端片段(下文中称为“N片段”)，其由氨基酸残基1至52组成；C末端片段(下文中称为“C片段”)，其由氨基酸残基62至121组成；和连接这些片段的环区(氨基酸残基53至61)(下文中称为“环”)。
[0008] N片段和C片段中的每一者主要由以下构成：具有由三个反平行[β]-折叠组成的三维结构的部分(下文中称为“结构域”；N片段中的结构域(由氨基酸残基15至52组成))称为“N结构域”，并且C片段中的结构域(由氨基酸残基62至104组成)称为“C结构域”)；以及不呈现特定三维结构、不含结构域的位于末端的部分(下文中称为“尾”；N片段中的尾(由氨基酸残基1至14组成)称为“N尾”，并且C片段中的尾(由氨基酸残基105至121组成)称为“C尾”)。
[0009] 针对C结构域和N结构域的抗MK抗体是已知的，例如分别如WO2008/059616和WO2012/122590中所公开的。基于先前的发现，MK具有许多生物活性并且涉及多种疾病和疾患，这些和其他抗MK抗体可以对许多疾病/疾患具有治疗效果。
[0010] 本公开涉及用于骨病症和/或损伤的非侵入性治疗选择。虽然近几十年来对长骨骨折的治疗有所改善，但延迟性骨愈合或甚至骨不连形成的发生率仍然高达10％(Cadet等人,(2013)J.Am.Acad.Orthop.Surg.21:538–547；King等人,(2007)Humeralnonunion.Hand Clin.23:449–456)。骨科并发症的高发病率仅部分通过为基于骨缝术方法的修复机械条件不足解释。大多数病例基于对骨折愈合的其他影响，包括患者的年龄或药物、病理疾患如骨质疏松症或糖尿病甚至遗传变异(Einhorn等人,(2015)Nature ReviewsRheumatology,11:45-54；Hayda等人,(1998)Clin.Orthop.Relat.Res.,355(增刊):31-40)。目前，一些治疗选择可用于治疗骨折相关并发症，包括施加生长因子(例如像骨形态发生蛋白2)、骨移植和非侵入性机械干预(包括低强度脉冲超声)(Einhorn TA(2003)J.Bone JointSurg.Am.85-A(增刊3):82-88；Giannoudis和Dinopoulos(2010)J.Orthop.Trauma,24(增刊1):S9-16；
Busse等人,(2002)CMAJ,166:437-441)。然而，这些疗法的成功是可变的，文献中报道了不一致的结果(Poynton等人,(2002)J.Orthop.Trauma,24:522-525)。因此，仍然需要用于改善骨折愈合的有效、稳健、充分表征且非侵入性的全身性疗法。
发明内容
Busse等人,(2002)CMAJ,166:437-441)。然而，这些疗法的成功是可变的，文献中报道了不一致的结果(Poynton等人,(2002)J.Orthop.Trauma,24:522-525)。因此，仍然需要用于改善骨折愈合的有效、稳健、充分表征且非侵入性的全身性疗法。
发明内容
[0011] 本公开基于发明人的以下发现：用抗MK抗体治疗加速年幼和成年小鼠的骨折愈合，所述小鼠包括卵巢切除术后的小鼠(OVX)-骨质疏松症的公认模型。具体地，本发明人已显示，施用抗MK抗体通过相对于未施用抗MK抗体的小鼠在第28天骨折骨痂中形成更大的骨加速骨折愈合。甚至在骨折愈合的早期阶段(第10天)，此结果也是非常明显的。还显示在OVX小鼠中施用抗MK抗体增加小梁骨矿密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)和厚度，并且增加皮质BMD。此外，本发明人已显示，向体外骨原细胞施用抗MK抗体消除了MK诱导的分化相关基因和β-连环蛋白调控基因表达的减少，并减少了LRP-6磷酸化。合起来看，这些发现提供了使用抑制或降低MK活性或表达的剂治疗骨病症/疾病和/或损伤的基础。
[0012] 本公开因此提供了在受试者中促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加骨矿密度(BMD)的方法，所述方法包括向受试者施用包含特异性结合MK蛋白的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质。
[0013] 在一个实例中，受试者选自由以下组成的组：
[0014] (i)具有骨折的受试者；
[0015] (ii)已经历或将经历手术程序以创建骨的受试者；
[0017] (iv)罹患或易患骨质疏松症的受试者。
[0018] 在一个实例中，向受试者施用分离或重组的蛋白质加速受试者中的骨愈合和/或增强受试者中的成骨细胞活性。例如，向受试者施用分离或重组的蛋白质可以加速受试者中的骨愈合。例如，向受试者施用分离或重组的蛋白质可以增强受试者中的成骨细胞活性。
[0019] 根据一个实例，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质特异性结合至位于MK的N结构域内的表位并抑制或降低MK的功能。例如，分离或重组的蛋白质所结合的表位可以位于如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61限定的MK的N结构域内。
[0020] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61处的高静电势簇的至少一部分。
[0021] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的构象表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少两个残基：18W、20W、34F、35R、36E、38T、43T、45R、47R和49R。在一个实例中，分离或重组的蛋白质结合至由残基18W、20W、35R和49R限定的表位。在一个实例中，分离或重组的蛋白质结合至由残基18W、20W、36E、38T、43T和45R限定的表位。在一个实例中，分离或重组的蛋白质结合至由残基18W、20W、34F、36E、45R和47R限定的表位。
[0022] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含：
[0023] (i)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0024] (ii)包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0025] (iii)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0026] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0027] (v)SEQ ID NO:2中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:3中所列出序列内包含的三个CDR。
[0028] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含：
[0029] (i)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0030] (ii)包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0031] (iii)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0032] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:12、13和14中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:15、16和17中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0033] (v)SEQ ID NO:10中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:11中所列出序列内包含的三个CDR。
[0034] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含：
[0035] (i)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0036] (ii)包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0037] (iii)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0038] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:21、22和23中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:24、25和26中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0039] (v)SEQ ID NO:18中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:19或20中所列出的序列内包含的三个CDR。
[0040] 根据另一个实例，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质特异性结合至位于例如如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104所限定的MK的C结构域内的表位，并抑制或降低MK的功能。
[0041] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质所结合的表位位于SEQ IDNO:1中所列出序列的氨基酸残基64-73和氨基酸残基78-101内。
[0042] 在另一个实例中，分离或重组的蛋白质所结合的表位位于MK的C结构域内并且分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基64至66、氨基酸残基64至67、氨基酸残基64至69、氨基酸残基64至73、氨基酸残基84至96或氨基酸残基87至96处的表位的至少一部分。
[0043] 在具体的实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：64Y 65K、66F、67E、69W、73D、84T、86K、87K 90Y和96E。
[0044] 根据本文的任何实例，本公开的分离或重组的蛋白质所结合的MK蛋白内的表位可以是构象表位，例如像反平行的β-折叠表位。
[0045] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104处的高静电势簇的至少一部分。例如，分离或重组的蛋白质识别选自由以下组成的组的至少一个氨基酸：SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-64、66、68-70、72、79、81、85-89、102和103。在一个实例中，分离或重组的蛋白质特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：63K、79K、81R 86K、87K、89R和102K。
[0046] 结合至位于MK的C结构域内的表位的可用于本公开方法的示例性分离或重组的蛋白质包含：
[0047] (i)包含分别含有SEQ ID NO:27、28和29中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
[0048] (ii)包含分别含有SEQ ID NO:30、31和32中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
[0049] 结合至位于MK的C结构域内的表位的可用于本公开方法的另一示例性分离或重组的蛋白质包含：
[0050] (i)包含分别含有SEQ ID NO:33、34和35中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
[0051] (ii)包含分别含有SEQ ID NO:36、37和38中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
[0052] 根据本文的任何实例，分离或重组的蛋白质包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
[0053] 在一个实例中，VH和VL处于单一多肽链中。根据该实例，分离或重组的蛋白质可以是：
[0054] (i)单链Fv片段(scFv)；
[0055] (ii)二聚体scFv(di-scFv)；或
[0056] (iii)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)和/或(ii)中的至少一者。
[0057] 在另一个实例中，VL和VH以单独的多肽链提供。根据该实例，分离或重组的蛋白质可以是：
[0058] (i)双体抗体；
[0059] (ii)三体抗体；
[0060] (iii)四体抗体；
[0061] (iv)Fab；
[0062] (v)F(ab’)2；
[0063] (vi)Fv；或
[0064] (iv)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(iii)之一。
[0065] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质是嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
[0066] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质可包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgA组成的组的人或非人灵长类重链免疫球蛋白恒定区。
[0067] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质可与化合物缀合。例如，分离或重组的蛋白质可与选自由以下组成的组的化合物缀合：放射性同位素、可检测的标记、治疗性化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加蛋白质在受试者中的半衰期的化合物及其混合物。
[0068] 本公开还提供了包含特异性结合至MK蛋白的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质在制备用于在受试者中促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加骨矿密度(BMD)的药物中的用途。
[0069] 合适的分离或重组的蛋白质如本文任何实例中所述。
[0070] 在一个实例中，所述药物是用于在选自由以下组成的组的受试者中促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加BMD：
[0071] (i)具有骨折的受试者；
[0072] (ii)已经历或将经历手术程序以创建骨的受试者；
[0073] (iii)已经历或将经历手术程序以促进骨科植入物或硬件与相邻骨整合的受试者；以及
[0075] 图1提供了在使用和不使用抗MK抗体治疗的成年小鼠中骨折股骨的生物力学和微计算机断层扫描分析(目标体积1)的结果。该图清楚地显示，相对于施用媒介物的那些小鼠，用抗MK抗体治疗的小鼠中骨折愈合加速。A)示出在第21天与完整股骨相比骨折股骨的相对弯曲刚度。B)示出在第28天与完整股骨相比骨折股骨的相对弯曲刚度。C)示出在第21天骨折骨痂的骨体积与组织体积比。D)示出在第28天骨折骨痂的骨体积与组织体积比。E)示出在第21天截骨间隙处的骨折骨痂的组织体积。F)示出在第28天截骨间隙处的骨折骨痂的组织体积。G)示出在第21天骨折骨痂在弯曲轴线x上的惯性矩。H)示出在第28天骨折骨痂在弯曲轴线x上的惯性矩。*通过曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney-U test)与媒介物有显著性差异(p<0.05)。(n＝6-8/组。)
[0076] 图2示出在第10天和第21天使用番红(Safranin)O染色分析骨折股骨的不同组织类型内容物的组织学切片。该图显示向小鼠施用抗MK抗体增加了骨折骨痂中的骨形成。A)愈合10天后两个内针孔之间的整个骨痂的组织形态计量学分析。B)愈合21天后两个内针孔之间的整个骨痂的组织形态计量学分析。C)来自在第10天用番红O染色的脱钙股骨的切片的代表性图像。D)来自在第21天用番红O染色的脱钙股骨的切片的代表性图像。比例尺：500μm。*通过曼-惠特尼U检验与媒介物有显著性差异(p<0.05)。(n＝6-8/组。)
[0077] 图3示出来自每个时间点和每个组的四只小鼠的骨折股骨的切片，所述切片针对MK染色并用苏木精复染。该图显示在用抗MK抗体治疗的小鼠中，在新血管形成和新骨形成的区域中MK表达降低。示出了代表性图像；Veh＝媒介物；C＝皮质；V＝血管；上图左侧的图像示出骨折后第4天的骨外膜区，其几乎没有阳性染色区域。上图右侧的图像示出骨折后第10天的软骨骨外膜骨痂。在增殖性软骨细胞和肥大软骨细胞中检测到Mdk表达。下图左侧的图像示出骨折后第10天骨性骨痂中的新血管形成区域。在媒介物治疗的血管周围检测到Mdk表达，但在Mdk-Ab治疗的小鼠中未检测到。下图右侧的图像示出骨折后第21天骨性骨痂中的新血管形成区域。Mdk表达一般较低。比例尺：50μm。(n＝4/组。)
[0078] 图4示出了相对于施用媒介物的那些动物，用抗MK抗体治疗的动物中β-连环蛋白阳性区和成骨细胞表面增加。A)示出了每个时间点和每个组的四只小鼠的骨折股骨的切片，所述切片针对β-连环蛋白染色并用苏木精复染。提供了代表性图像，其示出骨折后第10天截骨间隙近侧的骨外膜骨痂。增殖性软骨细胞和成骨细胞表达β-连环蛋白，而肥大软骨细胞是阴性的。在Ab治疗的小鼠中β-连环蛋白阳性区域更大。比例尺：100μm。veh＝媒介物；C＝皮质；HC＝肥大软骨细胞；OB＝成骨细胞；PC＝增殖性软骨细胞。B)示出了相对于施用媒介物的那些动物，用抗MK抗体治疗的动物中的β-连环蛋白表达百分比(n＝4/组)。C)示出了相对于施用媒介物的那些动物，对于用抗MK抗体治疗的动物在第21天的抗酒石酸酸性磷酸酶染色切片中每骨周长的破骨细胞数量。D)分析甲苯胺蓝染色切片的在第21天每骨周长的成骨细胞数量并且E)分析在第21天每骨表面的成骨细胞表面。F)在第28天骨外膜骨痂中的破骨细胞数量。*通过曼-惠特尼U检验与媒介物有显著性差异(p>0.05)。(n＝5-8/组。)[0079] 图5显示了对于用抗MK抗体或媒介物治疗的OVX和假手术的小鼠在第23天对骨折股骨进行的生物力学、μCT和组织形态计量学分析的结果。该图说明用抗MK抗体治疗加速骨质疏松性骨折愈合。生物力学测试：A)示出通过生物力学测试确定的与完整股骨相比骨折股骨的相对弯曲刚度。通过μCT分析确定的参数(目标体积2)：B)示出骨体积与组织体积比，C)示出组织体积并且D)示出骨折骨痂在弯曲轴x上的惯性矩；(n＝6-7/组)。通过整个骨折骨痂的组织形态计量学分析确定的参数：E)示出骨面积与组织面积比，F)示出软骨面积与组织面积比并且G)示出纤维组织面积与组织面积比。*与假手术+媒介物或OVX+媒介物组有显著性差异(p<0.05)。克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)。(n＝5-7/组。)。H)提供了来自在第23天使用Giemsa染色的未脱钙股骨的切片的代表性图像；比例尺：500μm。
[0080] 图6说明在卵巢切除术(OVX)后β-连环蛋白阳性区域减少并且在用抗MK抗体治疗后增加。A)示出了来自每个组的四只小鼠的骨折股骨的切片，所述切片针对β-连环蛋白染色并用苏木精复染。还示出了骨折后第10天截骨间隙附近的骨外膜骨痂的代表性图像；Veh：媒介物；C＝皮质；HC＝肥大软骨细胞；OB＝成骨细胞；PC＝增殖性软骨细胞。增殖性软骨细胞和成骨细胞表达β-连环蛋白，而肥大软骨细胞针对β-连环蛋白是阴性的。比例尺：
100μm。B)示出了相对于施用媒介物的那些动物，用抗MK抗体治疗的动物中的β-连环蛋白表达百分比(n＝4/组)。*通过克鲁斯凯-沃利斯检验与假手术+媒介物或OVX+媒介物组有显著性差异(p>0.05)。
100μm。B)示出了相对于施用媒介物的那些动物，用抗MK抗体治疗的动物中的β-连环蛋白表达百分比(n＝4/组)。*通过克鲁斯凯-沃利斯检验与假手术+媒介物或OVX+媒介物组有显著性差异(p>0.05)。
[0081] 图7说明用抗MK抗体的治疗在短时间治疗后提升卵巢切除(OVX)小鼠的完整股骨中的骨含量。针对用抗MK抗体或媒介物治疗的OVX小鼠和假手术小鼠，A)示出皮质骨矿密度(BMD)并且B)示出皮质厚度，如通过对完整股骨中段处皮质骨(目标体积3(VOI 3))的微计算机断层扫描(μCT)分析所测定的。针对用抗MK抗体或媒介物治疗的OVX小鼠和假手术小鼠，C)示出小梁BMD，D)示出骨体积与组织体积比，E)示出小梁厚度，并且F)示出小梁数量，如通过对完整股骨的远侧部分(VOI 4)的μCT分析所测定的。*通过克鲁斯凯-沃利斯检验与假手术+媒介物或OVX+媒介物组有显著性差异(p<0.05)。(n＝6-7/组。)。G)提供了针对用抗MK抗体或媒介物治疗的OVX小鼠和假手术小鼠对远侧完整股骨(VOI 4)的小梁区的代表性三维重建
[0082] 图8说明用抗MK抗体的治疗在短时间治疗后提升卵巢切除(OVX)小鼠的椎体中的骨含量。对于用抗MK抗体或媒介物治疗的OVX小鼠和假手术小鼠提供了如通过对椎体(目标体积5)的微计算机断层扫描分析所测定的以下结果：A)第二尾椎体的二维图像，B)小梁骨矿密度，C)小梁骨体积与组织体积比，D)小梁厚度，和F)小梁数量。*通过克鲁斯凯-沃利斯检验与假手术+媒介物或OVX+媒介物组有显著性差异(p<0.05)。(n＝6-7/组。)
[0083] 图9说明用抗MK抗体处理细胞减弱了MK蛋白对β-连环蛋白信号传导的消极影响。A)示出用MK蛋白和/或抗MK抗体刺激6h后的细胞增殖百分比，将其标准化为未刺激的对照(虚线)(n＝6)。B)示出在用MK蛋白和/或抗MK抗体刺激6h后分化的第5天相对于B2M表达(管家基因)的Alpl基因表达，将其标准化为分化前值(虚线)(n＝6)。C)示出在用MK蛋白和/或抗MK抗体刺激6h后分化的第5天的cFOS和ALPL蛋白表达，其中将α-微管蛋白用作对照(n＝
3)。D)示出在机械刺激30分钟(S)、在机械刺激之前与MK蛋白一起温育30分钟(S+Mdk)以及与抗MK抗体一起温育(Mdk-Ab)后分化的第14天的cFos的基因表达。将Gapdh用作管家基因，并将基因表达值标准化为未刺激的对照(虚线)(n＝6-9)。E)示出与或未与重组MK蛋白一起温育1h并用抗Mdk抗体进行免疫沉淀的ATDC5和MC3T3-E1细胞的结果(n＝6)。F)示出与MK蛋白和/或抗MK抗体一起温育6h后MC3T3-E1细胞中的磷酸化-LRP-6、LRP-6、β-连环蛋白和活性β-连环蛋白表达。n＝3。G)示出在使用鼠类原代颅骨成骨细胞(PO)或原代骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)的情况下用抗Mdk抗体进行免疫沉淀的结果。克鲁斯凯-沃利斯检验。*与对照值有显著性差异(p<0.05)。
3)。D)示出在机械刺激30分钟(S)、在机械刺激之前与MK蛋白一起温育30分钟(S+Mdk)以及与抗MK抗体一起温育(Mdk-Ab)后分化的第14天的cFos的基因表达。将Gapdh用作管家基因，并将基因表达值标准化为未刺激的对照(虚线)(n＝6-9)。E)示出与或未与重组MK蛋白一起温育1h并用抗Mdk抗体进行免疫沉淀的ATDC5和MC3T3-E1细胞的结果(n＝6)。F)示出与MK蛋白和/或抗MK抗体一起温育6h后MC3T3-E1细胞中的磷酸化-LRP-6、LRP-6、β-连环蛋白和活性β-连环蛋白表达。n＝3。G)示出在使用鼠类原代颅骨成骨细胞(PO)或原代骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)的情况下用抗Mdk抗体进行免疫沉淀的结果。克鲁斯凯-沃利斯检验。*与对照值有显著性差异(p<0.05)。
[0084] 图10示出了重组MK蛋白和抗MK抗体对原代成骨细胞和骨髓衍生的干细胞的影响。A)示出在机械刺激30分钟(S)、在机械刺激之前与MK蛋白一起温育30分钟(S+Mdk)以及与抗MK抗体一起温育后原代成骨细胞在分化的第21天的cFos基因表达。将Gapdh用作管家基因，并将基因表达值标准化为未刺激的对照(虚线)(n＝4-6)。B)示出了用MK蛋白和抗MK抗体刺激6h后mMSC的增殖水平(以百分比表示)。将表达值标准化为未刺激的对照(虚线)(n＝6)。
C)示出了在用MK蛋白和抗MK抗体刺激6h后分化的第10天mMSC的Alpl基因表达。将B2M用作管家基因，并将基因表达值标准化为分化前值(虚线)(n＝4)。克鲁斯凯-沃利斯检验。*与对照值有显著性差异(p<0.05)。
C)示出了在用MK蛋白和抗MK抗体刺激6h后分化的第10天mMSC的Alpl基因表达。将B2M用作管家基因，并将基因表达值标准化为分化前值(虚线)(n＝4)。克鲁斯凯-沃利斯检验。*与对照值有显著性差异(p<0.05)。
[0085] 图11示出了卵巢切除术(OVX)对子宫重量、完整骨和骨性骨痂形成的影响。A)在初始手术后11周，来自假手术小鼠和OVX小鼠的子宫。B)子宫的重量。C)完整股骨的干骺端区的代表性横向μCT图像。D)在骨折后第23天假手术小鼠和OVX小鼠的骨折骨痂的代表性纵向3DμCT图像。
[0086] 图12示出了通过流式细胞术测定的骨折后第1天骨折血肿和骨髓中的免疫细胞群。A-D)在假手术小鼠(白色条)和OVX小鼠(灰色条)的骨折血肿和骨髓中活的B淋巴细胞(CD19+)、炎性单核细胞(Ly6G+、F4/80+、CD11b+)、巨噬细胞(Ly6G-、F4/80+、CD11b+)、中性粒细胞(Ly6G+、F4/80-、CD11b+)、T淋巴细胞(CD3+)、细胞毒性T淋巴细胞(CD3+、CD8+)和T辅助淋+ +巴细胞(CD3、CD4)的百分比。对于假手术与OVX小鼠之间的比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<
0.001。
0.001。
[0087] 图13示出通过免疫组织化学分析的骨折后第3天骨折骨痂中的免疫细胞数量。A)每平方mm骨外膜骨痂Ly6G阳性中性粒细胞的数量。B)每平方mm骨髓腔F4/80阳性巨噬细胞的数量。C)每平方mm骨外膜骨痂CD45R阳性B淋巴细胞的数量。D)每平方mm骨外膜骨痂CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞的数量。对于假手术小鼠与OVX小鼠之间的比较*p<0.05，对于Mdk-Ab未治疗小鼠与治疗小鼠之间的比较#p<0.05。
[0088] 图14提供了骨折后第3天骨折骨痂中的免疫细胞染色。来自用和不用Mdk-Ab治疗的假手术小鼠和OVX小鼠的骨折股骨中的Ly6G、F4/80、CD45R和CD6阳性细胞的代表性图像。示出了截骨间隙近侧的骨外膜骨痂。N＝中性粒细胞；B＝B淋巴细胞；T＝T淋巴细胞；C＝皮质。对于免疫组织化学染色，比例尺＝100μm，并且对于免疫荧光染色，比例尺＝25μm。
[0089] 图15示出了骨折后第3天骨折骨痂中的细胞因子表达。来自用和不用Mdk-Ab治疗的假手术小鼠和OVX小鼠的骨折股骨的Mdk、IL-6、CCL2和CXCL1免疫染色切片的代表性图像。示出了截骨间隙近侧的骨外膜骨痂。C＝皮质。比例尺＝100μm。
具体实施方式
[0091] SEQ ID NO:1-人中期因子蛋白序列。
[0092] SEQ ID NO:2-IP-9可变重链蛋白序列。
[0093] SEQ ID NO:3-IP-9可变轻链蛋白序列。
[0094] SEQ ID NO:4-IP-9可变重链CDR1蛋白序列。
[0095] SEQ ID NO:5-IP-9可变重链CDR2蛋白序列。
[0096] SEQ ID NO:6-IP-9可变重链CDR3蛋白序列。
[0097] SEQ ID NO:7-IP-9可变轻链CDR1蛋白序列。
[0098] SEQ ID NO:8-IP-9可变轻链CDR2蛋白序列。
[0099] SEQ ID NO:9-IP-9可变轻链CDR3蛋白序列。
[0100] SEQ ID NO:10-IP-10可变重链蛋白序列。
[0101] SEQ ID NO:11-IP-10可变轻链蛋白序列。
[0102] SEQ ID NO:12-IP-10可变重链CDR1蛋白序列。
[0103] SEQ ID NO:13-IP-10可变重链CDR2蛋白序列。
[0104] SEQ ID NO:14-IP-10可变重链CDR3蛋白序列。
[0105] SEQ ID NO:15-IP-10可变轻链CDR1蛋白序列。
[0106] SEQ ID NO:16-IP-10可变轻链CDR2蛋白序列。
[0107] SEQ ID NO:17-IP-10可变轻链CDR3蛋白序列。
[0108] SEQ ID NO:18-IP-13可变重链蛋白序列。
[0109] SEQ ID NO:19-IP-13可变轻链v1蛋白序列。
[0110] SEQ ID NO:20-IP-13可变轻链v2蛋白序列。
[0111] SEQ ID NO:21-IP-13可变重链CDR1蛋白序列。
[0112] SEQ ID NO:22-IP-13可变重链CDR2蛋白序列。
[0113] SEQ ID NO:23-IP-13可变重链CDR3蛋白序列。
[0114] SEQ ID NO:24-IP-13可变轻链CDR1蛋白序列。
[0115] SEQ ID NO:25-IP-13可变轻链CDR2蛋白序列。
[0116] SEQ ID NO:26-IP-13可变轻链CDR3蛋白序列。
[0117] SEQ ID NO:27-CSM-1可变重链CDR1蛋白序列。
[0118] SEQ ID NO:28-CSM-1可变重链CDR2蛋白序列。
[0119] SEQ ID NO:29-CSM-1可变重链CDR3蛋白序列。
[0120] SEQ ID NO:30-CSM-1可变轻链CDR1蛋白序列。
[0121] SEQ ID NO:31-CSM-1可变轻链CDR2蛋白序列。
[0122] SEQ ID NO:32-CSM-1可变轻链CDR3蛋白序列。
[0123] SEQ ID NO:33-IP-14可变重链CDR1蛋白序列。
[0124] SEQ ID NO:34-IP-14可变重链CDR2蛋白序列。
[0125] SEQ ID NO:35-IP-14可变重链CDR3蛋白序列。
[0126] SEQ ID NO:36-IP-14可变轻链CDR1蛋白序列。
[0127] SEQ ID NO:37-IP-14可变轻链CDR2蛋白序列。
[0128] SEQ ID NO:38-IP-14可变轻链CDR3蛋白序列。
[0129] 概述
[0130] 在本说明书通篇中，除非另外明确说明或上下文另外需要，否则提及单一步骤、物质组成、成组步骤或成组物质组成将视为涵盖这些步骤、物质组成、成组步骤或成组物质组成中的一个和复数个(即一个或多个)。
[0131] 本领域技术人员应理解，本公开容许具体描述的内容以外的变型和修改。应理解本公开包括所有所述变型和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
[0132] 本公开不限于本文所描述的特定实施例的范围，所述特定实施例仅意图用于例示性目的。功能上等同的产物、组合物和方法明显在本公开的范围内。
[0133] 除非另外明确说明，否则本文本公开的任何实施例应理解为在作了必要修改的情况下适用于本公开的任何其他实施例。
[0134] 除非另外明确定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语应理解为具有与本领域的普通技术人员通常所理解相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
[0135] 除非另外说明，否则本公开中所用的重组蛋白质、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员所熟知的标准程序。此类技术在如以下之资源的文献中加以描述并且说明：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley和Sons(1984)；
J.Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:A
Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新版)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；和J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新版)。
J.Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:A
Practical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新版)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；和J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新版)。
[0136] 本文中的可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过以下文献中的论述得到进一步阐明Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991,Bork等人,(1994)J.Mol.Biol.242:309-320；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；
Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；和/或Al-Lazikani等人,(1997)
J.Mol.Biol.273:927-948。
Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；和/或Al-Lazikani等人,(1997)
J.Mol.Biol.273:927-948。
[0137] 术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为是指“X和Y”或“X或Y”，且将用以对于两种含义或对于任一含义提供明确的支持。
[0138] 在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变型诸如“包含(comprises/comprising)”应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤、或成组要素、整数或步骤，而非排除任何其他要素、整数或成组步骤、或要素、整数或步骤。
[0139] 所选择的定义
[0140] 技术人员将知道，“抗体”通常视为包含由多个免疫球蛋白链构成的可变区的蛋白质，例如包含VL的多肽和包含VH的多肽。抗体通常也包含恒定结构域，其中的一些可排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH与VL相互作用形成包含能够特异性结合至一个或数个密切相关的抗原的抗原结合区的Fv。一般来说，来自哺乳动物的轻链为κ轻链或λ轻链，且来自哺乳动物的重链为α、δ、ε、γ或μ。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。术语“抗体”还涵盖人源化抗体、去免疫化抗体、非耗尽型抗体、非激活型抗体、灵长类化抗体、人抗体和嵌合抗体。如本文所用，术语“抗体”还意图包括除了全长、完整或全抗体分子之外的形式，诸如能够结合表位决定子的Fab、F(ab')2和Fv。这些形式可称为抗体“片段”。这些抗体形式保留了选择性结合至人中期因子的一些能力，其实例包括但不限于以下：
[0141] (1)Fab，所述片段含有抗体分子的单价结合片段，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化全抗体以得到完整轻链和一条重链的一部分来产生；
[0142] (2)Fab'，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原以得到完整轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
[0143] (3)(Fab')2，抗体的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理全抗体而随后不还原来获得；F(ab)2是由两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；
[0144] (4)Fv，其定义为含有轻链可变区和重链可变区的基因工程片段，表现为两条链；
[0145] (5)单链抗体(“SCA”)，其定义为含有轻链可变区、重链可变区的基因工程分子，所述轻链可变区、重链可变区通过合适的多肽接头连接以作为基因融合的单链分子；此类单链抗体可以是多聚体形式，诸如双体抗体、三体抗体和四体抗体等，它们可以是或不是多特异性的(参见，例如，WO1994/007921和WO1998/044001)；以及
[0146] (6)单结构域抗体，通常是不含轻链的可变重结构域。
[0147] 因此，根据本公开的抗体包含独立的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、不含任何重链的可变轻结构域、不含轻链的可变重结构域和Fv。通过重组DNA技术或通过酶促方式或化学方式分离完整免疫球蛋白来产生此类片段。
[0148] 术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换用于指呈基本上完整形式的抗体，与抗体的抗原结合片段不同。具体地，全抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应功能。
[0149] 本文公开的抗体可以为人源化抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指衍生自非人抗体(通常为鼠类)的抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性但在人中具有较低的免疫原性。
[0150] 本文公开的抗体可以为非耗尽型抗体。如本文所用，术语“非耗尽型抗体”是指与其靶标结合但不募集影响靶细胞裂解的免疫系统效应功能的抗体。免疫系统的效应功能依赖于Fc结构域与C1q(补体级联的第一组分)和/或受体(FcR)的相互作用。补体依赖性细胞毒性(CDC)由与C1q相互作用的多个Fc结构域引发，其最终可通过形成膜攻击复合物(MAC)导致靶细胞裂解。另外，免疫系统的细胞，诸如粒细胞、巨噬细胞和NK细胞，可以通过FcR与结合靶细胞的mAb相互作用。通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用触发靶细胞的裂解。非耗尽型抗体包括没有Fc结构域的抗体片段，包括例如单价的(例如，Fab、scFv、纳米抗体和dAb)、二价的(例如，F(ab')2和双体抗体)和多价的(例如，三体抗体和五体抗体)形式。此外，非耗尽型抗体包括已被修饰以除去效应功能而不影响药代动力学的抗体，例如，可对Fc结构域中的在与C1q和FcR相互作用中起主要作用的氨基酸残基进行修饰，或者可以除去CH2结构域中的N连接的糖基化位点。如技术人员所知，工程化非耗尽型抗体的可能性与用于产生抗体的恒定区相关联。IgG3恒定区比IgG1恒定区更可能产生耗尽型抗体，而IgG1恒定区又比IgG2恒定区更可能产生耗尽型抗体，而IgG4恒定区通常意味着抗体是非耗尽型的。技术人员还应理解，对恒定区的修饰可以将耗尽型抗体转化为非耗尽型抗体，反之亦然。
[0151] 本文公开的抗体可以为非激活型抗体。如本文所用，“非激活型抗体”是指结合细胞表面受体并抵消或阻断内源性配体作用的抗体。
[0152] 术语“Kabat的EU编号系统”应理解成意指免疫球蛋白重链的编号是根据Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda中所教导的EU指数。EU指数是基于人IgG1EU抗体的残基编号。
[0153] 如本文所用，“可变区”是指如本文所定义的轻链和/或重链中能够特异性结合至抗原的部分，且例如包括CDR的氨基酸序列；即CDR1、CDR2和CDR3，和框架区(FR)。例如，所述可变区包含三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选FR4)以及三个CDR。VH是指重链可变区。VL是指轻链可变区。分配给CDR和FR的氨基酸位置可以根据Kabat(1987和1991，同上)或在执行根据本公开的方法中的其他编号系统，例如Clothia和Lesk(1987和/或1989，同上和/或Al-Lazikani等人,1997，同上)的高变环编号系统定义。
[0154] 如本文所用，术语“互补决定区”(同义词：CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域中在FR之间形成环的氨基酸残基，所述FR的序列在抗体之间变化。一些或全部CDR赋予将抗原结合在抗体上的能力。每个可变结构域通常具有三个CDR区，标识为CDR1、CDR2和CDR3。每个互补决定区可包含来自如由Kabat等人,(1991)定义的“互补决定区”的氨基酸残基和/或来自“高变区”Chothia和Lesk(1987)，或任何其他已知编号技术或其组合的那些残基，所述其他已知编号技术包括IMGT编号系统(Lefranc等人,(2003)Dev.Comp.Immunol.,27(1)55-77)。
[0155] “框架区”(下文FR)是除CDR残基以外的那些可变结构域残基。
[0156] 如本文所用，术语“恒定区”或“可结晶片段”或“Fc”或“Fc区”或“Fc部分”(它们在本文中可互换使用)是指抗体中包含至少一个恒定结构域且通常(但不一定)糖基化且能够结合至一种或多种Fc受体和/或补体级联的组分的区。重链恒定区可选自以下五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。此外，各种子类的重链(诸如重链的IgG子类)负责不同效应功能，且因此通过选择所需重链恒定区，可产生具有所需效应功能的蛋白质。优选地，本公开抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。示例性重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)、γ4(IgG4)或其杂交体。轻链恒定区可具有κ或λ型、优选κ型。
[0157] “恒定结构域”是抗体中序列与抗体/相同类型抗体(例如IgG或IgM或IgE)中的序列高度类似的结构域。抗体的恒定区通常包含多个恒定结构域，例如γ、α和δ重链的恒定区包含两个恒定结构域。
[0158] 如本领域技术人员应理解的，如本文所用，术语“残基”是指氨基酸残基。因此，词语“残基”可与术语“氨基酸”互换使用。
[0159] 在抗体背景下的术语“重组”是指在与其天然状态相比以改变的量或改变的速率由细胞产生或在无细胞表达系统中产生时的抗体。在一个实施方案中，所述细胞为不天然产生所述抗体或免疫球蛋白链的细胞。然而，所述细胞可为包含引起改变(优选增加)的量的多肽产生的非内源性基因的细胞。本公开的重组抗体包括未与转基因(重组)细胞或无细胞表达系统(其中产生多肽)的其他组分分离的多肽，以及在此类细胞或无细胞系统中产生随后从至少一些其他组分中纯化出的抗体。
[0160] 本文公开的抗体可以特异性结合至中期因子蛋白(诸如人中期因子蛋白)。如本文所用，术语“特异性结合”将意指与用替代性抗原或表位的情况相比，蛋白质以更久的持续时间和/或以更大的亲和力与中期因子或其特定表位更频繁、更迅速地反应或缔合。因此，“特异性结合”不必要求排他性结合或与另一抗原的不可检测结合。术语“特异性结合”与“选择性结合”在本文中可互换使用。
[0161] 在两种表位的背景下的“重叠”将意指两个表位共用足够数量的氨基酸残基以容许与一个表位结合的抗体竞争性地抑制与另一表位结合的抗体的结合。例如，两个表位共用至少1或2或3或4或5或6个或更多个氨基酸。
[0162] 本文提及的“单克隆抗体IP-9”或“IP-9”是指具有如SEQ ID NO:2中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:3中所示的可变轻链序列的单克隆抗体。
[0163] 本文提及的“单克隆抗体IP-10”或“IP-10”是指具有如SEQ ID NO:10中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:11中所示的可变轻链序列的单克隆抗体。
[0164] 本文提及的“单克隆抗体IP-13”或“IP-13”是指具有如SEQ ID NO:18中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:19或20中所示的可变轻链序列的单克隆抗体。
[0165] 本文提及的“单克隆抗体IP-14”、“IP-14”或“鼠类IP-14”是指这样的单克隆抗体，其具有包含分别含有如SEQ ID NO:33、34和35中所示的CDR1、CDR2和CDR3的可变重链序列，和包含分别含有如SEQ ID NO:36、37和38中所示的CDR1、CDR2和CDR3的可变轻链序列。mAb IP14是与WO2008/059616中命名为CSM-4的抗体相同的抗体。
[0166] 本文提及的“单克隆抗体CSM-1”或“CSM-1”是指这样的单克隆抗体，其具有包含分别含有如SEQ ID NO:27、28和29中所示的CDR1、CDR2和CDR3的可变重链序列，和包含分别含有如SEQ IDNO:30、31和32中所示的CDR1、CDR2和CDR3的可变轻链序列。CSM-1描述于WO2008/059616中。
[0167] 如本文所用，术语“治疗(treating/treat/treatment)”及其变型是指被设计用来在临床病理学过程中改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床介入。期望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态，以及消退或改善预后。例如，如果减轻或消除与疾病/疾患(例如，骨质疏松症)和/或损伤(例如，骨折)相关联的一种或多种症状或疾病/疾患的临床结果或预后得到改善，则成功“治疗”个体。
[0168] 如本文所用，术语“预防(preventing/prevent/prevention)”或其变型包括关于个体中的疾病的发生或再发提供预防。个体可能易于发生疾病或疾病复发或具有发生疾病或疾病复发的风险，但尚未诊断出疾病或复发。术语预防不需要绝对预防，但包括在一定程度上抑制疾病的进展。
[0169] “有效量”是指在必需的剂量下和时段内有效实现所需治疗或预防结果的至少量。有效量可以在一次或多次施用中提供。在本公开的一些实例中，术语“有效量”意指实现如上文所述的疾病或疾患的治疗所必需的量。有效量可以根据待治疗的疾病或疾患并且也可以根据与所治疗的哺乳动物有关的体重、年龄、种族背景、性别、健康状况和/或身体状况和其他因素而变化。通常，有效量将处于可以通过医学从业者的常规试验和实验来确定的相对广泛的范围(例如“剂量”范围)内。有效量可以在治疗期内以单次剂量或以重复一次或若干次的剂量施用。
[0170] “治疗有效量”是实现特定疾病(例如癌症)的可测量改善所需的至少最低浓度。本文中的治疗有效量可以根据以下因素而变化，诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及蛋白质在个体体内引发所需响应的能力。治疗有效量也是其中治疗上有益的效果超过蛋白质的任何毒性或有害影响的量。
[0171] “预防有效量”是指在必需的剂量下和时段内，有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，由于预防剂量是在疾病前或在疾病的早期阶段用于哺乳动物，因此预防有效量可以小于治疗有效量。
[0172] 术语“有效浓度50％”(缩写为“EC50”)表示抗体靶向的分子的给定作用(例如抑制/置换人中期因子与其靶标结合)的50％所需的本公开抗体的浓度。本领域技术人员应理解，较低的EC50值对应于更强力的抗体。
[0173] 根据本公开治疗的“哺乳动物”可以是灵长类动物、家畜(例如绵羊、马、牛、猪、驴)、伴侣动物(例如宠物，诸如狗和猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)、表演动物(例如赛马、骆驼、灰狗)或捕获的野生动物。在一个实施例中，哺乳动物是人。
[0174] 选择性结合至MK的分离或重组的蛋白质
[0175] 如本文所述，设想将包含选择性结合至MK的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质用于本公开方法中。选择性结合至MK的抗体在本领域中是已知的，包括但不限于WO2008/059616、WO2012/122590和WO2014/070642中描述的那些抗MK抗体。其他抗MK抗体描述于Sun X.Z等人,(1997)J.Neuropathol.Exp.Neurol.56(12):1339-48和Muramatsu H.等人,(2004)J.Biochem.,119:1171-77)。然而，适用于本公开方法的其他分离或重组的蛋白质(包括抗MK抗体和包含其抗原结合结构域的蛋白质)可以通过本领域已知的方法产生。
[0176] 本文描述了用于产生适用于本公开方法的分离或重组的蛋白质(包括抗MK抗体及其结合片段)的方法。此外，本文还描述了用于确定蛋白质的MK结合活性及其在本公开方法中使用的适用性的功能测定。
[0177] 在一个特定实例中，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质是包含下述抗体的抗原结合结构域的蛋白质，所述抗体特异性结合至位于例如如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61所限定的MK的N结构域内的表位，并从而抑制或降低MK的功能。例如，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质识别位于SEQ IDNO:1中所列出序列的氨基酸残基1-61处的高静电势簇的至少一部分。
[0178] 适用于本公开方法的蛋白质可以特异性结合至位于MK的N结构域内的由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的构象表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少两个残基：18W、20W、34F、35R、36E、38T、43T、45R、47R和49R。在一个实例中，构型表位由残基18W、20W、35R和49R限定。在一个实例中，构型表位由残基18W、20W、36E、38T、43T和45R限定。
在一个实例中，构型表位由残基18W、20W、34F、36E、45R和47R限定。
在一个实例中，构型表位由残基18W、20W、34F、36E、45R和47R限定。
[0179] 根据一个特定实例，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含WO2012/122590中命名为IP-9的抗体的抗原结合结构域。例如，分离或重组的蛋白质可以包含：
[0180] (i)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0181] (ii)包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0182] (iii)包含SEQ ID NO:2中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0183] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0184] (v)SEQ ID NO:2中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:3中所列出序列内包含的三个CDR。
[0185] 根据该实例用于本公开方法的特别优选蛋白质是命名为IP-9的抗体，其具有包含SEQ ID NO:2中所列出的序列的VH和包含SEQID NO:3中所列出的序列的VL。
[0186] 根据另一个特定实例，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含WO2012/122590中命名为IP-10的抗体的抗原结合结构域。例如，分离或重组的蛋白质可以包含：
[0187] (i)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0188] (ii)包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0189] (iii)包含SEQ ID NO:10中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:11中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0190] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:12、13和14中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:15、16和17中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0191] (v)SEQ ID NO:10中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:11中所列出的序列内包含的三个CDR。
[0192] 根据该实例用于本公开方法的特别优选蛋白质是命名为IP-10的抗体，其具有包含SEQ ID NO:10中所列出的序列的VH和包含SEQ ID NO:11中所列出的序列的VL。
[0193] 根据另一个特定实例，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含WO2012/122590中命名为IP-13的抗体的抗原结合结构域。例如，分离或重组的蛋白质可以包含：
[0194] (i)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的重链可变结构域(VH)；
[0195] (ii)包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的轻链可变结构域(VL)；
[0196] (iii)包含SEQ ID NO:18中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VH和包含SEQ ID NO:19或20中所列出的序列或表现出与所述序列的95％或更大同一性的序列的VL；
[0197] (iv)包含分别含有SEQ ID NO:21、22和23中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH，和包含分别含有SEQ ID NO:24、25和26中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或[0198] (v)SEQ ID NO:18中所列出序列内包含的三个CDR和SEQ IDNO:19或20中所列出的序列内包含的三个CDR。
[0199] 根据该实例用于本公开方法的特别优选蛋白质是命名为IP-13的抗体，其具有包含SEQ ID NO:18中所列出的序列的VH和包含SEQ ID NO:19中所列出的序列的VL。根据该实例用于本公开方法的另一特别优选蛋白质是命名为IP-13的抗体，其具有包含SEQ IDNO:18中所列出的序列的VH和包含SEQ ID NO:20中所列出的序列的VL。
[0200] 设想用于本公开方法的其他分离或重组的蛋白质包含下述抗体的抗原结合结构域的蛋白质，所述抗体特异性结合至位于例如如由SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104所限定的MK的C结构域内的表位，并从而抑制或降低MK的功能。例如，本公开的分离或重组的蛋白质所结合的表位位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基64-73和氨基酸残基78-101内。例如，本公开的分离或重组的蛋白质所结合的表位可以位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基64至66、氨基酸残基64至67、氨基酸残基64至69、氨基酸残基64至73、氨基酸残基84至96或氨基酸残基87至96处。
[0201] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质可特异性结合至由SEQ IDNO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：64Y 65K、66F、67E、69W、73D、84T、86K、87K 90Y和96E。
[0202] 根据本文所述的任何实例，分离或重组的蛋白质所结合的MK的C结构域内的表位可以是构象表位，例如反平行的β-折叠表位。
[0203] 设想用于本公开方法的包含特异性结合至位于MK的C结构域内的表位的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质可以识别位于SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-104处的高静电势簇的至少一部分。例如，分离或重组的蛋白质可以识别选自由以下组成的组的至少一个氨基酸：SEQ ID NO:1中所列出序列的氨基酸残基62-64、66、68-70、72、79、81、85-89、102和103。在一个实例中，分离或重组的蛋白质可以特异性结合至由SEQ ID NO:1中所列出的氨基酸序列形成的表位，其中表位包括选自由以下组成的组的至少一个残基：63K、79K、81R 86K、87K、89R和102K。
[0204] 根据一个特定实例，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含WO2008/059616中命名为CSM-1的抗体的抗原结合结构域。例如，分离或重组的蛋白质可以包含：
[0205] (i)包含分别含有SEQ ID NO:27、28和29中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
[0206] (ii)包含分别含有SEQ ID NO:30、31和32中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
[0207] 根据一个特定实例，设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质包含WO2008/059616中命名为CSM-1(在本文中还称为IP-14)的抗体的抗原结合结构域。例如，分离或重组的蛋白质可以包含：
[0208] (i)包含分别含有SEQ ID NO:33、34和35中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)；以及
[0209] (ii)包含分别含有SEQ ID NO:36、37和38中所列出的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。
[0210] 本文公开的抗体的免疫球蛋白链的同一性％通过GAP(Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.,48(3):443-453)分析(GCG程序)在空位产生罚分(gap creation penalty)＝5和空位延伸罚分(gapextension penalty)＝0.3下测定。查询序列的长度为至少50个氨基酸，并且GAP分析在至少50个氨基酸的区域上比对两个序列。甚至更优选地，查询序列的长度为至少100个氨基酸，并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域上比对两个序列。最优选地，这两个序列在其整个长度上比对。
[0211] 关于定义的本公开的分离或重组的蛋白质(例如像抗体的免疫球蛋白链)，应理解，高于以上所提供的那些的同一性％数字将涵盖优选的实施方案。因此，在适用时，根据最小同一性％数字，优选的是分离或重组的蛋白质包含的氨基酸序列与相关指定的SEQ ID NO至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％、更优选至少99.1％、更优选至少99.2％、更优选至少99.3％、更优选至少99.4％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％以及甚至更优选至少
99.9％相同。
99.9％相同。
[0212] 在另一个实施方案中，向指定的SEQ ID NO添加一个参见，从指定的SEQ ID NO中缺失一个残基，与指定的SEQ ID NO相比添加一个残基并且缺失一个残基，向指定的SEQ ID NO添加两个残基，从指定的SEQ ID NO中缺失两个残基，从指定的SEQ ID NO中改变一个残基，从指定的SEQ ID NO改变两个残基，从指定的SEQ ID NO中改变一个残基并缺失一个残基或者对指定的SEQ ID NO改变一个残基并添加一个残基，或其任何组合。
[0214] 设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质的氨基酸序列突变体可通过将适当核苷酸改变引入本公开的核酸中或者通过体外合成所需的多肽来制备。此类突变体在氨基酸序列内包含例如残基的缺失、插入或取代。可做出缺失、插入和取代的组合以获得最终的构建体，前提是最终的多肽产物具有所需的特征。
[0215] 突变的(改变的)多肽可使用本领域已知的任何技术进行制备。例如，可以对本公开的多核苷酸进行体外诱变。这种体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适的载体中、将载体转化到“增变”菌株，诸如大肠杆菌XL-1red(Stratagene)中，并将转化的细菌繁殖适当的数代。衍生自突变/改变的DNA的产物可容易地使用本文所述的技术进行筛选，以便确定它们是否具有受体结合和/或抑制性活性。
[0216] 在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待改变的一个或多个特征。突变的位点可例如通过(1)首先用保守氨基酸选择取代并且然后用更多基团选择取代(这取决于所实现的结果)、(2)缺失目标残基或者(3)与所定位的位点相邻地插入其他残基来单独或连续地改变。
[0217] 氨基酸序列缺失的范围通常为约1至15个残基，更优选为约1至10个残基并且通常为约1至5个连续的残基。
[0218] 取代突变体在抗体和/或免疫球蛋白链分子中去除至少一个氨基酸残基和在其位置中插入不同残基。取代诱变最感兴趣的位点包括被鉴定为对于抗原结合是重要的位点。这些位点，特别是属于具有人抗体和/或免疫球蛋白链的至少三个其他相同保守位点的序列的那些，优选以相对保守的方式取代。此类保守性取代在“示例性取代”的标题下的表1中示出。
[0219] 表1.示例性取代
[0220]
[0221]
[0222] 此外，如果需要，可以将非天然氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入到本公开的抗体和/或免疫球蛋白链中。此类氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生氨基酸(designer amino acids)，诸如α-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸类似物。
[0223] 设想用于本公开方法的分离或重组的蛋白质可以包含本文所述的抗MK抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一个实例中，VH和VL以单一多肽链提供。另选地，VH和VL可以单独的多肽链提供。
[0224] 根据其中VH和VL以单一多肽链提供的实例中，本公开的分离或重组的蛋白质可以以下形式提供：
[0225] (i)单链Fv片段(scFv)；
[0226] (ii)二聚体scFv(di-scFv)；或
[0227] (iii)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)和/或(ii)中的至少一者。
[0228] 根据其中VH和VL以单独的多肽链提供的不同实例中，本公开的分离或重组的蛋白质可以以下形式提供：
[0229] (i)双体抗体；
[0230] (ii)三体抗体；
[0231] (iii)四体抗体；
[0232] (iv)Fab；
[0233] (v)F(ab’)2；
[0234] (vi)Fv；或
[0235] (iv)与Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(iii)之一。
[0236] 根据其中本公开的分离或重组的蛋白质是抗体的实例，抗体可以是嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。
[0237] 在一个实例中，分离或重组的蛋白质还可包含选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgA组成的组的人或非人灵长类重链免疫球蛋白恒定区。
[0238] 在优选的实施方案中，本文所述的分离或重组的蛋白质是直接连接至本文所述的免疫球蛋白轻链恒定区的免疫球蛋白轻链可变区。类似地，在进一步优选的实施方案中，本文所述的免疫球蛋白重链可变区直接连接至本文所述的免疫球蛋白重链恒定区。
[0239] 本领域技术人员应理解，免疫球蛋白重链或轻链的可变区和恒定区可以通过以下方式进行如所述的连接：通过使用标准重组DNA技术以创建可以在合适的宿主中表达的多核苷酸(编码连接的可变区和恒定区)(以产生一条或多条所述免疫球蛋白链)或通过使用肽化学来合成连接的可变区和恒定区。
[0240] 根据其中分离或重组的蛋白质是人源化抗MK抗体或其结合片段的实例，人源化抗体或结合片段将保留亲本或前体抗体或片段的很大一部分的结合特性。合适的人源化抗体将保留特异性结合MK蛋白(例如人MK和/或小鼠MK)的能力，所述MK蛋白被用于产生此类抗体的亲本或前体抗体识别。优选地，用于本公开方法的人源化抗体表现出与亲本或前体抗体基本相同或较之改善的结合亲和力和亲合性(avidity)。理想的是，抗体对中期因子的亲和力(KD)将大于亲本抗体对中期因子的亲和力。
[0241] 结合亲和力可以通过缔合(Ka)速率和解离(Kd)速率来确定。平衡亲和常数K是Ka/Kd的比率。缔合(Ka)速率和解离(Kd)速率可以使用表面等离子体共振(SPR)测量(Rich和Myszka,(2000)Curr.Opin.Biotechnol.11:54；Englebienne P,(1998)Analyst.123(7):1599-1603)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的并且是可商购获得的(BiaCore 2000,Biacore AB,Upsala,Sweden；和Malmqvist M(1999),
Biochem.Soc.Trans.27:335-340)。用于测定结合亲和力的方法是本领域所熟知的并且包括半最大结合测定、竞争测定以及Scatchard分析。
Biochem.Soc.Trans.27:335-340)。用于测定结合亲和力的方法是本领域所熟知的并且包括半最大结合测定、竞争测定以及Scatchard分析。
[0242] 如技术人员应理解的，“亲合性”涉及两个分子(例如抗体与抗原)之间的相互作用的总强度。亲合性取决于相互作用的亲和力和效价。此外，“亲和力”涉及分子(例如抗体)的单个结合位点与配体(例如抗原)之间结合的强度。分子X对配体Y的亲和力由解离常数(Kd)表示，解离常数(Kd)是占据溶液中存在的一半X分子的结合位点所需的Y浓度。较小的Kd指示更强或更高的亲和相互作用，并且需要较低浓度的配体来占据这些位点。
[0243] 适用于本公开方法的抗MK抗体也可以是异型缀合抗体。异源缀合抗体主要由两个共价连接的抗体组成。例如，此类抗体已经被提出用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(US 4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO1991/000360；WO1992/200373；EP 586505)。设想可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备所述抗体。
[0244] 可能需要关于效应功能修饰本公开的抗体，以增强例如抗体在治疗本文所述病症(诸如骨质疏松症)中的有效性。例如，可将一个或多个半胱氨酸残基引入到Fc区中，从而允许在这个区中形成链间二硫键。由此生成的同型二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀死性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Caron等人,(1992)J.Exp.Med.,176(4):1191-1195；Shopes B.(1992)J.Immunol.,148(9):2918-2922)。如Wolff等人(1993)中所述，还可使用异型双功能交联剂制备具有增强活性的同型二聚体抗体。另选地，可工程化具有双Fc区的抗体且因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力(Stevenson等人,(1989)JAMA,261:884-888)。
[0245] 用于本公开方法的分离或重组的蛋白质可以通过人的干预产生，例如，如本文所述。在优选的实施方案中，本公开的分离或重组的蛋白质是“基本上纯化的”或“纯化的”。“基本上纯化的”或“纯化的”是指分离或重组的蛋白质，例如，抗体或其结合片段已与天然状态下与之相关联的一种或多种脂质、核酸、其他多肽或其他污染分子分离。优选的是，基本上纯化的多肽至少60％不含、更优选至少75％且更优选至少90％不含与其天然相关联的其他组分。在另一个实施方案中，“基本上纯化的”或“纯化的”意指分子就其所属分子类别而言在其存在的组合物中为主要物质，(即，它构成组合物中至少约50％的分子类型，并且通常构成组合物中的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多的分子种类，例如肽)。
[0246] 结合MK的蛋白质的产生
[0247] 可以使用本领域可获得的方法产生可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质，其实例在本文中描述。
[0248] 抗体的产生
[0249] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质是结合MK的抗体。用于生成抗体的方法在本领域中是已知的并且/或者描述于Harlow和Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,(1988)中。一般来说，在此类方法中，将任选地与任何合适的或所需的载剂、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制的MK蛋白或其免疫原性片段或表位或表达和展示其(即免疫原)的细胞施用于非人动物，例如，小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。免疫原可以鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内方式或通过其他已知途径施用。
[0250] 多克隆抗体的产生可通过在免疫之后在多个点对免疫动物的血液取样来监测。如果需要，可给予一次或多次另外的免疫以获得所需抗体滴度。重复加强和滴定的过程，直至获得合适的滴度。当获得所需水平的免疫原性时，将免疫动物放血且分离并保存血清，并且/或者使用所述动物来生成单克隆抗体(Mab)。
[0251] 单克隆抗体是设想用于本公开方法的MK结合蛋白的一种示例性形式。术语“单克隆抗体”或“MAb”是指能够结合至一种或多种相同抗原(结合至抗原内的相同表位)的同源抗体群。该术语不意图关于抗体的来源或其制备方式进行限制。
[0252] 对于Mab的产生，可以使用许多已知技术中的任何一种，例如像，US 4,196,265或Harlow和Lane(1988)，同上中举例说明的程序。
[0253] 例如，在足以刺激抗体产生细胞的条件下用免疫原免疫合适的动物。啮齿动物诸如兔、小鼠和大鼠是示例性动物。经基因工程化以表达人免疫球蛋白并且例如不表达鼠类免疫球蛋白的小鼠也可用于生成适用于本公开方法的抗体(例如，如WO2002/066630中所述)。
[0254] 免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于生成MAb的方案。这些细胞可以从脾脏、扁桃体或淋巴结的活检中获得，或从外周血样品中获得。然后将来自免疫动物的B细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，所述永生骨髓瘤细胞通常衍生自与用免疫原免疫的动物相同的物种。
[0255] 通过在选择性培养基中培养来扩增杂交体，所述培养基包含阻断组织培养基中核苷酸的从头合成的剂。示例性剂是氨蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。
[0256] 对扩增的杂交瘤进行抗体特异性和/或滴度的功能选择，例如像通过流式细胞术和/或免疫组织化学和/或免疫测定(例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬斑测定、点免疫测定等)。
[0257] 另选地，将ABL-MYC技术(NeoClone,Madison WI 53713,USA)用于产生分泌MAb的细胞系(例如，如Largaespada等人,(1996)J.Immunol.Methods.197:85-95中所述)。
[0258] 还可以通过筛选展示文库(例如噬菌体展示文库)来产生或分离抗体，例如，如US 6,300,064和/或US 5,885,793中所述。
[0259] 嵌合抗体
[0260] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质是结合MK的嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定的物种(例如，鼠类诸如小鼠)或属于特定的抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源。通常嵌合抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区以产生主要具有人结构域的抗体。用于产生嵌合抗体的方法描述于例如US 4,816,567；和US 5,807,715中。
[0261] 本公开还设想了使用嵌合免疫球蛋白，例如，其中将来自一个物种的可变区与来自另一物种的蛋白质区融合。例如，本公开设想了使用包含来自一个物种的T细胞受体的可变区的免疫球蛋白，所述可变区与来自不同物种的T细胞受体恒定域融合。
[0262] 人源化抗体和人抗体
[0263] 在一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质可以是结合MK的人源化的或人的抗体或蛋白质。
[0264] 术语“人源化抗体”应理解为是指嵌合抗体的子类，其具有衍生自非人物种的抗体的抗原结合位点或可变区和基于人抗体的结构和/或序列的剩余抗体结构。抗体结合位点包含来自非人抗体的互补决定区(CDR)和来自人抗体的剩余区，所述互补决定区移植到人抗体可变结构域中的适当FR上。抗原结合位点可为野生型或通过一个或多个氨基酸取代进行修饰。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基由对应的非人残基替换。
[0265] 用于人源化非人抗体或其部分(例如，可变区)的方法在本领域中是已知的。可以按照US 5,225,539或US 5,585,089的方法进行人源化。不排除用于人源化抗体的其他方法。
[0266] 如本文关于抗体所用，术语“人抗体”是指具有衍生自或对应于人(例如人生殖系细胞或体细胞)中存在的序列的可变区(例如VH、VL)和任选的恒定区的抗体。“人”抗体可包括并非由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或定点突变引入的突变(尤其是涉及在抗体的少量残基中，例如在抗体的1、2、3、4或5个残基中、例如在构成抗体的一个或多个CDR的残基中的1、2、3、4或5个中的保守取代或突变的突变)。这些“人抗体”实际上不需要由人产生，相反，它们可以使用重组方式产生和/或从包含编码人抗体恒定区和/或可变区(例如，如上所述)的核酸的转基因动物(例如小鼠)中分离。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库(例如，如US 5,885,793中所述)。
[0267] 识别选择的表位的人抗体也可以使用称为“定向选择”的技术生成。在该方法中，使用选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来指导识别相同表位的完全人抗体的选择(例如，如US 5,565,332中所述)。
[0268] 去免疫化抗体
[0269] 在另一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质可以是结合MK的去免疫化的抗体或蛋白质。去免疫化抗体和蛋白质具有一个或多个被除去(即，突变)的表位，例如B细胞表位或T细胞表位，由此减少哺乳动物将产生针对所述抗体或蛋白质的免疫响应的可能性。用于产生去免疫化的抗体和蛋白质的方法在本领域中是已知的并描述于例如WO2000/034317、WO2004/108158和WO2004/064724中。
[0270] 基于本文的描述，用于引入合适的突变并表达和测定所得蛋白质的方法对于技术人员是显而易见的。
[0271] 重链抗体
[0272] 在另一个实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质可以是结合MK的抗体的重链。重链抗体在结构上与许多其他形式的抗体的不同之处在于它们只要包含重链，但不包含轻链。因此，这些免疫球蛋白也称为“仅重链抗体”。重链免疫球蛋白存在于例如骆驼科动物和软骨鱼(也称为IgNAR)中。
[0273] 存在于天然存在的重链抗体中的可变区通常在骆驼科动物抗体中被称为“VHH结构域”并且在IgNAR中被称为V-NAR，以便将它们与存在于常规4-链抗体中的重链可变区(其被称为“VH结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变区(其被称为“VL结构域”)区分开。
[0274] 对来自骆驼科动物的重链抗体及其可变区的一般描述及其产生和/或分离和/或使用的方法尤其可见于以下参考文献WO1994/004678和WO1997/049805。
[0275] 对来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区的一般描述及其产生和/或分离和/或使用的方法尤其可见于WO2005/118629。
[0276] 抗体片段
[0277] 单结构域抗体
[0278] 在一些实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质是或包括结合MK的单结构域抗体(其与术语“结构域抗体”或“dAb”可互换使用)。单结构域抗体是包含抗体重链可变结构域的全部或一部分的单一多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如US 6,248,516)。
[0279] 双体抗体、三体抗体、四体抗体
[0280] 在一些实例中，可用于本公开方法的结合MK的分离或重组的蛋白质是或包括双体抗体、三体抗体、四体抗体或更高级蛋白质复合物，诸如WO1998/044001和/或WO1994/007921中所述的那些。
[0281] 例如，双体抗体是包含两个缔合多肽链的蛋白质，各多肽链包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是抗体轻链可变区，VH是抗体重链可变区，X是包含不足以允许单一多肽链中的VH和VL缔合(或形成Fv)的残基的接头或是不存在的，并且其中一个多肽链的VH结合至另一多肽链的VL以形成抗原结合位点，即形成能够特异性结合至一个或多个抗原的Fv分子。各多肽链中的VL和VH可以相同或者各多肽链中的VL和VH可以不同以便形成双特异性双体抗体(即，包含两个具有不同特异性的Fv)。
[0282] 能够诱导效应活性的双体抗体、三体抗体、四体抗体等可以使用能够结合至IL-3Rα的抗原结合结构域和能够结合至免疫细胞(例如T细胞)上的细胞表面分子(例如CD3)的抗原结合结构域来产生。
[0283] 单链Fv(scFv)片段
[0284] 在一些实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质是或包括结合MK的scFv片段。技术人员将知道，scFv在单一多肽链中包含VH和VL区并且在VH与VL之间包含多肽接头，所述接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构(即，使得单一多肽链的VH和VL能够彼此缔合以形成Fv)。例如，接头包含超过12个的氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3为更有利用于scFv的接头之一。
[0285] 本公开还设想使用二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中在VH的FR和VL的FR中引入单个半胱氨酸残基并且所述半胱氨酸残基由二硫键连接以产生稳定Fv。
[0286] 另选地或除此之外，本公开设想使用二聚scFv，即包含两个由非共价键或共价键(例如，通过亮氨酸拉链结构域(例如衍生自Fos或Jun))连接的scFv分子的蛋白质。另选地，两个scFv由长度足以允许这两个scFv形成并且结合抗原的肽接头连接，例如像US20060263367中所述。
[0287] 本公开还设想使用能够诱导效应活性的二聚体scFv。在一个实例中，二聚体蛋白质是dAb与scFv的组合。能够诱导效应功能的双特异性抗体片段的实施例描述于例如US 7,235,641中。
[0288] MK结合蛋白的重组表达
[0289] 在一些实例中，可用于本公开方法的分离或重组的蛋白质通过重组技术产生。
[0290] 在重组蛋白的情况下，可将编码其的核酸克隆至表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞，或哺乳动物细胞，诸如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或本来不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。用于表达免疫球蛋白的示例性细胞为CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。用于实现这些目的的分子克隆技术在本领域中是已知的且描述于例如Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience (1988，包括迄今为止的所有更新版)或Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中。多种克隆和体外扩增方法适用于构建重组核酸。产生重组抗体的方法在本领域中也是已知的。参见US 4,
816,567或US 5,530,101。
816,567或US 5,530,101。
[0291] 分离后，将核酸插入可操作地连接至表达构建体或表达载体中的启动子以供进一步克隆(扩增DNA)或在无细胞系统或细胞中表达。
[0292] 如本文所用，术语“启动子”应以其最广义语境来理解且包括基因组基因的转录调控序列，所述转录调控序列包括精确转录起始所需的TATA盒或起始因子元件，有或没有例如响应于发育和/或外部刺激物或以组织特异性方式改变核酸表达的其他调控元件(例如上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本公开的上下文中，术语“启动子”也用于描述重组、合成或融合核酸，或赋予、激活或增强其所可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可以含有一个或多个特定调节元件的额外拷贝以进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
[0293] 如本文所用，术语“可操作地连接至”意指相对于核酸定位启动子以使所述核酸的表达受所述启动子控制。
[0294] 可获得许多用于在细胞中表达的载体。载体组分通常包括但不限于以下中的一个或多个：信号序列、编码免疫球蛋白的序列(例如源于本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。技术人员将知道适用于表达免疫球蛋白的序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如单纯疱疹gD信号)。
[0295] 在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延长因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂交调控元件。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
[0296] 适合在酵母细胞(例如像选自包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)的组的酵母细胞)中表达的典型启动子包括但不限于ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
[0297] 用于将分离的核酸或包含所述核酸的表达构建体引入到细胞中以供表达的方式对于本领域技术人员来说是已知的。用于指定细胞的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入到细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染(诸如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA))以及其他方式。
[0298] 用于产生免疫球蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养，取决于所用细胞类型。可商购获得的培养基，诸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMl-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma)适于培养哺乳动物细胞。用于培养本文所述的其他细胞类型的培养基在本领域中是已知的。
[0299] MK结合蛋白的分离/纯化
[0300] 根据本公开方法使用的MK结合蛋白优选是分离的，且更优选以基本上纯化的形式提供。用于分离和纯化抗体和蛋白质的方法在本领域中是已知的并且/或者在本文中描述。
[0301] 在抗体或抗体片段被分泌到培养基中时，来自此类表达系统的上清液通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩。可在任何前述步骤中包含蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解并且可包含抗生素以防止外来污染物的生长。
[0302] 可以使用例如离子交换、羟磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱(例如蛋白质A亲和色谱或蛋白质G色谱)或前述方法的任何组合来纯化从细胞中制备的抗体和抗体片段。这些方法在本领域中是已知的并且例如描述于WO1999/057134或Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)中。
[0303] 技术人员还将知道，可对本公开的蛋白质，例如像抗体或其片段进行修饰以包含标签以有利于纯化或检测，所述标签例如聚组氨酸标签，例如六聚组氨酸标签，或流感病毒血球凝集素(HA)标签，或猿猴病毒5(V5)标签，或FLAG标签，或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。然后使用本领域中已知的方法(诸如亲和纯化)对所得蛋白进行纯化。例如，包含六聚组氨酸标签的免疫球蛋白可通过以下方式来纯化：使包含免疫球蛋白的样品与固定在固体或半固体支持物上的特异性结合六聚组氨酸标签的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)接触，洗涤样品以除去未结合的抗体并随后洗脱结合的抗体。另选地或除此之外，在亲和纯化方法中使用结合标签的配体或抗体。
[0304] 缀合物
[0305] 根据本公开使用的分离或重组的蛋白质可以作为如本文中根据任何实施方案所述的蛋白质(例如抗体或其结合片段)的缀合物提供。例如，可以对本公开的分离或重组的蛋白质进行修饰以包含本领域中已知且容易获得的其他非蛋白质性部分。优选地，适用于蛋白质衍生化的部分是生理学上可接受的聚合物，优选水溶性聚合物。此类聚合物可用于增加稳定性和/或降低清除率(例如，肾脏的)和/或用于降低本公开蛋白质的免疫原性。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或丙二醇(PPG)。
[0306] 在一个实例中，根据任何实施方案的如本文所述的分离或重组的蛋白质与另一种蛋白质缀合或连接，所述另一种蛋白质包括本公开的另一种蛋白质或包含抗体可变区的蛋白质，诸如抗体或由其衍生的蛋白质，例如，如本文所述。不排除其他蛋白质。其他蛋白质对于技术人员来说是显而易见的并且尤其包括例如免疫调节剂或延长半衰期的蛋白质或与血清白蛋白结合的肽或其他蛋白质。
[0307] 示例性血清白蛋白结合肽或蛋白质描述于US20060228364或US20080260757中。
[0308] 在一个实例中，根据本公开使用的分离或重组的蛋白质包含一种或多种可检测的标记物以有利于检测和/或分离。例如，化合物包含荧光标记，例如像荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7、荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)。这些荧光剂的吸收和发射最大值分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm；672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)。
[0311] 测定蛋白质的MK结合活性
[0312] 体外功能测定
[0313] 为了适用于本公开方法，分离或重组的蛋白质必须与MK结合，并从而抑制或降低MK活性和/或阻断MK的生物信号的传递。因此，可以进行一种或多种功能测定以确定候选蛋白质(例如抗体或其片段)与人MK的结合特异性和亲和力，从而确定该蛋白质在本公开方法中使用的适合性。
[0314] 各种体外测定可用于评估本公开的重组或分离的蛋白质(诸如抗体)结合MK蛋白和/或抑制或降低MK活性和/或治疗骨疾病/病症和/或增加骨愈合的适合性。
[0315] 例如，可以通过ELISA评估抗体或结合蛋白与人MK的结合特异性和亲和力。以这种方式，可以确定候选抗体的解离常数(Kd)。
[0316] 在另一个实例中，候选蛋白质或抗体的“Kd”或“Kd值”可以通过放射性标记的MK结合测定(RIA)测量，以确定其在本公开方法中的适用性。这个测定使得在滴定系列的未标记的MK蛋白存在下测试蛋白质或抗体与极低浓度的放射性MK蛋白平衡。洗涤去除未结合的MK蛋白后，测定放射性的量，所述量指示测试蛋白或抗体的Kd。
[0317] 根据另一个实例，通过使用表面等离子体共振分析，例如使用BIAcore表面等离子体共振(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)用固定的IL-3Rα来测量“Kd”或“Kd值”。
[0318] 在又另一个实例中，可使用趋化性测定来评估本公开的分离或重组的蛋白质阻断MK蛋白质与其受体结合和/或抑制与MK与其受体结合相关联的功能的能力。这些测定基于化合物(化学引诱物)诱导的细胞在体外或体内的功能性迁移。可通过任何合适的方式评估趋化性，例如，利用96孔趋化板的测定，或使用其他本领域公认的评估趋化性的方法。
[0319] 一般来说，趋化性测定监测合适细胞朝向化合物的增加水平、从屏障(例如，内皮、过滤器)的第一表面朝向相反的第二表面进入或通过屏障的定向运动或迁移。膜或过滤器提供了便利的屏障，使得可以监测合适细胞朝向化合物的增加水平、从过滤器的第一表面朝向过滤器的相反的第二表面进入或通过过滤器的定向运动或迁移。在一些测定中，将膜用诸如ICAM-1、纤连蛋白或胶原的物质包被以有利于粘附。此类测定提供体外近似的细胞“归巢”。
[0320] 例如，可以检测或测量对细胞在合适容器(容纳装置)中从第一室进入或通过微孔膜而进入第二室的迁移的抑制，所述第二室含有化学引诱物，例如中期因子蛋白和待测试的抗体，并且与第一室由膜隔开。选择具有合适孔径用于监测响应于化合物的特异性迁移的合适膜，例如硝化纤维、聚碳酸酯。例如，可以使用约3-8微米且优选约5-8微米的孔径。过滤器上的孔径可以是均匀的或在合适孔径范围内。
[0321] 为了评估迁移和对迁移的抑制，可以使用标准技术(例如，显微镜和流式细胞术)确定迁移进过滤器的距离、跨过过滤器仍粘附到过滤器的第二表面的细胞数量，和/或聚集于第二室的细胞数量。在一个实施方案中，用可检测的标记(例如，放射性同位素、荧光标记、抗原或表位标记)标记细胞，并且可以通过使用适当的方法(例如，通过检测放射性、荧光、免疫测定)确定粘附至膜和/或出现于第二室的标记的存在性来评估在存在和不存在候选抗体时的迁移。可以相对于合适的对照(例如，相比于不存在抗体时测定的背景迁移、相比于第二化合物(即标准物)诱导的迁移程度相比、相比于抗体诱导的未转染细胞的迁移)确定诱导或抑制的迁移程度。
[0322] 在一个实施方案中，将与MK蛋白结合或能够迁移至MK蛋白的细胞群置于细胞培养装置的室中，所述室与包含MK蛋白(化学引诱物)的另一个室液体连通。两个室由合适的膜，例如模拟受试者体内存在的细胞外基质的膜隔开。在存在或不存在候选蛋白质或抗体时评估通过膜从一个室到另一个室的细胞迁移量。与对照样品(不含蛋白质或抗体)相比，预防或减少MK介导的细胞迁移量的蛋白质或抗体被认为具有MK抑制活性。
[0323] 对于技术人员显而易见的是，筛选方法可涉及在与候选蛋白质一起温育后检测体外破骨细胞增殖水平，或候选蛋白质减少MK诱导的分化相关基因和β-连环蛋白调控基因表达降低和LRP-6磷酸化降低的能力，例如，如本文实施例3中所述。此类方法在本领域是已知的。
[0324] 体内功能测定
[0325] 在另一个实例中，可以使用体内测定评估分离或重组的蛋白质抑制或降低MK活性或表达的功效及其根据本公开方法治疗骨病症/疾病和/或损伤的相应有用性。
[0326] 例如，可以将候选蛋白质施用至患有骨折的非人哺乳动物，例如，如实施例1中所述的已经历截骨术的小鼠。根据该实例，结合MK并且相对于未施用蛋白质的对照动物中的骨折愈合速率加速骨折愈合速率的候选蛋白质被认为适合于在本文所述方法中治疗骨损伤(诸如骨折)和/或增加骨愈合。
[0327] 在另一个实例中，本公开的候选蛋白质可以施用至骨质疏松症的非人哺乳动物(例如鼠类)模型，诸如实施例2中描述的OVX小鼠模型。根据该实例，与施用候选蛋白质之前的症状和/或未施用候选蛋白质的对照哺乳动物相比，在哺乳动物受试者中例如通过增加BMD、BV/TV和/或骨厚度来减少或缓解或改善与骨质疏松症相关联的至少一种症状的所述候选蛋白质被认为适合于治疗所述疾病或病症。
[0328] 组合物
[0329] 适当地，在用于向哺乳动物施用本公开的分离或重组的蛋白质或缀合物的组合物或方法中，分离或重组的蛋白质或缀合物是与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂组合，如本领域中所理解。因此，本公开的一个实例提供包含分离或重组的蛋白质或其缀合物与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂的组合的药物组合物。另选地，本公开的分离或重组的蛋白质或缀合物可根据本领域已知的冻干法和重构技术来冻干以便储存和在使用前在合适的载剂中重构。
[0330] 在另一个实例中，本公开提供了药盒，其包括适于在施用至哺乳动物之前与分离或重组的蛋白质或缀合物组合或混合的药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。例如，本公开的分离的或重组的蛋白质或缀合物可以冻干形式提供以便在施用至哺乳动物之前与药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂组合或混合。在该实例中，药盒可以进一步包括例如根据本公开方法的使用说明书。
[0331] 一般来说，“载剂、稀释剂或赋形剂”意指可以安全地施用至任何哺乳动物(例如人)的固体或液体填充剂、粘合剂、稀释剂、囊封物质、乳化剂、湿润剂、溶剂、悬浮剂、包衣或润滑剂。根据特定施用途径，可以使用本领域中已知的多种可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，例如像Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)中所述。
[0332] 仅举例来说，载剂、稀释剂或赋形剂可以选自包括以下的组：糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、油类(包括植物油、合成油和合成单甘油酯或二甘油酯)、低级醇、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、润滑剂(诸如硬脂酸钠或硬脂酸镁)、等渗盐水和无热原质水。例如，载剂、稀释剂或赋形剂与肠胃外施用相容或适于肠胃外施用。肠胃外施用包括不经过消化道的任何施用途径。肠胃外施用的非限制性实例包括注射、输注等。举例来说，注射施用包括静脉内、动脉内、肌肉内和皮下注射。还设想通过可以例如皮内、肌肉内和皮下方式递送的储库型或缓释制剂进行递送。
[0333] 骨相关疾病、病症和损伤
[0334] 如本文所述，本公开提供了在受试者中促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加BMD的方法，所述方法包括向受试者施用包含特异性结合MK蛋白的抗体的抗原结合结构域的分离或重组的蛋白质、所述分离或重组的蛋白质的缀合物或包含其的组合物，如本文所述。因此，本公开的方法可特别适用于在受试者中治疗或预防其中希望促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加BMD的骨相关疾病、病症、疾患和/或损伤。
[0335] 待治疗的受试者可以选自以下：
[0336] (i)具有骨折的受试者；
[0337] (ii)已经历或将经历手术程序以创建骨的受试者；
[0338] (iii)已经历或将经历手术程序以促进骨科植入物或硬件与相邻骨整合的受试者；以及
[0339] (iv)罹患或易患骨质疏松症的受试者。
[0340] 如本文所用，术语“骨折”包括单纯骨折、青枝骨折、有创骨折、粉碎性(多块)骨折、嵌入骨折、复杂性骨折、丝状骨折、压缩性骨折、疲劳性骨折和/或病理性骨折。可以通过本公开方法有利地治疗的骨折的实例包括但不限于脊柱、腿部和臂部的骨折。根据本公开有利地治疗的骨折的另一个实例是脊椎压缩性骨折。当脊柱的一个或多个骨骨折或塌陷时，通常当脊椎已例如由于衰老或弱化骨的疾病(诸如骨质疏松症、佩吉特氏病或骨癌)而弱化时，这种骨折发生。
[0341] 如本文所用，“创建骨的手术程序”包括修复骨折的手术程序、用于融合椎骨的手术程序(例如脊柱融合术)，或包括例如对全关节成形术期间的植入物、骨折修复期间使用的骨螺钉、用于锚定肌腱或韧带的骨螺钉，或被设计用于机械稳定骨科手术部位的任何骨科硬件的整合的手术程序。类似地，“用于促进骨科植入物或硬件与相邻骨的整合的手术程序”包括对全关节成形术期间的植入物、骨折修复期间使用的骨螺钉、用于锚定肌腱或韧带的骨螺钉，或被设计用于机械稳定骨科手术部位的任何骨科硬件的整合。
[0342] 如本文所述，已显示施用本公开的分离或重组的蛋白质增加小鼠(包括OVX小鼠)中的BMD、BV/TV和厚度。因此，本公开的方法可特别用于治疗罹患骨质疏松症或易患骨质疏松症的受试者。骨质疏松症可以是原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症、成骨不全或特发性幼年骨质疏松症。
[0343] 在继发性骨质疏松症的情况下，骨质疏松症状可能是另一种疾患，例如甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进、白血病或晚期癌症的结果，或导致骨丢失或分解的另一种疾患的治疗结果，所述治疗例如皮质类固醇、甲状腺替代疗法或芳香酶抑制剂(如用于治疗乳腺癌)。因此，本公开方法可以用作组合疗法以防止骨质丢失或分解和/或防止可能变得易受骨质丢失或分解的受试者的骨破裂。
[0344] 剂量和方案
[0345] 对于预防或治疗如本文所述的骨相关疾病、病症和/或损伤，活性剂(例如，本公开的蛋白质或缀合物)的适当剂量将取决于待治疗的具体疾病、病症和/或损伤、疾病、病症和/或损伤的严重性和病程、所施用的活性剂是用于预防还是治疗目的、患者接受的先前疗法、患者的临床病史和对活性剂的响应以及主治医师的判断。通常，将施用治疗有效量的MK结合蛋白或缀合物。短语“治疗有效量”是指足以促进、诱导和/或增强所治疗受试者的治疗或其他治疗效果的量。治疗有效量应足够大以产生所需效果，但不应大到引起不良副作用。特定给药方案(即剂量、时程和重复性)将取决于特定个体和如医师所评估的所述个体的医学病史。通常，临床医生将施用活性剂(例如，MK结合蛋白或包含其的缀合物)直至达到实现所需结果的剂量。
[0346] 一般来说，剂量将随着患者的年龄、状况、性别和疾病、病症和/或损伤的程度而变化且可由本领域技术人员来确定。如果发生任何并发症，剂量可由个别医师调整。对于体内施用本文所述的MK结合蛋白或缀合物，正常剂量可在每天每公斤个体体重约10ng至约100mg或更高范围内变化。示例性剂量及其范围在本文中描述。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据待治疗的疾病、病症或损伤的严重性，可以持续治疗直至实现所需症状抑制或治疗。
[0347] 在一些实例中，如本文所述的MK结合蛋白或缀合物是以约1mg/kg至约30mg/kg之间，诸如约1mg/kg至约10mg/kg，或约2mg/kg或约3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg的初始(或负载)剂量施用。MK结合蛋白或缀合物可接着以约0.0001mg/kg至约1mg/kg之间，诸如约0.0005mg/kg至约1mg/kg，例如约0.001mg/kg至约1mg/kg，诸如约0.005mg/kg至约1mg/kg，例如约0.1mg/kg至约1mg/kg，诸如约0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.4mg/kg或0.5mg/kg的维持剂量施用。维持剂量可每7-30天施用一次，诸如每10-15天施用一次，例如每10天或11天或12天或13天或14天或15天施用一次。
[0348] 用于特定MK结合蛋白或缀合物的剂量可以在已给予一次或多次相应的MK结合蛋白或缀合物施用的哺乳动物体内凭经验确定。为了评估本公开的MK结合蛋白或缀合物的剂量功效，可以在施用后监测所治疗的疾病、疾患或损伤(例如骨质疏松症和/或骨折)的临床症状。例如，可以使用本领域已知的测试(例如，μCT(微计算机断层扫描)或Dexa-Scan(双能X射线吸收测定法或DEXA))基于治疗后患者的BMD来评估本公开的MK结合蛋白或缀合物的剂量在治疗骨质疏松症中的功效。在另一个实例中，可以通过射线照相术或本领域已知的其他方法评估本公开的MK结合蛋白或缀合物的剂量在治疗骨折中的功效，即通过评估骨折愈合和/或骨折连接(factureunion)的阶段。
[0349] 根据例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的和熟练从业人员已知的其他因素，根据本公开方法对MK结合蛋白或缀合物的施用可以是连续的或间断的。MK结合蛋白或缀合物的施用可以在一个预选时间段内基本上是连续的或可以是以一系列间隔的剂量进行。
[0350] 多种施用途径是可能的，包括但不限于口服、膳食、局部、肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮下注射)、吸入(例如，支气管内、眼内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)，这取决于待治疗的骨疾病、病症、疾患和/或损伤。其他合适的施用方法还可包括可再装载或可生物降解的装置和缓释聚合物装置。
[0351] 组合疗法
[0352] 在本文所述方法的一个实例中，将所述的分离或重组的蛋白质或缀合物或组合物与可用于促进骨形成和/或促进骨愈合和/或增加BMD的另一种化合物一起施用，作为组合或附加的治疗步骤或作为治疗性制剂的附加组分。
[0353] 例如，其他化合物可以是双膦酸盐，例如像阿仑膦酸盐(Foxamax)、利塞膦酸钠(Actonel)、伊班膦酸钠(Boniva)或唑来膦酸(Reclast或Aclasta)。另选地或除此之外，其他化合物可以是皮质类固醇，例如泼尼松或可的松。另选地或除此之外，其他化合物可以是地诺单抗(denosumab)(Prolia)。另选地或除此之外，其他化合物可以是雷尼酸锶(Protos)。另选地或除此之外，其他化合物可以是选择性雌激素受体调节剂(SERMS)，诸如雷洛昔芬(Evista)。另选地或除此之外，其他化合物可以是激素替代疗法(HRT)中使用的药物，诸如雌激素或孕酮。另选地或除此之外，其他化合物可以是特立帕肽(Forteo)。另选地或除此之外，其他化合物可以是非甾族抗炎剂或镇痛药。例如，合适的非甾体抗炎剂可以是布洛芬、萘普生或选自酮洛芬、吲哚美辛(Indocin或Tivorbex)、非诺洛芬(Nalfon)的COX-1和/或COX-2抑制剂。
[0354] 本发明现将参照以下非限制性实施例来更具体地描述。
[0355] 实施例
[0356] 实施例1-中期因子抗体对成年型骨折愈合的影响
[0357] 在该实施例中，本发明人评价了皮下施用的抗中期因子抗体对成年小鼠中骨折愈合的影响。
[0358] 方法
[0359] 动物
[0360] 在该实验中使用的所有小鼠是由乌尔姆大学(University of Ulm)提供的雌性C57BL/6J小鼠。将小鼠以每笼(370cm2)2至4只动物的组维持在14h光照和10h黑暗的昼夜节律中，随意进食水和食物。
[0361] 治疗
[0362] 简而言之，将9月龄小鼠随机分成两组，即第1组(n＝X)和第2组(n＝X)，并且使用0.4mm Gigli锯(RISystem,Davos,Switzerland)使每只动物在右股骨中段处接受标准化的截骨术，所述右股骨使用外固定器(轴向刚度为3.0N/mm，RISystem)稳定化。手术后立即开始治疗。将组1中的动物用抗中期因子抗体IP-10治疗，所述抗中期因子抗体IP-10以25mg/kg皮下施用，每周两次，持续3周。使用媒介物磷酸盐缓冲盐水(PBS)平行治疗第2组的动物。
将来自第1组和第2组中的每组的动物在手术后第4天、10天、21天或28天使用二氧化碳处死(在每个时间点每组n＝6-8)。从在手术后0、4、10或21天处死的小鼠收集血液样品。从所有小鼠取出骨折股骨和完整股骨以用于进一步的分析。
将来自第1组和第2组中的每组的动物在手术后第4天、10天、21天或28天使用二氧化碳处死(在每个时间点每组n＝6-8)。从在手术后0、4、10或21天处死的小鼠收集血液样品。从所有小鼠取出骨折股骨和完整股骨以用于进一步的分析。
[0363] 血清分析
[0365] 生物力学测试
[0366] 对在第21、23或28天处死的小鼠的完整股骨和骨折股骨的生物力学测试使用如等人,(2010)J.Orthop.Res.,28:1456-1462中所述的非破坏性3点弯曲测试进行。简而言之，在移除固定器后，将弯曲负荷(最大4N)施加到颅外侧骨痂侧的顶部。使用负荷-变形曲线的斜率计算骨的弯曲刚度。将骨折股骨的相对弯曲刚度计算为同一小鼠的骨折股骨与完整股骨之间的比。
[0367] 微计算机断层扫描(μCT)
[0368] 使用以8μm的体素分辨率运行的μCT扫描装置(Skyscan 1172，Kontich,Belgium)(50kV，200mA)分析来自小鼠的股骨。确定4个目标体积(VOI)用于μCT分析：VOI 1覆盖骨折皮质之间的骨痂并且VOI 2覆盖两个内针孔之间的骨外膜骨痂。VOI 3(完整皮质骨)覆盖距完整股骨的骨干中间近侧80μm至距完整股骨的骨干中间远侧80μm的区域。VOI 4(完整的小梁骨)的起点距完整股骨的干骺端生长板近侧200μm，并且终点距起始点近侧280μm。VOI 5覆盖第二腰椎椎体的小梁部分。使用两个体模(phantom)评估骨矿密度(BMD)，在每次扫描内使用限定的羟基磷灰石密度(250mg/cm3和750mg/cm3)。在没有阈值的情况下评价骨折骨痂的BMD，而根据Morgan等人,(2009)Bone,44(2):225-244中描述的方法使用642mg羟基磷灰石/cm3的全局阈值确定皮质骨的BMD。使用395mg羟基磷灰石/cm3的全局阈值评价小梁骨的BMD，如Wehrle等人,(2014)J.Orthop.Res.,32(8):1006-1013和O’Neill等人,(2012)Bone,50:1357-67中所述。根据美国骨与矿物质研究学会(American Society for Bone and Mineral Research，ASBMR)提出的用于μCT分析的指南使用Skyscan软件(NRecon,DataViewer,CTAn)进行骨参数分析，如Bouxsein等人,(2010)J.Bone Miner.Res.,25(7):1468-1486中所述。
[0369] 未脱钙股骨的组织形态计量学
[0370] 使用在第21天和第28天外植的骨折股骨的未脱钙组织切片来确定两个内针孔之间的整个骨痂中的骨、软骨和纤维组织的量。简而言之，将股骨在4％福尔马林中固定、在浓度递增的乙醇系列中脱水并包埋在甲基丙烯酸甲酯中。制备7μm的横截面并使用Giemsa染色以用于组织形态计量学分析。使用光学显微术(DMI6000B，Leica,Heerbrugg,Switzerland)检查骨痂组织。使用图像分析软件(Leica MMAF 1.4.0成像系统，Leica)测定骨、软骨和纤维组织的量。为了鉴定成骨细胞和成骨细胞表面，制备7μm的横截面并使用甲苯胺蓝染色并以400倍放大倍数分析。如Heilmann等人,(2013)PLoSOne,8(12):e84232中所述那样使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色来鉴定破骨细胞数量。
[0371] 脱钙股骨的组织形态计量学和免疫组织化学
[0372] 将在手术后4天、10天或21天处死的小鼠的股骨在4％福尔马林中固定、用20％乙二胺四乙酸(pH 7.2-7.4)脱钙10-12天，并在浓度递增的乙醇系列中脱水后包埋在石蜡中。制备厚度为7μm的纵截面并使用番红(Safranin)O进行染色以进行组织定量。对中期因子和β-连环蛋白的免疫组织化学染色使用以下抗体进行：多克隆山羊抗小鼠Mdk抗体(sc-1398，Santa Cruz Biotechnology,Dallas,USA)、多克隆兔抗小鼠β-连环蛋白抗体(AB19022，EMD Millipore Corporation,Merck,Darmstadt,Germany)、HRP缀合的链霉亲和素(Zytomed Systems,Berlin,Germany)、驴抗山羊IgG F(ab')2生物素缀合的(sc-3854，Santa Cruz Biotechnology)和山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,ThermoFisher Scientific,Waltham,USA)。将物种特异性非靶向免疫球蛋白用作同种型对照。将3-氨基-9-乙基咔唑(Zytomed Systems)用作色原体并且使用苏木精(Waldeck,Münster,Germany)对切片进行复染。使用图像分析软件Adobe Photoshop CS4(Adobe,Dublin,Ireland)针对β-连环蛋白进行阳性染色区域的定量。用颜色拾取工具并以40公差测定阳性染色的色域。在直方图中对阳性染色的像素计数并将其相对于图像的所有像素计算，以确定阳性染色区域的百分比。
[0373] 统计分析
[0374] 使用用SPSS软件(SPSS Inc.,Chicago,USA)的非参数曼-惠特尼U检验进行使用9月龄小鼠进行的实验的统计分析。所有结果均以带有中位数、第一四分位数和第三四分位数以及最大值和最小值的箱形图表示。将异常值(值小于第一四分位数减去四分位距范围的1.5倍或大于第三四分位数加上四分位距范围的1.5倍)标记为小圆圈。p<0.05的值被认为是统计学上显著的。
[0375] 结果
[0376] 用抗中期因子抗体治疗增加了成年小鼠骨折骨痂的机械能力和骨形成
[0377] 生物力学测试证实，与对照组相比，在愈合21天和28天后，用抗中期因子抗体治疗显著增加9月龄小鼠骨折股骨相对弯曲刚度(图1，A和B)。此外，与对照组相比，骨折骨痂的μCT分析揭示在愈合21天和28天后骨体积/组织体积(BV/TV)提高(图1，C和D)。骨痂大小和几何形状在骨折愈合的中间时间点即第21天未受影响(图1，E和G)，而在愈合28天后用抗中期因子抗体治疗的动物中TV显著更低(图1F)，这指示这些小鼠中的早期重塑阶段。
[0378] 骨折骨痂组织组成的组织形态计量学分析显示，用抗中期因子抗体治疗的动物在10天和21天后展示出新形成的骨量显著增加(图2)。在骨折愈合后期(第28天，数据未显示)，未观察到骨折骨痂组成的显著差异。
[0379] 通过用抗中期因子抗体治疗在骨折骨痂成骨细胞和软骨细胞中差异性实现中期因子蛋白表达
[0380] 由于已显示中期因子蛋白在骨折愈合过程中在若干种细胞类型中表达，因此本发明人还分析了用抗中期因子抗体治疗对中期因子表达的影响(图3)。
[0381] 在手术后第4天，显示中期因子蛋白在骨折骨痂的骨外膜区域中表达，所述表达通过用抗中期因子抗体治疗而减弱。在媒介物治疗的小鼠中，中期因子蛋白表达在手术后10天达到峰值。所述蛋白质位于增殖性软骨细胞和肥大软骨细胞的细胞内并位于新骨形成区域的细胞外。在骨外膜骨折骨痂的血管周围，中期因子蛋白表达明显增强，所述增强通过抗中期因子抗体治疗减弱。在媒介物治疗小鼠和抗体治疗小鼠中，在软骨细胞中细胞内检测到中期因子蛋白。在第21天，仅在分散的软骨细胞中观察到中期因子蛋白的表达，并且在新骨形成的区域中其表达非常低。在此时间点媒介物治疗小鼠与抗体治疗小鼠之间没有差异。
[0382] 截骨术增加了中期因子蛋白的血清水平
[0383] 因为在第1组与第2组中的动物之间鉴定出骨折骨痂中新血管形成区域中的中期因子表达的显著差异，所以本发明人研究了截骨术之前和之后的中期因子血清水平。
[0384] 在第0天的未治疗小鼠在血清中仅展示出低水平的中期因子蛋白。在对照动物中，血清中期因子蛋白水平在第4天增加一倍以上(58-68pg/ml)，并在第10天达到峰值(78-91pg/ml)，到第21天恢复到术前水平(表1)。
[0385] 表1. 9月龄小鼠中骨折愈合期间的中期因子(Mdk)血清水平。
[0386]
[0387] #对于骨折的影响p＜0.05
[0388] ＊对于Mdk-Ab影响p＜0.05
[0389] n.d.：无法检测到的；d0：术前值。(每组的n＝3-7表示为平均值±标准偏差。)曼-惠特尼U检验。
[0390] 与媒介物治疗的小鼠相比，用抗中期因子抗体治疗使血清中的中期因子蛋白水平在第4天略微降低并且在第10天显著降低。
[0391] 用抗中期因子抗体治疗增加了β-连环蛋白表达和成骨细胞活性
[0392] 由于已显示中期因子影响成骨细胞中的Wnt/β-连环蛋白信号传导(Liedert等人,(2011)Bone,48:945–951)，所以本发明人评价了用抗中期因子抗体的治疗对骨折愈合期间的β-连环蛋白信号传导的影响。在骨折后第10天对增殖性软骨细胞和成骨细胞进行针对β-连环蛋白的免疫组织化学染色(图4A)，而肥大软骨细胞是β-连环蛋白阴性的。在第10天，在用抗中期因子抗体治疗的动物的骨折骨痂中β-连环蛋白阳性区域的百分比显著增加(图4B)。
[0393] 因为先前已显示中期因子缺乏小鼠未展示出骨折骨痂中破骨细胞或成骨细胞的数量差异(Haffner-Luntzer等人,(201)PLoSOne,9(12):e116282)，所以在第1组和第2组的动物的骨折骨痂中分析破骨细胞或成骨细胞的数量，以确定用抗中期因子抗体治疗的效果。在第21天，两组中破骨细胞的数量类似(图4C)，而抗体治疗后成骨细胞的数量仅略微增加(p＝0.151；图4D)。相比之下，用抗中期因子抗体治疗后成骨细胞表面显著增加(图4E)，这表明成骨细胞活性增强。在第28天，抗体治疗的小鼠中破骨细胞的数量略微增加(p＝0.082；图4F)，这表明骨痂重塑更快。
[0394] 实施例2-中期因子抗体对年幼和骨质疏松小鼠中骨折愈合的影响
[0395] 由于骨质疏松症患者展示出降低的骨愈合能力和延迟的骨折愈合，因此本发明人评价了用抗中期因子抗体的治疗对年幼和骨质疏松小鼠的骨折愈合的影响。
[0396] 方法
[0397] 动物
[0398] 在该实验中使用的所有小鼠是由乌尔姆大学提供的雌性C57BL/6J小鼠。将小鼠以每笼(370cm2)2至4只动物的组维持在14h光照和10h黑暗的昼夜节律中，在整个实验中随意进食水和无植物雌激素饮食。
[0399] 治疗
[0400] 简而言之，将3月龄小鼠随机分成两组，使所述两组分别进行双侧假手术或卵巢切除术(OVX)。如Wehrle等人,(2014)J.Orthop.Res.,32(8):1006-1013中所述那样进行假手术和OVX。在接受假手术或OVX后8周，使用0.4mm Gigli锯(RISystem,Davos,Switzerland)使动物在右股骨中段处接受标准化的截骨术，所述右股骨使用外固定器(轴向刚度为3.0N/mm，RISystem)稳定化。截骨术后立即开始治疗。在治疗期间，使假手术组中的一半动物和OVX组中的一半动物接受抗中期因子抗体IP-10，所述抗中期因子抗体IP-10以25mg/kg皮下施用，每周两次，持续3周。使用媒介物磷酸盐缓冲盐水(PBS)平行治疗假手术组和OVX组中的剩余动物。将来自四组中的每组的动物在截骨术后第0天、3天、10天和23天使用二氧化碳处死(在每个时间点每组n＝6-7)。从在每个时间点处死的小鼠采集血液样品。从所有小鼠取出骨折股骨和完整股骨以及腰椎椎体以用于进一步的分析。
[0401] 血清分析
[0402] 使用人中期因子酶联免疫吸附测定试剂盒(由Cellmid Ltd提供)根据制造商的方案测定每只动物的中期因子蛋白质血清水平，所述试剂盒与鼠类中期因子交叉反应。
[0403] 生物力学测试
[0404] 对在第23天处死的小鼠的完整股骨和骨折股骨的生物力学测试使用如等人,(2010)J.Orthop.Res.,28:1456-1462中所述的非破坏性3点弯曲测试进行。简而言之，在移除固定器后，将弯曲负荷(最大4N)施加到颅外侧骨痂侧(carnio-lateral callus side)的顶部。使用负荷-变形曲线的斜率计算骨的弯曲刚度。将骨折股骨的相对弯曲刚度计算为同一小鼠的骨折股骨与完整股骨之间的比。
[0405] 微计算机断层扫描(μCT)
[0406] 使用以8μm的体素分辨率运行的μCT扫描装置(Skyscan 1172，Kontich,Belgium)(50kV，200mA)分析来自小鼠的股骨和椎体。确定4个目标体积(VOI)用于μCT分析：VOI 1覆盖骨折皮质之间的骨痂并且VOI 2覆盖两个内针孔之间的骨外膜骨痂。VOI 3(完整皮质骨)覆盖距完整股骨的骨干中间近侧80μm至距完整股骨的骨干中间远侧80μm的区域。VOI 4(完整的小梁骨)的起点距完整股骨的干骺端生长板近侧200μm，并且终点距起始点近侧280μm。VOI 5覆盖第二腰椎椎体的小梁部分。使用两个体模评估骨矿密度(BMD)，在每次扫描内使用限定的羟基磷灰石密度(250mg/cm3和750mg/cm3)。在没有阈值的情况下评价骨折骨痂的BMD，而根据Morgan等人,(2009)Bone,44(2):225-244中描述的方法使用642mg羟基磷灰石/
3 3
cm的全局阈值确定皮质骨的BMD。使用395mg羟基磷灰石/cm的全局阈值评价小梁骨的BMD，如Wehrle等人,(2014)J.Orthop.Res.,32(8):1006-1013和O’Neill等人,(2012)Bone,50:
1357-67中所述。根据美国骨与矿物质研究学会(ASBMR)提出的用于μCT分析的指南使用Skyscan软件(NRecon,DataViewer,CTAn)进行骨参数分析，如Bouxsein等人,(2010)J.Bone Miner.Res.,25(7):1468-1486中所述。
3 3
cm的全局阈值确定皮质骨的BMD。使用395mg羟基磷灰石/cm的全局阈值评价小梁骨的BMD，如Wehrle等人,(2014)J.Orthop.Res.,32(8):1006-1013和O’Neill等人,(2012)Bone,50:
1357-67中所述。根据美国骨与矿物质研究学会(ASBMR)提出的用于μCT分析的指南使用Skyscan软件(NRecon,DataViewer,CTAn)进行骨参数分析，如Bouxsein等人,(2010)J.Bone Miner.Res.,25(7):1468-1486中所述。
[0407] 未脱钙股骨的组织形态计量学
[0408] 使用在截骨术后第23天外植的骨折股骨的未脱钙组织切片来确定两个内针孔之间的整个骨痂中的骨、软骨和纤维组织的量。简而言之，将股骨在4％福尔马林中固定、在浓度递增的乙醇系列中脱水并包埋在甲基丙烯酸甲酯中。制备7μm的横截面并使用Giemsa染色以用于组织形态计量学分析。使用光学显微术(DMI6000B，Leica,Heerbrugg,Switzerland)检查骨痂组织。使用图像分析软件(LeicaMMAF 1.4.0成像系统，Leica)测定骨、软骨和纤维组织的量。为了鉴定成骨细胞和成骨细胞表面，制备7μm的横截面并使用甲苯胺蓝染色并以400倍放大倍数分析。如Heilmann等人,(2013)PLoS One,8(12):e84232中所述那样使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色来鉴定破骨细胞数量。
[0409] 脱钙股骨的组织形态计量学和免疫组织化学
[0410] 将在截骨术后3天或10天处死的小鼠的股骨在4％福尔马林中固定、用20％乙二胺四乙酸(pH 7.2-7.4)脱钙10-12天，并在浓度递增的乙醇系列中脱水后包埋在石蜡中。制备厚度为7μm的纵截面并使用番红O进行染色以进行组织定量。对中期因子和β-连环蛋白的免疫组织化学染色使用以下抗体进行：多克隆山羊抗小鼠中期因子抗体(sc-1398，Santa Cruz Biotechnology,Dallas,USA)、多克隆兔抗小鼠β-连环蛋白抗体(AB19022，EMD Millipore Corporation,Merck,Darmstadt,Germany)、HRP缀合的链霉亲和素(Zytomed Systems,Berlin,Germany)、驴抗山羊IgG F(ab')2生物素缀合的(sc-3854，SantaCruz Biotechnology)和山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Waltham,USA)。将物种特异性非靶向免疫球蛋白用作同种型对照。将3-氨基-9-乙基咔唑(Zytomed Systems)用作色原体并且使用苏木精(Waldeck,Münster,Germany)对切片进行复染。使用图像分析软件Adobe Photoshop CS4(Adobe,Dublin,Ireland)针对β-连环蛋白进行阳性染色区域的定量。用颜色拾取工具并以40公差测定阳性染色的色域。在直方图中对阳性染色的像素计数并将其相对于图像的所有像素计算，以确定阳性染色区域的百分比。
[0411] 统计分析
[0412] 使用克鲁斯凯-沃利斯检验和邓恩氏事后检验(Dunn’s post hoc test)分析使用假手术/OVX小鼠进行实验的统计分析的显著性。所有结果均以带有中位数、第一四分位数和第三四分位数以及最大值和最小值的箱形图表示。将异常值(值小于第一四分位数减去四分位距范围的1.5倍或大于第三四分位数加上四分位距范围的1.5倍)标记为小圆圈。p<0.05的值被认为是统计学上显著的。
[0413] 结果
[0414] 用抗中期因子抗体治疗加速了骨质疏松性骨折愈合
[0415] 生物力学测试确认，OVX显著降低媒介物治疗的小鼠的相对弯曲刚度。用抗中期因子抗体治疗使相对弯曲刚度在假手术组中略微增加并且在OVX组中显著增加(图5A)。骨折骨痂的μCT分析证实，OVX后BV/TV降低并且抗体治疗后BV/TV提高(图5B)。骨痂大小和几何形状不受OVX或中期因子Ab治疗的影响(图5，C和D)。骨折骨痂组织组成的组织形态计量学分析显示在手术后第10天治疗组之间没有显著差异(图5，E-G)。然而，在第23天，骨折骨痂骨含量在OVX后显著降低并且用抗中期因子抗体治疗时显著逆转(图5，E和H)。在用抗中期因子抗体治疗后，OVX小鼠中的纤维组织含量显著降低(图5，G和H)。
[0416] 用抗中期因子抗体治疗降低骨质疏松小鼠的Mdk血清水平
[0417] 骨折后第0天、3天、10天和23天的中期因子蛋白血清水平呈现于表2。明显的是，在第0天，没有一只小鼠具有可检测的循环中期因子蛋白。3天后，骨折增加了假手术小鼠和OVX小鼠中的中期因子蛋白血清水平。然而，中期因子蛋白血清水平仅在OVX小鼠中保持升高直至第23天。在第10天，用抗中期因子抗体处理使得OVX动物中的中期因子蛋白血清水平显著降低。
[0418] 表2：3月龄假手术小鼠和卵巢切除(OVX)小鼠中骨折愈合期间的中期因子(Mdk)血清水平；n.d.：无法检测到的。d0：术前值。(每组的n＝5-7表示为平均值±标准偏差。)克鲁斯凯-沃利斯检验。
[0419]
[0420] #对于OVX的影响p＜0.05
[0421] ＊对于Mdk-Ab影响p＜0.05
[0422] 用抗中期因子抗体治疗消除了OVX诱导的β-连环蛋白表达降低
[0423] 与第10天的假手术动物相比，OVX显著减少了年幼小鼠骨折骨痂中的β-连环蛋白阳性区域(图6)。用抗中期因子抗体治疗并未改变假手术小鼠中的β-连环蛋白表达，而在OVX小鼠中β-连环蛋白阳性面积百分比显著增加。
[0424] 用抗中期因子抗体治疗提高了骨质疏松小鼠的完整股骨和椎体中的骨含量[0425] 因为用抗中期因子抗体治疗显著提高了OVX小鼠骨痂中的骨含量，所以还研究了对完整骨的影响。抗体治疗增加了OVX动物的完整股骨中的皮质BMD(图7A)，而皮质厚度在所有组中均未受影响(图7B)。对完整股骨的小梁区的评价确认了OVX小鼠中的骨质疏松表型；在媒介物治疗的小鼠中，小梁BV/TV和数量显著减少。用抗中期因子抗体治疗显著增加OVX小鼠中的小梁BMD、BV/TV和厚度(图7，C-G)。假手术小鼠的骨参数在抗体治疗后仅略微增加。
[0426] 与股骨一致，OVX还导致媒介物治疗的小鼠的椎体中的小梁BV/TV和数量减少(图8)。用抗中期因子抗体治疗显著增加OVX动物中的椎骨小梁BMD、BV/TV和厚度(图8，B-D)。在假手术小鼠中，抗体治疗对脊柱小梁骨的影响大于对股骨小梁骨的影响；通过用抗中期因子抗体治疗显著改善了小梁BMD和厚度，而在假手术动物中小梁BV/TV和数量保持不变(图
8，C和E)。
8，C和E)。
[0427] 实施例3-使用抗中期因子抗体处理细胞减弱了中期因子对体外β-连环蛋白信号传导的消极影响
[0428] 基于在小鼠中在骨折愈合期间用抗中期因子抗体治疗后成骨细胞活性增强的发现，本发明人试图确定用中期因子蛋白或抗中期因子抗体的处理在体外的MC3T3-E1细胞、ATDC5细胞、C57BL/6原代成骨细胞和C57BL/6间充质干细胞中的影响。
[0429] 方法
[0430] 细胞培养条件
[0431] 从Sigma-Aldrich,Germany获得前成骨MC3T3-E1细胞并且将其在α-最低必需培养基(Gibco,ThermoFisher Scientific)中培养，所述α-最低必需培养基含有10％胎牛血清(FCS)(PAA Laboratories, Germany)、1％青霉素/链霉素(Gibco)和1％L-谷氨酰胺(Biochrom,Merck)。通过向培养基中加入10mMβ-甘油磷酸盐和0.2mM抗坏血酸-2-磷酸盐(两者均得自Sigma-Aldrich)诱导成骨分化。将细胞分别以20,000个细胞/cm2接种在6孔板或24孔板中以用于增殖和分化实验。在循环拉伸实验中，将细胞以每培养皿200,000个细胞涂铺在FCS包被的硅培养皿中。
[0432] 从Sigma-Aldrich获得ATDC5软骨祖细胞并将其在杜尔贝科氏改良型伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和汉姆氏(Ham’s)F12培养基的1:1混合物中培养，所述1:1混合物含有5％FCS(PAA Laboratories)、1％青霉素/链霉素(Gibco,ThermoFisher Scientific)、1％L-谷氨酰胺(Biochrom,Merck)、10μg/ml人转铁蛋白和3x
10-8M亚硒酸钠(两者均得自Sigma-Aldrich)，如Shukunami等人,(1996)J.Cell Biol.,133:
457-468中所述。将细胞以10,000个细胞/cm2接种在6孔板中。通过使正常培养基补充有10μg/ml人胰岛素(Sigma-Aldrich)和5ng/ml人转化生长因子β1(R&D Systems,Minneapolis,USA)来诱导成软骨分化。
10-8M亚硒酸钠(两者均得自Sigma-Aldrich)，如Shukunami等人,(1996)J.Cell Biol.,133:
457-468中所述。将细胞以10,000个细胞/cm2接种在6孔板中。通过使正常培养基补充有10μg/ml人胰岛素(Sigma-Aldrich)和5ng/ml人转化生长因子β1(R&D Systems,Minneapolis,USA)来诱导成软骨分化。
[0433] 从3-4日龄WT C57BL/6小鼠获得鼠类原代成骨细胞，并将其根据Schmidt等人,(2005)J.Cell Biol.,168:899-910中所述的条件培养。将原代成骨细胞以每培养皿200,000个细胞接种在FCS包被的硅培养皿中、通过向培养基中加入10mMβ-甘油磷酸盐和0.2mM抗坏血酸-2-磷酸盐进行分化21天并暴露于周期性拉伸。
[0434] 通过冲洗6周龄C57BL/6小鼠的长骨分离骨髓来源(mMSC)，将其通过塑料粘附选择并如Huebner等人,(2006)J.Bone Miner.Res.21:1924-1934中所述进行培养。将细胞以每孔7,500个细胞接种于24孔板中，并通过向培养基中加入10mMβ-甘油磷酸盐和0.2mM抗坏血酸-2-磷酸盐进行分化10天。所有实验一式两份或一式三份地进行三次。
[0435] 在每种情况下，向指定细胞培养物的培养基中加入100ng/ml重组中期因子蛋白(Dianova,Hamburg,Germany)和2μg/ml抗中期蛋白抗体。
[0436] 所有实验一式两份地进行三次。
[0437] 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定
[0438] 使用MTT测定来测定MC3T3-E1细胞和鼠类MSC的增殖。简而言之，将细胞以每孔3,000个细胞接种在96孔板中，持续24小时，然后向指定孔加入10μl 12mM MTT、100ng/ml中期因子蛋白和/或抗中期因子抗体(2μg/ml)并且温育6小时。除去上清液并加入150μl二甲基亚砜(DMSO)。摇荡10分钟后，测定490nm处的吸光度，并计算与未处理细胞相比的增殖速率。
[0439] 体外机械负载
[0440] 通过均匀周期性拉伸在分化的第14或21天进行MC3T3-E1细胞和原代成骨细胞的机械负载，如Kaspar等人,(2000)J.Biomech.33:45-51中所述。施加2％的正弦应变和1Hz的频率，持续30分钟。在机械负载前30分钟加入重组中期因子蛋白(100ng/ml)和/或抗中期因子抗体(2μg/ml)。对照培养皿平行制备而不负载。
[0441] 实时-RT-PCR
[0442] 将细胞在含有10μl/mlβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,Germany)中裂解。使用QIAshredder柱匀浆裂解物并且使用RNeasy Mini试剂盒(两者均得自Qiagen)分离总RNA，而使用不含RNA酶的DNA酶试剂盒(Qiagen)消化DNA。所有步骤均根据制造商的方案进行。根据制造商的说明书，使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)以20μl总体积将1μg总RNA逆转录成cDNA。根据制造商的方案，使用Brilliant Sybr Green QPCR预混试剂盒(Brilliant Sybr Green QPCR Master Mix Kit，Stratagene,Amsterdam,Netherlands)以25μl总体积进行定量PCR。将甘油醛3-磷酸脱氢酶用作管家基因(F：5′-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3′和R：5′-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3)。使用针对碱性磷酸酶的特异性引物(Alpl；F：5′-GCT GAT CAT TCC CAC GTT TT-3’和R：5′-GAG CCA GAC CAA AGA TGG AG-3’)分析骨原细胞分化。使用LinRegPCR软件，使用具有PCR效率校正的Δ-ΔCT方法计算相对基因表达，如Ramakers等人,(2003)Neuroscience Letters,339:62-66中所述。
[0443] 蛋白质印迹分析
[0444] 使用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离10μg细胞裂解物蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜(BioRad,Hercules,USA)。将膜在4℃下分别与针对α-微管蛋白、cFOS、β-连环蛋白、磷酸-β-连环蛋白(Ser33/37/Thr41)(所有均得自Cell Signaling,MerckMillipore,Darmstadt,Germany)、碱性磷酸酶(R&D Systems)、LRP-1(Abcam)、LRP-6、磷酸化-LRP-6(两者均得自Cell Signaling)或Mdk(Santa Cruz Biotechnologies)的抗体一起温育过夜。为了使蛋白质可视化，将膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗一起温育，并在SuperSignalWest Pico化学发光底物(Perbio Science,ThermoFisher Scientific)中显色。使用融合分子成像系统(Vilber Lourmat,Eberhardzell,Germany)可视化蛋白质条带。
[0445] 共免疫沉淀
[0446] 将细胞在6孔板中分化5天，并与中期因子蛋白在冰冷的PBS中一起温育1小时。在室温下加入交联剂溶液(10mM DSP)，持续30分钟。将细胞与终止液(1M Tris)一起温育15分钟、洗涤两次，并使用IP-裂解缓冲液(Pierce,ThermoFisher Scientific)裂解。通过在4℃下以12,000g离心10分钟除去细胞碎片。将与山羊IgG或山羊抗中期因子抗体(Santa Cruz Biotechnology)偶联的蛋白A-琼脂糖珠加入到溶液中并在4℃下一起温育过夜。将复合物以12,000g离心1分钟并用裂解缓冲液洗涤。通过在SDS样品缓冲液(125mM Tris/HCl+8.5％甘油+1％SDS+0.1％DTT)中在96℃下温育5分钟并在37℃下温育30分钟，从珠中裂解蛋白质复合物。通过蛋白质印迹可视化共免疫沉淀的蛋白质。
[0447] 结果
[0448] 使用MTT测定评价中期因子蛋白和抗中期因子抗体对MC3T3-E1细胞增殖的影响。在中期因子蛋白或抗中期因子抗体刺激6h后，各组之间未观察到差异(图9A)。然而，在分化的第5天，用重组中期因子蛋白刺激显著下调碱性磷酸酶(Alpl)和cFOS表达(图9，B和C)。用抗中期因子抗体进行的附加处理消除了中期因子诱导的作用。
[0449] 为了分析中期因子蛋白对成骨细胞对机械刺激的响应的影响，将MC3T3-E1细胞暴露于周期性拉伸(图9D)。重组Mdk下调机械诱导的这些细胞对cFos的基因表达，而与抗中期因子抗体的另外温育显著减弱了这种作用。
[0450] 为了研究骨折愈合期间推定的中期因子受体，使用用中期因子蛋白刺激的鼠类软骨祖细胞(chondroprogenic)ATDC5细胞和骨原(osteoprogenic)MC3T3-E1细胞进行免疫沉淀。有趣的是，先前描述的细胞内中期因子相互作用蛋白LRP-1和核仁蛋白(Sakamoto等人,(2011)J.Biol.Chem.,286:8405-13；Lee等人,(2012)J.Cell Physiol.227:1731-9；Take等人,(1994)J.Biochem.16:1063-1068)仅在ATDC5细胞中与中期因子蛋白免疫沉淀，而典型的Wnt信号传导受体LRP-6(Li等人,(2002)J.Biol.Chem.277:5977-81)在两种细胞类型中均与中期因子蛋白免疫沉淀(图9E)。在MC3T3-E1细胞中外源性中期因子蛋白质增加了沉淀的LRP-6蛋白的量(图9E)。基于该发现，如上所述研究了LRP-6在中期因子诱导的对这些细胞的影响中的作用。显示在中期因子蛋白刺激6h后LRP-6磷酸化降低(图9F)。另外，在中期因子蛋白刺激后，总β-连环蛋白和活性β-连环蛋白表达降低，这些作用被抗中期因子抗体减弱。
[0451] 接下来，在从C57BL/6小鼠分离的颅骨原代成骨细胞和mMSC中进行中期因子蛋白免疫沉淀。同样，显示LRP-6与中期因子蛋白共免疫沉淀(图9G)。基于该发现，评估了中期因子蛋白和抗中期因子抗体对原代细胞的影响。已证实，在原代成骨细胞中的重组中期因子蛋白处理也下调机械诱导的cFos基因表达，而与抗中期因子抗体的另外温育显著减弱了这种作用(图10A)。将mMSC与重组中期因子蛋白一起温育没有改变增殖速率(图10)，而Alpl表达降低(图10C)，所述降低同样地通过用抗中期因子抗体处理消除。
[0452] 实施例4-用抗中期因子抗体的治疗对雌激素缺乏小鼠中的早期免疫响应和骨折愈合的影响
[0453] 已知骨折愈合在处于雌激素缺乏情况下的绝经后的骨质疏松女性中延迟。还已知雌激素缺乏会影响伤口愈合期间的免疫系统和炎症响应。由于平衡的免疫响应是为适当的骨愈合所需的，因此本发明人试图确定雌激素耗尽对小鼠中的早期免疫响应的影响。本发明人假设雌激素缺乏增加骨折后的早期免疫反应并且炎症介质，诸如中期因子(其是促炎细胞因子和骨重塑的负调节子)可能参与该作用。为了检验这一假设，本发明人分析OVX小鼠和假手术小鼠的骨折血肿中免疫细胞和炎性细胞因子的存在。本发明人还确定了用抗中期因子抗体治疗对OVX小鼠和假手术小鼠中的早期免疫响应和骨折愈合的影响。
[0454] 方法
[0455] 动物
[0456] 在该实验中使用的所有小鼠是由乌尔姆大学提供的雌性C57BL/6J小鼠。将小鼠以每笼(370cm2)2至4只动物的组维持在14h光照和10h黑暗的昼夜节律中，在整个实验中随意进食水和无植物雌激素饮食。
[0457] 治疗
[0458] 简而言之，将3月龄至4月龄小鼠随机分成两组，根据实施例2中所述的方法使所述两组分别进行双侧假手术或卵巢切除术(OVX)。在接受假手术或OVX后8周，使用0.4mm Gigli锯(RISystem,Davos,Switzerland)使动物在右股骨中段处接受标准化的截骨术，所述右股骨使用外固定器(轴向刚度为3.0N/mm，RISystem)稳定化。截骨术后立即开始治疗以评价中期因子对骨折骨痂的影响。在治疗期间，使假手术组中的一半动物和OVX组中的一半动物接受抗中期因子抗体IP-10，所述抗中期因子抗体IP-10以25mg/kg皮下施用，每周两次，持续3周。使用媒介物磷酸盐缓冲盐水(PBS)平行治疗假手术组和OVX组中的剩余动物。将来自四组中的每组的动物在截骨术后0天、3天或23天使用二氧化碳处死(在每个时间点每组n＝5-6)。从所有小鼠取出骨折股骨和完整股骨以及子宫以用于进一步的分析。
[0459] 微计算机断层扫描(μCT)
[0460] 使用以8μm的体素分辨率运行的μCT扫描装置(Skyscan 1172，Kontich,Belgium)(50kV，200mA)分析在第23天处死的小鼠的股骨。使用两个体模评估骨矿密度(BMD)，每个体模在每次扫描内使用限定的羟基磷灰石密度(250mg/cm3和750mg/cm3)。如Morgan等人,(2009)Bone,44(2):225-244中所述使用642mg羟基磷灰石/cm3的全局阈值并且如Bouxsein等人,(2010)J.Bone Miner.Res.,25(7):1468-1486中所述根据美国骨与矿物质研究学会(ASBMR)提出的用于μCT分析的指南进行非矿化组织与矿化组织之间的鉴别。使用CTvol软件(Bruker)进行两个内针孔之间的骨折骨痂的三维(3D)重建。
[0461] 荧光激活的细胞分选(FACS)分析
[0462] 为了分析骨折血肿中的炎性细胞，进行FACS分析。截骨术后第1天，收获骨折股骨和对侧骨髓。使用手术剪刀收集骨折血肿。使用PBS冲洗对侧骨髓。将骨折血肿通过70-μm细胞滤网(CorningInc.,Durham,NC)以获得单细胞悬浮液，并对骨折血肿和骨髓的细胞进行红细胞溶解。将表3中列出的抗体用于鉴定巨噬细胞(Ly6G-、F4/80+、CD11b+)、中性粒细胞(Ly-6G+、F4/80-、CD11b+)、炎性单核细胞(F4/80+、Ly-6G+、CD11b+)、B淋巴细胞(CD19+)、T淋+ + + + +巴细胞(CD3)、细胞毒性T淋巴细胞(CD3、CD8)和T辅助淋巴细胞(CD3、CD4)。使用特异性同种型匹配的免疫球蛋白抗体(表3)作为阴性对照。将细胞(骨折血肿：分离细胞总数；骨髓：1×106个细胞)与抗体在冰上一起温育30分钟。使用7-氨基放线菌素(7-AAD，Sigma,Steinheim,Germany)进行死细胞鉴别。使用LSR II流式细胞仪(BDBioscience)和FlowJo软件v10(FlowJo LLC,Ashland,OR)分析细胞。
[0463] 表3.用于流式细胞术的抗体
[0464]
[0465] 脱钙股骨的组织形态计量学和免疫组织化学
[0466] 将在截骨术后3天或10天处死的小鼠的股骨在4％福尔马林中固定、用20％乙二胺四乙酸(pH 7.2-7.4)脱钙10-12天，并在浓度递增的乙醇系列中脱水后包埋在石蜡中。制备厚度为7μm的纵截面。使用表4中指定的抗体进行IL-6、中期因子、CCL2、CXCL1、Ly6G(中性粒细胞)、CD45R(B淋巴细胞)、CD8(细胞毒性T淋巴细胞)和F4/80(巨噬细胞)的免疫组织化学染色和免疫荧光染色。将物种特异性非靶向免疫球蛋白用作同种型对照。将3-氨基-9-乙基咔唑(Zytomed Systems)用作色原体并且使用苏木精(Waldeck,Münster,Germany)对切片进行复染。将FITC-链霉亲核素用于免疫荧光染色，并使用DAPI对切片进行复染。通过光学或荧光显微术(DMI6000B，Leica,Heerbrugg,Switzerland)检查切片。通过图像分析软件(LeicaMMAF 1.4.0成像系统，Leica)测定骨痂组织的量和阳性染色细胞的数量。
[0467] 表4.用于免疫组织化学的抗体
[0468]
[0469] 统计分析
[0470] 使用SPSS软件(SPSS Inc.,Chicago,IL)，使用关于正态分布的Shapiro-Wilk检验和ANOVA/LSD事后检验进行统计分析。所有结果均以平均值和标准偏差表示。p<0.05的值被认为是统计学上显著的。在每个时间点，样品大小为每组n＝5-6。
[0471] 结果
[0472] OVX诱导的骨质疏松症和延迟的骨折愈合
[0473] 如所预期的，经受卵巢切除术的小鼠的子宫展示出严重的萎缩(图11A)和显著减少的重量(图11B)。完整股骨的μCT分析证实了小梁腔室中的骨质疏松表型(图11C)。在第23天对骨折骨痂的分析显示由于OVX导致骨性骨痂发育显著受扰和皮质桥接不良(图11D)。
[0474] OVX增加了骨折血肿中的中性粒细胞数量
[0475] 将如通过FACS分析确定的在手术后第1天骨折血肿中免疫细胞的存在示出在图12A和图12B中。在这个时间点，在骨折部位先天性免疫系统和适应性免疫系统的细胞群在假手术小鼠与OVX小鼠之间没有显著差异。然而，OVX小鼠显著增加了B淋巴细胞的数量并减少了骨髓中T淋巴细胞的数量(图12C)。在T淋巴细胞群中，细胞毒性T细胞显著减少，而T辅助细胞显著增加(图12D)。此外，炎性单核细胞和巨噬细胞的数量没有受到影响，而中性粒细胞的数量显著增加。
[0476] 骨折后3天，通过免疫组织化学评价骨折骨痂中的免疫细胞。OVX小鼠在骨外膜骨痂中展示出显著更大数量的中性粒细胞(图13A)。中性粒细胞主要存在于纤维组织周围的骨折间隙以及早期骨外膜骨折骨痂中(图14)。主要位于截骨间隙附近的骨髓中的巨噬细胞的数量在各组之间没有显著差异(图13B)。位于骨外膜骨折骨痂中的B淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞的数量没有差异(图13C和D)。
[0477] OVX增加骨折骨痂中的中期因子和IL-6表达
[0478] 通过免疫染色分析骨痂中的中期因子的局部表达，研究中期因子在骨折愈合的炎性阶段期间的作用。在第3天，中期因子在OVX小鼠的骨折骨痂中表达(图15)。蛋白质位于从血肿组织到截骨间隙近侧的软骨折骨痂的骨外膜过渡区。在假手术动物中，中期因子表达较少。
[0479] 由于已知中期因子表达与IL-6表达相关联并且因为IL-6是中性粒细胞募集的强力诱导物，因此还通过免疫染色评价了IL-6表达。在假手术小鼠中，IL-6在肌肉组织和骨内膜细胞中表达，但在骨外膜细胞中表达较少，而OVX小鼠在与骨折间隙相邻的骨外膜细胞中表达增加(图15)。
[0480] 由于假设OVX后中期因子表达的上调可能涉及骨外膜骨痂中的中性粒细胞数量的增加，因此评价了用抑制性中期因子抗体治疗的效果。与未治疗的小鼠相比，在手术后直接用抑制性中期因子抗体治疗的小鼠在骨折骨痂中展示出显著更低数量的中性粒细胞(图13A)，而巨噬细胞、B淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞的数量没有显著改变(图13B-D)。此外，用抑制性中期因子抗体治疗的OVX小鼠在骨折间隙旁边的骨外膜细胞中表现出较低的IL-6表达(图15)。促炎细胞因子CCL2和CXCL1的蛋白质表达在各组之间类似(图15)。
[0481] 结论
[0482] 这项研究的结果证实，骨折后1天OVX小鼠骨髓中B淋巴细胞数量增加，而骨髓中性粒细胞和总T淋巴细胞的数量减少但CD4+/CD8+细胞的比率增加。由于已知B淋巴细胞合成了若干种炎性细胞因子，以及最近的发现表明它们是RANK/RANKL/OPG系统的活性调控子，因此该数据支持了在绝经期间B淋巴细胞数量增加与骨丢失之间存在强关联的结论。
[0483] 由于B淋巴细胞和T淋巴细胞以及中性粒细胞影响骨折愈合结果，因此在早期骨折血肿中还评价了这些细胞的数量。在创伤后第1天OVX小鼠和假手术小鼠之间没有观察到差异，但在骨髓中的细胞群是不同的。该发现表明炎性细胞向骨折骨痂的初始募集不受雌激素缺乏的影响。然而，在骨折后第3天，雌激素缺乏小鼠的骨外膜骨痂中存在显著更多的中性粒细胞，这表明在不存在雌激素时骨折部位的中性粒细胞的募集延长和/或存活增加。这些数据表明，促炎细胞因子中期因子可能参与雌激素缺乏对骨折愈合的炎性阶段的影响。
[0484] 在实施例2中描述的研究中，显示在骨折后第3天至第23天，雌激素缺乏小鼠中的中期因子血清水平增加。在这项研究中，显示在骨折后第3天OVX小鼠骨折骨痂中的中期因子的局部表达增加。由于已知中期因子可以化学吸引中性粒细胞和巨噬细胞，因此提出，中期因子表达的增加可能参与OVX小鼠中骨折骨痂处中性粒细胞的存在的延长。为了支持该结论，在用抗中期因子抗体治疗后观察到显著减少的中性粒细胞数量。然而，没有观察到CXCL1表达的显著变化，CXCL1是中性粒细胞募集最重要的蛋白质之一。
[0485] 先前的研究显示，中期因子缺乏小鼠在缺血性肾损伤后在肾小管间质中展示出较少数量的中性粒细胞和巨噬细胞(Sato等人,(2001)J.Immunol.,167:3463-3469)并且中期因子缺乏延迟了在愈合的再生阶段期间巨噬细胞至到骨折部位的募集。然而，在本研究中，没有检测到巨噬细胞数量或单核细胞趋化蛋白1(CCL2)表达的显著变化。另外，虽然证实了中期因子在体外调控B细胞存活，但没有检测到骨折骨痂中B淋巴细胞或T淋巴细胞数量的变化。在此基础上，雌激素缺乏小鼠的早期骨折骨痂中的中期因子表达增加似乎主要影响中性粒细胞的募集和存活。
[0486] 在文献中，描述了若干种促炎细胞因子参与雌激素缺乏受试者中炎性病症的严重性增加。这些细胞因子之一是IL-6，其被称为募集炎性细胞的关键因子(Jones等人,(2006)J .I nf e ct .Di s . ,1 93 : 36 0 - 36 9 ；R os e -J o h n S : (2 01 5)BestPract.Res.Clin.Endocrinol.Metab.29:787-797)。另外，若干项研究已证实，雌激素缺乏小鼠中组织损伤后IL-6表达增加(Aydin等人 ,(2015)Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.,117:173-179；Shivers等人,(2015)Cytokine,72:121-129)。在本研究中，相对于假手术小鼠，在OVX小鼠的骨外膜细胞中观察到更高的IL-6表达，但IL-6表达在用抗中期因子抗体治疗的假手术小鼠和OVX小鼠中均减弱。在此基础上，得出结论：
由于缺乏雌激素而增加的IL-6表达可能造成OVX小鼠骨折骨痂中的中性粒细胞数量增加，并且阻断中期因子导致IL-6减少并逆转中性粒细胞至骨折部位的募集。
由于缺乏雌激素而增加的IL-6表达可能造成OVX小鼠骨折骨痂中的中性粒细胞数量增加，并且阻断中期因子导致IL-6减少并逆转中性粒细胞至骨折部位的募集。
[0487] 总之，这项研究证实，雌激素缺乏显著影响骨折后的早期炎性阶段。骨折部位处较高的中期因子和IL-6表达与骨痂中的中性粒细胞数量的增加相关联。相反，用抗体中和中期因子减少中性粒细胞和IL-6的丰度，这与如实施例2中所观察到的加速骨质疏松小鼠中的骨折愈合相对应。
[0488] 本领域技术人员应理解，在不脱离本公开的广泛总体范围的情况下，可对上文所述的实施方案进行各种变型和/或修改。因此，本实施方案在所有方面应视为说明性的而非限制性的。
[0489] 本文所论述和/或参考的所有出版物都整体并入本文。
[0490] 对文件、法案、材料、装置、物品等的已包括在本说明书中的任何论述都仅出于提供本发明上下文的目的。不应视为认可的是任何或所有这些事项因为在本申请的各权利要求的优先日期之前存在而形成为先前技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的普通常识。
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