发明的领域

本发明涉及一种可在体外培养的新型角质细胞，及其在制备治疗急性和 慢性创伤的药物中的有益应用。因此，本发明属于医学领域，特别是通过组 织工程使创伤愈合的领域。

现有技术

同种异体(allogeneic)角质细胞在创伤治疗方面已经成功的应用了很长一 段时间，尤其是在溃疡和/或烧伤创伤的治疗方面(Maier，1993；Schnfeld et al.， 1993)。那些对周期漫长的传统治疗方法产生抗性的创伤，常常可以采用同 种异体角质细胞进行有效治疗(Phillips and Gilchrest，1993；Beele et al.，199l； Leigh et al.，1991；Lindgren et al，1998)。当采用同种异体角质细胞时，一开始 注意力主要集中于皮肤的更新，也就是移植表皮的再生方面。然而，不久研 究表明，治疗的成功主要是基于对机体自身再上皮化的刺激，而不是基于同 种异体细胞移植物在创伤中的“生长”。最近，许多调查研究表明，移植的角 质细胞在创伤中只保留一段特定长的时间，然后就通过一种临床上不可察觉 的方式从机体消除(Kawai et al.，1993)。对机体自身创伤愈合的刺激主要产生 于同种异体角质细胞在空间和时间上对如下物质的优化的释放：一组不同的 生长因子、细胞因子、细胞外基质(ECM)、小分子和蛋白酶(Lang et al.，1996； Marcusson et al.，1992)。所释放的因子的复杂性和数量证实了这种治疗方法 优于传统单一治疗方法，例如采用分离的生长因子的治疗方法。然而，采用 角质细胞的治疗方法除了再上皮化的主要影响外，其还能在肉芽组织中产生 肉眼可见的和可借助于显微镜观察到的变化(Lang et al.，1996)。另一经常被 描述的角质细胞有益于病人的效果为移植后的显著镇痛作用(Schnfeld et al.， 1993)。

对于创伤愈合来说，采用未分化的，积极分裂的角质细胞是十分有利的， 因为积极分裂的角质细胞具有能促进创伤愈合的复杂的分泌谱(profile)。除 了干细胞外，未分化的角质细胞在自然分化过程中仅经过数次细胞分裂就丧 失了体内增殖潜能；至今，在角质细胞的体外培养过程中总是观察到这种现 象(Barrandon and Green，1987)。结果是，特别适合于创伤愈合的积极分裂的 角质细胞迄今为止只能进行体外培养，这导致其在医疗方面的应用变得困难 而昂贵。

在治疗中采用的同种异体角质细胞，可以直接是所谓“角质细胞片”形 式，其由多层、可经酶处理而脱离的细胞聚集物组成，也可以是与生物相容 载体一起形成“生物活性创伤愈合敷料”。后者的优点在于，在使用前不需要 通过酶的预处理使其从培养皿基质上脱离。此外，采用生物相容膜作为培养 角质细胞的载体(EP 0462462，US 5,658,331；US 5,693,332；EP 0518920)，使更 快地(earlier)制备生物活性创伤愈合辅料成为可能，因为细胞不再必须形成自 有细胞聚集物。已生长至亚汇合状态的载体可用于创伤治疗。除了能快速获 得以外，使用亚汇合细胞聚集物的额外优点在于，相应培养的角质细胞较少 的剧烈分化，从而有利于创伤治疗。

角质细胞可以直接或与生物相容载体材料一起在-30℃至-196℃(优选 -70至-90℃)条件下进行冷冻保藏，再用于创伤愈合而不产生任何有害效果 (De Luca et al.，1992；Teepe et al.，1993)。这进一步提高了角质细胞的治疗有 用性，它使在一定程度上保持生物活性创伤愈合辅料的供应成为可能。

发明解决的问题

现有技术中公开的角质细胞和由其产生的生物活性创伤愈合辅料存在 特定的缺陷，本发明的目的在于克服这些缺陷。

现今已知的原代起源的角质细胞的明显缺点在于：所述的细胞在不丧失 其高效率的分裂能力并因此不丧失其制备生物活性创伤愈合辅料的适合性 的前提下，只能通过体外细胞培养过程自我复制较少的几代。根据现有技术， 本领域熟练技术人员通过体外培养只能使细胞数增加约103至104倍。

随之而来的另一缺点在于，所述角质细胞有限的体外培养能力导致必须 进行频繁且复杂的再分离；这就意味着所获得的经过复制的细胞材料不均 一，从而由此制造的创伤愈合敷料将会，或至少是有可能会，存在质量差异。

其更进一步的缺点在于，从各种供体再分离角质细胞将导致创伤愈合集 落的受体个体增加感染的风险。例如，增加感染HIV或肝炎的风险。

发明的描述

本发明涉及一种具有高增殖潜能的角质细胞，其不能无限增殖，但通过 体外培养的方法至少能复制150次。其导致细胞的增殖系数约为1044。相应 的角质细胞仍然保持其用于治疗创伤的有利特性。

本发明角质细胞主要是从供体分离并体外培养的角质细胞，所述分离和 初始培养可以由本领域的任何普通技术人员根据例如，Rheinwald和Green 在1975所公开的方法来进行。

本发明优选涉及一种从包皮的表皮部分分离得到的角质细胞。优选人类 来源的角质细胞，尤其是培养物KC-BI-1的角质细胞，该细胞依据基于专利 目的的布达佩斯条约，于2001年6月27日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心)， GmbH，Braunschweig，德国，其保藏编号为DSM ACC2514。本发明还包括 那些衍生自KC-BI-1培养物(DSM ACC2514)的角质细胞。因此，本发明还包 括由原始KC-BI-1培养物再传代和/或再克隆获得的所有细胞和培养物。

本发明角质细胞的培养用角质细胞KC-BI-1的培养(实施例1)举例说明。 采用实施例1中具体详述的复合培养基，和采用滋养细胞，尤其是采用经致 死性辐射处理的鼠3T3成纤维细胞，将有利于培养。胎牛血清的量应为2％ 至10％。制备滋养细胞可采用本领域技术人员熟知的方法，例如实施例2 中描述的方法。本发明角质细胞的再培养在最大汇合为80％时特别有益。角 质细胞在35℃至38℃间培养，优选37℃，其相对湿度为＞90％，优选95％， 其CO2饱和度为5％至9％。

根据实施例1所述的培养过程，角质细胞，尤其是来源于包皮的表皮部 分的人角质细胞，其群体倍增时间为1至2天(图1)。这些细胞能以实质上 稳定的复制速率复制许多代(图2)。但是，本发明不仅仅局限于角质细胞 KC-BI-1，本领域的熟练技术人员能在合适的条件下，采用权利要求1-8所 述的任何角质细胞实现本发明。

本发明所涉及的术语“不能无限增殖”是指原代分离得到的角质细胞和 这里培养得到的角质细胞不能自发转化和/或并未被本研究中已知的分子生 物学，化学或物理方法转化。后者是指细胞没有采用例如，病毒因子或序列， 化学诱变剂，或举例来说，采用辐射或不同方法的组合来处理。

“不能无限增殖”的角质细胞还指，与转化的肿瘤细胞系(Hrle-Bachor和 Boukamp，1993)或无限增殖的细胞系，特别是HeLa细胞系相比，所述的角 质细胞不具有端粒酶活性或具有实质上降低的端粒酶活性(参见图3)。尤其 在与无限增殖的角质细胞系HaCat的比较中这一点也是事实。

术语“不能无限增殖”也指所述的角质细胞系不能在缺少胎牛血清和/或 在缺少滋养细胞和/或在缺少表皮生长因子EGF的情况下，象例如无限增殖 的角质细胞一样复制(Schoop et al.，1999)。

但术语“不能无限增殖”还指，在细胞复制增加时，所述的角质细胞不会 改变其特征表型(参见图4)。

“不能无限增殖”还指，在移植至裸鼠，尤其是BALB/c后，所述的角质 细胞显示出正常的分化谱。“正常的分化潜能”在这里是指，角质细胞以与自 体角质细胞相同的方式发育成终末分化的角质细胞以及形成基上表皮层 (suprabasal epidermal layer)和角质层(stratum corneum)的能力。

本发明还涉及不能无限增殖、但能通过体外细胞培养而复制至少200代 的角质细胞。本发明还涉及不能无限增殖、但能通过体外细胞培养而复制至 少250代的角质细胞。本发明还涉及不能无限增殖、但能通过体外细胞培养 而复制至少300代的角质细胞。

本发明的优点在于使所述的角质细胞从一个或仅仅少数供体复制。例 如，从一个供体开始，经150轮细胞复制之后可获得1044个细胞，经250 轮细胞复制之后可获得1077个细胞，经300轮细胞复制之后可获得1090个 细胞。因此，本发明首次使得有可能生产大量、标准化的细胞材料用以制备 稳定且质量可靠的生物活性创伤愈合聚集物。相应数量的标准化细胞材料可 以例如，从冷藏细胞库开始复制，所述库是从具有本发明所述特性的角质细 胞制备的。

通过采用标准化的细胞材料作为制备生物活性创伤愈合敷料的起始材 料，可能的受体个体感染风险也降低，这是因为对角质细胞的分离将限于少 数供体，优选一个供体。

因此，本发明克服了迄今已知的角质细胞仅能有限传代的严重缺陷。

本发明还涉及一种产物，该产物由覆盖有本发明角质细胞的载体组成。 “覆盖”为了本发明目的是指载体表面部分地或全部地定居有本发明角质细 胞。部分定居的载体将尤为适合，因为在载体能用于创伤治疗前，所需要的 培养时间缩短。

适合本发明目的的载体的特性在于，其为一种能用于制备药物组合物的 生物相容载体材料。例如，可采用如WO 9113638中所述的疏水性生物相容 载体材料。不过，也可以采用那些具有显著亲水特性的载体材料。

本发明一优选实施方案包括使用由酯化透明质酸聚合物组成的载体材 料。在一特别优选的实施方案中，采用了酯化透明质酸聚合物，其由具有确 定几何学的有孔聚合物膜组成。例如，该聚合物膜的厚度为10至500μm， 开有孔径为10至1000μm的孔，这些孔具有确定的，均一的尺寸，并形成 有序的排列，相互间隔50至1000μm的恒定间距。在EP 0462426中记载了 这样一种膜。有孔的载体材料尤为适合，因为其不需要将生物活性创伤愈合 敷料按特定的方向置于创伤上。实施例3中举例描述了具有特定几何学且定 居有本发明角质细胞的酯化透明质酸有孔载体基质。该载体基质由Messrs Fidia Advanced Biopolymers Ltd.，Abano Terme，意大利公司生产，在德国市场 的产品名称为“Laserskin”。

该载体材料在制备与角质细胞相连接的生物活性创伤愈合敷料方面特 别优选的合适特性已经在动物模型(Lam et al.，1999)和人体(Harris et al.，1999) 中证实。除了改进上皮细胞的迁移和分化外，由透明质酸酯组成的基质对血 管生成和胶原蛋白产生都有积极作用。但是，目前使用的由透明质酸酯作为 基质的创伤敷料，其表面均覆盖有自体角质细胞和/或从角质细胞和成纤维细 胞获得的复杂结构的皮肤等效物。因此，其存在上述现有技术缺陷。采用本 发明中的有益的同种异体角质细胞将具体克服该缺陷。

本发明另一优选的实施方案涉及一种产物，该产物包含本发明的角质细 胞和可以再吸收的聚合物，其由以下组成：聚酯，聚碳酸酯，聚酐，聚原酸 酯，聚缩肽(polydepsipeptide)，聚醚酯，聚氨基酸或聚磷腈，尤其聚(L-交酯)， 聚(D，L-交酯)，聚(L-交酯-共-D，L-交酯)，聚(乙交酯)，聚(L-交酯-共-乙交酯)， 聚(L-交酯-共-三亚甲基-碳酸酯)或聚(二噁烷)。这些聚合物物质既可以为有孔 材料也可以为无孔材料。

本发明还涉及在-20℃至-196℃，优选-180℃以下冷冻保藏本发明的角 质细胞的方法。所述的角质细胞可以采用本领域技术人员熟知的标准方法进 行冷冻。尤其可用DMSO作冷冻保护剂。也可以采用其它的冷冻保护剂， 例如，甘油，羟乙基淀粉或二者的联合使用，以及这些与DMSO的联合使 用。例如，在WO 9624018，US 5891617或US 5298417中描述了合适的方法。

本发明还涉及对覆盖有本发明的角质细胞的载体进行冷冻保藏，其特征 在于将角质细胞及其相应的载体在-20℃至-196℃，优选-60℃至-80℃进行冷 冻保藏。冷冻保藏的优点在于所得的大量产物可以被储存，从而在临床使用 前能通过随机取样检验其质量的均一性。最后，存储保证了为医疗目的而在 短时间内获得创伤愈合聚集物。

本发明产物的合适的冷冻保护剂为，羟乙基淀粉，例如含量为7-13％ (w/w)。不过，也可以使用DMSO或甘油以及联合使用各种冷冻保护剂，特 别是羟乙基淀粉，DMSO和/或甘油。还可以使用海藻糖作为冷冻保护剂。

在2-5分钟内将温度从37℃快速降至-5至-10℃，优先降至-6至-8℃ 之后，含有载体和本发明角质细胞的产物将在适合的温度中平衡15-30分钟， 优选平衡23-26分钟。然后，使产物以＜1℃/分钟的冷冻速率，优选0.2至 0.6℃/分钟，最优选0.4℃/分钟的冷冻速率，冷冻至例如-60至-80℃。

实施例4通过具体例子描述了覆盖有KC-BI-1的透明质酸酯载体基质的 冷冻保藏。但是，也可以采用其它的冷冻保藏方法，例如WO 95707611，WO 9624018，EP 0296475中描述的方法；但是上述列举不能被视为保藏方法的穷 举，而仅仅只表明由生物相容载体和角质细胞组成的产物的冷冻保藏方法属 于现有领域的一部分。

本发明还涉及本发明描述的角质细胞和/或所述角质细胞和本文所述载 体的产物的医疗用途，尤其是在治疗创伤方面的用途。本发明一具体实施方 案是本发明角质细胞和/或所述角质细胞和载体的产物在治疗烧伤和/或溃疡 方面的用途。所治疗的烧伤优选二度烧伤，而所述的溃疡优选难以治愈的慢 性下肢溃疡，Ulcus cruris型溃疡，Ulcus cruris venosum型溃疡或糖尿病溃疡， 以及褥疮性溃疡。

所述的医疗用途包括将所述角质细胞和/或由本发明角质细胞和载体组 成的产物与本领域所知的有效治愈创伤的传统治疗方法联合使用和/或作为 其补充。这意味着一种或多种其它能有效治愈创伤的物质的联合使用和/或补 充使用。可以一提的是，在治疗Ulcus cruris venosum时，可以补充使用和/ 或联合使用水胶体和/或另外使用抗微生物物质，例如，施用抗生素。

本发明还涉及本发明角质细胞和/或生物相容载体与所述角质细胞形成 的产物用于制备治疗创伤，尤其是治疗烧伤和/或溃疡，例如治疗二度烧伤， Ulcus cruris(venosum)，糖尿病溃疡，或褥疮性溃疡的医疗产品。

本发明还涉及治疗上述创伤的方法，该方法的特征在于本发明角质细胞 和/或包含有角质细胞和载体的本发明产物被施用于需要治疗的创伤上。所述 的角质细胞和产物即可以为鲜制的也可为经冷冻保藏后的。实施例5中描述 了相应的治疗创伤的方法。

附图说明

图1：角质细胞KC-BI-1的复制，表示为培养时间的函数。

本图显示了角质细胞KC-BI-1在94天的培养阶段中的细胞复制数量 (CPD＝累积群体倍增)。在94天的观察阶段，细胞大约倍增了75次。这对应 于每一轮细胞复制时平均倍增时间为1.25天，或每10天倍增12.5代。

图2：角质细胞KC-BI-1在10个月中的倍增。

本图显示了角质细胞KC-BI-1在10个月中的细胞复制，表示为群体倍 增(PD)相对于1-67个细胞世代的函数。

图3：确定相对端粒酶活性。

本图显示了角质细胞KC-BI-1在经1，12，18，40，和57代后的相对 端粒酶活性与HeLa细胞系中的酶活性的比较。本图显示了与无限增殖的 HeLa细胞系相比，角质细胞KC-BI-1几乎没有或仅有轻微的端粒酶活性。

图4：经传代5和60代之后的角质细胞KC-BI-1的形态。

在光学显微镜下观察，传代第5代的(培养时间25天)和传代第60代的 (培养时间300天)角质细胞KC-BI-1没有任何形态学上的区别。

具体实施例

实施例1：以培养物KC-BI-1(DSM ACC2514)为例详述培养本发明角 质细胞的方法

1.材料

角质细胞KC-BI-1；经辐射的3T3-鼠成纤维细胞(滋养细胞，其制备参 见实施例2)；细胞培养基K/1(组成如下)；EDTA(0.02％)；胰蛋白酶/EDTA (0.05％/0.01％)；细胞培养瓶(T-细胞瓶)：25cm2，80cm2，175cm2。

2.细胞解冻

2.1滋养细胞解冻

细胞快速解冻然后加入5-10ml预热的K/1培养基中。将相应数量的滋 养细胞转移至合适的细胞培养瓶中，其上添加K/1培养基：

25cm2T-细胞瓶        0.5×106细胞     培养基终体积：5-6ml

80cm2T-细胞瓶        1.5×106细胞     培养基终体积：20ml

175cm2T-细胞瓶       3.5×106细胞     培养基终体积：50ml

滋养细胞可以立即投入使用或在24小时内使用。

2.2角质细胞解冻

细胞快速解冻然后加入5-10ml预热的K/1培养基中。将相应数量的细 胞加入含有滋养细胞的细胞培养瓶，其上添加新鲜的培养基：

25cm2T-细胞瓶     0.15×106细胞；培养基终体积：6-10mL

80cm2T-细胞瓶     0.4×106细胞；培养基终体积：20mL

175cm2T-细胞瓶    1×106细胞；培养基终体积：50mL

3.0培养

细胞于35-39℃，优选37℃保温。相对湿度为＞90％，优选95％，CO2浓 度为5-9％。在最大汇合为80％时，对角质细胞进行再培养。

为此，弃去细胞培养上清。滋养细胞用0.02％EDTA(2-10ml)漂洗两次， 并在37℃保温5-10分钟，然后通过轻敲(或震荡)使其脱离细胞培养瓶。然后 角质细胞用胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％，1-6ml)37℃处理5-10分钟，并通 过轻敲而小心地使其脱离。如果需要，用细胞刮刀将剩下的细胞小心刮下。 加入K/1培养基来中和胰蛋白酶/EDTA溶液，细胞通过小心地上下吹打而分 散。按2.2章节所指明的数量接种细胞。在第3天更换细胞培养基K/1，然 后每2天换液一次。

4.0K/1培养基的制备

按表1所示的顺序，依次添加所有的成分和贮存液并混合。加入WFI(注 射用水)将混合物补足到1升。然后用NaOH或HCl调节pH值至7.0-7.2。 克分子渗透压浓度应为320-400mOsm/kg。最后将K/1培养基过滤除菌。

4.1贮存液的制备

三碘甲腺原氨酸

将13.6mg的三碘甲腺原氨酸溶于1ml的0.1NaOH溶液中，向其中加 入99ml PBS。最终溶液用PBS稀释为1∶100。每升培养基须加入该溶液1ml。

EGF

将1mg的EGF溶于100ml的WFI中。每升培养基须加入该溶液1ml。

rh-胰岛素(仅在pH＜4.0时可溶)

向0.9L的WFI中加入5g的rh-胰岛素，并用6M HCl调节pH至2.5。 待rh-胰岛素溶解后，用1M NaOH调节pH至8.0。用WFI将该混合物补足 为1升。每升培养基须加入该溶液1ml。

4.2培养基的组成 成分   浓度/L WFI(注射用水)   0.8L 含有谷氨酰胺的DMEM   10.035g HAM’s F12   2.66g 碳酸氢钠   3.07g 丙酮酸Na   0.11g Apo-运铁蛋白   5mg 半硫酸化腺嘌呤   147.4mg 毛喉素(溶于几滴DMSO中)   2.05mg Rh-胰岛素浓缩液   1.0mL 氢化可的松10mM   0.11mL 三碘甲腺原氨酸贮存液   1.0mL EGF-贮存液   1.0mL 酚红   8.1mg FCS(2-10％)   20-100mL 6M HCl 按需要量加入 40％NaOH 按需要量加入 WFI 加入至1.0L

不过，细胞也可以从新鲜的活组织检查物中来培养，例如，从包皮的表 皮部分开始培养。未分化、正在增殖的角质细胞的最初分离，可以采用 Rheinwald和Green在1975年描述的方法。

所用的滋养细胞可以例如，使用实施例2中所描述的细胞。也可以采用 其它致死性成纤维细胞，优选其它鼠成纤维细胞，最优选细胞系3T3的后代。

实施例2：制备经辐射的3T3滋养细胞，用于角质细胞培养

1.材料1

鼠3T3成纤维细胞(例如，ATCC CCL 92，3T3-瑞士白化体，接触抑制性 成纤维细胞)可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA，USA获得；DMEM+10％胎牛血清(FCS)；PBS； 0.2％胰蛋白酶溶液；0.04％EDTA溶液；细胞培养瓶(T-细胞瓶)：25cm2， 80cm2，175cm2。

2.细胞解冻

细胞快速解冻然后加入5-10ml预热的K/1培养基中。通过离心，除去 含有DMSO的培养基。将细胞悬浮于5-10ml培养基中。经过细胞计数后， 将细胞接种于合适的细胞培养瓶中，接种密度为103至104细胞/cm2。然后 置于35-39℃，优选37℃保温。相对湿度为＞90％，优选95％，CO2浓度为 5-9％。

3.细胞培养

每日观察细胞的生长。细胞密度不能超过70-80％的最大汇合。按需要， 每2至4天，进行一次传代培养。为此，弃去培养基，细胞用合适体积(0.5-5 ml)的1∶2的EDTA和胰蛋白酶混合溶液漂洗。然后将已脱离的细胞加入 3.5-20ml的培养基中。以103至104细胞/cm2的密度进行在接种。

4.对滋养细胞进行辐射

滋养细胞以约60Gy(137Cs放射源中6000拉德)的辐射剂量接受辐射。

辐射后的和非辐射的细胞都采用标准方法在液氮中冷冻并贮藏较长的 一段时间。

实施例3：用来自培养物KC-BI-1(DSM ACC2514)的角质细胞覆盖载 体基质(本例中为Laserskin)的方法

现举例说明本发明生物活性创伤愈合敷料的制备。此处描述的创伤愈合 敷料由本发明角质细胞KC-BI-1和Laserskin组成，后者是一种含有透明质 酸酯的生物再吸收载体基质。

但是，本发明的范围不限于此处描述的组合。任何具有权利要求1-8所 述新特性的角质细胞都能用于覆盖。

还可以采用其它的合适的载体基质，只要其为能用于制备药物组合物的 生物相容载体材料。例如，可采用WO 9113638中描述的疏水性生物相容载 体材料。此外，也可以采用具有显著亲水特性的载体材料。

本发明另一优选的实施方案包括，将本发明角质细胞与再吸收聚合物联 合使用，包括：聚酯，聚碳酸酯，聚酐类，聚原酸酯，聚缩肽(polydepsipeptide)， 聚醚酯，聚氨基酸或聚磷腈，尤其聚(L-交酯)，聚(D，L-交酯)，聚(L-交酯-共 -D，L-交酯)，聚(乙交酯)，聚(L-交酯-共-乙交酯)，聚(L-交酯-共-三亚甲基-碳酸 酯)或聚(二噁烷)，以及采用由上述聚合物组成的有孔膜。

1.材料

K/1培养基(参见实施例1)；PBS；0.04％EDTA(用PBS稀释到0.02％)； 胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％)；无菌的Roux培养皿(T 25cm2，T 80cm2，T 175cm2，)；置于144×21Petri培养皿(表面积为145cm2)中的Laserskin(Messrs. Fidia Advanced Biopolymers srl，Abano Terme，意大利)；3T3滋养细胞；本发 明角质细胞，例如KC-BI-1。

2.生物活性创伤愈合敷料的培养

2.1.材料

辐射后的滋养细胞，例如，实施例2中提到的鼠3T3成纤维细胞；贮存 的本发明角质细胞；置于Petri培养皿中的大小为8.5cm×8.5cm的Laserskin (终产物)；K/2培养基。

2.2.3T3滋养细胞的接种(seeding out)

将根据实施例2制备的滋养细胞置于Laserskin上，接种密度约为15,000 至25,000细胞/cm2(大约相应于3×106细胞/Petri培养皿)。然后将Petri培养 皿在35至37℃，相对湿度＞90％和CO2浓度5-11％(优选CO2浓度7-9％) 的条件下，在37℃培养箱中培养。角质细胞于当日，或最迟于次日(24小时 后)接种在滋养细胞集落上。

2.3.角质细胞的接种和培养

采用本发明角质细胞制备生物活性创伤愈合敷料。举例来说，角质细胞 的传代培养可以按如下方法进行：

采用0.02％EDTA(80cm2 Roux培养皿：8mL；175cm2 Roux培养皿： 10ml)漂洗亚汇合培养物。然后，滋养细胞用0.02％EDTA(80cm2 Roux培 养皿：8mL；175cm2 Roux培养皿：10ml)在37℃保温5-10分钟，并小心震 荡使之脱离。

按实施例1所述，将角质细胞溶于胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％)混合 液中(80cm2 Roux培养皿：2-3mL；175cm2 Roux培养皿：5-6ml)，随后加入 细胞培养液(80cm2 Roux培养皿：7-8mL；175cm2 Roux培养皿：14-15ml)， 通过小心地上下吹打使细胞分散。

本发明角质细胞置于有滋养细胞的Laserskin膜上，其接种密度约为 15,000至25,000细胞/cm2(大约相应于3×106细胞/Petri培养皿)。然后将细胞 在35-39℃，优选37℃培养至30-100％汇合，优选80-100％汇合。相对 湿度＞90％，优选95％，其CO2浓度为5-9％。

实施例4：本发明生物活性创伤愈合敷料的冷冻保藏方法

当角质细胞在载体基质上定居直至30-100％汇合，优选80-100％汇合 后，可将本发明产物放在合适的容器(如热封PP袋)中，在控制的条件下冷 冻。为此，小心除去培养基，并代之以2-6℃的K/2冷冻培养基20ml。随 后，该产物在无菌条件下包装，并根据下述方法进行冷冻：

在2-5分钟内，将温度快速降至-5至-10℃，优选-6至-8℃，然后将产 物在相应温度平衡15-30分钟，优选23-25分钟。然后将产物冷却至，例如 -60至-80℃，冷冻速率为＜1℃/分钟，优选0.2至0.6℃/分钟，最优选0.4℃/ 分钟。产物在-60至-80℃保存。

K/2冷冻培养基：

将K/1生长培养基(参见实施例1)与7-13％(w/w)的羟乙基淀粉混合。

实施例5：应用定居了本发明角质细胞的载体基质覆盖创伤(以腿部 静脉溃疡为例)的用途举例

1.新鲜制备的创伤愈合敷料的运输

当角质细胞在Laserskin上生长至30-100％，优选80-100％汇合后，将 培养物用适量(优选30ml)K/3运输培养基漂洗1次或多次。将生物活性创伤 愈合敷料转移至适量(优选20ml)K/3运输培养基中。Petri培养皿的顶部空间 快速充入混有5-10％CO2的空气，然后用粘胶带，例如Parafilm密封，然 后置于运输箱中立即送至临床使用。

K/3运输培养基：

无胎牛血清(FCS)的生长培养基K/1(参见实施例1)。但是，也可以采用 简单的生理盐水溶液，例如基于磷酸-硼酸者，例如PBS，或基于 HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)或MES([2-N-吗啉代]乙烷磺酸)者。

2.冷冻保藏创伤愈合敷料的运输

经过冷冻保藏的创伤愈合敷料通常可以用干冰运输至临床。不过，也可 以采用其它的运输形式，只要保证创伤愈合敷料在-60℃以下运输。

经过冷冻保藏的创伤愈合敷料被迅速的解冻。然后除去冷冻培养基，并 用K/3运输培养基(参见上文)或其它的合适的生理溶液，例如Ringer’s溶液， 漂洗敷料1次或多次。

3.治疗用途

然后将敷料置于创伤上。当采用无孔载体材料时，必须将创伤愈合敷料 正确放置，以使细胞接触创面。采用能允许角质细胞定居在载体两侧的这类 有孔载体则意味着无须将本发明创伤愈合敷料以任何具体方位置于需要治 疗的创伤上。根据治疗的效果，这种治疗可以重复多次。

实施例6：角质细胞KC-BI-1(DSM ACC2514)的遗传特性

采用本发明上述方法，将KC-BI-1细胞再培养数代。对第4，13，和121 代的细胞进行遗传分析，调查了15个不同基因座(CSF1PO，D13S317， D16S539，D18S51，D21S11，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，Penta D，Penta E，TH01，TPOX和vWA)的长度多态性。采用本领域已知的方法对其 进行分析。为此，采用一种由Messrs Promega(Mannheim，德国)公司生产的 确定父系来源的测试盒(PoewerPlex16 System)，按生产商提供的说明书， 扩增相应的等位基因。通过确定片段长度鉴定出等位基因(标准长度ILS 600 为上述试剂盒的一部分)。在对应的表格中记载有群体中等位基因频率的资 料。

所有经分析的细胞世代在所有基因座的所有等位基因分析结果一致。该 资料因此使KC-BI-1细胞能进行遗传分类。由等位基因频率确定了分类概率 为＞99.999％。

DNA长度多态性的确定  标记     供体     KC-BI-1第4代    KC-BI-1第13代     KC-BI-1第121代  CSF1PO     11     12     11     12    11    12     11     12  D13S317     8     13     8     13    8    13     8     13  D16S539     11     13     11     13    11    13     11     13  D18S51     13     17     13     17    13    17     13     17  D21S11     29     29     29     29    29    29     29     29  D3S1358     15     15     15     15    15    15     15     15  D5S818     9     11     9     11    9    11     9     11  D7S820     9     9     9     9    9    9     9     9  D8S1179     10     14     10     14    10    14     10     14  FGA     23     26     23     26    23    26     23     26  Penta D     11     12     11     12    11    12     11     12  Penta E     10     12     10     12    10    12     10     12  TH01     8     9,3     8     9,3    8    9,3     8     9,3  TPOX     8     10     8     10    8    10     8     10  vWA     16     18     16     18    16    18     16     18

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