镓抑制生物膜形成
阅读：55发布：2020-10-20
专利汇可以提供镓抑制生物膜形成专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了含镓组合物，用于涂覆/浸渍设备或设备表面来防止 生物 膜 生长形成。本发明还提供了防止或抑制生物膜生长形成的方法。本发明还提供了杀灭建立的生物膜的方法。，下面是镓抑制生物膜形成专利的具体信息内容。
1.设备或设备表面，在所述设备或设备表面上涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
2.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是医疗设备。
3.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是留置医疗设备。
4.权利要求3的设备或设备表面，其中所述留置医疗设备是导管。
5.权利要求4的设备或设备表面，其中导管是脉管导管、硬膜外导管、腹膜导管或导尿管。
6.权利要求5的设备或设备表面，其中脉管导管是中枢神经系统导管、动脉管、肺动脉导管、外部插入的中央导管或中线导管。
7.权利要求6的设备或设备表面，其中中枢神经系统导管是心室内分流导管。
8.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是矫形设备。
9.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是假体设备。
10.权利要求2的设备或设备表面，其中医疗设备是气管内设备。
11.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是支架或导线。
12.权利要求11的设备或设备表面，其中所述支架是脉管支架、胆支架或尿支架。
13.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是起搏器。
14.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是医疗植入体。
15.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是光学透镜或目镜。
16.权利要求15的设备或设备表面，其中所述光学透镜是接触透镜。
17.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是牙科设备。
18.权利要求17的设备或设备表面，其中所述牙科设备是牙植入物。
19.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是呼吸机或吸入器。
20.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是引流管。
21.权利要求2的设备或设备表面，其中所述医疗设备是外科手术设备。
22.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是生物流体传送设备或容器。
23.权利要求22的设备或设备表面，其中所述生物流体传送设备或容器是预先装填的注射器、静脉注射袋、瓶子或安瓿。
24.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是药物传送设备。
25.权利要求24的设备或设备表面，其中所述药物传送设备是补片。
26.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是编码设备。
27.权利要求26的设备或设备表面，其中所述编码设备是计算机芯片。
28.权利要求1的设备或设备表面，其中所述设备是工业设备。
29.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是食品加工设备。
30.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是食品收集设备。
31.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是容水装置。
32.权利要求31的设备或设备表面，其中所述容水装置是游泳池、浴盆、水槽、贮水罐、井、瓶子或矿泉区。
33.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是水处理设备。
34.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是水冷却设备。
35.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是注水喷射设备。
36.权利要求28的设备或设备表面，其中所述工业设备是造纸和纸浆设备。
37.防止设备上生物膜生长形成的方法，包括将所述设备或其表面浸渍或涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
38.权利要求37的方法，其中浸渍或涂覆包括将设备或设备表面浸入所述的含镓组合物中。
39.权利要求38的方法，包括将设备或设备表面干燥。
40.权利要求38的方法，包括从设备或设备表面冲去过量的组合物。
41.权利要求37的方法，其中设备是医疗设备。
42.权利要求41的方法，其中医疗设备是留置医疗设备。
43.权利要求42的方法，其中留置医疗设备是导管。
44.权利要求43的方法，其中导管是脉管导管、硬膜外导管、腹膜导管或导尿管。
45.权利要求44的方法，其中导管是中枢神经系统导管、动脉管、肺动脉导管、外部插入的中央导管或中线导管。
46.权利要求45的方法，其中中枢神经系统导管是心室内分流导管。
47.权利要求41的方法，其中医疗设备是矫形设备。
48.权利要求41的方法，其中医疗设备是假体设备。
49.权利要求41的方法，其中医疗设备是气管内设备。
50.权利要求41的方法，其中医疗设备是支架或导线。
51.权利要求50的方法，其中支架是脉管支架、胆支架或尿支架.
52.权利要求41的方法，其中医疗设备是起搏器。
53.权利要求41的方法，其中医疗设备是医疗植入体。
54.权利要求41的方法，其中医疗设备是光学透镜或目镜。
55.利利要求54的方法，其中光学设备是接触透镜。
56.权利要求41的方法，其中医疗设备是牙科设备。
57.权利要求56的方法，其中牙科设备是牙植入物。
58.权利要求41的方法，其中医疗设备是呼吸机或吸入器。
59.权利要求41的方法，其中医疗设备是引流管。
60.权利要求41的方法，其中医疗设备是生物流体传送设备或容器。
61.权利要求60的方法，其中生物流体传送设备或容器是预先装填的注射器、静脉注射袋、瓶子或安瓿。
62.权利要求41的方法，其中医疗设备是药物传送设备。
63.权利要求62的方法，其中药物传送设备是补片。
64.权利要求37的方法，其中设备是编码设备。
65.权利要求64的方法，其中编码设备是计算机芯片。
66.权利要求37的方法，其中设备是工业设备。
67.权利要求66的方法，其中工业设备是食品加工设备。
68.权利要求66的方法，其中工业设备是食品收集设备。
69.权利要求66的方法，其中工业设备是水处理系统或工厂中的设备。
70.权利要求66的方法，其中工业设备是水冷却系统或装置。
71.权利要求66的方法，其中工业设备是水分配系统或装置。
72.权利要求66的方法，其中工业设备是注水喷射系统或装置。
73.权利要求66的方法，其中工业设备是容水装置。
74.权利要求73的方法，其中容水装置是游泳池、浴盆、水槽、井或矿泉区。
75.权利要求66的方法，其中工业设备是滤器、管道、管路、存储罐、蓄水池。
76.权利要求66的方法，其中工业设备是食品加工系统或工厂中的设备。
77.权利要求66的方法，其中工业设备是造纸和纸浆工厂中的设备。
78.防止或抑制表面上生物膜生长形成的方法，包括将含镓组合物施加于所述表面，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
79.权利要求78的方法，其中表面是工作台面、桌面、地板、砧板、墙壁或天花板。
80.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为1μM至10μM。
81.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为2μM至15μM。
82.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为4μM至12μM。
83.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为5μM至20μM。
84.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为10μM至30μM。
85.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为15μM至40μM。
86.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为20μM至50μM。
87.权利要求78或79的方法，其中所述含镓组合物中镓的浓度为16.25μM至100μM。
88.抑制或防止生物膜生长形成的试剂盒，其包含含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
89.杀灭设备上已建立的生物膜的方法，包括将表面暴露于足以杀灭已建立的生物膜浓度的含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
90.杀灭表面上已建立的生物膜的方法，包括将表面暴露于足以杀灭已建立的生物膜浓度的含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
91.杀灭已建立的生物膜的试剂盒，其包含含镓组合物，其中所述含镓组合物包含硝酸镓，所述生物膜包括铜绿假单胞菌生物膜。
镓抑制生物膜形成
[0001] 发明背景
[0002] 该申请享有2003年12月4日申请的U.S.临时专利申请No.60/526,907的优先权权益，在此以其整体引入作为参考。根据国家健康研究所的拨款编号RO1A134954和KO8HL-041173，政府在本发明中拥有权利。
[0003] 1.发明领域
[0004] 本发明总地涉及医疗和工业领域。更具体地，涉及含镓组合物防止或抑制生物膜生长形成以及由其引起的感染。
[0005] 2.相关技术的描述
[0006] 医疗设备的细菌污染通常是由生物膜形成引起的，其导致感染如医院感染。医院肺炎是第二大常见的医院感染，并与死亡率和发病率的最可能诱因相关。例如，从使用机械呼吸设备开始的这些年来，医院肺炎的风险显著升高(Official Statement，American ThoracicSociety)。医院感染，尤其是涉及血流或肺的那些通常导致死亡。
[0007] 美国医院中基于群体的医院感染监视研究表明5％的发病率或表示每1,000名患者-天中5名感染(Wenzel等，2001)。美国医院中流行病学重要的病原体的监视和控
制(SCOPE)医院血流感染的监视系统表明粗略的死亡率为27％，随着病原体有极大的改变。来自SCOPE数据库的医院血流感染估算表明70％发生在具有中央静脉导管的患者中(Wenzel等，1999)。SCOPE已经表明所有医院血流感染的49％发生在重症监护室，其中患者通常具有虚弱的免疫系统且细菌常常在呼吸机和/或导管上形成生物膜。
制(SCOPE)医院血流感染的监视系统表明粗略的死亡率为27％，随着病原体有极大的改变。来自SCOPE数据库的医院血流感染估算表明70％发生在具有中央静脉导管的患者中(Wenzel等，1999)。SCOPE已经表明所有医院血流感染的49％发生在重症监护室，其中患者通常具有虚弱的免疫系统且细菌常常在呼吸机和/或导管上形成生物膜。
[0008] 通常医院肺炎还由气管内导管引起，其是导致生物膜生长形成的 细菌定殖/污染的常见载体。气管内导管连接口咽环境和无菌的支气管肺泡空间，显著提高了医院肺炎的风险。气管内导管中生物膜的形成在引发呼吸机相关的肺炎中起作用并在导致这样感染的细菌种中选择抗生素抗性(Sottile等，1986；Inglis等，1989；Adair等，1993；Koerner等，1998；Gorman等，2001；Adair等，1999)。
[0009] 医院血流感染的主要诱因是脉管导管。估算美国(Raad，1998)每年发生约400,000例脉管导管相关的血流感染(CRBSI)。医院感染的另一常见诱因是尿道感染
(UTI)，构成所有医院感染的34％(Klempner等，1998)。医院UTI通常与导尿管污染相关。 [0010] 此外，由于生物膜生长形成的医院感染通常是外科手术的并发症，尤其是在具有失活组织和降低免疫力的癌症和免疫缺失患者中。手术创伤感染构成所有医院感染的17％(Platt和Bucknall，1988)。许多手术创伤感染与缝线的细菌污染相关。
(UTI)，构成所有医院感染的34％(Klempner等，1998)。医院UTI通常与导尿管污染相关。 [0010] 此外，由于生物膜生长形成的医院感染通常是外科手术的并发症，尤其是在具有失活组织和降低免疫力的癌症和免疫缺失患者中。手术创伤感染构成所有医院感染的17％(Platt和Bucknall，1988)。许多手术创伤感染与缝线的细菌污染相关。
[0011] 已经使用抗生素和防腐剂来涂覆/浸渍细菌可以在其上生长并形成生物膜的装置，生物膜导致感染如医院感染。然而，尽管通过抗生素控制这些感染很多年，但最终形成生物膜的细菌(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))对抗生素处理是抗性的，因此使得这些药剂治疗无效。控制生物膜形成的现有防腐剂的耐久性也是有限的。
[0012] 已经进行了几个测定各种类型的抗微生物处理在控制设备上生物膜形成中的效果的研究。例如，使用双氯苯双胍己烷(chlorohexidine)/磺胺嘧啶银浸渍脉管导管的表面，获得对抗革兰氏阴性杆菌如假单胞菌属(Pseudomonas)的有限活性。二甲胺四环素和利福平浸渍的导管在防止细菌定殖中有一些效果(Darouiche等，1999)。Anwar等(1992)表明用远远超过MIC水平的托普霉素处理将铜绿假单胞菌生物膜细胞数降低了约2个对数，而相同剂量在该生物体的浮游细胞中提供了＞8-对数的降低。将焦亚硫酸钠加入葡萄糖-肝素冲洗中消除了房导管的微生物定殖(Freeman和Gould(1985))。用随后结合
头孢菌素用于表面的阳离子表面活性剂(三月桂基甲基氯化铵)涂覆导管，发现比未处理的导管较少受到污染和产生生物膜(Kamal等，1991)。Flowers 等(1989)发现局部应用多抗生素膏剂后插入含有银离子的可连接皮下套给导管提供了保护性效果，导致较低的污染率。Maki(1994)提出几种方式来控制中央静脉导管上的生物膜，包括在移植过程中使用无菌技术，使用局部抗生素，最小化导管插入术的持续时间，使用用于静脉注射液的管路(in-line)过滤器，形成机械屏障来防止生物体通过连接导管和外科手术植入套的流入，用抗微生物剂涂覆导管的内腔，和除去污染的装置。
头孢菌素用于表面的阳离子表面活性剂(三月桂基甲基氯化铵)涂覆导管，发现比未处理的导管较少受到污染和产生生物膜(Kamal等，1991)。Flowers 等(1989)发现局部应用多抗生素膏剂后插入含有银离子的可连接皮下套给导管提供了保护性效果，导致较低的污染率。Maki(1994)提出几种方式来控制中央静脉导管上的生物膜，包括在移植过程中使用无菌技术，使用局部抗生素，最小化导管插入术的持续时间，使用用于静脉注射液的管路(in-line)过滤器，形成机械屏障来防止生物体通过连接导管和外科手术植入套的流入，用抗微生物剂涂覆导管的内腔，和除去污染的装置。
[0013] 工业应用中所用的防腐剂在防止细菌生物体的生物膜生长形成中也已经失败。例如，由于铜绿假单胞菌腹膜炎的爆发，将工业水污染和公众健康问题追溯到污染的泊洛沙姆-碘溶液，用于处理腹膜导管的清毒剂。发现铜绿假单胞菌污染制造碘溶液的工厂中所用的配水管和水滤器。一旦生物体成熟成生物膜，变得对碘递体溶液的杀菌活性具有抗性。因此，生物膜生长形成引起工业设置中的机械问题，在一些情况中其可能导致人的感染。 [0014] 之前使用金属螯合剂发展了抑制医疗和工业设置中生物膜形成的其他方法
(U.S.专利申请系列No.60/373,461)。这些方法公开了使用小分子螯合剂，即，EDTA、EGTA、去铁胺、detheylene三胺戊-乙酸和羟乙磷酸盐(etidronate)，用于抑制生物膜的用途。
U.S.专利6,267,979公开了使用金属鏊合剂结合抗真菌或抗生素组合物用于防止水处理、造纸浆和纸以及油田注水中的生物淤积。U.S.专利6,086,921公开了使用含硫醇化合物结合重金属作为杀菌剂；和U.S.专利5,688,516公开了使用非糖肽抗微生物剂结合二价金属鏊合剂用于处理和制备医疗留置装置。
(U.S.专利申请系列No.60/373,461)。这些方法公开了使用小分子螯合剂，即，EDTA、EGTA、去铁胺、detheylene三胺戊-乙酸和羟乙磷酸盐(etidronate)，用于抑制生物膜的用途。
U.S.专利6,267,979公开了使用金属鏊合剂结合抗真菌或抗生素组合物用于防止水处理、造纸浆和纸以及油田注水中的生物淤积。U.S.专利6,086,921公开了使用含硫醇化合物结合重金属作为杀菌剂；和U.S.专利5,688,516公开了使用非糖肽抗微生物剂结合二价金属鏊合剂用于处理和制备医疗留置装置。
[0015] 尽管用于控制生物膜生长形成的现有方法具有一定的效果，但在各种设置中如医疗和工业环境中，生物膜生长形成仍旧是个问题。因此，本领域需要更好的靶向生物膜生长形成的方法。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明克服了本领域中防止细菌生物体的生物膜生长形成中的缺 陷。因此，本发明提供了涂覆/浸渍足以抑制装置或装置表面上生物膜生长形成浓度的含镓组合物的装置如医疗和工业装置。特定实施方案中，本发明提供了防止装置上生物膜生长形成的方法，包括将装置或其表面浸渍或涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物。
[0018] 本发明包括任何医疗装置，如留置医疗装置，该装置是生物膜生长形成的载体并因此引起医院感染如医院肺炎，其通常是由于使用机械呼吸装置引起的。因此，本发明的一些实施方案中提供了涂覆/浸渍足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物的呼吸装置。 [0019] 气管内导管中生物膜的形成在引发呼吸机相关的肺炎中起作用。因此，本发明的一些实施方案中提供了涂覆/浸渍足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物的气管内导管。
[0020] 由于生物膜生长形成，脉管导管是医院血流感染的主要诱因。因此，本发明的一些实施方案中提供了涂覆/浸渍足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物的脉管导管。脉管导管可以包括中枢神经系统导管，动脉管，肺动脉管，外部插入的中央导管(PICC)或中线导管。中枢神经系统导管可以是心室内分流导管。
[0021] 由于生物膜生长形成通常引起医院感染的另一种导管是导尿管。因此，本发明的一些实施方案中提供了涂覆/浸渍足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物的导尿管。 [0022] 生物膜生长形成还发生在外科手术装置上。因此，本发明的一些实施方案中提供了涂覆/浸渍足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物的外科手术装置。
[0023] 本发明进一步包括其他留置医疗装置，如但不限于，硬膜外导管或腹膜导管，涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物。本发明的其他装置包括，但不限于，矫形装置；假体装置；支架，如脉管支架，胆支架，或泌尿支架；导线；肾造口术管；起搏器；医疗植入物；光学透镜或目镜如接触透镜；或引流管。可以涂覆/浸渍本发明含镓组合物的其他医疗装置包括换血装置，脉管入口，心血管导管，体外回路，可植入假体，脉管移植物，泵，心脏瓣膜和心血管缝线，仅 举几个例子。
[0024] 本发明的另一实施方案中，装置可以是生物流体传送装置或容器，如但不限于预先装填的注射器，IV(静脉注射)袋，瓶或安瓿。再一实施方案中，本发明的装置可以是药物传送装置如补片(patch)。补片可以是含有药物的装置、系统、组合物、绷带或石膏。再一实施方案中，装置可以是编码装置如计算机芯片。
[0025] 本发明另一特定实施方案中，提供了防止医疗装置上生物膜生长形成的方法，包括将装置或其表面浸渍/涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物。浸渍或涂覆可以包括将医疗装置或装置表面浸入含镓组合物中；将装置或装置表面干燥；从装置或装置表面冲去过量的组合物。
[0026] 进一步的特定实施方案中，因为镓的抗生物膜作用，在非医疗应用中使用本发明的含镓组合物。细菌生物膜的生物淤积是许多设置中的主要问题如牙科设备、加热和冷却装置、饮食服务和水处理工业以及许多其他的。因此，本发明的进一步实施方案中，装置可以是牙科装置如牙植入物，但不限于此，并可以包括其他牙科装置或设备。
[0027] 仍然其他实施方案中，本发明提供了涂覆/浸渍足以抑制装置或其表面上生物膜生长形成浓度的含镓组合物的工业装置。工业装置可以包括，但不限于，食品加工装置、食品集合或含水装置。含水装置可以是游泳池、浴盆、水槽、贮水罐、井、瓶子或矿泉区。再进一步的实施方案中，工业装置可以是水处理设备、水冷却设备、注水喷射装置或造纸和纸浆设备。
[0028] 本发明的再一实施方案中，提供了防止工业设备上生物膜生长形成的方法，包括将设备或其表面浸渍/涂覆足以抑制生物膜生长形成浓度的含镓组合物。浸渍或涂覆可以包括将工业装置或装置表面浸入含镓组合物中；将装置或装置表面干燥；并从装置或装置表面冲去过量的组合物。
[0031] 本发明涉及在此所述的含镓组合物可用于抑制或防止多种微生物的生物膜生长形成，如例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。特定实施方案中，生物膜生长形成由假单胞菌属种如铜绿假单胞菌引起。
[0032] 还涉及了本发明的含镓组合物可以用于防止动物模型或人受试者中的生物膜形成。
[0033] 因为由于生物膜生长形成的医院细菌感染可以导致疾病如菌血症，肺炎，脑膜炎，骨髓炎，心内膜炎，窦炎，关节炎，尿道感染，破伤风，坏疽，结肠炎，急性胃肠炎，支气管炎和各种脓肿，以及条件性感染，本发明进一步涉及防止这些疾病的方法，包括给需要的受试者提供有效量的含镓组合物。
[0034] 囊纤维化肺感染中由铜绿假单胞菌引起的生物膜形成是明显的。因此，进一步的实施方案中，本发明涉及防止囊纤维化受试者中生物膜生长形成的方法，包括给该受试者提供治疗有效量的镓组合物。本发明的含镓组合物可以全身传送，通过气溶胶，局部，或通过本领域已知的将治疗剂传送或给药于受试者的任何方式。
[0035] 本发明的含镓组合物还可应用于防止肺以外部位的铜绿假单胞菌感染引起的生物膜生长形成。例如，烧伤经常受到铜绿假单胞菌的感染，从其可能引起致命的血流入侵和脓毒性休克。认为这些感染涉及生物膜的形成。因此，将本发明的含镓组合物局部应用于伤口，通过防止或抑制生物膜生长形成来防止感染的产生。
[0036] 本发明进一步的实施方案中，提供了杀灭设备上已建立的生物膜的方法，包括将设备暴露于足以杀灭已建立的生物膜浓度的含镓组合物。另一实施方案中，提供了杀灭表面上已建立的生物膜的方法，包括将表面暴露于足以杀灭已建立的生物膜浓度的含镓组合物。
[0037] 再进一步的实施方案中，本发明提供了杀灭已建立的生物膜的试剂盒，包括含镓组合物。
[0038] 术语“医疗留置装置”指的是植入或插入人体内的任何医疗装置。这样的装置可以是暂时或永久植入或插入的。
[0039] 因此，本发明具有多种应用中的用途，如但不限于，工业应用、医疗应用和公众健康应用。与详述的实施方案无关，不意味着本发明的适用范围受到限制。
[0041] 从以下的详细描述中，本发明的其他目的、特征和优势将变得清楚。然而，应当理解，详细描述和特定的实施例，尽管表示本发明的特定实施方案，只是通过说明的方式给出，因为从该详细描述中，本发明精神和范围之内的各种改变和改进对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0044] 以下的附图形成本说明书的一部分并包括来进一步证明本发明的特定特征。通过参考这些附图中的一个或多个结合在此所示的特定实施方案的详述将更好地理解本发明。 [0045] 图1A-1H.灌注无乳铁蛋白(lactoferrin-free)(图1A-1D)和含乳铁蛋白(20μg ml)(图1D-1H)培养基的生物膜流动细胞中GFP-标记的铜绿假单胞菌的共焦显微镜图象。接种流动细胞4h(图1A和1E)、24h(图1B-1F)、3天(图1C-1G)和7天(图1D-1H)后获
得图象。图1A、1B、1E和1F是顶视图(x-y平面)；比例尺，10μm。图1C、1D、1G和1H是侧视图(x-z平面)；比例尺，50μm。结果是六个实验的表示。
得图象。图1A、1B、1E和1F是顶视图(x-y平面)；比例尺，10μm。图1C、1D、1G和1H是侧视图(x-z平面)；比例尺，50μm。结果是六个实验的表示。
[0046] 图2A-2B.伴清蛋白对铜绿假单胞菌生物膜对托普霉素(图2A)和H2O2(图2B)的抗微生物敏感性的影响。数据是平均±SEM，n＝6，来自三个不同的实验。
[0047] 图3A-3B.在生理Fe条件下低浓度的Ga(NO3)3抑制了结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的生长；在过量的Fe存在下阻止了生长的抑制。(图3A)在所示浓度
6
的Ga(NO3)3存在下，在没有添加OADC和Fe的7H9培养基中孵育Erdman结核分枝杆菌(10/ml)。在限定的时间点将等份细菌悬浮液接种于双份BACTEC 12B瓶子中，并测定随后的生长指数。显示了24、48和72h时所示浓度Ga(NO3)3的累积数据并表示为三个独立实验的平均±SEM。(图3B)在没有添加ODAC和Ga的7H9培养基中孵育Erdman结核分枝杆菌
6
(10/ml)，向其中加入10μMCa(NO3)3并提高柠檬酸Fe的浓度。72h时，将细菌悬浮液接种于BACTEC12B瓶子中，并测定随后的生长指数。从代表性实验中(n＝2)显示结果(平均
±SD)。当在BACTEC瓶(含高Fe的培养基)中进行实验时，还发现Fe逆转了Ga(NO3)3对
Erdman结核分枝杆菌和MAC的生长抑制效果(数据未显示)。
6
的Ga(NO3)3存在下，在没有添加OADC和Fe的7H9培养基中孵育Erdman结核分枝杆菌(10/ml)。在限定的时间点将等份细菌悬浮液接种于双份BACTEC 12B瓶子中，并测定随后的生长指数。显示了24、48和72h时所示浓度Ga(NO3)3的累积数据并表示为三个独立实验的平均±SEM。(图3B)在没有添加ODAC和Ga的7H9培养基中孵育Erdman结核分枝杆菌
6
(10/ml)，向其中加入10μMCa(NO3)3并提高柠檬酸Fe的浓度。72h时，将细菌悬浮液接种于BACTEC12B瓶子中，并测定随后的生长指数。从代表性实验中(n＝2)显示结果(平均
±SD)。当在BACTEC瓶(含高Fe的培养基)中进行实验时，还发现Fe逆转了Ga(NO3)3对
Erdman结核分枝杆菌和MAC的生长抑制效果(数据未显示)。
[0048] 图4A-4B.在镓存在下，结核分枝杆菌的Fe吸收受到显著抑制，而镓吸收只受到过量Fe的小程度抑制。在所示浓度冷竞争金属(coldcompeting metal)不存在或存在下，在59 67
7H9培养基(没有添加Fe和OADC)中用500nM柠檬酸 Fe(图4A)或柠檬酸 Ga(图4B)孵
7 67
育Erdman结核分枝杆菌(2×10/ml)6小时。然后将细菌重复洗涤，并测定细菌结合的 Ga
59
或 Fe含量。结果显示为获得的金属含量作为冷竞争金属提高浓度的函数。实验组重复进行三次，且所示的数据表示三个独立的实验(平均±SEM)。
7H9培养基(没有添加Fe和OADC)中用500nM柠檬酸 Fe(图4A)或柠檬酸 Ga(图4B)孵
7 67
育Erdman结核分枝杆菌(2×10/ml)6小时。然后将细菌重复洗涤，并测定细菌结合的 Ga
59
或 Fe含量。结果显示为获得的金属含量作为冷竞争金属提高浓度的函数。实验组重复进行三次，且所示的数据表示三个独立的实验(平均±SEM)。
[0049] 图5A-5B.Ga(NO3)3以浓度依赖性方式抑制了人巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长。以1∶1至5∶1的多重(细菌/巨噬细胞)范围将分枝杆菌(Erdman，H37Ra和MDR结核
分枝杆菌)加入源自人单核细胞的巨噬细胞(MDM)或人肺泡巨噬细胞(HAM)单层中(结果
是相同的)。2h后，洗涤单层，并加入饱和培养基。24h后加入所示浓度的Ga(NO3)3。 对照单层无Ga(NO3)3。在第3天记录使用所示浓度Ga(NO3)3的合并上清液和来自双或三孔的细胞裂解物的生长指数。图5A中所示的是使用MDM的代表性实验(平均±SD)。图5B中，将
累积数据表示为对照的百分比(平均±SEM，n＝2至5)。使用HAM(n＝2)的结果和使用
MDM的那些是相同的。
分枝杆菌)加入源自人单核细胞的巨噬细胞(MDM)或人肺泡巨噬细胞(HAM)单层中(结果
是相同的)。2h后，洗涤单层，并加入饱和培养基。24h后加入所示浓度的Ga(NO3)3。 对照单层无Ga(NO3)3。在第3天记录使用所示浓度Ga(NO3)3的合并上清液和来自双或三孔的细胞裂解物的生长指数。图5A中所示的是使用MDM的代表性实验(平均±SD)。图5B中，将
累积数据表示为对照的百分比(平均±SEM，n＝2至5)。使用HAM(n＝2)的结果和使用
MDM的那些是相同的。
[0050] 图6.Ga-转铁蛋白以浓度依赖性方式抑制了结核分枝杆菌巨噬细胞吞噬体中的59
Fe获得。在所示浓度的Ga-转铁蛋白不存在(对照)或存在下，将 Fe转铁蛋白(10μM)
加入含结核分枝杆菌的MDM中24h，裂解，并通过0.22μm(孔径)滤器将裂解物过滤。测定滤器上结核分枝杆菌相关的放射性(表示为cpm)。所示cpm值为代表性实验中加入的
59
Ga浓度的函数。插图显示三个分开实验的平均±SEM结果，以对照 Fe获得的百分比来作图。
Fe获得。在所示浓度的Ga-转铁蛋白不存在(对照)或存在下，将 Fe转铁蛋白(10μM)
加入含结核分枝杆菌的MDM中24h，裂解，并通过0.22μm(孔径)滤器将裂解物过滤。测定滤器上结核分枝杆菌相关的放射性(表示为cpm)。所示cpm值为代表性实验中加入的
59
Ga浓度的函数。插图显示三个分开实验的平均±SEM结果，以对照 Fe获得的百分比来作图。
[0051] 图7.将OD(A600)约.010的铜绿假单胞菌接种于琥珀酸盐培养基中，单独或补充FeCl3+/-Ga螯合物。然后在37℃孵育6小时的时间中以A600的改变监控生长。使用
Ga(NO3)3的较长孵育显示了相似的效果(数据未显示)。
Ga(NO3)3的较长孵育显示了相似的效果(数据未显示)。
[0052] 图8.镓对铜绿假单胞菌生长的影响。将细菌以1∶100强度接种于含有所示浓度镓的TSB培养基中并在37℃振荡生长。以A600的改变监控生长15小时。
[0053] 图9.灌注对照(上部)培养基和含有0.3μM Ga(NO3)3的培养基(中部)和0.25μg/ml头孢噻甲羧肟(ceftazadime)(底部)的生物膜流动细胞中GFP-标记的铜
绿假单胞菌的共焦显微镜图象。接种流动细胞1、2和4天后获得图象。图像是从上至下(top-down)视图(x-y平面)。
绿假单胞菌的共焦显微镜图象。接种流动细胞1、2和4天后获得图象。图像是从上至下(top-down)视图(x-y平面)。
[0054] 图10A-10D.镓杀灭已建立的生物膜。将三天时间的生物膜暴露于10μM、100μM和1000μM浓度的镓。用碘化丙锭测定生物膜的生活力，并在12小时(图10A)、24小时(图10B)、48小时(图10C)和72小时(图10D)记录观察。图10A-10D显示了镓以时间和浓度
依赖方式杀灭已建立的生物膜，并在临床上获得的峰值内的浓度也是如 此(140-700μM)。 [0055] 说明性实施方案的描述
依赖方式杀灭已建立的生物膜，并在临床上获得的峰值内的浓度也是如 此(140-700μM)。 [0055] 说明性实施方案的描述
[0056] I.本发明
[0057] 本发明克服了本领域在防止生物膜生长形成中的缺陷。已经发现生物膜内的细菌比浮游细胞固有地对抗生素和其他外毒素如过氧化氢的杀灭更有抗性(Costerton等，1999；Stewart等，2000；Elkins等，1999；Drenkard等，2002；Mah等，2001)，由于抗微生物分子对生物膜相关细胞的质量转移降低的速率(Suci等，1994)或因为生物膜细胞生理上不同于浮游细胞(Evans等，1991)。足以灭活浮游生物体的抗微生物浓度通常不足以灭活生物膜生物体，尤其是生物膜深处的那些，潜在地选择了抗性亚种群。生物膜生长形成还使得宿主吞噬细胞难以接近和杀灭生物体。因此，需要开发防止和/或破坏生物体如铜绿假单胞菌生物膜形成的试剂。
[0058] 本发明者已经表明铁(Fe)可用性在导致这些生物体生物膜形成的铜绿假单胞菌感染的致病机理的几个步骤中是关键的。镓(Ga)，能够与Fe竞争细胞吸收，在含Fe酶中镓替代Fe使其失活。本发明者产生的实质性数据还证明了镓能够破坏铁载体介导的结核分枝杆菌的Fe获得策略，该策略与铜绿假单胞菌所采用的具有许多相似性。获得的初步数据与镓对铜绿假单胞菌生长的相似抑制效果一致。更重要地，数据表明不抑制细菌生长浓度的镓有效地防止了铜绿假单胞菌体外的生物膜形成，且该浓度比已知的用于其他目的将镓给药于人可获得的低很多。数据表明镓可以破坏铜绿假单胞菌的Fe代谢，因此改变了该生物体生物膜建立中的关键步骤。
[0059] 本发明者还显示了镓以时间和浓度依赖性方式有效地杀灭已建立的生物膜，在临床上获得的峰值内浓度也是如此。
[0060] 因此，本发明提供了涂覆/浸渍防止或抑制生物膜生长形成的含镓组合物的装置或其表面。本发明还提供了防止装置或其表面上生物膜生长形成的方法。优选实施方案中，含镓组合物用来防止装置上铜绿 假单胞菌的生物膜形成，如气管内导管，呼吸机，其他医疗装置，或工业设备，通过将设备涂覆/浸渍该组合物。还涉及本发明的含镓组合物可以用于防止其他与铜绿假单胞菌相似Fe依赖性的生物体形成的生物膜。本发明的含镓组合物还可以用于防止患者如囊纤维化患者和其他铜绿假单胞菌感染患者中的生物膜生长形成。此外，本发明的含镓组合物可以用于杀灭装置或表面上已建立的生物膜。
[0061] II.细菌生物体和生物膜形成
[0062] 当微生物不可逆地粘着浸没表面并产生有助于粘着和提供结构基质的胞外聚合物时发生生物膜生长形成。这表面可以是惰性的，无生命的物质或活组织。对于生长率，生物膜相关微生物的行为不同于浮游(游离悬浮)生物体。此外，生物膜的特征在于它们对抗微生物处理的变得日益增强的抗性能力(1000-至1500-倍低的敏感)。一些实例中，生物膜可以由单个种或多个种构成，取决于设备及患者使用的持续时间。
[0063] 认为生物膜对抗微生物剂的抗性是由于其中包埋细菌细胞的胞外基质提供了对抗杀菌剂渗透的屏障(Costerton等，1999)。然而，还可能的是生物膜中的大部分细胞是生长缓慢，营养饥饿的状态，并因此对抗微生物剂的效果不再敏感。此外，对抗微生物剂的抗性可能是由于生物膜中的细胞采用了截然不同的和保护的生物膜表型，例如，通过药物射流泵提高的表达。
[0064] 生物膜可以由细菌、真菌、酵母、原生动物和其他微生物构成。发现最常见的生物膜是细菌生物膜。革兰氏阳性和革兰氏阴性两种细菌都能形成生物膜。能够形成生物膜的革兰氏阳性细菌实例包括，但不限于，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，凝固酶阴性葡萄球菌属，如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)，化脓链球(Streptococcus pyogenes)(组A)，链球菌属种(Streptococcusspecies)(viridan组)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(组B)，牛链球菌(S.bovis)，链球菌(厌氧种)，肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)和肠球菌属种(Enterococcusspecies)。其他革兰氏阳性杆菌包括炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和为类白喉菌(需氧和厌氧)的棒状杆菌属种(Corynebacterium species)(aerobic and anerobic)，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，破伤风梭状芽孢菌(Clostridium tetani)和难辨梭状芽孢菌(Clostridium difficile)。能
够形成生物膜的革兰氏阴性细菌的实例是来自大肠杆菌(Escherichia coli)，肠杆菌属种(Enterobacter species)，奇异变形菌(Proteus mirablis)和其他属种，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，沙雷氏菌属(Serratia)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，奈瑟氏菌属(Neisseria)和粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)的细菌。
够形成生物膜的革兰氏阴性细菌的实例是来自大肠杆菌(Escherichia coli)，肠杆菌属种(Enterobacter species)，奇异变形菌(Proteus mirablis)和其他属种，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，沙雷氏菌属(Serratia)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，奈瑟氏菌属(Neisseria)和粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)的细菌。
[0065] 能够形成生物膜的其他生物体包括皮肤真菌(犬小孢子菌(Microsporumcanis)和其他小孢子菌属(M.spp.)；和毛癣菌属(Trichophyton.spp.)如深红色
毛藓菌(T.rubrum)和须毛藓菌(T.Mentagrophytes)，酵母(例如，白色假丝酵母
(Candidaalbicans)，近平滑假丝酵母(C.Parapsilosis)，光滑假丝酵母(C.glabrata)，热带假丝酵母(C.tropicalis)或其他假丝酵母种，包括药物抗性的假丝酵母种)，
絮状表皮藓菌(Epidermophytonfloccosum)，粃糠状鳞斑霉(Malassezia fuurfur)
(Pityropsporon orbiculare或P.ovale)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，
烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)和 其他 曲霉 属，接合 菌(Zygomycetes)(根 霉
(Rhizopus)，毛霉(Mucor))，Hyalohyphomycosis(镰刀菌属(Fusarium Spp.)，巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)和申克孢子丝菌 (Sporothrix schenckii)。
毛藓菌(T.rubrum)和须毛藓菌(T.Mentagrophytes)，酵母(例如，白色假丝酵母
(Candidaalbicans)，近平滑假丝酵母(C.Parapsilosis)，光滑假丝酵母(C.glabrata)，热带假丝酵母(C.tropicalis)或其他假丝酵母种，包括药物抗性的假丝酵母种)，
絮状表皮藓菌(Epidermophytonfloccosum)，粃糠状鳞斑霉(Malassezia fuurfur)
(Pityropsporon orbiculare或P.ovale)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，
烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)和 其他 曲霉 属，接合 菌(Zygomycetes)(根 霉
(Rhizopus)，毛霉(Mucor))，Hyalohyphomycosis(镰刀菌属(Fusarium Spp.)，巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)和申克孢子丝菌 (Sporothrix schenckii)。
[0066] 从留置装置分离的最常见的引起生物膜生长形成的生物体包括葡萄球菌属种如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌；假丝酵母属种如白色假丝酵母；肠球菌属种如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，链球菌属种；铜绿假单胞菌；肺炎克雷伯氏菌和类白喉菌。这些生物体来自患者或保健工作者的皮肤、进口暴露的自来水，或环境中的其他来源，尤其是保健机构。
[0067] 铜绿假单胞菌形成生物膜的偏好是医疗和工业环境中生物膜生长形成问题的主要诱因。铜绿假单胞菌与生物膜形成和导管阻塞高度相关。例如，已经从医疗植入物如留置尿道、静脉或腹膜导管分离出铜绿假单胞菌的生物膜(Stickler等，1998)。
[0068] 铜绿假单胞菌也是经受机械呼吸的患者中肺炎的最常见诱因(Lode等，1992；Adair等，1999)，且这是影响垂危的最大破坏性感染(Chastre等，2002；Bergmans等，
1998)。最近的工作表明呼吸机相关肺炎发展中的关键因素是气管内导管和口咽中受到生物膜中活细菌的定殖(Inglis等，1989；Koerner，1997；Levine等，1991；Sottile等，1986；
Bauer等，2002)。铜绿假单胞菌也是AIDS晚期患者中群体获得性肺炎的诱因(Shepp等，
1994；Schuster等，1994)。由于细菌的生物膜生长形成，这些患者通常变得对感染敏感(Meynard等，1999)。
1998)。最近的工作表明呼吸机相关肺炎发展中的关键因素是气管内导管和口咽中受到生物膜中活细菌的定殖(Inglis等，1989；Koerner，1997；Levine等，1991；Sottile等，1986；
Bauer等，2002)。铜绿假单胞菌也是AIDS晚期患者中群体获得性肺炎的诱因(Shepp等，
1994；Schuster等，1994)。由于细菌的生物膜生长形成，这些患者通常变得对感染敏感(Meynard等，1999)。
[0069] 除了这些急性感染，铜绿假单胞菌导致囊纤维化(CF)或慢性支气管炎患者的慢性肺感染(Fick等，1989；Marshall等，1991；Pollack等，2000)，由于生物膜生长形成(Costerton等，1999)。与持续的铜绿假单胞菌感染相关的肺损伤是目前CF死亡的主要原因(Fick等，1989)。
[0070] 因此，进一步的实施方案中，本发明涉及防止囊纤维化受试者中生物膜生长形成的方法，包括给该受试者提供治疗有效量的镓组合物。本发明的含镓组合物可以全身传送，通过气溶胶，局部，或通过本领域已知的用于将治疗剂传送或给药于受试者的任何方式。 [0071] 本发明的含镓组合物还可以应用于防止肺以外部位的铜绿假单胞菌感染。例如，烧伤经常受到铜绿假单胞菌的感染，从其可能引起致命的血流入侵和脓毒性休克。认为这些感染涉及生物膜的形成。因此，将本发明的含镓组合物局部应用于伤口，通过防止或抑制生物膜生长形成来防止感染的产生。
[0072] 生物膜如铜绿假单胞菌还引起了工业问题的关注(Bitton，1994；Steelhammer等，1995)。该生物体生长成集合的状态，生物膜，在许多水处理工厂中引起问题。
[0073] III.含镓组合物及其用途
[0074] 镓是一组IIIa过渡金属，已经在核医学中用作定位肿瘤和炎症部位的工具。由3+
于镓对特定肿瘤和炎症细胞的偏好，镓定位于这些部位。Ga 的生物和治疗效果与其替
3+
代许多生物分子过程中的Fe 的能力相关，因此破坏它们(Chitamber等，1988；Hubbard
3+ 3+
等，1986)。Ga ，和Fe 一样，进入哺乳动物细胞，包括巨噬细胞，通过转铁蛋白依赖性和转铁蛋白无关性Fe吸收机理(Chitambar等，1987；Olakanmi等，1994)。快速分裂的肿瘤细胞中(与最终分化的细胞如巨噬细胞相反)，镓通过替代核糖核苷酸还原酶中的铁的能力来干扰细胞DNA复制，由于镓不同于和铁，不能经历氧化还原循环的事实，导致酶失活(Chitambar等，1988)。
于镓对特定肿瘤和炎症细胞的偏好，镓定位于这些部位。Ga 的生物和治疗效果与其替
3+
代许多生物分子过程中的Fe 的能力相关，因此破坏它们(Chitamber等，1988；Hubbard
3+ 3+
等，1986)。Ga ，和Fe 一样，进入哺乳动物细胞，包括巨噬细胞，通过转铁蛋白依赖性和转铁蛋白无关性Fe吸收机理(Chitambar等，1987；Olakanmi等，1994)。快速分裂的肿瘤细胞中(与最终分化的细胞如巨噬细胞相反)，镓通过替代核糖核苷酸还原酶中的铁的能力来干扰细胞DNA复制，由于镓不同于和铁，不能经历氧化还原循环的事实，导致酶失活(Chitambar等，1988)。
[0075] 还将镓治疗上用于恶性肿瘤和恶性相关的高钙血症(Foster等，1986；Todd等，1991；Jonkoff等，1993；Chitambar等，2003)。还已知镓可以累积肝脏、肾脏、脾脏和淋巴系统中单核来源的细胞。癌相关高钙血症患者的临床经验表明充分耐受硝酸镓，产生很少的临床相关副作用(Todd等，1991；Leyland-Jones，1991；Chitambar等，2003)。Ga(NO3)3形式的镓，目前批准静脉内给药于人用于治疗恶性的高钙血症。麦芽糖镓(gallium maltolate)形式的镓口服制剂，目前在治疗转移性前列腺癌，复发性多发性硬化，转移性膀胱癌和复发性淋巴溜的临床试验中。通过Titan Pharmaceutical(San Francisco，CA)来研发该药物。 [0076] 含镓化合物和硝酸镓还显示出能抑制引起慢性肺感染的胞内病原体(例如，参见WO98/09622，U.S.专利5,997,912和6,203,822)，每个在此以其整体引入作为参考。
[0077] 本发明提供了有效抑制或防止生物膜生长形成浓度的含镓组合物。抑制生物膜生长形成需要的镓含量低于杀灭或抑制细菌生物体需要的量。因此，一些实施方案中，镓的浓度至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μM或更高。本发明进一步的实施方案中，镓浓度为约1μM至约10μM，约2μM至约15μM，约4μM至约12μM，约5μM至约20μM，约10μM至约30μM，约15μM至约40μM，约20μM至约50μM，或更高。一些优选的实施方案中，镓浓度为约16.25μM至约100μM。已知镓具有替代铁的能力，本发明的镓浓度取决于组合物中可获得的铁含量。本领域技术人员将知道怎样基于铁可用性来测定镓浓度。
[0078] 本发明进一步提供了浓度为有效杀灭已建立的生物膜的含镓组合物。一些实施方案中，镓的浓度为约10μM至约1000μM。本发明进一步的实施方案中，镓浓度为约140μM至约700μM。另一实施方案中，镓浓度为约10μM至约100μM。另一实施方案中，镓浓度为约100μM至约1000μM。已知镓具有替代铁的能力，本发明的镓浓度取决于组合物中可获得的铁含量。本领域技术人员将知道怎样基于铁可用性来测定镓浓度。
[0079] IV.实施例
[0080] 包括以下实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员将认识到根据本发明者发现的代表技术的实施例中所公开的技术，能很好地进行本发明的实施，因此认为构成优选的实施方式。然而，本领域技术人员根据本发明的公开内容应当认识到所公开的特定实施方案中可以形成许多改变且仍然获得相同或相似的结果而没有脱离本发 明的精神和范围。
[0081] 实施例1
[0082] Fe可用性和铜绿假单胞菌生物膜生长形成
[0083] 本领域公知铜绿假单胞菌通过谨慎调控的过程形成生物膜。已经显示通过铜绿假单胞菌的数量感应系统(quorum sensing system)来调控生物膜形成(Davis等，1998)。本发明者之前的工作证明了Fe可用性在铜绿假单胞菌生物膜的建立阶段中起关键作用。此外，本发明者已经表明镓可以破坏细菌Fe依赖性代谢。发现半抑制浓度的镓能防止体外铜绿假单胞菌的生物膜形成。
[0084] 初步研究证明没有改变铜绿假单胞菌生长的Fe结合蛋白乳铁蛋白(LF)浓度深深地抑制了铜绿假单胞菌的生物膜形成，如在之前发展的生物膜形成的流动细胞模型中通过显微镜测定的(Singh等，2002；图1A-1H)。通过Fe的存在逆转了该效果并重复，如图2A-2B中所示的，使用Fe螯合剂去铁胺或伴清蛋白(Singh等，2002)。结果导致铜绿假单胞菌生物膜形成对环境Fe水平比细菌生长更敏感的结论。
[0085] Fe限制还导致铜绿假单胞菌对托普霉素或H2O2杀灭提高的敏感性(Singh等，2002；图2A-2B)，最可能是因为LF破坏了生物膜形成。然而，一旦建立了生物膜，LF不能改变生物膜。另外的工作证明Fe限制对生物膜形成的影响与铜绿假单胞菌游动性的改变相关-低Fe可用性刺激了颤动，其大概用来防止生物体从浮游状态进展成生物膜的起始(Singh等，2002)。
[0087] 实施例2
[0088] 镓对抗病原分枝杆菌的抗微生物活性
[0089] 发明者之前已经表明了镓抑制结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌复合物(MAC)胞外和人巨噬细胞内的生长(Olakanmi等，2000)。将分枝杆菌在BACTEC 12B液体培养基培养瓶14
中培养，不存在或存在Ga(NO3)3。BACTEC系统监控分枝杆菌生长，以细菌将[ C]掺入分枝
14
杆菌细胞壁的过程中产生的 CO2释放来监控。用Ga(NO3)3观察到每个分枝杆菌菌株的浓度依赖性生长抑制(Olakanmi等，2000)。由于其灵敏度和速度使用BACTEC系统。然而，其培养基含有达1.6mM的Fe(ferrozine测试)。相比较，体内胞外Fe浓度为5-10μM。当
Erdman分枝结核杆菌暴露于无Fe补充(2μM Fe)形成的7H9液体培养液中的镓时，如期望的，在更低的镓浓度观察到结核分枝杆菌的显著生长抑制(图3A)。在72h镓暴露时，IC50
3+ 3+
大约为1.25-2.5μM。在Fe 浓度≥Ga 浓度时，逆转了镓介导的生长抑制(图3B)。
中培养，不存在或存在Ga(NO3)3。BACTEC系统监控分枝杆菌生长，以细菌将[ C]掺入分枝
14
杆菌细胞壁的过程中产生的 CO2释放来监控。用Ga(NO3)3观察到每个分枝杆菌菌株的浓度依赖性生长抑制(Olakanmi等，2000)。由于其灵敏度和速度使用BACTEC系统。然而，其培养基含有达1.6mM的Fe(ferrozine测试)。相比较，体内胞外Fe浓度为5-10μM。当
Erdman分枝结核杆菌暴露于无Fe补充(2μM Fe)形成的7H9液体培养液中的镓时，如期望的，在更低的镓浓度观察到结核分枝杆菌的显著生长抑制(图3A)。在72h镓暴露时，IC50
3+ 3+
大约为1.25-2.5μM。在Fe 浓度≥Ga 浓度时，逆转了镓介导的生长抑制(图3B)。
[0090] 这些数据表明镓部分地通过破坏分枝杆菌的Fe获得介导了抗微生物效果。令人67 59
惊讶地，如使用 Ga或 Fe测定的，细菌具有的Fe容量高于Ga累积。最终，鉴于镓在竞争
59 67
结核分枝杆菌的 Fe获得中高度有效，而Fe对阻断 Ga获得相对无效(图4，Olakanmi等，
2000)。
惊讶地，如使用 Ga或 Fe测定的，细菌具有的Fe容量高于Ga累积。最终，鉴于镓在竞争
59 67
结核分枝杆菌的 Fe获得中高度有效，而Fe对阻断 Ga获得相对无效(图4，Olakanmi等，
2000)。
[0091] 实施例3
[0092] 镓对抗巨噬细胞中病原分枝杆菌的抗微生物活性
[0093] 分枝杆菌体内生长的关键部位是在宿主巨噬细胞内。发现镓抑制这些细胞内的结核分枝杆菌生长(Olakanmi等，2000；图5A)。NaNO3对分枝杆菌生长没有效果，证明镓是起作用的。尽管24小时分枝杆菌的生长抑制达50％，在48小时后观察到更显著的抑制(＞70％)(图5B)。这与吸收并将镓运至巨噬细胞中然后进入细菌中需要的时间相关。镓的效果不是由于源自单核细胞的巨噬细胞(MDM)单层的丢失。实际上，镓防止了由于结核分枝杆菌增殖单层随着时间的丢失。
[0094] 当静脉内给药Ga(NO3)3时，大部分镓与血清转铁蛋白(TF)螯合(Seligman等，1992；Bernstein，1998)。发现在抑制液体培养基中和人巨噬细胞内分枝杆菌的生长中，Ga-TF和Ga(NO3)3一样有效 (Olakanmi等，2000)。镓是胞外结核分枝杆菌的杀菌剂，当细菌胞内生长于巨噬细胞中时，也是如此(Olakanmi等，2000)。
[0095] 实施例4
[0096] 镓降低了胞内结核分枝杆菌的Fe获得
[0097] Fe-TF是胞外Fe的主要形式，并观察到外源添加的TF运送至含结核分枝杆菌的人巨噬细菌的吞噬体中(Clemens等，1996)。因此推定通过吞噬体内的细菌分裂镓竞争Fe吸收。本发明者使用他们实验室开发的测试，来显示位于巨噬细胞吞噬体内的结核分枝杆菌59
获得结合TF的胞外 Fe(Olakanmi等，2000)。然而，10μM Ga(NO3)3的存在显著降低了吞
59 59
噬体内结核分枝杆菌的 Fe获得(图6；Olakanmi等，2000)。这不是由于总MDM Fe的差异。
获得结合TF的胞外 Fe(Olakanmi等，2000)。然而，10μM Ga(NO3)3的存在显著降低了吞
59 59
噬体内结核分枝杆菌的 Fe获得(图6；Olakanmi等，2000)。这不是由于总MDM Fe的差异。
[0098] 两个最近的初步实验中，将MDM单层预装载59Fe或67Ga或两者(脉冲/追踪，每次24小时)。然后加入Erdman结核分枝杆菌。48小时后，测定从吞噬体分离的细菌相连的铁或镓。发现每种金属特异性地连接细菌。当镓和铁都加入时，铁获得抑制了71％和67％(n＝2)；相反，镓获得不定地增加(52％和22％)。
[0099] 实施例5
[0100] 镓对Fe阻遏物调节剂蛋白IdeR的影响
[0101] 铁调控元件IdeR调控分枝杆菌中过氧化氢酶SOD和铁载体的产生(Dussurget等，1996)，以类似铜绿假单胞菌Fur的方式。为了产生DNA结合，IdeR必须与二价金属复
2+ 2+
合如Fe 或Ni 。使用结核假单胞菌的含有高亲和性IdeR结合位点的HisE启动子区来测
定Ga(NO3)3对IdeR结合(凝胶迁移率变动分析)的影响(Schmitt等，1995)。镓(200μM)
2+ 2+ 2+
没有导致IdeR结合该DNA片段，而用200μM Ni 观察到了结合。镓没有干扰Ni 或Fe
激活IdeR结合。IdeR不是镓的靶标，这不令人惊讶，已知IdeR选择性地结合二价金属，而
2+
镓是三价的(Schmitt等，1995)。基于这些发现，预见了Ga 与铜绿假单胞菌 Fur相似的结合缺乏。
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合如Fe 或Ni 。使用结核假单胞菌的含有高亲和性IdeR结合位点的HisE启动子区来测
定Ga(NO3)3对IdeR结合(凝胶迁移率变动分析)的影响(Schmitt等，1995)。镓(200μM)
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没有导致IdeR结合该DNA片段，而用200μM Ni 观察到了结合。镓没有干扰Ni 或Fe
激活IdeR结合。IdeR不是镓的靶标，这不令人惊讶，已知IdeR选择性地结合二价金属，而
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镓是三价的(Schmitt等，1995)。基于这些发现，预见了Ga 与铜绿假单胞菌 Fur相似的结合缺乏。
[0102] 实施例6
[0103] 镓抑制了结核分枝杆菌的核糖核苷酸还原酶活性
[0104] 接着假定通过细菌内在化的镓导致Fe-依赖性代谢活性如核糖核苷酸还原酶(RR)的破坏。与此一致，其他研究者发现镓是RR活性的潜在抑制剂；使用放射性标记的CDP还原测试，用于RR活性和结核分枝杆菌RR，II型RR(Yang等，1994；1997)。450μM镓将RR活性抑制了50％(n＝2)，表明镓通过直接替代酶活性位点的Fe抑制了酶。该测试中镓的效能高于羟基脲10倍(IC50＝3-5mM)，羟基脲是实验上用来抑制RR的标准试剂(Yang等，
1997)。如之前所述的，已经报道了铜绿假单胞菌对通过羟基脲的生长抑制和DNA产生比其他细菌种更敏感(Gale等，1964)。尽管不存在对纯化哺乳动物RR的镓IC50 的数据，已经报道了在哺乳动物L1210细胞的无细胞提取物中降低50％的RR酪氨酰基特征性EPR峰，需要16mM镓(比对于结核分枝杆菌RR的镓IC50高约35倍)(Narasimhan等，1992)。抑制完
整细菌情形中的RR需要的镓浓度比抑制这些研究中所用纯化酶需要的低得多。
1997)。如之前所述的，已经报道了铜绿假单胞菌对通过羟基脲的生长抑制和DNA产生比其他细菌种更敏感(Gale等，1964)。尽管不存在对纯化哺乳动物RR的镓IC50 的数据，已经报道了在哺乳动物L1210细胞的无细胞提取物中降低50％的RR酪氨酰基特征性EPR峰，需要16mM镓(比对于结核分枝杆菌RR的镓IC50高约35倍)(Narasimhan等，1992)。抑制完
整细菌情形中的RR需要的镓浓度比抑制这些研究中所用纯化酶需要的低得多。
[0105] 实施例7
[0106] 镓对铜绿假单胞菌生长的作用
[0107] 上述表明镓有效地破坏了分枝杆菌铁代谢的数据促使了镓对生长于琥珀酸盐培养基中铜绿假单胞菌铁代谢的潜在影响的研究。铜绿假单胞菌生长依赖于外源Fe的添加(图7)。琥珀酸盐培养基中包括1μMFeCl3，铜绿假单胞菌菌株PA01导致6h内铜绿假单胞菌浓度(A600)＞10倍的增加，而不存在添加的铁下观察到可忽略的增加。当镓，以Ga(NO3)3形式或Ga-TF形式，以≥1μM的浓度加入铁补充的琥珀酸盐培养基中时，观察到铜绿假单胞菌生长的镓浓度依赖性抑制(图7)。100nM镓没有抑制生长(未显示)。在不同条件下观察到相似的结果(参见以下的)。
[0108] 实施例8
[0109] 镓抑制铜绿假单胞菌生物膜形成
[0110] 数据表明通过乳铁蛋白螯合的铁抑制铜绿假单胞菌生物膜形成和镓可以破坏微生物的铁获得。这些结果表明镓具有抗生物膜作用。因此，施用镓来阻断生物膜形成提供了潜在的治疗方法，已知出于很多原因，体内有效的铁螯合是非常困难的。
[0111] 首先，许多病原细菌具有高度有效的铁获得机理。因此有效的螯合剂将不得不以极度高亲和性结合铁。其次，由于胞外流体中存在宿主铁结合蛋白，生物可利用铁非常有限。这使得药物螯合剂不太可能还原更多可获得的铁。第三，病原生物体如铜绿假单胞菌产生可以降解铁螯合剂的酶。最后，对于许多生理过程人细胞需要铁。因此，即使有效的铁限制是可能的，这对宿主具有不利影响。
[0112] 为了研究镓抑制生物膜形成的可能性，测定Ga(NO3)3的亚抑制浓度(没有削弱生物膜实验中所用培养基中铜绿假单胞菌的生长，1∶100浓度TSB)。这对于测定镓的特异性抗生物膜作用是重要的而没有涉及生长抑制的效果。如图8中所示的，Ga(NO3)3没有显著降低铜绿假单胞菌的生长率(分批培养)直至浓度超过1μM。
[0113] 最初的生物膜实验中，使用0.3μM浓度的Ga(NO3)3，比该培养基中铜绿假单胞菌抑制浓度低3倍。为了评价乳铁蛋白对生物膜形成的影响，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的铜绿假单胞菌以连续培养流动细胞生长并随着时间产生生物膜。流动细胞室连续灌注含或不合Ga(NO3)3的生物膜培养基。
[0114] 无镓的培养基中(图9)，观察到生物膜发展的典型阶段。最初，细菌粘附于表面。生长2天后，微菌落(生物膜发展中早期形成的细胞丛)明显。第4天，形成柱形生物膜。
镓破坏了这种模式的发展。在Ga(NO3)3存在下，细菌粘附，但生物膜形成中随后的步骤得到了抑制(图9)。甚至在延长的孵育后，细菌没有集合成分化的生物膜结构；在镓存在下它们保持于薄层中。
镓破坏了这种模式的发展。在Ga(NO3)3存在下，细菌粘附，但生物膜形成中随后的步骤得到了抑制(图9)。甚至在延长的孵育后，细菌没有集合成分化的生物膜结构；在镓存在下它们保持于薄层中。
[0115] 由于镓对生物膜形成的惊人影响，进行了测定亚抑制浓度的其他抗微生物剂行为是否相似的其他实验。图9显示了亚抑制浓度的抗假单胞菌抗生素头孢噻甲羧肟没有抑制生物膜发展。这表明生物膜抑制不是亚抑制浓度抗生素的一般作用。将研究镓呈现该影响的机理。
[0116] 实施例9
[0117] 镓杀灭已建立的生物膜
[0118] 上述表明镓抑制生物膜形成的数据促使了测定镓对已建立的生物膜的潜在影响。将三天时间的生物膜暴露于浓度为10μM、100μM和1000μM的镓。用碘内锭测定生物膜的生活力，并在12小时(图10A)，24小时(图10B)，48小时(图10C)和72小时时(图
10D)记录观察。图10A-10D表明镓以时间和浓度依赖性方式杀灭已建立的生物膜，在临床上获得的峰值(140-700μM)中的浓度也是如此。
10D)记录观察。图10A-10D表明镓以时间和浓度依赖性方式杀灭已建立的生物膜，在临床上获得的峰值(140-700μM)中的浓度也是如此。
[0119] * * * * * * * * * * * *
[0120] 根据本发明的公开内容制成并实施在此所公开和要求的所有组合物和/或方法和/或装置而不需要过度的实验。尽管根据优选实施方案已经描述了本发明的组合物和方法，本领域技术人员将清楚可以将改变应用至在此所述的组合物和/或方法和/或装置以及方法中的步骤或步骤次序中而没有脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将清楚化学和生理相关的特定试剂可以替代在此所述的试剂而获得相同或相似的结果。认为所有这样本领域技术人员明白的相似替代和改变在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
[0121] 参考文献
[0122] 以下参考文献，至给在此所示那些提供实例方法或其他详细内容补充的程度，在此特意引入作为参考。
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