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纤维蛋白溶解的双反应性的有效的Kunitz抑制剂

阅读：289发布：2022-01-22

专利汇可以提供纤维蛋白溶解的双反应性的有效的Kunitz抑制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了涉及新型纤溶酶抑制多肽的组合物和方法，所述新型纤溶酶抑制多肽为人TFPI-2Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)的结构变体。所述多肽是有效的纤溶酶抑制剂，并且在某些实施方案中具有抗纤维蛋白溶解活性和/或与野生型TFPI-2KD1相比具有降低的抗凝血活性，而且不具有高免疫原性。所述纤溶酶抑制多肽可用作抗癌剂、抗纤维蛋白溶解剂、蛋白酶抑制剂，并且可用于其它情况。，下面是纤维蛋白溶解的双反应性的有效的Kunitz抑制剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.纤溶酶抑制多肽，其包括通式(I)的多肽：
N-Y-J-Z-C (I)其中：
(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端，且由独立选自天然和非天然氨基酸的0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 或
51-60个氨基酸组成；
(b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；
(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制
剂结构域(KD1)多肽；
(d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：
(i)通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是
独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基
酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(iii)通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5
是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(iv)通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然
和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基区多肽，其中X3和X6是独
立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，且X6是任意天然或非天然氨基酸，和
(vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的KD1羧基区多肽，其中X3、X6
和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨基酸；
(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端，且由独立选自天然和非天然氨基酸的0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 或
51-60个氨基酸组成；并且
(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶的活性。
2.如权利要求1所述的纤溶酶抑制多肽，其选自：
(a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)的KD1羧基区多肽，其中X3和X4
是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然
和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(c)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，
其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是
选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)的
KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或
W；
(f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1
羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(g)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨
基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；和
(h)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID
NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或
W。
3.如权利要求1所述的纤溶酶抑制多肽，其选自：
(a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，其中X3是E且X4是P]的式(II)
的KD1羧基区多肽；
(b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的KD1羧基区多肽；
(c)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVP[SEQ ID NO:20]的式(IV)的KD1羧基区多肽；
(d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:21]的式(V)的KD1羧基区多肽；
(e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，其中X3是E且X4是P]的式(II)的KD1羧基区多肽；
(f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是
具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的KD1羧
基区多肽；
(g)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是
具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVP[SEQ ID NO:20]的
式(IV)的KD1羧基区多肽；和
(h)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J
是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:21]的
式(V)的KD1羧基区多肽。
4.不多于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、
84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64或63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其包含SEQ ID NO:3-18、22-29以及32-35中任一项所示氨基酸序列，其中所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。
5.60或61个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑
制多肽的氨基酸序列至少96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：
(a)N是所述纤溶酶抑制多肽的氨基端；
(b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；
(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制
剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID NO:1
第17位处的氨基酸X2是R，并且SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位处分别存在半胱
氨酸残基；
(d)Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨
基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和
(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。
6.63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑
制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：
(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；
(b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；
(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制
剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID NO:1
第17位处的氨基酸X2是R，并且SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位处分别存在半胱
氨酸残基；
(d)Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和
X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；
(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和
(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。
7.61、62、63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤
溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：
(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；
(b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；
(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制
剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID NO:1
第17位处的氨基酸X2是R，并且SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位处分别存在半胱
氨酸残基；
(d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：
(i)通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是
独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基
酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(iii)通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5
是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(iv)通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然
和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，
(v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基区多肽，其中X3和X6是独
立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，且X6是任意天然或非天然氨基酸，和
(vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的KD1羧基区多肽，其中X3、X6
和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨基酸；
(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和
(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。
8.如权利要求1、4、5、6和7中任一项所述的纤溶酶抑制多肽，与具有SEQ ID NO:19所
示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制
剂结构域(KD1)相比，其具有降低的抗凝血活性。
9.融合蛋白，其包括与融合多肽结构域融合的权利要求1-7中任一项所述的纤溶酶抑
制多肽。
10.药物组合物，其包括权利要求9的融合蛋白以及生理可接受的载体。
11.组合物，其包括权利要求1-7中任一项所述的纤溶酶抑制多肽，所述纤溶酶抑制多
肽与聚亚烷基二醇相连以形成PAG化的多肽。
12.如权利要求11所述的组合物，其中聚乙二醇是所述聚亚烷基二醇，并且所述PAG化
的多肽是PEG化的多肽。
13.分离的多核苷酸，其包括编码权利要求1的纤溶酶抑制多肽的核酸序列。
14.表达载体，其包括权利要求13的多核苷酸。
15.宿主细胞，其用权利要求14的表达载体转化或转染。
16.产生权利要求1的纤溶酶抑制多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)将权利要求15的宿主细胞在一定条件下培养一段时间，足以允许所述纤溶酶抑制
多肽的表达；和
b)将所述纤溶酶抑制多肽从培养的宿主细胞中分离。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞表达的纤溶酶抑制多肽包括N-末
端甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，并且其中所述宿主细胞在一定条件下表达甲硫氨酸氨肽
酶(MAP)一段时间，足以使所述MAP将N-末端甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸从纤溶酶抑制
多肽上去除。
18.药物组合物，其包含：
a)权利要求1-7中任一项所述的纤溶酶抑制多肽；和
b)生理可接受的载体。
19.抑制纤溶酶活性的方法，其包括：
在一定条件下，将(i)纤溶酶与(ii)权利要求1-7中任一项的纤溶酶抑制多肽相接触
一段时间，足以使所述纤溶酶抑制多肽与所述纤溶酶结合，并因此抑制纤溶酶活性。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述接触步骤发生在体外。
21.对需要抑制纤溶酶活性的个体进行治疗的方法，其包括向所述个体施用有效量的
权利要求1-7中任一项的纤溶酶抑制多肽或者施用有效量的权利要求13的分离的多核苷
酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述个体患有癌症、血友病、风湿性关节炎或全身
 炎症反应综合征(SIRS)，或有疑似处于患有这些疾病的风险，或者所述个体需要或正在接受血管生成、骨再建或冠状动脉旁路移植术(CABG)。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述个体正在接受手术或近期已接受过手术。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述手术为心血管手术、肿瘤手术、泌尿生殖器手
术、骨科手术、胸部手术、整形手术、创伤手术、腹部手术、移植手术、神经外科手术或者耳鼻喉科手术。
25.分离包含Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)的纤溶酶抑制多肽的方法，其
包括：
(a)在一定条件下，将(i)固定化有失活的纤溶酶的固相与(ii)包含含有Kunitz型蛋
白酶第一抑制剂结构域(KD1)的纤溶酶抑制多肽和杂质的样品相接触一段时间，足以使所述KD1与失活的纤溶酶结合；
(b)在不破坏KD1-纤溶酶结合的条件下洗涤所述固相，以去除杂质；和
(c)将所述KD1从所述固相上洗脱，并因此将含有所述KD1的多肽分离。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述样品含有权利要求1-7中任一项所述的纤溶
酶抑制多肽。
27.保护分离的蛋白或分离的生物样品中的蛋白免受蛋白水解降解的方法，其包括：
将所述分离的蛋白或者所述分离的生物样品与权利要求1-7中任一项所述的纤溶酶
抑制多肽相接触。

说明书全文

纤维蛋白溶解的双反应性的有效的Kunitz抑制剂

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2013年3月15日提交的美国临时申请第61/793,131号和2013年12月30日提交的美国临时申请第61/922,026号的权益，在此将
其以引用的方式整体并入本文。

[0003] 政府权益声明

[0004] 本发明在政府的支持下完成，国立卫生研究院授予的批准号为HL036365和HL089661。在本发明中，政府有某些权力。

[0005] 序列表的声明

[0006] 与本申请有关的序列表以文本格式代替纸质拷贝提供，并且在此通过引用的方式并入到说明书中。包含序列表的文本文档的名称为720156_403WO_SEQUENCE_LISTING.txt。
该文本文档为30KB，创建于2014年3月14日，并且通过EFS-Web 电子提交。

[0007] 发明背景

技术领域

[0008] 本文公开的本发明的实施方案通常涉及抑制蛋白水解的组合物和方法，并且具体涉及抑制可导致有害的过度出血的纤维蛋白溶解的组合物和方法，以及抑制有助于肿瘤生
长和发展(包括癌症转移)的蛋白水解降解的组合物和方法。更具体地，本发明的实施方
案涉及新型Kunitz型抑制剂多肽，其为有效的纤溶酶抑制剂，且表现出有利的低抗凝血活
性和低免疫原性。

[0009] 相关领域的描述

[0010] 通过组织纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶(uPA)将蛋白水解酶纤溶酶(E.C.3.4.4.14)从它的酶原(纤溶酶原)激活后，纤溶酶为存在于人血浆中的90KDa的广
谱性的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶在纤维蛋白溶解过程和调节细胞外基质(ECM)组分周转中发
挥重要作用。tPA被认为主要涉及导致脉管系统血栓溶解的纤溶酶的激活，uPA被认为主要
负责导致ECM降解的纤溶酶的激活。与膜uPA受体(uPAR)结合的细胞表面uPA增强了纤
溶酶原的激活以及随之产生的纤维蛋白溶酶依赖的蛋白水解。在与细胞表面结合时，通过
使α2-抗纤溶酶循环，保护纤溶酶不被抑制，借此将纤溶酶介导的蛋白水解局部限定在细
胞表面位点或邻近细胞表面的位点。

[0011] 纤溶酶的蛋白水解活性是病理过程如炎症、肿瘤细胞生长和肿瘤转移的主要贡献者。例如，肿瘤细胞的侵袭性特性可至少部分依赖于ECM组分的直接的纤溶酶介导的蛋白
水解，并间接依赖于ECM降解过程中涉及的纤溶酶介导的其它蛋白酶的激活，如基质金属
蛋白酶原(proMMP)和胶原酶。纤溶酶可通过细胞表面的uPA/uPAR复合体激活MMP-3和
MMP-9，从而促进肿瘤发生的影响。因此，直接地和间接地纤溶酶引起的蛋白水解事件增强了血管的通透性，以促进肿瘤细胞进入血管和其在全身的分布。

[0012] 纤溶酶和MMP也可能通过促进特定的基质衍生生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)从ECM的释放，以及通过激活转化生长因子
(TGF-β)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的潜活形
式来参与血管生成。此外，在常见的生长因子和细胞因子的调节下，位于新生成的血管前端的内皮细胞表达纤溶酶和MMP途径中的组分。

[0013] 在减轻围术期出血和在将手术特别是器官移植手术、整形外科手术和心脏手术过程中的输血需要最小化中，广泛地期望可抑制纤溶酶。过度出血可需要输血，输血与一种或多种有害后遗症风险的增加有关，如感染的传播、过敏反应和不匹配输血(如输血供体和
受体之间的血型抗原、主要或次要的组织相容性抗原或其它的标志物的疏忽的不匹配或未
测定的不匹配)。

[0014] 以前，纤溶酶抑制剂抑肽酶( )在减少围术期出血中有广泛的用途，但是在2007年，在大型的多中心研究(Blood Conservation using Antifibrinolytics in a Randomised Trial,BART)发现在高风险的心脏手术中与可选的治疗方法相比，该药与更高
的死亡率有关之后，其被退出应用(Furgusson et al.,2008N Engl J Med.358:2319)。抑
肽酶是最初从牛肺部组织中分离到的Kunitz型抑制剂(Laskowski and Kato,1980Annu.
Rev.Biochem.49:593)，且其对几乎所有的丝氨酸蛋白酶都有抑制作用。尽管抑肽酶是在其被撤回之前已知的最有效的抗纤维蛋白溶解剂，在发现其与心肌梗塞、静脉移植高凝状态、肾衰竭的发病率和死亡率的增加有关后，它的应用被停止。此外，由于异基因蛋白的免疫原性，在给定的人患者中，抑肽酶(牛蛋白)的第二和后续应用与过敏性休克的可能性增加有
关。

[0015] 临床可用的其它的纤维蛋白溶解抑制剂通常指赖氨酸类似物，且其包括ε-氨基己酸(ε-ACA或EACA,Amicor)和凝血酸(TXA)。这些抑制剂与纤溶酶原的第一和第四三环
结构域中存在的赖氨酸结合位点结合，由此防止纤溶酶原与纤维蛋白结合，这就阻止了纤
维酶原通过tPA或uPA的有效激活。临床研究发现赖氨酸类似物减轻围术期出血的能力高
度可变，并且它们还未广泛地表现出与其应用有关的潜在的风险。与使用的抑肽酶的量相
比，需要更高剂量的赖氨酸类似物来减轻出血，并且近期的报告指出赖氨酸类似物可能引
起痉挛。作为候选的治疗性纤溶酶原抑制剂，赖氨酸类似物因而被认为是不可靠的。

[0016] 尽管在分子水平上识别有助于肿瘤发生和转移的蛋白水解机制上有此优势，但是仍需要安全和有效的治疗方法来阻止癌症的发展和/或预防癌症的转移。类似地，尽管对
纤维蛋白原激活和纤溶酶介导的蛋白水解过程的领域有大致的了解，安全、有效和可靠的
抗纤维蛋白溶解剂以减轻有害的围术期出血和/或否则抑制纤溶酶的活性的需要仍未得
到满足。某些本公开的实施方案解决了这些需要并提供了其它的相关优势。

[0017] 概述

[0018] 根据本文公开的本发明的某些实施方案，提供纤溶酶抑制多肽，其包含通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的多肽，其中：(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端，且由独立选自天然和非天
然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25-30、31-40、41-50或51-60个氨基酸组成；(b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨
酸；(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制
剂结构域(KD1)多肽；(d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：(i)通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)
[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸
且不是C、F、R或W，(ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然
和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(iii)通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID
NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基
酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(iv)通
式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基
酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基
区多肽，其中X3和X6是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，且X6
是任意天然或非天然氨基酸，以及(vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的
KD1羧基区多肽，其中X3、X6和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨基酸；(e)C是纤溶酶抑
制多肽的羧基端，且由独立选自天然和非天然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、1617、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50或51-60个氨基酸组成；以及(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶的活性。

[0019] 在某些进一步的实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽选自：(a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式
(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)(SEQ ID NO:2)的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然
和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；(b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不
存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)
的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；(c)所
述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1
多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5
是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非
天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；(d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID
NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或
W；(e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是
具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)(SEQ
ID NO:2)的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不
是C、F、R或W；(f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫
氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)
的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；(g)所
述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ
ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]
的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不
是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；以及(h)所述
纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID
NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧
基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W。

[0020] 在某些其它实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽选自：(a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，其中X3是E且X4是P，SEQ ID NO:39]的式(II)的KD1羧基区多
肽；(b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸
序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的KD1羧基区多肽；(c)所述纤溶酶抑制
多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是
具有序列IEKVP[SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:20，其中X3是E且X5是P]的式(IV)的KD1
羧基区多肽；(d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所
示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:21，其中X3是
E]的式(V)的KD1羧基区多肽；(e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫
氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有
序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，其中X3是E且X4是P，SEQ ID NO:39]的式(II)的KD1羧基
区多肽；(f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，
J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的KD1
羧基区多肽；(g)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫
氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVP[SEQ ID
NO:40；SEQ ID NO:20，其中X3是E且X5是P]的式(IV)的KD1羧基区多肽；以及(h)所述
纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID
NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:21，其
中X3是E]的式(V)的KD1羧基区多肽。

[0021] 根据某些实施方案，提供不多于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、
66、65、64或63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，包含SEQ ID NO:3-18、22-29以及32-35中的
任何一项所示氨基酸序列，其中所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。

[0022] 根据某些实施方案，提供60或61个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少96％、97％、98％或99％相同的氨基酸
序列，在通式(I)中：(a)N是所述纤溶酶抑制多肽的氨基端；(b)Y不存在或者是甲硫氨酸
或N-甲酰甲硫氨酸；(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型
蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或
S，SEQ ID NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38
位处分别存在半胱氨酸残基；(d)Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3
是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；(e)C是所述纤溶酶抑制多肽的羧
基端；和(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。

[0023] 在某些实施方案中，提供63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；(b)Y不存在或者是甲
硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的
Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是
D、N或S，SEQ ID NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基酸第14位
和第38位处分别存在半胱氨酸残基；(d)Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]
的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R
或W；(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。

[0024] 在某些实施方案中，提供61、62、63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：(a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；(b)Y不存在
或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；(c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨
基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨
基酸X1是D、N或S，SEQ ID NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基
酸第14位和第38位处分别存在半胱氨酸残基；(d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：(i)通式
(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天
然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基
区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(iii)通式(IV)：
I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天
然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且
不是C、F、R或W，(iv)通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3
是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，(v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基区多肽，其中X3和X6是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3
不是C、F、R或W，且X6是任意天然或非天然氨基酸，和(vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的KD1羧基区多肽，其中X3、X6和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的
氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨
基酸；(e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和(f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。

[0025] 根据某些其它实施方案，与含有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，上述纤溶
酶抑制多肽具有降低的抗凝血活性。在某些实施方案中，提供含有融合进融合蛋白结构域
的任何一种上述纤溶酶抑制多肽的融合蛋白。在某些实施方案中，提供包含此种融合蛋白
和生理可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，提供任何上述的纤溶酶抑制多肽，其与聚亚烷基二醇相连以形成聚亚烷基二醇化的(PAG化)多肽。在某些其它实施方案中，
聚乙二醇是所述的聚亚烷基二醇，且PAG化多肽是聚乙二醇化(PEG化)的多肽。

[0026] 转向另一个实施方案，提供包含编码上述纤溶酶抑制多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，提供含有此种多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案
中，提供用此种表达载体转化或转染的宿主细胞。在另一个实施方案中，提供产生上述纤
溶酶抑制多肽的方法，上述方法包括下述步骤：a)将上述宿主细胞在一定条件下培养一定
时间，足以允许所述纤溶酶抑制多肽的表达；和b)将所述纤溶酶抑制多肽从培养的宿主细
胞中分离。在某些实施方案中，由宿主细胞表达的纤溶酶抑制多肽包含N-末端甲硫氨酸
或N-甲酰甲硫氨酸，并且将所述宿主细胞在一定条件下表达甲硫氨酸氨肽酶(MAP)一段时
间，足以使所述MAP将N-末端甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸从所述纤溶酶抑制多肽上去除。

[0027] 在另一个实施方案中，提供药物组合物，其包含：a)任何上述的纤溶酶抑制多肽；和b)生理可接受的载体。在另一个实施方案中，提供抑制纤溶酶活性的方法，包括在一定
条件下将(i)纤溶酶与(ii)上述纤溶酶抑制多肽接触一段时间，足以使纤溶酶抑制多肽与
纤溶酶结合，并因此抑制纤溶酶的活性。在某些实施方案中，所述接触步骤发生在体外。

[0028] 在另一个实施方案中，提供对需要抑制纤溶酶活性的个体进行治疗的方法，包括向个体施用有效量的上述纤溶酶抑制多肽或上述分离的多核苷酸。在某些实施方案中，所
述个体患有癌症、血友病、风湿性关节炎或全身炎症反应综合征(SIRS)或有疑似处于患有
这些疾病的风险，或者所述个体需要接受或正在接受血管生成、骨再建或冠状动脉旁路移
植术(CABG)。在某些其它实施方案中，所述个体正在接受手术或最近已经接受了手术，在某些进一步实施方案中所述手术为心血管手术、肿瘤手术、泌尿生殖器手术、骨科手术、胸部手术、整形手术、创伤手术、腹部手术、移植手术、神经外科手术或耳鼻喉科手术。

[0029] 在另一个实施方案中，提供分离含有Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)的纤溶酶抑制多肽的方法，包括：a)在一定条件下将(i)固定化有失活的的纤溶酶的固相与
(ii)包含含有Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)的纤溶酶抑制多肽和杂质的样品
接触一定时间，足以使KD1与灭活的纤溶酶结合；b)在不破坏KD1-纤溶酶结合的条件下洗
涤固相，以去除杂质；和c)将KD1从固相上洗脱，并由此分离所述含有KD1的多肽。在某些
实施方案中，所述样品含有上述纤溶酶抑制多肽中的一种或多种。

[0030] 在另一个实施方案中，提供保护分离的蛋白或分离的生物样品中的蛋白不被蛋白水解降解的方法，包括：使分离的蛋白或分离的生物样品与上述纤溶酶抑制多肽中的至少
一种接触。

[0031] 通过参考下述详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。将本说明书涉及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利
申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以引用的方式整体并入本文。如果需要，可对本发明的方面进行修改以使用不同的专利、申请和出版物中的观念，从而提供本发明的
其它实施方案。

[0032] 附图简要说明

[0033] 图1显示了包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对纤溶酶活性的抑制。计算的抑制常数(Ki)为2.36nM。

[0034] 图2显示了包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对纤溶酶活性的抑制。计算的抑制常数(Ki)为0.49nM。

[0035] 图3显示了包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对因子VIIa-组织因子酰胺水解(amidolytic)活性分析的影响。计算的抑制常数(Ki)为5869.5nM。

[0036] 图4显示了包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对因子Xia酰胺水解活性(实心圆)和激肽释放酶酰胺水解活性(空心圆)的抑制分析的影响。

[0037] 图5显示了包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽(SM)和包含SEQID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽(DM)以及抑肽酶(BPTI)，对血浆凝块纤维蛋白
溶解分析中凝固时间的影响。

[0038] 图6显示了表面等离子体共振分析中不同浓度的纤溶酶抑制多肽与固定化的活性位点被封闭的纤溶酶的结合。上方图(60A)，包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶
酶抑制多肽；中图(60B)，包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽；底部图
(63-残基)，包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽。在表面等离子体共振
分析中，抑肽酶不与活性位点被封闭的纤溶酶结合。

[0039] 图7显示了KD1L17R-VT和KD1L17R-KT的SDS-PAGE。泳道1，还原的EZ-RunTM蛋白标志物(Fisher BioReagents)的混合物；泳道2，5μg未还原的KD1L17R-KT；泳道3，5μg未还原的KD1L17R-VT；泳道4，5μg还原的KD1L17R-KT；以及泳道5，5μg还原的KD1L17R-VT。使用的丙烯酰胺的浓度为15％。

[0040] 图8。MALDI-TOF-ESI质谱分析数据以及KD1L17R-KT与起始分子(KD1L17R-VT)TM
和BPTI的氨基酸序列比对。(A)利用Applied Biosystems Voyager DE-STR获得的
KD1L17R-KT的质谱分析法数据。对光谱进行校准以使分子量在理论值的0.1％内。(B)
KD1L17R-VT和两种KD1L17R-KT的氨基酸序列，一种KD1L17R-KT(SEQ ID NO:47)的N-末端序列为Gly-Asn-Asn-Ala-Glu-Ile(～80％,SEQ ID NO:49)，第二种KD1L17R-KT(SEQ ID NO:48)
的N-末端序列为Asn-Ala-Glu-Ile(～20％,SEQ ID NO:50)。所述少序列从循环3(天冬
酰胺)开始位于主序列的内部，并且计算的两种之间MW的差异为171Da，这也与图8(A)中
显示的质谱分析法的数据一致。根据非限制性理论推断，IIa或污染的蛋白酶在KD1L17R-VT的N-末端的氨基酸Thr-Gly和Asn-Asn之间以及C-末端氨基酸Lys-Val之间切割肽键
(以↓显示)。使用的编号系统是BPTI(Kunitz抑制剂原型)的。KD1L17R-VT中的N-末端
Gly-Ser-His-Met序列来自于克隆过程中引入的IIa剪切位点。将纤溶酶识别的P1和P2′
亚位点标记。

[0041] 图9。IIa的S1槽残基Asp189与在三个观察剪切位点处的KD1L17R-VT P1残基(被IIa识别)之间的分子相互作用的示意图。用卡通图表示IIa(浅色阴影的带状图)和
KD1L7R-VT(用箭头标记的深色窄带)的模拟复合物。IIa的Asp189可与KD1L17R-VT的
P1残基Lys63(A)形成直接的氢键，然而与Thr(B)和Asn(C)之间的每一类似的氢键通过
水分子介导。用棍表示IIa活性位点三个残基(His57、Asp102、Ser195)侧链和Asp189，以
及KD1L17R-VT的P1残基(Lys、Thr和Asn)。用球表示水分子(“W”)(图9B、C)。在图8B
中，箭头表示显示的氨基酸序列中的每一剪切位点。

[0042] 图10。由SPR测定的KD1L17R-KT与tPA和Glu-Plg的相互作用。(A)tPA与KD1L17R-KT结合。通过胺偶联法将tPA与CM5芯片偶联，并获得结合蛋白的1193响应单元(RU)的固定化水平。使用5个KD1L17R-KT浓度(0.1至2μM)；使用6分钟结合时间和10分钟分离时
间(流速10μl/min)。1μM的KD1L17R-VT获得的RU值为16，而非KD1L17R-KT获得的155。
(B)Glu-Plg与KD1L17R-KT结合。将Glu-Plg与CM5芯片偶联，并获得结合蛋白的742RU的固
定化水平。使用的KD1L17R-KT的浓度和分析物的结合和分离方案与(A)中的相同。1μM的
KD1L17R-VT获得的RU值为12，而非KD1L17R-KT获得的86。(C)KD1L17R-KT与纤溶酶原三环结构域
1的模拟复合物。描画纤溶酶原三环结构域1(空间填充模型)的静电表面和KD1L17R-KT(带
状模型)的卡通图。在三环结构域与KD1L17R-KT之间形成的氢键和盐桥(用虚线表示)的
残基用棍表示。用后缀‘I’标记KD1L17R-KT残基。在静电表面，深色区域代表电荷区，白色代表中性区。

[0043] 图11。KD1L17R-KT与纤溶酶、FXIa和pKLK的平衡抑制常数(Ki)的测定。将酶活性表示为抑制剂浓度增加时的部分活性百分比(抑制率/非抑制率)。用“实验方法”下的
实施例5中概述的方程1和2确定抑制常数(Ki)纤溶酶的浓度为3nM；FXIa和pKLK的浓
度分别为1nM。

[0044] 图12。在人NPP中，KD1L17R-VT、KD1L17R-KT和εACA对纤维蛋白溶解的影响。向NPP中加入IIa以起始凝固形成，这与405nm(A、B和C中的曲线1)处光密度的增加有关。
同时加入tPA使纤溶酶原转变为纤溶酶，其在10分钟内将纤维蛋白凝块完全溶解，如OD405
的起始增加，然后降低所表示的(A、B和C中的曲线2)。(A)KD1L17R-VT和KD1L17R-KT对纤维蛋白溶解的抑制。KD1L17R-VT：2μM(“2μM”空心三角形)、3μM(“3μM”空心三角形)以及5μM(“5μM”空心三角形)。KD1L17R-KT：2μM(“2μM”实心三角形)、3μM(“3μM”实心三角形)以及5μM(“5μM”实心三角形)。在每种情况下，使用IIa来起始凝固，使用
tPA来起始纤维蛋白溶解。(B)εACA对KD1L17R-VT对纤维蛋白溶解抑制的影响。KD1L17R-VT：
2μM(“2μM”空心三角形)、3μM(“3μM”空心三角形)以及5μM(“5μM”空心三角形)。
KD1L17R-KT+等摩尔的εACA：2μM(“2μM”实心三角形)、3μM(“3μM”实心三角形)以及
5μM(“5μM”实心三角形)。如(A)，在每种情况下，使用IIa来起始凝固，使用tPA来起
始纤维蛋白溶解。(C)εACA单独对纤维蛋白溶解的抑制。0.1mM(“0.1mM”空心正方形)、
0.3mM(“0.3mM”空心三角形)、0.5mM(“0.5mM”实心三角形)、1.0mM(“1.0mM”实心正方形)以及5mM(“5mM”空心圆)。如(A)和(B)，在每种情况下，使用IIa来起始凝固，使用
tPA来起始纤维蛋白溶解。

[0045] 图13。在小鼠肝脏裂伤出血模型中，KD1L17R-VT、KD1L17R-KT和εACA的影响。通过静脉注射用盐水、KD1L17R-VT、KD1L17R-KT或εACA处理动物。在肝脏左叶切出5-mm的横切口。收集切口部位渗出的全部血，总共持续30分钟。将不同组之间的总失血量进行比较。将数据表示为分别用盐水、KD1L17R-VT和KD1L17R-KT处理的10只动物的平均值±S.E.以及用εACA处理的16只动物的平均值±S.E.。不同组之间的概率p值如下：盐水相对于
KD1L17R-VT，0.002；盐水相对于KD1L17R-KT，0.001；盐水相对于εACA，0.002；KD1L17R-KT相对于KD1L17R-VT，<0.05；KD1L17R-KT相对于εACA，<0.05。与盐水对照相比，*，p值<0.01。

[0046] 图14显示了先前在小鼠肝脏裂伤出血模型中(66,以下)表征的KD1-L17R制备物的MALDI-TOF质谱分析数据和氨基酸序列。

[0047] 图15。μ-纤溶酶-KD1L17R-KT对Glu-Plg与PMA刺激的非贴壁U937细胞的结合的抑制。(A)U937细胞表面产生的纤溶酶的蛋白水解活性。将HBS/BSA，pH 7.5中的PMA
6
刺激的U937细胞(200μl,1×10细胞/ml)与含有2μM Glu-Plg的不同浓度的μ-纤溶
酶-KD1L17R-KT复合物(范围为0-3μM)或μ-纤溶酶-KD1L17R-VT复合物(2和4μM)，在37℃
孵育1小时。洗涤细胞，并在37℃用10nM uPA将细胞表面结合的Glu-Plg激活20分钟。
将所述样品十倍稀释，并通过S-2251合成底物水解(OD405)测定纤溶酶的形成。μ-纤溶
酶-KD1L17R-KT将形成的纤溶酶还原，且还原具有剂量依赖性，而μ-纤溶酶-KD1L17R-VT对此没有影响(参见图B)。插图(inset)，尺寸排阻凝胶纯化的μ-纤溶酶-KD1L17R-KT和μ-纤
溶酶-KD1L17R-VT的还原性SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)。表达的μ-纤溶酶的残基542-791在
R561(胰凝乳蛋白酶编号中的R15)和V562(胰凝乳蛋白酶编号中的V16)之间的被剪切。重
链(HC)由562-791的残基组成，轻链由542-561的20个残基组成，并且在凝胶上看不到轻
链。泳道1，MW标记物；泳道2，μ-纤溶酶-KD1L17R-KT复合物；泳道3，μ-纤溶酶-KD1L17R-VT复合物。(B)纯化的μ-纤溶酶-KD1L17R-KT复合物和μ-纤溶酶-KD1L17R-VT复合物对纤溶
酶产生降低的百分比。将纤溶酶活性表示为抑制剂浓度增加时的部分活性百分比(抑制率
/非抑制率)。(○)μ-纤溶酶-KD1L17R-KT；(●)μ-纤溶酶-KD1L17R-VT。

[0048] 图16。KD1L17R-KT与纤溶酶蛋白酶结构域和纤溶酶原/纤溶酶三环结构域1的模拟三元复合物。显示了与纤溶酶蛋白酶结构域(深色带状结构，顶部)和纤溶酶原/纤溶
酶三环结构域1(深色带状结构，底部)结合的KD1L17R-KT(浅色带状结构，中部)的卡通图。
用棍显示与三环结构域1的残基形成氢键和盐桥的KD1L17R-KT C-末端残基。类似地，用棍显示与纤溶酶蛋白酶结构域的Asp189和Glu73(胰凝乳蛋白酶编号)残基相互作用的Kunitz
结构域的Arg15和Arg17残基。将所述KD1L17R-KT残基用后缀‘I’标记。

[0049] 发明详述

[0050] 本文公开的本发明的某些实施方案基于下述令人惊奇的发现：设计的含有对人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2，也被称为基质丝氨酸蛋白酶抑制剂或胎盘蛋白5；
Sprecher et al.,1994Proc.Nat.Acad.Sci.USA91:3353；Chand et al.,2004J.Biol.
Chem.279:17500；SEQ ID NO:19)的Kunitz型抑制剂第一多肽结构域的微小结构修饰的多
肽具有作为纤溶酶抑制剂的意想不到的效果，且当与野生型的TFPI-2多肽比较时，其具有
降低的(如以统计学上显著的方式降低)抗凝血活性。因此，在这些和相关实施方案中，提
供相对先前描述的纤溶酶抑制剂具有更好的纤溶酶抑制活性的纤溶酶抑制多肽，并且鉴于
其与天然TFPI-2结构上的高度相似性，它也有利地表现出了很小的免疫原性或无免疫原
性。

[0051] 特别地，本文公开了含有Kunitz型抑制剂结构域1样的设计的纤溶酶抑制多肽，在某些实施方案中其包含通式N--(KD1)--C的纤溶酶抑制多肽，其中KD1包含具有SEQ ID
NO:1所示氨基酸序列的本文公开的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域多肽，也包含具有
SEQ ID NO:2、20或21(通式II、IV或V)中的一项所示氨基酸序列或如本文所述的通式
(III)中的氨基酸序列的KD1羧基区多肽。这些和结构上相关的纤溶酶抑制多肽能够抑制
(即相对于合适的对照，以统计学上显著的方式降低)纤溶酶的活性，并且任选地，在某些
其它实施方案中，与野生型的TFPI-2多肽相比，也可表现出降低的抗凝血活性。

[0052] 本公开的纤溶酶抑制多肽可用于多种需要有效地抑制纤溶酶的情况，如对于癌症治疗，自身免疫性疾病和炎症(如风湿性关节炎、全身炎症反应综合征)的治疗，调节血
管生成(如以统计上显著的方式抑制或降低血管生成的可能性或程度)，作为抗纤维蛋白
溶解剂，包括在手术、移植、输血以及抑制纤溶酶可能有用的其它情况(参见，如Bajaj et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329；US 2009/0018069)中使用的那些。如本文所述，例如，考虑到(a)纤溶酶在体内主要以无活性的酶原(前体)形式存在，而它的活性形式主要存在
于组织重塑的局部部位，如肿瘤发生或转移的部位，(b)通过直接和间接的机制，纤溶酶在伴随肿瘤生长和发展的ECM降解中发挥重要作用，和(c)有活性的纤溶酶在血管生成过程
中发挥作用，因而可期望地将其抑制以降低固体肿瘤血管化的程度，从而阻碍肿瘤的生长，通过使用的目前公开的纤溶酶抑制多肽可有利地靶向纤溶酶，以治疗癌症。先前已经描述
(如US 2009/0018069)了其它纤溶酶抑制剂的用途，例如减少手术中的过度出血、溶解血
栓疗法和器官移植，以及以出血性素质的高发率为特征的其它临床状况。

[0053] 在某些优选实施方案中，本公开的纤溶酶抑制多肽可包括通式(I)的多肽：

[0054] N-Y-J-Z-C(I)其中：

[0055] (a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端，且由独立选自天然和非天然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50或51-60个氨基酸组成；

[0056] (b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；

[0057] (c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽；

[0058] (d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：

[0059] (i)通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0060] (ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0061] (iii)通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，X5是选自天然和
非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0062] (iv)通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0063] (v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基区多肽，其中X3和X6是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，且X6是任意天然或非天然
氨基酸，以及

[0064] (vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的KD1羧基区多肽，其中X3、X6和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨基酸；

[0065] (e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端，且由独立选自天然和非天然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、1617、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50或
51-60个氨基酸组成；和

[0066] (f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶的活性，并且任选地，与具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，具有降低的抗凝血活性。

[0067] 在某些实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽选自：

[0068] (a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)(SEQ ID NO:2)的KD1羧基区
多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0069] (b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自
天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0070] (c)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多
肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，并
且X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0071] (d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其
中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0072] (e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)
(SEQ ID NO:2)的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸
且不是C、F、R或W；

[0073] (f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(III)：I-X3-K(III)的
KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0074] (g)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)
[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基
酸的氨基酸且不是C、F、R或W，并且X5是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；和

[0075] (h)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ
ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R
或W。

[0076] 在某些其它实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽选自：

[0077] (a)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，其中X3是E且X4是P，SEQ
ID NO:39]的式(II)的KD1羧基区多肽；

[0078] (b)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的KD1羧基区多肽；

[0079] (c)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVP[SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:20，其中X3是E且
X5是P]的式(IV)的KD1羧基区多肽；

[0080] (d)所述纤溶酶抑制多肽，其中N、Y和C均不存在，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:21，其中X3是E]的
式(V)的KD1羧基区多肽；

[0081] (e)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVPK[SEQ ID NO:2，
其中X3是E且X4是P，SEQ ID NO:39]的式(II)的KD1羧基区多肽；

[0082] (f)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEK的式(III)的
KD1羧基区多肽；

[0083] (g)纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKVP[SEQ ID NO:40；SEQ
ID NO:20，其中X3是E且X5是P]的式(IV)的KD1羧基区多肽；和

[0084] (h)所述纤溶酶抑制多肽，其中N和C均不存在，Y是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸，J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的KD1多肽，且Z是具有序列IEKV[SEQ ID NO:41；
SEQ ID NO:21，其中X3是E]的式(V)的KD1羧基区多肽。

[0085] 在某些实施方案中，提供不多于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、
66、65、64或63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，包括SEQ ID NO:3-18、22-29以及32-35中的
任何一项所示氨基酸序列，其中所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性。并且任选地，其中与具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一
Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，所述纤溶酶抑制多肽具有降低的抗凝血活性。

[0086] 在某些实施方案中，提供60或61个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少96％、97％、98％或99％相同的氨基酸
序列，在通式(I)中：

[0087] (a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；

[0088] (b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；

[0089] (c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID
NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位处分别
存在半胱氨酸残基；

[0090] (d)Z是通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0091] (e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和

[0092] (f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性，并且任选地与具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂
结构域(KD1)相比，其具有降低的抗凝血活性。

[0093] 在某些实施方案中，提供63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：

[0094] (a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；

[0095] (b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；

[0096] (c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID
NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位处分别
存在半胱氨酸残基；

[0097] (d)Z是通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W；

[0098] (e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和

[0099] (f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性，并且任选地，与具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，其具有降低的抗凝血活性。

[0100] 在某些实施方案中，提供61、62、63或64个氨基酸的纤溶酶抑制多肽，其具有与通式(I)：N-Y-J-Z-C(I)的纤溶酶抑制多肽的氨基酸序列至少94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，在通式(I)中：

[0101] (a)N是纤溶酶抑制多肽的氨基端；

[0102] (b)Y不存在或者是甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸；

[0103] (c)J是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸的Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽，其中SEQ ID NO:1第11位处的氨基酸X1是D、N或S，SEQ ID
NO:1第17位处的氨基酸X2是R，并且在SEQ ID NO:1的氨基酸第14位和第38位分别存
在半胱氨酸残基；

[0104] (d)Z是KD1羧基区多肽，其选自：

[0105] (i)通式(II)：I-X3-K-V-X4-K(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基区多肽，其中X3和X4是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0106] (ii)通式(III)：I-X3-K(III)的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0107] (iii)通式(IV)：I-X3-K-V-X5(IV)[SEQ ID NO:20]的KD1羧基区多肽，其中X3和X5是独立的，X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，并且X5是选自天
然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0108] (iv)通式(V)：I-X3-K-V(V)[SEQ ID NO:21]的KD1羧基区多肽，其中X3是选自天然和非天然氨基酸的氨基酸且不是C、F、R或W，

[0109] (v)通式(VI)：I-X3-K-X6(VI)[SEQ ID NO:30]的KD1羧基区多肽，其中X3和X6是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，且X6是任意天然或非天然
氨基酸，和

[0110] (vi)通式(VII)：I-X3-K-X6-X7(VII)[SEQ ID NO:31]的KD1羧基区多肽，其中X3、X6和X7是独立选自天然和非天然氨基酸的氨基酸，X3不是C、F、R或W，X6是任意天然或非天然氨基酸，且X7是任意天然或非天然氨基酸；

[0111] (e)C是纤溶酶抑制多肽的羧基端；和

[0112] (f)所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性，并且任选地，与具有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，其具有降低的抗凝血活性。

[0113] 所述人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2；SEQ ID NO:19；对于完整的TFPI-2KD1序列，也参见Chand et al.,2004J.Biol.Chem.279:17500的图4，在17505页)的野生型第一
Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)可被称为参考序列，其中当用如本文所述的序列同源
性工具将相似的序列进行比对时，将编号的氨基酸位点描述为与本描述的纤溶酶抑制多肽
有对应的位点。如本文所述，三维蛋白模拟研究显示，除了在KD1第17位用精氨酸取代亮
氨酸(L17R)，在KD1第11位用苏氨酸取代酪氨酸(如SEQ ID NO:3、4、11、15、24、25、32、33中的Y11T)以得到本发明的纤溶酶抑制多肽，允许在纤溶酶抑制多肽和纤溶酶之间形成氢
键。相对于只进行L17R取代(如SEQ ID NO:5、6、12、23中的)而允许的纤溶酶和纤溶酶
抑制多肽之间的相互作用而言，这一氢键结合增强了该相互作用。在所述模拟研究中还显
示，观察到在纤溶酶抑制多肽(如SEQ ID NO:3)的第60位的赖氨酸残基的侧链嵌入人纤
溶酶三环结构域的赖氨酸结合位点(LSB)。

[0114] 相应地，在某些实施方案中，提供含有L17R取代且具有羧基末端赖氨酸的60个氨基酸(如SEQ ID NO:5)和63个氨基酸(如SEQ ID NO:6)的纤溶酶抑制多肽，所述多肽作
为纤溶酶活性位点的抑制剂是有活性的，并且也能与纤溶酶三环结构域中的赖氨酸结合位
点结合，因而提供纤溶酶抑制活性的两种模式(即双重活性)。进一步，由于即使在体内通
过激活的凝血酶激活的纤溶酶蛋白溶解抑制剂(TAFI)将C-末端的K63去除后产生的62
个氨基酸的形式中，所述K60残基仍存在且可与纤溶酶的赖氨酸结合位点相互作用，因而
所述63个氨基酸的形式保留了与赖氨酸结合位点相互作用的能力。含有第11位取代(如
SEQ ID NO:3，例如Y11T)和第17位取代(如SEQ ID NO:3，例如L17R)的所述60个氨基酸
以及63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽是更有效的纤溶酶抑制剂，并且由于是通过C-末端赖
氨酸与纤溶酶原/纤溶酶上的赖氨酸结合位点结合，因而是双重反应性的。

[0115] 多肽和蛋白

[0116] 使用的术语“多肽”、“蛋白”和“肽”以及“糖蛋白”是可互换的，并且表示不限于任何具体长度的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰，如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化、甲酰化以及信号序列的添加或缺失。术语“多肽”或“蛋白”意为一条或多条氨基酸链，其中每条链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可包括非共价连接和/或通过肽键共价连接在一起的多条链，其具有天然蛋白的序列，即通过天然存在的且
特别是非重组细胞产生的蛋白，或者是通过基因工程或重组细胞产生的蛋白，并且包括含
有天然蛋白的氨基酸序列的分子或含有一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的天然序
列的分子。因此，“多肽”或“蛋白”可包括一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”明确包含本公开的免疫调节多肽，或有一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的免疫调节多肽序列。

[0117] 术语“分离的”意为将材料从它的原始环境(如，如果它是天然存在的，则是天然环境)中移出。例如，在活体动物中存在的天然存在的多肽或核酸不是分离的，但是从自然系统中的一些或全部共同存在的材料中分离到的相同的多肽或核酸是分离的。此种核酸可以是载体的一部分，和/或此种核酸或多肽可以是组合物(如细胞裂解物)的一部分，并且
由于此种载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的一部分，因而其仍然是分离的。
术语“基因”意为多肽链的产生中涉及的DNA片段；它包括编码区之前和之后的区域“头部和尾部”以及单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

[0118] 本文提及的术语“分离的蛋白”和“分离的多肽”意为个体蛋白或多肽(1)不含其在天然状态下通常与之结合的至少一些其它蛋白或多肽，(2)基本不含来自相同来源。如来自相同的物种，的其它蛋白或多肽，(3)通过来自不同物种的细胞表达，(4)与其天然状
态下与之结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它材料的至少约50％分离，(5)不与与天然状态下的所述“分离的蛋白”或“分离的多肽”相连的蛋白或多肽部分相连(通过共价或非共价相互作用)，(6)与天然状态下不与其相连的多肽可操作地连接(通过共价或非共价
相互作用)，或(7)不以其天然状态存在。此种分离的蛋白或多肽可由根据许多已知的人工
肽或人工蛋白合成的化学反应中的任何一种或其任何组合得到的合成来源的基因组DNA、
cDNA、mRNA或其它RNA编码。在某些实施方案中，所述分离的蛋白或多肽基本不含会干扰
其用途(治疗性、诊断性、疾病预防、研究或其它)的在其自然环境中发现的蛋白或多肽或
其它污染物。

[0119] 术语“多肽片段”指含有天然存在的或重组产生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失，和/或内部缺失或取代的多肽，其可以是单体或多聚体。如本文使用的，“连续氨基酸”指对应于公开的氨基酸序列的不间断线性部分的共价相连的氨基酸。在某些实施方案中，
肽片段可包含至少5-约500个氨基酸长度的氨基酸链。应当理解，在某些实施方案中，片
段长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、
60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。

[0120] 在蛋白的N-末端，多肽可以包含信号(或前导)序列，其在蛋白翻译时或翻译后指导蛋白的转移。为了便于所述多肽的合成、纯化或识别(如多聚-His)或增强多肽与固
体支撑物的结合，也可将所述多肽融合进连接子或其它序列的读码框或与之偶联。可在所
述多肽的N-末端和/或C-末端将其与融合结构域多肽相连，并且作为非限制性实例，可包
括免疫球蛋白来源的序列如Ig恒定区序列或其部分，亲和标签如His标签(如六聚组氨酸
TM
或其它多聚组氨酸)，FLAG 或myc或其它肽亲和标签，可测定的多肽部分如绿色荧光蛋白
(GFP)或其变体(如黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、其它发光蛋白或其衍生物
等)或其它可测定的多肽融合结构域、酶或其部分如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或其它已
知的酶测定和/或报告融合结构域等，这将是技术人员所熟知的。

[0121] 也如下文所述，重组蛋白表达系统在本领域是已知的，并且在某些实施方案中，可将其用于生产本文所述的纤溶酶抑制多肽。例如，某些细菌表达系统(如大肠杆菌重组蛋白表达系统)产生含有N-末端甲酰化的甲硫氨酸的多肽产物。因而，在一些情况下，所述纤溶酶抑制多肽可包括N-末端甲硫氨酸残基(其可以是未被修饰的甲硫氨酸或是甲酰-甲
硫氨酸或者是如本文提供的其它的甲硫氨酸的类似物、变体、模拟物或衍生物)，有时被称作起始子甲硫氨酸，其紧接地在Kunitz型酶第一抑制剂结构域(KD1)多肽序列之前。含有
此种N-末端甲硫氨酸(如甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸)的本描述的纤溶酶抑制多肽的非
限制性实例包括具有SEQ ID NO:7-10、13、14、17、18、26-29、34以及35所示氨基酸序列那些。也考虑下述实施方案：根据在也表达甲硫氨酸氨肽酶(MAP)(该酶能够将N-末端甲硫
氨酸剪切，以将其从初期的多肽产物中去除)的宿主细胞中的本领域接受的实践，重组表
达含有N-末端甲硫氨酸(如甲硫氨酸或N-甲酰甲硫氨酸)的这些或其它本文描述的纤溶
酶抑制多肽中的一种或多种。参见，例如，Natarajan et al.,2011PLoS ONE 6(5):e20176；
Shen et al.,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8108；Shen et al.,1997Prot.
Eng.10:1085。可选地，可通过重组产生所述的MAP酶(如Tsunasawa et al.,1997J.
Biochem.122:843；Bradshaw et al.,1998Trends Bioch.Sci.23:263；Ben-Bassat et
al.,1987J.Bacteriol.169:751)或通过购买获得(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO，如产品
目录号M6435)，并将其用于从合成后的本发明的纤溶酶抑制多肽上去除甲硫氨酸。

[0122] 可将含有半胱氨酸的肽用作可与本文描述的纤溶酶抑制多肽的N-末端和/或C-末端相连的融合肽，以允许根据已建立的方法将此种多肽快速地装配为二硫键交联的
二聚体、三聚体、四聚体或更高聚的多聚体。例如，包含半胱氨酸残基的含有免疫球蛋白基因超家族成员来源的序列的融合多肽能够形成链间二硫桥是已知的，其也是设计S-S连接
的多聚体的其它策略(如Reiter et al.,1994Prot.Eng.7:697；Zhu et al.,1997Prot.
Sci.6:781；Mabry et al.,2010Mabs 2:20；Gao et al.,1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA
96:6025；Lim et al.,2010Biotechnol.Bioeng.106:27)。也考虑将促进多聚体组装的肽
序列作为融合结构域转移至期望的多肽的可选方法，如本文描述的免疫调节肽(如Fan et
al.,2008FASEB J.22:3795)

[0123] 可根据多种已知的方法，生物合成地和/或化学地影响多肽修饰，并且也可包括与载体蛋白偶联(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)或其它
分子)，以及共价或非共价地固定于固体支撑物上。根据某些实施方案，考虑与载体生物合成偶联或化学偶联。

[0124] 如果需要，也可使用肽连接子/间隔区序列，以将多种多肽组分分开至足以确保每条多肽折叠为它的二级结构和/或三级结构的距离。可使用本领域已知的标准技术将此
种肽连接子序列并入融合多肽。某些肽间隔区序列的选择可基于，例如：(1)它们采用灵活的扩展构象的能力；(2)它们不采用可与第一和第二多肽上的功能性抗原表位相互作用的
二级结构的能力；和/或(3)可与所述多肽功能性抗原表位反应的疏水残基或带电残基的
缺乏。

[0125] 在一个示例性实施方案中，肽间隔区含有，例如Gly、Asn和Ser残基。间隔区序列也可包含其它接近中性的氨基酸，如Thr和Ala。可有效地用作间隔区的其它氨基酸序
列包括公开于Maratea et al.,Gene 40:3946(1985)；Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中
的那些。其它的示例性间隔区可包括，例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-G
lu-Ser-Lys-Val-Asp(SEQ ID NO:36)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.87:1066-1070)和 Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe
-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO:37)(Bird et al.,1988,Science242:423-426)。

[0126] 在一些实施方案中，当所述第一和第二多肽含有可用于将功能性结构域分开并防止位阻影响的非必需N-末端氨基酸区域时，就不需要间隔区序列。可将两条编码序
列在没有任何间隔区的情况下直接融合，或通过利用包含例如重复1至3次的五聚体
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:38)的柔性多聚接头融合。

[0127] 在某些示例性实施方案中，肽间隔区为1-5个氨基酸、5-10个氨基酸、5-25个氨基酸、5-50个氨基酸、10-25个氨基酸、10-50个氨基酸、10-100个氨基酸或任何其间范围的氨基酸。在其它示例性实施方案中，肽间隔区的长度为包含约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸。

[0128] 根据某些优选实施方案，纤溶酶抑制多肽可包括肽、多肽或肽模拟物，所述肽、多肽或模拟肽包含具有SEQ ID NO：3-18、22-29和32-35中任一项所示氨基酸序列的不多于 200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、
80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64或63个氨基酸的多肽或与之具有相近的序列同一性或结构特征，其中所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶的活性，并且与具
有SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一
Kunitz-型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)相比，具有降低的抗凝血活性。在某些实施方案中，
所述纤溶酶抑制多肽包含SEQ ID NO：3、5、15或16中任一项所示60-氨基酸序列，或由其
组成。在某些实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽包含SEQ ID NO:7、9、17、18、22、24或32中任一项所示61-氨基酸序列，或由其组成。在某些实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽包含
SEQ ID NO:23、25、26、28、33或34中任一项所示62-氨基酸序列，或由其组成。在某些实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽包含SEQ ID NO:4、6、10、11、13、14、27、29或35中任一项所示
63-氨基酸序列，或由其组成。

[0129] 测定纤溶酶抑制活性和抗凝血活性的方法在本领域是已知的，并且描述于，例如Chand et al.(2004J.Biol.Chem.279:17500),Petersen et al.(1996Biochem.35:266)和
US 2009/0018069(如在0062-0070、0124-0127、0133-0135、0137-0138段和其它地方，包括并入其中的参考文献)。相应地，可基于以统计学上显著的方式可检测的纤溶酶活性(如
纤溶酶蛋白水解活性)的抑制来鉴定纤溶酶抑制多肽，在某些实施方案中可检测到纤溶
酶抑制多肽不存在时的纤溶酶活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％的抑制。纤溶酶抑制的示例性试验测量405nm处溶液光密度的改变，其反应存
在或不存在候选纤溶酶抑制剂时，来自发光的纤溶酶底物H-D-缬氨酰-亮氨酰-赖氨酸
p-硝基苯胺二氢氯化物的p-硝基苯胺通过纤溶酶的释放(S2251,Chromogenix/DiaPharma
Group,West Chester,OH)。

[0130] 如在本领域通常提及的和如本文使用的，序列同一性和序列同源性可互换使用，并且通常指，在将候选序列与参考序列序列对齐并引入缺口(如果需要)，以达到最大的序
列同一性百分比之后，候选序列的核苷酸或氨基酸分别与参考多核苷酸序列或多肽序列中
的核苷酸或氨基酸残基相同的百分比，并且任选地，不考虑将任何保守取代作为序列同一
性的一部分。在某些实施方案中，本文公开的实施方案中的纤溶酶抑制多肽或编码多核苷
酸与本文描述的通式(I)[N-Y-J-Z-C]的纤溶酶抑制多肽序列的氨基酸残基(或编码此种
纤溶酶抑制多肽的多核苷酸的核苷酸)有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约
90％、91％、92％、93％或94％，或者至少约95％、96％、97％、98％或99％相同，对于通式(I)[N-Y-J-Z-C]的纤溶酶抑制多肽序列，其中J是SEQ ID NO:1，且Z选自通式(II)[SEQ ID NO:2]、通式(III)(I-X3-K，其中X3是天然或非天然氨基酸且不是C、F、R或W)、通式(IV)
[SEQ ID NO:20]或通式(V)[SEQ ID NO:21]。可根据熟知的序列分析算法确定此种序列同
一性，包括那些可从威斯康星大学Genetics Computer Group(Madison,WI)获得的算法，如FASTA、Gap、Bestfit、BLAST或其它算法。

[0131] “天然或非天然氨基酸”包括可用作肽、多肽和蛋白生物合成的基石的任何常见的自然存在的氨基酸(如丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨
酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y))，也包括修饰的、衍生的、对映体、罕见的和/或特殊氨基酸，不管其是天然存在的还是合成的，例如N-甲酰甲硫氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、ε-N-甲基赖氨酸、ε-N-三甲基赖氨酸、甲基组氨酸、脱氢酪氨酸、脱氢丙氨酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、同型半胱氨酸、同型丝氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸或其它可从天然来源分离得到和/或可化学合成的氨基酸，例如，如可在Proteins,Peptides and
Amino Acids Sourcebook(White,J.S.and White,D.C.,2002Humana Press,Totowa,NJ)
或在 Aminio Acids and Peptide Synthesis(Jones,J.,2002Oxford Univ.Press
USA,New York)或在Unnatural Amino Acids,ChemFiles Vol.1,No.5(2001Fluka Chemie
GmbH；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO) 或在 Unnatural Amino Acids II,ChemFiles
Vol.2,No.4(2002Fluka Chemie GmbH；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中找到的。对天然和
/或非天然氨基酸的另外的描述可在，例如Kotha,2003Acc.Chem.Res.36:342；Maruoka et al.,2004Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101:5824；Lundquist et al.,2001Org.Lett.3:781；
Tang et al.,2002J.Org.Chem.67:7819；Rothman et al.,2003J.Org.Chem.68:6795；
Krebs et al.,2004Chemistry 10:544；Goodman et al.,2001Biopolymers 60:229；Sabat et al.,2000Org.Lett.2:1089；Fu et al.,2001J.Org.Chem.66:7118；以及 Hruby et
al.,1994Meths.Mol.Biol.35:249中找到。本文使用标准的三字母缩写词或单字母符号来
表示天然和非天然氨基酸。

[0132] 其它非天然氨基酸会氨基酸类似物在本领域是已知的，并且包括，但不限于：非天然L或D衍生物(如存在于肽和/或肽模拟物(如上文出现的和本文其它地方出现的那些)中的D-氨基酸)、荧光标记的氨基酸以及下述具体实例：O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘
基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸(3-idio-tyrosine)、O-炔丙基-酪氨酸、
同型谷氨酰胺、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3-O-乙酰
基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-二羟基苯丙氨酸、氟化的苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、p-叠氮基-L-苯丙氨酸、p-酰基-L-苯丙氨酸、p-乙酰基-L-苯丙氨酸、m-乙酰基-L-苯丙氨酸、硒
基甲硫氨酸、碲基甲硫氨酸、硒基半胱氨酸、炔烃苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、p-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、p-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、p-苯
甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、高炔丙基甘氨酸、叠氮同型丙氨酸、p-碘代-苯丙氨酸、p-溴代-L-苯丙氨酸、二羟基-苯丙氨酸、二羟基-L-苯
丙氨酸、p-硝基-L-苯丙氨酸、m-甲氧基-L-苯丙氨酸、p-碘代-苯丙氨酸、p-溴代苯丙
氨酸、p-氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸、三氟亮氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、D-正亮氨酸(“dNle”或“D-Nle”)、5-氟-色氨酸、对-卤代-苯丙氨酸、同型-苯丙氨酸(“同
型-Phe”)、硒基-甲硫氨酸、乙硫氨基酪酸、S-亚硝基-同型半胱氨酸、硫代脯氨酸、3-噻吩基-丙氨酸、同型-烯丙基-甘氨酸、三氟异亮氨酸、反式和顺式-2-氨基-4-己烯酸、
2-丁炔-甘氨酸、烯丙基-甘氨酸、对-叠氮基-苯丙氨酸、对-氰基-苯丙氨酸、对-乙炔
基-苯丙氨酸、六氟亮氨酸、1,2,4-三唑-3-丙氨酸、2-氟-组氨酸、L-甲基组氨酸、3-甲
基-L-组氨酸、β-2-噻吩基-L-丙氨酸、β-(2-噻唑基)-DL-丙氨酸、高炔丙基甘氨酸
(HPG)以及叠氮同型丙氨酸(AHA)等。

[0133] 在某些实施方案中，如在例如包含于其它天然或非天然氨基酸中的苯丙氨酸或色氨酸或其类似物中所发现的，存在的天然或非天然氨基酸可能含有芳香族侧链，当存在芳
香环系统时，基于其结构技术人员可容易地将其识别，其通常是以单环或多环芳香烃环系
统的形式，仅由氢和碳组成，且含有6-19个碳原子，其中所述环系统可以是部分饱和的或
者是全部饱和的，并且其可以作为基团存在，包括但不需要局限于诸如芴基、苯基和萘基的基团。

[0134] 在某些实施方案中，如在例如包含于其它天然或非天然氨基酸中的丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸或其类似物中所发现的，存在的天然或非天然氨基酸可能含有疏水侧链，当存在疏水侧链(如当在生理环境中时，通常
是一条非极性的疏水侧链)时，技术人员可容易地基于其结构将其识别。在某些实施方案
中，如在例如包含于其它天然或非天然氨基酸中的赖氨酸、精氨酸或组氨酸或其类似物中
所发现的，存在的天然或非天然氨基酸可能含有碱性侧链，当存在碱性侧链(如当在生理
环境中时，通常是极性的且带有正电荷)时，技术人员可容易地基于其结构将其识别。

[0135] 本文公开的纤溶酶抑制多肽和蛋白可包含L-和/或D-氨基酸，只要维持了所述多肽的生物活性(如抑制纤溶酶蛋白水解活性，和/或与TFPI-2KD1(SEQ ID NO:19)相比，
具有降低的抗凝血活性)。在某些实施方案中，所述分离的纤溶酶抑制多肽也可包含通过
反应进行的多种已知的天然或人工翻译后或合成后共价化学修饰中的任何修饰，所述反应
包括糖基化(例如，在天冬酰胺残基处添加N-连接的寡糖、在丝氨酸或苏氨酸残基处添加
O-连接的寡糖、糖化等)、脂肪酰化、乙酰化、甲酰化、PAG化、PEG化和磷酸化。本文公开的多肽还可包括类似物、等位基因和等位基因突变体，后者可包含氨基酸缺失或添加或者一
个或多个氨基酸被其它天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基取代。

[0136] 肽和非肽类似物可被称作肽模拟物或模拟肽，这在制药工业中是已知的(Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986)；Evans et al.J.Med.Chem.30:1229(1987))。
这些化合物可包含一种或多种非天然氨基酸残基、一种或多种化学修饰部分(例如糖基
化、聚乙二醇化、荧光、放射性或其它部分)，和/或一种或多种非天然肽键(例如还原的肽键：--CH2-NH2--)。可通过多种方法产生模拟肽，包括一个计算机化分子模拟、随机突变或定点诱变、基于PCR的策略、化学诱变等。

[0137] 因此，根据某些本公开的实施方案，纤溶酶抑制多肽可包含不多于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、
75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64或63个氨基酸的多肽，包含本文所述的通式(I)[N-Y-J-Z-C]的多肽，在某些实施方案中，其包含SEQ ID NO:3-18、22-29和32-35中任一项所示氨基酸序列，其中所述纤溶酶抑制多肽抑制纤溶酶活性，且与具有SEQ ID NO:19所示
氨基酸序列的野生型人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)多肽第一Kunitz型蛋白酶抑制剂
结构域(KD1)相比，具有降低的抗凝血活性。

[0138] 相应地，在这些或其它实施方案中，将会理解，某些纤溶酶抑制多肽的氨基酸端可由独立选自天然或非天然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50或51-60个氨基酸组成，和/或在某些实施方案中，所述纤溶酶抑制多肽的羧基端可由独立选自天然或非天然氨基酸的0、1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 或 51-60个氨基酸组成，其中此种氨基端和羧基端可含有任何序列，只要所述分离的纤溶酶抑制多
肽不多于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、89、88、87、86、85、84、83、
82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64或63个氨基酸且包含如本文所述的通式(I)[N-Y-J-Z-C]的多肽，并且能够抑制纤溶酶活性，以及与具有SEQ ID
NO:19所示氨基酸序列的野生型TFPI-2KD1相比，表现出降低的抗凝血活性。

[0139] 如本文所述，在通式(I)[N-Y-J-Z-C]的多肽中，Y不存在或者是甲硫氨酸(如在重组设计和表达所述纤溶酶抑制多肽时可引入的N-末端甲硫氨酸；当在细菌中引入时，
其可以是N-甲酰甲硫氨酸)；J除了是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的57个氨基酸
的多肽外，它是Kunitz型蛋白酶第一抑制剂结构域(KD1，参见Chand et al.2004J.Biol.
Chem.279:17500)；并且Z是长度可能为3、4、5或6个氨基酸的KD1羧基区多肽，这取决于
是否存在通式(III)[I-X3-K]、通式(V)[SEQ ID NO:21]、通式(VI)[SEQ ID NO:30]、通式
(VII)[SEQ ID NO:31]、通式(IV)[SEQ ID NO:20]或通式(II)[SEQ ID NO:2]的KD1羧基
区多肽。本文公开了许多通式(I)的代表性的纤溶酶抑制多肽，因而参考本公开，根据本发明的实施方案，那些熟悉本领域的将能够容易地制备和应用其它的纤溶酶抑制多肽。

[0140] 例如，可通过常规的方法学测定代表性的纤溶酶抑制多肽的三维结构，因而几乎可以模拟一个或多个氨基酸被选择的天然或非天然氨基酸的取代，以测定此种衍生
的结构变体是否保留了本公开种类的空间填充特性。参见，例如Bajaj et al.,2011J.
Biol.Chem.286:4329；Chand et al.,2004J.Biol.Chem.279:17500；Bajaj,US
2009/0018069；Huber et al.,1974J Mol Biol.89:73-101；Schmidt et al.,2005J
Biol Chem.280:27832-27838；Wang et al.,1998Science 281,1662-1665；Bajaj et
al.,2001Thromb.Haemost.86,959-972；也可参见，例如 Donate et al.,1994Prot.
Sci.3:2378；Bradley et al.,Science 309:1868-1871(2005)；Schueler-Furman et
al.,Science 310:638(2005)；Dietz et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103:1244(2006)；
Dodson et al.,Nature 450:176(2007)；Qian et al.,Nature 450:259(2007)；Raman et al.Science 327:1014-1018(2010)。可用于这些和相关的实施方案(如用于合理地设计如
本文提供的免疫调节多肽)的计算机算法的一些另外的非限制性实例包括VMD，它是利用
3-D制图和内置脚本来展示、动画模拟以及分析大的生物分子系统的分子可视化程序(参
见伊利诺伊大学乌尔班纳-香槟分校的理论和计算生物物理学组的网站，ks.uiuc.edu/
Research/vmd/)。

[0141] 许多其它的计算机程序在本领域是已知的且是技术人员可用的，并且其能够测定来自能量最小化构象的空间填充模型的原子尺寸(范德华半径)：GRID寻求测定不同
化学基团的高亲和性区域，由此增强结合；蒙特卡洛搜索计算数学对齐(mathematical
alignment)；以及 CHARMM(Brooks et al.(1983)J.Comput.Chem.4:187-217) 和
AMBER(Weiner et al(1981)J.Comput.Chem.106:765)，它们对力场计算进行评估和分
析 (也参见，Eisenfield et al.(1991)Am.J.Physiol.261:C376-386；Lybrand(1991)
J.Pharm.Belg.46:49-54；Froimowitz(1990)Biotechniques 8:640-644；Burbam et
al.(1990)Proteins 7:99-111；Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61:185-190；
以及Kini et al.(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。多种适合的计算的计算机程
序也是可市售的，如从 (Munich,Germany)。

[0142] 本领域众所周知，可将聚亚烷基二醇如聚乙二醇(PEG)与治疗剂相连。据报道，聚亚烷基二醇化的(PAG化的)治疗剂，特别是PEG化的治疗剂可增加溶解度、循环寿命、安全性，减少肾脏的排泄以及降低免疫原性，因此潜在地提供了增加药物递送的方法。PEG化的治疗剂可显示：(a)与相应的非PEG化的化合物相比，在体内的血浆循环半衰期增长；(b)
与相应的非PEG化的化合物相比，治疗指数增加；和(c)与相应的非PEG化的化合物相比，
溶解度增加，从而影响可能的药物递送的增加。

[0143] 根据非限制性理论，聚乙二醇化是将寡糖和合成的聚合物(如聚乙二醇(PEG))位点特异性地和共价地与治疗性蛋白靶标分子相连的过程。聚乙二醇化可通过保护蛋白不受
蛋白水解酶作用以及增加蛋白的表观尺寸，显著增加蛋白的半衰期，因而降低蛋白的清除
速率。此外，PEG偶联物可增加蛋白的溶解度，并对生物分布有有利的影响。PEG化的蛋白
的物理和药理学特性受与多肽相连的PEG链的数量和大小、PEG位点的位置以及用于聚乙
二醇化的化学物的影响。将PEG与蛋白偶联的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺衍生的PEG与
赖氨酸的反应、马来酰亚胺和乙烯砜衍生的PEG与半胱氨酸的1,4-加成反应，以及含有酰
肼的PEG与糖蛋白氧化产生的醛的缩合。本文详细描述了聚乙二醇化的组合物和方法，并
且这在本领域是已知的，例如在美国专利第7,829,659中。

[0144] 由于PEG可溶于水，并可溶于多种有机溶剂，因而PEG是有用聚合物。PEG通常是无毒和无免疫原性的。当将PEG与不溶于水的化合物用化学方法相连时，产生的偶联物通
常变为可溶于水的并且可溶于多种有机溶剂。因此，如本文所使用的，可将PEG化的多肽与它的PEG部分化学相连，其意图包括，但不限于：线性和支链的PEG、甲氧基PEG、可水解降解或可酶解降解的PEG、悬挂型PEG(pendent PEG)、树状聚合PEG、PEG与一种或多种多元醇的共聚物，以及PEG与任何质量和/或大小的PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))的共聚物。

[0145] 公开了使用聚乙二醇来影响药物递送的实例，例如在美国专利第6,623,729号；美国专利第6,517,824号；美国专利第6,515,017号；美国专利第6,217,869号；美国专
利第6,191,105号；美国专利第5,681,811号；美国专利第5,455,027号；美国公开专
利申请第20040018960号；美国公开专利申请第20030229010号；美国公开专利申请第
20030229006号；美国公开专利申请第20030186869号；美国公开专利申请第20030026764
号以及美国公开专利申请第20030017131号中。美国专利第6,214,966号、美国公开专利
申请第2003000447号和美国公开专利申请第2001021763号描述用于使结合分子控释进入
溶液的可溶的、可降解的聚(乙二醇)衍生物。

[0146] 在例如 Greenwald et al.,Adv.Drug Del.Rev.2003,55:217；Molineux,Pharmacotherapy 2003(8Pt 2):3S-8S；Roberts et al.,Adv.Drug Deliv.
Rev.2002,54:459；Bhadra et al.,Pharmazie 2002,57:5,Greenwald,Controlled
Release 2001,74:159；Veronese et al.,Farmaco.1999,54:497；以及 Zalipsky,Adv.
Drug Deliv.Rev.1995:16,157中提供了关于聚乙二醇化的综述。在上述文献中，以及例如
在Greenwald et al.,J.Med.Chem.1996,39:424和在美国专利第7,786,119号中也描述
了制备PEG化的衍生物的方法。本领域技术人员将会容易地识别交替反应步骤，并且包括
描述于，例如"Comprehensive Organic Transformations:A Guide to Functional Group Preparations",Richard C.Larock,Wiley-VCH:1999 和 "March's Advanced Organic
Chemistry:Reactions,Mechanisms and Structure",Jerry March&Michael Smith,John
Wiley&Sons Inc:2001中的反应步骤。

[0147] 多种不同类型和分子量的市售PEG可从例如Nektar Therapeutics、SunBio、Serva(Crescent Chemical Co.)以及Fluka(Sigma-Aldrich)获得，并且包括但不限于如激
活的PEG-NHS酯试剂和NHS PEG乙烯砜的实例。可将这些激活的PEG试剂的实例直接与氨
基环烷醚化合物偶联。Polypure AS,Norway供应基本上只包含一种低聚物的单分散的PEG
和PEG衍生物。当适合时，可方便地将这些单分散的PEG和PEG衍生物用于形成更好的PEG
衍生物。

[0148] 也如上文所描述的，某些实施方案也涉及模拟肽或“人工”多肽。此种多肽可包含一种或多种氨基酸的插入、缺失或取代，一种或多种改变的或人工肽键，一种或多种化学部分(如聚乙二醇、糖基化、标记物、毒素或其它部分)，和/或一种或多种非天然氨基酸。模拟肽的合成在本领域是众所周知的，并且可包含通过下述方法改变的天然存在的蛋白或多肽：化学诱变、单个或多个定点诱变、PCR改组(PCR shuffling)、改变的氨酰基tRNA或氨酰基tRNA合成酶分子的使用、“终止”密码子如琥珀抑制子的使用、四种或五种碱基对密码子的使用或者其它方法。

[0149] 多核苷酸

[0150] 某些实施方案涉及编码本文描述的纤溶酶抑制多肽的核酸分子。产生预期的核酸和/或多肽的方法在本领域是众所周知的。例如，可将核酸和/或多肽从细胞中分离，或者
通过化学合成从头合成。也可将此种核酸或多肽并入载体，并将其转化进宿主细胞。可在
添加有用于诱导启动子、筛选转化子或扩增合适的序列的必需补充物或添加物的标准营养
培养基中培养宿主细胞。

[0151] 此外，纤溶酶抑制多肽的编码多核苷酸或多肽变体可分别包含相对于其天然的编码多核苷酸或多肽(如野生型，或者主要的或天然存在的等位基因形式)的一个或多个核
苷酸或氨基酸的取代、添加、缺失和/或插入。在一些实施方案中，变体包括N-末端L-氨
基酸被D-氨基酸取代的分子，并且在某些其它实施方案中，另外地或可选地，可用D-氨基
酸取代一个或多个其它氨基酸(如不位于N-末端的氨基酸)。在某些实施方案中，变体包
括N-末端α氨基酸被β或γ氨基酸取代的分子。优选地，变体显示与纤溶酶抑制多肽序
列或编码此种多肽的多核苷酸序列的一部分有至少约75％、78％、80％、85％、87％、88％或
89％的同一性，并且更优选地有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可通过将多肽或核酸变体序列与全长的多肽或多核苷酸的相应部分进行
比对，容易地测定所述的序列同一性百分比。一些序列比对的技术包括使用本领域技术人
员熟知的计算机算法，如Align或BLAST算法(Altschul,J.Mol.Biol.219:555-565,1991；
Henikoff and Henikoff,PNAS USA 89:10915-10919,1992)，其可在NCBI网站上获得(参
见[在线的]Internet:省参数。

[0152] 术语“可操作地连接的”意为，在合适的条件下，应用该术语的组分具有允许它们携带其固有功能的联系。例如，将与蛋白编码序列“有效地连接的”转录控制序列与蛋白编码序列连接，以在兼容控制序列的转录活性的条件下实现蛋白编码序列的表达。

[0153] 本文使用的术语“控制序列”指的是能够影响与之相连或有效地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。此种控制序列的性质可取决于宿主有机体。在具体实施方案中，原核生物的转录控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转绿终止序
列。在其它的具体实施方案中，真核生物的转录控制序列可包括包含一个或多个转录因子
识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列以及聚腺苷酸化序列。在某些实施方案中，“控制序列”可包括前导序列和/或融合组分序列。

[0154] 本文提及的术语“多核苷酸”意为单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，组成所述多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这两种核
苷酸的修饰形式。此类修饰可包括碱基修饰，如溴尿苷；核糖修饰，如阿拉伯糖苷和
2',3'-双脱氧核糖；以及核苷酸间连接修饰，如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫
代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯
(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、偶磷酰苯胺酯(phoshoraniladate)
以及氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。

[0155] 术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括含有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸连接”包括寡核
苷酸连接，如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、
硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯 (phosphorodiselenoate)、
phosphoroanilothioate、偶磷酰苯胺酯(phoshoraniladate) 以及氨基磷酸
酯 (phosphoroamidate) 等。参见，例如，LaPlanche et al.,1986,Nucl.Acids
Res.,14:9081；Stec et al.,1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077；Stein et al.,1988,Nucl.Acids Res.,16:3209；Zon et al.,1991,Anti-Cancer Drug Design,6:539；Zon
et al.,1991,Oligo 核苷酸 And Analogues:A Practical Approach,pp.87-108(F.
Eckstein,Ed.),Oxford University Press,Oxford England；Stec et al.,U.S.Pat.
No.5,151,510；Uhlmann and Peyman,1990,Chemical Reviews,90:543，无论出于何种目
的，在此将其公开内容以引用的方式并入本文。寡核苷酸可包含可检测的标志物，以能够检测寡核苷酸或其杂交。

[0156] 使用的术语“载体”指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(如核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”指适合用于转化宿主细胞并含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括，但不限于如转录、翻译和RNA剪切(如果存在内
含子)的过程。

[0157] 本领域技术人员将会理解，多核苷酸可包括表达或适合表达蛋白、多肽、肽等的基因组序列、另外的基因组和质粒编码序列以及更小的改造的基因片段。技术人员可对此种片段进行自然分离或合成修饰。

[0158] 如也可被技术人员认识到的，多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链，并且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子
且以一对一的形式与DNA分子对应的HnRNA分子以及不含内含子的mRNA分子。根据本公
开内容，多核苷酸中可以存在另外的编码或非编码序列，但不必要，并且多核苷酸序列可以与其它的分子和/或支撑材料相连，但不必要。多核苷酸可包括天然序列或可包括编码此
序列的变体或衍生物的序列。

[0159] 因此，根据这些和相关的实施方案，本公开内容也提供编码本文所述的纤溶酶抑制多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，提供包含编码如本文所述的纤溶酶抑制多肽的一
些或全部核苷酸序列的多核苷酸以及此种多核苷酸的互补多核苷酸。

[0160] 在其它相关的实施方案中，多核苷酸变体与编码本文描述的纤溶酶抑制多肽的多核苷酸序列可具有很高的同一性。例如，多核苷酸可以是，用本文描述的方法(例如，如下文所述的使用标准参数的BLAST分析)，与参考多核苷酸序列如具有本文公开的氨基酸序
列的编码纤溶酶抑制多肽的序列相比，具有至少70％的序列同一性，优选具有至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的多核苷酸。本领域技术人员将会认识到，可将这些值进行适当地调整，以通过将密码子的简并性、氨基酸的相似性、阅读框的定位等考虑在内，从而测定两条核苷酸序列编码的蛋白的相应的同一性。

[0161] 通常，多核苷酸变体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地，相对于含有本文所阐述的氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽而言，使变体多核苷酸编码的纤溶酶抑制多肽对纤溶酶的结合亲和力基本上不降低。

[0162] 在某些其它相关的实施方案中，多核苷酸片段可包括与编码如本文所述的纤溶酶抑制多肽的序列相同或互补的序列的不同长度的连续延伸，或基本由其组成。例如，提供包含编码本文公开的纤溶酶抑制多肽或其变体的序列中的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、
190、200、220、240、260、280、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多或其间任何中间长度的连续核苷酸的多核苷酸，或基本由其组成的多核苷酸。将会容易地理解，在本文中的“中间长度”意为在引用的值之间的任何长度，如50、51、52、53等；100、101、102、103等；
150、151、152、153等；包含200-500、500-1,000等的之间的全部整数。可通过未在天然序列中发现的另外的核苷酸将如此处所述的多核苷酸序列的一端或两端进行扩展。这一另外
的序列可由位于编码本文所述的纤溶酶抑制多肽的多核苷酸的一端或两端的1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸组成。

[0163] 在另一个实施方案中，提供可在中等严格至高度严格的条件下，与编码如本文提供的纤溶酶抑制多肽或其变体的多核苷酸序列，或者该序列的片段或互补序列杂交的多核
苷酸。杂交技术在分子生物学领域是众所周知的。为了示例说明，用于测试本文提供的多
核苷酸与其它多核苷酸的杂交的合适的中等严格的条件包括：在5倍SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃、5倍SSC中杂交过夜；然后在65℃，分别用
含有0.1％SDS的2倍、0.5倍以及0.2倍SSC洗涤两次，洗涤20分钟。本领域技术人员将
会理解，可容易地操控杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液中的盐含量和/或杂交进行
的温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严格的杂交条件包括上文描述的那些，除了将杂交的温度升高至60℃-65℃或65℃-70℃。

[0164] 可通过常规的方法学(例如Chand et al.,2004J.Biol.Chem.17:17500；Bajaj,US 2009/0018069；Huber et al.,1974J Mol Biol.89:73-101；Schmidt et
al.,2005J Biol Chem.280:27832-27838；Wang et al.,1998Science 281,1662-1665；
Bajaj et al.,2001Thromb.Haemost.86,959-972)测定代表性的纤溶酶抑制多肽(如
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、
85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101-110、111-120、121-130、
131-140、141-150、151、160、161-170、171-180、181-190或191-200个氨基酸的多肽)的三维结构，包括与纤溶酶蛋白酶结构域复合时，此种多肽的三维结构，从而基本上模拟一个或多个选择的天然或非天然氨基酸的取代、添加、缺失或插入，以测定此种衍生的结构变体是否保留了本公开的纤溶酶抑制种类的空间填充特性。多种用于测定纤溶酶抑制多肽内的合
适的氨基酸取代(或合适的编码所述氨基酸序列的多核苷酸)，从而例如维持纤溶酶蛋白
酶结构域的亲和力或达到更高的亲和力的计算机程序对技术人员而言是已知的。

[0165] 可将本文描述的多核苷酸或其片段(不管所述编码序列自身的长度)与其它DNA序列如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶切位点、多克隆位点、其它的编码片段等组合，以使它们的全长可能有较大变化。因此考虑可使用几乎任何长度的核酸片段，伴随
优选地，全长限于在预期的重组DNA方案中易于制备和应用。例如，考虑全长为约10,000、约9000、约8000、约7000、约6000、约5000、约4000、约3000、约2,000、约1,000、约900、约
800、约700、约600、约500、约400、约300、约200、约190、约180、约170个碱基对等(包括其间所有的中间长度)的示例性多核苷酸片段是有用的。

[0166] 如下文所述，当将多核苷酸序列进行比对时，如果当按最大的一致性进行对齐时，两条序列中的核苷酸序列相同，则说这两条序列是“相同的(identical)”。通常通过在比较窗口比较序列的同一性和比较具有序列相似性的局部区域，对两条序列进行比对。本文使用的“比较窗口”指具有至少约20个连续位点的片段，通常为30-约75、40-约50，当将
序列与具有相同数量的连续位点的参考序列最优对齐之后，可在该窗口将这两条序列进行
比对。

[0167] 可使用缺省参数，使用生物信息学软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的TM TM
Lasergene suite的Megalign 程序将用于比对的序列进行最优对齐。这一程序体现了
在下述参考文献中描述的几个对齐方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary
change in proteins–Matrices for detecting distant relationships.In
Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical
Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,Unified
Approach to Alignment and Phylogenes,pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology
vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,CABIOS
5:151-153(1989)；Myers,E.W.and Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.
D.,Comb.Theor 11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；
Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy–the Principles and Practice
of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.and
Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730(1983)。

[0168] 可选地，可通过下述方法将用于比对的序列进行最优对齐：通过Smith andWaterman,Add.APL.Math 2:482(1981)的局部同一性算法，通过 Needleman and
Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性对齐算法，通过Pearson and Lipman,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜素相似性方法，通过计算机化实施这些算法
(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science
Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA以及TFASTA)，或者通过检查。

[0169] 适合用于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个优选实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.,Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)
和Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。可将BLAST和BLAST 2.0，例如
与本文描述的参数一起使用，以测定两条或更多条多核苷酸之间的序列同一性百分比。可
通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公
开获得用于实施BLAST分析的软件。在一个示例性实例中，可使用参数M(一对匹配残基
的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算核苷酸序列的累积得分。当出
现下述情况时停止每一方向的信息命中(word hits)：累积对齐得分通过量X脱离其最大
实现值；由于一个或多个负得分残基对齐的积累，累积得分变为零或零以下；或者到达每
一系列的末端。所述BLAST算法参数W、T和X决定了对齐的敏感性和速度。BLASTN程序
(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望为(E)10作为默认值，并且BLOSUM62打分矩
阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))对齐使用
(B)为50、期望(E)为10、M＝5、N＝-4作为默认值，且将两条链进行比对。

[0170] 在某些实施方案中，通过在至少有20个位点的比较窗口中将两条最优对齐的序列进行比对来测定所述“序列同一性百分比”，其中在比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列相比(其不含有添加或缺失)，可包含20％或更少的添加或缺失(即缺口)，通常为
5％-15％，或10％-12％，以将两条序列进行最优对齐。通过测定在两条序列的同一位点处存在相同核酸碱基的位点的数量，获得匹配位点的数量，将匹配位点的数量除以参考序列
中位点的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100，来计算所述百分比，从而获得所述的序列同一性百分比。

[0171] 本领域技术人员将会理解，作为遗传密码简并的结果，存在许多编码如本文所述的纤溶酶抑制多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与编码含有如本文公开的氨基酸
序列的纤溶酶抑制多肽的原始多核苷酸序列具有最低的序列同一性。然而，本公开内容明
确涵盖由于密码子选择的差异而改变的多核苷酸。在某些实施方案中，特别涵盖为在哺乳
动物中表达而将密码子优化的序列。

[0172] 因此，在本发明的另一个实施方案中，可使用诱变方法(如定点诱变)来制备本文描述的纤溶酶抑制多肽的变体和/或衍生物。通过该方法，可通过将编码多肽序列的基本
(underlying)多核苷酸进行诱变以对多肽序列进行特定的修饰。这些技术提供了制备和测
试序列变体的简单方法，例如，将前述的一种或多种考虑合并，通过向所述多核苷酸中引入一个或多个核苷酸序列改变。

[0173] 定点诱变允许通过下述方法来产生突变体：使用编码预期突变DNA序列的特定的寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序
列，从而在穿过缺失连接的两侧形成稳定的双链。可将选择的多核苷酸序列进行突变，以改善、更改、降低、修饰或者改变多核苷酸自身的特性，和/或改变编码的多肽的特性、活性、组成、稳定性或其初始序列。

[0174] 在某些实施方案中，考虑对编码本文公开的纤溶酶抑制多肽或其变体的多核苷酸序列进行诱变，以改变编码多肽的一种或多种特性，如所述肽或其变体的纤溶酶-结合亲
和力或者纤溶酶抑制效果。定点诱变技术在本领域是众所周知的，并且被广泛用于产生多
肽和多核苷酸变体。例如，经常使用定点诱变以改变DNA分子的特定部分。在此种实施方
案中，使用通常长度为包括约14个-约25个核苷酸左右的引物，伴随着改变位于序列连接
两侧的约5个至约10个残基。

[0175] 本领域技术人员将会理解，定点诱变技术经常使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型的载体包括如M13噬菌体等的载体。这些噬菌体可容易地
从市场上获得，并且它们的用途对于本领域技术人员是众所周知的。定点诱变也经常使用
双链的质粒，其去除了将目标基因从质粒转移至噬菌体的步骤。

[0176] 通常，通过首先获得单链载体或将序列中含有编码期望肽的DNA序列的双链载体的分开的两条链融化，来实施根据本法进行的定点诱变。通常通过合成来制备含有期望的
突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与单链载体退火，并使其经DNA聚合酶如大肠杆
菌聚合酶I Klenow片段处理，以完成含有突变的链的合成。从而形成异源双链，其中一条
链编码原始的非突变序列，且第二条链含有预期突变。然后将该异源双链载体用于转化合
适的细胞，如大肠杆菌细胞，并且选择包含含有突变的序列排列的重组载体的克隆。

[0177] 使用定点诱变制备选择的肽编码DNA片段的序列变体提供了产生潜在的有用种类的方法，但是由于还有其它获得肽序列变体及其编码DNA序列的方法，因而不限于
此方法。例如，可用诱变剂如羟胺，处理编码期望的肽序列的重组载体，以获得序列变
体。对于这些方法和方案的具体细节可在Maloy et al.,1994；Segal,1976；Prokop and
Bajpai,1991；Kuby,1994和Maniatis et al.,1982的教导中找到，为了该目的，将其以引
用的方式并入本文。

[0178] 本文使用的术语“寡核苷酸定向诱变过程”指依赖于模板的过程以及载体介导的扩增，其导致特定的核酸分子的浓度相对于它的初始浓度有所增加，或者导致可检测的信
号的浓度增加。本文使用的术语“寡核苷酸定向诱变过程”意图指包含引物分子模板依赖
的延伸的过程。术语模板依赖的过程指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链
的序列由众所周知的互补碱基配对原则决定(参见，例如，Watson,1987)。通常，载体介导的方法包括向DNA或RNA载体中引入核酸片段、载体的克隆扩增以及扩增的核酸片段的回
收。美国专利第4,237,224号提供了此种方法的实例，特别地将其以引用的方式整体并入
本文。

[0179] 在另一种用于产生多肽变体的方法中，可使用如美国专利第5,837,458号中描述的递归序列重组。在该方法中，对重组和筛选或选择进行反复循环，以“逐步形成(evolve)”具有例如对纤溶酶的结合亲和力增加的单独的多核苷酸变体。某些实施方案也提供质粒、
载体、转录或表达盒(cassettes)形式的含有至少一种如本文所述的多核苷酸的构建体。

[0180] 根据某些相关的实施方案，提供包含如本文所述的一种或多种构建体的重组宿主细胞、编码纤溶酶抑制多肽或其变体的核酸，以及产生编码产物的方法，此方法包括来自编码核酸的表达。可通过在合适的条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞，方便地实现表
达。在通过表达产生之后，可使用任何合适的技术将纤溶酶抑制多肽分离和/或纯化，然后将其按预期使用。

[0181] 在多种不同的宿主细胞中的用于克隆和表达多肽的系统是众所周知。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母以及杆状病毒系统。本领域可用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑色素瘤细胞以及多种其它细胞常用的、优选的细菌宿主为大肠杆菌。

[0182] 在原核细胞如大肠杆菌中表达肽在本领域是公知的。为了回顾，参见，例如Pluckthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。作为产生重组多肽的一种选择，本领
域技术人员也可在培养中的真核细胞中表达肽，参见最近的综述，例如Ref,(1993)Curr.
Opinion Biotech.4:573-576；Trill et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560。

[0183] 可选择或构建含有合适的调节序列的合适的载体，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志物基因以及其它合适的序列。视情况，载体可以是质粒、病毒(如噬菌体或噬菌粒)。进一步的细节参见，例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition,Sambrook et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。在Current Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,JohnWiley&Sons,1992及其后续的更新中详细描述了许多已知的核酸操作的技术和方案，例如
制备核酸构建体、诱变、测序、向细胞中引入DNA、基因表达以及蛋白分析。

[0184] 使用的术语“宿主细胞”指引入或可引入编码一种或多种本文所的免疫调节多肽的核酸序列的细胞，并且其进一步表达或可表达选择的目的基因，如编码任何本文上述的
纤溶酶抑制多肽的基因。该术语包括亲本细胞的后代，不管所述后代与原始亲本的形态或
基因组成是否相同，只要其存在选择的基因。相应地，也考虑包含向宿主细胞中引入此种核酸的方法。引入可通过使用任何可用的技术进行。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸
钙转染，DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，以及利用逆转录病毒或其它病毒(如牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔以及利用噬菌体的转染。引入之后，可例如通过在可使基因表达的条件下培养宿主
细胞，引起或允许核酸的表达。在一个实施方案中，将所述核酸整合进宿主细胞的基因组
(如染色体)。根据标准技术，可通过包含促进基因组重组的序列来促进整合。

[0185] 在某些实施方案中，为了表达具体的多肽，例如如本文所述的纤溶酶抑制多肽，本发明也提供包括在表达系统中使用如上文所述的构建体的方法。使用的术语“转导”指
将基因从一个细菌转移至另一个细菌，通常通过噬菌体来进行。“转导”也指通过逆转录
病毒获得或转移真核细胞序列。使用的术语“转染”指细胞摄入外来或外源DNA，并且当
已经将外源DNA引入细胞膜内侧时，细胞才被“转染”。本文公开了多种转染技术，并且
这些技术在在本领域是众所周知。参见，例如Graham et al.,1973,Virology 52:456；
Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Laboratories；Davis et al.,1986,Basic Methods In Molecular Biology,Elsevier；以及Chu et al.,1981,Gene 13:197。可将此种技术用于向合适的宿主细胞引入一种或多种
外源DNA部分。

[0186] 本文使用的术语“转化”指细胞基因遗传特征的改变，并且当将细胞修饰以包含新DNA时，细胞才被转化。例如，当将细胞的天然状态进行基因修饰时，细胞才是被转化。转染或转导之后，转化的DNA可通过物理地整合进细胞的染色体而与细胞的DNA重组，或者可作为不复制的游离成分短暂地存在，或者可作为质粒独立地进行复制。当所述DNA随细胞分
裂复制时，才认为一个细胞被稳定转化。当使用的术语“天然存在的”或“天然的”与生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等有关时，它指在自然中发现的且未经人操作的材料。类似地，本文使用的“非天然存在的”或“非天然的”指在自然中没有发现或者被人进行了结构上的修饰或由人合成的材料。

[0187] 某些实施方案也考虑包含一种或多种核酸分子，如编码一种或多种本文所述的纤溶酶抑制多肽的多核苷酸，的转基因动物或转基因植物，可将其用于产生“基因敲除”动物或产生纤溶酶抑制多肽。可使用的一些转基因动物的实例包括山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其它动物。所述转基因动物可以是嵌合的杂合子、非嵌合的杂合子或是非嵌合
的纯合子。(参见，例如，Hogan et al.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual 2ed.,Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson et al.,Mouse Genetics and
Transgenics:A Practical Approach,Oxford Univ.Press(2000)；Pinkert,Transgenic
Animal Technology:A Laboratory Handbook,Academic Press(1999).)

[0188] 癌症

[0189] 也如上文所指出的，某些本公开的实施方案针对预防或减轻已知患有癌症或有患癌症风险的个体的癌症进程或阻止其转移的方法，所述癌症以有害的或者是不合适的蛋白
水解为特征，其是非期望的纤溶酶活性和/或纤溶酶过表达造成的直接或间接结果，例如
多种固体和/或恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌。本文描述了关于具体类型的癌症的某些示例性实例，但是本发明不意图受此限制，并且也可能发现在治疗以有害的纤
溶酶活性为特征的其它癌症中的用途。

[0190] 个体存在癌症或恶性病况指个体中存在发育异常的细胞、癌细胞和/或转化细胞，包括，例如赘生性细胞(neoplastic)、肿瘤细胞、非接触性抑制细胞或致癌基
因转化的细胞等(例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌或前列腺癌或者子宫内膜癌或卵巢癌，
或者表皮组织或内脏表面的癌症(carcinomas)如腺癌、肾细胞癌、鳞状细胞癌、小细
胞癌、燕麦细胞癌等，肉瘤如软骨肉瘤、骨肉瘤等，黑色素瘤)，这在本领域是已知的，
并且已建立了针对它的诊断和分类标准，根据这些征兆、症状和/或风险因子可将
个体认定为患有或有患(或有发展为)具体类型的癌症或恶性病况的风险(例如，
Roulston,J.E.and Bartlett,J.M.S.(Eds.),Molecular Diagnosis of Cancer:Methods
nd
and Protocols(2 Ed.),2004,Humana Press,Totowa,NJ；Hayat,M.A.(Ed.),Cancer
Imaging,2007,Academic Press,NY；Skarin,Atlas of Diagnostic Oncology,2002,Mosby/Elsevier,Philadelphia,PA；Nakamura,R.M.et al.,Cancer Diagnostics,2004,Humana
Press,Totowa,NJ等)。因此，这些和相关的标准是已知的，并且可进一步包括癌症发展和
转移性疾病的测定，即，一个或多个癌症细胞从组织或器官中的初始或原发肿瘤部位扩散
至一个或多个不同的第二部位，肿瘤细胞在此寄住并增殖以形成对个体可产生有害的临床
后果的继发性肿瘤。

[0191] 在某些实施方案中，本公开内容考虑，例如此类肿瘤细胞是成瘤转化的上皮细胞，如癌细胞。某些优选实施方案考虑将本文描述的组合物或方法用于癌症的治疗，所述癌症以在存在过度的纤溶酶活性和/或过表达的组织中发生为特征。

[0192] 例如，可根据识别的疾病发展阶段将形成个体肿瘤的癌症进行分类，例如通过根据肿瘤-结节-转移(TNM)分期系统进行的分级(如Chang et al.,2008CA Cancer J Clin
58:54-59)。如目前在本领域所实践的，癌症的早期阶段代表了疾病发展的早期步骤，其中目前的临床实践包括作为管理策略的所谓的“等待观察”。在“等待观察”中，对疾病进程进行阶段性评估，但是只要癌症仍被周围的上皮所限制而不破坏其下的基底膜，就不进行侵
袭性的处理(如手术)。

[0193] 对于卵巢癌进程也建立了类似的分期范例，例如，国际妇产科联合会(FIGO)据此，通常将卵巢癌分为上皮性卵巢癌阶段I(癌症细胞的发生限于卵巢内部)、II(卵巢
内及盆腔癌细胞)、III(癌症细胞的发生限于卵巢内、盆腔和腹部或接近的区域部位)
和IV(III以及其它(远端的)器官参与，作为癌症部位)，以及复发性的卵巢癌。(TNM
Classification of Malignant Tumours,Sixth Edition,UICC,2002)。也以类似的
方式将子宫内膜癌进程按阶段进行了分类(参见，例如NIH/NCI 癌症信息数据
库,National Cancer Institute,Frederick,MD)：阶段I(癌细胞的发生仅限于子宫内)、
II(在子宫和子宫颈中检测到癌症)、III(癌细胞超出子宫和子宫颈，但限于盆腔区域)和
IV(检测到癌症超出骨盆，包括膀胱、直肠、腹部或腹股沟淋巴结，或超出这些部位)。

[0194] 也根据 TNM分期系统 (American Joint Committee on Cancer(AJCC),TNMClassification of Malignant Tumours,Sixth Edition,UICC,2002)将肾细胞癌进程进行
了界定。因而，阶段I肾细胞癌包括直径不超过7厘米的肾内肿瘤，阶段II包括超出7厘
米的肾内肿瘤，阶段III包括肿瘤限于肾(Gerota’s)筋膜并且到达了受影响的肾脏附近的
一个淋巴结，在阶段IV肾癌细胞已经侵袭了肾筋膜以外的组织，以在受影响的肾脏附近的
多处淋巴结或至少一处远端部位的癌症为证。

[0195] 由于多种为移除含有侵袭和/或转移性癌细胞的癌组织进行的手术治疗的后遗症包含非期望的但经常不可避免的副作用，因而根据某些本文公开的实施方案，通过可阻
止癌症进程发展为侵袭性和/或转移性阶段的治疗即维持“等待观察”状态，来预防或减弱癌症进程或阻止癌症转移是可期望的。相应地且不希望受理论约束，某些本文公开的实施
方案涉及通过以干扰癌症进程并因此将手术需要排除的方式，施用一种或多种本文公开的
纤溶酶抑制多肽，从而将个体的癌症维持在此种侵袭前、转移前阶段。

[0196] 因此，在相关实施方案中提供抑制纤溶酶活性的方法，包括在一定条件下，施用治疗有效量的如本文提供的纤溶酶抑制多肽一段时间，足以抑制纤溶酶活性。在这些和相关的实施方案中，可进一步考虑测定纤溶酶抑制多肽对纤溶酶蛋白水解活性的抑制，例如，通过测定在不存在纤溶酶抑制多肽时，可检测的丝氨酸蛋白酶底物(如显色底物)的纤溶酶
酶剪切水平与存在纤溶酶抑制多肽时，可检测的丝氨酸蛋白酶底物(如显色底物)的纤溶
酶酶剪切水平的差异(具有统计显著性)来进行。

[0197] 保护蛋白不被蛋白水解降解

[0198] 本公开内容某些明确考虑的实施方案针对本文描述的纤溶酶抑制多肽中的任何一种或多种在保护蛋白不被蛋白质-降解酶如蛋白酶(proteases)或蛋白酶
(proteinases)降解中的用途，在具体实施方案中，所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶。相应地，通过包含于多种已知的或考虑的过程的一种或多种本发明的纤溶酶抑制多肽，提供大
量抑制或大幅度降低蛋白水解降解的方法(例如，相对于不存在抑制剂时可检测的蛋白水
解降解而言，以统计上显著的方式降低)。熟悉本领域的人员将会意识到大量的可被有益
地保护而不被非期望的蛋白酶降解的蛋白和蛋白产物。此类人员也将意识到大范围的已知
的用于测定是否存在蛋白水解以及进一步测定本发明的纤溶酶抑制多肽中的任何一种或
多种是否能够有效地抑制或大幅度降低此类蛋白水解的酶分析、生物化学分析及其它的分
析。

[0199] 本发明的纤溶酶抑制多肽的此种有利用途的实例包括在表达期望的蛋白产物的细胞培养物中，在将蛋白从其天然来源(包括也来自细胞培养物的生物样本)纯化的过程
中，以及在用于表达否则可能被纤溶酶、胰蛋白酶或其它的蛋白酶降解的蛋白的转基因动
物的乳汁中，用于阻止蛋白水解的此类多肽的包含物。因此，这些和相关的实施方案将会发现在研究领域、制造领域、工业领域以及其他领域中的用途。

[0200] 将纤溶酶活性位点失活以纯化含有羧基-末端赖氨酸的纤溶酶抑制多肽

[0201] 如本文所述，许多本发明的纤溶酶抑制多肽包含在羧基末端含有赖氨酸的KD1羧基区多肽序列。在不希望被理论约束的情况下，并且考虑到本文描述的纤溶酶抑制多肽的
纤溶酶结合、纤溶酶抑制以及抑制剂-纤溶酶相互作用特性，相信在这些多肽羧基末端的
赖氨酸残基有助于所述纤溶酶抑制多肽的功能活性。特别地且进一步根据非限制性理论，
羧基末端的赖氨酸似乎可通过空间上以及功能上不同于纤溶酶的酶活性位点的赖氨酸结
合位点，允许或促进纤溶酶抑制多肽与纤溶酶的结合。这样，出现在本文所述的纤溶酶抑制多肽中的羧基末端赖氨酸残基赋予了纤溶酶抑制多肽独特的纤溶酶-结合特性，此种结合
可能也会干扰纤溶酶与纤维蛋白的结合。由于通过本文所述的多肽中改变的氨基酸残基
(例如SEQ ID NO:3-18、22-29以及32-35)(对应于SEQ ID NO:19的未改变的TFPI-2KD1
序列第11和17位)可直接抑制纤溶酶活性位点，以及部分由于纤溶酶抑制多肽通过C-末
端赖氨酸与纤溶酶原/纤溶酶的赖氨酸结合位点结合，因此可部分证明本发明的纤溶酶抑
制多肽的双反应性。

[0202] 相应地，本公开内容预想本文所述的纤溶酶抑制多肽对纤溶酶的结合亲和力的实施方案，并且在具体实施方案中，可通过使用纤溶酶原或灭活的纤溶酶作为固定化亲和配
体，用它来分离具有羧基末端赖氨酸的包含KD1的多肽，从而利用来自羧基末端赖氨酸与
纤溶酶上的赖氨酸结合位点的相互作用的结合亲和力。

[0203] 例如，可根据标准的可接受的方法，使用赖氨酸-琼脂糖凝胶柱，从不新鲜的血液(outdated blood)(或新鲜血液)中获得所述血浆，再从血浆中分离纤溶酶原，其中使血浆经过赖氨酸-琼脂糖凝胶柱，并通过纤溶酶原的三环结构域将其捕获。通过用高盐缓冲液
洗涤，将与柱非特异性结合的杂质去除，然后将结合的纤溶酶原用含有作为竞争性亲和配
体的赖氨酸的缓冲液特异性洗脱。然后使洗脱下来的纤溶酶原不含赖氨酸(例如，通过透
析或超滤或其它合适的手段)，并且任选地将其激活以使其转变为纤溶酶，然后可通过用已知的化学抑制剂如氯甲基酮抑制剂(如D-Val-Phe-Lys氯甲基酮)处理而将其活性位点封
闭。然后通过标准方法，将所述的纤溶酶原或被封闭的纤溶酶与固相基质如琼脂糖凝胶或
其它合适的载体偶联，例如，在将琼脂糖凝胶的溴化氰激活后。然后可通过亲和相互作用，将所述的纤溶酶原/纤溶酶琼脂糖凝胶柱用于捕获具有羧基末端赖氨酸的含有野生型KD1
的多肽，或任何本文所述的具有羧基末端赖氨酸的含有KD1的纤溶酶抑制多肽(例如SEQ
ID NO:3-18、22-29以及32-35)。然后用含有赖氨酸的缓冲液竞争性洗脱结合的含有KD1的
多肽，所述缓冲液破坏含有KD1的多肽的羧基末端赖氨酸与纤溶酶的赖氨酸-结合位点的
相互作用。然后将含有KD1的多肽浓缩，并通过标准方法如脱盐柱或透析，将游离的赖氨酸从制备物中去除。通过此方法或基于本公开内容对技术人员显而易见的相关的变化方法，
可获得具有羧基末端赖氨酸的野生型的含有KD1的多肽，或任何本文所述的具有羧基末端
赖氨酸的含有KD1的纤溶酶抑制多肽(例如SEQ ID NO:3-18、22-29以及32-35)，然后可将
其按预期使用，例如，根据任何本文所述的方法使用。

[0204] 药物组合物和施用

[0205] 在某些实施方案中，本发明也涉及含有本文公开的纤溶酶抑制多肽的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含药学可接受的赋形剂、载体或稀释液中的纤溶酶抑制多肽，并且当向动物施用时，优选地为哺乳动物，最优选为人，它的量可有效阻止或减缓癌症进程，或者阻止癌症转移。在其它实施方案中，所述药物组合物包含药学可接受的赋形剂、载体或稀释液中的纤溶酶抑制多肽，并且它的量可对需要抑制纤溶酶活性的个体
进行有效地治疗，例如，在包括向个体施用有效量的本文所述的纤溶酶抑制多肽的方法中。

[0206] 与需要抑制纤溶酶有关的疾病、病症(disorders)和治疗的实例包括，但不限于：肿瘤发生、血管生成、骨再建、手术、血友病、骨科手术、冠状动脉旁路移植术(CABG)以及全身炎症反应综合征(SIRS)。也公开了对需要的个体进行风湿性关节炎治疗的方法，包括向
个体施用有效量的本文所述的纤溶酶抑制多肽。也考虑包含本文所述的纤溶酶抑制多肽的
药物组合物在其它环境中控制出血的用途，例如作为抗纤维蛋白溶解组合物以及作为纤溶
酶过量或tPA或其它可直接或间接促进纤溶酶或其它相关蛋白酶活性的血液活性物质的
解毒剂。

[0207] 可通过提供类似功用的任何可接受的药剂施用模式来施用纯的或以合适的药物组合物的形式的纤溶酶抑制多肽。可通过将纤溶酶抑制多肽与合适的药学可接受的载体、
稀释液或赋形剂组合来制备所述的药物组合物，并且可将其制成固体、半固体、液体或气体形式，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、油膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球以及气雾剂。施用此种药物组合物的典型途径包括，但不限于：口服给药、局部给药、经皮给药、吸入给药、肠胃外给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、鼻内给药、腹腔内给药、静脉内给药、动脉内给药、经皮给药、舌下给药、皮下给药、肌肉内给药、直肠给药、颊部给药、鼻内给药、脂质体给药、通过吸入给药、眼内(intraoccular)给药、通过导管(如在血管成形术中)给
药、通过局部递送给药、皮下给药、脂肪内(intraadiposal)给药、关节内给药或鞘内给药。
本文使用的术语肠胃外给药包括皮下注射，静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输液技术。制备药物组合物，以允许在向患者施用所述组合物时，其中包含的活性成分是生物可利用的。将向个体或患者施用的组合物采用一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单个
剂量单位，装有气雾剂形式的本发明的化合物的容器中可含有多个剂量单位。对本领域技
术人员而言，制备此种剂量形式的实际方法是已知的，或者将是显而易见的；例如，参见The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。根据本教导，在任何情况下，施用的组合物将含有治疗有效量的可用于治疗目标疾病或病况的纤溶酶抑制多肽。

[0208] 本文的有用的药物组合物也含有药学可接受的载体，包含任何合适的稀释液或赋形剂，其包括自身不引起产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何药物制剂，并且它的
施用没有异常毒性。药学可接受的载体包括，但不限于液体，如水、盐水、甘油以及酒精等。
在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.current edition)中给出
了对药学可接受的载体、稀释液以及其它赋形剂进行的深入讨论。

[0209] 药物组合物可以是固体或液体形式。在一个方面，所述载体是微粒，所以所述组合物是，例如片剂或粉剂形式。所述载体可以是液体，伴随着所述组合物为，例如口服糖浆、可注射的液体或气雾剂，其可用于，例如吸入给药。当意图口服给药时，所述组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬液和凝胶形式也作为固体或液体包含于本文考虑的形式内。

[0210] 作为用于口服给药的固体组合物，可将所述药物组合物制成粉剂、颗粒、压缩片、丸剂、胶囊、口香糖、干胶片(wafer)或类似的形式。此种固体组合物将通常含有一种或多种惰性稀释液或可食用的载体。此外，可存在下述的一种或多种：粘结剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，如海藻酸、海藻酸钠、初生凝胶、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷油、水杨酸甲脂或橙香精；以及着色剂。

[0211] 当所述药物组合物为胶囊形式如明胶胶囊时，其除了包含上述类型的材料外，可包含液体载体如聚乙二醇或油。

[0212] 所述药物组合物可以为液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬液。作为两个实例，所述液体可用于口服给药或通过注射递送。当意图口服给药时，优选的组合物除含有本发明的化合物之外，还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及增味剂。在意图注射给药的组合物中，可包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂以及等渗剂中的一种或多种。

[0213] 所述液体药物组合物，不管是溶液、悬液还是其它类似的形式，可包含下述佐剂中的一种或多种：无菌稀释液，如注射用水、盐溶液，优选地为生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；固定油，如可用作溶剂或悬浮介质的合成单甘脂或双甘酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节紧张性的药剂，如氯化钠或右旋糖。可将所述肠胃外制剂密封于安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选为无菌的。

[0214] 意图肠胃外给药或口服给药的液体药物组合物应含有一定量的纤溶酶抑制多肽，以获得合适的剂量。通常，组合物中的纤溶酶抑制多肽的量至少为0.01％。当意图口服给
药时，这一量可在组合物重量的0.1％-约70％之间变化。优选的口服药物组合物含有约
4％-约50％的纤溶酶抑制多肽。制备根据本发明的优选的药物组合物和制剂，以使肠胃外
剂量单位含有0.01％-10％重量的纤溶酶抑制多肽。

[0215] 可意图将所述药物组合物局部给药，在这种情况下载体可适当地包括溶液、乳剂、油膏或凝胶基质。所述基质，例如，可包括下述中的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释液如水和酒精，以及乳化剂和稳定剂。局部施用的增稠剂药物组合物中可存在增稠剂。如果意图经皮给药，所述组合物可包含透皮贴剂或离子导入装置。局部制剂可含有浓度为约0.1％-约10％w/v(每单位体积的重量)的所述纤溶酶抑制多肽。

[0216] 特别地，某些实施方案考虑将本文公开的纤溶酶抑制多肽制成贴剂以促进止血，如纤维蛋白原贴剂或含有纤维蛋白原的贴剂。此种贴剂可用于多种上述用途，例如，在主
要伤口部位。多种局部的和其它的止血贴剂是已知的(例如，Erdogan et al.,2008J.
Biomed.Mat.Res.B Appl.Biomat.85:272；Spotnitz et al.,2012Transfusion 52:2243；
Schuetz et al.,2004Ann.Thorac.Surg.78:569；van de Walle et al.,2012Acta.
Biomater.8:4080)，并且因为这样(as such)，基于本文的教导，本领域技术人员可容易地预想将本公开的纤溶酶抑制多肽掺入到此类贴剂中。

[0217] 在其它实施方案中，可意图将本发明的药物组合物直肠给药，以例如栓剂的形式，其可在直肠中融化并释放所述的纤溶酶抑制多肽。直肠给药的所述组合物可含有作为合适的无刺激性赋形剂的油性基质。此类基质包括，不限于：羊毛脂、可可油和聚乙二醇。

[0218] 含有本文提供的纤溶酶抑制多肽的本发明的药物组合物还可包含不同的材料，这些材料可修饰固体或液体剂量单位的物理形态。例如，所述组合物可包含在活性成分周围
形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可选自例如糖、虫胶以及其它的肠溶性包衣剂。可选地，可将所述活性成分包裹于明胶胶囊中。所述固体或液体形式的药
物组合物可包含与纤溶酶抑制多肽结合并因而帮助多肽递送的药剂。在这一方面可发挥作
用的合适的药剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白或脂质体。

[0219] 所述药物组合物可由用作气雾剂使用的剂量单位组成。使用的术语气雾剂表示从那些多种胶体性质的系统到由压缩包组成的系统范围内的多种系统。可通过液化气体或压
缩气体或者通过将活性成分进行分配的合适的泵系统来递送。可以在单相、双相或三相系
统中递送气雾剂，以递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、激活剂、阀门、子容器等，这些可共同组成试剂盒。在不进行过度实验的情况下，本领域技术人员就可确定优选的气雾剂。

[0220] 可通过制药领域众所周知的方法学来制备本发明的药物组合物。例如，可通过将纤溶酶抑制多肽与无菌蒸馏水以及任选地合适的稳定剂、溶质和/或渗透剂组合以形成溶
液来制备意图注射给药的药物组合物。可加入表面活性剂以促进均匀溶液或悬液的形成。
表面活性剂是与纤溶酶抑制多肽非共价相互作用，以促进水递送系统中的多肽溶解或均匀
悬浮的化合物。

[0221] 按治疗有效量施用所述纤溶酶抑制多肽，该量可根据多种因素而发生变化，这些因素包括：具体多肽的活性；纤溶酶抑制多肽的代谢稳定性和作用长度；患者的年龄、体
重、总体健康状况、性别以及饮食；施用模式和时间；排泄速率；药物组成；具体疾病或病况的严重性以及正在接受治疗的个体。通常，治疗有效的日剂量(对于70Kg的哺乳动物)为
约0.001mg/Kg(即0.07mg)-约100mg/Kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70Kg的
哺乳动物)为约0.01mg/Kg(即0.7mg)-约50mg/Kg(即3.5g)；更优选地，治疗有效剂量
(对于70Kg的哺乳动物)为约1mg/kg(即70mg)-约25mg/Kg(即1.75g)。

[0222] 本文提供的有效剂量范围不意图具有限制性，并且其代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量应根据单个个体来制定，这是相关领域技术人员理解和可确定的(参见，th
例如Berkowet al.,eds.,The Merck Manual,16 edition,Merck and Co.,Rahway,N.
J.,1992；Goodman et al.,eds.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis
th
of Therapeutics,10 edition,Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.,(2001)；
Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and
Therapeutics,3rd edition,ADIS Press,LTD.,Williams and Wilkins,Baltimore,MD.
(1987),Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,Boston,(1985)；Osolci
th
al.,eds.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18 edition,Mack Publishing
Co.,Easton,PA(1990)；Katzung,Basic and Clinical Pharmacology,Appleton and
Lange,Norwalk,CT(1992))。

[0223] 视情况，可通过在一天中施用多剂量或单一剂量的形式来施用每一治疗所需的总剂量。通常，治疗由少于纤溶酶抑制多肽最佳剂量的较小剂量起始。此后，小增量地增加剂量直至达到在此种情况下的最佳效果。所述纤溶酶抑制多肽可单独施用，或者与其它针对
病理或针对病理上的其它症状的诊断和/或药物联合施用。纤溶酶抑制多肽的施用受体可
以是任何脊椎动物，如哺乳动物。在哺乳动物中，优选的受体为灵长目(Orders Primate)
(包括人、猿类和猴)、偶蹄目(包括马、山羊、牛、羊、猪)、啮齿目(包括小鼠、大鼠、兔和仓鼠)以及食肉目(包括猫和狗)的哺乳动物。在鸟类中，优选的受体为火鸡、家鸡以及同一
目中的其它成员。最优选的受体为人。

[0224] 对于局部施用，优选向目标区域施用有效量的含有纤溶酶抑制多肽的本发明药物组合物，例如与要被治疗的那些组织相邻的皮肤表面、粘膜等。这一量通常为，每次施用约
0.0001mg-约1g的纤溶酶抑制多肽，这取决于要治疗的区域，用途是诊断性、预防性还是治疗性的，症状的严重性以及使用的局部媒介物的性质。优选的局部制剂为油膏，其中每毫升油膏基质使用约0.001-约50mg的活性成分。可将所述药物组合物制成经皮的组合物或经
皮递送装置(“贴剂”)。此类组合物包括，例如背衬、活性化合物贮库、控制膜、衬垫和接触胶黏剂。可将此类透皮贴剂用于提供连续脉冲或如期望的按需递送本发明的纤溶酶抑制多
肽。

[0225] 可使用本领域已知的方案来制备所述的纤溶酶抑制多肽，从而在向患者施用后可提供活性成分的快速释放、维持释放或延迟释放。控释药物递送系统递送系统包
括含有聚合物包被的贮库或药物-聚合物基质制剂的渗透泵系统和溶解系统。在美国
专利第3,845,770号和第4,326,525号以及P.J.Kuzma et al.,Regional Anesthesia
22(6):543-551(1997)中给出了控释系统的实例，将其全部以引用的方式并入本文。

[0226] 也可通过鼻内药物递送系统递送所述纤溶酶抑制多肽，以进行局部、全身以及TM
鼻-脑的医学治疗。Controlled Particle Dispersion(CPD) 技术、传统的鼻用喷雾瓶、
吸入器或喷雾器是本领域技术人员已知的，其可通过靶向嗅部和鼻旁窦来提供药物的有效
的局部和全身递送。

[0227] 某些实施方案也涉及适合向女性或雌性动物施用的阴道内壳或核心药物递送装置。所述装置可包括被鞘包围的聚合物基质中的药物活性成分，并且类似于PCT公开专利
第WO 98/50016中描述的应用睾酮的装置，能够以基本零阶的方式每天释放所述纤溶酶抑
制多肽。

[0228] 用于眼部递送的现行方法包括局部施用(滴眼剂)、结膜下注射、眼周注射、玻璃体内注射、手术植入和离子导入法(用低电流将电离的药物运送至身体组织，并经过身体
组织)。为了安全和有效地眼内施用，本领域技术人员会将最适赋形剂与所述纤溶酶抑制多肽组合。

[0229] 最合适的途径将取决于要治疗的病况的性质和严重性。本领域技术人员也熟悉确定施用方法(例如口服给药、静脉内给药、吸入给药、皮下给药、直肠给药等)、剂量形式、合适的药物赋形剂以及与向需要抑制纤溶酶活性的个体递送所述纤溶酶抑制多肽有关的其
它事项。

[0230] 根据不同的考虑的实施方案，所述需要抑制纤溶酶活性的个体可患有癌症(例如，实体瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌或结肠癌，或者另外的癌症)、血友病、风湿性关节炎或全身炎症反应综合征(SIRS)，或有疑似处于患有这些疾病的风险，或者所述个体可能需要
或已经接受血管生成、骨再建或冠状动脉旁路移植术(CABG)。所述个体可能正在接受手术
或可能近期(例如1、2、4、6、8、10、12或24小时内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内)接受过手术，例如心血管手术、肿瘤手术、泌尿生殖器手术、骨科手术、胸部手术、整形手术、创伤手术、腹部手术、移植手术、神经外科手术或耳鼻喉科手术。

[0231] 相关领域技术人员将熟悉可适于施用本文所述的药物组合物的任何数量的诊断标准、手术标准和其它的临床标准。参见，例如Humar et al.,Atlas of Organ
Transplantation,2006,Springer；Kuo et al.,Comprehensive Atlas of Transp
lantation,2004Lippincott,Williams&Wilkins；Gruessner et al.,Living Donor
Organ Transplantation,2007McGraw-Hill Professional；Antin et al.,Manual of
Stem Cell and Bone Marrow Transplantation,2009Cambridge University Press；
Wingard et al.(Ed.),Hematopoietic Stem Cell Transplantation:A Handbook
for Clinicians,2009American Association of Blood Banks；Sabiston,Textbook
of Surgery,2012Saunders&Co.；Mulholland,Greenfield’s Surgery,2010Lippin
cott,Williams&Wilkins；Schwartz’s Principles of Surgery,2009McGraw-Hill；
Lawrence,Essentials of General Surgery 2012Lippincott,Williams&Wilkins。

[0232] 将会理解，可使用，除非专门表明反对，病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学中的传统方法以及本领域技术内的重组DNA技术来实践本发明的一些实施方案，并
且为了示例说明的目的，下文描述了其中的许多方法。在文献中透彻地解释了此类技
术。参见，例如Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocals in
Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel et al.,Short Protocals rd
in Molecular Biology,3 ed.,Wiley&Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis et al.Molecular
Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach,vol.
I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid
Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(B.
Hames&S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)以及其它类似的参考文献。

[0233] 可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养以及转化(例如电穿孔、脂质体转染)。可根据制造商的说明书或按本领域通常完成的或如本文所述来实施酶反应或
纯化技术。通常根据本领域众所周知的传统方法以及在整个本说明书中引用和讨论的不
同的通用和更具体参考文献中所述的方法来实施这些以及相关的技术和方法。除非提供
具体定义，使用的与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药物化学中的实验室方法和技术有关的术语是那些在在本领域众所周知的且常用的术语。可将标准技术
用于重组技术，分子生物学、微生物学、化学合成，化学分析、药物制备(preparation)、制剂(formulation)和递送，以及患者的治疗。

[0234] 如在本说明书和附加权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数(plural references)，除非内容里有其它明确规定。贯穿本说明书，除非上下文需要，否则单词“包括(comprise)”或其变形如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将被理解为指，包含阐述的元素(element)或整数(integer)或者元素组或
整数组，但不排除任何其它元素(element)或整数(integer)或者元素组或整数组。本说
明书中的每一实施方案将比照(mutatis mutandis)每一其它实施方案来应用，除非有其它
明确规定。

[0235] 等同

[0236] 当为了示例说明，在本文展示或描述本发明的具体步骤、元素、实施方案以及应用时，由于在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可具体根据前述教导进行修饰，因而当然将会理解本发明不限于前述教导。相应地。本发明除受所附的权利要求
的限制外，不受限制。

[0237] 下述实施例以示例说明的方式呈现，并且不具有限制性。实施例

[0238] 实施例1

[0239] 纤溶酶抑制多肽的抑制活性

[0240] 可通过将人组织因子通路抑制剂-2第一Kunitz结构域(KD1)的编码序列进行定点诱变来设计根据本公开内容的纤溶酶抑制多肽，利用重组技术将其在大肠杆
菌中表达，以及根据已建立的方法学对其进行基本纯化(Bajaj et al.,2011J.Biol.
Chem.286:4329)，除了本发明的纤溶酶抑制多肽序列是首次在本文中描述的。该实施例描
述了含有SEQ ID NO:3和5所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽的特征。

[0241] 如所述的，在用于分析纤溶酶活性的分析(Bajaj et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329)中利用人纤溶酶(Hematologic Technologies,Essex Junction,VT)
对所述纤溶酶抑制多肽对纤溶酶的抑制进行测试，将H-D-Val-Leu-Lys-p-硝基苯胺
(S-2251,Diapharma,West Chester,OH)作为纤溶酶底物，并使用不同浓度的所示纤溶酶抑
制多肽。图1显示了含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对纤溶酶活性的
抑制。计算的抑制常数(Ki)为2.36nM。图2显示了含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的
纤溶酶抑制多肽对纤溶酶活性的抑制。计算的抑制常数(Ki)为0.49nM。

[0242] 基本上如所述的(Chand et al.,2004J.Biol.Chem.279:17500；Bajaj etal.,2011J.Biol.Chem.286:4329)，也在使用可溶的人组织因子(100nM)和因子
VIIa(50nM)以及显色底物S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-p-硝基苯胺,Diapharma)的分析中，
对不同浓度的包含SEQ ID NO:3的纤溶酶抑制多肽对因子VIIa-组织因子的酰胺水解活性
的抑制进行了测试。图3显示了包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对因
子VIIa-组织因子的酰胺水解活性的作用。计算的抑制常数(Ki)为5869.5nM。

[0243] 图4显示了包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽对因子XIa酰胺水解活性(实心圆)和激肽释放酶酰胺水解活性(空心圆)抑制分析的作用。根据Bajaj
et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329中所述的方法来实施这些分析。

[0244] 根据Bajaj et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329中所述的方法，但是使用不同浓度的本文所述的包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽(SM)、本文所述的包
含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽(DM)以及抑肽酶(BPTI)，测试在血浆凝
固纤维蛋白溶解分析中，不同浓度的上述三种蛋白对凝固时间的影响。具体结果(Typical results)显示于图5中。

[0245] 实施例2

[0246] 纤溶酶抑制多肽的纤溶酶-抑制活性

[0247] 在一组单独的实验中，对纯化的重组产生的包含SEQ ID NO:3、4、5和6所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽各自在体外对人纤溶酶活性的抑制进行测试，使用H-D-缬氨
酰-亮氨酰-赖氨酸p-硝基苯胺二氢氯化物(S2251,Chromogenix/Diapharma)作为底物。
使用抑肽酶作为阳性对照。将纤溶酶抑制剂在Tris-缓冲盐水(TBS)中连续稀释，并将其
分至96孔板中至终浓度为0.1nM-60nM。加入纤溶酶，以使每个反应产生1.2nM的终浓度。
将孔室温孵育1小时，然后向每孔加入S2251至终浓度为300μM，并将板在37℃再孵育1
小时。基于p-硝基苯胺从底物中释放所产生的405nm处光密度的改变速率计算纤溶酶活
性。然后将数据拟合为4-参数对数曲线以测定表观IC50。进行两次独立实验，并且分别测
定每一样品的纤溶酶抑制活性。结果显示于表1中：

[0248]纤溶酶抑制多肽 IC50(nM)
I.
SEQ ID NO:3 1.8
SEQ ID NO:5 3.4
抑肽酶(阳性对照) 0.48
II.
SEQ ID NO:4 0.80

[0249]SEQ ID NO:6 1.8
抑肽酶 0.57

[0250] 实施例3

[0251] 纤溶酶抑制多肽与纤溶酶的直接结合

[0252] 进行表面等离子体共振(SPR)实验，以表征固定化的纤溶酶与每一含有SEQ IDNO:3、5和6的本文所述的纤溶酶抑制多肽之间的结合相互作用。根据制造商的说明书，
TM
在这些分析中使用The BiaCore SPR仪器(GE Healthcare)。用氯甲基酮抑制剂(如
D-Val-Phe-Lys氯甲基酮二氢氯化物,EMD Biosciences,La Jolla,CA)封闭人纤溶酶的活
TM
性位点，并将活性位点封闭的纤溶酶固定化于BiaCore CM5芯片。

[0253] 图6显示了在表面等离子体共振分析中，不同浓度的纤溶酶抑制多肽(1、2、4、8和10μM的SEQ ID NO:3和5；1、2、4、8、10和12μM的SEQ ID NO:6)与固定化的活性位点封
闭的纤溶酶的结合。上方的图(60A)显示了含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的纤溶酶抑
制多肽与纤溶酶的结合。通过SPR测定的亲和结合常数为130nM。中间的图(60B)显示了
包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的纤溶酶抑制多肽与纤溶酶的结合。通过SPR测定的亲
和结合常数为313nM。底部的图(63-残基)显示了包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的纤
溶酶抑制多肽与纤溶酶的结合。通过SPR测定的亲和结合常数为290nM。在表面等离子体
共振分析中，抑肽酶不与活性位点封闭的纤溶酶结合。三条纤溶酶抑制多肽与纤溶酶的结
合亲和力都为凝血酸或ε-氨基乙酸的4-8倍。

[0254] 实施例4

[0255] 纤溶酶抑制多肽与纤溶酶的模拟结合

[0256] 根据所述的方法学(Bajaj et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329)，也对人纤溶酶三环结构域1与具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽之间
的相互作用进行3维模拟。在SEQ ID NO:4中，KD1羧基区多肽(氨基酸58-63)具有SEQ
ID NO:2所示序列I-X3-K-V-X4-K，其中X3是E且X4是P。观察到SEQ ID NO:4第60位
的赖氨酸残基的侧链指向外侧，并且不干扰或促进纤溶酶和所述纤溶酶抑制多肽之间的结
合相互作用。预期SEQ ID NO:4第63位的赖氨酸残基将在体内被激活的TAFI(凝血酶激
活的纤维蛋白溶解抑制剂)剪切，这将因此产生具有SEQ ID NO:20所示KD1羧基区多肽
I-X3-K-V-X5(氨基酸58-62)的62个氨基酸的纤溶酶抑制多肽SEQ ID NO:25，其中X3是
E且X5是P，以产生C-末端序列IEKVP(SEQ ID NO:40)。

[0257] 根据所述的方法学(Bajaj et al.,2011J.Biol.Chem.286:4329)，也对纤溶酶三环结构域1与具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的60个氨基酸的纤溶酶抑制多肽之间的相
互作用进行三维模拟。在SEQ ID NO:3中，所述KD1羧基区多肽具有序列I-X3-K-(氨基酸
58-60)，其中X3是E。在该结合相互作用中，观察到SEQ ID NO:3第60位的赖氨酸残基的
侧链适合进入人纤溶酶三环结构域的赖氨酸结合位点(LSB)。这些相互作用类似于用SEQ
ID NO:25的62个氨基酸的纤溶酶抑制多肽模拟的纤溶酶相互作用时观察到的那些，其中
SEQ ID NO:25的KD1羧基区多肽(氨基酸58-62)具有序列IEKVP(SEQ ID NO:40；SEQ ID
NO:20，其中X3是E且X5是P)。

[0258] 通过非限制性理论，相信通过TAFI将C-末端K60从SEQ ID NO:3的60个氨基酸的纤溶酶抑制多肽上去除，可产生不能与人纤溶酶三环结构域的LSB结合的分子。通
过比较，并且也如上文所指出的，如果以具有IEK60VPK63作为KD1羧基区多肽的SEQ ID
NO:4的63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽代替为起始，通过TAFI将K63去除仍会产生保留了
KD1(C-末端为IEKVP62)与纤溶酶的LSB的结合能力的62个氨基酸的纤溶酶抑制多肽(SEQ
ID NO:25)。这一62个氨基酸的纤溶酶抑制多肽(SEQ ID NO:25)不是TAFI的底物，因而
不会失去其与纤溶酶的LSB结合的能力。

[0259] 三维模拟研究显示，相对于人组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2；SEQ ID NO:19)的野生型的第一Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD1)，除了在第17位用精氨酸取代亮氨酸
(L17R)之外，在第11位用苏氨酸取代酪氨酸(例如,如SEQ ID NO:3、4、11、15、24、25、32、
33中的Y11T)，允许在纤溶酶抑制多肽与纤溶酶之间形成氢键，以相对于仅进行L17R取代
时被允许的相互作用而言(例如，如在SEQ ID NO:5、6、12、23中的)，加强纤溶酶与纤溶酶抑制多肽之间的相互作用。

[0260] 相应地，并且考虑到前文，含有L17R取代的60个氨基酸的纤溶酶抑制多肽(如SEQ ID NO:5)以及63个氨基酸的纤溶酶抑制多肽(如SEQ ID NO:6)都具有作为纤溶酶活
性位点抑制剂的活性，并且可与三环结构域中的赖氨酸结合位点结合，这提供了两种纤溶
酶抑制活性的模式。因此，这两种形式具有双活性。进一步，由于在体内通过激活的TAFI
将所述63个氨基酸形式的C-末端的K63去除之后，所产生的62个氨基酸形式中仍含有
K60并且可与赖氨酸结合位点相互作用，因而所述63个氨基酸的形式保留了它与赖氨酸结
合位点相互作用的能力。含有第11位被取代(例如SEQ ID NO:3，如Y11T)以及第17位被
取代(例如SEQ ID NO:3，如L17R)的60个氨基酸的纤溶酶抑制多肽和63个氨基酸的纤溶
酶抑制多肽都是更强的纤溶酶抑制剂，并且由于其可通过C-末端赖氨酸与纤溶酶原/纤溶
酶上的赖氨酸结合位点结合，因而是双反应性的。

[0261] 实施例5

[0262] 含有选择性Kunitz抑制结构域的诱饵纤溶酶原受体

[0263] 该实施例描述了组织因子通路抑制剂-2的Kunitz结构域1(KD1)，其中将P2'残基Leu17(牛胰蛋白酶抑制剂编号)突变为Arg，并且其以增加了5倍的亲和力选择性抑制
纤溶酶的活性位点。将KD1突变体(Leu17Arg)用凝血酶剪切(以1:50的酶与底物之比，
进行24小时的延长孵育)，获得含有的完整的Kunitz结构域(其在活性位点抑制功能上
无可测定的改变)的更小分子。NH2-末端测序以及MALDI-TOF/ESI数据显示起始分子含有
C-末端缬氨酸(KD1L17R-VT)，而更小的分子含有C-末端赖氨酸(KD1L17R-KT)。对含有C-末端赖氨酸的KD1L17R-KT作为纤溶酶原/纤溶酶诱饵受体的潜在活性进行检测，包括其对纤溶酶原活性的抑制以及产生的纤溶酶的活性位点的抑制。

[0264] 在表面等离子体共振实验中，组织纤溶酶原激活剂(tPA)以及Glu-纤溶酶原与KD1L17R-KT结合(Kd～0.2-0.3μM)，但不与KD1L17R-VT结合。进一步，KD1L17R-KT比KD1L17R-VT更有效地抑制tPA-诱导的血浆凝块纤维蛋白溶解，此外，与ε-氨基己酸相比，在其中纤维蛋白溶解系统被激活的小鼠肝脏裂伤损伤模型中，KD1L17R-KT可更有效地减少失血。在佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯刺激的U937单核样细胞中，所述微(μ)-纤溶酶-KD1L17R-KT
复合物抑制尿激酶-诱导的纤溶酶原激活，而μ-纤溶酶-KD1L17R-VT复合物不能抑制该过
程。

[0265] KD1L17R-KT抑制纤溶酶的活性位点，并且是纤溶酶原/纤溶酶三环结构域的诱饵受体，因而它能限制纤溶酶的产生和纤溶酶的活性。因此在某些优选实施方案中，具有双功能的KD1L17R-KT可能是控制病理过程中的纤溶酶原激活的优选药物。

[0266] 在实施例5中使用的缩略词为：BPTI，牛胰蛋白酶抑制剂；BSA，牛血清白蛋白；εACA，ε-氨基己酸；ECM，细胞外基质；FXIa，因子XIa；Glu-Plg，Glu-纤溶酶原；HBS/BSA，pH 7.5，含有100mM NaCl、0.1mg/ml BSA的50mM Hepes，pH 7.5；HBS-P，含有100mM NaCl、
0.005％(v/v)P20的20mM Hepes，pH 7.4；IIa，凝血酶；IPTG，异丙基硫代半乳糖苷；KD1，Kunitz结构域1；MMP，基质金属蛋白酶；NPP，正常混合的血浆；PAI-1，纤溶酶原激活剂抑制剂-1；PAI-2，纤溶酶原激活剂抑制剂-2；PMA，12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯；S-2251，H-D-Val-Leu-Lys-p-硝基苯胺；S-2366，焦Glu-Pro-Arg-p-硝基苯胺；SPR，表面等离子体共振；TBS，pH 7.5，含有100mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH 7.5；TBS/BSA，含有0.1mg/ml BSA的TBS；TE，凝血酸；TFPI-2，组织因子通路抑制剂-2；tPA，组织纤溶酶原激活剂；pKLK，血浆激肽释放酶；uPA，尿激酶纤溶酶原激活剂。

[0267] KD1与BPTI残基编号.根据Schechter and Berger65，对KD1和BPTI的残基P2、P1、P1′、P2′进行编号。其在酶中相应的亚位点分别为S2、S1、S1′、S2′。所述残基编号与BPTI对应，以使残基15位于P1位点且残基17位于P2′。为了比较，使用BPTI的编
号系统将KD1进行编号，以使BPTI第15和17位的残基分别与KD1第24和26位的残基对
应。因此，KD1中的残基与BPTI中的相差9个残基。

[0268] KD1L17R-VT定义.KD1L17R-VT含有人TFPI-2第1-73位的残基，在其N-末端也含有克66
隆过程中引入的4个额外的残基(Gly-Ser-His-Met)。它含有C-末端残基缬氨酸。

[0269] KD1L17R-KT定义.约80％的KD1L17R-KT含有人TFPI-2残基8-72，且剩余的20％含有人TFPI-2残基10(BPTI中的残基1)-72；它含有C-末端残基赖氨酸。在此，将这两种共
同称作KD1L17R-KT。

[0270] 将胰凝乳蛋白酶的氨基酸编号系统用于纤溶酶和IIa的蛋白酶结构域。胰凝乳蛋白酶编号中的第195位残基与纤溶酶第741位的残基以及IIa第525位的残基对应。类似
地，胰凝乳蛋白酶编号中的第189位的残基与纤溶酶第735位的残基以及IIa第519位的
残基对应。

[0271] 作为进一步的简要背景，纤溶酶是多功能的蛋白水解酶(MW92,000)，其作为单1 2
链的非活性酶原——纤溶酶原在血液中循环。尽管纤溶酶原在身体中广泛表达，肝细
3,4
胞是其合成的主要部位。循环的纤溶酶原具有NH2-末端谷氨酸(Glu-Plg)，并且含有
5
Pan-apple结构域、五个三环结构域以及羧基末端潜在的丝氨酸蛋白酶结构域。天然的
6,7
纤溶酶原以紧密构象的形式存在，其中Pan-apple结构域与三环结构域5结合。当将
Arg561–Val562剪切键剪切时，单链的纤溶酶原转变为由二硫键相连的双链活性蛋白酶纤
8,9
溶酶。 Glu-纤溶酶的重链由Pan-apple结构域和五个三环结构域组成，而轻链含有C-末
9
端蛋白酶结构域。纤溶酶原可被尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)或组织纤溶酶原激活剂
9-11
(tPA)激活。通过自身催化，形成缺少Pan-apple结构域的Lys-纤溶酶(和Lys-纤溶
5,8
酶原)。由于Pan-apple结构域与三环结构域5之间不存在相互作用，因而Lys-纤溶酶
12,13
原以比Glu-Plg更开放的构象存在。与Glu-Plg相比，Lys-纤溶酶原更易被纤溶酶原
14,15 16 17,18
激活剂激活。纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1) 和PAI-2 可抑制纤溶酶原激活剂
19 20
tPA以及uPA；而α2-抗纤溶酶以及α2-巨球蛋白可抑制纤溶酶。

[0272] 纤溶酶在纤维蛋白溶解中发挥重要作用，并且负责血栓形成部位凝块的溶解。921,22
在纤维蛋白溶解过程中，纤溶酶原首先被tPA激活，从受损的内皮中释放。从N-末端
起始，tPA由指结构域、表皮生长因子样结构域、两个三环结构域和C-末端蛋白酶结构域
23,24
组成。 tPA的指结构域以及第二个三环结构域与暴露于血栓凝块中的C-末端赖氨酸残
25,26
基结合。纤溶酶原通过其三环结构域1和4，也位于纤维蛋白凝块，tPA在这里将其转
27
变为纤溶酶。在纤维蛋白降解过程中，纤溶酶产生额外的C-末端赖氨酸残基，这增强了
28
tPA以及纤溶酶原/纤溶酶与凝块的结合，以进行有效溶解。进一步，与循环的纤溶酶相
21
比，与纤溶酶结合的纤维蛋白很少被α2-抗纤溶酶抑制。因此，此种纤维蛋白溶解的局部
(localized)机制阻止了循环的纤维蛋白原的降解。

[0273] 在严重损伤中29以及在主要的手术步骤如心脏手术中，纤维蛋白溶解系统是超活30,31 32
化的。在损伤中，不受控的出血是可预防性死亡的主要原因。当预防性的使用抗纤维
30,33,34
蛋白溶解剂时，可显著降低失血以及减少大量输血的需求。抑肽酶(牛胰蛋白酶抑
制剂,BPTI)是纤溶酶活性位点的有效抑制剂，其曾经是心血管搭桥手术中用于防止失血
35
的主要的抗纤维蛋白溶解剂。然而，由于它的副作用如肾损伤、心肌梗塞以及潜在的过敏
36,37,38
性，其已退出临床市场。本发明使用的抗纤维蛋白溶解剂是凝血酸(TE)和ε-氨基
39
己酸(εACA)；尽管这两种赖氨酸类似物都不如抑肽酶有效，并且也都与肾衰竭和痉挛有
39,40
关。因而，可期望将具有优良效果的分子用作抗纤维蛋白溶解剂。

[0274] 纤溶酶原系统也在细胞外基质(ECM)的细胞外周蛋白水解依赖的降解41-46以及47
细胞因子的激活中发挥重要作用。纤溶酶激活了一些基质金属蛋白酶原(proMMP)，包括
48,49 50,51
将其它基质组分如胶原降解的proMMP 3、9、12和13 。进一步，纤溶酶通过释放某些
基质相关生长因子如纤维母细胞生长因子和血管内皮生长因子，在血管生成中发挥重要作
52,53 54
用，也在潜在的转化生长因子-β的激活中发挥重要作用。因此，纤溶酶参与炎症、
9
伤口愈合、细胞迁移、肿瘤生长以及凋亡。所有这些功能都是由于uPA(与uPA受体相关)
介导的纤溶酶原的激活，所述纤溶酶原与单核细胞/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮和表皮细
55
胞、角质细胞、纤维母细胞以及血小板上存在的细胞表面受体结合。含有C-末端赖氨酸
56-58
残基的纤溶酶原受体在不同类型的细胞中大量表达，并且肿瘤细胞的侵袭特性取决于
59,60
纤溶酶介导的ECM的蛋白水解。因此，可预期将通过阻止纤溶酶原与细胞表面受体的结
合来减少纤溶酶原的激活以及抑制纤溶酶的形成用于控制这些病理过程。

[0275] 组织因子通路抑制剂-2(TFPI-2)也被称作胎盘蛋白5或基质丝氨酸蛋白酶抑制61-63
剂，其含有三个前后相连的Kunitz型抑制结构域。 TFPI-2的Kunitz结构域1(KD1)是
其唯一的抑制结构域并且其抑制纤溶酶、因子(F)Xia、血浆激肽释放酶(pKLK)以及FVIIa/
64 a 65
组织因子。利用丝氨酸蛋白酶亚位点 S2'/P2'的特征，设计变体KD1-L17R分子，其
66 66
是更有效的纤溶酶抑制剂；进一步，它不抑制pKLK或FXIa。大肠杆菌表达的KD1-L17R
含有C-末端缬氨酸，并且在不属于Kunitz结构域的N-末端含有9个残基；在此将其称作
b
KD1L17R-VT。

[0276] 根据某些实施方案，本文所述的是更小的KD1分子种类，其含有C-末端赖氨酸并c
且缺少开始的7-9个残基；本文将其称作KD1L17R-KT。在此公开了KD1L17R-KT的结构和功能特征，包括其对纤溶酶的抑制以及与纤溶酶原三环结构域的结合。因此，根据某些本文公开的实施方案，具有双功能的KD1L17R-KT是用于控制病理过程中的纤溶酶产生以及抑制纤溶酶的优选药剂。

[0277] 实验方法

[0278] 材料.大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS和 pET28a表达载体从 NovagenInc.(Madison,WI) 获得。离心过滤装置 (3000Mr 阈值 ) 购自
Millipore(Bedford,MA)。Q- FF、SP- FF、
TM
-200以及His-Trap HP柱从Amersham Biosciences获得。卡那霉素、异丙基硫
代半乳糖苷(IPTG)以及12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(PMA)从Sigma(St.
Louis,MO)获得。人α-凝血酶(IIa)、FXIa、pKLK以及纤溶酶购自Haematologic
TM
Technologies Inc。tPA(Alteplase ) 购自 Genentech(South San Francisco,CA)。
uPA 从 Calbiochem,EMD Biosciences Inc.(San Diego,CA) 获得。Glu-Plg 从 Enzyme
TM
Research Laboratories(South Bend,IN)获得。εACA(Amicar ) 从 ICN Biomedicals
Inc.(Aurora,Ohio)获得。正常混合的血浆(NPP)购自George King Bio-Medical Inc.
(Overland Park,Kansas)。纤溶酶底物S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-p-硝基苯胺)、pKLK和
FXIa底物S-2366(焦Glu-Pro-Arg-p-硝基苯胺)从Diapharma Inc获得。其它试剂全部
是市场上可得的最高纯度的试剂。

[0279] KD1L17R-VT的表达和纯化.将含有KD1cDNA序列的人TFPI-2第1-73位残基的编码序列克隆，并利用T7启动子系统使其在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中过表达为氨基末
66-69
端His6标记的融合蛋白。利用定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla
CA)产生点突变体KD1L17R-VT。将His6标记的KD1L17R-VT在生长于含有15mg/升卡那霉素的
Luria肉汤的大肠杆菌中表达，并且用1mM IPTG在37℃诱导1小时。从包涵体中纯化His6
66,68-70
标记的KD1L17R-VT，并且按所述的将其重折叠。

[0280] 用IIa在1:1000的酶/底物摩尔比，将纯化的His6标记的KD1L17R-VT在37℃消化2小时。通过对等时间间隔的等份消化物(temporal aliquots)进行SDS-PAGE分析来确
69
认IIa将KD1完全消化。利用用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl,pH 7.5(TBS)平衡的
TM 66
Superdex -200凝胶过滤层析将不含His6标签的蛋白与His6标签和IIa分离。在将制备
物用于生物化学实验之前，用1mg/ml的消光系数(A280)2.45、纯度(SDS-PAGE)、N-末端序列以及质谱分析法对其蛋白浓度进行表征。

[0281] KD1L17R-KT的制备和分离.将KD1L17R-VT(1mg/ml，在TBS中，pH7.5)与IIa以1:50的酶/底物摩尔比，在37℃孵育24小时，产生更小的KD1L17R-KT分子种类。利用用TBS，pH 7.5TM 66平衡的Superdex -200凝胶过滤层析将KD1L17R-KT从IIa中分离。在将纯化的KD1L17R-KT
用于生物化学实验之前，用1mg/ml的消光系数(A280)2.84、纯度(SDS-PAGE)、N-末端序列以及质谱分析法对其蛋白浓度进行表征。

[0282] SDS-PAGE.利用Laemmli缓冲液系统进行SDS-PAGE。71使用的丙烯酰胺浓度为10％-15％，并用考马斯亮蓝染料将凝胶染色。

[0283] 氨基酸序列分析以及质谱分析法.将蛋白从还原性SDS-PAGE转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以进行N-末端序列分析。在UCLA Biopolymer Core facility(UCLA,Los
Angeles,CA)，利用具有在线的乙内酰苯硫脲(PTH)-氨基酸分析的脉冲-液体固相测序仪
(Applied Biosystems cLC system)，进行自动化的N-末端蛋白测序。通过基质辅助激光
解吸附电离(MALDI)-MS以及电喷雾电离(ESI)-MS收集质谱分析法(MS)的数据。在进行
TM
MS测量之前，用装入移液吸头的反相介质(C4-树脂ZipTip ,Millipore,Billerica,MA
TM
USA)将蛋白溶液脱盐并浓缩。将用线性模式操作的Voyager DE-STR MALDI飞行时间
质谱仪(Applied Biosystems,Foster City,CA USA)用于MALDI-MS测量。将蛋白样
品溶液(0.5μL)点样至不锈钢样品板上，然后加入0.5μL的MALDI基质溶液、α-氰
基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。在获取数据之前，允许将点样的样品在室温干燥。使用纳升
TM
喷雾源和solariX 混合15-特斯拉傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪(Bruker
Daltonics,Billerica,MA,USA)收集ESI-MS数据。

[0284] 利用表面等离子体共振(SPR)，KD1L17R-KT与tPA和Glu-Plg的结合.在25℃，在T100流式生物传感器(Biacore,Uppsala,Sweden)上进行结合研究。利用胺偶
联化学将Glu-Plg(利用SDS-PAGE，纯度为～98％)或tPA(利用SDS-PAGE，纯度>98％)固
定化于羧甲基葡聚糖流动细胞(CM5传感器芯片,GE Healthcare)上。用1-乙基-3-(3-二
甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺的混合物激活流动细胞表面5分
钟(流动速率10μl/分)，然后将蛋白(在10mM醋酸钠中为20μg/ml,pH 5.5)注射到表
面上。用1M乙醇胺将未反应的位点封闭5分钟。使每一分析物(KD1L17R-VT和KD1L17R-KT，
100-2000nM)流经HBS-P缓冲液(20mM HEPES,pH 7.4,100mM NaCl,0.005％(v/v)P20)中
的流动细胞，速率10μl/分钟，持续6分钟。在变为不含所述蛋白的HBS-P缓冲液后，监测
分析物的解离10分钟。用含有20mM εACA的HBS-P将流动细胞再生。通过减去灌注无偶
联蛋白的流动细胞的分析物所获得的信号，对非特异性结合的数据进行校正。使用1:1的
TM
结合模型，利用BIAevaluation 软件(Biacore)对结合进行分析。通过得到的解离(kd)速
率常数与结合(ka)速率常数的商来计算Kd值。

[0285] 蛋白酶抑制分析.如所述的，所有的反应都在含有0.1mg BSA/ml(TBS/BSA)和2mM2+ 2+ 66,68
Ca (TBS/BSA/Ca ,pH 7.5)的TBS，pH 7.5中进行。将每种酶(纤溶酶、pKLK和FXIa)
-1 3
与不同浓度(10 -2×10nM)的KD1L17R-KT在96-孔微量滴定板中室温孵育1小时(总体
积100μL)。然后加入每种酶的合适的合成底物(5μL)至终浓度为1KM，并且在Molecular
Devices Vmax动态酶标仪(Molecular Devices Vmax kinetic microplate reader)中对剩
*
余的酰胺水解活性进行测量。利用非线性回归数据分析程序Grafit对抑制常数Ki进行测
定。利用用于紧密结合抑制剂的方程(方程1)对KD1L17R-KT的数据进行分析，其中vi和v0
72,73
分别是抑制率和非抑制率，且[I]0和[E]0分别是抑制剂和酶的总浓度。

[0286] 方程1

[0287] 根据Beith,72利用方程2通过对底物效应进行校正获得Ki值，其中[S]是底物浓度且每种酶的KM是特定的。

[0288] 方程2

[0289] 纤维蛋白溶解(凝块溶解)分析.如早前所概述的，根据Sperzel和Huetter7466
的方法，进行微小修饰。简要地，利用IIa来起始NPP中纤维蛋白的形成，并且通过同时
添加tPA诱导形成的凝块的溶解(纤维蛋白溶解)。通过利用Molecular Devices酶标仪
( 190)测定405nm处的光密度，对凝块形成和溶解进行监测。简要地，
向240μL NPP中分别加入10μL的每种待测化合物(KD1L17R-VT、KD1L17R-KT、εACA)或盐水对照。然后将225μL的该混合物加至含有25mM CaCl2的TBS/BSA中的25μL IIa和tPA。
在250μL终体积中，IIa的浓度为0.15μg/ml，且tPA的浓度为1μg/ml。在对照条件下
(不含tPA且不含测试化合物)，OD405立即升高，显示凝块形成，之后极度缓慢地降低，代表纤维蛋白溶解。由于凝块形成几乎在5分钟之后完成，将由tPA诱导的纤维蛋白溶解评估
为长达60分钟的OD405的相对降低。对终浓度为2μM-5μM的KD1L17R-VT(加/减εACA)和
KD1L17R-KT以及终浓度为0.1mM-5mM的εACA(不含KD1L17R-VT)进行测试。

[0290] 小鼠肝脏裂伤模型.UCLA校长动物研究委员会(UCLA Chancellor’s AnimalResearch Committee)批准了利用本小鼠模型来研究KD1L17R-VT和KD1L17R-KT的功效的方案。
使用C57/BL6小鼠(8-10周龄)，每只体重为～20gm。用标准的啮齿动物食用的食物和水
来喂养动物，并将其在正常室温并具有12小时的昼夜循环的饲养室中饲养。基于用于人
的抑肽酶的剂量即4μg/gm，根据小鼠的重量，对KD1L17R-VT或KD1L17R-KT的剂量进行调整。
75
该剂量达到的计算的血液水平为～8μg/ml(～1μM)。将注射了εACA(100μg/gm，计
算的血液水平为200μg/ml或～1.3mM)的动物用作阳性对照，并将接受盐水的那些动物
39,75
用作阴性对照。εACA的剂量基于人方案中使用的剂量。利用多粘菌素B固定化的树
TM
脂(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel from Pierce,Rockford,IL)将脂多糖从盐水、
KD1L17R-VT以及KD1L17R-KT中去除。将εACA以20mg/ml的浓度溶解于不含脂多糖的盐水中。
用鲎阿米巴样细胞裂解物试剂盒(Biowhittaker Inc.,Walkersville,MD)测出抗纤维蛋白
溶解剂和盐水都不含脂多糖。

[0291] 在即将麻醉前，通过尾静脉向小鼠静脉内注射100μL体积的无菌平衡盐溶液中的药物。用异氟烷诱导并维持麻醉。在程序全程将动物以仰卧的姿势置于电热垫上，以将
直肠温度维持在37℃。将腹部的毛刮除并准备好。通过前右肋下的切口暴露出肝脏。通过
连续轻压左侧腹后方(left flank posteriorly)将肝脏的左叶从腹中取出。使用锋利的
无菌#10解剖刀片在左叶离下边缘1cm处切出5-mm的横切口。将左叶切口部位渗出的全
部血液收集到预先称重的无菌的3cm×3cm塑料托盘中，总共持续30分钟。在30分钟结束
时使动物安乐死。

[0292] 利用因子单向方差分析(Factorial one-way analysis of variance)(ANOVA)方法来对四个处理组(盐水、εACA、KD1L17R-VT以及KD1L17R-KT)小鼠肝脏的平均总失血量(mg)进行比较。利用该ANOVA模型的事后检验，计算任意两个平均值比较的p值。对全部四种
处理的平均总失血量的误差分布进行检查显示，在对处理的效果进行控制后，所述分布是
正态分布(高斯分布)。利用Shapiro-Wilk拟合优度检验，将该分布与高斯分布进行形式
上的比较。因此，不需要将总失血量进行转化。

[0293] 通过微(μ)-纤溶酶-KD1L17R-KT降低Glu-Plg与U937细胞表面受体的结合。利用pET28a载体，在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达含有人纤溶酶原蛋白酶结构域第
76
542-791位残基的重组N-末端His6标记的μ-纤溶酶原，其以包涵体的形式表达。使
用镍填充的His-Trap柱将所述His6标记的μ-纤溶酶原进行分离，并且如所概述的利用
76
SP- FF柱将其进行重折叠和纯化。用IIa将分离的μ-纤溶酶原(1mg/
ml)进行消化以去除His6标签[66]，并且通过用1:1000酶/底物摩尔比的uPA在37℃处
理2小时而将其激活为μ-纤溶酶。通过还原性的SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)确证，His6
TM
标签的去除允许激活为μ-纤溶酶。利用Superdex -200凝胶过滤柱将IIa、uPA以及His6
76
标签与μ-纤溶酶分离。分别将KD1L17R-VT和KD1L17R-KT与纯化的μ-纤溶酶以1.2:1的
TM
摩尔比室温孵育2小时。然后利用Superdex -200凝胶过滤柱，将每一KD1-纤溶酶复合物
76
与游离的KD1L17R-VT或KD1L17R-KT分离。

[0294] 如早先所述的，在37℃，含有5％CO2的条件下，用补充了10％胎牛血清的77,78
RPMI-1640培养基培养U937单核样细胞。如所述的，在无菌条件下，将所述细胞用40nM
78
PMA刺激18小时。通过轻轻倒出回收未贴壁的细胞，洗涤，并用含有100mM NaCl、0.1mg/
6
ml BSA，pH 7.5的50mM Hepes(HBS/BSA,pH 7.5)将其悬浮。然后在37℃，将所述细胞(10/
ml,200μl)与含有不同浓度的μ-纤溶酶-KD1L17R-KT或μ-纤溶酶-KD1L17R-VT的2μM
Glu-Plg孵育1小时。用200μl HBS/BSA,pH 7.5将所述细胞洗涤并重悬，并且在37℃，用
10nM uPA将与细胞结合的Glu-Plg激活20分钟。将每一反应混合物10倍稀释，并且利用
Molecular Devices动态酶标仪，通过S-2251合成底物的水解来测定纤溶酶活性(反应结
58,78 79
合的Glu-Plg)。通过将数据与下文给出的Halfman的IC50四参数逻辑斯蒂方程拟合
来测定IC50(Glu-Plg与细胞表面受体的结合降低50％所需的μ-纤溶酶-KD1L17R-KT的浓
度)

[0295] 方程3

[0296] 其中，y是在给定浓度x的KD1L17R-KT或KD1L17R-VT存在时，由与U937细胞受体结合的Glu-Plg产生的纤溶酶对S-2251的水解速率；a是KD1L17R-KT或KD1L17R-VT不存在时
S-2251水解的最大速率；且s是斜率。每个点都有相同的权数，并且利用Erithcus软件的
TM 80
非线性回归分析程序GraFit 将数据与方程3进行拟合。我们使用如Cheng and Prusoff
81
中所述的以及进一步被Craig 详细阐述的下述方程来获得KD1L17R-KT与Glu-Plg相互作用
的Kd值。

[0297] 方程4

[0298] 其中使用的[Glu-Plg]的浓度为2μM(～生理浓度)。9我们使用1μM的Kd(Glu-Plg/9,78,82
细胞表面受体)值来获得Glu-Plg的Kd(KD1L17RKT)。

[0299] 分子模拟.将μ-纤溶酶83、纤溶酶原三环结构域184以及野生型的KD169的晶体结构作为模板，来模拟KD1L17R-KT与纤溶酶三环结构域1的二元复合物，以及KD1L17R-KT与所述纤溶酶蛋白酶结构域和三环结构域1的三元复合物。早前已经对模拟这些复合物的
66,85
方案进行了描述。由于野生型KD1 晶体结构中的C-末端残基是无序的，因此我们使用
86 87
MODELLER程序来构建KD1分子的这一部分。利用程序CHARMM和CHARMM19力场 (其由
50步Steepest Descent组成，然后进行500步Adopted Basis Newton-Raphson)，通过能
量最小化将构建的模型进一步完善。在整个最小化过程中，将的谐波限制
α
应用于蛋白的C 原子。

[0300] 结果

[0301] 通过IIa进行的KD1L17R-VT蛋白水解.除了与BPTI-Kunitz结构域对应的58个残基，所述73-残基的KD1L17R-VT构建体在其N-末端还包含另外的9个残基。KD1L17R-VT的
66
C-末端尾部残基(59EKVPKV64,BPTI编号,SEQ ID NO:44)包含两个赖氨酸残基。进行实
验，以测试与在去除His6标签过程中使用的浓度相比，将KD1L17R-VT与更高浓度的IIa孵育能否剪切K60-V61残基之间和/或K63-V64残基之间(59EK↓VPK↓V64)。如果可以剪
切，根据非限制性理论，产生的分子除了可抑制纤溶酶的活性位点，相信其也可作为诱饵受体来减弱病理纤溶酶原的激活。在37℃，将KD1L17R-VT(在TBS，pH 7.5中，1mg/ml)与IIa
以1:50酶/底物摩尔比孵育24小时，导致形成被称作KD1L17R-KT的更小分子量的类型。图
TM
7给出了KD1L17-VT和KD1L17R-KT的SDS-PAGE的数据。利用Superdex -200凝胶过滤层析将
KD1L17R-KT与IIa分离以进行进一步的研究。

[0302] KD1L17R-KT的NH2-末端序列显示于表1中，并且MALDI-TOF-ESI数据显示于图8A中。有两条可读序列，主要序列(KD1L17R-KT(～80％),SEQ ID NO:47)处于～80pmol水平，且少数序列(KD1L17R-KT(～20％),SEQ ID NO:48)处于～20pmol水平。较小序列(SEQ ID
NO:48)从循环3开始进入较大序列(SEQ ID NO:47)的内部。

[0303] 表1.IIa剪切的KD1L17R-VT的NH2-末端序列分析。

[0304]

[0305] 将序列分析与质谱分析的数据结合显示～80％的KD1L17R-KT具有N-末端序列GNNAEI(SEQ ID NO:49)，～20％具有N-末端序列NAEI(SEQ ID NO:50)；这两种具有相同的
C-末端序列EKVPK(SEQ ID NO:51)。图8B显示了BPTI、KD1L17R-VT以及KD1L17R-KT的氨基酸序列比对。根据非限制性理论，相信IIa对KD1L17R-VT的C-末端在VPK↓V之间的剪切；然
而，在N-末端的PT↓GN和GN↓NA进行的水解可能是通过IIa进行的，或者可信地是通过
污染的蛋白酶进行的。在C-末端的EK↓VP之间没有发现剪切。因此，KD1L17R-KT的C-末
端与20％的N-末端缺少最开始的两个氨基酸的分子是同源的(图8A和8B)。

[0306] IIa剪切Arg/Lys(P1亚位点)-xxx肽键，并且对位于P2位点的脯氨酸或小的疏水88 88,89
残基有强烈的偏好。进一步，IIa强烈不喜欢位于P2位点的大残基或酸性残基。相
应地，在使用较高浓度IIa的条件下，期望KD1L17R-VT的62Pro-Lys↓Val64(图9)之间的
剪切，然而不喜欢59Glu-Lys↓Val-Pro62之间的剪切(图8B)。尽管位于P1亚位点的苏
氨酸或者天冬酰胺不是IIa优选的，其S1口袋残基Asp189可通过水分子与Thr或Asn相
互作用(图9)。根据非限制性理论，相信Pro或Gly在P2位点的存在也可促进通过IIa进
行的Pro-Thr↓Gly-Asn之间或者Gly-Asn↓Asn-Ala之间的蛋白水解(图9)。因此，获
得了含有完整的Kunitz结构域和C-末端赖氨酸的稳定的KD1L17R-KT蛋白。

[0307] KD1L17R-KT与tPA和Glu-Plg的结合.利用表面等离子体共振(SPR)来研究KD1L17R-KT与固定化的tPA(图10A)以及Glu-Plg(图10B)的结合。tPA与KD1L17R-KT结合
3 -1 -1 -4 -1
的kon为0.91±0.2×10 M s ，koff为1.9±0.3×10 s ，且Kd为210±20nM。Glu-Plg与
3 -1 -1 -4 -1
KD1L17R-KT结合的kon为1.1±0.4×10 M s ，koff为3.1±0.8×10 s ，且Kd为280±30nM。
在SPR实验中，KD1L17R-VT显示了与tPA或者Glu-Plg的微弱结合，根据非限制性理论，这表明KD1L17R-KT的C-末端赖氨酸对于该相互作用是十分重要的。

[0308] 接下来，对KD1L17R-KT与纤溶酶原三环结构域1的复合物进行模拟。所述C-末端赖氨酸以与εACA类似的方式结合(图10C)。此外也注意到了两种另外的相互作用：(1)抑制剂KD1L17R-KT的Glu59 羧酸盐与纤溶酶原Arg32的胍基基团形成盐桥；和(2)所述抑制剂
Lys60的羰基基团与纤溶酶原三环结构域1的Arg70的侧链形成氢键。这些另外的相互作
用反应了与KD1L17R-KT对εACA的亲和力相比，其对纤溶酶原三环结构域1的亲和力更高。
84,90

[0309] KD1L17R-KT的抑制特性 .KD1L17R-KT以与KD1L17R-VT相似的高亲和力(Ki＝1±0.2nM)66
抑制纤溶酶(图11)。进一步，KD1L17R-VT 和KD1L17R-KT对FXIa和pKLK抑制的Ki都>10μM(图
66
11)。此外，KD1L17R-VT 或KD1L17R-KT(数据未显示)不抑制IIa、激活的蛋白C、tPA、uPA或组织激肽释放酶。这是数据共同显示KD1L17R-KT中的Kuntiz结构域是全功能性的。

[0310] 纤维蛋白溶解分析.将KD1L17R-KT、KD1L17R-VT以及εACA对tPA诱导的血浆凝块纤维蛋白溶解的抑制能力进行比较。向NPP中添加IIa引起了由OD405的增加反映的纤维蛋白的形成(图12A-C，曲线1)。同时添加tPA引起初始凝块形成，然后通过tPA介导的纤溶酶
原向纤溶酶的转变诱导纤维蛋白的溶解(曲线2，图12A-C)；在每种情况下，纤维蛋白溶解
的中点在6-7分钟之间。所有这三种抗纤维蛋白溶解剂都以剂量依赖的形式抑制纤维蛋白
溶解。当KD1L17R-VT为2μM时，其将纤维蛋白溶解的中点增加至22分钟；当其为3μM时，增加至29分钟；且当其为5μM，增加至43分钟(图12A)。相比之下，当KD1L17R-KT为2μM时，其将纤维蛋白溶解的中点增加至27分钟；当其为3μM时，增加至37分钟；且当其为5μM
时，增加至>60分钟(图12A)。因此，在每一测试浓度，作为抗纤维蛋白溶解剂，KD1L17R-KT
66
比KD1L17R-VT更有效。由于KD1L17R-VT 和KD1L17R-KT对纤溶酶的活性位点抑制是相似的(图
11)，因此KD1L17R-KT效力的另外的增加可能是由于其与tPA和/或纤溶酶原三环结构域的
结合(图10A和10B)。因而，期望纤维蛋白凝块处的局部纤溶酶原的激活也会减弱。

[0311] 与根据纤溶酶抑制的Ki值预测的浓度相比，需要更高浓度的KD1L17R-VT或KD1L17R-KT以抑制纤维蛋白溶解。在不希望被理论束缚的情况下，对这些现象的解释可能是抗纤维蛋白溶解分析是基于动力学的分析，而平衡抑制常数Ki是根据将所述抑制剂与纤溶
酶延长孵育得到的。

[0312] εACA的抗纤维蛋白溶解活性是由它与tPA和纤溶酶原三环结构域的结合导致84,90
的。因此，对εACA增强观察到的KD1L17R-VT的纤维蛋白溶解抑制的能力进行测试。这
些数据显示于图12B中。向2、3或5μM KD1L17R-VT中添加等摩尔数的εACA，这对血浆凝
块纤维蛋白溶解的抑制程度没有可观察到的影响。对这一现象最可能的非限制性解释是，
与KD1L17R-KT(Kd～0.2-0.3μM，图10)相比，εACA对tPA或纤溶酶原的亲和力较低(Kd～
84,90
10μM) 。与这些数据一致，在不存在KD1L17R-VT的情况下，需要更高浓度的εACA来抑制
血浆凝块纤维蛋白溶解(图12C)。当添加的εACA为0.1mM时，凝块溶解的中点增加至10
分钟；当其为0.3mM，增加至19分钟；且当其为0.5mM时，增加至>60分钟。当使用浓度为
1或5mM的εACA时，基本上观察不到纤维蛋白溶解。

[0313] 小鼠肝脏裂伤模型.由于增加的纤维蛋白溶解是小鼠肝脏裂伤模型中小血管出91
血的重要原因，因而对KD1L17R-KT减少失血的效力进行评估，并将其与在该动物模型中
εACA和KD1L17R-VT的效力进行比较。使用的εACA、KD1L17R-KT或KD1L17R-VT的剂量与临床设定的常用剂量相当。尽管这两种抗纤维蛋白溶解剂的半衰期都很短(～2小时)，在总持
续时间为30分钟的出血中，每一抑制剂都应当保持足够的水平以进行效力研究。三种抗纤
维蛋白溶解剂对失血量的影响描述于图13中。与盐水相比，KD1L17R-KT将出血量降低了～
74％(p 0.001)，KD1L17R-VT降低了～50％(p 0.002)，且εACA降低了～49％(p 0.002)。
KD1L17R-VT和εACA处理的动物的失血量之间基本上没有区别。在该动物模型中，在抑制纤溶酶诱导的纤维蛋白溶解方面，KD1L17R-KT比KD1L17R-VT(p<0.05)或者εACA(p<0.05)更有效。

[0314] 在所述的小鼠肝脏裂伤模型，KD1L17R-KT(SEQ ID NO:47:48,～80％:～20％)和66
先前被描述为“KD1-L17R”的工程化KD1多肽制剂 (其被认为在C-末端具有Val)之间没
有统计学上显著的差异。因此通过SDS-PAGE、质谱分析法以及N-末端序列分析对KD1-L17R
进行表征(图14)。SDS-PAGE分析表明所述蛋白未被显著降解。N-末端测序显示Gly-Se
r-His-Met-Asp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro(SEQ ID NO:53)是开始的10个残基，并且质谱数据
显示样品的分子量为8792.1Da，其在SEQ ID NO:52(76个氨基酸)的理论值8787Da的标
准误差范围内，但是比含有C-末端缬氨酸的KD1-L17R(SEQ ID NO:46,77个氨基酸)的理
66
论值8888Da少了～100Da。因而显示KD1-L17R 具有如本文所阐述的SEQ ID NO:52的76
个氨基酸的序列，其缺少C-末端缬氨酸，但是具有C-末端赖氨酸，这与KD1L17R-KT的情况相同。在该小鼠肝脏裂伤模型中，在阻止出血方面，具有C-末端赖氨酸的KD1-L17R(SEQ ID
NO:52)和同样具有C-末端赖氨酸的KD1L17R-KT(SEQ ID NO:47:48,～80％:～20％)表现
出比具有C-末端缬氨酸的KD1L17R-VT(SEQ ID NO:46)更高的效力。

[0315] 还观察到，在注射所述药物后不久，用εACA处理的16只动物中的4只(每天1/4)普遍发生痉挛。在手术过程中，这些动物对3-4.5％异氟烷具有单侧或两侧阵挛性运动。在诱导麻醉的过程中，没有观察到异常运动，而在手术开始15-20分钟之后观察到了。当在麻醉状态下动物仍无反应时，痉挛表现为四肢中的一条或多条的重复阵挛性运动。没有观察
到动物有任何的紧张性运动。在给予εACA或TE处理的动物中，先前观察到了惊厥和痉挛，
92,93
并且其对这些药物作为抗纤维蛋白溶解剂表现出主要的副作用。其它近期研究已经报
39,40,94 39,94,95
道εACA 或TE 引起大量病人的痉挛和惊厥。在用KD1L17R-VT或KD1L17R-KT处理的
动物中没有观察到痉挛。

[0316] 此外，εACA、TE和抑肽酶的使用与肾功能障碍/肾衰竭有关，36-39,94而TFPI-2的66 96
两种KD1分子(含有Arg15→Lys或Leu17→Arg)在小鼠或大鼠中不引起肾脏毒性。
因此，根据本文所述的一些实施方案，KD1L17R-KT是在体内降低纤维蛋白溶解的优选药剂。

[0317] μ-纤溶酶—KD1L17R-KT对Glu-Plg与PMA刺激的非贴壁U937细胞的结合的影82
响.纤溶酶原的大部分细胞表面受体都将赖氨酸作为它们的C-末端残基。设计实验以测
定KD1L17R-KT(而非KD1L17R-VT)是否与Glu-Plg的三环结构域结合，以及是否损害其与U937细胞表面受体的结合。制备μ-纤溶酶-KD1L17R-VT与μ-纤溶酶-KD1L17R-KT的复合物以封
TM
闭Kunitz结构域功能。经Superdex -200凝胶纯化的μ-纤溶酶-KD1L17R-VT与μ-纤溶
酶-KD1L17R-KT复合物的SDS-PAGE显示于图15A的插图中。将PMA刺激的U937细胞与含
不同浓度μ-纤溶酶-KD1L17R-VT复合物或μ-纤溶酶-KD1L17R-KT复合物的Glu-Plg孵育
(图15A)。如从图15A中显示的S-2251水解数据推断得到的，μ-纤溶酶-KD1L17R-KT(而
非μ-纤溶酶-KD1L17R-VT)浓度的增加抑制Glu-Plg与细胞表面受体的结合。纯化的μ-纤
溶酶-KD1L17R-KT或μ-纤溶酶-KD1L17R-VT导致的纤溶酶产生减少的百分数显示于15B中。
μ-纤溶酶-KD1L17R-KT复合物干扰Glu-Plg与PMA刺激的U937细胞的结合。利用方程3和
4计算的KD1L17R-KT与Glu-Plg相互作用的Kd值为～300nM，该值与从SPR数据(图10B)得
到的值(～280nM)一致。

[0318] 图15中显示的数据与单个KD1L17R-KT分子同时与纤溶酶原/纤溶酶的三环结构域以及纤溶酶的活性位点结合的模型一致。构建KD1L17R-KT与所述纤溶酶蛋白酶结构域以及
所述纤溶酶原/纤溶酶三环结构域1的三元复合物的分子模型，并将其显示于图16中。如
图16所示，KD1L17R-KT通过它的P5-P5′残基与纤溶酶活性位点相互作用，这是Kunitz结构域与丝氨酸蛋白酶结构域结合的典型模式。类似地，KD1L17R-KT的C-末端赖氨酸与纤溶酶
原/纤溶酶的三环结构域1的相互作用与三环结构域1和赖氨酸类似物εACA或TE之间
的相互作用相似。然而，与赖氨酸类似物相比，KD1L17R-KT的特征为有另外的点与纤溶酶原/纤溶酶的三环结构域1接触，其增强了结合相互作用(图16)。

[0319] 相应地，并且通过非限制性理论，考虑本文所述的KD1L17R-KT多肽作为抗纤维蛋白溶解剂的双重功能。首先，KD1L17R-KT减弱了tPA和纤溶酶原与纤维蛋白中暴露的C-末端氨酸残基的结合，这就减少了纤溶酶的形成。第二，KD1L17R-KT抑制产生的纤溶酶的活性位点。

[0320] 实施例5中引用的参考文献：

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[0417] 可将上文所述的不同的实施方案组合以提供进一步的实施方案。将本说明书中参考的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利申请，通过引用的方式整体并入本文。如果需要应用不同专利、申请以及出版物中的理念以提供进一步的实施方案，可对实施方案的方面进行修改。

[0418] 根据以上详细描述可对所述实施方案作出这些以及其它的改变。通常，在所附的权利要求中，使用的术语不应被理解为将权利要求限于说明书以及权利要求中公开的具体
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一种智能骨科手术系统	2020-05-12	224
骨科手术钽棒设备	2020-05-13	358
一种骨科手术牵引器	2020-05-13	761
一种骨科手术台	2020-05-11	968
一种骨科手术辅助器	2020-05-13	266
骨科用手术台	2020-05-11	804
骨科手术垫单	2020-05-11	75
骨科手术辅助架	2020-05-11	403
骨科手术机器人	2020-05-11	328
一种骨科手术辅助装置	2020-05-12	115

纤维蛋白溶解的双反应性的有效的Kunitz抑制剂

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