一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法
专利汇可以提供一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种重组 纤维 结构 胶原蛋白 海绵 及其制备方法，该胶原蛋白海绵具有重组纤维结构，整体结构呈海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在，且具有三维螺旋结构。其制备方法主要包括：利用 切向流过滤 技工艺进行胶原蛋白的纯化及浓缩；在体外进行分子自组装；离心分离；凝胶化；反复预冻、解冻及 水 洗； 冷冻干燥 。本发明的制备方法产能高、工艺稳定，制得的重组纤维结构胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的 止血 和修复，具有良好的应用前景。，下面是一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有重组纤维结构，整体结构呈海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在。
2.如1所述的重组纤维结构胶原蛋白海绵，其特征在于：胶原分子具体有三螺旋结构；
能保留其原有的生物学性能，能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓；所述胶原蛋白海绵是利用切向流过滤技术进行胶原蛋白的纯化及浓缩后进行分子自组装、凝胶化、冷冻干燥而制备而成；所述胶原蛋白海绵在动物体内2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率为自重的60倍以上。
3.制备如权利要求1~2所述的重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，包括以下步骤：
步骤1，利用切向流过滤技术进行胶原蛋白的纯化及浓缩；
步骤2，纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合，缓冲液中含有5~
20ppm交联剂，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，调节pH为6.5~8.5，在体外进行分子自组装；
步骤3，离心，弃上清液，获得浑浊液；
步骤4，凝胶化；
步骤5，在不同温度下进行反复预冻、解冻及水洗；
步骤6，冷冻干燥。
4.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤1是将盐析后胶原纤维用纯化液进行重溶，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化、浓缩，此过程在4~13℃温度下进行。
5.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤1中，将盐析后胶原纤维用醋酸溶液重溶，所述盐析后胶原纤维重溶后的浓度为0.5~
8mg/mL；所述步骤1中，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化，纯化液选用0.01M~0.5M醋酸溶液；所述步骤1纯化过程中结合搅拌及纯化液的补给，使得胶原能够顺利的进行纯化。
6.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤1中，纯化时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为50~100KD；最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.1~1μm；在2~4h内实现胶原溶液的纯化。
7.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤2中，所述胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5；所述生物缓冲液pH为7.2~7.5；分子自组装于30±0.5℃孵育30~90min。
8.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤2中，所述生物缓冲液包括HEPES、PBS、TES中的一种或几种；所述交联剂包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亚胺中的一种或几种。
9.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤5中，具体包括以下工艺：
1）-80℃快速冷冻，解冻，水洗；其中解冻是在室温下进行缓慢解冻；
2）在不同温度下反复冷冻，解冻，水洗：将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻；解冻是在室温下进行缓慢解冻。
10.制备如权利要求3所述的制备重组纤维结构胶原蛋白海绵的方法，其特征在于：所述步骤4具体为：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入模具中，继续升温至35~37℃，凝胶化30min~90min；所述步骤5中，所述水洗是将水凝胶浸泡在自重2~5倍的4~10℃去离子水中
1~3次，清除凝胶内的盐分和对于交联剂。
一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
步骤2，纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合，缓冲液中含有5~
20ppm交联剂，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，调节pH为6.5~8.5，进行分子自组装；
步骤3，离心，弃上清液，获得浑浊液；
步骤4，凝胶化且进行交联；
步骤5，在不同温度下进行反复预冻、解冻及水洗；
步骤6，冷冻干燥。
2）在不同温度下反复冷冻，解冻，水洗：将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻；解冻是在室温下进行缓慢解冻。
（2）使用切向流过滤技术对胶原进行纯化，纯化液选用0.01M~0.5M醋酸溶液，选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为50~100KD，由于胶原分子的分子量达到300KD，纯化过程中结合搅拌及溶解液（纯化液）的补给，使得胶原能够顺利的进行纯化；
其中，搅拌条件可选择为：磁力搅拌器，转速为800~1200rpm；
纯化液的补给满足：纯化液的体积始终保持初始状态，也就是透析出多少液体就加进多少液体，从而使系统内纯化液体积不变；
（3）最终进行胶原浓缩，选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.1~1µm；
浓缩过程中中断对透析系统的纯化液补给，最终胶原溶液的浓度自然会上升达到浓缩的目的。
胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5；
所述生物缓冲液包括如HEPES、PBS、TES中的一种或多种，pH为7.2~7.5，混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，例如TES缓冲液(1×,pH7.5)由10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)；
缓冲液中还含有5~20ppm交联剂，所述交联剂包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亚胺等中的一种或几种，交联剂加入之后胶原就开始发生交联反应；
（2）混合后调节其pH为6.5~8.5，进行分子自组装：
溶解于稀酸中的胶原，在pH调节至中性，温度达到生理温度时，胶原就会在体外重组形成纤维结构，不同的离子环境会影响胶原纤维的具体形态；
（3）于30±0.5℃孵育30~90min：温度太低时形成的胶原纤维过大，而高于此温度后形成的胶原纤维其螺纹性周期结构会有残缺，不完整。
（2）在不同温度下反复冷冻，解冻，水洗：
将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻；
解冻是在室温下进行缓慢解冻；
所述水洗是将水凝胶浸泡在自重2~5倍的4~10℃去离子水中1~3次，清除凝胶内的盐分和多余交联剂；
反复预冻可以是将温度升到接近共晶点，从而将物料内部水分全部结晶成冰晶；本发明的预冻主要是为达到：（1）提高凝胶的强度；（2）凝胶中的水分能形成一定的冰晶，可以在凝胶内形成较大的连通孔，方便清洗干净彻底。
步骤1：
（1）将盐析后胶原纤维用醋酸重溶，重溶后的浓度为0.5mg/mL；
（2）使用切向流过滤技术对胶原进行：
a) 纯化，纯化液选用0.01M醋酸溶液，选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为50KD；
b)浓缩，此过程在4~13℃温度下进行，最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.1µm；
步骤2：
（1）将纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合：
胶原溶液的浓度为1mg/mL，pH为2.0；缓冲液为10×PBS，其中含有5ppm戊二醛交联剂，pH为7.4，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃；混合后调节其pH为8.5；
（2）进行分子自组装，30±0.5℃孵育30min；
步骤3：离心，弃上清液；离心速度为6000rpm，室温下离心30min；
步骤4：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入合适的模具中，继续升温至37℃，凝胶化90min；
步骤5：-80℃快速冷冻后，在室温下进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重2倍的10℃去离子水中3次；之后将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻，再进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重2倍的10℃去离子水中3次；
步骤6：预先冷冻后进行冷冻干燥，时间为24h。
步骤1：
（1）将盐析后胶原纤维用醋酸重溶，重溶后的浓度为3.5mg/mL；
（2）使用切向流过滤技术对胶原进行：
a) 纯化，纯化液选用0.2M醋酸溶液，选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为
70KD；
b)浓缩，此过程在4~13℃温度下进行，最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.65µm；
步骤2：
（1）将纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合：
胶原溶液的浓度为3mg/mL，pH为3.0；缓冲液为2×TES，其中含有10ppm碳化二亚胺交联剂，pH为7.2，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃；混合后调节其pH为7.5；
（2）进行分子自组装，30±0.5℃孵育90min；
步骤3：离心，弃上清液；离心速度为9000rpm，室温下离心10min；
步骤4：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入合适的模具中，继续升温至35℃，凝胶化90min；
步骤5：-80℃快速冷冻后，在室温下进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重5倍的4℃去离子水中次；之后将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻，再进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重3倍的4℃去离子水中3次；
步骤6：预先冷冻后进行冷冻干燥，时间为48h。
步骤1：
（1）将盐析后胶原纤维用醋酸重溶，重溶后的浓度为8mg/mL；
（2）使用切向流过滤技术对胶原进行：
a) 纯化，纯化液选用0.5M醋酸溶液，选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为
100KD；
b)浓缩，此过程在4~13℃温度下进行，最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为1µm；
步骤2：
（1）将纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合：
胶原溶液的浓度为5mg/mL，pH为3.5；缓冲液为5×HEPES缓冲盐溶液，其中含有20ppm甲醛交联剂，pH为7.3，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃；混合后调节其pH为6.5；
（2）进行分子自组装，30±0.5℃孵育60min；
步骤3：离心，弃上清液；离心速度为12000rpm，室温下离心3min；
步骤4：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入合适的模具中，继续升温至36℃，凝胶化60min；
步骤5：-80℃快速冷冻后，在室温下进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重4倍的7℃去离子水中次；之后将水凝胶在-40℃和-20℃再进行冷冻，再进行缓慢解冻，后将水凝胶浸泡在自重2倍的4℃去离子水中2次；
步骤6：预先冷冻后进行冷冻干燥，时间为36h。
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