发明背景

皮肤保护身体的器官免受外界环境的威胁并充当恒温器以维持 身体的温度。其由几个不同的层构成，各层具有特化的功能。主要的 层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮是覆在真皮上面的上皮细胞的层 化层，真皮由结缔组织构成。表皮和真皮都进一步由皮下组织(脂肪 组织的内层)支持。

表皮，皮肤的最上层，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin， New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。其由角 质形成细胞构成并且基于其分化的状态分为几层。表皮可进一步分为 角质层和由粒状melphigian以及基底细胞组成的活表皮层。角质层是 吸湿的并且按重量计算需要至少10％的水分以维持其弹性和柔软性。 吸湿性部分归因于角蛋白的保持水分的能力。角质层失去其柔软性和 弹性时，其变得粗糙易碎，导致干性肤质。

正好位于表皮下面的真皮为1.5至4毫米厚。其是皮肤的三层中 最厚的一层。此外，真皮也是大多数皮肤的结构的家，包括汗腺和脂 腺(其通过皮肤中称为毛孔或粉刺的开口分泌物质)、毛囊、神经末 梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是胶原和弹 性蛋白。

皮下组织是皮肤的最深层。其充当保持体温的绝热器和保护器官 的减震器(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society， 1-7(1998))。另外，皮下组织也贮存作为能源蕴藏的脂肪。皮肤的pH 一般在5和6之间。该酸性是由于存在来自皮脂腺分泌物的两性氨基 酸、乳酸和脂肪酸造成的。术语“酸性保护膜(acid mantle)”是指皮 肤的大多数区域上存在可溶于水的物质。皮肤的缓冲能力部分归因于 贮藏在皮肤角质层中的这些分泌物。

皱纹，老化证据标志中的一个标志，可以是由生物化学、组织学 和生理学变化造成的，所述变化是从环境的破坏中积累的(Benedetto， International Journal of Dermatology，38：641-655(1999))。 此外，存在可导致面部皱纹的特征性折痕、折皱和摺痕的其他次要因 素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MO：Mosby Year Book： 5-15(1990))。这些次要因素包括重力的恒定拉力、对皮肤的经常性 和恒定性定位压力(即，在睡眠期间)，和由面部肌肉的收缩产生的 反复的面部活动(Stegman等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MO：Mosby Year Book：5-15(1990))。为了潜在地减缓一些老化的体征，使用了 不同的技术。这些技术从含有α羟酸和维生素A的面部保湿液到手术 方法和神经毒素的注射。

皮肤的一个基本功能是为潜在地对正常体内稳态有害的水分和 物质的转运提供屏障。没有坚韧的、半透性的皮肤，身体将很快脱水。 皮肤帮助防止有害物质进入身体。尽管大多数物质不能渗透过该屏障， 但已发展了许多策略来选择性地增加皮肤的透性并获得不同程度的成 功。

因为非蛋白非核苷酸治疗剂例如抗真菌剂不能有效地透过皮肤， 为了提供治疗有效量的抗真菌剂，目前必需将其注射入皮肤或全身性 施用。美国食品和药品管理局已批准了这样的用于治疗真菌感染的方 法。在这些治疗中，通过受到监控的注射或定量施用来注射施用抗真 菌剂。然而，这些治疗可导致不利的副作用。因为施用的无痛性质、 减少的对应用抗真菌剂的培训、起作用和达到治疗性临床结果所必需 的更少的剂量和限制一般和全身性递送相关的副作用，所以抗真菌剂 的局部施用提供了局部递送的更安全和更想要的可选择的治疗法。

因为适合用于免疫的抗原性试剂不能有效地透过皮肤，为了提供 治疗有效量的用于免疫的抗原试剂，目前必需将毒素注射入皮肤。美 国食品和药品管理局已批准了这样的方法用于治疗例如疟疾、狂犬病、 炭疽、结核病，或涉及儿童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破伤 风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、麻疹、腮腺 炎、风疹、水痘、肺炎球菌肺炎(pneumococcus)、A型肝炎和流感。 在这些治疗中，通过受到监控的注射施用用于免疫的抗原试剂。然而， 这样的治疗可能是不舒适的并且一般还伴随有一些疼痛。因为施用的 无痛性质、可覆盖更大的治疗表面积、减少的对应用治疗剂的培训、 起作用和达到治疗性临床结果所必需的更少的剂量，所以用于免疫的 抗原试剂的局部施用提供了更安全和更想要的可选择的治疗法。

其他治疗剂的透皮施用也是非常吸引人的领域，因为，其具有这 样的有利方面，例如减少患者的不适感，治疗剂至血液中的直接施用 和通过使用特殊建造的设备和/或使用受控释放制剂和技术监控递送 的有利因素。

发明概述

本发明提供了可广泛地用于各种治疗剂或药妆剂 (cosmeceutical)的组合物的新方法和组合物，所述治疗剂或药妆剂的 组合物可被靶向或成像，从而使递送最大限度地到达特定位置。

本发明还涉及这样的制剂，所述制剂用于除了胰岛素、肉毒毒素 (botulinum toxin)、抗体片段和VEGF外的蛋白-优选地具有小于 20,000kD的分子量的蛋白的透皮递送。这些基于蛋白的试剂可包括例 如适合用于免疫的抗原。在另一方面本发明涉及用于非蛋白非核苷酸 治疗剂例如某些抗真菌剂的透皮递送的制剂。当使用术语“治疗剂” 或“具有生物学活性的蛋白”时，本发明明确地不包括胰岛素、肉毒 毒素、VEGF和抗体片段。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物 学活性例如产生免疫应答，因此这些仍包括在本发明的合适的方面中。

本发明还涉及用于透皮递送非蛋白非核苷酸治疗剂例如抗真菌 剂。合适的抗真菌剂包括，例如两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依 曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、制霉菌素或 环吡酮等。

本发明还涉及用于透皮递送适合用于免疫的抗原性试剂的制剂， 所述抗原性试剂可以是基于蛋白的抗原、非蛋白非核苷酸试剂或其杂 合体。合适的抗原包括，例如环境试剂、病原体或生物危害物质 (biohazard)之类的抗原。合适的试剂优选地包括，例如，和疟疾、 狂犬病、炭疽、结核病相关的抗原，或和儿童免疫例如B型肝炎、白 喉、百日咳、破伤风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎 病毒、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、肺炎球菌、A型肝炎和流感的免 疫相关的抗原。

然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物学活性例如产生免疫 应答，因此这些仍包括在本发明的合适的方面。不容易穿过皮肤但显 著小于例如胰岛素(最优选的试剂少于20,000kD)或具有不同物理化 学性质的试剂可通过本发明的另一方面递送。确切地，通过本发明可 将想要用于免疫的抗原运输穿过皮肤而无需注射。该结果给儿童免疫、 或潜在的重要的生物危害物或环境危害物提供了非注射替代方案。此 外，例如，非蛋白非核苷酸治疗剂例如某些抗真菌剂的特征在于较差 的局部穿透性，特别是对于真菌感染例如指甲或甲板的感染或 oncomychosis。

因此本发明还涉及用于治疗性和诊断性物质的透皮递送的局部 制剂，包括蛋白(特别是具有低于20,000kD的分子量的蛋白)或其他 具有生物学活性的试剂，例如，非蛋白非核苷酸治疗剂例如某些抗真 菌剂或其它用于免疫的试剂。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他 生物学活性例如产生免疫应答，因此这些仍包括在本发明的合适的方 面。合适的抗真菌剂包括，例如两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依 曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、制霉菌素或 环吡酮等。合适的试剂优选地包括，例如涉及疟疾、狂犬病、炭疽、 结核病的抗原，或涉及儿童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破伤 风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、麻疹、腮腺 炎、风疹、水痘、肺炎球菌、A型肝炎和流感的免疫的抗原。

本发明也提供了包含具有生物学活性的蛋白和载体的组合物。所 述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的聚合主链，并且其以对 透皮递送有效的量存在。所述载体和具有生物学活性的蛋白之间的结 合是非共价结合。

本发明的另一方面是提供了包含具有生物学活性的非蛋白非核 苷酸试剂和载体的组合物。所述载体包含具有附着的带正电荷的分支 基团的聚合主链，并且其以对透皮递送有效的量存在。所述载体和具 有生物学活性的非蛋白非核苷酸蛋白之间的结合是非共价结合。

本发明的另一目的是提供用于将具有生物学活性的蛋白给受试 者施用的试剂盒。所述试剂盒包含用于将具有生物学活性的蛋白递送 给受试者的皮肤或上皮的装置和组合物，所述组合物包含具有附着的 带正电荷的分支基团的聚合载体。带正电荷的分支基团可选自 -(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段，其 中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约 25的奇整数，其中所述载体和具有生物学活性的蛋白之间的结合是非 共价结合。

本发明也提供了给受试者施用具有生物学活性的蛋白的方法。该 方法包括将所述蛋白和有效量的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部 地施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的聚合主链。 所述载体和具有生物学活性的蛋白之间的结合是非共价结合。

本发明提供了给受试者施用非蛋白非核苷酸的具有生物学活性 的试剂的方法。该方法包括将所述具有生物学活性的试剂和有效量的 载体一起给受试者的皮肤或上皮局部地施用。所述载体可包含具有附 着的带正电荷的分支基团的聚合主链。所述载体和具有生物学活性的 试剂之间的结合是非共价结合。

本发明的一个目的是提供包含适合用于免疫的抗原和载体的组 合物。所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的聚合主链，并 且该载体以对透皮递送有效的量存在。所述载体和所述抗原之间的结 合是非共价结合。本发明的另一目的是提供用于将适合免疫的抗原给 受试者施用的试剂盒。所述试剂盒包含用于将适合免疫的抗原递送给 受试者的皮肤或上皮的装置和具有载体的组合物。所述载体包含具有 附着的带正电荷的分支基团的聚合主链，所述带正电荷的分支基团选 自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段以及触角足PTD，其中下标n1 是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整 数，其中所述载体和所述抗原之间的结合是非共价结合。

本发明的另一目的是提供给受试者施用适合用于免疫的抗原的 方法，该方法包括将适合用于免疫的抗原和有效量的载体一起给受试 者的皮肤或上皮局部施用。所述载体包含具有附着的带正电荷的分支 基团的聚合主链。所述载体和所述抗原之间的结合是非共价结合。

本发明也提供了包含成像部分和/或靶向试剂以及载体的组合 物。所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的聚合主链，并且 所述载体以对透皮递送有效的量存在。所述载体和所述成像部分或靶 向试剂之间的结合是非共价结合。

在一个实施方案中，本发明提供了这样的组合物，所述组合物包 含下列物质的非共价复合物：

a)带正电荷的主链；和

b)至少一个选自下列的成员：

i)具有数个附着的成像部分或数个带负电荷的成像部分的 第一带负电荷的主链；

ii)具有数个附着的靶向试剂或数个带负电荷的靶向部分 的第二带负电荷的主链；

iii)非蛋白非核苷酸的具有生物学活性的试剂

iv)除了胰岛素、肉毒毒素、抗体片段或VEGF外的治疗性 蛋白。

其中所述复合物携带净正电荷。

生物学试剂，在本发明的这个方面，可以是治疗剂或药妆剂。当 使用术语“治疗剂”或“生物学活性蛋白”时，本发明明确地不包括 胰岛素、肉毒毒素、抗体片段和VEGF。然而，因为适合于免疫的抗原 具有其他生物学活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适 当的方面。可选择地，候选试剂可用于在体内确定这些非共价复合物 的效率。

在另一方面，本发明提供了包含具有至少一个附着的效能基团的 带正电荷的主链和用于分子成像的试剂(例如光学成像试剂)的非共 价复合物的组合物。最优选地，在本申请中，所述试剂被靶向用于诊 断和/或治疗作用的特定试剂。例如，可将光学成像试剂和带正电荷的 主链和靶向黑色素瘤的组分结合以用于黑色素瘤的被靶向的局部诊 断。在另一方面，本发明提供了用于在受试者中将生物学试剂递送至 细胞表面的方法，所述方法包括给受试者施用上述的组合物。

在另一方面，本发明提供了制备药物组合物或药妆组合物 (cosmeceutical composition)的方法，该方法包括将带正荷的主链 组分和至少一个选自下列的成员与药物或药妆(cosmeceutical)可接 受的载体组合以形成具有净正电荷的非共价复合物：

i)具有数个附着的成像部分或数个带负电荷的成像部分的 第一带负电荷的主链；

ii)具有数个附着的靶向试剂或数个带负电荷的靶向部分 的第二带负电荷的主链；

iii)非蛋白非核苷酸的具有生物学活性的试剂

iv)除了胰岛素、肉毒毒素、抗体片段和VEGF外的治疗性 蛋白。

在另一方面，本发明提供了用于配制药物或药妆物递送组合物的 试剂盒，所述试剂盒包含带正电荷的主链组分和至少一种选自上述i) 组至v)组的组分，以及制备所述递送组合物的说明书。

在另一方面，本发明涉及这样的组合物，该组合物包含具有生物 学活性的试剂例如具有分子量低于20,000kD的蛋白和其他具有生物 学活性的试剂，例如，非蛋白非核苷酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可 选择地用于免疫的试剂，以及载体，所述载体包括这样的带正电荷的 载体，即所述带正电荷的载体具有此处描述的附着的带正电荷的分枝 或“效能”基团的主链。

所述具有生物学活性的试剂可以是基于蛋白(例如，具有低于 20,000kD的分子量的蛋白)、非蛋白非核苷酸治疗剂(例如某些抗真 菌剂)、或用于免疫的试剂。合适的抗真菌剂包括，例如两性霉素B、 氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、 咪康唑、制霉菌素或环吡酮等。如此处所使用的，适合用于免疫的抗 原性试剂可以是不会治疗性改变血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白 非核苷酸试剂或其杂合体。因此，所包括的试剂是其自身适合用于免 疫的抗原。合适的抗原包括，例如，针对环境试剂、病原体或生物危 害物的抗原。合适的抗原的其他示例包括可用于抗疟疾、狂犬病、炭 疽、结核病的免疫的抗原，或涉及儿童免疫例如B型肝炎、白喉、百 日咳、破伤风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、 麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、肺炎球菌、A型肝炎和流感的免疫的抗 原。

最优选地，所述带正电荷的载体是长链带正电荷的多肽或带正电 荷的非肽基聚合物，例如，聚烯化亚胺。明显地不能穿过皮肤或上皮[相 对于本发明的相同试剂和载体]和对降低血糖不具治疗性效果的蛋白 和非蛋白非核苷酸治疗剂通常具有广泛不同的表面和物理化学性质， 这通常使得不能确定提供例如胰岛素的透皮递送的技术是否可用于所 述蛋白和非蛋白治疗剂。然而，如此处所描述的，本发明的载体令人 非常吃惊地能够提供蛋白和非蛋白治疗剂的透皮递送，所述载体具有 带正电荷的主链，该主链具有带正电荷的分支基团。

通过使用检测例如在实施例中描述的检测可容易地鉴定适合用 于特定蛋白的透皮递送的特定载体。这些蛋白可以是，例如具有低于 20,000kD的分子量的小蛋白。如此处所用的，词“治疗”在血糖的情 况下是指血糖水平的降低，该降低足以在例如糖尿病患者中减轻高血 糖症的急性症状或体征。

本发明也提供了制备药物组合物或药妆组合物的方法，该方法包 括将载体和具有生物学活性的试剂(例如，具有低于20,000kD的分子 量的蛋白)组合，所述载体包含带正电荷的多肽或带正电荷的非肽基 聚合物例如长链聚烯化亚胺(其中所述多肽或非肽基聚合物具有此处 定义的带正电荷的分枝或“效能”基团)。可选择地，可将载体和其 他具有生物学活性的试剂例如非蛋白非核苷酸治疗剂(例如，某些抗 真菌剂)或其它用于免疫的试剂组合。

本发明也提供了用于制备或配制包含载体和治疗性物质的组合 物和生产可用的制剂所需的额外物品或可用于生产这样的制剂的预混 剂的试剂盒。这样的试剂盒可由施药器(applicator)或用于根据本 发明的方法使用所述组合物或其组分的其他装置组成。如此处所用的， “装置”可以是指适合用于例如根据本发明的方法用于递送、混合或 制备组合物的仪器或施药器。

本发明也提供了用于透皮递送包含在组合物中的具有生物学活 性的试剂的装置，所述组合物包含这样的载体，所述载体包含优选地 从短链至中等链长度的带正电荷的多肽或另外的具有此处所定义的带 正电荷的分支基团或“效能”基团的长链非肽聚合媒体物。这些装置 在结构上可以如皮肤贴剂一样简单，或可以是更复杂的装置，其可包 括用于分配和监控组合物的分配的手段和任选地用于在一个或多个方 面监控受试者的状况(包括监控受试者对正被分配的物质的反应)的 手段。

在本发明的另一方面，所述装置可以只包含可分开地用于皮肤的 治疗性的具有生物学活性的试剂和载体。因此，本发明也包括了这样 的试剂盒，其包含这样的装置和材料，所述装置可通过皮肤分配药物， 所述材料含有带正电荷的载体或主链并适合用于受试者的皮肤或上 皮。

一般地，本发明也包括用于施用具有生物学活性的试剂的方法， 该方法包括局部施用有效量的具有生物学活性的试剂和带正电荷的多 肽或非多肽聚合物例如聚烯化亚胺，所述聚烯化亚胺具有此处描述的 带正荷的分支基团。

“和......一起”是指以组合的方法施用两种组分，该方法可包括 将其在组合物中混合，然后再将所述组合物给受试者施用，或将其分 开施用，但以使其一起作用从而提供有效量的具有生物学活性的试剂 的必需递送的方式分开施用。例如，可首先将含有带正电荷的载体的 组合物用于受试者的皮肤，然后再使用含有具有生物学活性的试剂的 皮肤贴剂或其他装置。

本发明也涉及给上皮细胞施用具有生物学活性的试剂的方法，所 述上皮细胞包括除了皮肤上皮细胞外的上皮细胞，例如，眼上皮细胞 或肠胃系统的细胞。

附图概述

图1提供了用于本发明的组分的示意图。

图2提供了本发明的几个实施方案的示意图。

图3-4显示含有实施例2中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转 基因的质粒的透皮递送的结果。

图5显示含有实施例3中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转基 因的质粒的透皮递送的结果。

图6显示含有实施例4中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转基 因的质粒的透皮递送的结果。

图7显示含有实施例5中所描述的肉毒毒素的透皮递送的结果。

图8是实施例6中所描述的肉毒毒素的透皮递送的结果的照片描 述。

图9是这样的两种不同视野和不同分辨率(图a和b 10X对图c 和d 40X的放大倍数)的照片描述，该照片说明实施例9的成像复合 物的分布遵从具有荧光光学成像试剂(图b和d)的黑色素瘤色素沉 积细胞的明视野分布(图框a和c)。

图10是显示在两个不同的放大倍数下，实施例10中描述的阳性 NeutrAvidin染色的照片描述。图10的(a)和(b)部分是在10X放大倍 数下而(c)和(d)部分是在20X放大倍数下。图10(b)的(e)和(f)部分 是在20X放大倍数下的重复染色图象。

图11表示实施例11中所描述的载体主链的相对毒性的结果。

图12表示实施例11中所描述的透皮基因递送效率的结果。

图13是光学成像探针至CEA阳性细胞的选择性递送的照片描述， 其显示实施例11中所描述的结肠癌和成纤维细胞共培养物的明视野 图像(图a)和结肠癌的荧光图象(图b)。

发明详述

本发明提供了用于成像试剂或其他治疗剂的选择性、持久性递送 的基于组分的系统。可通过在bedside制剂中设计想要的组分来选择 组合物的单个性状。此外，在一个方面，提供成像部分和特异性靶向 部分以和带正电的主链形成非共价(优选为离子的)复合物。通过将 这些组分非共价地置于复合物中，本发明避免了将组分附着在带正电 荷的主链的精确位置上的需要，这和其他策略相反，所述其他策略增 加了复杂性和成本，以及将效能降低至这样的水平，使得由于空间限 制的原因还没有报导过成功的组合。在另一方面，通过单独地使用某 些带正电荷的载体可透皮递送某些物质，而无需带负电的主链的参与。 在这些情况下，所述物质和其衍生物具有足够的官能团和本发明的载 体非共价结合，优选地通过离子相互作用结合。术语“足够的”该意 义上是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化来决定的 结合(和单独的组分相比)。

参照图1进一步理解本发明。在该图中，组分显示为(1)具有附 着的带正电荷的基团(也称作效能基团，如附着至加黑的条块的加黑 的环所示)的固体主链，例如(Gly)n1-(Arg)n2(其中下标n1是从3 至大约5的整数，下标n2是从大约7至大约17的奇整数)或TAT结 构域；(2)成像部分(附着至浅色的条块的空心三角形)；(3)靶向 试剂和/或(4)具有生物学活性的试剂(附着至浅色的条块的空心圆) 例如非蛋白非核苷酸治疗剂或除了胰岛素、肉毒毒素、抗体片段和 VEGF外的基于蛋白的治疗剂；图2举例说明多组分组合物的各种示例， 其中所述基团描述于图1中。例如，在图2中，举例描述了第一多组 分组合物，其中带正电荷的主链和成像组分、靶向组分、治疗剂结合。 举例描述了被设计用于诊断/预后成像的第二多组分组合物。在该组合 物中，带正电荷的主链和成像组分以及靶向组分(例如识别黑色素瘤 的靶向组分)结合在一起以建立局部黑色素瘤检测平台。本发明，在 下面将更全面地描述，提供了许多用于治疗和诊断程序的额外的组合 物。

组合物

此处所使用的术语“具有生物学活性的试剂”是指治疗疾病或减 轻健康相关的问题(包括主观估计的和/或美容性的健康相关的问题) 的治疗剂。例如，具有生物学活性的试剂可以是治疗性蛋白，在某些 实施方案中，优选地是分子量低于20,000kD的蛋白。然而，要注意的 是，当使用术语“治疗剂”或“具有生物学活性的蛋白”时，本发明 明确地不包括胰岛素、肉毒毒素、VEGF和抗体片段。然而，因为适合 于免疫的抗原具有其他生物学活性例如产生免疫应答，因此这些仍包 括在本发明的合适的方面。在本发明的其他实施方案中，具有生物学 活性的试剂可以是非蛋白非核苷酸试剂(例如，某些抗真菌剂)。此 处提供合适的具有生物学活性的试剂的其他非限定性示例。

在本发明的所有方面，此处描述的载体和具有生物学活性的试剂 之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所述相互作用可包括，例 如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。

在某些实施方案中，本发明提供了包含下列物质的非共价复合物 的组合物：

a)带正电荷的主链；和

b)至少一个选自下列的成员：

i)具有数个附着的成像部分或数个带负电荷的成像部分 的第一带负电荷的主链；

ii)具有数个附着的靶向试剂或数个带负电荷的靶向部分 的第二带负电荷的主链；

iii)非蛋白非核苷酸的具有生物学活性的试剂；

iv)除了胰岛素、肉毒毒素、VEGF和抗体片段外的治疗性 蛋白，

其中所述复合物携带净正电荷。在一组实施方案中，所述组合物 包含至少二个选自组i)至iv)的成员。在另一组实施方案中，所述组 合物包含来自i)和ii)组的每一组中的至少一个成员和一个来自iii) 或iv)组的成员。优选地带正电荷的主链的长度是来自b)组的成员的 组合长度的大约1至4倍。可选择地，所述带正电荷的主链的电荷是 来自b)组的成员的组合电荷的大约1至4倍。在一些实施方案中，电 荷密度是均匀的并且长度比率和电荷比率近似相等。可基于组分的分 子研究或可从组分的质量来确定大小对大小(长度)的比率。

“带正电荷的”是指载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在 一些生理相容的条件下具有正电荷。更确切地，此处所用的“带正电 荷的”是指所述基团含有在所有pH条件都带电荷的官能团，例如季胺， 或含有可在某些溶液相条件下例如伯胺情况下pH发生变化的条件下 获得正电荷的官能团。更优选地，此处所用的“带正电荷的”是指具 有在生理相容条件下和阴离子结合的形为的基团。对于本领域技术人 员而言很明显的是具有多个带正电荷的部分的聚合物不必是同聚物。 对于本领域技术人员而言，带正电荷的部分的其他示例在现有技术中 是熟知的并且可容易地使用。本发明中描述的其自身不具有治疗活性 的带正电荷的载体代表在例如此处描述的组合物和方法中可用的新的 化合物。因此，在本发明的另一方面，我们详细描述了这些新的化合 物，其包括包含这样的带正电荷的主链和其自身不具治疗性生物学活 性的任何载体，所述主链具有此处描述的附着的带正荷的分支基团。 当使用术语“治疗剂”或“具有生物学活性的蛋白”时，本发明明确 地排除抗体片段。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物学活性 例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。

在另一个实施方案中，本发明提供了这样的组合物，该组合物包 含具有生物学活性的试剂和包含带正电荷的主链的载体。所述具有生 物学活性的试剂可以是，例如，蛋白(特别是分子量低于20,000kD 的蛋白)、非蛋白非核苷酸治疗剂(例如某些抗真菌剂)或用于免疫 的试剂。所述载体可以是，例如，带正电荷的多肽或非肽基聚合物， 其可以是异聚物或同聚物例如聚烯化亚胺。所述多肽或非肽基聚合物 可具有此处描述的带正电荷的分支基团或“效能”基团。各个基于蛋 白的治疗剂和非核苷酸非蛋白治疗剂具有独特的改变总复合物特性的 物理化学特性。这些带正电荷的载体是下面被描述为带正电荷的主链 的材料中的一些材料。

本发明也提供了施用治疗有效量的具有生物学活性的试剂的方 法，其包括给受试者(其可以是人或其他哺乳动物)的皮肤或上皮施 用具有生物学活性的试剂和一定量的具有分支基团的带正电荷的主 链，所述量足以将所述蛋白透皮递送给受试者。在该方法中，所述蛋 白和带正电荷的载体可作为预先混合的组合物而应用，或可以分开的 方式给皮肤或上皮施用。例如，所述蛋白可存在于皮肤贴剂中或其他 装置中，所述载体可含于液体或其他类型的组合物中，所述组合物在 使用皮肤贴剂之前用于皮肤。

带正电荷的主链

带正电荷的主链(也称作带正电荷的“载体”)一般是线性的原 子链，其在链上具有在生理pH下携带正电荷的基团，或具有附着至侧 链(其是从主链延伸出来的侧链)上的携带正电荷的基团。优选地， 带正电荷的主链自身不具有明确的酶促或生物学活性。线性主链是碳 氢主链，在一些实施方案中，其被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子 插入。大部分主链原子通常是碳原子。此外，所述主链通常是重复单 位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基、聚(丙烯胺)、聚烯化亚胺等)的 聚合物，但可以是异聚合物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是 聚丙烯胺，其中许多胺的氮原子以携带正电荷的铵基(四取代的)形 式存在。在另一实施方案中，带正电荷的主链是非肽基聚合物，其可 以是异聚合物或同聚合物例如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯 亚胺，其具有从大约10,000至大约2,500,000、优选地从大约 100,000至大约1,800,000，和最优选地从大约500,000至大约1,400, 000的分子量。在另一组实施方案中，所述主链已附着多个含有带正 电荷基团(例如，铵基、吡啶基、基、锍基、胍基或amidinium基) 的侧链部分。该组实施方案中的侧链部分可以以间隔上是一致的或可 变的间距沿主链排布。此外，侧链的长度可以相似或不同。例如，在 一组实施方案中，侧链可以是具有从1至20个碳原子并在远端(远离 主链)以上面提到的带正电荷的基团中的一个结束的线性的或分枝的 烃链。在本发明的所有方面，载体和具有生物学活性的试剂之间的结 合是通过非共价相互作用结合的，所述相互作用的非限定性示例包括 离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。

在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链 基团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选 地，所述多肽具有从大约10,000至大约1,500,000，更优选地从大 约25,000至大约1,200,000，最优选地从大约100,000至大约1,000, 000的分子量。本领域技术人员认识到，当氨基酸用于本发明的该部 分时，所述侧链在附着的中心可具有D型或L型(R或S构型)。可 选择地，所述主链可以是多肽的类似物，例如类肽peptoid。参见， 例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)； Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1992)；和 Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 89：9367(1992))。简 而言之，类肽是多聚甘氨酸，其中侧链附着至主链的氮原子而不是附 着至α碳原子。如上所述，侧链的部分通常以带正电荷的基团结尾以 提供带正电荷的主链组分。在例如美国专利号5,877,278中描述了类 肽的合成。当该术语用于此处时，具有类肽主链结构的带正电荷的主 链被认为是“非肽”，因为其不是由在α碳原子位置上具有天然发生 的侧链的氨基酸构成的。

通过应用例如多肽的空间或电子模拟物可使用多种其他主链，其 中肽的酰胺键由替代物取代，所述替代物是例如酯键、硫代酰胺 (-CSNH-)、反向硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亚甲基(-NHCH2-)或反向亚 甲基氨基(-CH2NH-)、酮亚甲基(-COCH2-)、次磷酸(-PO2RCH2-)、磷酰 胺和磷酰胺酯(-PO2RNH-)、反向肽(-NHCO-)、反式烯烃(-CR＝CH-)、氟 代烯烃(-CF＝CH-)、二亚甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羟亚乙基(-CH (OH)CH2-)、亚甲氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、亚磺酰氨基(-SO2NH-)、 亚甲亚磺酰氨基(-CHRSO2NH-)、反向亚磺酰氨基(-NHSO2-)，以及具 有丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亚基的主链，例如，由Fletcher等 人((1998)Chem.Rev.98：763)综述的，和由其中引用的参考资料 所详细描述的。许多前述的替代物产生近似电子等排的聚合物主链(和 形成于α氨基酸的主链相比)。

在上面提供的各主链中，可悬挂携带带正电荷的基团的侧链基 团。例如，亚磺酰胺连接的主链(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附着至 氮原子上的侧链基团。类似地，羟乙烯基(-CH(OH)CH2-)链可携带 附着至羟基取代基的侧链基团。通过使用标准的合成方法，本领域技 术人员可容易地改造其他键合化学物质以使其提供带正电荷的侧链基 团。

在特别优选的实施方案中，带正电荷的主链是这样的多肽，所述 多肽具有这样的分支基团(也称作效能基团)，所述分支基团包含 (gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或触角足(Antennapedia)的 蛋白转导域、或其片段，其中下标n1是从0至20的整数，更优选地 是0至8的整数，更优选地是2至5的整数，下标n2独立地是从大约 5至大约25、更优选地大约7至大约17、最优选地大约7至大约13 的奇整数。其他优选的实施方案是这样的实施方案，在所述实施方案 中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、 (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下标p 和q各独立地是从0至20的整数，所述片段通过该片段的C端或N 端附着至主链。优选的HIV-TAT片段是其中下标p和q各自独立地是 0至8、更优选地2至5的整数的片段。在另一优选的实施方案中，带 正电荷的侧链或分支基团是触角足(Antp)蛋白转导域(PTD)、或其保 持活性的片段。优选地带正电荷的载体包括至少大约0.05％(总载体 重量的百分比)、优选地从大约0.05至大约45％重量和最优选地从大 约0.1至大约30％重量的量的侧链带正电荷的分支基团。对于具有式 -(gly)n1-(arg)n2的带正电荷的分支基团，最优选的量是从大约0.1至 大约25％。

在另一特别优选的实施方案中，所述主链部分是多聚赖氨酸，带 正电荷的分支基团附着至所述赖氨酸侧链的氨基。用于该特别优选的 实施方案的多聚赖氨酸具有从大约10,000至大约1,500,000、优选 地从大约25,000至大约1,200,000，和最优选的大约100,000至大 约1,000,000的分子量。其可以是可商购获得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚赖氨酸中的任一种，例 如，具有MW＞70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的 MW的多聚赖氨酸、具有MW 150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有 MW＞300,000的多聚赖氨酸。多聚赖氨酸的恰当选择依赖于组合物的 其余组分，要足以为组合物提供总的净正电荷和提供一定的长度，该 长度优选地是带负电荷的组分的组合长度的1至4倍。优选的带正电 荷的分支基团或效能基团包括，例如， -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或 HIV-TAT。在另一优选的实施方案中，带正电荷的主链是长链聚烯化亚 胺例如聚乙烯亚胺，例如，具有分子量大约为1,000,000的聚乙烯亚 胺。

这样的带正电荷的主链或载体分子是新的化合物并形成本发明 的方面，所述主链或载体包含具有上述分支基团的多肽或聚烯化亚胺。

在本发明的另一个实施方案中，只有具有带正电荷的分支基团的 带正电荷的载体是活性物质(例如，具有生物学活性的试剂，或成像/ 靶向试剂)的透皮递送所必需的。在该情况的一个实施方案中，所述 带正电荷的载体是具有多个上述的带正电荷的侧链基团的多肽(例如， 赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)。优选地，所述多肽具有至 少大约10,000的分子量。在另一个实施方案中，带正电荷的载体是非 肽基聚合物例如具有至少大约100,000的分子量的具有多个带正电荷 的侧链基团的聚烯化亚胺。这些聚烯化亚胺包括聚乙烯亚胺和聚丙烯 亚胺。在任一示例中，为了用作透皮递送所唯一必需的试剂，所述带 正电荷的载体分子包含带正电荷的分枝或效能基团、HIV-TAT或其片 段、触角足PTD或其片段，所述带正电荷的分枝或效能基团包含 -(gly)n1-(arg)n2，其中下标n1是从0至20，更优选地从0至8，更 优选地从2至5的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25，更优 选地从大约7至大约17和最优选地从大约7至大约13的奇整数。优 选的侧链或分支基团具有上述的通式-(gly)n1-(arg)n2。其他优选的实 施方案是这样的方案，在所述方案中，分支基团或效能基团是具有式 (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立 地是从0至20的整数，所述片段通过该片段的C端或N端附着至载体 分子。所述侧链分支基团可在附着的中心具有D型或L型(R或S构 型)。优选的HIV-TAT片段是这样的片段，在所述片段中，下标p和 q各自独立地是从0至8、优选地2至5的整数。其他优选的实施方案 是这样的实施方案，在所述实施方案中，分支基团是保持基团活性的 触角足PTD基团或其片段。这些在本领域中是已知的，例如根据 Console等人，J.Biol.Chem.278：35109(2003)。

在特别优选的实施方案中，所述载体是具有附着至赖氨酸侧链氨 基的带正电荷的分支基团的多聚赖氨酸。用于该特别优选的实施方案 的多聚赖氨酸可以是可商购获得(例如Sigma Chemical Company，St. Louis，Missouri，USA)的多聚赖氨酸中的任一种，例如，具有MW＞ 70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚赖氨酸、 具有MW 150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有MW＞300,000的多 聚赖氨酸。然而，优选的多聚赖氨酸具有至少大约10,000的MW。优 选的带正电荷的分支基团或效能基团包括，例如， -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT 或其片段、和触角足PTD或其片段。

其他组分

除了带正电荷的主链组分外，本发明的多组分组合物还包含至少 一种选自下列的组分：

i)具有数个附着的成像部分或数个带负电荷的成像部分的第 一带负电荷的主链；

ii)具有数个附着的靶向试剂或数个带负电荷的靶向部分的第 二带负电荷的主链；

iii)非蛋白非核苷酸的具有生物学活性的试剂

iv)除了胰岛素、肉毒毒素、VEGF和抗体片段外的治疗性蛋白。

在此处描述的相关方面，在本发明的一些实施方案或组合物中， 带正电荷的主链或载体可单独地用于提供某些类型的物质的透皮递 送。此处描述的具有生物学活性的试剂的组合，例如，非核苷酸非蛋 白治疗剂例如抗真菌剂或除了胰岛素、肉毒毒素、VEGF和抗体片段(特 别是具有分子量低于20,000kD的蛋白)的蛋白，和适合用于免疫的抗 原性试剂的组合，也可用于这些组合物。在本发明的相关方面，一些 实施方案或组合物包含成像试剂例如适合用于磁共振成像或光学成像 的试剂。这些实施方案或组合物可以，例如，提供用于黑色素瘤光学 成像试剂的局部递送。

带负电荷的主链，当用于携带成像部分、靶向部分和治疗剂时， 可以是具有在生理pH条件下携带负电荷的基团的各种主链(类似于上 述的主链)。可选择地，具有足够表面负电荷的部分的成像部分、靶 向部分和治疗剂不需要附着额外的主链来和带正电荷的主链通过离子 相互作用结合，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在该上下文 中，“足够的”包含有这样的意思，即成像部分、靶向部分或治疗剂 的表面存在带负电荷的基团的合适的密度，从而提供对上述的带正电 荷的主链的离子引力。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够 的负电荷和本发明的带正电荷的载体非共价地结合。可选择地，可使 用其他不带电荷的部分以足够的密度提供和本发明的载体主链的非离 子、非共价结合，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在离子或 非离子非共价相互作用的意义上，术语“足够的”可以通过例如颗粒 大小或功能分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定。合适 的带负电荷的基团是羧酸、次膦酸、膦酸或磷酸、亚磺酸或磺酸等。 在一些实施方案中，带负电荷的主链是寡糖(例如，葡聚糖)。在另 一个实施方案中，带负电荷的主链是多肽(例如，多聚谷氨酸、多聚 天冬氨酸或这样的多肽，即在所述多肽中，谷氨酸或天冬氨酸残基被 不带电荷的氨基酸间插)。一般通过酯键可将下面更详细描述的部分 (成像部分、靶向部分和治疗剂)附着至具有这些悬挂基团的主链。 可选择地，分隔带负电荷的氨基酸或悬挂在带负电荷的主链的末端的 氨基酸可用于附着成像部分和靶向部分，通过例如二硫键(通过半胱 氨酸残基)、酰胺键、醚键(通过丝氨酸或苏氨酸的羟基)等进行附 着。

在带负电荷的聚合物不存在的情况下，所述成像部分和靶向部分 自身可以是小阴离子。可选择地，所述成像部分、靶向部分和治疗剂 自身可通过共价修饰以提供足够的表面带负电荷的部分以和带正电荷 的主链通过离子相互作用结合，这对于本领域技术人员来说是显而易 见的。在这两种情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以和 本发明的带正电荷的载体非共价结合。在该上下文中，术语“足够的” 是指可通过例如颗粒大小或功能性分光光度学上的变化(和单独的组 分相比)来确定的结合。

成像部分

许多诊断或成像部分用于本发明并以有效的量存在，该有效量依 赖于进行诊断或成像的条件、施用的途径、试剂和用于所述试剂的检 测的设备的灵敏性等。

合适的成像或诊断剂的示例包括不透射线的照影剂、顺磁性照 影剂、超顺磁性照影剂、光学成像部分、CT造影剂和其他造影剂。例 如，不透射线的照影剂(用于X射线成像)可包括无机和有机碘化合 物(例如，泛影酸盐)、不透射线的金属和其盐(例如，银、金、铂等) 和其他不透射线的化合物(例如，钙盐、钡盐例如硫酸钡、钽和氧化 钽)。合适的顺磁性照影剂(用于MR成像)包括二乙三胺五乙酸钆 (Gd-DTPA)和其衍生物，和其他钆、锰、铁、镝、铜、铕、铒、铬、 镍和钴复合物，包括和1，4，7，10-四氮杂环十二烷基-N，N′，N″，N- 四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷基 -N，N′，N″-三乙酸(D03A)、1，4，7-三氮杂环壬烷基-N，N′，N″-三乙酸 (NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷基-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)、 羟基苄基乙烯基-二胺二乙酸(HBED)等的复合物。合适的超顺磁照影 剂(用于MR成像)包括磁铁矿、超顺磁性氧化铁、单晶体氧化铁，特 别是可被附着至带负电荷的主链的这些试剂中的各试剂的复合形式。 其他合适的成像试剂是CT照影剂，包括碘化和非碘化以及离子化和非 离子化的CT照影剂，以及照影剂例如自旋标记物(spin-labels)或其 他诊断上有效的试剂。合适的光学成像试剂包括例如Cy3、Cy3.5、 Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、 Oregon green 514、绿色荧光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和 HAMRA。

诊断剂的其他示例包括标记物。可使用各种标记物或标签，例如 放射性核素、fluors、酶、 底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配体(特 别是半抗原)等。其他有用的物质是用放射性物质或成分标记的物质， 例如葡庚糖酸99mTc盐。

将成像部分附着至带负电荷的主链的选择依赖于许多条件。某些 成像试剂在生理pH下是中性的，从而优选地附着至带负电荷的主链， 或者所述试剂被共价修饰从而包含足够的带负电荷的部分，从而和带 正电荷的载体形成复合物。其他成像试剂携带足够的负电荷，即使在 缺少带负电荷的主链的情况下仍和带正电荷的载体形成复合物。在这 些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷和本发明的带正电 荷的载体非共价地结合。术语“足够的”在本上下文中是指可通过例 如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确 定的结合。带负电荷的成像部分的示例是磷酸根离子，其用于磁共振 成像。

靶向试剂

许多靶向试剂用于此处描述的组合物。一般地，如上面对于成像 试剂所讨论的，将靶向试剂附着至带负电荷的主链。一般地，靶向试 剂可以是任何这样的成分，即该成分使得可能指导治疗剂或组合物的 另一组分到达特定位点或改变复合物的向性(相对于没有所述靶向试 剂的复合物的向性)。靶向试剂可以是细胞外靶向试剂。这样的试剂 也可以是细胞内靶向试剂，其可使治疗剂定向至特定的细胞区室(例 如，线粒体、细胞核等)。所述试剂最简单地也可以是小阴离子，其通 过改变净电荷的分布来改变复合物的向性，使其从更高的带负电的细 胞表面和细胞外基质组分转向更多的细胞种类或甚至特异性地离开带 有最多负电的表面。

优选地将靶向试剂或试剂共价地或非共价地和本发明的带负电 荷的主链连接。根据本发明的优选的模式，优选地通过连接性基团将 靶向试剂共价地附着至用作带负电荷的主链成分的聚天冬氨酸、硫酸 化或磷酸化的葡聚糖等。在一组实施方案中，所述靶向试剂是用于提 高细胞转染(即，用于促进组合物或其各种成分跨膜迁移，或者用于 帮助从内体外出或穿过核膜)的融合肽。所述靶向试剂也可以是存在 于细胞类型的表面上的受体的细胞受体的配体，例如糖、转铁蛋白、 或去唾液酸-血清类粘蛋白。

其他有用的靶向试剂包括糖、肽、激素、维生素、细胞因子、小 阴离子、脂质或来源于这些成分的序列或部分，并且所述序列或部分 能够和其对应的受体特异性结合。优选地，所述靶向试剂是糖和/或肽 细胞受体的配体或其片段、受体或受体片段等。更优选地，所述靶向 试剂是生长因子受体、细胞因子受体或细胞凝集素受体或粘着蛋白的 受体的配体。靶向试剂也可以是使得可能靶向凝集素例如去唾液酸糖 蛋白受体的糖。

在其他实施方案中，在缺少带负电荷的主链的情况下使用靶向 试剂。在该组实施方案中，靶向试剂携带足够的带负电荷的部分以和 上述的带正电荷的载体形成离子复合物。在这些情况下，所述物质或 其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价结 合。术语“足够的”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功能性 分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来决定的结合。用于该组 实施方案的合适的带负电荷的靶向试剂是在生理学pH下具有净负电 荷的基于蛋白的靶向试剂和可促进附着至特定细胞表面的靶向试剂， 例如小的聚阴离子(例如，磷酸盐、天冬氨酸盐和柠檬酸盐)，所述 聚阴离子可基于被靶向的细胞的净表面电荷而改变靶向。

具有生物学活性的试剂

许多具有生物学活性的试剂，包括治疗剂和药妆剂，可用于本发 明并且以有效的量存在，所述有效的量依赖于正被治疗或预防的病症 或施药的途径、试剂的功效以及患者的大小和对治疗方案的敏感性。

如前面提到的，当使用术语“治疗剂”或“具有生物学活性的蛋 白”时，本发明明确地不包括肉毒毒素、VEGF和抗体片段。此外，本 发明明确地不包括能够获得血糖水平的治疗性改变(例如，治疗高血 糖)的治疗性蛋白，例如胰岛素。然而，因为适合用于免疫的抗原具 有其他的生物学活性(例如产生免疫应答)，因此其仍包含于本发明 的适当的方面之内。适合用于免疫的抗原性试剂可以是不会治疗性地 改变血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核苷酸试剂或其杂合体。 然而，编码抗原的核苷酸明确地不适合于本发明的组合物。因此，所 包括的试剂是其适合用于免疫的抗原自身。合适的抗原包括，例如， 针对环境试剂、病原体或生物危害物的抗原。合适的抗原性试剂优选 地包括，例如，和疟疾、狂犬病、炭疽、结核病的治疗相关的抗原， 或涉及儿童免疫例如对B型肝炎、白喉、百日咳、破伤风、b型嗜血 杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、麻疹、腮腺炎、风疹、水 痘、肺炎球菌、A型肝炎和流感的免疫的抗原。

可附着至带负电荷的主链的合适的治疗剂基本上可在任何种类 的试剂中找到，包括，例如，止痛药、镇喘药、抗生素、抗抑郁药、 抗糖尿病药、抗真菌剂、止吐药、抗高血压药、抗性无能药、抗炎药、 抗肿瘤药、抗HIV药、抗病毒药、anxiolytic agents、避孕药、致育 剂、抗血栓药、prothrombotic agents、激素、疫苗、免疫抑制剂、 维生素等。可选择地，可将足够的带负电荷的基团引入治疗剂以提供 和上述带正电荷的主链通过离子相用作用的结合。存在许多合适的方 法例如磷酸化法或硫酸盐化法，这对本领域技术人员是显而易见的。

此外，某些试剂自身拥有足够的和上述带正电荷的载体结合的带 负电荷的部分而不需要附着至带负电荷的主链。在这些情况下，所述 物质或其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共 价结合。术语“足够的”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功 能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。

合适的药妆剂包括，例如，表皮生长因子(EGF)以及人生长激 素和抗氧化剂。

更特别地，用于本发明的治疗剂包括镇痛药如利多卡因、奴佛卡 因、布比卡因、普鲁卡因、丁卡因、苯佐卡因、可卡因、甲哌卡因、 依替卡因、丙美卡因、罗哌卡因、丙胺卡因等；抗哮喘药例如氮卓斯 汀、酮替芬、曲撤诺、皮质激素、色甘酸钠、萘多罗米、沙丁胺醇、 双甲苯喘定甲磺酸盐、吡布特罗、沙美特罗、terbutyline、胆茶碱等； 抗生素药例如新霉素、链霉素、氯胺苯醇、氟哌酸、环丙沙星、甲氧 苄氨嘧啶、sulfamethyloxazole、β-内酰胺类抗生素、四环素等； 抗抑郁药例如奈福泮、奥昔哌汀、米帕明、曲唑酮等；抗糖尿病药例 如双胍biguanidines、磺脲类药等；止吐药和抗精神病药例如氯丙嗪、 氟奋乃静、奋乃静、丙氯拉嗪、普鲁本近、甲哌硫丙嗪、三氟丙嗪、 氟派啶醇、东莨菪碱、地芬尼多、曲美苄胺等；神经肌肉因子例如阿 曲库、氯化米哇库铵、罗库溴铵、氯化琥珀胆碱、多沙氯铵、筒箭毒 碱；抗真菌剂例如两性霉素B、制霉素、杀念珠菌素、依曲康唑、酮 康唑、咪康唑、克霉唑、氟康唑、环吡酮、益康唑、萘替芳、特比萘 芬、灰黄霉素、环吡酮等；抗高血压药例如萘心安、普罗帕酮、 oxyprenolol、尼非地平、利血平等；抗性无能药例如一氧化氮供体等； 抗炎药包括固醇类抗炎药例如可的松、氢化可的松、地塞米松、去氢 氢化可的松、泼尼松、氟扎可等，和非固醇抗炎药例如吲哚美辛、布 洛芬、雷米那酮、prioxicam等；抗肿瘤药例如阿霉素、环磷酰胺、 放线菌素、博来霉素、duanorubicin、多柔比星、表柔比星、丝裂霉 素、雷帕霉素、甲氨喋呤、夫洛夫脱兰、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、顺 铂、鬼臼乙叉甙、干扰素、苯芥胆甾醇、紫杉酚(包括类似物和衍生 物)、喜树碱和其衍生物、长春碱、长春新碱等；抗HIV药(例如， antiproteolytics)；抗病毒药例如金刚烷胺、美替沙腙、碘苷、阿糖 胞苷、阿昔洛维、泛西洛维、更苷洛韦、膦甲酸、索利夫定、三氟尿 苷、伐昔洛韦、西多福韦、地达诺新、司他夫定、扎西他宾、叠氮胸 苷、三氮唑核苷、金刚乙胺等；抗焦虑药(anxiolytica gents)例如 硝苯呋海因、地西泮等；COX-2抑制剂；避孕药例如孕激素等；抗血 栓药例如GPIIb/IIIa抑制剂、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子、 链激酶、尿激酶、肝素等；prothrombotic agents例如凝血酶、因 子V、VII、VIII等；激素例如生长激素、催乳素、EGF(表皮生长因 子)等；免疫抑制剂例如环孢霉素、硫唑嘌呤、mizorobine、FK506、 泼尼松等；维生素例如A、D、E、K等；和其他治疗性或药物活性的 试剂。参见，例如，GOODMAN&GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第9版，Hardman，等人，eds.McGr aw-Hill， (1996)。

在最优选的实施方案中，所述生物学试剂选自具有低于20,000kD 的分子量的蛋白和其他具有生物学活性的试剂例如非蛋白非核苷酸治 疗剂，例如某些抗真菌剂和用于免疫的抗原性试剂。在本发明的所有 方面，合适的示例明确地不包括胰岛素、肉毒毒素、VEGF和抗体片段。

如上面对于靶向试剂和成像试剂所指出的，可在缺少带负电荷的 主链的情况下使用某些生物学试剂或药妆剂。这些生物学试剂或药妆 剂是这样的试剂，该试剂在生理pH下一般携带净负电荷以和带正电荷 的载体形成复合物。示例包括用于免疫的抗原(其一般包括蛋白或糖 蛋白)和许多抗真菌剂，以及用于黑色素瘤的靶向成像的试剂(其具 有或不具有固有的治疗潜能)。在这些情况下，所述物质或其衍生物 具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价地结合。术语 “足够的”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度 学上的变化(和单独的组分相比)来决定的结合。

具有附着的成像部分、靶向试剂或治疗剂的带负电荷的主链

对于上面的组分组中的三组组分，包括成像部分、靶向试剂和治 疗剂，将单个的化合物附着至带负电荷的主链，通过共价修饰以引入 带负电荷的部分，或者，如果该化合物含有足够的带负电荷的部分， 可直接使用其，以提供和上述的带正电荷的主链的离子结合。必要时， 一般地，通过连接性基团进行附着，用于将特定的试剂共价地附着(借 助于存在于所述试剂和主链上的官能团)至主链。许多连接性基团用 于本发明的该方面。参见，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques， Academic Press，San Diego，CA(1996)；Wong，S.S.，Ed.， Chemistry of Protein Conjuga tion and Cross-Linking，CRC Press， Inc.，Boca Raton，FL(1991)；Senter，等人，J.Org.Chem.55： 2975-78(1990)；和Koneko，等人，Bioconjugate Chem.2：133-141 (1991)。

在一些实施方案中，治疗剂、诊断剂或靶向试剂不具有可用于附 着连接性基团的官能团，从而可首先经修饰以引入例如羟基、氨基或 硫醇取代基。优选地，在试剂的非干扰部分提供所述取代基，所述取 代基可用于附着连接性基团，并且不会不利地影响试剂的功能。

在另一方面，本发明提供了这样的组合物，该组合物包含具有至 少一个附着的效能基团的带正电荷的主链的非共价复合物。在本发明 的该方面，带正电荷的主链基本上可以是上述带正电荷的主链中的任 何一种，并且也包含(和上面选择的主链一样)至少一个附着的效能基 团。合适的效能基团包括，例如，(Gly)n1-(Arg)n2，或TAT结构域， 其中下标n1是从3至大约5的整数，下标n2独立地是从大约7至大 约17的奇整数。例如，TAT结构域可具有式 (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下标p和q各独立地是从0至20的 整数，所述片段通过该片段的C端或N端附着至载体分子。侧链分支 基团在附着的中心可具有D型或L型(R或S构型)。优选的HIV-TAT 片段是其中下标p和q各自独立地是0至8、更优选地2至5的整数 的片段。

某些其他分子的透皮递送

已发现上述带正电荷的载体可用于蛋白和某些其他具有生物学 活性的试剂(例如，具有分子量低于20,000kD的蛋白、非蛋白非核苷 酸治疗剂例如某些抗真菌剂、或用于免疫的抗原性试剂)的透皮递送。 带正电荷的载体的使用可使蛋白或标记基因都能够运入皮肤细胞或运 出皮肤细胞，和以有效量和活性形式将其递送入深层组织。与可注射 的或可移植的材料相比，以这种方式进行的局部递送可减少剂量、降 低毒性和可使为想要的效果提供更精确的剂量最优化，特别是在抗真 菌剂、适合用于免疫的抗原性试剂或用于皮肤病症例如黑色素的分子 成像的情况下。该实施方案可包含一些小的优选多价的阴离子，例如， 磷酸盐、天冬氨酸盐或柠檬酸盐，或可在基本上缺少这样的聚阴离子 的情况下进行该实施方案。

类似地，术语“蛋白”包括从天然来源中提取的蛋白和可通过化 学或重组的方法通过合成获得的蛋白。蛋白也可以以经修饰的形式存 在，或者例如以重组肽、融合蛋白或杂合分子的形式存在。在一些情 况下，蛋白可以是具有必需的活性的更大的蛋白分子的部分。优选的 蛋白是分子量低于20,000kD的蛋白[例如，可用于透皮组合物和方法 的蛋白，例如用于免疫的抗原]，其在物理化学性质上可发生很大的变 化。同样，可从天然来源获得或可合成非蛋白非核苷酸治疗剂，包括 抗真菌剂。

本发明的组合物优选地以产品形式存在，以用于受试者或患者 (即需要特定治疗的人或其他哺乳动物)的皮肤或上皮。术语“需要” 是指包括药物和健康相关的需要以及想要更加美观、更具美感或更主 观的需要。组合物也可用于例如改变或改善面部组织的外观。

一般地，通过将要被施用的蛋白(特别是分子量低于20,000kD 的蛋白)或其他具有生物学活性的试剂(例如，非蛋白非核苷酸治疗 剂或用于免疫的试剂)和带正电荷的载体以及通常地一种或多种额外 的药物可接受的载体或赋形剂混合来制备组合物。在其最简单的形式 中，其可包含可被缓冲的简单的药物可接受的水性载体或赋形剂，例 如盐水。然而，组合物可包含一般存在于局部药物组合物或药妆组合 物中的其他成分，包括皮肤或药物可接受的载体、赋形剂或介质(即 和其施用的组织相容的载体、赋形剂或介质)。此处使用的术语“皮 肤或药物可接受的”是指此处描述的组合物或其组分适合用于和这些 组织接触，或用于患者而通常无过度的毒性、不相容性、不稳定性、 过敏反应等。适当地，本发明的组合物可包含常规地用于所述领域特 别是药妆和皮肤学领域中的任何组分。在本发明的所有方面，载体和 具有生物学活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所 述相互作用包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组 合。

可预先配制组合物或在施用时制备组合物，例如，通过提供在施 用时或施用前进行组装的试剂盒来进行制备。可选择地，如上面所提 到的，可以分开的形式例如通过提供这样的试剂盒来给患者施用治疗 性蛋白和带正电荷的主链，例如通过提供包含皮肤贴剂或含有治疗性 蛋白的其他分配装置和含有带正电荷的载体(和任选地其他成分)的 液体、凝胶、乳膏剂等来施用。在该特定的实施方案中，通过给皮肤 使用含有载体的液体或其他组合物，然后使用皮肤贴剂或其他装置来 施用组合物。

施用本发明的组合物，以使能够施用有效量的治疗性蛋白或其他 有益物质，例如成像试剂或靶向试剂。对于透皮递送，术语“有效量” 是指提供更多的具有生物学活性的试剂的透皮递送(和在缺少载体的 情况下的所述试剂相比)的任何组合物或方法。对于抗原，“有效量” 是指足以使受试者能够在使用或系列使用抗原后产生对抗原的免疫应 答的量。对于抗真菌剂，“有效量”是指足以减少真菌感染引起的症 状或体征的量。对于不会治疗性地改变血糖水平的其他具有生物学活 性的试剂而言，“有效量”是指这样的量，即该量足以产生表征该试 剂(例如Physicians′Desk Reference等中的试剂)的明确生物学效 果或治疗效果而不引起明显的毒性。当使用术语“治疗剂”或“具有 生物学活性的蛋白”时，本发明明确地排除抗体片段。然而，因为适 合用于免疫的抗原具有其他生物学活性例如产生免疫应答，因此这些 仍属于本发明的适当的方面。

组合物可包含合适的有效量的治疗性蛋白或其他具有生物学活 性的试剂，以进行单剂治疗应用，或其可以是更浓缩的，以在施用的 部位进行稀释的方式或以多次施用的方式进行使用。一般地，含有蛋 白(特别是分子量低于20,000kD的蛋白)或其他具有生物学活性的试 剂的组合物可含有按重量计算从大约1×10-20至大约25％的具有生物 学活性的试剂和从大约1×10-19至30％的带正电荷的载体。一般地， 含有非蛋白非核苷酸治疗剂或用于免疫的试剂的组合物可含有按重量 计算从大约1×10-10至大约49.9％的抗原和从大约1×10-9至大约 50％的带正电荷的载体。载体分子的量或其与具有生物学活性的试剂 的比例依赖于所述组合物中选择使用的载体。通过，例如进行一个或 多个实验例如下面描述的实验可容易地确定在给定的情况下载体分子 的合适的量或比例。

本发明的组合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、悬浮液、乳 膏剂、洗剂、凝胶、粉剂或其他用于给可使用所述组合物的皮肤或其 他组织施用的典型固体或液体组合物。除了具有生物学活性的试剂和 载体分子外，这些组合物可包含一般用于此类产品的其他成分，例如 抗微生物剂、增湿剂和水合剂(hydration agents)、渗透剂、防腐 剂、乳化剂、天然的或合成的油、溶剂、表面活性剂、去垢剂、胶凝 剂、润滑药、抗氧化剂、芳香剂、充填剂、增稠剂、石蜡、气味吸收 剂(odor absorbers)、染料、着色剂、粉剂、粘度控制剂和水，和 任选地包含麻醉剂、止痒添加剂、植物萃取物、调节剂、暗化剂 (darkening agent)或亮化剂(lightening agent)、吉洛特、湿 润剂、云母、矿物质、多酚、硅氧烷或其衍生物、防晒剂(sunblocks)、 维生素和植物药(phytomedicinals)。

本发明的组合物可以控释组合物或缓释组合物的形式存在，其中 将要递送的蛋白物质和载体包囊化或装入材料中，以使其在一段时间 内以受控的方式释放至皮肤上。可将要递送的物质和载体装入基质、 脂质体、载体、微囊、微球体等，或装入固体颗粒材料，所有这些材 料都是被选择和/或被构建来在一段时间内释放所述物质的。可将治疗 性物质和载体一起包囊化(例如，在相同的包囊中)或分开包囊化(在 分开的胶囊中)。

当然，给受试者施用本发明的组合物是本发明的另一方面。

通过皮肤贴剂等在受控释放和/或监控的情况下进行施用可能是 普便的方法，因此通常以在皮肤贴剂或其他装置中包含组合物的形式 提供本发明的组合物。在适合用于免疫的抗原的情况下，最优选地， 通过在医生或其他专业护理人员的指导下施用所述组合物。其可以单 次治疗的方式或以在一段时间内多次周期治疗的方式进行施用。对于 用于上述目的适合用于免疫的抗原的透皮递送，将上述的组合物局部 地施用于皮肤或甲板以及周围的皮肤。类似地，在非蛋白非核苷酸治 疗剂例如抗真菌剂的情况下，优选地，在医生或其他专业护理人员的 指导下施用所述组合物。其可以单次治疗或以在一段时间内多次周期 治疗的方式进行施用。为进行治疗性蛋白的透皮递送，将上述的组合 物局部地给皮肤施用。

用于在专业护理人员指导下施用或由患者或受试者施用本发明 的组合物的试剂盒也可包含适合于该目的定制的施药器。在用于甲板 或脚趾甲板或周围的解剖结构的施药器的情况下，这样的定制的施药 器可包括例如人造甲板、甲油(lacquer)、具有着色剂的指甲油、凝 胶或这些材料中的任何一些材料或所有材料的组合。

在另一方面，本发明涉及用于局部施用上述带正电荷的载体和有 效量的具有生物学活性的试剂(例如，具有分子量低于20,000kD的蛋 白、适合用于免疫的抗原、抗真菌剂或非蛋白非核苷酸治疗剂)的组 合的方法。如上所述，可通过使用包含适当的类型和量的这两种物质 (确切地说是载体和具有生物学活性的试剂)的本发明的组合物来进 行施用。然而，本发明也包括以组合的方式施用这两类物质，尽管其 不一定在相同的组合物中。例如，可将治疗性物质以无水的形式整合 入皮肤贴剂或其他分配装置中，可在使用皮肤贴剂之前将带正电荷的 载体给皮肤表面施用，这样可使所述两类物质共同作用，产生想要的 透皮递送。因此，在该意义上，所述两种物质(载体和具有生物学活 性的试剂)以组合或可能相互作用的方式作用，从而在原位形成组合 物或组合。

制备组合物的方法

在另一方面，本发明提供了用于制备药物组合物的方法，该方法 包括将带正电荷的主链组分和至少一种选自下列的成员与药物可接受 的载体组合形成具有净正电荷的非共价复合物：

i)具有数个附着的成像部分或数个带负电荷的成像部分的 第一带负电荷的主链；

ii)具有数个附着的靶向试剂或数个带负电荷的靶向部分 的第二带负电荷的主链；

iii)非蛋白非核苷酸的具有生物学活性的试剂；

iv)除了胰岛素、肉毒毒素、VEGF或抗体片段外的治疗性蛋 白。

在本发明的一些实施方案中，可单独地使用带正电荷的主链或载 体以提供某些类型的物质的透皮递送。此处，按重量计算包含大约1 ×10-20至大约25％的具有生物学活性的试剂和大约1×10-19至大约30％ 的带正电荷的载体的组合物和方法是优选的。包含非核苷酸非蛋白的 治疗剂例如抗真菌剂或适合用于皮肤病症例如黑色素瘤的诊断的选择 性成像试剂、或适合用于免疫的抗原性试剂的组合物和方法也是优选 的，其中所述组合物和方法按重量计算包含大约1×10-10至大约49.9％ 的所述抗原和大约1×10-9至大约50％的带正电荷的载体。

可容易地配制各种药物组合物的这一易配性说明了本发明的广 泛的可应用性。一般地，通过将带正电荷的主链组分和想要的目的组 分(例如，靶向组分、成像组分或治疗组分)以获得具有可变的净正电 荷的组合物的比例和顺序混合来制备组合物。在许多实施方案中，可 通过例如在bedside使用用于组合物的施用的药物可接受的载体和稀 释剂来配制组合物。可选择地，可通过合适地混合组分来配制组合物， 然后将其冻干和贮存(通常在室温下或更低温度下)直至使用或将其 配制入合适的递送赋形剂中。

可配制组合物以提供适合于各种施用模式的混合物，所述施用模 式的非限制性示例是经局部、经皮肤、经口、经直肠、经阴道、经肠 胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、透皮等途径。本发明的药 物组合物优选地包含这样的赋形剂，所述赋形剂对于可注射特别是用 于直接注射入想要的器官或用于局部施用(至皮肤和/或粘膜)的制剂 是药物可接受的。特别地该药物组合物可以是无菌的、等渗溶液或无 水组合物(例如，冷冻干燥的组合物)，通过加入无菌水或生理盐水， 可使其重构从而制备可注射的溶液。

可选择地，当局部施用组合物时(例如，当想要透皮递送时)， 可将组分或目的组分以无水的形式给皮肤施用(例如，通过使用皮肤 贴剂施用)，其中以分开的方式用带正电荷的主链或载体处理皮肤。 通过该方式，所述总组合物基本上在原位形成并被施用给了患者或受 试者。

使用组合物的方法

递送方法

可使用各种方法在体内或离体将本发明的组合物递送至受试者、 细胞和靶位点。事实上，可使用一般用于将组合物导入使其最终和要 治疗的组织接触的途径中的任一途径。优选地，将组合物和药物可接 受的载体一起施用。可获得施用这些化合物的合适的方法，所述方法 对本领域技术人员来说是熟知的。尽管可使用超过一种的途径来施用 特定的组合物，但和其他的途径相比，特定的途径通常可提供更快速 和更有效的反应。通过特定的要被施用的组合物和通过用于施用组合 物的特别方法部分地确定药物可接受的载体。因此，存在许多合适的 本发明的药物组合物的制剂(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985)。

可通过例如静脉内、局部、腹膜内、subdermal、皮下、透皮、 肌内、口服、关节内、肠胃外、鼻内或通过吸入进行施用。因此合适 的施用位点包括，但不限于皮肤、小支气管、胃肠道、眼睛和耳朵。 组合物一般包含常规的药物载体或赋形剂，并且可额外地包含其他药 剂、载体、佐剂等。优选地，按重量计算，制剂占本发明的组合物的 大约5％至75％，剩余部分由合适的药物赋形剂组成。可通过本领域熟 知的方法(参见，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))使合适的赋形剂 和特定的组合物和施用途径相适应。

制剂可采用固体、半固体、冷冻干燥的粉剂、或液体剂型的形式， 例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳剂、栓剂、滞留 型灌肠剂、乳膏剂、软膏、洗剂、气溶胶等形式。在药物组合物采用 丸剂、片剂或胶囊剂的形式的实施方案中，制剂可包含具有生物学活 性的组合物和任何一种下列物质：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙 等；崩解剂例如淀粉或其衍生物；润滑剂例如硬脂酸镁等；和粘合剂 例如淀粉、  阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素和其衍生物。 组合物可存在于单位剂量或多次剂量封闭的容器例如安瓿或小瓶中。 给患者施用的剂量应当足以在一段时间内在患者中达到有益的治疗性 反应。

在一些实施方案中，可给器官或培养细胞施用缓释制剂，所述制 剂可携带想要的组合物。可通过例如注射，给生物体的器官施用缓释 组合物。“缓释”，其是指使组合物能够被周围的组织或培养细胞吸 收更长的时间，该时间比通过施用粘性更低的介质例如盐溶液中的所 述组合物所达到的时间更长。

可将组合物单独地或和其他合适的组分一起制成气雾剂制剂 (即，其可被“雾化”)，从而通过吸入法进行施用。可将气雾剂制 剂置于加压的可接受的推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。 为了通过吸入法进行递送，也可将组合物作为干粉递送(例如， Nektar)。

适合肠胃外施用例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径施用的 制剂包括水性和非水性的、等渗无菌注射溶液和水性或非水性的无菌 悬浮液，所述溶液可包含抗氧化剂、缓冲液、制菌剂、和使制剂和想 要的患者的血液等渗的溶质，所述悬浮液可包含悬浮剂、助溶剂、增 稠剂、稳定剂和防腐剂。

施用的其他方法包括，但不限于，使用血管成形气囊、导管、凝 胶制剂的施用。用于血管成形气囊、导管、凝胶制剂递送的方法在本 领域是熟知的。

成像方法

本领域技术人员理解，可使本发明的组合物适应各种成像应用。 在一个实施方案中，可通过使用基于组分的成像系统进行虚拟结肠镜 术(Virtual Colonoscopy)。目前，虚拟结肠镜术包括将造影剂基本 上注入结肠并在CT上显现图象，然后重构3-D图象。类似的技术可用 于MR。然而，粪便、粘液和空气都可充当照影剂屏障，从而可给结肠 壁的重建图产生人为的表面。细胞靶向照影剂的加入可帮助克服这些 障碍，从而提供真实的壁重建图和帮助避免假阳性以及假阴性。存在 几种可在此使用基于组分的系统的方法。最简单地，可将阳离子效能 主链和单一的照影剂(例如CT、MR或光学照影剂)一起使用。从而可 显现出细胞表面层，任何不规则物或障碍物都详尽地显示于图象的重 建图中。然而，基于组分的系统提供了加入确定的第二试剂的额外选 择。该试剂由阳离子效能主链、不同的成像部分和靶向组分(例如靶 向两个结肠癌特有的抗原)组成。可这样选择成像部分(从简单的成 像部分至诊断剂)以使一种为CT照影剂而另一种为MR照影剂，或使 两种都为MR照影剂，其中一种为T2试剂而另一种为T1试剂。以这种 方式，可按照前面所述的方法重建表面，对于肿瘤抗原是特异性的任 何区域可被显现和覆盖在原始的重建图上。此外，也可将治疗剂整合 入被靶向的诊断系统中。可将类似的策略用于局限性肠炎和溃疡性结 肠炎(和再与治疗法组合)。可选择地，可在例如黑色素瘤的诊断或治 疗的情况下，优选地可将光学成像部分和检测方法与荧光成像部分结 合在一起使用。在这些实施方案中，检测可以是可视的、图象辅助的 或完全基于图象的，例如在暗视野成像分析中。

实施例

实施例1

本实施例举例说明通过使用本发明的带正电荷的主链或载体透 皮递送非常大的复合物，即包含蓝色荧光蛋白(BFP)转基因的质粒。

主链的选择：

通过将Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带 正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18 个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨 酸侧链的游离胺基来进行该附着。将所述经修饰的主链称为“KNR2” 以表示肽基载体的第二大小。对照聚阳离子是相同大小的来自相同批 次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)。选择另外的对照聚阳离子Superfect(Qiagen)作为体 外高转染率的参照(即体外现有技术功效对毒性的同时的正对照和参 照)，该聚阳离子是被活化的基于树枝状高分子(dendrimer)的试剂。

治疗剂的选择：

使用包含蓝色荧光蛋白(BFP)的完整的转基因和由巨细胞病毒 (CMV)启动子驱动的部分侧翼序列的8kb的质粒(基于pSport的模板， Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。BFP用作已转染细胞的可鉴定标记， 然后转录和翻译该基因从而可在荧光显微镜下直接被观察到(即无需 另外的染色)。因此，只有这样的细胞(即其中在有效载荷递送(payload delivery)前所述复合物已穿过质膜和核膜的细胞)可具有转基因表 达。该特定的质粒具有大约2.64×106的分子量，从而被选择用于估计 通过这些复合物进行的非常大的治疗剂的递送。

样品的制备：

在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合 物。尽管增加电荷密度增加了大小(即每个复合物上存在更多的主链)， 但每个复合物的效能因子密度的增加可抵消这些改变。因此，最优选 择可在低比率(即基于大小)或高比率(即基于效能因子的密度)时 发生，此处对KNR2的这两个方面进行了估计。基于厂商的推荐和以前 对最大功效的报导来选择K2的功效和Superfect的功效的最佳比率。 将所有组的核苷酸治疗剂的剂量标准化，也对在细胞培养物中待测的 组合物的总体积和终pH进行标准化。

制备下列混合物：

1)K2(比率为4∶1)与0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝 色荧光蛋白的质粒的溶液。

2)KNR2(比率为15∶1)与0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动 的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液。

3)KNR2(比率为10∶1)与0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝 色荧光蛋白的质粒的溶液。

4)KNR2(比率为4∶1)与0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝 色荧光蛋白的质粒的溶液。

5)KNR2(比率为1.25∶1)与0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动 的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液。

6)厂商推荐的Superfect(比率为5∶1)与0.5mg/mL表达由 CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液。

细胞培养方案：

由对治疗组不知情的观测者进行所有细胞培养实验。在6孔板上， 向70％汇合的HA-VSMC原代人大动脉平滑肌细胞(第21代； ATCC，Rockville，MD)中加入1.0mL的各溶液并在含有10％血清的 M-199中在37℃和10％的CO2下培养48小时。也对未处理的对照小孔 进行评估，以每组n＝5个小孔对各组进行评估。

效率分析：

由盲测者在60度、180度和200度下使用带有BFP滤镜和平场复 消色差透镜的Nikon E600落射荧光显微镜从各小孔的上部获得完整 细胞板的低放大倍数照片(总共10X)。使用Image Pro Plus 3.0成 像套件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)确定总的呈阳性 的细胞面积的百分比。将该结果对各组的总的细胞面积进行标准化， 并记录为基因递送的效率(以可检测水平表达转基因的总细胞的百分 比)。

毒性分析：

随后盲测者在染料排斥试验(可存活的细胞排斥染料，而不能存 活的细胞不能排斥染料)中对小孔进行估计，然后将小孔中的样品溶解 在0.4％的磷酸缓冲盐溶液中的SDS中。在Spectronic Genesys 5 UV/VIS分光光度计中在595nm波长(蓝色)处对样品进行估计以定量 估计不能存活的细胞(作为转染剂毒性的直接估量)。通过在OD595 测量之前将浓度调整至与OD280值相匹配来将样品标准化成相同的细 胞数目。

数据处理和统计分析：

盲测者通过使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics， Silver Spring，MD)进行分批图象分析(batch image analysis)来 确定总的阳性染色并将其标准化为总的横切面面积以确定各组的阳性 染色的百分比。随后在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件 (Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各 组的平均值和标准差。

结果：

效率：

效率的结果如下(平均值±标准差)：

1)0.163±0.106％

2)10.642±2.195％

3)8.797±3.839％

4)15.035±1.098％

5)17.574±6.807％

6)1.199±0.573％

和单独的多聚赖氨酸和Superfect相比，Runs#4和#5表现出统计学 上显著(P＜0.05，使用Fisher PLSD和TUKEY-A事后检测法进行单 因子ANOVA重复测量)的基因递送效率的增加。

毒性：

平均毒性数据如下(在OD595下以AU记录；低值，例如单独的 盐水所显示的，与低毒性关联，而更高的值，例如在条件1下所显示 的，表明高细胞毒性)：

盐水-0.057A；

1)3.460A；

2)0.251A；

3)0.291A；

4)0.243A；

5)0.297A；

6)0.337A。

结论：

用1.25至4.0的KNR2对DNA的比例可实现比对照(甚至目前的 金标准Superfect的对照)毒性更小、效率更高的基因递送。该实验 进一步确认了使用该载体将相当大的治疗性复合物递送过膜的能力。

实施例2

该实施例举例说明在一次施用后大的核苷酸通过本发明的载体 穿过皮肤的运输。

主链选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带 正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18 个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨 酸侧链的游离胺基来进行该附着。和前面一样，所述经修饰的主链被 命名为“KNR2”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经 修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis， MO)。选择另外的对照聚阳离子Superfect(Qiagen)作为体外高转染 率的参照(即体外现有技术功效对毒性的同时的正对照和参照)，该 聚阳离子是被活化的基于树枝状高分子的试剂。

治疗剂的选择：

对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆 菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5 kb的质 粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。此处βgal 用作已转染的细胞的可鉴定标记，然后转录和翻译所述基因，在对所 述外源酶进行特异性染色后可直接观察到所述细胞。因此，只有这样 的细胞(即其中在有效载荷递送前所述复合物已穿过皮肤然后到达靶 细胞并穿过质膜和核膜的细胞)可具有转基因表达。该特定的质粒具 有大约2,805,000的分子量。

样品的制备：

在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合 物。基于厂商的推荐和以前确定最大效率的体外实验选择对于K2的效 率、KNR2的效率和Superfect的效率的最佳比率。将所有组的核苷酸 治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行 标准化。如下制备样品：

标记为AK1的组：将每个终等分(即总共80微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基载体KNR2以4∶1的比混合均匀并用 磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物 用1.8ml Cetaphil增湿剂混合均匀并以200微升进行等分。

标记为AL1的组：将每个终等分(即总共80微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐 溶液稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物用1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

标记为AM1的组：将每个终等分(即总共80微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和Superfect以5∶1的比混合均匀并用磷 酸缓冲盐稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物用1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

在用肽基载体和核苷酸治疗剂进行一次处理后确定透皮递送效率 的动物实验

在进行处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57 black 6小鼠(每组n＝4)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因 为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。 动物不进行脱毛处理。动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低， 在有所反应后，任意提供食物和水过夜。处理后24小时，通过吸入 CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。 将经处理的部分分成三个等分，用10％的中性缓冲的福尔马林固定颅 部分12-16小时，然后保存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如先前所 描述的，对中心部分进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上 进行β半乳糖苷酶染色(Waugh，J.M.，M.Kattash，J.Li，E.Yuksel， M.D.Kuo，M.Lussier，A.B.Weinfeld，R.Saxena，E.D. Rabinovsky，S.Thung，S.L.C.Woo，和S.M.Shenaq.Local Overexpression of Tissue Plasminogen Activator to Prevent Arterial Thrombosis in an invivo Rabbit Model.Proc Natl Acad Sci U S A.1999 96(3)：1065-1070.还有：Elkins CJ，Waugh JM， Amabile PG，Minamiguchi H，Uy M，Sugimoto K，Do YS，Ganaha F， Razavi MK，Dake MD.Development of a platform to evaluate and limit in-stent restenosis Tissue Engineering 2002. Jun；8(3)：395-407)。将经处理的尾部部分进行快速冷冻以进行溶解研 究。

毒性：

通过在成对的切片上进行染料排斥实验来对上述接受功效分析 的组进行毒性估计。切片只进行针对效率的染色或针对毒性的染色， 因为该方法对同时进行两种染色是不可靠的。对于毒性分析，将切片 浸没在排斥染料中进行5分钟，然后在37℃下在10％的CO2下温育30 分钟。在该时间期间不排斥染料的任何细胞被认为是不能存活的细胞。

数据处理和统计分析：

由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的 Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。和前面一样，使用 Image Pro Plus软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确 认法确定β半乳糖苷酶活性(蓝色，使用此处使用的底物法)或细胞 毒性的阳性数。将这些结果标准化为各组的被核固红染色的总的横切 面细胞数目，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比列表。然后， 在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA) 在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准误。

结果：

结果归纳在下面的表中并在图3中进行说明。和K2(基本上为阴 性对照)以及用作功效的基准标准的Superfect相比，带正电荷的肽 基透皮递送载体在递送效率和转基因表达上获得了统计学上显著的增 加。尽管相对于K2，Superfect确实获得了统计学上显著的提高，但 在该模型系统中，和Superfect相比，KNR2在递送效率上获得了超过 一个数量级的提高。

表1：按照处理组的以总数目的百分比表示的β半乳糖苷酶呈阳 性的细胞的平均值和标准差。

 组  平均值  标准差  AK1  15.00  0.75  AL1  0.03  0.01  AM1  1.24  0.05

P＝0.0001(在置信度99％下是显著的)

毒性的结果示于图4，该图描述了处理后24小时不能存活的总面 积的百分比。此处，和KNR2或Superfect相比，K2表现出统计学上 显著的细胞毒性，即使是在这样的剂量上亦如此，即在该剂量上，如 以前所述K2具有较低的转运效率(Amabile，P.G.，J.M.Waugh，T. Lewis，C.J.Elkins，T.Janus，M.D.Kuo，和M.D. Dake.Intravascular Ultrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery.J.Am.Col.Cardiol.2001 June；37(7)：1975-80)。

结论：

肽基透皮载体可高效地将大的复合物转运通过皮肤，特别是在以 前所述的转基因表达和总的复合物的大小受到限制的情况下。此处使 用阳性面积而非阳性数目进行分析是因为(1)所述方法被大大简化并 且在图象分析中具有大的精确性，(2)已在II.B中结论性地提供了效 率的点证明，(3)面积测量值为理解体内结果提供了更广的范围，因 为非细胞组分占据了横切面的相当部分，和(4)有助于和更大的非肽基 载体复合物的比较。

实施例3

本实施例举例说明在连续七天的应用中使用本发明的带正电荷 的肽基载体将大的基于核苷酸的治疗剂穿过皮肤的透皮递送。

主链的选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带 正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18 个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨 酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR2”。 对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸 (称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。

治疗剂的选择：

对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆 菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5 kb的质 粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。该特定的 质粒具有大约2,805,000的分子量，从而被选择用来估计通过肽基载 体进行的非常大的治疗剂穿过皮肤的递送。

样品的制备：

在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合 物。选择实验比例以比较前面的实验中提出的单剂实验。将所有组的 核苷酸治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终 pH进行标准化。如下制备样品：

标记为AK1的组：将每个终等分(即总共240微克)中8微克的 βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基载体KNR2以4∶1的比混合均 匀并用磷酸缓冲盐稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合 物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升等分。

标记为AL1的组：将每个终等分(即总共240微克)中8微克的 βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均匀并用磷酸 缓冲盐溶液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和 5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

在用肽基载体和核苷酸治疗剂进行7天每天一次的处理后确定累 积的透皮递送效率的动物实验

在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57 black 6小鼠(每组n＝4)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠 不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。动物 不进行脱毛处理。将动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低， 在有反应后，任意提供食物和水过夜。在每天大致相同的时刻每天一 次地重复该处理7天。在7天的处理后，通过吸入CO2对小鼠实行安 乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分 分成三个等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小 时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如前所述，对中心部分 进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上进行β半乳糖苷酶染 色。将经处理的尾部节段进行快速冷冻以进行溶解研究。

数据处理和统计分析：

由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的 Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。和前面一样，使用 Image Pro Plus软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确 认法确定对于β半乳糖苷酶活性是阳性的面积。将这些结果标准化为 各组的总的横切面面积，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比 列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus， Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值 和标准差。

结果：

将结果归纳于下面的表中并在图5中进行说明。和K2相比，肽 基透皮递送载体在递送效率和转基因表达上获得了统计学上显著的增 加。

表2：在7次每天一次的施用后各处理组的以总面积的百分比表 示的累积的β半乳糖苷酶的转基因表达的平均值和标准差。

    组     平均值     标准差     AK     5.004     2.120     AL     0.250     0.060

P＝0.0012(在置信度99％下是显著的)

实施例4(非肽基载体)

本实施例举例说明在连续七天的应用中通过使用本发明的带正 电荷的非肽基载体将大的基于核苷酸的治疗剂穿过皮肤的透皮递送。

主链选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至聚乙烯亚胺(PEI)MW 1,000,000 来装配带正电荷的主链，通过以30％的饱和度(即每100个赖氨酸残 基中有30个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连 接至PEI侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为 “PEIR”以表示大的非肽基载体。对照聚阳离子是相同大小的和来自 相同批次的未经修饰的PEI(称为“PEI”，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)。

治疗剂的选择：

对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆 菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5kb的质 粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。该特定的 质粒具有大约2,805,000的分子量。

样品的制备

在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合 物。将所有组的核苷酸治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合 物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：

标记为AS的组：将每个终等分(即总共240微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和对照PEI以5∶1的比混合均匀并用 Tris-EDTA缓冲液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合 物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

标记为AT的组：将每个终等分(即总共240微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和组合物非肽基载体PEIR(“PEIR”)以 5∶1的比混合均匀并用Tris-EDTA缓冲液稀释至600微升。为进行体 内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进 行等分。

标记为AU的组：将每个终等分(即总共240微克)中8微克的βgal 质粒(p/CMV-sport-βgal)和高度纯化的Essentia非肽基载体PEIR (“纯的PEIR”)以5∶1的比混合均匀并用Tris-EDTA缓冲液稀释至 600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合 均匀并以200微升进行等分。

在用非肽基载体和核苷酸治疗剂进行7天每天一次的处理后确定 累积的透皮递送效率的动物实验

在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57 black 6小鼠(每组n＝3)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠 不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。动物 不进行脱毛处理。将动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低， 在有反应后，任意提供食物和水过夜。在每天大致相同的时刻每天一 次地重复该处理7天。在7天的处理后，通过吸入CO2对小鼠实行安 乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分 分成三个等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小 时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如前所述，对中心部分 进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上进行β半乳糖苷酶染 色。将经处理的尾部节段进行快速冷冻以进行溶解研究。

数据处理和统计分析：

由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的 Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。使用Image Pro Plus 软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确认法确定对于β 半乳糖苷酶活性是阳性的面积。将这些结果标准化为各组的总的横切 面面积，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比列表。然后，在 单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA) 在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。

结果：

将结果归纳于下面的表中并在图6中进行说明。和PEI相比，以 组合物形式存在的和以超纯形式存在的非肽基透皮递送载体在递送效 率和转基因表达上获得了统计学上显著的增加。PEI 的超纯形式表现 出比标准的PEIR具有更高的效率的倾向，这与试剂的更高的经计算得 到的特异性活性一致。

表3：在7天每天一次的施用后各处理组的以总面积百分比表示 的累积的β半乳糖苷酶的转基因表达的平均值和标准差。

    组     平均值     标准差     AS     0.250     0.164     AT     2.857     0.718     AU     3.500     0.598

P＝0.0058(在置信度99％下是显著的)

结论：

非肽基透皮载体可高效地将大的复合物转运通过皮肤，特别是在 前述的转基因表达物和总复合物大小受到限制的情况下。尽管效率不 如用更小的肽基载体的复合物获得的效率高，但获得了显著的增加。 明显的是，使用大的非肽基复合物的基因表达产物的分布几乎特异性 地基于毛囊，而肽基载体的分布结果是在整个截面上进行扩散。因此， 大小和主链的向性可用于纳米机械靶向递送。

实施例5

本实施例显示在一次施用后，和对照相比，肽基载体将含有完整 的标记蛋白肉毒毒素的大复合物运输穿过完整皮肤的用途。此处选择 肉毒毒素作为大蛋白例如用于免疫的试剂的模型系统。

主链的选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW112,000来装配带 正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18 个赖氨酸残基共价地附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖 氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为 “KNR”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多 聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。

治疗剂：

选择Boxtox商标的肉毒毒素A(Allergan)进行本实验。其具 有大约150,000的分子量。

样品的制备：

根据厂商说明书重构肉毒毒素。用经计算超过12倍摩尔量的硫 代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)对等分蛋白进行生物素化。被 标记的产物称作“Btox-b”。

如同在递送高度带负电荷的大的核苷酸复合物中的一样，在各情 况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性 或净正电荷防止了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对 蛋白复合物的排斥。对所有组的Btox-b剂量进行标准化，也对要局部 施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：

标记为“JMW-7”的组：将每等分(即总共20U)中2.0U的Btox-b 和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓冲盐溶 液稀释至200微升。将所得的组合物和1.8ml Cetaphil混合均匀并以 200微升进行等分。

标记为“JMW-8”的组：将每等分(即总共20U)中2.0U的Btox-b 和以4∶1的电荷比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。将 所得的组合物和1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

在用肽基载体和经标记的肉毒毒素进行一次处理后确定透皮递送 效率的动物实验

在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6 小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将200微升剂量的适当处理物施用于 背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达 到该区域)。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟，通过吸入 CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。 将经处理的部分分成三等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅 部分12-16小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如下面所 概述的，由盲测者将中心部分进行快速冷冻并将其直接用于生物素显 示。为进行溶解研究，快速冷冻经处理的尾部节段。

如下进行生物素显示。简而言之，将各切片浸没在NeutrAvidin 缓冲液中1小时。为观察碱性磷酸酶的活性，在盐水中洗涤横切面4 次，然后浸没在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小时。然后在 盐水中漂洗切片，在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对 整个切片照相。

数据处理和统计分析：

由盲测者使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)通过分批图象分析确定总的阳性染色，并将其标准化为 总的横切面面积以确定各组的的阳性染色百分比。然后，在单向ANOVA 重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置 信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。

结果：

在将Btox-b与KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起进行一 次局部施用后，用总面积的百分比来表示对于生物素化的肉毒毒素呈 阳性的平均横切面面积。将所述结果列于下列的表中并在图7中进行 说明。在图7中，在用“EB-Btox”和“n1”进行每天一次的处理三天 后，将对于标记是阳性的面积测定为总面积的百分比，“EB-Btox”包 含Btox-b和肽基载体KNR，“n1”包含Btoxb和聚阳离子K，作为对 照。描述各组的平均值和标准差。

表4.在将Btox-b与KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起进行一次 局部施用后，以总横切面的百分比表示的被标记的肉毒毒素面积的平 均值和标准差。

    组     平均值     标准差     JMW-7     33.000     5.334     JMW-8     8.667     0.334

P＝0.0001(在置信度99％下是显著的)

实施例6

实施例5表明在鼠类模型的完整皮肤中局部施用后，肽基透皮载 体可使肉毒毒素有效地转运。然而，该实验没有表明复合蛋白肉毒毒 素在转运穿过皮肤后是否以功能性形式释放。因此建立下列的实验来 估计：使用该肽基载体(同样，无蛋白的共价修饰)是否可将肉毒毒 素作为局部试剂递送穿过完整的皮肤仍具治疗效果。

通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW112,000来装配带 正电荷的主链，以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖 氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧 链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对 照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸 (称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在实施例 5中一样使用相同的肉毒毒素治疗剂，和以相同的方式制备其。如下 制备样品：

标记为“JMW-9”的组：将每等分(即总共60U)中2.0单位的肉 毒毒素和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓 冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均 匀并以200微升进行等分。

标记为“JMW-10”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉 毒毒素和K以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。 将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

标记为“JMW-11”的组：用磷酸缓冲盐溶液将每等分(即总共60U) 2.0单位的无聚阳离子的肉毒毒素稀释至600微升。将所得的组合物 和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

在用肽基载体和肉毒毒素进行一次处理后确定透皮递送效率的动 物实验

在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6 小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地 施用于脚趾至大腿中部mid-thigh。两只腿都进行处理，对腿的任一 侧，处理都是随机的。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟， 根据公开的足趾外展(digital abduction)分值(用于在施用肉毒毒 素后评价足的灵活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A，B，and F in mice. Toxicon.2001 Dec；39(12)：1815-20)就足趾外展的能力对小鼠进 行估计。小鼠的灵活性也通过主观估计。

数据处理和统计分析：

由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA 重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置 信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。

结果：

将平均足趾外展分值(在肉毒毒素与KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”) 或无聚阳离子的稀释剂一起进行一次局部施用后获得的)示于下列的 表中并在图8的代表性显微照片中进行说明。和两个对照(其相互之 间是相当的)相比，肽基载体KNR提供了统计学上显著的肉毒毒素穿 过皮肤的功能性递送。本发明的另外的独立重复实验(总共三个独立 的实验，所有实验具有相同的结论：具有KNR而非对照的局部肉毒毒 素具有统计学上显著的麻痹作用)进一步确认了本发现和揭示了在具 有K或不具有K的局部肉毒毒素(即两个对照)之间没有显著的不同。 有趣的是，小鼠始终朝向被麻痹的肢体方向走动(在100％的接受处理 的动物中发生该现象，在来自任一对照组的对照中发生率为0％)。如 图8所示，用肉毒毒素和对照聚阳离子多聚赖氨酸或用肉毒毒素而无 聚阳离子(“单独的Btox”)处理的肢体可活动足趾(当被提起时， 作为防御机制)，但用肉毒毒素和肽基载体KNR(“Essentia Btox lotion”)处理的肢体则不能活动。

表6.在一次局部施用肉毒毒素和肽基载体KNR(“JMW-9”) 肉毒毒素和对照聚阳离子K(“JMW-10”)、或单独的肉毒毒素 (“JMW-11”)后30分钟的足趾外展分值。

    组     平均值     标准差     JMW-9     3.333     0.333     JMW-10     0.333     0.333     JMW-11     0.793     0.300

P＝0.0351(在置信度95％下是显著的)

结论：

本实验表明肽基透皮载体可将治疗有效量的肉毒毒素治疗剂转 运穿过皮肤而无需治疗剂的共价修饰。本实验也进一步确认当在对照 中局部施用时肉毒毒素不起作用。

实施例7

本实验证实示非肽基载体在本发明中的性能。

主链的选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至聚乙烯亚胺(PEI)MW 1,000,000 来装配带正电荷的主链，通过以30％的饱和度(即每100个赖氨酸残 基中有30个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连 接至PEI侧链的游离胺基来进行该附着。经修饰的主链被命名为 “PEIR”以表示大的非肽基载体。对照聚阳离子是相同大小的和来自 相同批次的未经修饰的PEI(称为“PEI”，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)。如实施例5中那样，使用相同的肉毒毒素治疗剂。

根据厂商说明书从BOTOX产品重构肉毒毒素。如同在递送高度 带负电荷的大的核苷酸复合物的情况中一样，在各情况下，使用过量 的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性或净正电荷防止 了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对蛋白复合物的排 斥。对所有组的肉毒毒素剂量进行标准化，也对要局部施用的组合物 的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：

标记为“AZ”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒 素和超纯形式的非肽基载体PEIR以经计算为5∶1的MW比混合均匀并 用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

标记为“BA”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒 素和PEI以5∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。 将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。

在一次处理后确定治疗效率的动物实验

在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57 black 6 小鼠(每组n＝3)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地 施用于脚趾至大腿中部。对两只腿都进行处理，对两侧中的任一侧来 说，处理都是随机的。动物不进行脱毛处理。在最初的处理之后30 分钟，根据公开的足趾外展分值(用于评价足的灵活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A，B，and Finmice.Toxicon.2001 Dec；39(12)： 1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力对小鼠进行估计。小鼠 的灵活性也通过主观估计。

数据处理和统计分析：

由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA 重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置 信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。

结果：

将在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素 和对照聚阳离子PEI(“BA”)、和重复实验(本试验进行单次独立 重复实验)后获得的平均足趾外展分值示于下列的表中。和对照相比， 非肽基载体PEIR提供了统计学上显著的肉毒毒素穿过皮肤的功能性 递送。和前面一样，观察到动物朝向被麻痹的肢体作圆周走动。

表6：重复实验1.在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“AZ”)、 或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA”)后30分钟的足趾外展分值。 显示平均值和标准差。

    组     平均值     标准差     BA     0.833     0.307     AZ     3.917     0.083

P＝0.0002(在置信度99％下是显著的)

表7：重复实验2.在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“ AZ1”)、 或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA1”)后30分钟的足趾外展分 值。显示平均值和标准差。

    组     平均值     标准差     BA1     0.333     0.211     AZ1     3.833     0.167

P＝0.0001(在置信度99％下是显著的)

结论：

本实验非肽基透皮载体可将治疗剂量的肉毒毒素转运穿过皮肤 而无需在之前共价修饰肉毒毒素。这些发现补充了用肽基转移试剂进 行的实验。选择使用非肽基或肽基载体获得治疗效果可使施用适合特 定的情况、环境和方法，加宽了本发明的透皮递送平台的范围。

在这些实验中，使用肽基或非肽基载体的肉毒毒素和不使用所述 载体的局部肉毒毒素的渗透进一步产生了透皮渗透抗原以进行免疫的 用途，特别是在使用不易穿过皮肤的抗原例如肉毒杆菌进行免疫的情 况下。功能性肉毒毒素的递送确保至少4个不同的抗原表位以完整的 状态被透皮递送；在两个实施例中的任何一个中在缺少所述载体的情 况下都不能递送功能性肉毒毒素的事实进一步证实：相对于缺少载体 的试剂，所述载体提供了显著的免疫潜能。因为免疫要求抗原以足以 产生免疫应答的量穿过皮肤，该方法使得能够递送用于免疫的抗原。 因为该方法不要求抗原的共价修饰和不需要涉及病毒基因转移，因此 在安全稳定性和效率方面产生了许多有利方面。

实施例8

本发明详述了具有TAT效能因子的肽基和非肽基载体的产生以及 这些载体和肉毒毒素的装配。

聚乙烯亚胺(PEI)和TAT片段GGGRKKRRQRRR的偶联

将缺少所有侧链保护基团的TAT片段GGGRKKRRQRRR(6mg， 0.004mmol，Sigma Genosys，Houston，TX)溶解在1ml 0.1M MES缓 冲液中。向其中加入EDC(3mg，0.016mmol)，然后加入50％(w∶v)的 水中的PEI 400k(分子量)溶液(～0.02ml，～2.5×10-5mmol)。通 过试纸测定pH为7.5。再加入1ml的0.1M MES，加入HCl将pH调 整至大约为5。再加入一部分EDC(5mg，0.026mmol)，搅拌pH～5 的反应物过夜。第二天早上，冷冻和冻干反应混合物。

用无菌1xPBS将Sephadex G-25柱子(直径1cm×高14cm) (Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)调成浆。通过具 有19kD分子量的FITC葡聚糖(Sigma，St Louis，MO)的洗脱标准化 柱子。标准物最初在5ml PBS处洗脱，在6ml处具有中间峰，在7ml 处结束。将来自上面的冻干的反应混合物溶解在小体积的PBS中并加 到柱上。通过连续加入1ml PBS来洗脱其。收集级分，第一级分由首 先洗脱的3m l组成，包括反应物体积。随后的级分为1ml。

在280nm处测定被洗脱的级分的UV吸光率。对应于5-7ml的级 分3、4和5显示出中等吸收峰。将所有级分冻干并获取红外(IR)光 谱。在级分4-6中观察到TAT片段的特征性胍三重峰(2800-3000cm-1)。 这些级分也显示在1700cm-1处的酰胺片段，从而进一步确定TAT片段 和PEI的结合。

使用TAT片段GGGRKKRRQRRR(11.6mg，0.007mmol)进行另一重 复实验。计算该量以使30个PEI胺基中有一个预期和TAT片段反应。 这非常接近上述的原始的多聚赖氨酸-寡聚精氨酸(KNR)功效因子的 组合物。如上所述通过IR进一步确定TAT片段至PEI胺基的成功的共 价附着。

多聚赖氨酸至TAT片段的偶联：

向1ml 0.1M MES，pH～4.5中的多聚赖氨酸(10mg1.1×10-4mmol； Sigma)溶液中加入TAT片段(4mg，0.003mmol)，然后再加入EDC (3.5mg，0.0183mmol)。在室温下搅拌所得的反应混合物(pH～4.5)。 将反应物在-78℃下冷冻过夜。第二天将反应混合物融解至室温，通过 加入饱和碳酸氢钠将pH调整至～8。将反应混合物直接用于如上所述 构成和标准化的Sephadex G-25柱。其洗脱于7个始于5ml后的1ml 级分中。测出UV280的吸光率，在级分2、3和4中显示出相关的峰。 冻干的级分的IR显示级分1-7中的特征性胍峰(2800-3000cm-1)。级 分1在1730cm-1处具有很强的峰而在1600cm-1处无峰，但对于级分2-6， 情况正好相反。因此，进一步确定了TAT片段至肽基载体，多聚赖氨 酸的成功的共价附着。

随后将共价附着的TAT片段和PEI(PEIT)以及共价附着的TAT 片段和多聚赖氨酸(KNT)与肉毒毒素混合以形成如下的非共价复合物：

标记为“JL-1”的组：将每等分(即总共20U)2.0单位的Btox-b 和PEIT以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。

标记为“JL-2”的组：将每等分(即总共20U)2.0单位的Btox-b 和KNT以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。

在非共价复合物形成后，将颗粒在12,000xg下在旋转微量离 心管中离心5分钟，然后在20微升去离子水中重悬浮并在Germanium 衰减全反射小室中进行蒸发以进行IR。从而进一步确认复合物中 Btox-b的存在。总地说来，该实验进一步确定合成方案可用于其他效 能因子，如在前面的实施例中一样，通过使用具有带正电荷的分支基 团或效能基团的寡聚精氨酸的载体可将所得的载体和具有生物学活性 的试剂(在该情况下是肉毒毒素)结合。

实施例9

本实验展示肽基载体用于特定抗原的成像。在本实验中，光学成 像部分和经修饰的靶向黑色素瘤的抗体与Essentia肽基载体中的一 种即KNR2的复合物适合用于黑色素瘤的局部检测。

主链的选择：

通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带 正电荷的肽基主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中 有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至 赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。经修饰的主链被命名为“KNR2”。 对照聚阳离子是相同大小的来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸 (称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。

通过上述的EDC偶联将针对保守的人黑色素瘤结构域的鼠类单克 隆抗体神经节苷脂2(IgG3，US Biologicals，Swampscott，MA)共价 地附着至短的多聚天冬氨酸阴离子链(MW 3,000)以产生称为 “Gang2Asp”的衍生抗体。此外，通过使用寡核苷酸作为聚阴离子设 计阴离子成像试剂，其中序列是ATGC-J(此后称作“ATGC-J”)，“J” 代表共价附着的Texas Red荧光团，(Sigma Genosys，Woodlands，TX)。 为进行本实验，将6.35微克Gang2Asp和0.1712微克ATGC-J混合， 然后再和17.5微克KNR2在总体积为200微升的去离子水中混合以获 得5∶1∶1：：KNR2∶ATGC-J∶Gang2Asp的终比例。将混合物涡旋2分钟。 将所得的复合物加于水合CellTek Human Melanoma切片和对照 CellTek Gytokeratin Slides(SDL，Des Plaines，IL)上并温育5分 钟，然后对荧光分布进行照相评估，也对相同视野的黑色素瘤色素的 亮视野分布进行照相评估。也使用不具有ATGC-J或不具有Gang2Asp 的额外的对照。

结果：

非共价复合物提供了遵从抗体衍生物的向性(而不是遵从在缺少 抗体的情况下复合物的分布)的光学成像试剂的分布。更值得注意的 是，如图9中描述的，所述复合物遵从这样的分布，即该分布和黑色 素瘤细胞的分布相匹配。

结论：

本实验展示了这样的可行性复合物的产生，通过使用适合用于局 部递送的载体产生用于穿过皮肤的运输和通过光学技术显现黑色素瘤 的所述可行性复合物。可将这样的方法和例如手术边界确定法 (surgicalmargin-setting)结合使用或可将其用于常规的黑色素瘤 监视。也可容易地将类似的策略用于和皮肤相关的其他病症的局部诊 断，这对本领域技术人员来说是显而易见的。假定光学成像部分具有 非常高的灵敏度，那么通过这些非共价复合物可在提高对这些疾病的 检测上提供远大的前景。

实施例10

本发明显示肽基载体在不同大小和结构的蛋白的混合物的透皮 递送中的渗透效率和深度。

方法：

对Revitix蛋白[Organogenesis，Canton，MA]进行生物素化并 将其在4℃下贮存。生物素化的Revitix蛋白的使用浓度为 10-15ng/μl。本研究中的检测样品和用于比较的对照示于表1。本研 究具有两个对照，一个用pH和Revitix匹配的去离子水，另一个只用 Revitix本身。处理组的检测样品是具有肽基载体的Revitix。

表8：检测商品和比较对照。

组 检测样品和比较对照  研究时间点 A 水，pH 7.0  2天 B 只有Revitix  2天 C Revitix+载体  2天 D 水，pH 7.0  9天 E 只有Revitix  9天  F Revitix+载体 9天

在用肽基载体和Revitix蛋白进行2天和9天的每天一次的处理 后确定累积的透皮递送的效率的动物实验：

通过吸入异氟烷，然后再经腹膜内注射啮齿动物麻醉剂混合物 (3.75ml 100mg/ml氯胺酮，3.00ml 20mg/ml噻拉嗪和23.25ml盐 水)来麻醉C57 black 6雌性小鼠(每组n＝5只)。在每只小鼠被麻 醉后，在处理的第一天之前两天用剃刀(Oster)在每只小鼠的背部刮 出2.0cm×2.0cm给药位点。动物不进行进一步的脱毛处理。只在 用Cetaphil润肤霜(Galderma，Fort Worth，TX)进行处理的应用 期间通过吸入异氟烷来麻醉动物，对于动物，将200微升剂量的合适 处理物给背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴 或四肢达到该区域)施用。动物保持麻醉2至5分钟，同时用检拾器 滑环(finger covers)将合适的治疗药品擦进皮肤。将动物在受控的 加热环境中恢复以预防体温过低，在有反应后，任意提供食物和水过 夜。在每天大致相同的时刻每天一次地重复该处理2天和9天。在2 天和9天的处理后，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，在最后处理实 施8小时后，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理 的部分分成三等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16 小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。将中间部分用于 NeutrAvidin、苏木精和伊红染色和Chloroesterase-特异性染色。为 进行溶解研究，快速冷冻经处理的尾部节段。

数据处理和统计分析

由盲测者进行数据收集和图象分析。用Retiga 1300B照相机 (QImaging，Burnaby，BC，Canada)在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对经染色的切片照相。由盲测者使用Image Pro Plus 分析软件利用绿色通道提取(green channel extraction)和阀值撷 取(thresholding)来确定阳性染色，并用阳性象素来表示其。然后 使用Statview软件(Abacus Concepts，Berkeley，CA)确定各组的 统计分析并以平均值和标准差表示。使用单因子ANOVA重复测量和 Fisher PLSD事后检测法在95％的置信度下对所有比较进行统计显著性 分析。

结果：

用生物素标记Revitix蛋白，对各种蛋白都显示良好的标记。使 用NeutrAvidin染色来确定Revitix蛋白的透皮递送。对照组(图a 和c和e)和处理组(b和d和f)的两个不同放大倍数的照片显示于图 10中，其中a和b在10X放大倍数下，c至f在20X放大倍数下。将 阳性NeutrAvidin染色的平均值用于比较。在第3天，Revitix+主链 的阳性染色平均值显著高于水(50.297±6.394对16.676±2.749)和单 独的Revitix(50.297±6.394对18.379±6.394；P＝0.0041)。

表9：阳性NeutrAvidin染色。显示平均值和标准差。

    组     平均值     标准差     A     16.676     2.749     B     18.379     6.394     C     50.297     6.394

P＝0.0041(置信度95％下是显著的)

结论

生物素标记的蛋白的凝胶分析使得能够在体外确定标记。

2天时间点用于确定通量。本实验进一步确认：和两个对照组相 比，经标记的蛋白的透皮递送在统计学上具有显著增加。和对照组相 比，在载体组中，信号的深度和量都显著地增加了。有趣的是，正如 通过凝胶电泳和向性的空间估计所验证的，各种蛋白的群体通过这些 预先装配的颗粒被运送穿过皮肤。

实施例11

这些实验展示新的分子成像平台，该平台通过使用肽基载体和肿 瘤抗原的抗体能够产生靶向的荧光探针的透过上皮的递送。

主链：

通过将-Arg9共价地附着至多聚赖氨酸(MW150,000)装配带正电 荷的肽基主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18 个赖氨酸残基共价地附着-Arg9)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧 链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对 照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸 (称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。

方法：

探针设计：

所述探针是基于静电相互作用自组装的多组分系统。这样的系统 可允许容易的替代功能部分。中心组分是具有过量的正电荷和多个附 着的CPPs的载体主链。所有的载荷(cargo)都是带负电荷的。终复 合物具有净正电荷以保持运输活性。

体外载体毒性：

就毒性对下列载体主链进行检测：

1.KNR

2.无R9侧链的多聚赖氨酸(K)

3.Superfect(Qiagen，Valencia，CA)，商购获得的转 染剂

用0.4mg载体(n＝6个小孔/组)在无血清培养基中温育培养至 70％汇合的HeLa细胞(ATCC，Manassas，VA)2小时，然后用PBS洗 涤。使用标准的染料排斥法检测毒性，其中可存活的细胞排斥染料， 而不能存活的细胞不排斥染料。使用分光光度计(Spectronic Genesys 5 UV/VIS)在595nm波长下测量染料的吸收。通过在OD595 测量前将浓度调整至和OD280值相匹配来将样品标准化为细胞数目。

体内报告基因的透皮递送：

为确定KNR载体是否能够将大分子量的以生物发光报告基因形式 存在的载荷递送穿过组织屏障(皮肤)，用各种载体主链检测下列探 针：

1. 主链：KNR；对照-K、Superfect、无载体

2. 载荷和成像部分：表达蓝色荧光蛋白的质粒(BFP，8kb， 2.6×106MW)

通过离子相互作用(阳离子主链-阴离子DNA)形成主链-质粒 (8μg质粒)，然后每天给C57 black 6小鼠(每组n＝4)的背部皮 肤施用，进行7天。然后收获经处理的皮肤部分，用荧光显微镜估测 BFP的表达。只在真皮中通过BFP阳性细胞/总细胞的百分比来确定透 皮基因递送效率。

靶向肿瘤细胞的成像探针的递送：

为确定KNR系统是否能够提供靶向结肠癌抗原的光学成像探针的 递送，用各种寻靶组分检测下列探针：

1. 主链：KNR

2. 成像部分：用荧光素异硫氰酸酯(FITC，Molecular Probes) 标记的4碱基寡核苷酸(Sigma-Genosys)

3. 靶向部分：a)通过EDC偶联共价缀合至阴离子多聚天冬氨酸 (3KMW)的针对癌胚抗原(CEA；clone CD66e，US Biological)的单克 隆抗体；b)对照-缀合至多聚天冬氨酸的针对肌动蛋白的单克隆抗体 (clone 3G1，US Biological)。

在形成KNR-成像部分-靶向部分复合物后，将共培养的(n＝6个小 孔/组)过量表达CEA的人结肠癌细胞(LS174T，ATCC)和对照小鼠成纤 维细胞(3T3，ATCC)与复合物在无血清培养基中温育2小时。然后用 PBS洗涤细胞3遍。通过对标记了FITC的LS174T细胞和3T3细胞的 百分比进行定量来估计靶向递送。通过形态学鉴定3T3细胞和LS174T 细胞。

结果：

和对照相比，KNR在透皮递送和BFP的转基因表达上的效率超过 对照20倍(5％±2.12％对0.25％±0.06％，P＜0.01)，证实了大到足以分 子成像的复合物的局部递送的可行性。在估计被靶向的递送中，荧光 素和TR信号，尽管各自是组合物的不同组分，但其在结肠癌细胞的 40.2％的象素上共定位(Ф相关性0.74，P＜0.001)。对照成纤维细胞被 荧光素或TR标记的程度最低，而87.6％±8.3％的结肠癌细胞对于荧光 素信号是阳性的。载体主链的相对毒性的结果显示于图11中，透皮基 因递送效率结果显示于图12中。

图13描述了在使用CEA特异性成像探针(图a)后，结肠癌(C) 和成纤维细胞(F，纺锤形)共培养物的明视野图象以及显示结肠癌但 非成纤维细胞的荧光素标记(图b)的荧光图象。

表10：成像探针的透皮递送和转基因表达。显示以百分比表示的 平均值和标准差。

    组     平均值     标准差

    BFP     5％     2.12％     对照     0.25％     0.06％

P＜0.01(在置信度99％下是显著的)

结论：

使用KNR证实了在局部施用后，大复合物(BFP基因)的透皮递 送和与抗原分布并行的光学探针的被靶向的递送。这些结果肯定了使 用该系统进行黑色素瘤的局部监视和结肠癌的粘膜下检测的可行性。 对本领域技术人员来说显而易见的是，该平台可用于治疗剂、诊断剂 或两者的组合的被靶向的递送。此外，通过结肠镜检查或dematoscopy (或直接的显现)以及成像方法例如虚拟结肠镜检查，该平台可用于实 时成像。

要理解此处描述的实施例和实施方案只是用于说明目的，要理解 本领域技术人员会联想到其各种修饰或改变，所述修饰或改变在本申 请的精神和范围内和在所附的权利要求的范围内。此处引用的所有出 版物、专利和专利申请以其全文在此引用作为所有目的的参考。

交叉引用相关的申请

本申请要求2004年3月3日提交的美国临时申请系列号 60/550,014的优先权，其内容在此以其全文引用作参考。

关于在联邦资助建立的研究和开发下进行的发明的权利的声明 不适用