权利要求

结合人IL-12的人抗体及其生产方法本申请是申请日为2000年3月24日，申请号为00807783.5,发 明名称为"结合人IL-12的人抗体及其生产方法"的发明专利申请的 分案申请。 相关申请本申请是要求1999年3月25日提交的美国临时申请序号 60/126,603的优先权的非临时申请，所述临时申请的内容通过引用结 合到本文中。发明背景'人白细胞介素12(IL-12)最近鉴定为一种细胞因子，它具有独特的 结构和多效作用（Kobayashi等(1989)丄170: 827-845; Seder等 (!993) Pro.廳.^aw?. Sc/. 90: 10188-10192; Ling等（1995) ~MW. 154: 116-127; Podlaski等(1992;Mrc/1.说oc/^加.万〖o/?/^j. 294: 230-237)。 IL-12在与若干涉及免疫和炎症反应的疾病有关的病理学中起着重要 的作用。 一篇关于IL-12、其生物活性和在疾病中的作用的综述可见 Gately等（1998)爿朋i?ev. /mwwo/. 16: 495-521 。在结构上IL-12是一种异源二聚体蛋白'(称为"p70亚单位，，），它 包含通过二硫桥将二者连接在一起的35 kl)i亚单位(p3》和40 kDa亚 单位(p40)。所述异源二聚体蛋白主要由诸如单核细胞、巨噬细胞和树 突细胞的抗原提呈细胞产生。这些细胞类型还分泌相对于p70亚单位 过量的p40亚单位。p40和p35亚单位在遗传学上是不相关的，而且 也没有关于它们具有生物活性的报道，尽管p40同源二聚体可能具有 IL-12拮抗剂的作用。在功能上,DL-12在调节抗原特异性1型T辅助(Thl)淋巴细胞和2 型T辅助(Th2)淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。TM和Th2细胞控 制自身免疫性疾病的发生和发展，IL-12在调节Thl淋巴细胞的分化和 成熟中起重要的作用。Thl细胞释放的细胞因子是炎症性细胞因子，包括丫干扰素(IFN力、IL-2和淋巴毒素(LT)。 Th2细胞分泌IL-4 、 IL-5、 IL-6、 IL-10和IL-13促进体液免疫、过敏反应和免疫抑制。与Thl反应在自身免疫性疾病中占优势以及IFNy的促炎活性一 致的是，IL-12可能在与许多诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化 (MS)和节段性回肠炎的自身免疫性疾病和炎症疾病有关的病理学中起 主要作用， 一已经证实MS病人的IL-12的表达增加，因为文献证实急性MS 斑中存在不同水平的p40 mRNA 。 （Windhagen等> (1 "5)丄 182: 1985-1996)。另外，用MS患者表达CD40L的T细胞体外刺激抗 原提呈细胞使IL-12产生增加(与对照T细》包相比)，这与CD40/CD40L 相互作用是工L-12的有效诱导剂的观测结果一致，与健康对照相比，在RA患者滑液中S见测到IL-12 p70水平升高 (Morita等(1998)^W/^/fe OT《朋eww。few. 41: 306-314)。在RA滑液中 细胞因子信使核酸(mRNA)表达类型筌定主要为Thl细胞目子。（Bucht 等，（1996) 五jc;?. /?m?m朋/. 103: 347-367)。 IL-12似乎还在与节段 性回肠炎(CD)有关的病理学中起重要作用，在节l殳性回肠炎患者的肠 粘膜中观测到IFNY和rL-12表达增加(Fais等(1994)/. i""ter/e/wi Aes'. 14: 235-238; Parronchi等，（1997) 丄尸。仇150: 823-832; Montelecme等， (1997) G。Wro幼&TO/ogy, 112: 1169-1178和Berrebi等，（1998)爿w, J. 户a仇152: 667-672)。 CD患者的粘膜固有层的T细胞的细胞因子分泌 类型的特征是主要为Thl反应，包括IFNY水平明显升高(Fuss等，（1996) /m/m/w/. 157: 1261-1270)。而且，CD患者的结肠组织切片显示丰富 的表达IL-12的巨噬细胞和表达IFNy的T细胞(Parronchi等(1997)4肌 J.户a^. 150: 823-因为人IL-12在各种人类疾病中的作用，因此设计了备种治疗茉 略来抑制或中和IL-12活性，尤其是寻找结合并中和IL-I2的抗体用作 抑制IL-12活性的手段，某些最早期的抗体为小鼠单克隆抗体(mAb)， 它由IL-12免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌(参见例如Strober等的世界专利申请公布号WO 97/15327; Neurath等(l995)丄五平A/M. 182: 1281-1290; Duchmann等(1996)J. //wm^?/. 26: 934-938),这些小鼠 IL-12抗体的体内应用受到限制，因为存在将小鼠抗体给予人类的有关 问题，例如血清半衰期短、不能亂义某些人类效应物功能以及在人体 内诱发抗小鼠抗体的不需要的免疫反应（"human anti-mouse antibody" (HAMA)反应)。一般来说> 试图解决在人类使用完全小鼠抗体有关问题的措施包 括通过遗传工程改进所述抗体使其成为更接近人类的抗体.例如制备 了嵌合抗体，嵌合抗体中所述抗体链的可变区是鼠源性的，而所述抗 体链的恒定区是人源性的(Jimghans等(I990)Ca恥eri?仏50: 1495-1502; Brown等(1991)尸roc. Zo^. 88: 2663-2667; Kettleborougli等(1991)£>w«ee?7>ig. 4: 773-7S3),但是因为这些嵌合抗体和人 源化抗体仍然保留部分鼠序列，所以它们仍然可能激发不需要的免疫 反应、人抗嵌合抗体(HACA)反应，当长时间给予所述抗体时尤其如 此。鼠抗体或其衍生物(例如嵌合抗体或人源化抗体)的优选IL-12抑 制剂应该为完全人抗IL-12抗体，因为这样的抑制剂不会M HAMA 反应，即使长期使用也不会激发HAMA。然而，本领域没有关于这类 抗体的介绍，因此仍然需要这样的抗体。发明概述本发明提供结合人IL-12的人抗体。本发明还涉及应用本发明的 人抗IL-12抗体治疗或预防其病理学涉及IL-12的急性或慢性疾病或病 症.一方面，本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分，在一个实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括：在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点 或超突变位点选择性突变人抗体或其抗原结合部分，使得它结合人 IL-12 ,在一个优选实施方案中，本发明提供选^f性突变的人IL-12抗体，包括:在具有增强活性的氨基酸残基的优选选4斧性诱变位点选择性突 变人抗体或其抗原'结合部分，使得它结合人IL-12 。在另一个优选实施方案中，在一个以上具有增强活性氨基酸残基 的优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选择性突 变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在另一个优选实施方案中，在3 个以下优选逸择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变选择性突 变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在另一个优选实施方案中，在2 个以下的优逸选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选 择性诱变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在再一优选实施方案中， 选择性突变所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分，以便 获得目标特异性亲和水平，相对于当用噬菌体展示技术对相同抗原选 择抗体时获得的水平，所迷目标水平提高。在另一个优选实施方案中， 所述选择性突变的人IL-12抗体还保留了至少一个需要特性，例如保 留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性、保留表位识別、产生接近种 系免疫^求蛋白序列的抗体，在另一个实施方案中，本发明^:供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分：它结合人1L-12,并且根据表面胞质团共振测定，它以O.ls-1或0.1 s-1以下的K。ff速率常数(rateconstant)与人IL-12解离，或者它以 1 x 10^M或1 x K)-SM以下的IC5o抑制体夕卜植物凝集素母细胞增殖 测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖，更优选所迷分离的人抗 体或其抗原结合部分以l x 10々s"或l x 10々S"以下的Kofr速率常数 与人IL-12解离，或者以l x 10-?M或l x 10-?M以下的ICm抑制体 外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖.更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1 x 10-、"或l x lCT、"以下的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者以1 x 1()-8M或l x 10—8M以下的IC5o抑制体外PHA测定中的^i物凝集素母细胞增殖，更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1 x io4 s"或l x 104 s"以下的K。ff速率常数与人IL-12 解离，或者以1 x 1(r9M或l x io-9 M以下的IC5o抑制体外PHA测 定中的植物凝集素母细胞增殖.更优选所述分离的人抗体或其抗原结 合部分以i x 10-5 s-i或i x i0-5 s"以下的K。ff速率常数与人IL-12解 离，或者以1 x 10"。M或1 x 10—"M以下的IC5。抑制体外PHA测定 中的植物凝集素母细胞增殖，甚至更优选所迷分离的人抗体或其抗原 结合部分以1 x l(T5 ^或1 x l(T5 s-!以下的K^r速率常数与人IL-12 解离，或者以1 x 10-"M或l x I(T"M以下的IC5o抑制体外PHA测 定中的植物凝集素母细胞增殖。在另一个实施方案中，本发明"^供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它具有以下特性：a) 以1 x :i6^M或l x 10-6M以下的IC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ID NO: 1氨基餅列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的轻链CDR3 , 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重链CDR2;以及具有包含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离 的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 5氨基酸序列的重链 CDR1;以及具有包含SEQEDN0:6氨基酸序列的轻链CDR1 。在一 个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含 SEQ ID NO: 7氨基贿列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO: 8 氨基酸序列的轻链可变区，在另一个实施方案中，本发明拐l供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它具有以下特性：a) 以1 x 10力M或1 x 1(^M以下的IC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ID NO: 9氨基財列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQ ID NO: 10氨基酸序列的轻链CDR3 .在一个优选实施方案中 > 所述分离的人抗体或其抗原结合部分具 有包含SEQ ID NO: 11氨基餅列的重链CDR2 ;以及具有包含SEQ IDNO:12氨基酸序列的轻链CDR2。在一个优逸实施方案中，所述分 离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 13氨基it^列的. 重链CDR1 ;以及具有包含SEQ ID NO: 14氨基齡列的轻链CDRi 。 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体具有包含SEQ ID NO: 15 氨基酸净列的重链可变区；以及具有包含SEQIDNO: 16氨基酸序列 的轻链可变区，在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a) 以1 x 1Q力M或1 x 10—^M以下的rC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQBDNO: n氨基麟列的重链CDR3.,以及c) 具有包含SEQ ID NO: 18氨基酸序列的轻链CDR3 。 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 19氨基酸序列的重链CDR2 ;以及具有包含SEQ ID NO: 20氨基酸序列的轻链CDR2 ,在一个优选实施方案中，所述分 离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 21氨基齡列的 重链CDR1;以及具有包含SEQ ID NO: 22氨基酸序列的轻链CDR1 。 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包 含SEQ ID NO: 23氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO: 24氨基酸序列的轻链可变区.在一个优逸实施方案中，所述分离的人 抗体包含选自Kabat等论述的IgGl 、 IgG2、 IgG3 、 IgG4 、 IgM 、 IgA和IgE恒定区或者它们的任何等位基因变异体的重链恒定区(Kabat,E.A.,等(1991) S，e/3ces o/ iV她!力j: o/ /w,wo/鄉'o?/ /她m'〔第五 版>.美国人类健康服务部(U.S. Department of Heath and Human Services), NIH公告第91-3242号)，通过引用包括在本文中，在一个 更优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区是IgGl ,在另一个优选实 施方案中，所述分离的人抗体是Fab片段或F(ab，)2片段或羊链Fv片 段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a) 以l x 10-9M或l x 10'9M以下的IC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含选自SEQ ID NO: 404-SEQ ID NO: 469的氨基酸序列 的重链CDR3;以及c) 具有包含逸自SEQ ED NO: 534-SEQ ID NO: 579的氨基遏lf歹'j 的轻链CDR3 ,在一个优选实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分具 有包含逸自SEQ ID NO: 335-SEQ ID NO: 403的氨基齡列的重链 CDR2 ;以及具有包含选自SEQ ID NO: 506-SEQ ID NO: 533的氨基酸 序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其 抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO: 28S-SEQ ID NO: 334的氨基 断列的重链CDR1 ;以及具有包含选自SEQ ID NO: 470-SEQ ID NO: 505的氨基^^列的轻链CDR1 ,在一个优选实施方案中，所述分离 的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID NO: 23氨基酸序列的重链 可变区；以及包括含SEQE)NO: 24氨基酸序列的轻链可变区。在一 个优选实施方案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或 Fab片段或F(aV)2片段或单链Fv片段，在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a)以l x 10力M或i x 10力M以下的ICso抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ID NO: 25的氨基酸岸列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQ ID NO: 26的氨基断列的轻链CDR3 。 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 27的氨基齡列的重链CDR2;以及具有包含SEQ IDNO:2S的盡^基酸序列的轻链CDR2。在一个优选实施方案中，所述 分离,的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 29的氨基^ 列的重链CDR1;以及具有包含SEQ ID NO: 30的氨基酸岸列的轻链 CDH1 ,在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部 分具有包含SEQ ID NO: 31氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含 SEQ ID NO: 32氨基睃序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中， 所述分离的人抗休包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab，)2片 段或单链Fv片li。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a) 以1 x 1(^M或l x 1C^M以下的IC5。抑制体外PHA测定中 的才直物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 3氨基齡列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 5 M酸序列的重链 CDR1 ,或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取 代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQIDNO: 1 氨基贿列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重链CDR2 和含SEQ ED NO: 5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍以下；以 及c) 包括含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 4氨基蔣列的轻链CDR2和舍SEQ ID NO: 6氨基餅列的轻链 CDR1 ，或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取 代的突变体，其中所述突变体的k。fr速率较所迷包括含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的轻链CDR2 和含SEQIDNO:6氨基酸序列的轻链CDRl的抗体高IO倍以下。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a) 以l x 10-9]V[或l x 10-9M以下的IC5。抑制体外PHA测定中 的4直物凝集素母细j包增殖；—b) 包J会食SEQ ID NO: 9氨基財列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 〗1氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 13氨基酸序列的重链 CDR1 ,或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取 代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO: 9 氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQIDNO: 11氨基齡列的重链CDR2 和含SEQ ID NO: 13氨基酸序列的重链CDR1的抗体高IO倍以下；以 及c) 包括含SEQ ID NO: 10氨基断列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 12氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 14氨基酸序列的轻 链CDIU ,或者为其在接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸 取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO: 10氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 12氨基酸序列的轻链 CDR2和含SEQ ID NO: 14氨基酸序列的轻链CDR1的抗体高10倍以 下。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a) 以l x 10-9M或l x 10-9M以下的IC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQ ID NO: 17氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 19氨基齡列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 21氨基醋列的重 链CDR1，或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQBDNO: 17氨基麟列的重链CDR3 、含SEQ DD NO: 19 氨基,列的重链CDR2和舍SEQ ID NO: 21氨基贿列的重链CDR1 的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO: 18氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 20氨基酸序列的轻链CDR2和舍SEQ ID NO: 22氨基酸序列的轻 链CDRl,或者为其在优逸选择性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在一个或多个氨基酸取代的突变体,其中所迷突变体的k。ft、速率较所 述包括含SEQ ID NO: 1S氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 20 氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 22氨基^f-列的轻链CDR1 的抗体高IO倍以下。本发明还提供编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分 子， 一种优选的分离核酸编码包含SEQIDNO: 17氨基酸序列的重链 CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中， 所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO: 19氨基酸序列的抗体重链可变 区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQID NO: 21氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR1 。在另一个实施方案 中，所速分离的核酸编码包含SEQ ID NO: 23氨基酸序列的抗体重链 可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQIDNO: 18氨基酸序列的轻链CDR3 。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。 在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDNO: 20氨基 酸序列的抗体轻链可变区的CDR2,在另一个实施方案中，所述分离 的核酸编码包含SEQ ID NO: 22氨基酸序列的杬体轻链可变区的 CDR1,在另一个实施方案中，所迷分离的核酸编码包含SEQ IDNO: 24氨基^列的抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它：a)以l x 10力M或I x 10—9M以下的ICs。抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括舍SEQIDNO:25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO: 27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 29氨基酸序列的重 链CDRl,或者为其在优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所 迷包括含SEQ ID NO: 25氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO:—27 氨基財列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 29氨基醋列的重链CDR1 的抗体高10倍以下；以及c) 包括含SEQ ID NO: 26氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 28氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 30氨基酸序列的轻 链CDRl,或者为其在优选逸择性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所 述包括含SEQ ID NO: 26氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 28 氨基酸序列的轻链CDR2和舍SEQ ID NO: 30氨基醋列的轻链CDRl 的抗体高IO倍以下，一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO: 25氨基酸序列的重链 CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中， 所述分离的核酸编码包含犯Q ID NO: 27氨基酸序列的抗体重链可变 区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQE) NO: 29氨基酸序列的抗体重链可变区的CDRI 。在另一个实施方案 中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO: 31氨基^f列的抗体重链 可变区，在另一个实施方案中，所迷分离的核酸编码包含SEQIDNO: 26氨基酸序列的轻链CDR3 .所迷分离的核酸编码抗体轻链可变区， 在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQIDNO: 28氨基 酸序列的抗体轻链可变区的CDR2,在另一个实施方案中，所述分离 的核酸编码包含SEQ ID NO: 30氨基酸序列的抗体轻链可变区的 CDRI.在另一个实施方案中，所迷分离的核酸编码包含SEQIDNO: 32氨基*列的抗体轻链可变区，另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它 具有以下特性：a) 它结合人IL-i2,并且根据表面胞质团共振测定，它以（U s—1 或O.l s^以下的k。ff速率常数与人IL-12解离，或者它以l x 1(^M或1 x IC^M以下的IC5。抑制体夕卜植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定) 中的植物凝集素母细胞增殖。b) 具有包含选自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变 区> 其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优逸选才奪性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。c) 具有包含选自VU种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变 区，其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它具有以下特性：a) 它结合人IL-12,并且根据表面胞质团共振测定，它以0.is—1 或0.1s"以下的koff速率常数与人IL-12解离> 或者它以l x 10"lvl或1 x 10-SM以下的ICs(5抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定） 中的植物凝集素母细胞增殖，b) 具有包含选自SEQ ID NO: 595-667的氨基酸序列的重链可变 区，其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变.c) 具有包舍选自SEQ ID NO: 669-675的氨基酸序列的轻链可变 区，其中所迷轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选逸择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结. 合部分，它具有以下特性：a)它绪合人IL-12,并且根据表面胞质团共振测定，它以0Js" 或0.1s"以下的koff速率常数与人IL-i:2解离，或者它以l x 10^M或1 x 1一M以下的IC5Q抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定) 中的植物凝集素母细胞增殖。b) 具有包含COS-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优逸选择性诱变位点、接触 位点或超突变位点存在突变。c) 具有包含DPL8种系氨基贿列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位 点或超突变位点存在突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它具有以下特性：a) 它结合人IL-12,并且才艮据表面胞质园共振测定，它以O.l s" 或O.l s"以下的k。ff速率常数与人IL-12解离，或者它以l x 10"M或1 x 1(^M以下的IC5Q抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定） 中的植物凝集素母细胞增殖。b) 具有包含逸自VH3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变 区，其中所述重链可变区包含結构类似于其他VH3种系家族成员CDR2 的CDR2和结构类似于其他VH3种系家族成员CDR1的CDRl ,而且 其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优逸选择性诱变 位点、接触位点或超突变位点存在突变。c) 具有包含逸自V人l种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变 区，其中所述轻链可变区包含结构类似于其他VJU种系家族成员 CDR2的CDR2和结构类似于其他VW种系家族成员CDR1的CDR1, 而且其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变，在一个优选实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分的 重链CDR3存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体 或其抗原结合部分的轻链CDR3存在突变，在另一个实施方案中.，所 述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR2存在突变.在另一个优逸实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR2存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR1存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离 的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR1存在突变，另一方面，本发明提供带有本发明抗体编码核酸的重組表达载体 以及这种载体导入其中的宿主细胞，本发明还包括通过培养本发明的 宿主细胞制备本发明的抗体的方法。再一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原結合部分，它 中和人IL-U的活性和至少一种选自狒狒IL-12 、狨IL-12 、黑猩猩 IL-12 、弥猴(cynomolgus) IL-12和恒河猴IL-12的其他灵长类IL-12的 活性，但是它不中和小鼠EL-12的活性，再一方面，本发明提供包含本发明抗体或其抗原结合部分和药学 上可接受的载体的药用組合物。再一方面，本发明提供包含所述抗体或其抗原结合部分和其他药 物治疗药物的组合物。再一方面，本发明提供抑制人IL-12活性的方法，包括使人IL-12 与本发明的抗体如J695接触，从而抑制人IL-12活性，再一方面，本发明提供抑制罹患其中IL-12活性有害的疾病的病 人的人IL-12活性的方法，包括给予所迷病人本发明的抗体如J695 , 从而抑制所迷病人的人IL-12活性.所迷疾病可为例如节段性回肠炎、 多发性石更化或类风湿性关节炎。再一方面，本发明的特4正为政善抗体或其抗原结合部分的活性以 获得预定目标活性的方法，包括.a) 揭:供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 从H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H52、 H56 、 H58、 L30、 LM、 L32、 L50 、 L91 、 L92、 L93 、 L94逸择优选选择性 诱变位点。c) 分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选 择性诱变位点的突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；e) 逐步组合所迷亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分。f) 评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性。g) 如果步-慄d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使逸自H35、 H50、 H53 、 H54 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 L30A和L96的其他氨基 酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或 其抗原结合部分；h) 评价第二組突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自 H35、 H50、 H53、 H54 、 H95 、 H96、 H97 、 H兆、L30A和L96 的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗 体或其抗原结合部分；i) 逐步組合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性 的步骤g)的各个突变，形成組合抗体或其抗原结合部分；j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定組合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结 合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使逸自H33B 、 H52B 和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得第三組突变抗体或其抗原结合部分；1)评价笫三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自 H33B 、 H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目 标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部分；m)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活 性的步骤k)的各个突变，形成組合抗体或其抗原结合部分；n)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活 性的抗体或其抗原结合部分，另一方面，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方 法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 逸择用于突变的互补决定区（CDR)中的优逸选择性谤变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定逸定的优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点；c) 分别使所迷选定的优选逸择性诱变位点、接触位点或超吏变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；e) 对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d);f) 組合所迷亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g) 评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分，在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活 性的方法，包括：a) 提供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重組抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选逸择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点； C)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所迷抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；e) 对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d);f) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各 个突变，形成組合抗体或其抗原结合部分；以及g) 评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有?丈进活性的抗体或其抗原綍合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96 , 在另一个优选实施方案中，所錄突变位点逸自H30、 H31、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58 、 L30 、 L31 、 L32 、 L53和L93,在一 个更优选的实施方案中，逸择性诱变的残基选自优选选择性诱变位 点，它们选自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30 、 L31 、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94 。在一个更优选 的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94 ,在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；b) 逸择用于突变的互补决定区（CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c) 分别使所述逸定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少 一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要 4呆留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改 进活性和至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点逸自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H98、 H101、 L30、 L31 、 L32、 L34 、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94浮口 L96 , 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体，在另一个优逸实施方案中，所述超突变位点选 自H30、 H31、 H31B、 H32 、 H52 、 H56 、 H58 、 L30 、 L3】、 L32 、 L53和L93 ，而所迷其他特性逸自1)〗呆留与其他蛋白或人体组 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源 二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3) 产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中， 选择性诱变的残基选自优逸逸择性诱变位点，它们选自H30、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 L32、 L50、 L91、 L92、 L93、 L94,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或 人体組织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35 异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/ 或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体.在一个更优选的实施方案 中，所述接触位点选自L50和L94,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识另'J,即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结 合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 '活性的方法，包括：a) ^是供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重纽抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触拉点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一組突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少 一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特 性；直到获得相对于所迷亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和 至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f) 对至少一个其他优选选棒性诱变位点、接触位点或超突变位点 重复步骤a)至e);g) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成組合抗 体或其抗原结合部分；以及h) 评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原結合部分.在一个优逸实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L% , 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识別，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选 自H30、 H31 、 H31B、 H32 、 H52 、 H56 、 H58 、 L30 、 L3I 、 L32 、 L53和L93 ,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源 二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3) 产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体，在一个更优选的实施方案中， 逸4奪性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31 、 L32、 L50、 L91、 L92、 L93、 L94,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或 人体組织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识別p70p40/p35 异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/ 或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体.在一个更优选的实施方案 中，所述接触位点选自L50和L94,而所述其他特性选自1)保留与 其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识别 p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结 合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) ^供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的接触位点或超突变位 点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的接触位点或超突变位点突变为至少2个其 他氨基酸残基，由此获得一組突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬 菌体展示系统表达所述抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要 保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改 进活性和至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分，在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 IJ2、 L34、 L50、 L52、 JL53、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 JL94和L96, 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识別，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体，在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选 自H30、 H31、 H31B、 H32 、 H52、 H56 、 H58 、 L30 、 L31 、 L32 、 L53和L93 ,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組 织的非交L义应性，2)保留表位识别，即优逸识别p70p40/p35异源 二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3) 产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优逸的实施方案中， 选择性诱变的残基选自优选逸择性诱变位点，它们选自H30、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 U2、 L50、 L91、 L92、 L93、 L94,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或 人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别> 即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/ 或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案 中，所述接触位点选自L50和L94,而所述其他特性选自1)保留与 其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别 p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结 合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 —步提高；b) 逸择用于突变的互补决定区（CDR)中的优选逸择性诱变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其4也氨基酸残基，由此获得一組突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特 性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和 至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f) 对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点 重复步骤a)至e);g) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氛基酸残基，形成組合抗 体或其抗原结合部分；以及h)评价所述組合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97 、 H98、 H101、 L30、 131、 L32、 L34、 L50、 ）L52、乙53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94牙口 L96, 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应 性，2)保留表位识別，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体，在另一个优选实施方案中，所迷超突变位点选 自H30、 H31、 H31B、 H32 、 H52 、 H56 、 H58 、 L30 、 L3I 、 L32 、 L53和L93 ,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源 二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3) 产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中， 选择性诱变的残基逸自优选选择性诱变位点，它们选自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 L32、 L50、 L91、 L92、 L93、 L94,而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或 人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识别p70 p40/p35 异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/ 或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案 中，所述接触位点选自L50和L94,而所述其他特性逸自1)保留与 其他蛋白或人体組织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识別 p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结 合干犹，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) ^是供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 股A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34 、 L50、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分別使所述逸定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；.e)评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对亍所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉 反应性，2)保留表位识别，即优选识別p70p40/p35异源二泉体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H9S 、 HlOl、 L30、 L31、 L3-2、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选:泽用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一組突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d),所述CDR位点 既不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H9S、 HlOl、 L30、 L31 、 L32、 L34、 L50 、 L52、 L53 、 L55、 L91、 L92、 L93 、 L94和L96位点；i)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部 分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗 原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得結合部分，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活小生的方法，包才会：a) 摸:供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重組抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H5S 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91、 L92、 L93 、 L94以外的位点选^f用于突变的互补决定区(CDR)中的 氨基酸残基；c) 分別使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基 酸残基> 由此获得一组突变抗体或其抗原结^分，并以非噬菌体展 示系统表达所述抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此筌定增强活性的氨基酸残基；其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识別p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包才舌：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统 选择获得，但是其活性不能通过所迷噬菌体展示系统诱变进一步提 高；b) 在H30、 ffil、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52 、 H52A 、. H53 、 H54 、 H56 、 H5S 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 132、 L34、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分別^f吏所述选定位点突变为至少2个其卩也氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述 抗体系列；•d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基e) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d),所述CDR位点 既不是b)项选定的位点，也不是H30 、 H31 、 H31B 、 H32 、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、謂l、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55、 L91、 L92、 L93 、 L94位点；f) 組合所述亲.代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部 分；以及g)评^f介具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的 抗体或其抗原结合部分，所述其他特性优逸选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉 反应性，2)保留表位识别，即优逸识别p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包4舌：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H5S 、 H95 、 H96 、 H97 、 H9S 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50 、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；f) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e),所述CDR位点既 不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31 、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、咖、H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、.L32、 L34、 L50、 L52、 L53、L55、 L91、 L92、 L93 、 L94和L96位点；g) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性但不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成 组合抗体或其抗原结合部分；以及h) 评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗 原结合部分相对于所迷亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种 其他特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在另 一个实施方案中^本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 亲和力的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统 选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b) 在咖、H31、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50、 H52 、 H52A、 H53、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H9S 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34 、 L50、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选棒用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一組突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述 抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此筌定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H5S 、 H95 、 H96 、 H97 、鹏、 測l、 L30、 L31、 L32、 U4 、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述逸定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；.d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化；f) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e),所述CDR位点既 不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31 、 H31B 、 H32 、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96位点；g) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性但是不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成具有至少一种保留特性的組合抗体或其抗原结合部分；以及h) 评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗 原结合部分相对于所逸亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种 特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具 有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分，所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉 反应性'2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p3S异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合千扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性而不影响其他特性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分;b) 在H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34 、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点逸择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得 一 组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性并保留其他特性的抗体或其抗原 结合部分，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统 选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提 高；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H5S 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分別使所迷逸定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一組突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所迷抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d),所述CDR位点 既不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、咖、H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H兆、HlOl、 L30、 L31 、 L32、 L34、. L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96位点；i)組合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示改进 活性而且不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成組 合抗体或其抗原结合部分；以及g)评^"具有2个增强活性的氨基酸残基的所述組合抗体或其抗 原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种 其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。所逸其他特性优逸选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉 反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗休，附闺筒迷 '图1A-1B显示一系列结合人IL-12的人抗体的重链可变区的氨基 ^列与种系序列Cos-3/JH3和Dpl18 Lvl042的排列对比。Kabat编 码用来指示氨基酸位置.显示了 Joe 9野生型的全长序列。而其他抗 体，只显示了与Joe9野生型不同的氨基酸位点，图1C-1D显示一系列结合人IL-12的人抗体的轻链可变区的tt 睃净列的对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置*显示了 Joe9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位 点。图2A-2E显示通过定点诱变突变的Y61抗体的重链CDR位点和 各位点的相应氨基酸取代，图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实 心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较，图2F-2H显示通过定点诱变突变的Y61抗体^轻链CDR位点和 各位点的相应氨基酸取代。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实 心奈)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。图3证实人抗EL-12抗体J695对弥猴血浆新蝶呤水平的体内效力。图4显示用胶原免疫小鼠后不同天数的关节炎平均评分的曲线 闺，-沐实与用大鼠IgG治疗相比，用C17J5治疗显箸威轻关节炎相关 症状'发明详述为了更容易理解本发明，首先定义某些术语.术语"增强活性的氨基酸残基"包括增强所述抗体活性的氨基酸 残基。当然增强活性的氨基酸残基可取代接触位点、超突变位点或优 选逸择性诱变位点的氨基酸残基，进而在一个或多个CDR中可能存在 一个以上的增强活性的氨基酸残基，增强活性的氨基^^基包括增强 抗体的结合特异性/亲和性例如增强抗人IL-12抗体与人IL-12的結合 的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体例如抑制人 IL-12的人IL-12抗体的中和效价的氨基酸残基。术语"抗体》包括4个多肽链組成的免疫玉求蛋白分子，4个多肽 链是通过二硫键内部连接的2个重链(H)和2个轻链(H).重链由1个 重链可变区(本文简称为HCVR或VH)和1个重链恒定区组成，重链恒 定区由3个结构域CH1 、 CH2和CH3组成，轻链由1个轻链可变区(本 文简称为LCVR或VL)和1个轻链怛定区組成，轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可进一步分为超变区(称为互补决定区(CDR))和更保守区(称为枸架区(FR)》超变区位于构架区之间。各VH 和VL由3个CDR和4个FR組成，/人氨基末端至羧基末端的排列顺 序如下：FR1 、 CDR1 、 FR2 、 CDR2 、 FR3 、 CDR3 、 FR4 。术语抗体的"抗原结合部分"（或"抗体部分"）包括保持特异性 结合抗原(例如ML-12)—能力的抗体—片，殳，曾经证实抗体的抗原结合功能 可由全长抗体片^^完成，属于术语抗体的"抗原结合部分"的结合片 段实例包括(i) Fab片■R,它是由VL 、 VH 、 CL和CH 1结构域组成 的一价片段；问F(ab')2片段，它是包括通过铰链区的二硫键连接的2 个Fab片段的二价片段；（i!i) VH和CH1结构域组成的Fd片段；（iv)抗 体单臂VL和VH结构域组成的Fv片lfc (v) VH结构域构成的dAb片 段(Ward等，（1989) Atowe 341: 544-546);以及(vi)分离的互补决定区 (CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由独立的基因编 码> 但是它们可利用重組方法以合成接头连接在一起，合成接头使它 们能够制成其中VL和VH区成对形成一价分子的单一蛋白链(称为单 链Fv(scFv);参见例如Bird等(1诉8) Sc/e"ce 242: 423-426和Huston等 (1988)Ato/,』a^. 体细胞突变的氨基酸 被同源种系抗体序列的相应种系残基取代的过禾呈。本发明的人抗体的 重链序列和轻链序列分別与VBASE数据库中的种系序列对比，鉴定 具有最高同源性的序列。使本发明的人抗体的差异通过突变编码该不 同氨基酸的确定核苷酸位置而恢复为种系序列，研究由此鉴定为回复 突变的候选对象的各氨基酸的作用是直接还是间接影响抗原结合，而 突变后发现影响所述人抗体任何需要特性的任^可氨基酸不纳入最终的 人抗体；例如逸择性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不进行回复突 变.为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不 同、但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是对 于所迷氨基酸两侧至少10个、优选12个氨基酸，第二种种系序列与 本发明人抗体的序列相同而且共线性。可在优化抗体的任何阶段进行 回复突变；但是优选正好在选择性诱变方法之前或之后进行回复突 变。更优选正好在选择性诱变方法之前进行回复突变.本文使用的术语"人白细胞介素IL-12 ，，（本文简称为WL-12或 IL-12)包括主要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人细胞因子.该术语包括 一种异源二聚体蛋白，该蛋白包含通过二硫键将二者结合在一起的35 kD亚单位(p35)和40 kD亚单位(p40)。所述异源二聚体蛋白称为"p70 亚单位"，例如以下文献进一步介绍了人EL-12的结构：Kobayashi 等(19S9)丄五xpil^d 170: 827-845; Seder等(1993) Pwa W加/.爿o^. Sc!'. 90: 10188-10192; Ling等(l995) «/. Sep Md 154: 116-U7; Podlaski等 (1992) Zra^.说印/y^. 294: 230-237 .术语人EL-12包括重组人IL-12 (rh IL-12),它可利用标准重組表达方法制得。术语"Kabat编码"、"Kabat定义"和"Kabat标记"在本文 中交互使用，本领域公知的这些术语是指编码比抗体或其抗原结合部 分的重链可变区和轻链可变区的其他氨基酸残基更易变(即超变)的氨 基酸残基的系统(Kabat等(1971) Z朋.JcW. 還：3S2-391和 Kabat, E.A.等(1991) Segwewce 0//Vofe/"s o//mmwwo/og/o?/ /"fe/"UW,第 五版，美国人类健康^^务部，NIH公告第91-3242号)。对于重链可变 区而言，超变区为CDR1的第31-35位氨基酸、CDR2的第50-65位 氨基酸和CDR3的第95-102位氨基酸。对于轻链可变区而言，超变区 为CDR1的第24-34位氨基酸、CDR2的第50-56位氨基酸和CDR3 的第89-97位氨基酸。Kabat编码在本文中用来指示对本发明抗体进行修饰的氨基酸位 置《例如可使Y61抗IL-12抗体重链CDRi位置31的丝氨酸(S)突变 为谷氨酸(E) (H31S—E),或者可4吏轻链CDR3位置94的甘氨酸(G)突 变为酪氨酸(Y) (L94G卄Y)。术语"人抗体"包括具有相当于Kabat等介绍的人种系免疫球蛋 白序列的可变区和恒定区的抗体(参见Kabat等(19W)化^e"cas" o/ 尸尸o。/7w/?ra加/og!'^/ /"fere对，第五版> 美国人类健康月l务部，NIH 公告第91-3242号)。本发明的人抗体可包含例如不是由CDR(尤其是 CDR3)的人种系免疫球蛋白序列(例如体外随机诱变或定点诱变或体 内体细胞突变导入的突变)编码的氨基酸残基，优逸用本文介绍的"选 择性诱变方法"导入所述突变.所述人抗体可具有至少一个被氨基酸 残基例如由非人种系免疫球蛋白序列编码的增强活性的氨基酸残tt 代的位点。所^抗体可具有高达20个被不是人种系免疫球蛋白序列 組成部分的氨基酸残基取代的位点》在其他实施方案中，取代最高达 10个、最高达5个、最高达3个或最多2个位点。在一个优选实施方 案中，这些取代位于以下更详细介绍的CDR区.然而，本文使用的术 语"人抗体"不包括其中另一种哺乳动钩(例如小鼠)种系来源的CDR序列移植到人构架序列上的抗体。术语"重組人抗体"包括通过重组方法制备、表达、产生或分离 的人抗体，例如利用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以 下部分II中进一步介绍)、从重組组合人抗体文库分离的抗体(在以下 部分III中进一步介绍)、从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如(Taylor, L.D.等(1992) Wwc/: Jc/必7fey. 20: 62S7-6295)或者涉XA免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其 他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有人种 系免疫球蛋白序列来源的可变区和恒定区(参见Kabat， E.A,等(1991) Se《wewce iVofe/w o//www"o/og/c"/ /Wei^st, 第五版，美国人类健康 服务部，NIH公告第91-3242号)。然而，在某些实施方案中，使这样 的重组人抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基园动物时，进 行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基#列可 能不是体内人抗体种系所有组成成分中天然存在的序列，尽管所述序 列得自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列有关。但是， 在某些实施方案中，这样的重组抗体得自选择性诱变方法或回复突变 或这两种方法。"分离抗体"包括基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗 体(例如基本不含特异性结合非ML-12抗原的抗体、特异性结合hlL-12 的分离抗体)。特异性结合ML-12的分离抗体可结合其他物种的IL-12 分子（下文更详细讨论)。此外，分离抗体可基本不含其他细胞物质和/ 或化学物质."中和抗体"（或"中和wl-12活性的抗体"）包括其与hlL-12的 结合抑制ml-12的生物活性的抗体。这种对ml-12生物活性的抑制作 用可通过检测ML-12生物活性的一个或多个指标评价，所述指标例如 为对植物凝集素母细胞增殖测定(PHA)中的人植物凝集素母细胞增殖 的抑制作用，或对人IL-12受体结合测定中的受体结合的抑制作用(参 见实施例3-y干扰素诱导测定》这些wl-12生物活性指标可通过本领域已知的若干标准体外或体内测定中的 一个或多个测定评价(参见实 施例3),术语"活性"包括各种活性，例如抗体对抗原的结合特异性/亲和性如结合IL-12抗原的抗ML-12抗体；和/或抗体的中和效价如其与 hIL_12的结合抑制hIL-12的生物活性的抗ML-12抗体> 例如对PHA 母细胞增殖的抑制作用或对人IL-12受体结合测定中的受体结合的抑 制作用（参见实施例3).术语"表面胞质团共振"包括例如采用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway， NJ)通过4全测生物传感 器基体(matrix)中的蛋白浓度改变而可分析实时生物特异性作用的光 学现象，关于其进一步的介绍参见实施例5和Jonsson, U.等（1993)爿朋， 舰51: 19-26; Jonsson， U.等（1991)祝她由,'拜11: 620-627; Johnsson, B.等(1995)丄A/o/. Z?ecogm'f. 8:125-131和Johmson, B.等(1991) ^w/.说oc力e肌198: 268-277 。本文使用的术语"K。ff>5是用以指抗体与抗体/抗原复合物解离的 解离速率常数(off rate constant),本文使用的术语"Kd"是指一种具体抗体抗原相互作用的.解离 常数(dissociation constant).术语"核酸分子"包括DNA分子和RNA分子.核酸分子可以是 单链核酸或双链核酸，但是优选为双链DNA 。关于编码结合EL-12的抗体(包括"分离抗体"）或抗体部分(例如 VH、 VL、 CDR3)的核酸，本文使用的术语"分离核酸分子"包括其 中编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其他编码结合非ML-12 抗原的抗体或抗体部分的核苷^列的核酸分子，所迷其他序列可能 天然邻接人类基因组DNA中的所述核酸，因此，例如编码抗IL-12抗 体的VH区的本发明分离核酸不含其他编码结合非IL-12抗原的其他 VH区的序列.术语"分离核酸分子"还包括编码双价、双特异性抗 体的序列，所述双价双特异性抗体例如为双体分子，其中VH和VL区不含其他非所述双体分子序列。术语"载体"包括能够转运与其连接的另一个核酸分子的核酸分 子。 一种类型的载体是"质粒"，质粒是额外DNA节段可连接入其中的环形双链DNA环。另一类载体是病毒载体，在病毒载体中额外DNA 节段可连接入病毒基因組中，某些载体能够在其导入的宿主细胞中自 主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。 其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞时整合入宿 主细胞的基因組中，因此与宿主基因組一起复制.此外，某些载体能 够控制与其有效连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为"重组 表达栽体"（或者筒称为"表达载体" > 一般来说，重组DNA技术中 应用的表达载体通常为质粒形式，在本说明书中，"质粒"和"载体" 可交互使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括同类 的其他形式表达载体，例如具有同等功能的病毒载体(例如复制缺陷型 反转录病毒、赠—病毒和A良伴随病毒)。术语"重組宿主细胞"（或简称为"宿主细胞"）包括重组表达载 体已经导入其中的细胞.当然这类术语不仅指具体对象的细胞，而且 也指这种细胞的子代细胞。因为突变或环境的影响连续传代时可能发 生某些改变，所以这样的子代细胞可能事实上与亲代细胞不完全相 同，但是仍然包括在本文使用的术语"宿主细J包"范畴内。本文使用的术语"改变"是指抗体或其抗原结合部分中的一个或 多个氨基酸的改变，可通过在一个或多个位点添加、取代或缺失氨基 酸而产生这样的改变。应用已知技术如PCR诱变可引起所迷变化，术语"接触位点"包括抗体重链可变区或轻链可变区的CDR1 、 CDR2或COR3中的氨基酸位点，这些位点被以26种已知抗体抗原结 构之一接触抗原的氨基酸占据，如果CDR氨基酸以26种已知抗体抗 原复合物结构中的任一种接触所述抗原，则可认为该氨基酸占据了接 触位点.与非接触位点相比，接触位点被接触抗原的氨基酸占据的可 能性更高，接触位点最好为含有以26种结构中的3种以上结构(>11.5%)接触抗原的氨基酸的CDR位点。接触位点最优选为含有以25种结构中的8种以上结构(>32%)接触抗原的氨基酸的CDR位点。术语"超突变位点"包含占椐抗体重链可变区或轻链可变区的 CDR1 、 CDR2或CDR3区中的位点的氨基酸残基，这些残基被认为 在所述抗体的体内亲和力成熟过程中体细胞超突变的频率或概率高，"体细胞超突变的高频率或高概率"包括所迷残基在所述抗体的体内 亲和力成熟过程中发生体细胞超突变的5-约40%机会的频率或概率。 当然在该规定范围的所有范围值也是本发明的一部分，例如5-约 30%、 5-约15%、 15-30约％。术语"优选选择性诱变位点"包括占据重链可变区或轻链可变区 的CDR1 、 CDR2或CDR3区的位点的氨基酸残基，可认为优选选择 性诱变位点既可是接触位点又可是超突变位点，术语"选才,性诱变方法"包括通过选4奪和单独突变在至少一个优 逸选择性诱变位点、超突变位点和/或接触位点的CDR氨基酸而改进 抗体活性的方法。"逸择性诱变的"人抗体为含有应用选择性诱变方 法在所选定位点产生的突变的抗体。在另一个实施方案中，所述选择 性诱变方法用来提供优逸突变抗体重链可变区的CDR1 、 CDH2或-GDR3 (此后分别称为Hl 、 H2和H3)或轻链可变区的CDR1 、 CDR2 或CDR3 (此后分别称为Ll 、 L2和L3)的各选定氨基酸残基的方法. 氨基酸残基可选自优选选才奪性诱变位点、接触位点或超突变位点。根 椐各个氨基酸在轻链可变区或重链可变区的位置选择各个氨基酸，当 然超突变位点也可以是接触位点。在一个实施方案中，逸才李性诱变方 法是"l巴向方法"。表迷"靶向方法"包括以靼向方式优选突变抗体 重链可变区的CDR1 、 CDR2或CDR3或者轻链可变区的CDR1 、 CDR2或CDR3的各个选定氨基酸残基的方法，例如"逐组靶向方法 (Group-wise targeted approach)"或"逐个CDR ,巴向方、法(CDR-wise targeted approach)",在"逐组耙向方法，》中，针对具体各組的各氨基 酸残基进行逸择性突变，包括组I (包括L3和H3)、組H(包括H2和Li)和組m(包括u和m),所列各组的顺序为优选靼向顺序，在"逐 个CDR扭向方法"中，以以下优选乾向顺序针对各CDR的各个氨基 酸残基进行选4奪性突变：H3 、 L3 、 H2 、 Ll 、 Hl和L2 ,使逸定 的氨基酸残基突变为例如至少2个其他氨基酸残基，并测定突变对抗 体活性的影响。以抗体的结合特异性/亲和性和/或抗体的中和效价的变 化检测活性。当然，选择性诱变方法可用来优化任何来源的任何抗体， 包括噬菌体展示、人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞分离的 人抗体。选择性诱变方法优选用于不能用噬菌体展示技术进一步优化 的抗体。应该指出的是，任何来源包括噬菌体展示、人IgG种系基因 的转基因动物、从人B细胞分离的人抗体的各种抗体可在选择性诱变 方法之前或之后进行回复突变。术语"增强活性的氨基酸残基"包括增强抗体活性的氨基酸残 基。当然增强活性的氨基酸残基可取代优选选择性诱变位点、接触位 点或超突变位点的氨基酸残基，进而在一个或多个CDR中可能存在1 个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基包括增强抗 体(例如结合人IL-12的抗人IL-12抗体)的结合特异性/亲和性的氨基酸 残基.增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体中和效价的氨基酸残 基> 所述抗体例如为抑制人IL-12的人IL-12抗体。本发明各方面在以下各小节中更详细地介绍。I.结合人IL-12的人抗体本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分。本发 明的人抗体优选为重組中和性人抗hlL-I2抗体。例如通过用实施例1 所述的噬菌体展示技术筛选ML-12的一个或多个人VL和VHcDNA文 库，从而可选择结合人IL-12的本发明抗体。最初筛选人Vl和VhcDNA 文库鉴定了一系列的抗IL-12抗体，其中一种本文称为"Joe 9"(或 "Joe 9野生型"），选定其用于进一步研制。Joe 9是一种亲和力较低 的人IL-12抗体(例如Koff约0.1 sec"),但它仍可用于特异性结合和检测ML-12。可如下提高Joe9抗体的亲和力：对重链CDR和轻链CDR 进行诱变，产生一組"混合及匹配"而且可进一步突变的轻链可变区 和重链可变区序列，最终获得对UL-12的亲和力增强的无数其他抗 WL-12抗体(参见实施例1 、表2 (见附件A)和图1A-D的序列对比》

在这些抗体中，在本文中称为Y61的人抗ML-12抗体证实，结合 亲和力显著改善(例如K。(Y约2 x 10"4 sec'1)。选择Y61抗ML-12抗休 通过分别突变重链CDR和轻链CDR中的具体氨基酸残基进一步成熟 亲和力，根据占据优选选4奪性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的 氨基酸残基逸择用于位点特异性突变(选择性诱变方法)的Y61的氨基 酸残基。关于重链CDR和轻链CDR选定位点的取代的总结见图SASH 。本文称为 J695的本发明优选重组中和抗体产生于Y61轻链CDR2 位置50的Gly取代为Tyr以及Y61轻链CDR3位置94的Gly取代为 Tyr.

关于Joe 9野生型至J695谱系(lineage)的一組本发明抗IL-12抗体 的重链可变区和轻链可变区'氨基酸序列对比示于图1A-1D。关于Joe9 至J695镨系，这些序列的对比可备定结合ML-12的本发明抗体的优选 重链可变区和轻链可变区的共有序列以及CDR3 、 CDS2和CDR1的 共有序列。此外，总结于图2A-2H的Y61诱变分析对于包含修饰Y6I 但仍然保持良好hIL-12结合特性的序列的Y61至J695谱系，可鉴定 结合hlL-12的重链可变区和轻链可变区的共有序列以及结合hlL42的 CDR3、 CDR2和CDR1共有序列。在后附的序列表中以鉴定序列鉴 定的本发明优选CDR 、 VH.和VL序列（包括共有序列）总结如下。

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以测定Kd速率和K。ff速率的表面胞质团共振分析功能性表征Joe 9野生型亲和力成熟产生的抗体，获得了一系列K。ff速率在以下范围内 的抗体：约0.1s"至约I x 10-5 s-、更优逸Koff约1 x s"至约1 x l()-5 s"或l x 10-53-1以下。如实施例3所述，还体外表征了抗体抑 制植物凝集素(PHA)母细胞增殖的能力。获得了一系列IC化值在以下 范闺内的抗体：约1 x 10《M至约1 x lCr" M、更优选约1 x 10—1C)M 至l x 1(T"M或更低，

因此，在一个方面，本发明提供这样的分离人抗体或其抗原结合 部分：结合人IL-12并以0.1 s"或以0.1 s-1以下的表面胞质团共振测定的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者它以l x l(T6 M或l x 10-6 M 以下的ICsQ抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)的植物凝 集素母细胞增殖，在优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗 原结合部分以l x 10-2 s"或l x 10—2s"以下的K。ff速率常数与人IL-12 解离，或者以l x 1CT?M或1 x 10"M以下的IC5。抑制体外PHA测定 的植物凝集素母细胞增殖，在更优选的实施方案中，分离的人IL-12 抗体或其抗原結合部分以l x 1(^s"或l x 1(^s"以下的K。ff速率常 数与人IL-i2解离，或者以1 x 10"M或1 x 10—SM以下的IC5o抑制 体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖，在更优选的实施方案中，分 离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1 x io4 s"或1 x io4 s-i以下 的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者以l x 10力M或1 x 1(^M以下 的ICw抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施 方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以I x 10-5 s-i或i x l(T5 s"以下的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者以1 x 10-WM或l x 10_1Q M以下的ICso抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。 在甚至更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分

以l x 10—5 S"或l x 10-5 S—1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或

者以1 x 10-"M或l x 1CT"M以下的IC5o抑制体外PHA测定的植物 凝集素母细胞增殖，

可用表面胞质团共振测定IL-12抗体的解离速率常数(K。ff)(参见实 施例5)。 一般来说，表面胞质团共振分析应用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)通ii^面胞质团共振(SPR)检测配体（固定在 生物传感器基休上的重组人EL-12)和分析物(抗体溶液)之间的实时结 合作用，也可以通过固定分析物(生物传感器基体上的抗体)而提供配 体(重组EL-12溶液)进行表面胞质团共振，可用若干合适体外测定中的 一种或多种测定评价IL-12抗体或其抗原结合部分的中和活性(参见实 施例3)。

本领域众所周知，抗体重链CDR和抗体轻链CDR在抗体与抗原的结合特异性/亲和性中起重要作用，因此本发明包括具有Joe 9的轻 链CDR和重链CDR的人抗体以及具有经修饰增强抗体的结合特异性/ 亲和性的CDR的其他抗体。如实施例1所证实，对所述轻链CDR和 重链CDR的一系列修饰可使人抗hIL-12抗体的亲和力成熟。结合人 • IL-12的Joe 9野生型至J695的人抗体系列的重链和轻链可变区的氨基 酸序列对比见图1A-1D。根据序列对比(见上表的总结)确定抗体CDR 的共有序列基序。例如Joe 9至J695谱系的VHCDR3的共有基序包含 氨基齡列：（H/S)-G-S-(HZY)-D-(N/T/Y)(SEQIDNO: 1)，该氨基齡 列包含SEQ ID NO: 7所示共有HCVR的位置95-102的氨基酸。VL CDR3的共有基序包含氨基酸序列：Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R7K)-

(SEQ ID NO: 2)，该氨基酸序列包含SEQ ID NO: 8所示共有LCVR的 位置S9-97的氨基酸。

因此，另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部 分，它具有以下特性：

a) 以1 x 10—^M或1 x 1CT6M以下的ICso抑制体外PHA测定中 的才直物凝集素母细胞增殖；

b) 具有包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的重链CDR3 ;以及

c) 具有包含SEQ ID NO: 2氨基,列的轻链CDR3 。

在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列：F小R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3)(它包括含氨基財 列SEQ ID NO: 7的共有HCVR的位置50-65的氨基酸)的VHCDH2以 及还包括含氨基,列：（G/Y)-N-(D/S>(Q/N>R-P-S (SEQ ID NO: 4) (它包括含氨基齡列SEQ ID NO: S.的共有LCVR的位置50-56的氨 基酸)的VL CDR2 。

在另一个优选卖施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列：F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5)(它包括含氨基齡列SEQ ID NO: 7的共有HCVR的位置27-35的4&酸)的VH CDR1以及还包括含氨基酸序列：（S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/YXT/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO: S的共有 LCVR的位置24-34的氨基酸)的VL CDR1 。在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQ ID NO: 7 氨基麟列的HCVR和含SEQ ID NO: 8氨基酸序列的LCVR 。根椐对产生J695抗体的Y61进行的突史分析可确定其他共有基 序(总结于图2A-2H)。如图2A-2H所示的条形图所证实，Y61的貧链 和轻链CDR的某些残基可取代而不会显著减弱所述抗体的hIL-12结 合特性，例如以12个不同氨基酸残基对CDR HI的位置30的各个取 代不会.显著降低所述抗体的K。ff速率，说明该位置可用各种不同g 酸残基取代，因此根据突变分析(即可用其他氨基酸残基取代的Y61 中的位置)，确定共有差^序。重链和轻链CDR3的共有基岸分别示于 SEQ ID NO: 9和10 ,重链和轻链CDR2的共有基序分別示于SEQ ID NO: 11和12,而重链和轻链CDR1的共有基序分別示于SEQ ID NO: 13 和14 , VH和VL区的共有差—序分別示于SEQ ID NO: 15和16 。因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗 原结合部分，它具有以下特性：a) 以l x 10-9m或1 x lCf9M以下的ICso抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ID NO: 9氨基酸序列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQ ID NO: 10氨基酸序列的轻链CDR3 。 在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQIDNO: 11氨基睃净列的VH CDR2以及还包括含SEQ ID NO: 12氨基酸序列的VL CDR2。在另一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQIDNO: 13氨 基酸序列的VHCDRl以及还包括含SEQ ID NO: 14氨基酸序列的VL CDRJ 。在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQIDNO: 15氨基蔣列的HCVR和含SEQ ID NO: 16氨基餅列的LCVR 。本发明的一种优选抗体是人抗ML-12抗体Y61 ,它是通过PCR 诱变CDR3使Joe 9野生型的亲和力成熟而制得(如实施例1所迷)。根 据表面胞质团共振和体外中和测定，Y61的特异性/结合亲和性改 善.Y61的重链和轻链CDR3分别示于SEQ ID N〇：17和18 , Y6i 的重链和轻链CDR2分别示于SEQIDNO: 19和20 ,而Y61的重链和 轻链CDR1分別示于SEQ ID NO: 21和22 。 Y61的VH具有SEQ ID NO: 23的氨基酸序列，而Y61的VL具有SEQ ID NO: 24的氨基酸序 列（这些序列也示于闺1A-1D,与Joe9对比)。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它： -a) 以l x 10-9m或1 x 10-9m以下的ICso抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ID NO: 17氨基酸序列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQ ID NO: 18氨基酸序列的轻链CDR3 , 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQIDNO: 19氨基断列的重链CDR2 ,以及具有包含SEQ ID NO: 20氨基酸序列的轻链CDR2 .在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分 具有包含SEQIDNO: 21氨基酸序列的重链CDR1,以及具有包含SEQ ID NO: 22氨基酸序列的轻链CDR1 。在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具 有包含SEQ ID NO: 23氨基財列的重链可变区，以及具有包含SEQ ID NO: 24氨基^列的轻链可变区，在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同 种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat， E,A.，等(1991) 5fe《wenc" o/ _P7^e/mo//m7m^o/og/ca//Wem^，第五版，美国人类健康服务部> NIH公告第91-3242号)„所述抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区。 或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab、)片^^或单链Fv片段。对Y61各个残基的修饰产生一批图2A-2H所示的抗体，以表面胞 质团共振和/或体外中和测定测定各抗体的特异性/结合亲和性，因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它：a) 以1 x 1C)-9M或1 x 10—9M以下的IC5。抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含选自SEQ ID NO: 404-SEQ ID NO: 469的氨基酸序列 的重链CDR3;以及c) 具有包含选自SEQ ID NO: 534-SEQ ID NO: 579的氨基酸序列 的轻链CDR3 ,在一个优逸实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原結合部分具 有包含选自SEQ ID NO: 335-SEQ ID NO: 403的氨基断列的重链 CDR2;以及具有包含选自SEQ ID NO: 506-SEQ ID NO: 533的氨基酸 序列的轻链CDR2。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原結合部分 具有包含逸自SEQ ID NO: 2S8-SEQ ID NO: 334的氨基酸序列的重链 CDR1 ;以及具有包含选自SEQ ID NO: 470-SEQ ID NO: 505的氨基酸 序列的轻链CDR1 ,在再一优逸实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包 括含SEQ ID NO: 23氨基酸序列的重链可变区以及含SEQ ID NO: 24 氨基^列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl 、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同 种异型变异体，正如Katb站所论述(Kabat, E.A.，等(1"1) S^we"e" o/ 0/7加附w加/og/e"〃"&ms/，第五版，美国人类健JJ良务部，N1H 公告第91-3242号)。所逸抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区.或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab》片段或单链Fv片段。本发明的一种特別优逸的重組中和抗体J695是通过对抗体Y61 的接触和超突变氨基酸残基进行定点诱变而制得(参见实施例2和以下 部分III)。 J695与Y61的不同之处在于：Y61轻链CDR2位置50的 Gly取代为Tyr以及Y61轻链CDR3位置94的Gly取代为Tyr, J695 的重链和轻链CDR3分別示于SEQ ID NO: 25和26 , J695的重链和 轻链CDR2分别示于SEQ ID NO: 27和28 >而J695的重链和轻链CDRl 分别示于SEQ ID NO: 29和30. J695的VH具有SEQ ID NO: 31的氨 基酸序列，而J695的VL具有SEQ ID NO: 32的氨基酸序列（这些序列 也示于固〗A-1D ,与Joe9对比>因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它：a) 以l x l(T9 M或l x 10力M以下的IC5Q抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 具有包含SEQ ED NO: 25的氨基贿列的重链CDR3 ;以及c) 具有包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的轻链CDR3。 在一个优选实施方聿中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的重链CDR2,以及具有包含SEQ ID NO: 28的氨基^列的轻链CDR2 。在另一个优选实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分 具有包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的重链CDRl,以及具有包含 SEQ ID NO: 30的氨基齡列的轻链CDRl 。在再一优选实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分具 有包含SEQ ID NO: 31氨基酸序列的重链可变区 > 以及具有包含SEQ ID NO: 32氨基*列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同 种异型变异体，正如Katbat所论迷(Kabat, E.A.,等(1991) S巧"e"c^ o/o//mm,o/ogz'c"//"tem^,第五版，美国人类健康服务部> NIH 公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区。 或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab，2)片段或单链Fv片段。可使Joe 9至J695的镨系抗体或Y61至J695的谱系抗体的 CDR3、 CDR2和CDR1的优选共有序列产生其他突变，以获得本发 明的其他抗IL-12抗体。可应用标准分子生物学技术，例如PCR诱变， 针对轻链和/或重链CDR的各个3妻触氨基酸残基或超突变氨基酸残基 进行这样的修饰方法，然后如本文所述对修饰抗体进行动力学和功能 分析(例如实施例3所述的中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它：a) 以l x 10-6^或1 x 10'6M以下的ICsQ抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 5氨基酸序列的重链 CDR1 ,或者为其在优逸选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多 个氨基酸取代的突变体,其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO: i氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重 链CDR2和含SEQ ID NO: 5氨基酸序列的重链CDR1的抗体高10倍 以下；以及c) 包括含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 4氨基齡列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 6氨基酸序列的轻链 CDR1 ,或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多 个氨基酸取代的突变体,其中所述突变体的k^r速率较所述包括含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的轻 链CDR2和含SEQ ID NO: 6氨基,列的轻链CDRI的抗体高10倍 以下。另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分> 它：a) 以1 x 10力M或1 x 10力M以下的ICso抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQ ID NO: 9氨基麟列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 11氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 13氨基財列的重链 CDRl ,或者为其在优选逸择性谦变位点、接触位点或超突变位点存 在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述 包括含SEQ ID NO: 9氨基酸序列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 11氨 基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 13氨基酸序列的重链CDRl 的抗体高10倍以下；以及c) 包括含SEQ ID NO: 10氨基醋列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 12氨基§^列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 14氨基麟列的轻 链CDRl,或者为其在优选选捧性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在一个或多个氨基酸取代的突变体,其中所迷突变体的k。ff速率较所 述包括含SEQ ID NO: 10氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: U 氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 14氨基酸序列的轻链CDRl 的抗体高IO倍以下。一般技术人员还知道，可对本发明抗体例如Y61或J695的CDR 区进行其他突变，以获得本发明的其他抗IL-12抗体，如上所述，可 用标准分子生物学技术进行这样的修饰方法。分別如实施例3和5所 述，可对修饰抗体进行功能和动力学分析.对Y61各个残基进行达到 与J695相同的修饰示于图2A-2H,见实施例2介绍，因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它：a) 以l x 10》M或l x 1(^M以下的IC5o抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQ ID NO: 17氨基齡列的重链CDH3 、含SEQ ID NO: 19氨基耕列的重链CDR2和含SEQEDNO:21氨基醋列的重链CDRi ,或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或 多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO: 17氨基財列的重链CDR3 、含SEQ ID NO: 19氨基酸序 列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 21氨基酸序列的重链CDR1的抗体 高10倍以下；以及c)包括含SEQIDNO: 18氨基g饼列的轻链CDR3、含SEQ ID NO: 20氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 22氨基酸序列的轻 链CDH1 ,或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或 多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含 SEQ ID NO: 18氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 20氨基醋 列的轻链CDR2和含SEQ H) NO: 2》氨基断列的轻链CDR1的抗体 高IO倍以下.另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部 分，它：a) 以l x 10-9M或l x 10-9M以下的ICso抑制体外PHA测定中 的植物凝集素母细胞增殖；b) 包括含SEQIDNO: 25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO: 27氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO: 29氨基酸序列的重 链CDR1 ,或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含SEQ ID NO: 25氨基財列的重链CDR3 、含SBQ ID NO: 27氨基齡 列的重链CDR2和舍SEQ ID NO: 29氨基酸序列的重链CDR1的抗体 高10倍以下；以及c) 包括含SEQ ID NO: 26氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ED NO: 28氨基贿列的轻链CDR2和含SEQ ID NO: 30氨基酸序列的轻 链CDR1 >或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或 多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的koff速率较所述包括含 SEQ ID NO: 26氨基酸序列的轻链CDR3 、含SEQ ID NO: 28氨基贿列的轻链CDR2和含SEQIDNO: 30氨基酸序列的轻链CDR1的抗体 高IO倍以下。在再一实施方案中，本发明提供分离的人抗体或其抗原结合部 分，它中和人IL-12活性以及中和至少一种选自以下的其他灵长类 IL-32活性：狒狒IL-12、狨EL-12、黑猩猩IL-12、弥猴IL-12和恒河 猴IL-12,但其不中和小鼠IL-12活性。II.选择重组人抗体可通过筛选重组组合抗体文库、优选scFv逸菌体展示文库分离获 得本发明的重组人抗体，所述文库用从得自人淋巴细胞的mRNA制备 的人VL和VHcDNA制得，制备和筛逸这样的文库的方法学是本领域 已知的.除了市售用于制备噬菌体展示文库的试剂盒(例如Pharmacia Zteeom6irt加i^(3ge爿打"'6ofi^ System ,目录号27-9400-01;以及Stratagene Sz^24PTM噬菌体展示试剤盒，目录号240612)之外，具体适用于制备 和筛选抗体展示文库的方法和试剂实例可参见例如Kang等的PCT公 布号WO 92/18619; Winter等的PCT公布号WO 92/20791; Bre池ng等 的PCT公布号WO 93/01288 ; McCafferty等的PCT公布号WO 92/01047 ; Garrard等的PCT公布号WO 92/09690 ; Fuchs等(1991) 历o/redwo/ogy 2:1370-1372 ; Hay等(1992) //ywWoww 2: 81-85; Huse等(19S9) 逃：1275-1281; McCafferty等，Ato"M (1990)逃：552-554 ; Griffiths等(l993) J12: 725-734 ;Hawkins等(1992) / Afo/及o/逃：; Clackson等(1991) A^we 352: 624-628 ; Gram等(1992) iWAS巡：3576-3580 ; Garrad等(1991) 说o/Tec/7加/og)/ 2: 1373-1377 ; Hoogenboom等(l 991) Wwc A" H: 4133-4137和Barbas等(1991)iWAS:赵:7978-7982 。用于该方法的抗体文库优选为用人VL和VH cDNA制备的scFv 文库。优选用重組人IL-12作为抗原筛选scFv抗体文库，以逸择具有 对IL-12的结合活性的人重链和轻链序列.为了逸择对IL42的p35亚单位或p70异源二聚体特异性的抗体，在存在过量游离P40亚单位情况下进^f亍筛选测定。例如应用实施例1所迷的micro-Friguet滴定法可 确定亚单位优选抗体，在选定初始的人VL和VH节段后，进行其中筛逸不同成对的选 定VL和VH节段的IL-12结合的"混合和匹配"实验以逸择优选VL/VH 对組合(参见实施例l)。另外，为了进一步提高ML-12结合的亲和力和 /或降#^解离速率常数，可用类似于天然免疫反应过程中与抗体亲和力 成熟有关的体内体细胞突变过程的方法，优选在VH和/或VL的CDR3 区中随机突变所述优选VL/VH对的VL和VH节段'这种体外亲和力 成熟可通过应用分別与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增 VH和VL区而完成，所述引物在某些位置巳经"掺入了 " （ " spiked ")4 种核苷酸碱基的随机混合物，使得获得的PCR产物编码随机突变已经 导入VH和/或VL CDR3区的VH和VL节段。可再选择和再筛选这些 随机突变VH和VL节段对hIL-12的结合，可逸定对IL-12结合具有高 亲和力和低解离速率的序列。表2(参见附件A)显示了因为体外亲和力 成熟而产生的结合特异性/亲和力改变的抗体。在从重组免疫球蛋白展示文库选才爭、分离和筛选了本发明的抗 ML-12抗体后，可从噬菌体颗粒(例如噬菌体基因组)回收编码逸定抗体 的核酸，并将其用标准重組DNA ^L术亚克隆入其他表达栽体。必要 时，可进一步操作所述核酸以产生本发明的其4也抗体形式(例如与编码 额外免疫球蛋白结构域(例如额外恒定区）的核酸连接).为了表达通过 筛选组合文库分离的重组人抗体，使编码所述抗体的DNA克隆入重組 表达栽体中，并将其导入哺乳动物宿主细胞中，见以下部分IV的更详 细介绍。在实施例1更详细地介绍了应用噬菌体展示技术选择人IL-12结 合抗体的方法以及通过随机诱变或定点诱变CDR区使选定抗体亲和 力成熟，如实施例1所述> 篩• VL和VH cDNA文库鉴定一 系列抗IL-12抗体，其中选定Joe9抗体用于进一步研制。比较Joe9的重链可变 区与从VBASE数据库选择的重链种系序列，显示Joe9与COS-3种系 序列相似，COS-3属于种系序列的VH3家族„VH3家族是人VH种系所有组成成分的一部分，VH种系所有组 成成分可根据核苷酸序列同源性分为.7个家族> 即VHI-VH7 (Tomlinson等.(1992)丄Mo/: S/o/., 227, 776二798和Cook等（1995) 加;w朋/^v rodW乂 16,237-242)。 VH3家族的成员最多，在种系所有組 成成分中占的比例最大。对于任何给定的人VH3种系抗体序列，在整 个Vh3家族中的氨基酸序列同一性是最髙的(参见例如Tomlinson等 (1992) Mo/.所o/., 227, 776-798和Cook等(1995) /w肌z加/o" 7b&y, 16,237-242)。任何2个VH3家族种系VH序列之间的氨基酸序列同一 性变化范围为约100个VH残基中的69-98个残基(即任何2个种系VH 序列之间的氨基酸序列同源性为69-98%)。对于大多数种系序列对， 具有至少S0个或SO个以上的相同氨基酸残基(即至少80%氨基酸序列 同源性)。VH3家族成员间的高度氨基^列同源性使某些氨基酸残 基位于VH链CDR和构架区的关键位点。这些氨基酸残基赋予CDR 以结构4争4正.抗体结构研究表明，4艮据占据CDR和构架区某些位置的关键氨 基酸残基，可将CDR构象分为各种家族的正则CDR结构，因此，在 具有正则结枸和相同关键氨基酸残基的不同抗体中存在相似的局部 CDR构象(Chothia等(1987) Afo/.历o/.， 196,卯1-917和Chothia等 (1989) W加ww, 3425 877-883),在VH3家族中，在CDR1和CDR2正财 结构的关4囊位点存在保守的氨基酸残基同 一性(Chothia等(l 992)丄Mo/. 嵐，227: 799-817)。COS-3种系VH基因是VH3家族成员之一，而且是3-30 (DP-49) 种系VH等位基因的一种变异体。COS-3只在位置5与Joe9 VH氨基 ^列不同。Joe9 VH和COS-3之间以及Joe 9 VH和其他VH3家族 成员之间的高度氨基酸序列同源性赋予高度CDR结构同源性(Chothia等(1992)J, Mo/. S/o/" 227, 799-817; Chothia等(1987),/. Mo/. 5/。/。 1%: 901-917和Chothia等(19S9) 342， 877-883)。技术人员知道，鉴于与Joe 9的高度氨基酸序列相似性和正则结 构相似性，其他VH3家族成员也可用来获得结合人IL-12的抗体，例 如可如下达到此目的：通过链改组技术选择合适的VL (Winter等(l994) 爿朋wa/i?ev. /切mwwo/., 12, 433-55)或者将啮齿动物抗体或其他人抗体的 CDR(包括本发明抗体的CDR)移植到VH3家族构架上。根据核苷酸序列同源性，人V^种系所有组成成分可分为10个家 族(Williams等（1996), A/o/. S/o/., 264, 220-232》比较Joe 9的轻链可 变区与从VBASE数据库逸择的轻链种系序列，显示Joe 9与DPL8 X 种系相似。Joe 9 VL与DPL8序列<义在4个构架位置上不同，而且与 其他Vxl家族成员的构架序列高度同源，鉴于与Joe 9的高度氨基酸 序列同源性和正则结构相似性，其他VjJ家族成员也可用来获得结合 人IL-12的抗体，例如可如下达到此目的：通过链改组技术选择合适 的VL (Winter等同上)或者将啮齿动物抗体或其他人抗体的CDR(包括 本发明抗体的CDR)移植到Vxl家族构架上。本发明方法包括结合ML-12的重组抗体，它包含得自种系序列的 VH3家族成员之一的重链可变区和得自种系序列的Vxl家族成员之一 的轻链可变区。此外，技术人员知道，任何VH3家族重链序列成员可 与任何V;J家族轻链序列成员组合。本领域技术人员还知道，在一个群体(例如人类群体)中存在导致 种系氨基酸序列变化的DNA序列多态性，这样的种系序列遗传多态性 可因为天然等位基因变异而存在于群体中的个体之间，这样的天然等 位基因变异通常可导致1-5%的基因核苷,列变异。天然等位基因变 异所致的任何以及全部这样的核苷酸变异以及由此产生的种系序列氨 基酸多态性均属于本发明范畴.因此， 一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它具有以下特性：a) 结合人IL-12 >并根椐表面胞质团共振测定，以0.1 s^或0.1 s-1 以下k。ff速率常数与人EL-12解离，或者以1 x 10"M或1 x 10"M以 下的IC5Q抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定）中的植物凝 集素母细胞增殖。b) 具有包含选自VH3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可 变区，其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的接触位点 或超突变位点存在突变。c) 具有包含选自VU种系家族成员之一的氨基酸序列的轻链可 变区，其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选逸择 性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在 重链CDR3中存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分 在轻链CDR3中存在突变，在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分 在重链CDR2中存在突变。在另一个优选实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分 在轻链CDR2中存在突变，在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分 在重链CDR1中存在突变，在另一个优逸实施方案中，所迷分离的人抗体或其抗原结合部分 在轻链CDR1中存在突变。一般技术人员知道，鉴于VH3种系家族成员之间或轻链VM种系 家族成员之间的高度氨基*列相似性，所以种系序列突变可获得结 合人IL-12的其他抗体.表l(参见附件A)显示了 Vh3家族成员的种系 序列> 而且证实了家族成员中的显著序列同源性，表1还显示了VU 家族成员的种系序列，提供Joe9的重链序列和轻链序列作为比较.例 如可在本发明抗体发生突变的相同氨基酸位置(例如Joe 9中的突变)，使VH3或V入l家族成员的种系序列发生突变，可用标准分子生物学技 术，例如PCR诱变，针对种系序列中的各个氨基酸残基进行修饰，然后如本文所迷对修饰抗体进行动力学和功能分析(例如实施例3所述的 中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)„因此， 一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结 合部分，它具有以下特性：a) 具有包含选自SEQ ID NO: 595-667的氨基SL宇列的重链可变 区，其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变.b) 具有包含选自SEQ ID NO: 669-675的氨基酸序列的轻链可变 区，其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。一般技术人员知道> 鉴于Joe 9和COS-3重链种系序列之间以及 Joe 9和DPL8 X种系序列之间的高度氨基^列相似性> 所以这些种 系序列CDR区的其他突变可获得结合人IL-12的其他抗体。可用如上 所述的标准分子生物学技术进行这样的修饰方法，因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗 原结合部分，它具有以下特性：a) 结合人IL-12,并根据表面胞质团共振测定，以0.1^或0.1s'1 以下koff速率常数与人IL-12解离，或者以l x 10-SM或l x 10-SM以 下的ICso抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝 集素母细胞增殖。b) 具有包含COS-3种系氨基齡列的重链可变区，其中所述重 链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触 位点或超突变位点存在突变。c) 具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位 点或超突变位点存在突变.由于某些氨基酸残基占据轻链可变区和重链可变区的CDR和构架区的关键位点,所以结构特征存在于这些区中。具体来说，CDR2 和CDR1区是正则结构分类的依据，因为家族成员之间存在髙度氨基 ^Jf列同源性，所以这些正则特性存在于家族成员之间。技术人员知 道，在赋予这些正则结构的氨基酸残基的〗务饰可产生结合IL-12的其 他抗体。可采用如上所述的标准分子生物学技术进行所述#~饰。因此> 另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原 结合部分，它具有以下特性：a) 结合人IL-1.2,并根据表面胞质团共振测定，以0.1 s"或0.1 s" 以下k。ff速率常数与人IL-12解离，或者以1 x 10—^M或1 x 10《M以 下的IC5o抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝 集素母细胞增殖。b) 具有包含选自VH3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可 变区> 其中所述重链可变区包括与其他VH3种系家M员的CDR2结 构相似的CDR2以及与其他VH3种系家族成员的CDR1结构相似的 CDR1 ,而且其中所迷重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优 选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变；c) 具有包含逸自V入l种系家族成员之一的氨基^^列的轻链可 变区，其中所述轻链可变区包括与其他VM种系家族成员的CDR2结 构相似的CDR2以及与其他VX1种系家族成员的CDR1结构相似的 CDR1 ,而且其中所述轻链可变区在具有增強活性的氨基酸残基的优 选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变，本发明重組人抗体具有与选自VBASE数据库的人种系免疫球蛋 白序列同源的可变区和恒定区.重组人抗体的突变(例如随机诱变或 PCR诱变)产生不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸。此外，得 自人类提供者的重组抗体文库将包括由于发生于B细胞发育期间的正 常体细胞突变过程而不同于其相应种系序列的抗体序列。值得注意的 是5如果PCR扩增获得的"种系"序列编码不同于真正种系构型的构架区的氨基酸(即与真正种系序列相比扩增序列发生改变)，则最好使 这些氨基酸不同变回真正种系序列（即枸架残基"回复突变"为种系构 型》因此本发明可任选包括回复突变步骤，为此，首先比丰支所述种系 编码的重链和轻链氨基酸序列与突变免疫球蛋白重链和轻链构架氨基 ,列，鉴定与最接近种系序列不同的突变免疫球蛋白构架序列的氨 基酸残基，然后，利用遗传密码确定应该使哪个核苷酸改变，从而使 突变免疫球蛋白序列的合适核苷酸回复突变为相应的种系序列。应用标准方法如PCR介导的诱变(其中突变核苷酸掺入PCR引物，使得PCR产物存在所述吏变)或定点诱变对突变免疫球蛋白构架序列进行诱 变。研究鉴定为回复突变侯逸对象的各氨基酸的作用，以了解在抗原 结合中的作用是直接作用还是间接作用，而最终的人抗体不应有突变后发现影响人抗体任何需要特性的任何氨基酸；举例来说，使用逸择 性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不易发生回复突变。测定诱变获 得的抗体特性的测定可包括ELISA 、竟争性ELISA 、体外和体内中和 测定和/或(参见例如实施例3)各种来源（包括人、灵长类和/或其他物种） 的組织切片的组织化学。为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不 同、但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是第 二种种系序列的所述氨基酸两侧至少10个、优选12个氨基酸与本发 明人抗体的序列相同而且共线性。这保证用本发明的人抗体治疗个体 的专化抗原提呈细胞提呈给免疫系统的任何肽表位都不是外源性的， 而是与自身抗原相同，即所述第二种种系序列编码的免疫J泉蛋白。可 在优化抗体的任何阶段进行回复突变；但是优逸正好在选择性诱变方 法之前或之后进行回复突变.更优选正妤在逸棒性诱变方法之前进行 回复突变。HI.对优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的修饰通常可用以上部分n所述的噬菌体展示方法选择亲和力提高的抗体。可以通过CDR残基的随机突变組合以及产生包含不同序列抗体的 大文库达到此目的，然而，对于有效选择方法，抗体抗原反应必须处 于平衡，以便高亲和力抗体在不同时间优选结合所述抗原，在达到某 一水平的亲和力(即抗体Y61的亲和力)后，当噬菌体展示方法用来提高选定抗IL-12抗体的亲和力时，不能确定建立平衡的选择条件(推测由于抗原和噬菌体颗粒之间的额外非特异性作用所致)。因此，不能用 噬菌体展示方法选择更高亲和力的抗体。西此，对于至少部分抗体或 抗原，噬菌体展示方法受限于其选择具有高度改善的结合特异性/亲和 性的抗体的能力。所以，建立了克服了这些限制的称为逸择性诱变方法(Selective Mutagenesis Approach)的方法，它不需要抗#>的谨菌体展 示的亲和力成熟，该方法由本发明提供。尽管研制了该选择性诱变方 法，用以克服^f吏用噬菌体展示系统的缺陷，但是应该指出的是，该方 法也可用于噬菌体展示系统。而且，选择性诱变方法可用来增强任何 抗体的活性。为了增强抗体的活性(例如亲和力活性或中和活性)，人们最好使 重链和轻链的各CDR位点突变为相应的其他可能氨基酸残基。但是， 因为抗体内平均存在70个CDR位点，所以这种方法是非常费时的而 且操作繁复.因此，本发明方法使人们可通过只突变重链和/或轻链 CDR中的某些选定残基而增强抗体的活性。此外，本发明方法可增强 抗体活性，而不影响其他需要抗体特性.根据一级序列或其在可变区中的位置，不能精确预测确定抗体可 变区的什么氨基酸残基接触抗原，尽管如此，Kabat等通过对不同特 异性抗体进行序列对比，已经鉴定了为抗体之间显著不同的可变区局 部区域的CDR (Kabat等(1971) —4朋.Wl^c"d 巡：382-393， Kabat, E.A.等(l 991) S，幼ce 。/尸r她/m o///n卿;io/喂'c"/ /鹏mt,第五版，美 国人类健康服务部，NIH^^第91-3242号)，结构研究表明，抗原结 合表面由CDR中存在的氨基酸残基形成。还知道CDR外面的其他氨 基酸残基在抗原结合中起结构性作用或直接参与抗原结合.所以，对于各抗原抗体对，CDR内以及CDR外面的氨基酸残基可能是重要 的。Tomlison等进行了序列对比研究，在重链和轻链CDR1和CDR2 中以及在为体细胞突变高频位点的部分K链CDR3中鉴定了许多位 点，（Tomlison等(1996) J. Mo/.历o/. 256: 813-817),具体来说，位置 H31、 H31B、 H33、 H33B 、 H52B 、 H56 、 H58 、 L30 、 L31 、 L31A、 L50、 L53、 L91 、 L92 、 L93和L94鉴定为体细胞突变高 频位点.然而> 该分析不包括重要重链CDR3区以及已知位于抗体结 合位点中心而且潜在与抗原产生重要作用的轻链CDR3部分„此外， Tomlison等提出单独的体细胞多样性不一定能预测特定氨基酸在抗原 结合中的作用，而且他们认为保守氨基酸残基接触抗原，而非保守氨 基酸残基不接触抗原。该结论进一步得到关于体细胞突变对抗体亲和 力的影响的突变研究的支持(幼ora?, p9卯j,尸JMS S7:必"-7).高亲和 力抗对笨偶氮基胂酸盐(Ars)抗体的19个体细胞突变同时被其相应的 种系残基取代，产生种系形式的活性丧失200倍的抗Ars抗体，只恢 复19个体细胞突变中的3个突变就可恢复抗Ars抗体的全部亲和力， 证实允许发生许多体细胞突变而不影响抗原结合活性。该结果的部分原因在于抗体多样性特性本身。未成熟B细胞最初 可产生识别许多自我抗原或非自我抗原的低亲和力抗体，而且，抗体 可能发生引起自身反应的亲和力成熟序列变化过程。所述低亲和力抗 体的超突变可用来消除自身反应性（"负性选择"）并增加对外源抗原 的亲和力.所以> 分析无数抗体的一级和结构数据不能提供以下目的 的预测方法：（1)体细胞超突变位点在亲和力成熟过程与降低对不需 要抗原的亲和力的过程中的作用；或者(2)特定氨基酸如何影响特定 抗原抗体对的特性。通过分析许多抗原抗体复合物的晶体结构进行了阐明特定氨基 酸残基在抗原识別中的作用的其他努力(MacCallum等(19%) J. Mo/. 说o/. 262: 732-745》指出位于CDR中和CDR外的位点的潜在作用。括重链H31、 H33、 H50、 H52、 H53 、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H兆和H100以及轻链L30A、 U2、 L91、 L92、 L93、 L94、 L96,但是，所述作者指出，应用这些数据和其他结构数据预 测抗原接触可或多或少预测接触位点，因此推测不同策略可能适用于 不同抗原。Pini等介绍了在大噬菌体展示文库的抗体CDR序列中随机化多个 残基，以快速增加抗体亲和力(Pini等(1998) J. C/2e"1. 273: 21769-然而，Pini等所论述的高亲和力抗体在总共8个位置具有突 变，而对增强抗体亲和力必须哪些变化进行简化分析(reductionary analysis)不可行，因为需要测试无数可能组合所需要的最小数目的氨基 酸。此外，随机化多个残基不一定能够保留抗体的其他需要特性，需 要的抗体特性是本领域已知的，包括例如保留非交叉反应性，例如与 其他蛋白或人組织的非交叉反应性，以及保留与改善中和效价的人种 系免疫球蛋白序列密切相关的抗体序列，其他需要特性包括保留物种 交叉反应性的能力、保留表位特异性的能力和保留在哺乳动物细胞中 高水平表达蛋白的能力。可用本领域已知的技术观测或测量所述需要 特性，所述技术包括但不限于ELISA、竟争性ELISA、体外和体内中 和测定(参见例如实施例3)、根据需要对包括人、灵长类或其他来源的 不同来源的組织切片的免疫組织化学分析以及利用瞬时表达或稳^ 达研究在哺乳动物细胞中的表达。另外，Pini等的方法可导入比增强亲和力实际需要的最小数目更 多的变化，而且可产生在人体内引发抗人抗体(HAMA)形成的抗体. 此外，如其他地方所论述，本文证实的噬禽体展示或其他相关方法， 包括核糖体展示，在抗体和抗原之间亲和力达到一定水平后，这些方 法不适用，而且因为其他作用，包括与其他噬菌体或核糖体组分以及 抗原的其他作用，不能在合理的时间.范围内建立达到平衡所需的条件.一般技术人员可以从上述参考文献内容收集关于抗体多样性原 因的有趣科学信息。然而，本发明提供增强特定抗原抗体对的抗体亲 和力的方法，同时保留抗体的其他相关特性或需要特性，这在考虑需 要赋予特定抗体各种不同特性包括抗原结合时特別重要。如果起始抗体具有需要保留的需要特性时，选4奪性诱变方法是保 留这些需要特性而同时增强抗体活性的最佳策略。例如诱变Y61时，目的是增强抗体对ML-1的亲和力而且提高抗体的中和效价，同时保 留所需要的特性，需要的Y61特性包括(l)保留与其他蛋白或人组织 的非交叉反应性,（2)保留精确的表位特异性，即优选识別p70(p40/p35) 异源二聚体中的p40表位，因此防止游离可溶性p40的结合干扰；以 及(3)产生具有尽可能接近其相应种系免疫球蛋白序列的重链和轻链 氨基酸序列的抗体.在一个实施方案中，本发明方法提供选择性诱变方法作为保留抗 体需要特性同时增强亲和力和/或中和效价的策略，术语"选择性诱变 方法"定义同上，包括分別使选定氨基酸残基突变的方法。可首先从 优逸选择性诱变位点逸择需要突变的氨基酸残基，然后从接触位点、 再后从超突变位点选择需要突变的氨基酸残基，可使各个选定的位置 突变为至少2个其他氨基酸残基，确定所述突变对抗体需要特性以及 抗体活性改善的影响，选择性诱变方法包括以下步骤：按照顺序1)优选选4奪性诱变位点；2)接触位点；3)超突变位 点，逸择候逸位置，然后根据在抗体重链可变区和轻链可变区中的位 置对位置排序(优选顺序为：CDR3>CDR2>CDR1);按照排列的顺序分别使候选的优逸选4奪性诱变位点、超突变'位点 和/或接触位点突变为所有可能的其他氨基酸残基，分析各个突变对抗 体活性的影响，以确定增强活性的氨基酸残基；必要时，逐步组合各个增强活性的氨基酸残基，分析各种組合对抗体活性的影响；选择具有增强活性的氨基酸残基的突变抗体，就其 免疫原性潜能根据氨基酸取代的部位和同一性对所迷突变抗体进行排 序。最高位次为包含几乎与种系数据库描逸的可变区序列相同的氨基 酸序列的突变抗体，或者具有与其他人抗体相似的氨基酸序列的突变抗体。第二位次为包含种系序列或其他A抗体序列罕见的氨基酸取代的突变抗体，最低位次为种系序列或另一种人抗体序列未曾有的氨基 酸取代的突变抗体，如上所述，突变抗体包含的至少一个增强活.性的氨基酸残基位于CDR3优于位于CDR2 ，位于CDR2优于位于CDR1 。 重链可变区CDR优于轻链可变区CDR 。还可以研究突变抗体例如与其相应的亲代抗体相比的活性增强 情况，例如应用中和测定或利用表面胞质团共振分析的结合特异性/亲 和性(参见实施例3)可测定突变抗体的活性改善。优逸活性改善较亲代 抗体增高至少2-20倍。活性改善较亲代抗体增高可至少为"xl"至 "x2 "倍，其中"xl"和"x2 "为2-20之间而且包括2和20的整 数，包括所述范围中的范围，例如2-15(例如5-10)。还可以研究具有增强活性的氨基酸残基的突变抗^本，以确定突变 后是否保留至少一种其他需要特性'例如以抗ML-12抗体测试：（1)保 留与其他蛋白或人组织的非交叉反应性，（2)保留表位识別，即优选识别p70(p40/p35)异源二聚体中的p40表位，因此防止游离可溶性p40 的结合干扰，以及(3)产生具有尽可能接近其相应种系免疫球蛋白序 列的重链氨基g齡列和轻链氨基酸序列的抗体；以及根据不同于种系 序列的数目确定哪些抗体至少可能引发人免疫反应，对具有]个以上 (例如至少2个或至少3个)增强活性的氨基酸残基的抗体进行相同的观 测，以确定是否保留了需要特性。在诱变Y"61中应用"选4奪性诱变方法"的一个实例如下所述，各 突变H31S—E 、 L50—Y或L94G—Y分別增强抗体的中和活性。然而 当测试組合克隆时，組合克隆H31S—E + L50—Y + L94G—Y的活性 不比L50—Y + L94G卄Y (J695)更好。所以，CDR1的位置31由种系氨基酸残基Ser变为Glu对于J695的活性比Y61有提高是非必须的。 因此，选择性诱变方法鉴定与最终活性有关的最小数目的变化> 由此 降低最终抗体的免疫原性潜力而且保留抗体的其他需要特性。选择性诱变方法制备的编码VH和VL的分离DNA可转化为全长 抗体链基因、Fab片段^^基因或scFV基因，如IV部分所述。为了表达 选择性诱变方法制备的VH和VL区，可将编码重链和轻链的表达载 体转染入各种宿主细胞，见IV部分的详细介绍.优逸宿主细胞包括原 核生物宿主细胞，例如大肠杆菌，或者真核生物宿主细胞，例如酵母 细胞，如酿酒酵母。最优选的真核生物宿主细胞是哺乳动物宿主细胞， 见IV部分的详细介绍。逸择性诱变方法提供了制备活性增强的抗体的方法而不需要用 其他方法预先进4亍抗体亲和力成熟。选择性诱变方法提供制备经过回 复突变、亲和力增强的抗体的方法。选择性诱变方法还提供增强亲和 力成熟抗体的活性的方法，技术人员知道，选择性诱变方法可用于本领域已知的标准抗体搡 作技术.实例包括但不限于CDR移植抗体、嵌合抗体、scFV片段、 全长抗体的Fab片段和其他来源例如转基因小鼠的人抗体。对抗体进行快速大规模的突变分析包括利用核糖体展示技术的 体外转录和翻译(参见例如Hanes等，（1997)尸rac. A^/.爿o^. Sc/. 94: 4937-4942; Dall Acqua等，（1998) Cwm &n/c.祝o/. 8:443-450; He 等，（1997) i?仏25: 5132-5134)和授予Kawasaki的美国专利第5,643,768和5,658,754号。选择性诱变方法还提供制备可用核糖 体展示技术选择的活性增强抗?本的方法.在本发明方法中，通过改变HCVR和/或LCVR的各个CDR位点 而进一步修饰抗体或其抗原结合部分.尽管可以用噬菌体展示抗体制 备这些修饰，但是优选所迷方法，因为可用在其他类型宿主系统如细 菌、酵母或哺乳动物细胞表达系统中表达的抗体实施该方法。选择用 于修饰的CDR中的各个位点基于为接触位点和/或超突变位点的位占f 、、 9本文定义的优选接触位点和超突变位点示于表3(参见附件A),其 按照本发明方法的修饰详细介绍于实施例2 。优选接触位点选自 H30、 H31 、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50 、 L52 、 L53 、' L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96。优选超突变位点选自H30、 H31、 H3IB、 H32 、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31 、 L32 、 L53和L93 ,更优选的氨基酸残基 (称为"优选选择性诱变位点"）既是接触位点又是超突变位点，它们 选自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H52、 H56 、 H5S、 L30、 L31、 L32、 L50、 L91 、 L92 、 L93 、 L94 。特别优选的接触位点 选自L50和L94 ,优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自以下位点 的氨基酸残基：H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34 、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96。更优选增强活性的氨基酸残基取代位于以 下位点的氨基酸残基：H30、 H31、 H31B 、 H32 、 H33 、 H52 、 H56、 H58、 L30、 L31 、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94 。 特别优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自L50和L94的位点的氨 基酸残基。一4殳来"i兑，本发明方法包括：选才奪目的亲^R抗体或其抗原结合部 分的重链或轻链CDR中特別优选的选择性诱变位点、接触位点和/或 超突变位点，随机突变所述各位点(例如利用突变寡核苷酸的遗传方法 制备修饰抗体的"微小文庠(mini-library)")或者使一个位点突变为特 定需要氨基酸，以鉴定显示增强活性的氨基酸残基，纯化修饰抗体(例 如用非噬菌体展示宿主系统)，检测修饰抗体对抗原的活性(例如利用 BIAcore分析测定k^速率)，必要时，对其他CDR位点重复所述步骤， 組合证实活性增强的各个突变，以及测试各种組合是否产生较亲代抗体更高活性(例如亲和性或中和效价)的抗体或其抗原结合部分。因此，在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部 分的活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 依次选择用于突变的互补决定区(CDR)中的1)优选选择性诱 变位点，2)接触位点或3)超突变位点，由此鉴定选定的优逸选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点；c) 分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；e) 任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变 位点重复步骤a)-d);f) 組合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g) 评价所述組合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分.最好所述选定抗体的活性提高而如上所述不丧失或保留亲代抗体的至少一种需要特性。 一般 技术人员应用^域已知的技术可检测或观测所述需要特性。优选的接触位点逸自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H9S、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96 。优选超突变位点选自H30 、 IB1 、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31 、 132、 L53和L93。 更优选的优选选择性诱变位点逸自H30 、 H31 、 H31B 、 H32 、 H33、 H52、 H56、 H58 、 L30、 L31 、 L32 、 L50、 L91 、 L92、L93和L94 «特別优选的接触位点选自L50和L94 。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 选4奪用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触位点或超突变位点；c) 分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变 位点重复步骤a)-d);f) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、2个单独显示具有改进 活性的增强活性的氨基酸残基，形成組合抗体或其抗原结合部分；以 及g) 评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原 结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相 对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。优选的接触位点选自H30、 H3K H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31 、 L32 、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55、 L9K L92、 L93、 L94和L96 .优选超突变位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58 、 L30 、 L31 、 L32 、 L53和L93, 更优逸的优选选择性诱变位点选自H30 、 H31 、 H31B 、 H32 、 H33、 H52、 H56、 H58、 UO、 L31 、 L32、 L50 、 L91 、 L92、 L93和L94 。特别优选的接触位点选自L50和L94 。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 选择用于突变的互补决定区（CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的优逸选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获4寻一组突变抗体或其抗原 结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变 位点重复步骤a)-d);f) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、3个单独显示具有改进 活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗休或其抗原结合部分；以 及g) 评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述組合抗体或其抗原 结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合，分的活性；直到获得相对于所迷亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自以下位点的氛基酸残 基：H30、 H31、 H31B、 H32、 H33、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、鹏、H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 Ul、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96 ,在诱变各个逸定位点后，可对突变克隆测序，以鉴定在各克隆的 选定位点中导入了什么氨基酸残基。可选择少数克隆(例如约24个)进 行测序，在统计学上来说应获得10-15种独特抗体，但可对大多数克 隆(例如60个以上)进行测序，保证筌定在选定位点具有每种可能取代的抗体。在一个实施方案中，首先选择用于诱变的重链和/或轻链CDR3区 的接触位点和/或超突变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选择随机诱变CDR3区而体外卩吏亲和力成熟的抗体，最好首先选4奪重链和/ 或轻链CDR1或CDR2中的接触位点和/或超突变位点.在一个更优选的实施方案中，首先选择用亍诱变的重链和/或轻链 CDR3区的优选选择性诱变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选 择随机诱变CDR3区而体外使亲和力成熟的抗体，最好首先选择重链 和/或轻链CDRl或CDR2中的优逸选择性诱变位点，在另 一个优选实施方案中，如下依次通过选4和性诱变方法优化选 定抗体：首先使选自H30 、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H52、 H56、 H5S、 L30、 L31、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94的优选选 择性诱变位点各自突变为至少2个其他氨基酸残J^(优选为5-14个其他 氨基酸)，所获得抗体的特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的 特征为保留至少 一种其他地方论述的其他特性)。如果一个优选选择性 诱变位点的突变根本不能或不能足够增强亲和力或中和效价，甚至如 果組合多个增强活性的氨基酸取代优逸选择性诱变位点的氨基酸残基 也不能获得具有目标活性(包括亲和力和/或中和效价)的組合抗体，则 从H35、 H50、 H53、 H54 、 H95 、 H96、 H97 、 H98 、 L30A和 L96选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并使其各自突变为至少2 个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸残l-),获得抗体的特征 为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方 论述的其他特性)，如果选自H35、 H50、 H53、 H54、 H95、 H96、 H97、 H98、 L30A和L96的氨基酸残基的单一突变根本不能或不能足够增强活性 (包括亲和力和/或中和效价)，甚至如果组合多个增强活性的氨基酸取 代这些位点的氨基酸也不能获得具有目标活性(包括亲和力和/或目标 中和效价)的组合抗体，则从H33B、 H52B、 L31A选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并使其各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优 选为5-14个其他氨基酸残基)，获得抗体的特征为亲和力、中和效价提 高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特性)。当然，连续选择性诱变方法可在以上概述的任何步骤终止，只要 鉴定出具有需要活性(包括亲和力和中和效价)的抗体'如果预先选定 位点的诱变鉴定出了增强活性的氨基酸残基Z但是组合抗体仍然未达 到活性的目标組合(包括亲和力和中和效价)，和/或如果所鉴定的增强 活性的氨基酸还影响其他需要特性而因此不可接受时，则可对其他CDR残基进4亍诱变(参见IV部分)，本发明方法可用来改善抗体或其抗原结合部分的活性，以获得预 定的目标活性(例如预定的亲和力和/或中和效价，和/或需要特性)。因此，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分活性以获得预定目 标活性的方法，包j舌：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 从H30、 H3i、 H31B、 H32、 H33 、 H52 、 H56 、 H58、 L30、 L31、 L32、 L50 、 L91 、 L92、 L93 、 L94选择优选选择性 诱变位点.c) 分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基 酸残基，由此获得笫一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价第一組突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选体或其抗原结合部分；e) 逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性 的各个突变，形成組合抗体或其抗原结合部分。f) 评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定組合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性.g) 如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原 结合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、 H50、H53、 H54、 H95、 H96 、 H97 、 H98 、 L30A和L96的其他氨基 酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二組突变抗体或 其抗原结合部分；h) 评价第二組突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自 ■H35、 H50、 H53、 H54 、 H95 、 H96、 H97、 H9S、 L30A和L96 的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗 体或其抗原结合部分；i) 逐步组令所述亲代抗体或其抗原结合部分、.显示具有改进活性 的步骤g)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；j)评价所迷組合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性或部分目标活性；k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结 合部分，或者获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B 、 H52B 和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得第三組突变抗体或其抗原结合部分；1)评价第三組突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自 H33B、 H52B和L31A的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目 标活性或部分活性的抗体或其抗原结令部分；m)逐步組合所迷亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活 性的步骤k)的各个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；n)评价所迷组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体 或其抗原结合部分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活 性的抗体或其抗原结合部分.可应用许多诱变方法，包括PGR装配、Kimkel (dtit-mig-)和疏代 磷酸(Amersham Sculptor试剂盒)寡核苷酸定向诱变，各种各样的宿主表达系统可用来表达突变抗体> 包括细菌、酵 母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及虔菌体展示表达系统)。合适 细菌表达栽体的实例为pUC119(Sfi》其他抗体表达系统是本领域已知的和/或在以下IV部分中介绍，可鉴定用本发明方法生产的修饰抗体或其抗原结合部分，而不依 赖于噬菌体展示方法进行选择。因此，对于改善通过噬菌体展示系统 选择获得但是其活性不能进一步通过噬菌体展示系统诱变增强的重組 亲代抗体或其抗原结合部分的活性，特别优选本发明方法，因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合 部分的活性的方法，包括：a) 提供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 —步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优逸逸择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此筌定选定的接触位点或超突变位点；c) 分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所逸抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；e) 任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变 位点重复步骤b)至d);f) 组合所迷亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g) 评价所述組合抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或 其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分.优选接触位点选自H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95 、 H96、 H97、H98、 HlOl、 L30、 L31 、 L32、 L34 、 L50、 L52、 L53 、 U5、L91、 L92、 L93、 L94和L96 ,优选超突变位点逸自H30 、 H31 、H31B、 H32、 H52、 H56、 H5S 、 L30、 L31 、 132、 L53和L93. 更优选的优选选棒f生诱变位点选自H30 、 H31 、 H3IB 、 H32 、 H33、 H52、 H56、 H58 、 L30 、 L31 、 L32 、 L50、 L91 、 L92 、 L93和L94 。特别优选的接触位点选自L50和L94 ,利用现有的方法制备结合亲和力和中和效价提高同时保留如上 所述的其他抗体特性是不可能的或者极其费时，但是，本发明方法可 非常容易地鉴定这类抗体。本发明方法处理的抗体可以是任何来源的 抗体。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合 部分的活性的方法，包括：a) 提供重組亲代抗体或其抗原结合部分；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定逸定的优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点；c) 分別使所述逸定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，而且以合适表达系统表达所述抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述幸代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要 保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改 进活性和至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分.在一个优逸实施方案中，所述接触位点逸自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 ffi3、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96 , 而所述其他特性选自】）保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识別p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58、 L30 、 L31 、 L32 、 L53和L93) 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性 诱变位点，它们选自H30、 H31、 H3】B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94,而所述 其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保 留表位识別，即优逸识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位， 防止游离可溶性p40的结合千扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白 序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94,而 所述其他特性逸自l)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应性，.2) 保留表位识别，即优逸识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球 蛋白序列的抗体，如果抗体针对特定抗原的亲和力会因此增强，而此时噬菌体展示 方法(或相关系统，包括核糖体展示)不再适用，且要保留其他需要特 性，则可应用本发明方法。因此，在另一个实施方案中，本发明提供 改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：a)提供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所迷噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定逸定的优选逸择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此筌定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特 性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原結合部分具有改进活性和 至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f) 任逸对至少一个其他优选选4奪性诱变位点、接触位点或超突变 位点重复步骤a)至e);g) 组合所迷亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性和至少一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成組合抗 体或其抗原结合部分；以及其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合 部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分，在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L9i 、 L92 、 L93 、 L94和L96, 而所迷其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉皮应 性，2)保留表位识别，即优逸识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体，在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、 H31 、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58 、 L30、 L31、 L32、 L53和L93, 而所述其他特性逸自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识别，即优逸识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在一个更优逸的实施方案中，选择性诱变的残基逸自优选选择性 诱变位点，它们选自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31 、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94,而所述 其他特性逸自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保 留表位识别，即优逸识別P70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位， 防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白 序列的抗体，在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94,而 所述其他特性选自l)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应性，2) 保留表位识別，即优选识別p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位> 防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球 蛋白序列的抗体，在另一个实施方案中，本发明提y供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括:a) 提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重組抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其'活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 逸择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选^^性诱变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c) 分別使所迷选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一組突变抗体或其抗原 结合郜分，并以非噬菌体展示系统表达所迷抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要 保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原結合部分具有改 进活性和至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H3]、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、腦、H101 、 L30、 L31 、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L9i 、 L92 、 L93 、 L94和L96 , 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应 性，2)保留表位识別，即优逸识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫^泉蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30 、 、 H31B、 H32、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 L32、 L53和L93， 而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应 性，2)保留表位识別，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选争法诱变的残基选自优选选择性 诱变位点，它们选自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H52、 H56、 H58、 L30、 L31、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94,而所述 其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交5L^应性，2)保 留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位， 防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白 序列的抗体.在一个更优选的实施方案中，所迷接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自l)保留与其他蛋白或人体纽织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识別p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性p40的结合干扰> 和/或3)产生接近种系免疫球 蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的 活性的方法，包括：a) 提供重組亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体 展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进 一步提髙；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位 点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c) 分別使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位 点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原 结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定3曾强活性的氨基酸残基；其抗原结合部分的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要 保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改 进活性和至少 一种保留特性的抗体或其抗原结合部分.在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H33、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 L31、 L32、 134 、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96 , 而所述其他特性逸自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应 性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点逸自H30 、 H31 、 H31B、 H32、 H52、 H56 、 H58 、 L30、 L31、 L32、 L53和L93, 而所迷其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉反应 性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的 p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免 疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优逸选择性 诱变位点，它们逸自H30、 H31、 H31B、 H32、 H33、 H52、 H56、 H5S、 L30、 L31 、 L32 、 L50 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94,而所述 其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保 留表位识别，即优逸识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位， 防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白 序列的玩^本。在一个更优选的实施方案中，所迷接触位点选自L50和L94 ,而 所述其他特性选自i)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2) 保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球 蛋白序列的抗体。IV.修饰其他CDR残基最后，可用增强活性的氨基酸残基需要、和/或结合抗原和/或保 留所述抗体其他需要特性直接或间接需要的任何方法鉴定特定抗体抗 原对中的所有CDR残基.这类CDR残基称为"优选选择性诱变位点". 应该注意的是，在特定的条件下也可以用其他方法鉴定所述优选选择 性诱变残基，包括抗体和抗原的共结晶以及分子建模.如果完成了优选鉴定集中于上述优选选择性诱变位点、接触位点 或超突变位点的增强活性的氨基酸的所有努力> 或者如果需要其他改 进> 可如下所迷修饰其余CDR残基。应该知道，按照上述实施方案已经可以在任何一个或多个接触位点或超突变位点修饰所述抗体，但是 可能需要进一步改进。所以，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30 、 H31 、 H31B 、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、股、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、脂、H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50 、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基^^戋基；c) 分别使所迷逸定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价所述突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原結合部分相 对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨 基酸残;fce) 评价所迷突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原结合部分相 对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化，直 到获得相对亍所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或 其抗原结合部分。所述其他特性优选逸自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉 反应性，2)保留表位识別，即优选识別p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体.如果一个残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；因此， 在另一个实施方案中，本发明ll供改善抗体或其抗原结合部分的活性 的方法，包括：a) 拐:供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H3l、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H9S 、HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选捧用于突变的互补决定区（CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所述逸定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此養定增强活性的氨基酸残基；e) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d),所述CDR位点 既不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31 、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、 H50、. H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96位点；f) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成組合抗体或其抗原结合部 分；以及g) 评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述組合抗体或其抗 原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性> 直到获得 相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原 结合部分。如果完成了优选鉴定集中于上述接触位点或超突变位点的增强 活性的氨基酸的所有努力，或者如果需要其他改进，而且所述抗体不 能通过诱变和噬菌体展示(或相关的核糖体展示)方法进一步优化，则 可如下所述修饰其余CDR残基，应该知道，按照上述实施方案已.经可 以在任何一个或多个优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点修 饰所述抗体，但是可能需要进一步?支进。'因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合 部分的活性的方法，包才舌：a) "^供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选捧获得，但是其活性不能通过所迷噬菌体展示系统诱变进 一步提高；b) 选择用于突变的互补决定区(CDR)中H30 、 H31 、 H31B 、 H32、 H33、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 •H95、 H96、 H97、 H98、 H101 、 L30、 L31 、 L32 、 L34 、 L50、 L52、 L53、 L55、 L91 、 L92 、 L93 、 L94以外的氨基酸残基和；c) 分别使所述逸定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基 酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌#^展 示系统表达所述抗体系列；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗"本或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述'亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分.所述其他特性优逸选自.1)保留与其他蛋白或人体組织的非交叉 反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。如果单一诱变不足以提高所述抗体的亲和力，则可诱变其他残 基，因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合 部分的活性的方法，包括：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分，所迷抗体以噬菌体展示系统 选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提 高；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；C)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗z本系列；d) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所迷亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此筌定增强活性的氨基酸残基；e) 对至少一个其他位点重复步骤b)至d),所述位点既不是b)项选 定的位点，也不是H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35 、 H50 、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 134、 L50、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94位点；i)組合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有 改进活性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部 分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗 原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有政进活性的抗体或其抗原结合部分.所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识別，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。可能完成了优选荟定集中于所述优选选择性诱变位点、接触位点 或超突变位点的增强活性的氨基酸的所有努力，或者可能需要其他改 进，而且重要的是保留所述抗体的其他特性，因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合 部分的活性而不影响其他特性的方法，包括：a)提，供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分別使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得 一 组突变抗体或其抗原结合部分；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代 抗体或其抗原结合部分具有改进活性并保留其4tM争性的抗体或其抗原 结合部分，所述其他特性优选选自】）保留与其他蛋白或人体组织的非交叉 反应性，2)保留表位识別，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以，在另一个实施方案中，本发明"^供改善抗体或其抗原结合部分的活性 的方法，包括：a) 提^供亲代抗体或其抗原结合部分；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、腦、H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50、 L52、 L53 、 L55、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c) 分別使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分；其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残差、；e) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性变化；f) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至e),所述CDR位点既 不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31 、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H58、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31、 L32 、 L34 、 L50 、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96位点；g) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个分別显示改进 活性而不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合 抗体或其抗原结合部分；以及h) 评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述組合抗体或其抗 原結合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种 其他特性的保留情况；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性和至少一种保留的其他特性的抗体或其抗原结合部 分。对优选选择性诱变位点、接触和超突变残基的诱变可能并没有足 够增强所述抗体的亲和力，而诱变和噬菌体展示方法(或相关核糖体展 示方法)可能不再有用，而且应该保留至少一种其他特性。因此，在另一个实施方案中，本发明^_供改善抗体或其抗原结合 部分的亲和力的方法，包括：a) 提/供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统 逸4奪获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提 高；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、固、H95 、,、而、H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32, L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、L92、 L93、 L94和L96以外的位点逸4爭用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分別使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 评价该組突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化，直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉 反应性，2)保留表位识别，即优选识別p70 p40/p35异源二聚体情况 下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近 种系免疫球蛋白序列的抗体。如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以， 在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原結合部分的活性 的方、法，包4会：a) 提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统 选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b) 在H30、 H31、 H31B、 H32、 H33 、 H35 、 H50、 H52 、 H52A 、 H53 、 H54 、 H56 、 H58 、 H95 、 H96 、 H97 、 H98 、 HlOl、 L30、 L31、 L32、 L34、 L50 、 L52、 L53 、 L55 、 L91 、 L92、 L93、 L94和L96以外的位点选择用于突变的互补决定区(CDR) 中的氨基酸残基；c) 分别使所迷选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得一组突变抗体或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；d) 评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e) 对至少一个其他CDR位点重复步骤b)至d)，所迷CDR位点 既不是b)项选定的位点，也不是H30、 H31、 H31B、 H32 、 H33 、 H35、 H50、 H52、 H52A、 H53、 H54、 H56、 H5S、 H95、 H96、 H97、 H98、 HlOl、 L30、 L31 、 L32、 L34、 L50、 L52 、 L53 、 L55 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94和L96位点；f) 组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个分別显示改进 活性而不影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合 抗体或其抗原结合部分；以及g) 评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗 原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种 其他特性的保留情况，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗原结合部分。V.表达抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因和重链基 因，制备本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一个或多 个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重組表 达载体转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达，而且 优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收所述 抗体.标准重組DNA方法学用来获得抗体重银基因和抗体轻链基因， 使这些基因导入重组表达载体中，然后使所述载体导入宿主细胞中， 所述标准方法例如为以下文献介绍的方法：Sambrook, Fritsch和 Maniatis (编辑),A/o/era/"尸C/o"/"g;爿iaijorafo/y Ma"m/,第二版， Cold Spring Harbor, N.Y.， （1989), Ausubel, F.M.等（编辑）Cw^reW /V她a)/s /" M)/eo/"尸Greene Publishing Associates, (l鄉)和 Boss等的美国专利第4,816,397号，为了获得编码Joe 9 wt或Joe 9 wt-相关抗体的重链可变区的DNA片段，如II部分所述，从人文库篩选人IL-12特异性抗体并使其突变。获得编码Joe 9 wt或Joe 9 wt-相关VH和VL节段的DNA片段后，应 用标准方法例如PCR定点诱变(PCR介导的诱变，其中突变核苷酸掺 入PCR引物中，佳—得PCR产物存在所述突变)或其他定点诱变方法， 对这些序列进行诱变。应用标准重组DNA技术进一步操作具有需要水 平的活性和结合特异性/亲和性的人IL-12抗体如J695 >例如使可变区 基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作 中，VL或VH编码DNA片段与编码另 一种蛋白的另一 DNA片段如 抗体恒定区或柔性接头有效连接，本文使用的术语"有效连接"是指 两种DNA片段连接在一起，使得两种DNA片段编码的氨基酸序列保 持在读框中„编码VH区的分离DNA可通过使VH编码DNA与另 一种编码重 链恒定区(CH1 、 CH2和CH3)的DNA分子有效连接而转化为全长重 链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat， E.A.等(1991) S，OTce o//Voto'/w o/加附w"o/og/ca/ /"fe尸賊第五版,美 国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可 获得包含这些区段的DNA片段，所述重链恒定区可以是IgGl 、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgE 、 IgM或IgD恒定区及Kabat介绍 的其任何同种异型变异体(Kabat, E.A.等(1991) &gwe"ce 0/尸roto'm o/ 加m朋o/og/o?/ /"femrt,笫五版，美国人类健彭良务部，NIH公告第 9i-3242号)，但是最优选为IgGl或lgG4恒定区。对于Fab片段重链 基因，VH编码DNA可以与另 一种只编码重链CHI恒定区的DNA分 子有效连接。编码VL区的分离DNA可通过使VL编码DNA与另一种编码轻 链恒定区CL的DNA分子有效连接而转化为全长轻链基因（以及Fab 轻链基因)，人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat, E.A,等(1991) S叫we"ce o/尸n)fe!'w 美 国人类健勤良务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可获得包含这些区段的DNA片段，所述轻链恒定区可以是K或X恒定 区，但是最优选X恒定区。为了获得scFv基因，使VH和VL编码DNA片段与另 一种编码 柔性接头的片段如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段有效连接，使得 VH和VL序列可表达为邻接的单链蛋白，VL和VH区通过柔性接头 连接在一起(参见例如Bird等(198S) Sc/e"ce 242: 423-426; Huston等 (19S8) W。f/.爿c"c/. Sc/. M: 5S79-5883; McCafferty等，Atowe (簡）逃：552-554)。为了表达本发明抗体或抗体部分，使如上所述获得的编码部分或 全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得所述基因与转录控制序 列和翻译控制序列有效连接。在这种情况下，术语"有效连接"是指 抗体基因连接入载体，使得所述载体中的转录控制序列和翻译控制序 列发挥其预定的调节所述抗体基因的转录和翻译的作用。选择与所用 的表达宿主细胞匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗 体重链基因可插入独立的载体，而更常见的是，将这两种基因插入同 一表达载体。应用标准方法(例如连接在抗体基因片ISl和载体中的互补 限制性位点，或者如果没有限制性位点则平端连接)使抗休基因插入表 达载体中。在插入J695或J695相关的轻链序列或重链序列之前，所 迷表达载体已经带有抗体恒定区序列。例如一种使J695或J695相关 的VH和VL序列转化为全长抗体基因的方法是将其分別插入编码重 链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH节段与所述载体中的 CH节段有效连接，而VL节段与所述载体中的CL节段有效连接。另 外或者二者择一，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌 的信号肽，抗体链基因可克隆入载体，以便信号肽按读框与抗^本链基 因的氨基末端连接，信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即 非免疫球蛋白信号肽)。除了抗体链基因之外，本发明重组表达载体携带有控制抗体链基 因在宿主细胞中表达的调节序列.术语"调节序列"是指包括控制抗体乾基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号）。例如以下文献介绍了这类调节序列：Goeddel; G幼e £x;?ras^o« 7fec/mo/ogy: A^f/jofits /" £>j^v;«o/ogy 185, Academic Press, San Diego, CA(19卯)。本领域技术人员知道，表达载体的设计，包括调节 序列的选择，可能取决于诸如用于转化的宿主细胞的选择、需要蛋白 的表达水平等的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包 括控制蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如得自以下 病毒的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增 强子)、猿猴病毒40 (SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如 腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。关于病毒调节元件及其 序列的进一步介绍，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bdl 等的美国专利第4,510,245号和Scliaffiier等的美国专利第4,968,615 号，Bujard等的美国专利第5，464,758号和Bujard等的美国专利第 5,654,168号。除了抗体链基因和调节序列之外，本发明重组表达载体可携带其 他序列，例如调节所述载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点) 和选择标记基因。选择标记基因有助于选择所述载体已经导入其中的 宿主细胞(参见例如均为Axel等的美国专利第4,399,216 、 4,634,665 和5,179,017号> 例如，逸择标记基因通常赋予载体导入其中的宿主 细胞对药物如G41S 、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选4爭标记基 因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因（用于甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主 细胞)和基因(用于G418选择)，为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达栽体通过标准技术 转染入宿主细胞中，各种形式的术语"转染"包括遒常用于将外源DNA 导入原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞的各种各样的技术，例如 电穿孔、磷酸钩沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可在原核生 物宿主细胞或真核生物宿主细胞中表达本发明抗体，但是优选在真核 生物宿主细胞中表达抗体，而最优选哺乳动物宿主细胞，因为真核生物细胞、尤其是哺乳动物细胞较原核生物细胞更可能装配和分泌适当 折叠的免疫活性抗体.用于表达本发明重组抗休的优选哺乳动物宿主细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin , (1980) 尸rac. Ato/.OS^ 22: 4216-4220介绍的dhfr- CHO细胞> 和 DHFR选择标记一起使用，如R丄Kaufman和P.A. Sharp (1982) Mo/. S/o/. 1H: 601-621中所介绍)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细 胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，如下 制备抗体：培养宿主细胞足够长时间，使抗体在宿主细胞中表达，更 优逸所述抗体分泌入宿主细胞在其中生长的培养基中，应用标准蛋白 纯化方法可从培养基中回收抗体.宿主细胞也可以用来产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或 scFv分子。应该知道，关于上述方法的各种改变也属于本发明范畴， 例如最好用编码本发明抗体的轻链或重链(而不是同时的二者)的DNA 转染宿主细J包。重組DNA 4支术也可用来去除结合h!L-12非必需的编 码轻链或重链或二者的DNA的一部分或全部。本发明的抗体也包括这 样的截短DNA分子表达的分子.另外，可以应用标准化学交联方法交 联本发明抗体与第二种抗体制备双功能抗体，其中一条重链和一条轻 链是本发明的抗体，而另一条重链和轻M非h!L-12抗原特异性的。在一个用于重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的优选系统 中，编码抗体重链和抗体轻链的重組表达载体通过磷酸钥介导的转染导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链基因和抗体轻链 基因独立与增强子/启动子调节元件(例如得自SV40、 CMV、腺病毒 等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP 启动子调节元件)有效连接，以驱动高水平的基因转录。重組表达载体 还携带有DHFR基因，它使得可应用甲#^呤选择/扩增选摔以载体转 染的CHO细胞.培养选定的转化体宿主细胞，以便表达抗体重链和抗 体轻链，从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用来制备重 組表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。可用人免疫球蛋白基固的转基因动物(例如小鼠)表达本发明的抗体或其抗原结合部分(参见例如Taylor, L.D.等(1992) Nucl, Acids Res.巡：62S7-6295),也可以修饰植物细胞，以产生表达本发明 抗体或其抗原结合部分的转基因植物，鉴于以上所述，本发明的另一个方面涉及可用于重组表达本发明 抗体和各种抗体郜分的核酸、载体和宿主细胞组分。本发明的特征优 选在于编码J695的CDR或J695的完整重链可变区和/或轻链可变区的 分离核酸。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于一种编码抗 体重链可变区的分离核酸，所述分离核酸编码包含SEQ ID NO: 25氨 基酸序列的J695重链CDR3 。优选编码抗体重链可变区的核酸还编码 包含SEQ ID NO: 27氨基酸序列的J695重链CDR2 。更优选编码抗体 重链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO: 29氨基酸序列的J695重链 CDR1 。甚至更优逸所述分离核酸编码包含SEQ ID NO: 31氨基^ 列的抗体重链可变区(J695的全长VH区》在其他实施方案中，本发明的特征在于一种编码抗体轻链可变区 的分离核酸，所述分离核酸编码包含SEQ ID NO: 26氨基酸序列的J695 轻链CDR3 ,优选编码抗体轻链可变区的核酸还编码包含SEQ ID NO: 28氨基酸序列的J695轻链CDR2 ,更优选编码抗体轻链可变区的核 酸还编码包含SEQ ED NO: 30氨基酸序列的J695轻链CDR1 .甚至更 优选所述分离核酸编码包含SEQ ID NO: 32氨基酸序列的抗体轻链可 变区(J695的全长VL区)。本发明还提供编码抗体重链和抗体轻链的重組表达载体，例如在 一个实施方案中，本发明提供编码以下抗体链的重组表达载体：a) 具有包含SEQIDNO:31 g酸序列的可变区的抗体重链；以及b) 具有包含SEQ ID NO: 32氨基酸序列的可变区的抗体轻链， 本发明还提供一种或多种本发明重组表达载体导入其中的宿主细胞。优选所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞，更优选宿主细胞为CHO细胞、NS0细胞或COS细胞。本发明甚至还提供如下合成本发 明重組人抗体的方法：在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直到 合成本发明的重組人抗体。所述方法还可包括从培养基中分离所迷重 组人抗体。VI.药用组合物和药物的给药本发明抗体和各种抗体部分可掺入适合给予患者的药用组合物 中。通常所述药用组合物包括本发明抗体或抗体部分以及药学上可接 受的载体，本文4吏用的"药学上可接受的载体"包括生理学上匹配的 任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收 剂等，药学上可接受的载体的实例包括一种或多种水、盐水、磷酸緩 冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合物，在大多数情况 下，最好所述組合物包含等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨 醇)或氯化钠.药学上可接受的栽体还可包括微量的辅助物质，例如润 湿剂或乳化剂、防腐剂或緩冲剂，它们延长抗体或抗体部分的保藏期 或有效性。本发明的抗体和各种抗体部分可掺入适用于胃肠外给药的药用 组合物中，优选抗体或抗体部分制备为含0.1-250 mg/m!抗体的注射溶 液。注射溶液可由装于燧石小瓶或琥珀小瓶、安瓿或预填充的注射器 的波体剂型或冻千剂型构成，緩冲剂可为pH 5.0-7.0 (最好pH 6.0)的L-组氨酸(1-50 mM),最好5-10 mM 。其他合适的緩冲剂包括但不限于琥 珀酸钠、杼檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用来以0-300 mM浓 度(液体剂型最好为150 mM)改善溶液的等渗性(toxicity).冻干剂型可 包含低温防护剂，主要为0-10%蔑糖(最好0.5-1.0%),其他合适低温防 护剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可包含增量剂，主要为1-10%甘露 醇(最好2-4%)。液体和冻干剂型可应用稳定剂，主要为l-50mML-蛋 氨酸(最好5-10mM)。其他合适的增量剂包括甘氨酸、精氨酸> 也可包 含0-0.05%吐温80 (最好0.005-0.01%).其他表面活性剂包括但不限于吐温20和BRIJ表面活性剂。在一个优选实施方案中，药用组合物包含约0.01 mg/kg-10 mg/kg 剂量的所述抗体。更优选所述抗体剂量包括每隔1周给予1 mg/kg， 或每周给予0.3 mg/kg。本发明的组合物可以为各种形式。这些形式包括例如液体、半固 体和固体剂型，例如波体溶液(例如注射溶液和输注溶液)、分散剂或 悬浮剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和对全剂。优选形式取决于预定的 给药模式和治疗用途，常见的优选组合物为注射溶液或输注溶液形 式，例如类似于用于其他抗体被动免疫接种人类的组合物，优选的给 药模式为胃肠外给药(例如静脉内、皮下、飽菱内、肌肉给药)。在一 个优选实施方案中，所述抗体通过静脉输注或注射给药。在另一个优 选实施方案中，所述抗体通过肌肉或皮下注射给药。通常治疗組合物在生产及储藏条件下必须是无菌稳定的。所迷组 合物可配制为溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其他适合高浓度药物 的有序结构。可如下制备无菌注射溶液：将需要量的所述活性化合物 (即抗体或抗体部分)以合适溶剂根据需要与以上列举的 一种成分或组 合物混合> 然后过滤除菌。一般如下制备分散剂：将所述活性化合物 掺入含有基本分散介质和以上列举的需要的其他成分的无菌溶媒中。 在用于制备无菌注射溶液的无菌冻千粉的情况下，制备的优选方法 是：真空干燥和喷雾干燥，由所述活性成分和任何其他需要成分的预 先过滤除菌溶液制得冻干粉，例如利用如卵磷脂包衣、在分散剂的情 况下维持需要的颗粒大小，以及利用表面活性剂可维持溶液的合适流 体性。通过4吏組合物中含有延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶可 延长注射組合物的吸收。尽管对于许多治疗应用来说，优逸的给药途径/给药模式为皮下注 射、静脉内注射或输注，但是可用本领域已知的各种方法给予本发明 的抗体和各种抗体部分。技术人员知道，给药途径和/或给药模式取决 于需要的^，在某些实施方案中，可应用避免所述化合物快速释放的载体制备所述活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片 和微包囊传递系统。可应用可生物降解、生物匹配的聚合物，例如乙 烯醋酸乙蜂酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备Robinson编著，Marcel Dekker， Inc., New York, 1978 .在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可利用例如惰性稀 释剂或可食同化载体口服给药。所述化合物(和其他成分，如果需要的 话)可装入硬壳或软壳明胶胶嚢、压制成片或直接掺入患者的食物中。 对于口服治疗性给药，所述化合物可掺混于赋形剂，而且以摄食片剂、 口颊片、锭剂、力交嚢剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米紙嚢剂等形式 使用。为了通过非胃肠外给药给予本发明化合物，可能必须用防止其时给予。其他活性化合物也可以掺入所迷組合物中„在某些实施方案中， 本发明抗体或抗体部分可与一种或多种其他治疗药物配制在一起和/ 或共同给予> 所迷药物可用于治疗EL-12活性起有害作用的疾病。例 如本发明的抗ML-12抗体或抗体部分可与 一种或多种结合其他靶的其 他抗体(例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)配制在一 起和/或共同给予，而且，本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以 上的前迷药物联合使用。这样的联合治疗可有利地使用较低剂量的所 给予的治疗药物，因此避免与各种单一治疗相关的可能毒性或并发 症。熟练医师知道，当本发明抗体用作联合治疗的一部分时，最好比 只给予患者所述抗体的剂量更低的剂量的抗体(例如通过应用联合治 疗可达到协同治疗它又使得可应用较低剤量的所述抗体而达到 需要的治疗效果)，白细胞介素12在与涉及免疫和炎症因素的各种疾病有关的病理 学中起重要作用.这些疾病包括^f旦不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、少年慢性关节炎、Lyme关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、 脊柱关节病、系统性红斑狼疮、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、炎症 性肠病、胰島素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮 痺、皮炎性硬皮病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反 应、与器官移植有关的急性或慢性免疫病、肉样瘤病、动脉硬化、弥 散性血管内凝血、Kawasaki病、Grave病、肾病综^sf正、慢性疲劳综 合征、Wegener肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾脏显微镜下血 管炎、慢性活动性肝炎、眼色素层炎、脓毒性休克、毒素性休克综合 征、脓毒病综合征、恶病质、感染性疾病、寄生虫病、获得性免疫缺 陷综合征、急性横贯性脊髓炎、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海 默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力 衰竭、心肌梗死、Addison病、I型散发性多腺体缺陷和II型多腺体 缺陷、Schmidt综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑形脱发、 血清反应阴性关节病、关节病、Reiter病、牛皮癣'法关节病、溃疡性 结肠炎关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关 性关节病、脊柱关节病、动脉硬化性疾病/动l^更化、特应性变态反应、 自身免疫性大疱病、寻常天疱裔、落叶状天疱疮、类天疱瘠、线性IgA 病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性 贫血、少年恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free Disease 、慢性粘膜M 念珠菌病、巨细胞性关节炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性 肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关性疾病、丙型 肝炎、普通可变性免疫缺陷(普通可变性低丙种球蛋白血症)、扩张性 心肌病、女性不育、卵巢功能衰竭、成熟前卵巢功能衰竭、纤维性肺 病、隐原性纤维性肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结締组 织病相关性间质性肺病、混合型结締组织病相关'f生肺病、全身性硬化 相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑 狼痴相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren病相关性肺病、 关节僵硬性脊推炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、舍铁血黄素沉着病相关性肺病、药物引起的间质性肺病、辐射性纤雉化、闭塞性细 支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴细胞侵润性肺病、感染后 间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典 型自身免疫性肝炎或狼瘙样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色棘皮症的B型胰島素抵抗、甲状旁腺功能^^下、与器官移植有关的急性免疫病、与器官移植有关 的慢性免疫病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞減少、肾病NOS、肾小球肾炎、显微镜下的 肾脏&&管炎、莱姆病、盘状狼疮红斑、特发性男性不育或NOS、精子 的自身免疫、多发性硬化(全部亚型)、胰乌素依赖型糖尿病、交感性 眼炎、继发于结締組织病的肺动脉高压、Goodpasture综合征、结节性 多动脉炎在肺部的表现、急性风湿热、类风湿性脊推炎、Still病、全 身性硬化、Takayasu病/动脉炎、自身免疫性血小板减少、特发性血小 板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿自身免疫 性甲状腺机能低下(Hashimoto病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能低 下、原发性粘液性水肿、晶状体性眼色素层炎、原发性脉管炎和白癜 风。本发明的人抗体和各种抗体部分可用来治疗自身免疫性疾病、尤 其是与炎症有关的疾病> 包括类风湿性脊推炎、变态反应、自身免疫 性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎，优选本发明抗体或其抗原结合部分用来治疗类风湿性关节炎、节 段性回肠炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病和牛皮癣，见VII部 分更详细的介绍'本发明的人抗体或抗体部分也可以与用于治疗自身免疫性疾病 和炎症性疾病的 一种或多种其他治疗药物一起卩吏用。本发明抗体或其抗原结合部分可单独或联合使用以治疗所迷疾 病，应该知道，本发明抗体或其抗原结合部分可单独使用或与其他物 质例如治疗药物联合使用，所迷其他药物由技术人员选定以达到预定 目的。例如所述其他物质可以是本领域已知的用于治疗本发明抗体所治疗疾病或病症的治疗药物。所述其他物质也可以是赋予所迷治疗組 合物有益特性的物质，例如影响所述組合物粘度的物质，还应该知道，本发明范围内的組合是用于其预定目的的組合。以 下列举的物质是为了i^明本发明而不是为了限制本发明。为本发明組 成部分的组合可以是本发明抗体和至少 一种选自以下所列的其他物 质。所述組合也可以包括一种以上其他物质，例如两种或三种其他物 质，只要这样的組合形成的組合物能够实现其预定作用。优选的組合为非类固醇抗炎药物(也称为NSAIDS),非类固醇抗炎药物包括诸如布洛芬的药物。其他优选组合有包括强的松龙的皮质类固醇；当联合本发明抗IL-12抗体治疗患者时，通过逐渐減少所需要的类固醇剂量可减少甚至消除应用类固醇的周知副作用，可与本发明 抗体或抗体部分联合用于治疗类风湿性关节炎的治疗药物的非限制性实例包括以下药物：抑制细胞闳子的抗炎药物(CSAID);其他的人细胞 因子或生长因子(例如TNF、 LT、 IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-7、 IL-S、 IL-15、 IL-16、 IL-18、 EMAP-II、 GM-CSF 、 FGF和PDGF)的抗 体或拮抗剂，本发明抗^本或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例 如CD2 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD25 、 、 CD30 、 CD40 、CD45 、 CD69 、 (B7.1)、 CD86 (B7.2)、 CD卯)或其配体(包括CD154 (gp39或CD40L))的抗体联合使用。优逸的治疗药物组合可在不同位点干扰自身免疫和随后的炎症 级联反应；优选的实例包括TNF拮抗剂，例如嵌^^人源化或人TNF 抗体、D2E7 (1996年2月9日申请的美国申请序号08/599,226)、 cA2 (Remicade加)、CDP 571 、抗TNF抗体片段(例如CDP870)和可溶性p55 或p75 TNF受体以及它们的衍生物、（p75TNFRIgG (EnbreFw)或 p55TNFRIgG (Lenerc邻t)、可溶性IL-13受体(sIL-13),此外还有TNPa 转化酶(TACE)抑制剂；同样IL-1抑制剂(例如白细胞介素1转化酶抑 制剂，例如Vx740或IL-lRA等)因为同样的原因可能也是有效的。其 他优选的組合包括白细胞介素11 、抗P7s和p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)。再一优选组合为自身免疫反应中的其他重要作用物，它们可与IL-12作用平行发挥作用、依赖于IL-12作用或与IL-12作用协同作 用；特別优选IL-18拮抗剂，包括IL-1S抗体或可溶性IL-18受体或IL-18 结合蛋白，已经证实，IL-12和IL-18相互重叠但是具有不同的作用， • 二者的拮抗剂組合可能是最有效的。叉一优选組合是非消耗性抗-CD4 抑制剂，另外的其他优逸組合包括协同刺激途径CD80 (B7.1 )或CD86 (B7,2;)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与药物联合使用，所述药物 例如甲氨蝶呤、6-MP 、石危哇噪呤、柳氮磺吡淀、美沙拉"秦、奥沙拉 嗪氯喹啉/羟氯喹啉、青霉胺、金疏苹果酸盐(肌肉注射和口服)、硫唑 嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇类（口服、吸入和局部注射)、p-2肾上腺 素受体激动剤(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤类(茶碱、氨 茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和氧托铵、环孢菌素、 FK506 、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、 皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、A良苷激动剂、抗血栓 形成剂、补体抑制剂、肾上At素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFa 或IL-1信号转导的药物(例如IRAK、 NHC、 IKK、 p38或MAP激酶 抑制剂)、IL-1 p转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s 、 p-选择蛋白糖 蛋白配体(PSGL)、 TNFa转化酶(TACE)抑制剂、T细胞信号转导抑制 剂如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌吟、6-巯 基嚆呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的 衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM)和p55TNPRIgG (Lenerc邻t)、 sIL-lRI 、 sIL-lRII、 sIL-6R 、 可溶性EL-13受体(sIL-13》和抗炎细胞因子(例如IL-4 、 IL-10 、 IL-11、 IL43和TGFp),优选组合包括曱氨蝶呤或来氟米特，在中度或 重度类风湿性关节炎的情况下优选环孢菌素.与本发明抗体或其抗体部分联合用于炎症性肠病的治疗药物的 非限制性实例包括以下药物：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇类；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；At唑嘌呤; 甲硝哇；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂； 血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1(3单克隆抗体；抗IL-6单克 隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡嚏基咪唑化合物；其他人 细胞因子或生长因子(例如TNF、 LT、 IL-1、 IL-2、 IL-6 、 IL-7 、 IL-S、 IL-15、 IL-16、 IL-1S、 EMAP-II、 GM-CSF、 FGF和PDFG) 的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分 子(例如CD2 、 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD25 、 CD2S 、 CD30 、 CD40、 CD45、 CD69、 CD90)或其配体的抗体联合使用，本发明抗 体或其抗原结合部分也可以与各种药物联合使用，所述药物例如为甲 氨蝶p令、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、 NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺 苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上J^素能药物、干扰促炎 细胞因子如TNFct或IL-l信号转导的药物(例如IRAK:、 NIK、 IKK、 p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1|3转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、 p-逸棒蛋白糖蛋白配体(PSGL)、 TNTFa转化酶抑制剂、T细胞信号转 导抑制剂如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺"比咬、硫唑噤.呤、 6-巯基噤吟、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它 们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-lRl 、 sIL-lRII 、 sIL-6R 、可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4 、 IL-10、 IL-ll、 EL-13和TGFp),可联合抗体或抗原结合部分治疗节段性回肠炎的治疗药物的优 选实例包括以下药物：TNF拮抗剂，例如抗TNP抗体、D2E7 (1996 年2月9日申请的美国申请序号08/599,226)、 cA2 (Remicade™)、 CDP 571 、抗TNF抗体片段(例如CDP870)、 TNFR-Ig构建物(p75TNFRIgG (Enbrel加)和p55TNFRIgG (Lenercept)、抗P7s 、 p-选择蛋白糖蛋白配 体(PSGL)、可溶性EL-13受体(sIL-13)和PDE4抑制剂.本发明的抗体 或其抗原结合部分可与诸如布地奈德和地塞米^^的皮质类固醇类联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与以下药物联合使用：例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉秦，而且也可以与干扰促炎因 子(例如IL-l)的合成或作用的药物联用，例如IL-lp转化酶抑制剂(例 如Vx740)和IL-lra ,本发明抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信 号转导抑制剂联用，例如酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明抗体 或其抗原结合部分可与IL-ll组合使用。可与本发明抗体或抗体部分联合治疗多发性;更化的治疗药物的 非限制性实例包括以下药物：皮质类固醇类；强的柏、龙；甲基强的松 龙；好u唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨蝶"令；4-氨基吡啶；替扎 尼定；干扰素-J31a (Avonex; Biogen); 干扰素-plb (Betaseron; Chiron/Berlex); Copolymer 1 (Cop-l; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);高压氧；静脉免疫球蛋白；克拉立平(clabribine);其 他人细胞因子或生长因子(例如TNF 、 LT、 IL-1 、 IL-2 、 IL-6 、 IL-7、 IL-8、 IL-15、 IL-16、 IL-18 、 EMAP-II 、 GM-CSF 、 FGF 和PDFG)的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细 胞表面分子(例如CD2 、 CD3 、 CD4 、 CDS 、 CD25 、 CD28 、 CD30、 CD40、 CD45、 CD69 、 CD80 、 CD86 、 CD90)或其配体 的抗体联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与各种药物联 合使用，所述药物例如为甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506 、雷帕霉素、 霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的 松龙、磷酸二酯斷中制剂、腺普激动剂、抗血松形成剂、补体抑制剂、 肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFa或信号转导的药物 (例如IRAK、 NIK、 DCK、 p38或MAP激酶抑制剂)、IL-ip转化酶 抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、 p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、 TACE 抑制剂、T细胞信号转导抑制剤如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、 柳氮磺吡唳、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可 溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受 体、sIL-lRI、 sIL-lRII、 sIL-6R、可溶性IL-13受体(sIL-13》和抗炎细胞因子(例如IL-4、 IL-IO、 IL-13和TGF(3)。可与本发明抗体或其抗原结合部分联合治疗多发性硬化的治疗 药物的优选实例包括干扰素-p如干扰素J31a和干扰素plb ; Copaxone,皮质类固醇类、IL-1抑制剂、TNF抑制剂和抗CD40配体 和CD80的抗体，本发明的药用组合物可包含"治疗有效量"或"预防有效量"的 本发明抗体或抗体部分，"治疗有效量"是指以必要的给药剂量和时 间周期达到需要的治疗效果的有效量。抗体或抗体部分的治疗有效量 可随各种因素(例如个体的疾病状态、年龄、性別和体重）以及抗体或 抗体部分在个体激发需要反应的能力而变化。抗体或抗体部分的治疗 有效量也可以为抗体或抗体部分的治疗有益作用超过其任何毒性或有 害作用的剂量，"预防有效量"是指以必要的给药剖量和时间周期达 到需要的预防效果的有效量。 一般来说，因为预防有效量是在患者患 病前或疾病早期阶段使用，所以预防有效量低于治疗有效量。可调整给药方案以获得最佳需要反应(例如治疗反应或预防反 应)。例如单次大剂量给药，可随时间给予数个分剂量，或者可根据治 疗情况的要求相应减少或增加剂量。特別优选配制为剂量单位形式的 胃肠外组合物，以便于给药而且剂量均匀，本文卩吏用的剂量单位形式 是指根据待治疗的哺乳动物对象的单位剂量调制的物理独立单位；每个单位含有预计产生需要治疗效果的预定量活性化合物和需要的药用 载体。本发明的剂量单位形式的规格取决于或直接取决于(a)活性化合 物的独特特性和需要达到的具体治疗效果或预防效果，以及(b)配制 技术固有的限制 > 例如活性化合物在各个个体的治疗敏感性。本发明抗体或抗体部分治疗或预防有效量的典型非限制性范围 为0.01-20 mg/kg,更优选1-10 mg/kg,甚至更优选0.3-1 mg/kg。需 要注意的是，剂量值可随需要緩解的病症类型和程度而变化，进一步 需要指出的是，对于任何具体对象，具体给药方案应该在不同时间根 据个体需要和管理或监控所述组合物使用的人员的专业判断而进行调整，本文给出的剂量范围^f义仅是举例说明，而不是限制要求保护的组 合物的范闺或实施。VIL本发明抗体的使用因为本发明抗hlL-12抗体或其部分能够结合h!L-12 ,所以可应用 常规克疫测定，例如酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria) 或组织的免疫组织化学，将其用来检测h!L-12(例如生物样品，例如血 清或血浆)„本发明提供检测生物样品中的hlL-12的方法，包括使生物 样品与本发明抗体或抗体部分接触，以及检测与ML-12结合的抗体(或 抗体部分)或非结合的抗体(或抗体部分)，由此检测生物样品中的hIL-12 ,应用有助于检测结合抗体或非结合抗体的可检测物质直接标记或 间接标记抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发 光物质和放射性物质。合适的酶实例包括辣根过氧物酶、碱性磷酸酶、 (3-半乳糖苷酶或乙酰胆^喊酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生 物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞 形酮、荧光素、异s克氰酸荧光素、罗丹明、二氯三噢胺荧光素、丹磺 酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；合适放射性物质的实 例包括1251、 1311、 35s或3h,作为标记抗体的替代方法，可应用以可检测物质标记的rML-12 标准品和非标记抗hIL-12抗体通过竟争性免疫测定检测生物体液中的 hIL-12 .在该测定中，混合生物样品、标记的rML-12标准品和抗ML-12 抗体，测定标记的rh!L-12标准品结合非标记抗体的量.生物样品中的 hIL-12量与结合抗hIL-12抗体的标记rhIL-12标准品量成反比。本发明的Y61和J695抗体也可以用来检测非人类物种来源的 IL-12 、尤其是灵长类来源的IL-12 ,例如Y61可用来检测弥猴和恒河 猴的IL-12. J695可用来检测弥猴、恒河猴和狒狒的IL-12 。然而， 抗体既不与小鼠IL-12交叉反应也不与大鼠IL-12交叉反应(参见实施 例3, F小节).本发明的抗体和抗体部分能够在体外(参见实施例3)和体内(参见实施例4)中和hlL-12活性。因此，本发明的抗体和抗体部分可用来抑 制IL-12活性，例如抑制含有ML-12的细胞培养物、人类对象或其他 具有本发明抗体与之交叉反应的il-12的哺乳动物对象(例如灵长类， 诸如狒狒、弥猴和恒河猴)的IL-12活性，在一个优选实施方案中，本 发明提供中和人IL-12活性和至少一种其他灵长类IL-12 、但是不中和 小鼠IL-12活性的分离的人抗体或其抗原结合部分，所述灵长类1L-12 选自狒狒IL-12 、狨IL-12 、黑猩猩IL-12 、弥猴IL-12和恒河猴IL-12 。 所述IL-12优逸为人IL-12 。例如对于含有或怀疑含有ML-12的细胞 培养物，可在所述培养基中加入本发明抗体或抗体部分，抑制培养物 中的ML-12活性。在另一个实施方案中，本发明提供在患有其中IL42活性有害的 疾病的患者抑制IL-12活性的方法。IL-12参与了各种各样的疾病的病 理生理学(Windhagen等，（1995) J. £邵.Med 182: 1985-1996; Morita等 (1998)v4w/?"/to fl"d灿ewMoto亂41: 306-314; Budit等，（1996) C//". 5;cp. /mw朋o/. 103: 347-367; Fais等(1994)丄/"f^/e尸o" 14: 235-238; Pairoiichi等，（1997)^«, J. /^/i. 150: 823-832; Monteleone等，（1997) G。Wroe"&ra/ogy. 112: 1169-1178和Berrebi等，（1998)爿肌J. _P"A. 152: 667-672; Parronchi等(1997)ylm.«/. 150: 823-832)。本发明提供在 患有这种疾病的患者抑制IL-i2活性的方法，该方法包括给予所述患 者本发明抗体或抗体部分，使得所述患者体内的IL-12活性受到抑制。 最好是所述EL-12为人IL-12,所述患者为人类患者。或者，所述患者 可以是表达本发明抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物，甚至所述 患者可以是导入了 HL-12的哺乳动物(刺如通过给予ML-i2或表达 UL-12转基因),本发明抗体可以因为治疗目的而给予人类患者(下文进 一步讨论).此外，本发明抗体可给予表达所述抗体与之交叉反应的 IL-12的非人类哺乳动物，其目的是兽医学目的或作为人类疾病动物模 型。关于后者，逸样的动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效能(例如试验给药剂量和给药疗程)。本文使用的术语"其中IL-12活性有害的疾病"包括其中已经证实所述病症患者体内存在的IL-12是或怀疑是与所述病症的病理生理 学有关或者为引起所述病症恶化的因素的疾病和其他病症。因此，其 中IL-12活性有害的病症是预期抑制IL-12活性可緩解所述病症的症状 和/或发展的病症。这类病症的证据是例如所迷病症患者的生物体液中 的IL-12浓度升高(例如所述患者的血清、血浆、滑液等中的IL-12浓 度升高)，所述IL-12浓度可用例如如上所述的抗DL-12抗体检测。关 于其中IL-12活性有害的病症有许多实例。在一个实施方案中，所述一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可用于生产治疗本文所 述疾病或病症的药物.下面进一步讨论本发明抗体和抗体部分在治疗 几个非限制性的具体病症中的应用；白细胞介素i2在诸如类风湿性关节炎的炎症性疾病中具有作 用.在类风湿性关节炎患者的滑液中已经检测到诱导型IL-12p40信 使，而且证实IL-12存在于类风湿性关节炎患者的滑液中(参见例如 Moiita等，（1998) Zw/mto i?/2ewm"tow虹:306-314)。发现IL-12阳 性细胞存在于类风湿性关节炎滑膜的内层下。本发明人抗体和抗体部 分可用来治疗例如类风湿性关节炎、少年类风湿性关节炎、Lyme关 节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎和痛风性关节炎。 一般来说，所述 抗体或抗体部分系统性给药，尽管对于某些病症来说，局部给予所述 抗体或抗体部分可能是有益的。本发明抗体或抗体部分也可以与一种 或多种其他用于治疗自身免疫性疾病的治疗药物一起给予，在用于类风湿性关节炎的胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠模型中，在 关节炎之前用抗IL-12 mAb (大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体，C17.15) 处理小鼠非常明显地抑制疾病的发生以及降低疾病的发生率和严重程度。发生关节炎后早期给予抗IL-12 mAb治疗降低关节炎严重程度， 但是发生疾病后晚期用抗IL-12 raAb治疗小鼠对疾病严重程度的影响 最小。及，逸遂敏靡《白细胞介素-12也在炎症性肠病节段性回肠炎具有作用。节段性 回肠炎患者的肠粘膜的IFN-y和IL-12表达增高(参见例如Fais等，（1994) 丄/"fe《e尸o" 7?" M: 235-238; Paironchi等，(1997) ^州er.丄雄： 823-832; Monteleone等，（1997) C7o^TO朋fero/ogy JJ1: 1169-1178; Berrebi等，（1998)』伤ef. 尸加/w/. Ji2: 667-672》已经证实抗IL-12抗 体抑制小鼠结肠炎模型疾病，所述模型例如为TNBS诱导的结肠炎 IL-12失效小鼠，以及抑制最近的IL-10失效小鼠疾病，因此，本发明 抗体>和抗体部分可用于治疗炎症性肠病，C.錄颜必白细胞介素-12在多发性硬化的病理生理学中为关^:介导物。在多发性」現化患者的病变部位证实了诱导型IL-12 p40信^使或IL-12本身 的表达(Windhagen等，（1995)丄£cp. Med巡：1985-1996， Drulovic等， (1997)丄Afewra/. HI: 145-150),慢'f鍵行性多发性硬化患者的IL-12循环水平升高。研究多发性硬化患者的T细胞和抗原提呈细胞(APC) 揭示，自我保持的各个系列的免疫'tM目互作用为进行性多发性硬化发 生Thl型免疫反应的基础，T细胞分泌的IFN-y增加导致APC产生的 IL-12增加，这可长时间维持产生慢性状态的TM型免疫活化和疾病的 循环(Balashov等> (1997) Ato/.爿cW. 24: 599-603)。采用多发 性硬化的小鼠和大鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)模型研究了 IL-12在 多发性硬化患者中的作用。在多发性硬化的小鼠复发緩解型EAE模型 中，用抗IL-12 mAb预先处理延迟麻痹以及降低临床评分，在麻痹高 峰或随后的复发期用抗IL-12 mAb治疗降低临床评分.因此，本发明抗体或其抗原结合部分可用来緩解人类患者多发性硬化的相关症状， D.腐房素汆濕耍^^求病白细胞介素"2为胰乌素依赖型糖尿病(IDDM)的重要介导物。通 过给予IL-12在NOD小鼠诱导IDDM ,而抗IL-i2抗体对IDDM过继 转移模型具有保护作用。发病早的DDDM患者常常出现所谓的"蜜月 期"，在"蜜月期"中保有部分残留胰岛细胞功能。这些残留胰岛细 胞产生胰島素，而且调节血糖水平比给予胰島素更好。用抗IL-12抗 体治疗这些早期发病的患者可进一步防止破坏胰岛细胞，由此维持内 源性来源的胰島素。£付库白细胞介素-12为牛皮癣的关l建介导物。牛皮痺包括与TH1型细 胞因子表达类型有关的急性和慢性皮肤病变，（Hamid等（199'6) J. Allergy Clin. Imimmol. 1: 225-231; Turka等(1995) Mol. Med. 1: 690-699)。在患病的人体皮肤样品中检测到IL-12 p35和p40 mRNA 。由此， 本发明的抗体或其抗原结合部分可用来緩解诸如牛皮癣的慢性皮肤 病.通过以下实施例进一步阐明本发明，而不能将其解释为以任何方 式限制本发明，在整个本说明书中引用的所有引用文献，包括参考文 献、授予的专利和公开的专利申请，其内容均通过引用特别结合到本 文中。进而应该知道，在此所附的所有表格(参见附件A)内容均引用性 纳入本发明，附件A* 1按诚Kabatiii号的VH3家族种系氨基酸序列(所包括的Joe VH用于比较）5"t::;; H x:: S " " - S s c " -jt u s >; TT DC G " D " v w_______"c"______"sm"tco WrifC"，r" s POrt入）l m s " t>om n » " w t)t c " Rf" S It x H S " LOKK " " Y M C "p S ro。 S " T W WWW "KTf »T AV7 ITC " 共FT lSJ*OOS KWniT乙OKH t mTCOTAVTVCTT frl"， IShDttSRJtT乙YL6tut， 》i •、--------OVQLV""bYYMJv，、-w »-----S1f AtfM"HQ""""".S7DCSWK"k&S VUGft J*T1 "。W " "T " LOrtft S t'AKCt) t " I" HJT"SP&"KHT"LOMW""""-------2藝1薩9323.5 络滞齿滅110/35§〖翁_table see original document page 0

表l按照Kabat编号的VM家族种系氨基S^列(所包括的3oeVL用于比较)table see original document page 120

转滔 * 被112/35951

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表4.在过量游离IL-12p40存在下的中和活性 table see original document page 131

实施例实施例1:分离抗IL-12抗体 A.筛选IL-12结合抗体通过筛逸3个不同的scFv噬菌体展示文库分离抗ML-12的抗体， 所速噬菌体展示文库利用从人扁挑体(称为scFv 1)、扁挑体和外周血淋 巴细胞(PBL)(称为svFv 2)、以及骨號来源的淋巴细胞(称为BMDL)获 得的mRNA的人VL和VH cDNA制得.Vaughan等(1996) Atowe 说of"/2. 14:309-314中介绍了文库的构建以及筛逸方法，应用所述各种抗原即人EL-12 p70亚单位、人IL-12 p40亚单位、 嵌合IL42(小鼠p40/人p35)、小鼠EL"12、生物素化人IL-12和生物素 化嵌合IL-12筛选所迷文库，应用标准方法使所述抗原包被在免疫试 管中，从而选捧BL-12特异性抗体(Marks等，（1991) J. Mol. Biol, 222:58卜597)。用IL-12或生物素化IL-12篩选scFv文库2 ,产生大量IL， 12特异性结合物。根据BstM酶性消化类型确定而且经DNA测序证 实，选择5个不同的克隆类型。主要克隆类型有VHDP58/VLDPL11 、 VHDP77/VLDPK31 、 VHDP47/VL和VHDP77/VLDPK31 ,它们均能 够识别IL-12的p40亚单位。以IL-I2 p70筛选BMDL文库获得3个不同克隆类型.发现其中2 个克隆为交叉反应克隆。对主要克隆测序，而且该克隆由 VHDP35/VLDP组成。该克隆识別IL-12的p40亚单位。用IL-12 p70 筛选svFv文库1没有获得特异性IL-12抗体，为了鉴定优选结合p70异源二聚体或iL-12的p53亚单位而不是 p40亚单位的IL-12抗体，《吏用联合的scFv 1 + 2文库以及BMDL文库' 为了选择识別p70异源二聚体或p35亚单位的IL-12抗体，使噬菌体 文库预温育，并在游离p40存在下进行选择。对分离克隆的测序显示9 个不同抗体谱系。通过"micro-Friguet "滴定法进一步分析亚单位优 逸性。以ELISA中捕获生物素的IL-12滴定含有scFv的上清液并测定 ED50 。产生50% ED的seFv浓度与浓度逐渐增加的游离p70或p40 (抑 制剂)预温育。检测生物素IL-12包被板的ELISA信号的减少，并对游 离p70或p40浓度作图。这为p70和p40的各克隆提供IC50。如果两 种亚单位的滴定过程一致，则svFv既结合p40又结合p70 .滴定过程 的任何变化说明p70优选于p40的程度，B.对IL42的抗体谱系特异性的亲和力成熟6Joe9)测试各克隆抑制IL-12在IL-12受体结合测定(称为RBA)中结合其 受体的能力> 以及测试其抑制IL-12诱导的PHA刺激的人体母细胞增 殖(PHA测定)的能力，如实施例3所述，克隆Joe9在RBA和PHA测 定中的IC5o值均最低，两种测定的IC5o值均为1 x 1(T6M.另外，Joe 9重链可变区(VH)的变化数与从VBASE数据库鉴定的最接近的种系 序列C0S-3相比最小.表1(见附件A)显示VH3家族种系序列，其中COS-3为成员之一，以及VJ家族种系序列各成员。所以，选择亲和力成熟的Joe 9 。 Joe9野生型(Joe9 wt)抗体的VH和VL的氨基酸序列 示于图1A-1D,为了提高Joe 9的亲和力，制备各种突变的重链和轻链二者的互 补决定区3(CDR3)。应用重链CDR3(称为"H3 ")或轻链CDR3 (称 为"L3 ")特异性简并寡核苷酸通过定点PCR诱变产生CDR3变异体， 在各CDR3中平均存在3种-咸基取代(称为"掺入(spike)")。应用含有 全部.4种核苷酸的随机混合物的简并重链寡核苷酸：C)(A)(C)(T)GGTCGTACAGTAATA35 (SEQ ID NO: 580)和寡核芬酸 pUC反向Tag: GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEQ ID NO: 581 )对重链CDR3进行PCR诱变，产生所有组 成成分的重链CDR3突变体。应用Joe 9反向寡核普酸(5'TGG GGC CAA GGG ACA3， （SEQ ID NO: 582)和fdteteseq 24+21寡核苷酸(5，-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT-3' (SEQ ID NO: 5S3)扩增亲代轻乱两种PCR产物之间的互补性用来驱使两种片段在PCR装配反应 退火，用pUC反向Tag (SEQ ID NO: 5S1)和fdTag 5，-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3， （SEQ ED NO: 584)扩增全长重组svFv文库，用含有 全部 4种核香酸的混合物的轻链寡核苷酸：(T)(G)(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3， （S£Q ID NO: 5S5)和Jfoe 9反向寡核苷酸：5，TGG GGC CAA GGG ACA3， （SEQ ID NO: 586)对轻链进行PCR诱变，产生所有组成成分的轻链CDR3 突变体，应用pUC反向Tag (SEQ ID NO: 581)和HuJH3FOR寡核苷酸 5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3， （SEQ ID NO: 587)扩增亲代 重链，两种PCR产物之间的亙补性用来驱使两种片段在PCR装配反 应退火，用反向Tag GAC ACC TCG ATC AGC G (SEQ ID NO: 3SS)和HuJX 2-3 FOR NOT寡核苦酸5,GAG TCA TTC TC<3 ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC3, (SEQ ID NO: 5S9)扩 增全长重組svFv文库，用1 nM生物素化IL-12选择重链CDR3突变体，用含7 nM浓度 的游离IL-12或p40的PBS于室温下洗涤l小时。利用噬菌体ELISA 分析克隆，并应用低密度IL-12芯片以BIAcore动力学结合研究测试结 合IL-12的克隆(参见实施例5中的BIAcore分析方法)。 一般来说， BIAcore分一斤利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)通 过表面胞质团共振(SPR)测量配体(固定在生物传感器基体上的重组人 IL-12)和分析物(抗体溶液)之间的实时结合作用。该系统利用SPR的光 学特性检测葡聚糖生物传感器基体中蛋白浓度变化，蛋白质与已知浓度的葡聚糖基体共价结合。通过葡聚糖基体注射抗体，注射抗体和固 定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果是SPR信号改变，SPR信号变化记录为共振单位(RU),而且沿传感图的y轴随着时 间而显示.为了测定解离速率(offrate，k。ff)、结合速率(onrate，k。n)、结 合速率常数（Ka)(association rate constant)和解离速率常数 (Kd)(dissociation rate contstant),应用BIAcore动力学评价软件(2.i版 本》以中和测定分析证实k。ff速率改善的克隆，中和测定包括抗体对 IL-12结合其受体的抑制作用(RBA测定)、对IL-12诱导的PHA刺激的 人母细胞增殖的抑制作用(PHA测定)和对IL-12诱导的人母细胞产生y 干扰素的抑制作用(IFNy测定)。关于重链CDR3掺入克隆70-l至70-13的中和测定的解离速率和/或IC5Q值的总结见表2(参见附件A),克 隆704的kdr速率比亲代Joe9克隆更佳，而且具有2.0 x 1CT?M的最 低ICso值.因此，逸择克隆70-l转化为完整IgGl 。应用1 nM生物素EL-12选择轻链CDR3突变体，用舍7 nM浓度 的游离p40的PBS洗涤，利用噬菌体ELISA分析克隆，并应用低密度 IL-12芯片以BIAcore结合分析测试结合EL-12的克隆，以中和测定测 试解离速率优于亲代joe 9克隆的克隆，所述中和测定测定对EL-12受体結合的抑制作用或对PHA母细胞增殖的抑制作用。关于轻链CDR3突变克隆78-34至79-1中和测定的解离速率和/或1(350值的总结见表 2(参见附件A)。根据k。a-速率，与亲代Joe9相比，克隆78-34和78-35的k。ff速率 提高。选择其中2个克隆对重链突变体进行組合分析。C. 組合克隆具有最佳结合特性的突变轻链和重链克隆用于组装scFv 。通过 PCR重叠延伸并连接(pull-throug)如上所述的突变VH和VL区段而组 合效价特性改善的突变克隆組合。组合重链突变体(70-2 、 70-13和 70-1)和轻链突变体(78-34 、 78-35和79-1)产生克隆101-14至26-1 , 如表2所示(参见附件A)。这些克隆中和测定的koff速率和/或ICso值见 表2。BIAcore结合分析鉴定了克隆101-11 >它由重链CDR3突变克隆 70-1和轻链CDR3突变克隆78-34组合产生，其解离速率为0.0045 s人 此k。ff速率分别与重链CDR3突变体克隆70-l (0.0134 s")或轻链CDR3 突变克隆78-34(0.0164 s")相比显著改善。此外，克隆101-1 l的中和测 定显示显箸改善。.因此，逸择克隆101-11进行如下所述的亲和力成熟，D. 克隆101-11的亲和力成熟克隆101-11的进一步亲和力成熟包括应用掺入寡核苷酸引物对 101-11的重链和轻链CDR3二者进行重复循环的PCR诱变。以降低浓 度的生物素化IL-12 (bio-EL-12)选择克隆。应用BlAcore结合分析和 RBA 、 PHA中和测定评价所述突变克隆的结合特性.克隆136-9至 170-25的k。ff速率和/或IC5Q值见表2(参见附件A)。克隆103-14证实 受体结合测定和PHA母细胞测定二者的IC5。值均提高，克隆103-14 还证实koff速率低，因此选择它进行进一步的亲和力成熟.E,制备和选择克隆103-14轻链CDR3的随机文库应用如下概述的3个不同文库于3个节段系统性随机化克隆 103-14的轻链CDR3 (QSYDRGFTGSMV (SEQ ID NO: 590》，其中X 由序列NNS的随机密码子编码，N为任何核苷酸，而S为脱氧胞嘧 啶或脱氧胍。L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEQ ID NO: 591) L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEQ ID NO: 592) L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEQ ID NO: 593)对克隆103-14的全部3个轻链CDR (称为L3.1 、 L3.2和L3.3) 进行随机诱变。不突变克隆103-14的重链CDR3 (称为H3)。构建基于 克隆103-14的4个随机文库(H3和L3.1 、 L3.2 & L3.3),使其接受各 种各样的选择条件，包括应用有限的抗原浓度和存在或缺乏过量游离 抗原(p40和p70).主要用BIAcore从选择物(克隆73-Bl至99-G11)筛 选产品，间或应用RBA进行筛选，结果示于表2(参见附件A)。对克隆103-14的轻链CDR进行随机诱变获得克隆Y61 ,与亲代 克隆103-14相比，其ICso值明显改善，选棒Y61转化为完整IgGl 。 按照PHA测定，完整Y61-IgGl的ICw值约130 pM , ICso值不受游 离p40过量50倍摩尔的影响，证实游离p40不与Y61抗IL-12抗体交 叉反应，因而未减少抗体结合异源二聚体。Y61重链可变区和轻链可 变区的全长序列如下所示.Y61重链可变区^列 C股H1QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYX3MH WVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKT CDR H3HGS抑N WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 23)Y61轻链可变区肽序列QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLUY GNDQRPS GV舰FSGSKSGTSASLAJTGLQAEDEADYYC QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG (SSQ 1D XO:24)按照Kabat定义指示CDR残基，实施例2 : Y61超突变位点和接触位点的突变通常采用噬菌体展示方法对亲和力改善的重組抗体进行选择。可 如下达到此目的：通过随机突变组合的CDR残基，获得包含不同序列 的单链抗体的大文库。一^i艮据其抗体抗原反应达到平衡的能力选才奪 亲和力改善的抗体。但是，当Y61 scFV在噬菌体表面表达并与IL-12 温育时，未能找到允许系统达到正常抗体抗原平衡的选择奈件，scFV-噬菌体^果持与IL-12结合，推测是由于非特异性作用所致，因为純化 Y61 scFv显示正常解离动力学。因为Y61不能应用噬菌体展示亲和力 成熟的常规方法(即制备文库以及通过诱变多CDR残基进行选择)，所 以开发了新的茉略，其中使各个CDR位点突变，该策略涉及逸择用于突变的合适CDR位点，而且基于養定和选 择为优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的氨基酸，接触 位点定义为当抗原与抗体反应时与抗原接触的概率高的残基，而超突 变位点定义为认为在抗体体内亲和力成熟过程中发生体细胞超突变的 概率高的残基，优选选择性诱变位点为既是接触位点又是超突变位点 的CDR位点，应用实施例1所迷的方法已经优化Y61抗体的CDR3 区，因此，难以应用噬菌体展示选择方法进一步改进位于抗体结合位 点中心的区城.通过去除不利的抗原抗体接触或工寿呈枸建新的接触使 CDR3区外面的潜在接触位点突变，可进一步改善活性，认为是抗原接触点的Y61的氨基酸残基和体内亲和力成熟过程中的体细胞超突变部位的CDR位点示于表3 (参见附件A)。对于Y61的 亲和力成熟，选择CDR3外面的15个残基、L3环中的3个残基和H3 环中的5个残基进行PCR诱变。使Y61 scFv基因克隆入pUC1.19 (Sfi)质粒载体中，以用于诱变， 以P逸杌密码子设计合成寡核香酸，以使各个逸定位点突变。经PCR诱 变后，对少数克隆(约24个)测序，并用宿主细胞例如细菌、酵母或哺 乳动物宿主细胞表达。纯化表达抗体，用BIAcore系统测定k。ff。.然后 用中和测定测试解离速率改善的克隆(与Y61相比)。对其他CDR位点 重复该过程，将证实中和活性改善的各个突变组合，以获得中和效价 更高的抗体。为了提高中和效价突变的Y61 CDR位点和各位点的相应氨基酸 取代示于图2A-2H。给出了 BIAcore分析测得的解离速率。这些解离 速率示于每个表右侧的直方图中。位点H30、 H32、 H33、 H50 、 H53 、 H54 、 H58 、 H95 、 H97、 HlOl、 L50、 L92 、 L93的取代结果证实，所检测的所有氨 基酸取代均产生解离速率比Y61低的抗体.发现位点H52、 L32和 L50中只有一个氨基酸取代改善了 Y61的解离速率> 所有其他改变均 对活性产生不利影响。对于L50, Gly4Tyr这个单一的改变明显提高 (5-10倍）Y61的中和效价，结果证实，这些位点对Y61的活性是重要 的，说明大多数情况下噬菌体展示能够逸择最佳残基.但是，在位点 H31 、 H56 、 L30和L94发现数个取代改善Y61的解离速率，说明这 些位点对抗原结合也是重要的，尽管噬菌体展示方法不能选择这几个 最佳残基，对Y61的接触位点和超突变位点进行选择性突变鉴定了轻链 CDR2中的氨基酸残基L50和轻链CDR3中的残基L94,它们均提高 Y61的中和能力，这些突变的組合产生累加效应，获得抗休J695,其 中和能力明显增强。J695重链可变区序列和轻链可变区序列的全长序列ip下所示。J695重链可变区it亭列CDRH1QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGF丁FS SYGMH WVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSMKYYADSVKGf RFTISRDNSKNTLYLOM"NSLRAEDT/WYYCKT CDR H3HGSHJ)N WGQGTMVTVSS,師0:3〗）J695轻链可变区肽序列 C孤L1QSVLTQPPSVSGAPGQRV丁fSC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLtY CDR L2YNDQRPS GVPDRFSGSKSG丁SASLA1TGL(?AEDEADYYC QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG (SEQ ID NO: 32)按照Kabat定义指示CDR残基，关于重链和轻链可变区序列对比的总体情况示于图1A-ID,说明 从Joe9至J695的克隆的谱系tt。 CDR和残^&按照Kabat编号，实施例3 :抗hIL-12抗体的功能活性为了检测本发明的人抗人IL-12抗体的功能活性，所述抗体用于 数个检测抗体抑制EL-12活性的能力的检测法中.A.制备PHA活化的人淋巴母细胞按照Current Protocols in Immunology, Unit 7.1 ,斤述> 通过Ficoil-Hypaque梯度离心（1500 rpm, 45分钟）从健康供者收集白细胞 (leutopac),从白细胞再分离人外周血单核细胞(PBMC)。收集位于血 液水溶液和淋巴细胞分离液交界面的PBMC ,用磷酸緩冲盐水(PBS) 以1500 ipm离心15分钟洗涤3次，以去除Ficon-Paque颗粒。然后4姿照Current Protocols in Immunology, Unit 6.16所述，活4b PBMC形成、淋巴母细另包。将洗涤后的PBMC以0.5-1 x io6细胞/ml重 悬浮于添加0.2% (v/v) PHA-P (Difco, Detroit, MI)的RPMI完全培.养基 (RMPI 1640培养基，10。/。胎牛血清(FBS)、 100 U/ml青霉素、100 pg/inl链霉素)中，在5W二氧化碳大气中于37'C培养4天。4天后， 用加有0.2% (v/v) PHA-P和50 U/ml重组人IL-12的RPMI完全培养基 以i : 1体积将细胞培养物一分为二，通过使携带人IL-12 cDNA的表 达载体转染入COS细胞(参见Kaufeian等，（1991) Wwc/eZc^"'血19, 4484-4490)产生重组人IL-12 ,按照PCT/US96/01382所述纯化重组人 IL-12,然后〗吏细胞培养物再培养1-3天。收获PHA母细胞，用RPMI 完全培养基洗涤2次，用95% FBS 、 5% DMSO以10 x 106细胞/1111 冻存细胞，在存在IL-2下培养1天后收集用于IL-12受体结合测定(参见B部 分)的PHA母细胞，而在存在IL-2下培养3天后收集用于PHA母细胞 增殖测定(参见c部分)和y干扰素诱导测定(参见D部分)的pha母细 胞.受体结合测定如下分析抗IL-12抗体抑制放射性标记的IL-12结合PHA母细胞 上的IL-12受体的能力。使各种浓度的抗IL-12抗体与50-100 pM 125I-hlL-12(应用Bolton-Hunter标记方法制备碘化hJL-12 ,比活20-40 mCi/mg， NEN-Dupont)在结合緩冲液(RPMI 1640 , 5%FBS, 25 mM Hepes pH 7.4)中于37 。C预温育1小时.如上所迷分离PHA母细胞， 洗涤一次，再用结合緩冲液重悬浮为2 x 10?细胞/ml细胞密度.在抗体i"I-hlL-12混合物中加入PHA母细胞(1 x 106细胞)，室温下温育2 小时。如下分离细胞结合放射性与游离125WhIL-12 :室温下离心检测 混合物30秒i吸出液体，用0.1 ml结合li冲液洗涤，然后于4'C以 10,000 x g离心4分钟.利用y计数器检测细胞沉淀物的细胞结合放射 性。在缺乏抗体的情况下测定总结合，而通过在所迷测定中含有25nM 非标记IL-12测定非特异性结合。 一式二份进行温育。在采用Y61和J695人抗IL-12抗体的IL-12受体结合测定中，两 种抗体对IL-12受体结合具有相似的抑制作用。Y61抑制1L-12受体 结合的IC5o值约1.6 x 10—IIM,而J695的ICso值约U x ICT"M.C人pha母细胞增殖测定评价抗IL-12抗体抑制PHA母细胞增殖的能力(IL-12刺激PHA母 细胞增殖)，在微量滴定板(U形底，96孔，Costar , Cambridge ， MA)的100 ml RPMI完全培养基中使连续稀释的抗IL-12抗体与230 pg/ml hIL-12于37 'C 、 5%二氧化碳预温育1小时。洗涤如上所述分离 的PHA母细胞一次，将其用RPM完全培养基重悬浮为3 x io5细胞 /ml细胞密度，在抗体/h!L-12混合物中加入PHA母细胞(IOO ml , 3 x 104细胞)，于37 'C、 5%二氧化碳温育3天，用0,5 mCi/孔（3H)-胸苷CAmersham, Arlington Heights, EL)标记4-6小时.将培养内容物通 过细胞收集器(Tomte" Orange, CT)收获在玻璃纤维滤膜上，利用液闪 计数检测掺入细胞DNA中的(^H)-胸苷。 一式二份检测所有试样。存在各种浓度p70: p40 (即IL-12异源二聚体与游离p40亚单位的 比率)的中和结果示于表4 (参见附件A),分析在PHA母细胞增殖测定中的Y61人抗IL-12抗体证实，在只 有EL-12 p70而没有任何过量的p40 (p70: p40比率为1 : O)的情况下， 所述抗体抑制PHA母细胞增殖的ICso值约1,8 x 10-1GM.在存在50 倍过量游离p40 (p70: p40比率为1: 50)的情况下，Y61抗体抑制PHA 母细胞增殖的ICso值约1.8 x 10'1QM 。该结果证实，Y61抑制母细胞增殖的能力不受存在的过量p40的影响。在p70: p40比率1 : 0的情况下，人抗IL-12抗体J695抑制PHA 母细胞增殖的IC5o值约'1.0 x io-】1 M。在p70: p40比率1: 50的情况 下，该抗体抑制PHA母细胞增殖的ICso值约5.8 ± 2.8 x io'12 M (n = 2),说明过量p40对J695抗体只有轻微的抑制作用.总体结果证实， 因为在L50和94的突变，J695比Y61的中和活性有改善。d.y干扰素诱导测定如下分析抗I3L-12抗体抑制PHA母细胞j IFNy)的能力，在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100 ml RPMI 完全培养基中使各种浓度的抗IL-12抗体与200-400 pg/mi hIL-12于37 'C、 5°/。二氧化^灰预温育1小时。洗涤如上所述分离的PHA母细胞一 次> 将其用RPMI完全培养基重悬浮为1 x io7细胞/ml细胞密度。在 抗体/hlL-12混合物中加入PHA母细胞(100jLd, 1 x 106细胞)> 于37 'C和5%二氧化碳温育18小时。温育后从各孔取出150 pl无细胞上清 、液，应用ELISA (Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge,MA)检测所产生的人IFN丫水平， 一式二^"检测各上清液，人抗IL-12抗体Y61在该测定中的分析证实，Y61抑制人IFNy 产生的ICso值约1.6 x io-10 M ,而人抗IL-12抗体J695抑制人IFNy 产生的ICso值约5.0 ± 2.3 x 10-12 M (n = 3)。结果证实，因为L50和 L94的修饰而显箸改善J695的亲和力，e.用分离的pbmc诱导产生非人il-12为了检测人抗hIL-12抗体与其他物种IL-12的交叉反应性，如下 制备非人IL-12。对弥猴、狒狒和犬PBMC使用lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway), 对犬PBMC使用Accu-paque (Accurate Chemical & Sci. Corp., Westbuiy， NY)，或者对大鼠PBMC使用Lympholyte-rat (Accurate Chemical & Sci. Corp., Westbury, NY),如上所述通过密度梯度离心从新鲜的肝素化血液分离PBMC,然后按照文献所述(D'Andrea等，（1992) 五x/x 176， 1398, Viliinger等，（1995) Bue加er等，（1998) Cytokine 10, 241-248),诱导PBMC产生IL-12 ,洗涤后的PBMC以1 x 106细胞/ml重悬浮于加有0.0075% (重量/体积）SAC (Pansorbin; Calbioch她棚Behring Co.， La Jolla， CA)或 1-5 mg/ml ConA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)和0.0075% SAC的RPMI完全培养基中， 在5%二氧化碳大气下于37 'C培养18小时.离心收集无细胞和无SAC 培^基并通过0.2 ram滤膜过滤，乂人Emory University School of Medicine, Atlanta, GA获1寻的恒河猴 IL-12为重組恒河猴IL-12 。F.小鼠2D6细胞增殖测定小鼠T细胞克隆2D6在小鼠IL-2、 IL-4、 IL-7和IL-12作用下 增殖(Maruo等，（1997)7. Lewbq/fe61, 346-352)。还检测到其在 含有大鼠IL-12的大鼠PBMC上清液作用下的明显增殖.犬、弥猴、 狒狒或人IL-12对2D6细胞没有作用，以加有50 niM J3-巯基乙醇(J3ME) 和30 ng/ml小鼠IL-12的RPMI完全培养-基培养小鼠2D6细胞。检测 前1夭，洗除小鼠IL-12 ,用加有pME的RPMI完全培养基温育所述 细胞过夜。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100 ml RPMI完全培养 基中使连续稀释的抗IL-12抗体与40 pg/ml小鼠IL-12于37'C、 5% 二氧化碳下预温育1小时。洗涤2D6细胞一次,将其用含卩ME的RPMI 完全培养基重悬浮为1 x io5细胞/ml细胞密度，在抗体/h!L"12混合 物中加入2D6细胞(100)x1, 1 x 104细胞》于37'C、 5%二氡化碳温 育3天，以0.5 mCi/孔(3H)-胸苷标记4-6小时，收获培养内容物，利 用液闪计数进行计氣 一式二份检测所有样品.G. J695与非人IL-12的种间交叉反应性应用从数个非人类物种分离的PBMC分析J695与非人IL-12的种 间交叉反应性。应用如上所述的几个生物测定证实大鼠、犬、弥猴和 狒狒PBMC上清液中存在非人IL-12活性，所述测定例如小鼠2D6细 胞增殖测定、人PHA母细胞增殖测定和通过用针对小鼠IL-12和/或人 IL-12的兔和/或羊多克隆抗体阻断非人PBMC诱导的反应的Y干扰素 诱导测定。然后通过测定观测到50%抑制反应的J695抗体浓度，以相 同生物测定评价人抗ML-12抗体Y61和J695与PBMC上清液中的非 人IL-12或纯化的小鼠IL-12和恒河猴IL-12的交叉反应性，种间交叉 反应性结果总结于表5。结果证实，Y61和J695分别能够识别各种猴 的IL-12 (例如Y61能够识别弥猴IL-12和恒河猴EL-12 , J695能够识 別弥猴IL-12 、恒河猴EL-12和狒狒IL-12),而且J695对犬IL-12的活 性约低35倍；Y61和J695均与小鼠或大鼠IL-12没有交叉反应性。H. J695的人细胞因子特异性以竟争性ELISA测试J695的特异性，其中测试一組人细胞因子 干扰可溶性J695结合固定的人IL-12的能力。该组人细胞因子包括 EL-1 ct和U p (Genzyme, Boston, MA)、 IL-2 (Endogen)、 IL~4 、 IL-10 、 IL-17 、 IFNy和TGF國pl (R&D, Minneapolis, MN)、 IL-8 (Calbiochem)、 PDGF 、 IGF-I和IGF-II (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN)、 TNFa和淋巴毒素、IL-6 、可溶性IL-6受体、IL-11、 IL-12 p70、 EL-12p40、 M-CSF和LIF, EBI-3为非洲淋巴瘤病 毒感染B淋巴细胞诱导产生的IL-12 p40相关蛋白(Devergne等，（1996) J. Virol. 70:1143-1153)，它表达为人IgG-Fc嵌合体(EBI-3/Fc)。还测试 了单链鲑精DNA(Sigma)。表5种间交叉反应性数据table see original document page 145

用0.1 ml人IL-12 (2 ng/ml的0.1 M碳酸盐包被緩冲液(4体积0.1 M 碳酸氢钠和8.5体积O.l M碳酸氬钠))于4 包被平底ELISA免疫测定 微量滴定板(96孔，高度结合，Costar)过夜。用含0.05%吐温20的 PBS (PBS-T)洗涤板2次，用200 |ul的1 mg/ml牛血清白蛋白(BS夂Sigma) 的PBS-T于室温下封闭1小时，再用PBS-T洗涤2次，加入含IL-12 抗体J695 (100 ng/ml)的样品(100 jil)和各细胞因子(2 nM)的含50 jug/ml BSA的PBS-T (PBS-T/BSA)并于室温下温育2小时。洗涤板4次，然 后与100 ^小鼠抗人X-HRP (1: 500的PBS-T/BSA > Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL)于室温下温育1小时。洗涤板4次，然后用 ABTS (Kirkegaard & Perry Lab.， Ga池ersburg, MD)在黑暗中显色20-30 分钟。用微量板读数器(Molecular Devices, Menlo Park, CA)读取OD450 imi,确定相对于缺乏任何可溶性细胞因子时J695结合IL-12包被板的 百分结合率.结果证实，J695结合固定的人IL-12只被人IL-12 p70阻断，在 较低程度上被人EL-12 p40阻断，不被所测试的任何其他细胞因子阻 断。3L对新型IL-i2^^子的结合已经介绍了一种替代EL-12异源二聚体，其中p35亚单位被新型 p19分子代替，应用3D同源性检索IL-6/IL-12家族成员鉴定了 p19 , 而且以活化树突细胞合成p19 « p19结合p40形成pl9/p40 二聚体， 它具有IL-12样活性，但是其IFNy诱导作用不如p35/p40异源二聚体 有效。预测识別单独的p40 、但是优选识别p70分子中的p40(例如J695 和Y61 ，参见实施例3H)的抗体也会既中和p35/p40分子又中和p〗9/p40 分子.实施例4:抗hlL-12抗体的体内活性用改进的Bree等使用的模型检测IL-12抗体对IL-12诱导反应的 体内作用，以研究人IL-12对弥猴外周血液学的影响(Bree等，（1994) 说oc/2e附5/op/2;^ 204: 1150-1157)。在以前的研究中，以1pg/kg/天连续5天给予人IL-12 ,在24小时后使白细胞(WBC)数降低、 尤其是淋巴细胞和单核细胞亚組降低。在72小时时观察到血小板数降 低。在IFN-y.作用下单核细胞活化标志血浆新蝶呤水平在24小时时开 始升高，在72小时时达到最高.在人抗hlL-12抗体的第一个研究中，使平均体重5kg的15只健 康弥猴镇静，并分为5组(n- 3)。第1組接受静脉内(IV)给予10 mg/kg 人静脉免疫球蛋白(IVIG, Miles， Eckhart, IN,用A蛋白琼脂糖凝胶纯 化)，第2組接受静脉内给予1 mg/kg C8.6.2 (中和小鼠抗人IL-12单克 隆抗体)。第3組接受静脉内给予10 mg/kg C8.6.2 ,第4組接受静脉内 给予1 mg/kg Y61 (人抗人IL-12抗体，从CHO细胞条件培养基纯化)' 第5组接受静脉内给予10 mg/kg Y61 .给予所述抗体后1小时，所有弥猴接受单次皮下(SC)注射人IL-12 (1 jig/kg)*在以下时间点取血试样：基线、8、 24、 48、 96和216 小时，分析全血细胞分类计数和血清化学.还检测血清人IL-12 、 C8.6.2抗体、Y61抗体、猴IFN，、猴IL-IO、猴IL-6和血浆新蝶呤水平，用IL-12和IVIG对照抗休(第1組)处理的弥猴呈现大多数预期的血液学变化，包括WBC 、血小板、淋巴细胞计数和单核细胞计数降 低。这样的降低在用1或10 mg/kg CS.6.2或Y61抗体处理的弥猴(第 2-5組)没有观测到或不明显。通过猴IFN-y和猴IL-IO (Biosource International, Camarillo, CA)、 猴IL-6 (Endogen)和血浆新蝶吟(ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY) 特异性的elisa分析血清或血浆样品，在任何el-12治疗的动物，包 括用IL-12和IVIG治疗的对照动物，均没有检测到IFN-y 、 IL-i0或 IL-6 ,这可能是因为IL-12剂量低(仅1剂的1 pg/kg).尽管如此，IL-12 和IVIG处理动物的血浆新蝶呤水平增加约3倍，但是所有CS.6.2 或Y61处理动物均没有变化，包括较低剂量(l mg/kg) Y61处理的动 物，说明Y61在体内有效阻断这种对IL-12的敏感反应。在第二个研究中，通过给予外源性rhIL-12和检测J695是否能够 阻断或降低通常与给予riilL-12有关的反应，从而研究J695在弥猴体 内的活性和药效学(PD)。对雄性弥與每组11=3)如下给药：经隐静脉以 单剂快速静脉浓注(iv)注射或背部皮肤皮下(sc)注射0.05 、 0.2或1.0 mg/kg J695或1 mg/kg静脉免疫球蛋白(IVIG),给予J695或IVIG后1 小时，所有动物接受单剂背侧皮肤皮下注射1 pg/kgrWL-12 。给予J695 后直到28天通过股静脉收集血样.从每个血样获得血清，并用ELISA 检测IL-12 、 j695 、 IFN-y和抗j695抗体.应用反相高效液相层析检 测新蝶"^。相对于给予J695或rML-12之前检测的新蝶呤水平归一化的新蝶 呤水平示于图3。为了比较各组间的新蝶呤抑制作用，计算各动物新 蝶呤水平归一化的曲线下面积(AUC)(表6》新蝶呤暴露(AUC)受到剂 量依赖性的抑制，相对于IVIG对照组各IV組抑制约71-93%, SC组 抑制约71-100%.这些结果说明，当通过IV或SC途径给药时，抑制 新蝶呤作用50。/。需要的J695剂量(ED50)低于0.05 mg/kg.表6 : j695在弥猴体内对il-12诱导的新蝶呤的剂量M性抑制给予IVIG或J695 和i'hIL-12的途径 1 J695剂量 (mg/kg) IVIG剂量 (mg/kg) 归一化新蝶呤 水平的AUC 与对照相比新蝶 吟AUC下降的。/。table see original document page 148

用J695处理还防止或减少通常与给予rhIL-12有关的血液学变化 (白细胞减少和血小板减少)。给予rhIL-12后24小时，淋巴细胞计数 相^f于对照IV和SC IVIG处理组的基线值下降约50%,所有3个剂 量水平的SC或IV给予J695均防止这种降低，使得24小时时的淋巴 细胞计数与基线值大致相同。给予IL-12后48小时，用IV和SCIVIG 处理组的血小板计数相对于基线值下降约25%。目标为维持高于90%效应水平的血清水平的典型剂量方案为大致 每隔一周IV和SC给予1 mg/kg或大致每周给予0.3 mg/kg,假设重 复给药有轻微累积作用。该研究证实，能够对各种猴安全给予这样剂 量的抗体.在独立的毒性研究中，还发现能够安全给予各种猴高至IOO mg/kg的所述4元体。j695还有效防止用嵌合IL-12处理的小鼠产生IFN-y ,所述嵌合 IL-12是組合小鼠p35亚单位和人BL-12 p40亚单位的分子。与在小鼠 无生物活性的人il-12相反，这种嵌合il-12在小鼠保持生物功能，包 括诱导ifn-y。此外，人p40亚单位允许所述嵌合分子被j695结合并 中和。腹膜内注射给予雌性C3H/HeJ小鼠(IO只/实验組)嵌合IL-12 , 每次剂量为0.05 mg/kg,在第O、 1、 2、 3和4天每天给药5次，在注射IL-12之前30秒，在第0 、 2和4天腹.膜内注射给予剂量为 0.05 、 0.01 、 0.002 、 0.0004 、 0.00008和0.000016 mg/kg的J695 。 在第0、 2和4天腹膜内注射给予剂量为0.05mg/kg的对照hulgGly。 在第5天从小鼠取血，并用ELISA测定血清IFN-y水平，结果证实' J695对IFN-y产生量产生剂量依赖性抑制，ED5。约0.001 mg/kg 。总 而言之，这些结果证实，J695是体内IL-12活性的有效抑制剂。实施例5 :人抗体与重组人IL-12 (rhlL-12)结合的动力学分析应用BIAcore系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)通过表面胞质团 共振(SPH)检测捕获配体(人抗AIL-12抗体J695 ,捕获在生物传感器 基体上)和分析物(rhIL-l2溶液)之间的实时结合作用。所迷系统利用 SPR的光学特性检测葡聚糖生物传感器基体中的蛋白浓度变化，蛋白 质共价结合到已知浓度的葡聚糖基体上。通过葡聚糖基体注射抗体， 注射抗体和固定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果 SPR信号发生改变.SPR信号变化记录为共振单位(RU),而且随时间 沿传感器闺的y轴显示，为了有,力于山羊4充人IgG (Southern Biotechnology Associates, Cat. No. 2040-01， Birmingham, AL)固定在生物传感器基体上，首先用100 mM N-羟基琥銷酰亚胺(NHS)和400 mM盐酸N-乙基-N'-(3-二甲M 基丙基)碳二亚胺(EDC)活化基体上的羧基，使山羊抗人IgG通过游离 胺基共价连接到葡聚糖基体上，接着，经活化的基体注射山羊抗人IgG 通过活化的生物传感器注射用醋酸钠，pH 4.5稀释的35 jil山羊抗人 IgG (25 pg/mi),蛋白上的游离胺直接结合到活化的羧基上，注射IM 乙醇胺失活未反应的基体EDC-酯。标准胺偶联试剂盒可市售获得 (Biacore AB, Cat. No. BR-1000-50, Uppsala, Sweden)'用HBS流动緩冲液(running buffer) (Biacore AB, Cat. No. BR-1001-88, Uppsala, Sweden)稀释J695 ,以便J695通过山羊抗人IgG捕 获在基体上，为了测定rhlL-12特异性抗体结合固定的山抗人IgG的能力，如下进行生物测定。以流速5 pJ/min通过山羊抗人IgG多克隆 抗体偶联的葡聚糖基体注射等份J695 (25 ng/mi; 25 pl等份)。在注射所 述蛋白之前和在注射后立即使HBS緩冲液单独流经各流动池(flow cdi)。基线和相当于J695注射结束后约30秒时间点之间的信号净差用 来代表IgGl J695结合量(约1200 RU)。检测直接结合可溶性rhIL-12 的rhIL-12特异性抗体。用HBS流动緩冲液稀释细胞因子，以5 pl/min 流速通过固定蛋白基体注射50 jul等份々所用rML-12的浓度为10、 20、 25、 40、 50、 SO、 100、 150和200nM。注射AIL-12之前 和注射后立即使单独的HBS緩冲液流经各流动池.基线信号和细胞因 子注射结束后的信号的净差用来表示具体样品的结合值.在注射下一 个样品之前用100 mM盐酸再生生物传感器基体。为了测定解离常数 (off-rate)、结合常数(on-rate),应用BIAcore动力学评价软件(2.1版》与COS产生的J695相比，CHO产生的J695结合rhlL-12的典型 结果示于表7。表7: CHO或COS产生的J695与rML42的结合table see original document page 151

应用BIAcore技术定量分析捕获J695和可溶性rhIL-12之间的分 子动力学作用。进行数个独立的实验，并用商业性BIAcore数学分析 软件分析结果，获得动力学速率常数，如表8所示。表8 : J695对rhIL-12的表观动力学速率常数和亲和力常数table see original document page 151

CHO产生的J695 (Kd = U4xl(T10 M")抗体和COS产生的J695 (Kd = 9/74 x 1(T"M")抗体作用的计算表观常数(Kd)存在微小不同。用 以下公式由观测到的速率常数计算J695和rhIL-12之间的表观解离常 数(Kd): Kd=解离速率/結合速率.为了测定和rhlL-12作用的表观解离速率常数和表观结合速 率常数，应用固定量J695 (2 lag/ml)和不同浓度的rh!L-12进行数个结 合反应。捕获J695和可溶性rhJL-12之间的实时结合作用传感器图表 明，两种形式的抗体的结^^相和解离相非常相似，为了进一步评价捕获IgGl J695 mAb结合可溶性重組细胞因子的 能力，应用直接BIAcore方法。在该方法中，用IgGl J695 (、g/ml)包 被山羊抗人IgG (25 jig/ml)偶联的羧甲基葡聚糖传感器表面，然后加入 重组细胞因子。当可溶性rh!L-12注射通过捕获CHO或COS产生的 IgGl J695的生物传感器表面时，信号量随细胞因子溶液浓度增加而增 加，所测试的任何浓度(高至1000 nM)的rmIL-12 (R&D Systems, Cat. No, 419-ML, Minneapolis, MN)或rhIL-12均没有观测到结合。这些结果 支持以下结论：IgGl J695抗体识別rhIL-12上的不同决定簇。表9显示了应用BIAcore的实验结果，证实人IgGl J695 mAb只 结合可溶性rh!L-12 ,而不结合任何一种其他重組细胞因子，表9:利用BIAcore技术的J69S表位作固table see original document page 152

实施例6: J695与IL-12的亲和力的进一步研究利用BIAcore胞质团共振技术定量分析J695抗体和人EL-12之间 的分子动力学作用，获得表观动力学速率常数，BIAcore技术用来检测可溶性rhIL-12对固相捕获J695的结合， 使山羊抗人IgG抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的 J695并捕获在所述表面上。加样不同浓度的rhIL-12 ,随时间检测不 同浓度IL-12对J695的结合。假定为零级解离动力学和一级结合动力 学以及J695和IL-12为简单的一对一分子作用，计算表观解离速率常 数和表观结合速率常数。进行了 3个独立实验，所示值为3个实验的 平均值。根据这些测量结果获得表观解离速率常数(kd)和表观结合速率 常数(ka),并用其计算所述作用的Kd值(见表10),结果表明J695对 rML-12具有高度亲和力.表10: J695和人IL-12作用的动力学参数table see original document page 153

实施例7 :大鼠抗小鼠白细胞介素-12的单克隆抗体C17.15的特性和 中和活性为了评价应用小鼠ru12特异性的单克隆抗^本在炎症和自身免疫小鼠模型的IL-12治疗研究与类似的人类疾病方法的相关性，研究了 大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体C17.15与小鼠IL-12的作用。评价C17.15 中和PHA母细胞增殖测定中的小鼠IL-12活性以及阻断小鼠IL-12结 合细胞表面受体的能力> 也评价C17.15-小鼠IL-12结合作用的动力 学'在人PHA母细胞增殖测定(参见实施例3)中，连续稀释的C17,15 或大鼠IgG2a (对照抗体)与230 pg/mL小鼠IL-12于37 'C预温育1小 时，使PHA刺激的母细胞加入到所述抗体IL-12混合物中，于37 'C 温育3天，然后用1 ^Ci/孔卩H]-胸苷标记细胞6小时.收获培养物，检测掺入的[311]-胸苷。在没有加入小鼠IL-12情况下检测背景非特异性增殖， 一式二份检测所有样品。发现在该测定中C17,15对重组小鼠 IL-12的IC5o(M)为1.4 x 10-11,相比之下，观测到在相同条件下J695 对重組人IL-12的IC5。值为5.8 x 10'12(见表11).表11:比较抗人IL-12单克隆抗体J695和大鼠抗小鼠IL-12单克隆table see original document page 154

还测定了 C17.15抑制小鼠IL-12结合细胞受体的能力，连续稀释 的C17.15与100 pM [1251]-小鼠IL-12在结合緩冲液中于37 。C预温育1 小时.2D6细胞(2 x 106)加入到抗体/[1251]-小鼠〖_12混合物中，于室 温下温育2小时。分离细胞结合放射性与游离pI]-EL-12 ,测定保留 的细胞结合放射性。缺乏抗体时测定标记小鼠IL-12与2D6细胞上的 受体的总结合，通过在测定中包含25 nM未标记的小鼠IL-12而测定 非特异性结合。总结合減去非特异性结合计算得特异性结合. 一式二 份进行温育。结果表明，C17.15抑制小鼠IL-12结合细胞受体的IC50 (M)为1.5 x IO.10。通过生物分子作用分析评价C17.15对重组小鼠IL-12的亲和力. 使山羊抗大鼠IgG抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的 C17.15抗体，使C17.15捕获在芯片表面上。将不同浓度的重组小鼠 IL-12加样在CH.i5表面上，随时间检测小鼠IL-12对固定C17.15的 结合.假定为零级解离动力学和一级结合动力学以及固定C17.15和小 鼠IL-12为筒单的一对一分子作用，计算表观解离速率常数和表观结 合速率常数.根据这些测量结果计算表观解离速率常数(kd,解离速率常数)和表观结合速率常数(ka ,结合速率常数)。这些结果用来计算所迷作用的Kd值。观测到重組小鼠IL-12-C17.15作用的结合速率为3,8 x 105M-Vi,解离速率为1.84 x !0〜1，而Kd为4.8 x在中和小鼠IL-I2活性和结合细胞表面受体中观测到的C17.15活 性以及C17.15结合小鼠IL-12的动力学与相似的J695-rhlL-12作用测 量结果有关。说明根椐结合速率、解离速率、Kd、 ICso和PHA母细 胞测定，大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15和抗人IL-12抗体J695的作用 模式几乎相同，因此，C17.15在炎症和自身免疫疾病的小鼠模型中用 作J695的同源抗体，研究IL-12阻断对这些模型动物疾病的发生或发 展的影响(参见实施例8),实施例8 :给予tx-小鼠IL-12抗体对小鼠自身免疫性疾病或基于炎症 的疾病的治疗A, a-Il-12抗体C17.15对胶原诱导型小鼠关节炎的抑制作用已经证实了 IL-12水平和类风湿性关节炎(RA)有关。例如，与健 康对照相比，在RA患者的滑液中检测到IL-12 p70水平升高(Morita 等(l998)^4rf/w-fe«m/i?/2ewmafow. 41: 306-314》因此，评孑介大鼠抗小 鼠IL-12抗体C17.15抑制胶原诱导型小鼠关节炎的能力，第0天用1I型胶原免疫雄性DAB/1小鼠(10/組)，从第-1天(胶原 免疫前1夭)至第12天隔天用C17.i5或对照大鼠IgG以10 mg/kg腹膜 内注射处理所述小鼠。临床监测所述小鼠足爪发生关节炎的情况直到 第90天为止。关节炎分级为：O-正常；1-炎症局限于一个关节；2-涉及一个以上的关节、但是不是整个足爪；3-涉及整个足爪；4-足爪 变形；5-所涉及关节僵硬. 一个小鼠的关节炎评分为该小鼠各单独足 爪的关节炎级別的总和(最大- 20),结果表示为每组的均数士SEM, 如图4所示，结果表明C17.15处理小鼠仅在处理后第50天以后 才有可检测到的关节炎评分，C17.15处理小鼠获得的最大关节炎平 均评分低于IgG处理小鼠检测到的最大评分至少5倍.证实大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15可防止小鼠发生胶原诱导型关节炎.b.大鼠a-小鼠il-12抗体ch.15对小鼠结肠炎的抑制作用还证实IL-12在结肠炎的发生/病理学中具有作用，例如已经证实 抗IL-12抗体抑制小鼠结肠炎模型(例如TNBS诱导型结肠炎IL-12失 效小鼠(Simpson等(1998)J.Med 187 (S): 1225-34)的疾病。同样证 实了抗IL-12抗体抑制IL-10失效小鼠的结肠炎发生，以2个研究评价 了大鼠抗小鼠IL-12抗体C17.15抑制小鼠TNBS结肠炎的能力 (Davidson等(！998) J. /mww"o/, 161 (6): 3143-9)。在第一个研究中，通过插入直肠的儿科脐动脉插管给予含2.0mg TNBS的150 50%乙醇溶液，在无病原体的SJL小鼠诱导结肠炎。 对照小鼠只用150 50%乙醇溶液处理。在第11天通过尾静另永静脉 内给予单剂0.75 、 0.5 、 0.25或0.1 mg C17.15或0,75 mg对照大鼠 IgG2a ,在第11和17天对小鼠称重，并在第17天进行组织学评分， 从而评价所述治疗的治疗作用。用C17.15治疗小鼠的体重在抗体治疗 的48小时内增加，而在治疗后第6天正常，组织学证实了 C17.15的 治疗作用。进一步还评价了所述治疗小鼠脾脏和结肠的CD4+T细胞的 IFN-y分泌以及所述治疗小鼠脾脏或结肠来源的巨噬细胞的IL-12水平 (见表12)。在第二个研究中，优化给药方案，在第12至14天分别用总剂量 为0.1 mg或0.5 mgC17.15或0.1 mg对照IgG2a的一半剂量治疗小鼠。 发现与未治疗的对照相比，以0.1 mg/小鼠或0.25 mg/小鼠的剂量单剂 给予C17.15仅部分改善TNBS诱导型结肠炎，而且不会显著降低 CD4+T细胞体外产生IFN-y ,但是显著降低il"12分泌，在0.5 mg/小 鼠或0.5 mg/小鼠以上的单剂给药时观测到反应。采用所测试的最低抗 体剂量并以2次分剂量注射给予(第12和14天)改进给药方案，表明多 次低剂量比一次性大剂量更有效，所获得^:据示于表12 ,表12 :抗小鼠IL-12 raAb C17.15抑制在小鼠建立的结肠炎table see original document page 157

按照结肠的排泄和肉眼外观评价，相隔1天以2个分剂量给予总 剂量为0.1 mg/小鼠或0.05 mg/小鼠的C17.15单克隆抗IL-12完全逆转 结肠炎.此外，该剂量方案显箸下调固有层(lamina propria) T细胞产生 IFN-y和巨噬细胞产生IL-12 ,使得后一水平与没有TNBS结肠炎的对 照乙醇处理小鼠^J则到的水平相似，因此，给予TNBS结肠炎小鼠模 型C17.15以剂量依赖方式逆转结肠炎的发展。C. a-IL-12抗体对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的抑制作用人们普遍认为IL-12在多发性硬化(MS)的发病机理中起作用。已 经证实诱导的IL-12 p40信使在MS患者的急性斑中表达而在炎症性脑 梗塞病变没有表达(Windhange, A.等(1995) J.五x/?. 182: l兆5-19%)。得自MS患者的T细胞(而非对照T细胞)遒过上调CD40L表达 刺激抗原提呈细胞产生IL-12 (Balashov， K.E.等(1997) Prac. Wa//. Jcad OS^ 94: 599-603). MS患者的EFN-y分泌增加，体外用a-IL-12抗体可阻断IFN-y分泌(Balashov, K,E.等(1997)Ww/. LK4 94: 599-603)。在MS患者检测到血清IL-12水平升高，但是其他神经 疾病血清IL-12水平没有升高(Nicoletti,F.等（1996)汄Wwto加"iw加/. 70: 87-90)。已经证实IL-12产生增加与MS患者疾病活动有关(Cormabdla， M.等(1998)J. C//". /"ve处102: 671-678)。研究了 IL-12在小鼠多发性硬 化模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发病机理中的作用 (Leonard, J.P.等(1995) , ^r;?. Md 181: 281-386; Banerjee， S.等(199g) Zrt/m'to(1998) 41: S33 ;以及Segal， B.M等(1998) /五;cp. Me^. 187:537-546)。已知该模型疾病由TH1亚群T细胞"i秀导产生。所以， 评价a-IL-12抗体预防急性EAE发生的能力，发现ct-EL-12抗体能够抑制急性EAE发生、抑制发生后的疾病> 并减轻用自身抗原髓鞘碱性蛋白免疫小鼠的复发的严重程度(Banerjee, S.等(1998)^rt/^M?朋ew肌（1998)41:S33)， a-IL-12抗体在小鼠的治疗 的有益作用在停止治疗后持续2个月以上。还证实抗IL-12抗体抑制 过继转移致脑炎T细胞接受小鼠的疾病(Leonard， J.P.等(19950丄五罕. Meaf. 181: 281-386).实施例9: J695的临床药理学在双盲交叉研究中，对64名健康男性对象给予剂量逐渐递增的 J695或安慰剂，在给药前和给药后0.25 h检测补体片^ C3a证实补体 系统没有活化。只有观测到伴随感染症状的对象的CRP和纤维蛋白原 水平升高。所有对象均存活，而且J695的总体耐受性非常好。没有1例因为 副作用事件(AE)而停止治疗。现测到的最常见AE是头痛和普通感冒/ 气管炎，这两种副作用均不是严重病症，1名研究对象为33岁单身男性，在研究开始就患有滴状牛皮癣， 按照随机研究设计，该患者随机接受经SC给予的5mg/kgJ695.给予 所述抗体之前10天，所述患者仅在手臂和腿上有散在小丘疹病变。给予所述抗体时，该患者出现红斑变红、增厚而且角化过度。给予J695 后1周，所述患者述说皮肤症亚?i^,包括病变变平和脱皮减轻。第 二次给予J695 (5 mg/kg IV)不久，在没有任何局部治疗的情况下患者的 皮肤完全没有牛皮癣病变。在第二次给予抗体后随着预期的J695清除 再次出现覆盖有白色鳞屑的红斑，实施例10 :比较2个CHO细胞系产生的J695为了重组表达J695 ,通过磷酸钩介导的转染将编码所述抗体重链 和所述抗体轻链的重组表达载体导入dhfr- CHO细胞中(Urlaub, G.和 Chasin, LA. (19S0)Ato/.力ok/. 0S4 22: 4216-4220)。在所述重 组表达载体中的抗体重链基因和轻链基因各自与增强子/启动子调节 元件(例如产生自SV40 、 CMV 、腺病毒等的调节元件，例如CMV 增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元 件)有效连接，以驱动高水平转录所述基因，所述重组表达载体还携带 有DHFR基因，DHFR基因允许用甲氨蝶呤逸择/扩增选择所述载体转 染的CHO细胞，使150个编码人抗体J695肽序列的表达载体的微生物溶解于50 mi圆锥形管的2.7 ml水中。加入300 2.5 M氯化钙，将该DNA混 合物滴加到50 ral圓锥形管的3 ml 2 x HEPES緩冲盐水中，涡旋5秒 并室温下温育20分钟后，使1 mL溶液均匀分散在各板中(仍然为F12 培养基)，使该板于37'C温育4小时。吸去液体，在每个板中加入2ml 10% DMSO的F12 , DMSO震荡持续i分钟，然后在各板中加入5 ml PBS稀释DMSO,用PBS洗板2次，然后加入10 ml加有H/T和5% FBS (选择表达DHFR的细胞)的a MEM , 37 'C温育过夜。以每孔100个 细胞密度将细胞接种入96孔板，各板于37 °C、 5。/。二氧化破温育2 周，每周更换培养基i次，最后一次更换培养基后5天，1 : 50稀释培养上清波，并用人 IgGy链特异性ELISA进行测试，使产生最高ELISA信号的克隆从96孔板转移到1，5mJy孔ccMEM十5%透析血清的12孔板中，3天后进行 另一个人IgGy链特异性ELISA , 12个具有最髙活性的克隆分入 ocMEM + 5%透析血清和20 nM MTX中，细胞系031898218在存在20 nMMTX下生长，而没有任何明显细胞死亡或生长率降低，在3日测 定中产生1.8 ;:i^ml hlgG。 031898218在含MTX的培养基中生长的 T-25培养物平均产生J695为11.9 pg/ml 。称为ALP903的细胞系适应 在无血清条件下悬浮生长，产生7.5 pg J695/细胞/24h 。ALP903细胞最初用aMEM/5% FBS/20 nM MTX培养基选择后， 再用20nMMTX传代。所述细胞在100 nM MTX逸择下培养，然后 在随后的30天中用500 nM MTX传代2次*此时所述培养物产生32 J695/mL/24h,通过有限稀释亚克隆培养物'亚克隆21S-22在96孔板 中2天产生16.5 yg/mL J695 ,在12孔板中2天产生50.3 pg/mL J695 。 用aMEM/5。/。透析FBS/500 nM MTX培养克隆218-22 3S天，然后使其 如上所述进行无血清旋转培养。称为ALP 905的无血清悬浮培养的平 均细胞特异性产量为5Spg/细胞/24h,第一种用来产生J695的细胞系(ALP卯3)由培养物产生J695抗体 的产量低于第二种细胞系ALP卯5 。为了保证ALP 905产生的J695 在功能上与ALP 903产生的J695相同，评价了两批抗体的IL-12亲和 力、阻断IL-i2结合细胞受体的能力、抑制IL-12诱导IFN-y的能力以 及抑制IL-12介导的PHA母细胞增殖的能力。通#面胞质团共振研究(BIAcore分析)检测结合IL-12的动力学 速率常数，从而确定ALP卯3和ALP 905批J695对IL-12的亲和力。 以3个实验(如实施例3所述)测定ALP 903和ALP卯5批J695抗体结 合rML-12的解离速率常数(kd)和结合速率常数(ka).通过解离速率常 数除以结合速率常数计算获得结合IL-12的亲和力Kd.计算各个实验 的Kd,然后平均.结果表明ALP卯3和ALP卯5批J695测得的动力 学参数和结合rML-12的亲和力非常类似：ALP卯3批的计算Kd为 1.19 ±0.22 x l(Ti0M,而ALP卯5批的Kd为1.49 ±0.47 x 10"OM(见表13)。评价ALP 903和ALP 905产生的J695阻断rhlL-12结合PHA活 化的人T淋巴母细胞上的IL-12受体的能力(参见实施例3)。测试以10 倍连续稀释的起始浓度为l x 10-s的各J695样品，使所述抗体与50pM ["I]-人IL-12在结合緩冲液中于37 'C预温育1小时，PHA母细胞加 入抗体/[1251]-人IL-12混合物中，室温下温育2小时。通过离心和洗涤 步骤分离细胞结合放射性和游离[1251]-1-12,计算抑制百分率，利用4 参数曲线拟合由抑制曲线确定J695的ICso值，并通过2个独立实验证 实， 一式二份进行温育，两批J695的结果非常相似(见表U》评价ALP 903和ALP 905细胞产生的J695抑制rh!L-i2诱导体外 pha活化的人淋巴母细胞产生IFN-y的能力，连续稀释的J695与200 pg/mL rhIL-12于37 'C预温育1小时。加入PHA淋巴母细胞，37 'C温 育18小时，温育后取出无细胞上清液，用elisa测定人IFN-y水平. 利用4参数曲线拟合用抑制曲线的ICso值对抗体浓度作图。结果证实 两批J695抑制IFN-y产生的能力非常相似，体外PHA母细胞增殖测定用于测定ALP 903和ALP 905 J695对 rhIL-12的中和能力，连续稀释的每种类型的J695与230 ?§/^人]1-12于37 。C预温育1小时。然后加入PHA母细胞，37 'C温育3天，然 后用17(^/孔[3印-胸苷标记细胞6小时，收获培养物，测量掺入的卩H]-胸苷。在缺乏rhIL-12的情况下测定非特异性增殖(背景).发现ALP卯3 和ALP 905 J695的IC50值非常相似，见表13 ,ALP卯3批和ALP 905批J695抗体的中和rhlL-12活性、阻断EL-12 结合细J綠面受体和结合rhlL-12中的活性没有明显不同，所以这两种 不同细胞类型产生的抗体是等同物。表13:比较ALP卯3和ALP905批的J695的特性table see original document page 162

等同实施方案本领域技术人员知道或者最多用常规实验就能够确定本文所述 本发明具体实施方案的许多等同实施方案.这样的等同实施方案包括 在以下权利要求书内.序列表<】10> Jodien, Salfeld等 •<120〉结合人IL-2的人抗体及其生产方法 <130> BBI-093CPPC<;mo〉<150> 60/126, 603 <151> 1999年3月25日<柳> 675<170〉 Pat;entln Ver. 2.0<2lt»> 1 <211> 6 <212> PRT<213>人(Homo sapiens) <220〉<223〉位置1的Xaa可为His或Ser <220〉<223〉位置4的Xaa可为Tyr或His <220><223〉位3: 6的Xaa可为Tyi', Asn或Thr <柳> 1Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa 1 5〈210〉 2 <211> 12 <212〉 PKT<213〉人(Homo sapie】is) <220><223〉位置2的ha可为Ser或丁hr<220〉<223>位置4的Xaa可为Asp或Glu <220〉<223>位置5的Xaa可为Ser, Arg或Lys <220><223〉位置6的Xaa可为Ser, Gly或Tyr <220〉(223>位置7的Xaa可为Leu, Phe, Thr或Ser <220〉<223〉位昱8的Xaa可为Arg, Ser, Thr, Trp或His <220〉<223〉位置9的Xaa可为Gly或Pro <220〉<223>位置10的Xaa可为Ser, Ti]r, Ala成Leu <220〉<223〉位置11的Xaa可为Arg, Ser， Met, Thr或Leu <220><223>位置12的Xaa可为Val, lie, Thr, Met或Leu <400> 2Gin Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10<210> 3<211〉 17<212> PRT<213〉 人(Homo<400> 3sapiens)Plie lie Arg Tyr Asp Giy Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15<210〉 4 <211〉 7 <212> PRT<213〉人(Honio sapiens) <220>〈223〉位直]的Xaa可为Gly或Tyr <220><223〉位置3的Xaa可为Asp或Ser <220><223〉位置4的Xaa可为Gin或Asn <400> 4Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser ] 5<2I0> 5 <211> 9 〈212> PRT〈2l3>人(Houio sapiens) <220><223〉 Xaa为Ser或Glu <400> 5Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly Met His 1 5<210〉 6 <211> 13 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens) <220〉<223>位置]的Xaa可为Ser或Thr <220〉<223〉位瓦3的Xaa可为Ser或Gly <220〉<223〉位置4的Xaa可为Arg或Ser <220〉<223〉位置S的Xaa可为Gly或Yal <220〉<223>位罝9的ha可为Ser或Ala〈220><223〉位置10的Xaa可为Asn, Gly或Tyr <220〉<223〉位置11的Xaa可为Thr或Asp <220〉<223>位置13的Xaa可为Lys或llis <400〉 6Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn lie Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa 1 5 10<210〉 7 <211> 115 <212> PRT<213〉人(Houio sapiens) <220><223〉位置6的Xaa可为Gln或Glu <220〉<223>位置16的Xaa可为Arg或Gly <220><223>位置31的Xaa可为Ser或Glu <220〉〈223〉位置84的Xaa可为Lys或Asn <220〉<223〉位置97的Xaa可为Thr, Ala或Lys <220〉<223〉位置98的Xaa可为Thr或Lys <220><223>位置99的Xaa可为Ser或His 〈220〉<223>位置102的Xsa可为Tyr或His <220><223〉位置304的Xaa可为Tyr, Asn或T!)r <柳〉7Gin Val Gin Leu Val Xaa Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Xaa 15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro G】y Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ala Phe I〗e Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Asx 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Gin Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thrioo 105 noVal Ser Ser 115<210> 8 <211〉 112 <212> PITT<2l3>人(Hoiao sapiens) <220〉<223〉位置1的Xaa可为Ser或Gli! <220〉<223〉拉置2的Xaa可为Tyr或Ser <220><223>位置]3的Xaa可为Thr或Ala <220〉<223>位JL 23和91的Xaa可为Ser或Thr <220〉<223>位Ti 25的Xaa可为G〗y或Ser <220><223〉位置26的Xaa可为Arg或Ser<2加〉<223>位置30的Xaa可为Gly或Val <220><223>位置31的Xaa可为Ser或Ala <220〉<223〉位置35的Xaa可为Lys或His <220〉<223〉位置51的Xaa可为Gly或Lys <220〉<223>位置54的Xaa可为Gln或Asn <220><223〉位置79的Xaa可为Val或Leii <220〉"Zj, 1i且»o Aaa 。j w rtsp取Lr丄u <220〉〈223〉位置94的Xaa可为Ser, Arg或Lys <220〉<223>位置95的Xaa可为Ser, Gly或Tyr <220〉<223〉位罝96的Xaa可为Leii, Phe, Thr或Ser <220><223〉位置97的Xaa可为Arg, Se:r, Thr, Trp或His <220><223>位置98的Xaa可为Gly或Pro <220〉<223〉位置99的Xaa可为Ser, Thr, Ala或Lei: <220〉<223〉位置]00的Xaa可为Arg， Ser, Met, Thr或Leu <220〉<223〉位置101的Xaa可为Val, lie, T!)r, Mt't或Leu <223>位置32的Xaa可为/,sn, Gly或Tyr<220〉<223〉位置33的Xaa可为Thr或Asp <220〉<223〉位置53的Xaa可为Asp或Ser <400> 8• Xaa Xaa Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gin 15 10 15Arg Val Thr lie Ser Cys Xaa Gly Xaa Xaa Ser Asn lie Xaa Xaa Xaa 20 25 30Xaa Val Xaa Trp Tyr Gl【i Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45lie Tyr Xaa Asn Xaa Xaa Arg Pro Ser Giy Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Giy Ser Lys Ser Gly 'Thr Ser Ala Ser Leu AJa lie Thr Giy Xaa Gin 65 70 . 75 80Ala Glu Asp Glu Ala Asp 丁yr Tyr Cys Gin Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110<2〗0〉 9 <211〉 6 <212〉 PRT<213〉人(Hoino sapiens) <220〉<223〉位置2的Xaa可为Gly, Val, Cys或HisI<22G><223〉位S 3的Xaa可为Ser或Thr <220〉, <223〉位3i 4的Xaa可为]iis, Thr, Val, Arg,或lie <220〉<223〉位置5的Xaa可为Asp或Ser<220〉〈223〉位置6的Xaa可为Asn, Lys, Ala, Thr, Ser, Phe, Trp,或His <400〉 9His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5<2〗0〉 10 <211〉 12 〈212〉 PRT<213〉人(Ho边o sapiens) <220><223〉位置4的Xaa可为Asp或Ser <220><223〉位置5的Xaa为任"f可氨基酸 <220><223>位置6的Xaa可为Gly, A邻，Gin, Leu, Phe, Arg, His, Asn或Tyr 〈400〉 ]0Gin Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Tlir His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 11 <211> 17 <212〉 PRT<213>人(Hcmio sapiens) <220〉<223〉位罝I的Xaa可为Phe, Thr或Tyr <220〉<223>位置3的Xaa可为Arg或Ala <220〉〈223〉位置5的Xaa可为Asp, Ser， Gli)或A]a <220〉<223>位置6的Xaa可为C'ly或Arg 〈220〉<223>位置8的Xaa为任何氨基酸<220〉<223〉位置10的Xaa可为Tyr或Glu <柳> 11Xaa lie Xaa Tyr Xaa Xaa Sei' Xaa Lys Xaa 丁yr Ala Asp Ser Val L)'s 15 10 15Gly<210〉 12 <211> 7 <212> PRT<213〉人(Homo sapiens) <220〉<223〉位置]的Xaa可为Gly, "00〉 12Xaa Asn Asp Gin Arg Pro SerTyr, Ser， Thr, Asn或Gin<210〉 13 <211〉 9 <212> PRT<213〉人(fiomo sapiens) <220〉<223〉位置4和.5的Xaa为任何^^酸 <220〉<223〉位置6的Xaa可为Tyr或His <220〉<223〉位置7的Xaa可为Giy, Met, Ala, Asn或Ser <400〉 13Pbe Tlir Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Met His 1 5<2i0〉 14 dl〉〗3 《2〗2〉 PRT <213〉人（H動<220〉<223〉位置9的Xaa可为Ser, Cys, Arg， Asn, Asp或丁hr <220〉<223〉位置10的Xaa可为Asn, Met或lie <220〉<223〉位置11的Xaa可为Thr, Tyr, Asp, His, Lys或Pro <柳> 14Ser Gly Gly Ai'g Ser Asn lie Gly Xaa Xaa Xaa Val Lys 1 5 10<210〉 ]5 <2】〗〉】〗4 <212〉 PRT<213>人(Homo sapiens) <220><223>位置30的Xaa可为Ser或Glu <220><223>位置83的Xaa可为Lys或Asi] <220〉<223>位置5的Xaa可为Gin或Glu <柳> 15Gin Val Gin Val Xa.a Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 15 10 15Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr Gly 20 25 30Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala. 35 40 45Phe lie Axg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr TyT Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr I〗e Ser Arg Asp Asn Ser L.ys Asn Thr Leu Tyr Lei:G5 70 75 SOGin Met Xaa Ser Lei】Arg Ala G〗u Asj、 Thr Ala Val Tyr 丁yr Cj's LysS5 SOThr His Gly Ser His Asp Asn '!Vp Gl)' G}.y Thr Met Val Thr Val100105l]OSer Ser<210〉 16 <2I1〉 112 <212〉 PRT<2〗3〉人(Hoino sapiens) <220〉<223〉位置1的Xaa可为Ser或Gin <220><223>位置2的Xaa可为Tyr或Ser <220><223>位置13的Xaa可为Thr或Ala <220〉<223〉位置25的Xaa可为Gly或Ser <220><223〉位置51和95的Xaa可为Gly或Tyr <220〉<223>位置79的Xaa可为Val或Leu <400〉 16Xaa Xaa Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Xaa Pro Gly Gin 15 10 15Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Xaa Arg Ser Asn lie Gly Ser Asii 20 25 30Tl!r Val Lys Trp Tyr Gin Gin Leu Pro G]y Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45lie Tyr Xaa Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val hro Asp Arg Phe Ser 50 55 £0Gly Ser Lys Ser G]y Thr Ser A2a Ser Leu A〕a lie Thr Gly Xsa Gin t;5 70 75 £:〔)A3 a Glu Asp Glu Ala Asp T.vr Tyr Cys Cln Ser Tyr Asp Arg Xaa Thr S5 90 95His Pro Ala Leu Lei' Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110.<2]0〉 17 <211〉 6 <212〉 PRT<213〉人(Hojjio sapiens) <400〉 17His Gly Ser His Asp Asm 1 5<210〉 18 <211> 12 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens)<400〉 18Gin Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1<210> <211> <212〉 〈213〉5 1019 17 PRT人(Homo sapiens)<400> 19Plie lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn l-ys Tyr Tyr Ah Asp Ser Val Lys1Giy<210〉 <211〉 <212〉 〈213〉5 10 1520 了PRT人(Ho:i!o sapiens)<柳> 20Gly /is:i A邻Gin Arg Pro Ser 1 5<2】0> 21〈211〉 9<212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens).<400〉 21Pl)e Thr Phe Ser Se;r Tyr Gly '、let His 1 5<210〉 22<2]1〉 】3<212〉 PRT<213> 人(H'<柳〉 22Ser Gly Gly Arg Ser Asn lie Gly Ser Asn Thr Va] Lys 1 5 10<210〉 23 <211〉 115 <212〉 PRT<2i3>人(Houo sapiens) <400〉 23Gin Val Gh、 Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Yal Gin Pro Gly Arg 15 〗0 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys "Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Tiir lie Ser Arg Asp /is【i Ser Lys Asn Thr Leu Tyr G5 7'0 75 80Leu Gin Met L:,'s Ser Leu Arg A]a G〗u A印Thr Ma Vtil Tyr Tyr Cys S5 90 £'5Lys Tl)r Viis G]y Ser His As〗）Asn 'frp Gly Gin Gly Thr Met Vsl Thr 100 1G5 l]OVa】Ser Ser 115<210〉 24 <2H〉 112 -<212> PRT<213〉人(Houio sapiens) "00〉 24Ser Tyr Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Tl]r Pro Gly Gin 15 〗0 15Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Trp lie Gly Ser Asn 20 25 30Thr Val Lys Trp Tyr Gin G〗ii Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leii Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Tlir Ser Ala Ser Uu Ala lie Thr Gly Val Gin 65 70 75 80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Arg G〗y Thr 85 90 95His Pro Ala Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Va.l Leu Gly 100 105 110<2】0〉 25 <211〉 6 <212〉 PRT<213〉人(Hc鹏sapiens) <• 25His Gly Ser His Asp Asn I 5<210〉 26 <211〉 12<212〉 PRT<213〉人(Hoioo sapiens) 〈400〉 26CUn Ser Tyr Asp Arg Tyr Thi' His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 27 <2〗1〉 17 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens) <400〉 27Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1.5 10 15Gly<210〉 28 〈2】1> 7 <212〉 PRT<213>人(〖lowo sapiens) <400〉 28Tyr Asn Asp Glti Arg Pro Ser 1 5<210〉 29 <21D 9 <212〉 PRT<213〉人(Ho)do sapiens) <400〉 29Plie Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5<2〗G〉 30 <21〗> 13 <212〉 PRT<213〉人〈Ho鹏sapier)i;) <400〉 30Ser Gly Ser Arg Sei' As!i I]e G]y Ser As" 'Ho- Val Lys<210〉 31<2H> 1】5<212〉 PRT<213〉 人(H'<400〉 3110Gin Val Gin Leu 1Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gl!) Pro Gly Arg 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Aia Ser Gly Phe Thr Phe Sei' Ser Tyr2025 30Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pi-o Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val3540 45Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Aia Asp Ser Va〕.50Lys Gly Arg Plie Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va!l Tyr Tyr Cys 85 90 95Lys Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr100105 110Val Ser Ser 115<210〉 32 <211〉]】2 <2I2> PRT<213〉人(Homo sapiens) <400> 32Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Fro Ser Vsl Sey G3》'A]a Pro Gly Gh〗 1 5 10 15Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn lie Gly Ser As!i 20 25 30Th:r Val Lys Trp Tyr Glri Gin Leu Pro Giy Thr Ala Pro b's Leu Leu 35 40 45formula see original document page 179(210〉 34 <211〉〗12 <212〉 PRT<213>人(Houo sapiens) <400〉 34Ser Tyi' Va】Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 . 5 ]0 15Arg Val Tl)r lie Ser Cy.s Ser Gly Gly Arg Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30Thr Val Lys Trp Tyr Gin Gin Uu Pro Gly 丁l，r Ala Pro Lys Uu Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie 丁l〗r Gly Val Gin65 AlaArgGlu Asp Glu Ala S5Gly Ser Arg Val 10070 75Asp Tyr 丁yr Cys Gin Ser 90SOTyr Asp Ser Ser Leu 95Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110<210> 35 <211> 115 <212〉 PRT<213>人〈Homo sapiens)"00〉 35 Gin Val Gin 1Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gli、 Pro Gly Giy 5 10 15Ser Leu A]-g l_eu Ser Cys A〗a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr2025 30Gly !L His Trp Vai Arg G;ti A〗a Pro Gly Lys G]y Leu Glu 丁rp Val3540 45Ala Phe lie /U-g Tyr Asp Gly Ser Asn l^'s Tyr Tyr Ala Asp Ser V'"l5055 SOLys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Gin Met Asn Ser l一eu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr C)'s 85 90 95'Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr 100 105 110Val Sei" Ser 115<2]0〉 36 <211> 112 <212> PRT<213>人(Hoiuo sapiens) <220〉<223>位置32的Xaii为Gly或Tyr <400〉 36Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro G]y Gin 15 10 15Arg Val Tlu- lie Ser Cys Tlu- Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Xaa 20 25 30Asp Val His Trp Tyr Gin Gl】i Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu A]a lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95Ser Gly Ser Arg Vhl Pl!e G}y Thr «y Tlir Lys Val 丁hr Va3 Leu t;!y 100 K)5 r丄o〈210〉 37<211〉 115<212〉 PRT<213>人(Houio sapiens)<400〉 37Gin Val Gin Leu Val Gli) Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg ■〗 5 10 15Ser Uu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30Gly Met His TYp Val Arg Gin Ala Fro Gly Lys Gly Leti Glu Trp Val 35 40 45Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr A]a Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe 丁hr lie Ser A;rg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Glii Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 恥 95Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gin Gly 了hr Met Val Thr 100 105 110Val Ser Ser 115<210〉 38 <211〉 112 <2〗2〉 PRT<2〗3〉人(Honio sapiens)<400〉 38 Ser Tyr Val 1Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Tkr Pro Gly Gin 5 10 15Arg Vai Thr lie Ser. Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30Thr Val Lys Trp Tyr (;li、 Glii Leu S)ro Gly Thr A].a Pro Lys Lei! Leu;5如45]:le 丁yr Gly Asn帥G]r, Arg I)ro Ser Gi:，' Val Pro /邻Arg Phe Ser 50 55 GOGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Val Gin 65 70 75 80Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Sei- Leu 85 90 95'Arg Gly Ser Arg Val Plie Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 ]05 1】0<210〉 39 <211〉 115 <212〉 PRT<213〉人(Houio sapiens) "00> 39Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 35Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr2025 30Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val3540 45Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val5055 60Lys G]y Arg Plie Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Gin Met Lys Ser Leu Arg Ala Glii Asp Thr Ala Val Tyr Tyi' Cys S5 90 95Thr Thr Ser Cly Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Tiir100105 110Val Ser Ser 115<210> 40 <211〉 112 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens) 40Ser Tyr Val Leu Tlir Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly G.ln 15 10 15Arg Val Thr lie Ser Cys Ser G]y Gly Arg Ser Asn lie Gly Sei. Asn 20 25 30Thr Val Lys Trp 丁yr Gin Glii Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Val Gin 65 70 75 80Ala Glu Asp Glu Ala八sp Tyr Tyr Cys Glt、 Ser Tyr Asp Arg Gly Phe 85 90 95Thr Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr G]y Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 ]05 110〈210〉 4] <211> 1】.5 〈212> PRT<2l3>人(Hoino sapiens) <400〉 41Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gli】Pro Gly Arg 15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys A〗a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 丁yr 20 25 30Giy Met His Trp \'a】Arg Ala Pro Gly L'/s Gly Leu G]u Trp Val35 《0 45Ala P!ie Jle Arg T)':r Asp Gly Ser As〗i Lys Tyr Tyr /da Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Tl)r l'le Ser /ag Asp Asn Ser Lys Asn Tlir Leu Tyr65 70 75 SOLeu Gin Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Thr Thr Ser G].y Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Ttii' 100 105 l]OVal Ser Ser 115〈2〗0〉 42 〈2〗]〉H2 〈212〉 PRT<2]3〉人(Homo sapiens) <> 42Ser Tyr Val Leu Thr G]n Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15Arg Val Thr lie Ser Cys Ser (ily Gly Arg Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30Thr Val Lys 丁rp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Uu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Hie Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Val Gin 65 70 75 80Ala Glu Asp Glu Ala Asp 丁yr Tyr Cys Gin Sei' Tyr Asp Ser Ser Leii 35 90 95丁rp Gly Ser Arg Val Phe G]y Tlir Gly ThT Lys Val Thr Val Leu Gly 100 ]05 110<210> 43 <211>〗J5 <2〗2> PRT<213>人(Hc.iuo sapiens) <400> 43Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Giy Val Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyi-20 25 加Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Giy Lys Gly Leu GIli Trp Val 35 40 化Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Ai.g Phe Th:r I】e Sei- Arg Asp Asii Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80Leu Gin Met Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Tl)r Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Tl]r Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly G]!i Gly Thr Met Va】Thrioo 服 noVal Ser Ser 115<210> 44 <211〉 112 <212> PRT<213〉人(Homo sapiens) <柳> 44Ser Tyr Val Leu Tl]r Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 】5Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ser Asii lie Gly Ser Asn 20 25 . 30Thr Val Lys Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leii Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser G〗y Val Pro Asp Arg Plie Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Giy Thr Ser Ala St'r Le" /da lie Thr Gly Val Gin C5 70 ?5 SOTl)r Gly Ser Arg Val Phe Gly 丁hr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly !00 105 110<210> 45 <211> 115 <212> PRT<2〗3〉人(Hoiao sapiens) <400〉化Gin Val Gl" Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Glt、 Pro Gly Arg 15 10 ]5Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe T)n: Phe Ser Ser Tyr20 2530Gly Met His Trp Val Arg Gl" Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 4045Ala Phe lie Ai-g Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr657075 80Leu Gin Met Lys Ser Leu Ai'g Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys85 9095Thr Thr His Gly Ser His Asp Asn Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr100 105110Val Ser Ser 115<210> 46 <21】〉112<212〉 PRT<213〉人(卜;oir!o sapiens)<-W0>犯Ser Tyr Val Leu 了hr G〗n Pro Pro Ser Val Ser Gly 1"i】r Pro Gly Gin 〗5 〗0 巧Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly G]y Arg Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30Thr Val Lys Ti-p Tyr Glii Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45lie Tyr Gly Asn Asp Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Tlir Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Val Gin 65 70 75 80A】a Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95Trp Gly Ser Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Vai Thr Val Leu Gly 100 105 110<210> 47 <211〉 115 <212> PRT人(Houio sapiens) <柳〉47Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15Ser !一eu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30Gly Met His Trp Val Arg Gin A].a Pro G]y Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ala Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala. 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Phe Gly Thr G]y Thr Lys Vai Thr Val Leu G])' 100 105 ]」0table see original document page 191

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<213>人〈Homo sapiens) <柳〉255Gin Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Leu 丁'nr lie 1 5 10<210〉 256 <211> 12 <2]2〉 PRT 〈213〉人（Hoiiiosapiens)<柳> 256Gin Ser Tyr Asp Arg Gly G丄u Thr Pro Ser lie Thr 〗 5 10<210〉 257<21]〉 12<212〉 PRT <213〉人（Homosapiens)<400〉 257Gin Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Phe Gin Met Tyr 1 5 10〈210〉 258 <211> 12 <212> PKT<213〉人(Ho)no sapiens)〈柳> 25SGin Ser Tyr Asp Arg Gly Arg Asn Pro Ala Leu Tlir 1 5 10<210> 259 <211〉 12 <212> PRT<2〗3>人(Hoiao s邻iens)<400> 259Gin Se〕- Tyr Asp Arg G丄y Thr卜;i;i Pro Lm! 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Phe Ser Ala Tyi- Gly Met His 1 5<210> 310 <2〗1〉 9 <212> PRT<2〗3〉人(Homo sapiens) <400〉 310Phe Thr Phe Ser lie Tyr "y Met His 1 5<210〉 311 <211〉 9 <212〉 PRT〈213〉人(Hoido sapiens) <400> 311Phe Thr Phe Ser Ser Glu Gly Met 3 5<210〉 312<21〗> 9<212> PP'T<2)3〉人(！lo加s邻iCTic)<400> 212Pi)t' Tiir H'!e Ser Ser Cys Met His 1 5<210〉 313 <211> 9 <212> PRT<213>人(Homo sapiens) <咖〉313Phe Thr Phe Ser Ser Ser Gly Met His 1 5<210〉 314<211〉 9<212〉 PITT<213>人(Hoido sapiens)<柳> 314Phe Tlir Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5<210> 315 <211〉 9 〈212〉 PKT<213>人(Hoiuo sapiens) <400> 315Phe Thr Phe Ser Ser His Gly Met His 1 5<210> 316 <2】.1> 9 <212〉 PRT<2i3〉人(Houio sapiens) "00〉 316Phe Thr Hie Ser Ser Arg Gly Met His 1 5<2]0> 3】7 <21〗> 9 <:212〉 PRT<213〉人（)teo s叩ieiis) "00〉 3HPhe Thr P!)e Ser Ser Asn «y Met }Hs1 5<210> 318 <21D 9 <212〉 PRT<213〉人(Hoino sapiens) "00> 318Phe Thr Pl、e Ser Ser Thr Gly Met His 1 5<210〉 319 <211> 9 <2)2> PRT<213>人(Homo sapiens) <柳〉319Phe Tlu- Fhe Ser Ser Ala Gly Met His 1 5<210> 320 <211〉 9 <212〉 PRT<213>人(Houio sapiens) <柳> 320Phe Thr Phe Ser Ser Val Gly Met His 1 5<210〉 321 <21〗〉9 <212> PRT<213〉人(Homo sapiens) <柳〉321Phe Thr Phe Ser Sei- Leu Gly Met };is 1 5<2I0〉 322<21]〉 9<2]2> Fill'<213>人(n咖o f邵iei!s)<400〉 322Phe Thi' Phe Ser Ser lie Gly Met His 1 5<2〗0〉 323 <211〉 9 <212〉 PRT<2l3〉人(Homo sapiens) <柳〉323Phe Tl，r Phe Ser Ser Tyr Asp Met His 1 5<2lO〉 324 <211> 9 <212〉 PRT<2l3〉人(Howo sa.piens〉 〈柳> 324Phe Thr Ffie Ser Ser 丁yr Glu Met His 1 5〈210〉 325 <211〉 9 <212〉 PRT<2】3>人(Houio sapiens) <柳> 325Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Cys Met His 1 5<210> 326 <211> 9 <212> PRT<2】3〉人(i-iouio sapiens) <400> 326Phe Thr Phe Ser Se-r 丁y:r Ser Met 2 5<2〗0> 327 <2]〗> 9 、'212〉 F'P.T<213〉人(Homo sapiens) ◊300〉 327Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met His 1 5•<210〉 328 <21】〉9 <212> PITT<2l3〉人(Hoibo sapiens) <400〉 328Phe Thr Phe Ser Ser T)'r Asn Met His 1 5<210〉 329 <211> 9 <212> PRT<213〉人(Hoiuo sapiens) <400〉 329Phe Thi' Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5<210〉 330 <211> 9 <212> PRT<213〉人(H咖o sapiens) "00> 330Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His 1 5<2io〉 ：m<211> 9 <212〉 PJ(T<213〉人(!Iouo sapiens) <400> 53】Pl',e Thr f)'e Str Ser Tyr Vs) Met !化s 1 5<2】0> 332<211〉 9 <212> PRT<213〉人(Homo sapie'is) <柳〉332Phe Thr Phe Ser Ser 丁yr Met Met His 1 5<210〉 333<211〉 9<212〉 Pl订<2)3〉人(lloiiio sapiens)<400> 333Phe Thr Phe Ser Ser Tyr lie Met His 1 5<210〉 334 <211〉 9 <212> PRT<213>人(Hoino sapiens) <400〉 334Pl)e Thr Phe Ser Ser Tyr Pro Met His 1 5<210〉 335 <2】1> 17 <212〉 PRT<213>人(Homo sapiens) <柳> 335lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asii Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15Gly〈211〉 17 <2〗!i> Pi:T<2】3〉人(Ho歸s印iehs)Cys lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asi] L)'s T)'r Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 ' 10 15Gly'<210> 337 〈211〉 17 〈212〉 PRT<213〉人(Hoiuo sapiens) <400> 337Tyr lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15Gly<210> 338 <211> 17 <212> PRT<213〉人(Houjo sapiens) <柳> 338His lie Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1Gly《210〉 <2I1〉 <2上2> <213><400〉5 10 1533917PITT人(Ho迈o sapiens)339Lys lie 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<213〉人(Homo sapiens)

<400> 355

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<210> 356 <2U〉 17 <212〉 PRT

<2i3〉人(Hoido sapiens)

<400〉 356

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Gly

<210〉 357 <2]1〉 ]7 <212> PRT <213〉人（Homo

sapiens)

<400〉 357

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Gly

<2〗0> 35S <23〗〉〗7 d2〉 PRT <23 3〉人胸iio

sapiens)

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<213〉人(Ho旭o sapiens)

<400〉 359

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Gly

<210> 360 <2U> ]7 <212〉 PRT

<21,3〉人(Homo sapiens)

<400> 360

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<2】3>.人(1〗011、0 sapiens)

<柳〉361

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<210〉 362 <2U> 17 <212> PET <213>人（Hoino"00〉 362

Phe lie Arg 丁yr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

<210〉 363 <2]1〉 17 <212〉 PITT

<213〉人(Houio sapiens) "00〉 363

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Gly

<210〉 364 <211〉 n <212〉 PRT

<213〉人(Homo sapiens) <4O0〉 364

Phe lie Arg Tyr Asn Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 ■ 10 15

Gly

<2)0〉 365 〈2]3〉 17 <212> PRT

<2I3>人('Homo sapier's) <柳> 船

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<213〉人(Ho迈o s邵ie】is〉

<400〉 366

Phe lie Arg Tyr Thr Gly Ser As)i Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 367 <2〗]〉]7 <2]2〉 PKT

<213〉人(Hoieo sapiens)

<400〉 367

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Gly

<210〉 368 <21]〉 17 <212〉 PKT

<213〉人(Homo sapiens)

"00〉 368

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Gly

<2】0〉 369 <2〕]〉】7

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<400〉 369

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<210> 370 <2)〗〉】7

<2]2〉 PRT

'<213〉人(Hoino sapiens)

"00〉 370

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Gly

<210〉 371 <211〉 17 <212> PRT

<213〉人(Ho边o sapiens)

〈400〉 371

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Gly

<210> 372 <211〉 17 <212〉 PRT

<213〉人(Hcmo sapiens)

<400〉 372

Phe lie Arg Tyi' Asp As】）Ser Asn !Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val L)'s 1 5 i0 15

<2】0〉 373 <2】】〉]7

<212> P!(T

人（Hoi!io sapieiis)〈400〉 373

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<210〉 374 <2〗1〉 17 <2i2〉 PRT

<2J3〉人(Houio sapiens) "00> 374

Phe lie Arg Tyr Asp Ser Ser Asti Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<2】0> 375 <211〉 ]7 <212〉 PUT

<213>人（Homo sapiens) <400〉 375

Phe lie Arg Tyr Asp Tyr Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Hys 15 10 ]5

Gly

<2】0〉 376 <21]〉 17 <212〉 PKT

<2〗3>人(Homo sapiens) <400〉 376

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Gly

<210> 3T7<211〉 ]7 <212〉 PRT

<213>人(Homo sapiens) <400〉 377

Phe lie Arg Tyr Asp Arg Ser Asri Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

G].y

<2]0〉 378 <211〉 ）7 <2〗2〉 PR丁

<2】3〉人(Homo sapiens) "00〉 378

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Gly

<210〉 379 <21]> 17 <212> PRT

<213>人(Hoiuo sapiens) <400> 379

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<210> 380 <2U> 17 <212> PCT

<2〗'3>人(Hc咖sapie〗is) <尝〉380

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<213〉人(Ho, sapiens)

◊100〉 381

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〈210〉 382 <21〗〉]7 <212〉 PRT

<2l3>人(Ho)bo sapiens)

<柳> 382

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Gly

<210〉 3S3 <2m〗7 <212> PR丁

<213>人(Ho鹏；邻ie)is〉

〈400〉 383

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Gly

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<400〉 3S4formula see original document page 275<212> PfTl、<23_3〉人(Hoiao sapiens) 〈400〉 388Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val L)'.s 1 5 10 15Gly<210〉 389 <211〉 17 <212〉 PET<2〗3〉人(Hoino sapiens) "0O> 389Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15Gly<210〉 390 <211〉 17 <212> PRT<213>人(Hoiao sapiens) "00〉 390Phe lie Arg Tyr Asp Gly Ser Met Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15Gly<210> 391 <211> 17 <212〉 PRT<213>人(K。;iio sa〗）je'ns) <柳〉3S1Phe工ie ib'g Tyr Asp Gly Ser Leu i,ys Tyr Tyr Asp Ser Val Lys 1 5 i() 15Gly<210〉 392 <211〉 17 <212〉 PRT<213>人〈Homo sapiens)<400> 392Phe I]e Ai'g Tyr Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15Gly<210> 393 <211> 17 <212> PRT<213〉人〈Howo sapiens)〈■400〉 393Phe !Qe Arg Tyr Asp Gly Ser Pro Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15Gly<210> 394 <211>】7 <212〉 PRT<213>人(Hoiao sapiens)<> 394Phe lie Arg Tyr Asp G])' Ser Phe Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 ' 】0 15Gly。CT乂 395。n> 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<210〉 542 <211〉 12 <212> PRT<213>人(Homo sapiens)'〈400〉 5t!2Gln Ser Tyr Ala Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 543 <211> 12 <212〉 PRT <213〉人（H咖osapiens)<4O0> 543Gin Ser Tyr Leu Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 544 <21l> 12 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens)<柳> 544Gin Ser Tyr lie Arg Gly Thr Ms Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 545 <21〗> 12 <212〉 PRT<2I3〉人(Homo sapiens)<柳> 545Gin Ser Tyr TVp Arg G】y Thi- His Pro Ala Uu U'u 1 5 10<2〗0> 5小3<2〗！〉 12 <2!2〉附<400〉 5邻Gin Ser Tyr Phe Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1<210〉 <211> 〈212〉 .<213〉5 10547]2PRT人(Hoino sapiens)<400〉 547Gin Ser Tyr Asp Asp Gly Thr His Fro Ala Leu Leu1<210> <211〉 <212〉 <213>5 1054812PRT人(Homo sapiens)〈柳> 548Gin Ser Tyr Asp Cys Gly Thr His Pro Ala Leu Leu1<210> <2U> <212〉 <2]3〉5 1054912PRT人(Homo sapiens)<400〉 549Gin Ser Tyr Asp Ser Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 550 <211> 12 <212〉 PKT<213〉人(Howo sapiens) <400> 550Gin Ser 丁yr Asp 了yr Gh' Thr His Pro Ala Leu Lei， 1 5 10<2;0〉 551 <2〗1〉 12 <2〗2〉 PKT<213〉 乂v(Hc'】flo sapiens)<嫩> 551Gin Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 552 <211〉 12 <212〉 PRT<213〉人(Hoiuo sapiens)〈''100〉 552Gin Ser Tyr Asp Asn Gly Thr His Pro Ala. Leu Leu ] 5 10<210〉 553<211〉 12<212〉 PRT .<213〉人(Hoiao sapiens)<400〉 553 Gin Ser Tyr 1Asp Gin Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 5 10<210〉 554 <211> 12 <212> PRT<213〉人(HoiDo sapiens)<400〉 554Gin Ser Tyr Asp Thr Gly Thr His Pro Ala Leu Uu 1 5 10<210〉 555<2U〉 12<2〗2> PRT <213〉人（Horaosapiens)<4GG> 555GLn Ser Tyr Asp Gl:,' Gly T〗:r His Pro A].a Le'j Leu 〗 5 2 0<2]0〉 556 <21!> 12<212〉 FRT<213〉人〈Homo sapiens) <400〉 556Gin Ser Tyr Asp Ala Gly Thr flis Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 557 <211> 12 <212> PRT<213>人(Homo s叩iens)〈400〉 557Gin Ser Tyr Asp Val Gly 丁hr His Pro Ala Leu JLeu ] 5 10<210〉 558/■O 1 ， \ ， o \ 6 A 1 乂 丄6<212〉 PKT<2〗3>人(Homo sapiens)<400〉 558Gin Ser Tyr Asp Met Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 559 <211〉 12 <212> PRT<213〉人(Hoino sapiens) <400> 559Gin Sei' Tyi- Asp Leu Gly Thr His Pro Ala Uu Leu15 10〈210〉 5G0 <2ll〉 12<2i2〉 nrr<213〉人〈Hoao<4G0>柳Gin Sei- Tyr八印lie Gly Tb: His Pro A]a Uu 〗 5 ]0〈210> 561<211〉 12<212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens)<鄉〉561Gin Ser Tyr Asp Pro Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10〈210〉 562 〈211〉 12 <212〉 PRT<213〉人(Homo sapiens)"00〉 562Gin Ser Tyr Asp Trp Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 563 <211〉 12 <212〉 PRT<213>人(Homo s邻iens)<400〉 563Gin Ser Tyr Asp Arg Asp Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 564 <211> ]2 <212> PRT<2】3>人(Homo sapiens)<400>柳Gin Ser Tyr Asp Arg Cys Thr His Pro A].a Leu Leu 1 5 10<210> 565 〈2H> 12 <212〉 PRT<2i3>人（Kc,加s印iens)<40C: 565(;ln Ser 'j":.t Arg Ser Thr Kis Pro .A〗a Ltn! Leu 1 5 K)<210〉 566 <211〉 12 <212〉 P叮<213〉人(Houio sapiens)'<400〉 566Gin Ser Tyr Asp Arg 丁yr Thr His Pro Ala Leu Leu 1.5 10<210〉 567 <21〗> 12 <2]2〉 PR丁<213〉人(Houio sapiens)<400〉 567Gin Ser Tyr Asp Arg His Thr His Pro Ala Leu Leu 15 10<210〉 568 <211> 12 <212〉 PRT<213〉人(Howo sapiens)<柳> 568Gin Ser Tyr Asp Arg Arg Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 569 <211〉 12 <212〉 PRT<213〉人(Hoiiio sepiens)<400> 569Gin Ser Tyr Asp Arg Asn Thr His Pro Ala Leu Le" 1 5 10 570 <2〗〗> 〗2 <212> PRT<2I3>人(Homo eapie'ns) 570Gin Ser Tyr Asp Arg Gin Thi' His Pro Ala Leu Leu1<210> <211〉 <212〉 <2〗3〉5 1057112PRT人(Houio sapiens)<400〉 571GLi Ser Tyr Asp Arg Thr T!ir His Pro Ala Leu Leu1<210〉 <211〉 <2〗2> <213〉5 1057212PRT人(Homo sapiens)"00> 5.72Gin Ser Tyr Asp Arg Gly Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 573 <211> 12 <212> PRT<213〉人(Horao sapiens) <400> 573Gin Ser Tyr Asp Arg Ala Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 574 <2U〉 12 <212> PRT<2l3>人(Hoiao sapiens) <咖〉57-1Gli! Ser Tyr As:) Arg Vsi Th]: His Pro Ala Le" Leu 1 !5 -!0<210> 575 <2〗2〉 PF'T〈'2〗3>人Olo)!)o sap;ieriS)<400〉 575Gl!〗Ser Tyr Asp Arg Leu Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 576 <2H〉】2 <212〉 PRT <213>人（Howosapiens)<400〉 576Gh] Ser Tyr Asp Arg lie Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 577 <211〉 12 <212> PRT<2】3〉人(Homo sapiens)<400〉 577Glii Ser Tyr Asp Arg Pro Thr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210> 578 <211〉 12 <212> PRT<213>人(Hoino sapiens)<柳〉578G〗；i Ser Tyr Asp Arg Trp 丁hr His Pro Ala Leu Leu 1 5 10<210〉 579《211> 12<212〉 PRT<2〗3>人(Houio sapiens)<40()> 579(;〗rs Ser Tyr /邻Arg Phe T〗ir fiis Pro Ala lm Leu 1 5 10<210> 580 <211〉 -IS<212〉脆<213〉合成构建物<223〉位置16-34的核普酸可被任何核-资酸取代，使得随机核芬酸占所迷序列的12% <■> 580tgtcccttgg ccccagtagt catagctccc actggtcgta cagtaata 48■<210〉 581 <211〉 35 <212> DM <213〉合成枸建物<•> 581gacacctcga tcagcggata acaatttcac acagg 35<210〉 582 <211〉 15 <212〉 DN'A <213>合成构建物<400> 582tggggccaag ggaca 15<210> 583 <211> 45 <212> DMA <213〉合成构建物<400> 583attcgtccta taccgttcta ctttgtcgtc tttccagacg ttagt '!5<210〉 584<211〉 18<2〗.2〉 DMA <213>合成构建物〈400〉 58-1attcg1x:cta taccgttc 18<210> 585 <211> CS <2]2> DNA <213〉合成构建场<223〉位置28-42的核普酸可放.法何扭苷酸取代，使得随机核普睃占所述序列的]2%ggt,cccagU ccgaagaccc t.cgaE'-cccc.t caggct.uctg tc&tatgact £gcagt£tUa 60 g-tcagc 66<210〉 586 <2U> 15 <212〉 DNA <2〗3〉合成构建物<柳> 586tggggcc幼g gga.ca. 15<210〉 587 <211〉 24 <212〉 D,、'A <213〉合成构建物<400> 587tgaagagacg gtgaccattg tccc 24<210> 5SS <211〉 16z r> , a 、 ti、 i '<213>合成构建物 <柳〉588gacacctcga tcagcg 16<210〉 589 <211〉 48 <212> DNA <213>合成构建物<柳> 589gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48<210> 590 <211〉 12 <2]2〉 PRT<213>人（Ho'jio s邻ieus) <〉590Gln Ser Tyr Asp Arg Gly F1】e Thr Gly Ser Met Val 1 5 K)(:2〗0> 591 (:211> ].2 <212> Fl(T 〈'2】3〉人（Hohc'sapiens)〈220〉<223〉 N为任何核苦酸而S为脱氧胞嗜啶或脱氧胍的卵S序列的随机密码子编码Xaa <400> 591Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pl)e Thr Gly Ser Met Val 1 5 10<210〉 592 <211〉 12 <212> PKT<213>人(Homo sapiens) <220><223〉 M为任何核脊酸而S为脱氣胞嘧啶或脱氧^-的NNS序列的随4几密码子编码Xaa <柳> 592Gln Ser Tyr Xaa Xa.a Xaa. Xaa久'aa Xaa Ser Met Val 1 5 10<210> 593 <211〉 12 <212〉 PRT<213〉人(Hoino sapiens) <220><223〉 N为任何核苦酸而S为脱氣胞嘧啶或脱氧胍的NKS序列的随机密码子编码Xaa <柳〉593Gin Ser Tyr Asp Ai'g Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa. 1 5 10<210〉 594 <211〉 ]00 <212〉 Pl汀<213>人(Homo s邵iens) <400〉 5S4Glu Val Gin Leu Vsl Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly G]y 1 5 10 15Sei' Leu Arg Leu Ser C:'s Ala Ala Sei' Gly Pl'.e Thr H':e Ser Asp H:;s 力0 2 "0 o 0Tyr Met Asp 丁rp V'al Arg Gl" Ala Pro Gly〖js G〕.y L.e,.i G.li! T].p Vsi 35 40 45Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr 丁l]r Giu Tyr Ala Ala 50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Phe Tlir lie Ser Arg /Up Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80L-eu Tyr Leu G〗n Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95Tyr Cys Ala Arg 100<210> 595 <2]1〉 ]00 <2〗2> PRT<2l3〉人(Homo sapiens)<400〉 5S5 Glu Val Gin ]Leu Val Glu Ser Gly Gly G]y 5 JOLeu Val GinPro Gly Gly 15Ser Leu Arg Uu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 丁hr Phe Ser Asp His 20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Ohi Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45Gly Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Tlu- Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60Sei' Va〗Lys Gly Arg Leu Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr65707580Leu Tyr Leu Gin Ser Ser Leu Lys 1'hr Ghi Asp Leu Ala Val TyrS5 9095了yr Cys Ala Arg 】00<2】0> 5&6《21〗> KX)<2〗2〉 PRT <212>人G!。加<柳〉5S6sepieus)G1li VaJ Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va】Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala八la Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gl】，Ala Gli] Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val .35 40 45Gly Leu lie Arg八s!i Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60Ser Val Lys Gly Ai'g Leu Thr lie Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80Met Tyr Leu Glu Met Ser Asn Leu Lys Thr G3a) Asp Leu Ala Val Tyr 85 90 95Tyr Cys Ala Arg 100<210> 597 <211> 100 <212〉 PRT<213〉人(Hoino sapiens) <400> 597G]u Val Gl!i Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 ' 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin A]a Gin Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45Gly Leu I]e Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Tl)r Glu Tyr A】a Ala 50 55 60Ser Val Lys Gly Arg Leu T!ir lie Ser Arg Glu Asp Ser Lys Asn Ti)r 65 70 75 SOLeu Tyr Leu G]n Met Se:r Ser Leu Thr Gli: Asp Leu Ala Val Tyr S5 90 95丁yr Cys Ala Arg ICO<210> 598 <211〉 98 d2〉 PRT<213>人(Hoino sapiens) "00〉 598Glu Val Gin Leu Val Gli' Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala A]a Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30Ala Met His Trp Val Arg G丄n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45Ser Gly lie Ser Trp Asn Ser Gly Ser lie Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60Lys Gly Arg Pl)e Thr lie Ser Arg Asp Asii Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 SOUu Gin Met Asn Sei- Leu Ai'g Ala Glu Asp Thr Ala Uu Tyr Tyi. Cys 85 90 95八la Lys<2]0〉 599 <211〉 98 <212> PRT<213〉人(Hoino sppiens) <400> 599Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15Ser Uu Arg l..eu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30G])' Met Ser Trp Val A't G二n A]a Pro Gly Lys Gly Leu Glu t"〕 Val'30Se'r G〗y lie Asp. 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