甜菊醇糖苷类的重组生产
阅读：858发布：2022-06-15
专利汇可以提供甜菊醇糖苷类的重组生产专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 涉及甜菊醇糖苷类的重组生产。本 发明 公开了经过改造能够表达编码UDP-糖基转移酶(UGT)之重组基因的重组 微 生物 、 植物 和植物细胞。这样的微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇糖苷类，例如莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D，其可用作食品中的天然 甜味剂 和膳食补充剂。，下面是甜菊醇糖苷类的重组生产专利的具体信息内容。
1.一种产生靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物的方法，其包括使包含甜菊醇、前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物的起始组合物与以下的一种或更多种：
a)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化；
b)多肽，其能够对甜菊醇13-O-单糖苷进行鼠李糖基化；
c)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT74家族包括UGT74G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化；
d)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT85家族包括UGT85G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化；和/或
e)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化；
其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；
以及一种或更多种UDP-糖在适合一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上的反应条件下接触，
从而产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或更多种UDP-糖包括UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、果糖和/或UDP-木糖。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶甜菊醇糖苷类包括甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊醇单葡萄糖苷、甜菊醇鼠李糖苷或甜菊醇木糖苷。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶甜菊醇糖苷类组合物包含甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊醇单葡萄糖苷、甜菊醇鼠李糖苷和/或甜菊醇木糖苷、或者其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中
a)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊苷或莱鲍迪苷B、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷A；或者
b)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-1，2-二糖苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷B；或者
c)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、或甜菊苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷E；或者
d)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、或莱鲍迪苷E、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷D；或者
e)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、或甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、和/或鼠李糖合成酶(RHM2)多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生杜尔可苷A；或者
f)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷、或杜尔可苷A、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、鼠李糖合成酶(RHM2)多肽、和/或能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触；并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷C；或者
g)所述前体甜菊醇糖苷类是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、1，2-甜菊醇木糖苷、或甜菊醇-1，2-木糖二苷、或者其混合物，所述一种或更多种UDP-糖是UDP-葡萄糖和UDP-木糖，
所述甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类或其混合物与能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽、能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽相接触、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD1)多肽、和/或UDP-葡糖醛酸脱羧酶(UXS3)多肽；
并且
在所述一种或更多种糖部分从所述一种或更多种UDP-葡萄糖和UDP-木糖转移到甜菊醇、所述前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物上之后产生莱鲍迪苷F。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在已转化有编码所述能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物，所述基因与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列具有至少80％的同一性。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是体外方法，其还包括提供所述一种或更多种UDP-糖和/或无细胞系统用于所述一种或更多种UDP-糖的再生。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述体外方法是酶促体外方法或全细胞体外方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述全细胞体外方法包括将包含所述一种或更多种UDP-糖和一种或更多种底物的原材料喂食给全细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞具有降低的降解外源蔗糖的能力。
11.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞包含一种或更多种编码以下的重组基因：蔗糖合酶(SUS)多肽、蔗糖转运蛋白多肽、鼠李糖合成酶(RHM2)多肽、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD1)多肽、或UDP-葡糖醛酸脱羧酶(UXS3)多肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其中
(a)所述蔗糖转运蛋白多肽由拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUS1基因或其功能同源物编码；
(b)所述SUS多肽由小果咖啡(Coffea arabica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)或甜叶菊(Stevia rebaudiana)SUS1基因或其功能同源物编码；
(c)所述RHM2多肽包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)RHM2多肽；
(d)所述UGD1多肽包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)UGD1多肽或新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)UGD1多肽；和/或
(e)所述UXS3多肽包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)UXS3多肽或新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)UXS3多肽。
13.根据权利要求11所述的方法，其中
(a)所述蔗糖转运蛋白多肽包括与SEQ ID NO：179中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的蔗糖转运蛋白多肽；和/或
(b)所述SUS多肽由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：175-177中任一个所示核苷酸序列具有至少90％的同一性，或者所述SUS多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：180中所示氨基酸序列具有至少90％的同一性。
14.根据权利要求11所述的方法，其中：
(a)在已转化有编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)蔗糖转运蛋白多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述蔗糖转运蛋白多肽；
(b)在已转化有基因的通透化重组宿主细胞中产生所述SUS多肽，所述基因编码的多肽与SEQ ID NO：175-177中任一个所示氨基酸序列具有至少80％的同一性，或者具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：180中所示氨基酸序列具有至少80％的同一性；
(c)在已转化有编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)RHM2多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述RHM2多肽；
(d)在已转化有编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)UGD1多肽或新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)UGD1多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD1)多肽；和/或
(e)在已转化有编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)UXS3多肽或新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)UXS3多肽之基因的通透化重组宿主细胞中产生所述UXS3多肽。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述体外方法中包含的全细胞的内源蔗糖转化酶是被破坏的。
16.根据权利要求9所述的方法，其还包括在细胞生长期间或之后喂食原材料。
17.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞：
(a)是悬浮的或固定化的；
(b)被截留在藻酸钙珠或藻酸钠珠中；
(c)与中空纤维管反应器系统相连；
(d)被浓缩并截留在膜反应器系统中；或
(e)在发酵液中或者在反应缓冲液中。
18.根据权利要求9所述的方法，其还包括通过使用通透剂来使所述全细胞通透化，其中所述通透剂是溶剂、去污剂、表面活性剂，或者通过机械冲击、电穿孔或渗透冲击来使所述全细胞通透化。
19.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉菌(Aspergillus)属的真菌细胞或者来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、Cyberlindnera jadinii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、发夫酵母(Xanthophyllomyces
dendrorhous)、白色念珠菌(Candida albicans)物种的酵母细胞、藻类细胞、或者来自大肠杆菌(Escherichia coli)物种或芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌细胞。
20.根据权利要求9所述的方法，其中用于所述全细胞体外方法的全细胞是解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
21.根据权利要求1所述的方法，其包括使用磷酸酶。
22.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和
19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化的多肽包含：
(i)与SEQ ID NO：5或152中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽；
(ii)在SEQ ID NO：5的第206位氨基酸残基处具有精氨酸、第207位氨基酸残基处具有半胱氨酸并且在第343位氨基酸残基处具有精氨酸的多肽；
(iii)在SEQ ID NO：5的第30位残基处具有酪氨酸或苯丙氨酸、第93位残基处具有脯氨酸或谷氨酰胺、第99位残基处具有丝氨酸或缬氨酸、第122位残基处具有酪氨酸或苯丙氨酸、第140位残基处具有组氨酸或酪氨酸、第142位残基处具有丝氨酸或半胱氨酸、第148位残基处具有丙氨酸或苏氨酸、第152位残基处具有甲硫氨酸、第153位残基处具有丙氨酸、第
156位残基处具有丙氨酸或丝氨酸、第162位残基处具有甘氨酸、第195位残基处具有亮氨酸或甲硫氨酸、第196位残基处具有谷氨酸、第199位残基处具有赖氨酸或谷氨酸、第211位残基处具有亮氨酸或甲硫氨酸、第213位残基处具有亮氨酸、第221位残基处具有丝氨酸或苯丙氨酸、第253位处具有缬氨酸或异亮氨酸、第286位处具有缬氨酸或丙氨酸、第427位处具有赖氨酸或天冬酰胺、第438位残基处具有丙氨酸、并且第462位残基处具有丙氨酸或苏氨酸的多肽；
(iv)在SEQ ID NO：5的第211位残基处具有甲硫氨酸、并且第286位处具有丙氨酸的多肽；或
(v)氨基酸序列如SEQ ID NO：10、12、76、78、95中所示的多肽；
(b)能够对甜菊醇13-O-单糖苷进行鼠李糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：150中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽；
(c)能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽；
(d)能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化的多肽包含：
(i)与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽；或
(ii)在SEQ ID NO：3的第9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、
334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471位残基处具有一个或更多个氨基酸替换的多肽；
(e)能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和
19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化的多肽包含：
(i)与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽；或
(ii)在SEQ ID NO：7的第29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、
198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处具有一个或更多个氨基酸替换的多肽。
23.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用：
(a)RHM2多肽；
(b)UGD1多肽和UXS3多肽；
(c)蔗糖和蔗糖合酶多肽；和/或
(d)磷酸酶多肽。
24.根据权利要求1所述的方法，其还包括从所述起始组合物中分离所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述分离步骤包括将所述起始组合物的液相与所述起始组合物的固相分开以获得包含所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物的上清液，以及：
(a)使所述上清液与一种或更多种吸附树脂接触以获得至少一部分所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物；或
(b)使所述上清液与一种或更多种离子交换或反相色谱柱接触以获得至少一部分所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物；或
(c)结晶或提取所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物；
从而分离所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物。
26.根据权利要求1所述的方法，其还包括从所述起始组合物中回收所产生的靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中相对于来自甜菊植物的甜菊醇糖苷类组成，所回收的靶甜菊醇糖苷类组合物富含所产生的靶甜菊醇糖苷类，并且相对于获自来源于植物的甜菊提取物，所回收的靶甜菊醇糖苷类组合物具有降低水平的来源于甜菊植物的组分。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述甜菊醇是来源于植物的或合成的甜菊醇。
29.一种产生靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物的方法，其包括使包含甜菊醇、前体甜菊醇糖苷类和/或其混合物的起始组合物与以下的一种或更多种：
a)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化；
b)多肽，其能够对甜菊醇13-O-单糖苷进行鼠李糖基化；
c)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT74家族包括UGT74G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化；
d)尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)UGT85家族包括UGT85G1多肽的多肽，其能够使甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化；和/或
e)多肽，其能够对所述前体甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化；
以及一种或更多种UDP-糖在第一生物催化过程中在适合糖部分转移到所述甜菊醇或所述前体甜菊醇糖苷类上的反应条件下接触，以产生中间体靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物；并且
在第二生物催化过程中使用所述中间体靶甜菊醇糖苷类或靶甜菊醇糖苷类组合物，从而产生所述靶甜菊醇糖苷类或所述靶甜菊醇糖苷类组合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述甜菊醇是来源于植物的或合成的甜菊醇。
31.重组宿主细胞，其包含编码多肽的重组基因，所述多肽能够从ent-异贝壳杉烯酸合成甜菊醇并且与SEQ ID NO：164中所示氨基酸序列具有至少80％的同一性，其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类。
32.在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类的方法，其包括在一种或更多种基因表达的条件下使权利要求31所述的重组宿主细胞在所述细胞培养物中生长，并且其中由所述重组宿主细胞产生所述一种或更多种甜菊醇糖苷类。
33.重组宿主细胞，其包含重组基因，所述重组基因编码缺少叶绿体转运肽的ent-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽，其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类。
34.在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类的方法，其包括在一种或更多种基因表达的条件下使权利要求33所述的重组宿主细胞在所述细胞培养物中生长，并且其中由所述重组宿主细胞产生所述一种或更多种甜菊醇糖苷类。
35.重组宿主细胞，其包含编码多肽的重组基因，所述多肽能够对甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化，并且与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列具有至少80％的序列同一性；所述重组宿主细胞还包含：
a)编码多肽的基因，所述多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷类在其C-13羟基处糖基化，并且与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；
b)编码多肽的基因，所述多肽能够对甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者
13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’处进行β1，3-糖基化，并且与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；
c)编码多肽的基因，所述多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷类在其C-19羧基处糖基化；
和/或
d)编码第二多肽的基因，所述多肽能够对甜菊醇糖苷类的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’处进行β1，2-糖基化；
其中所述基因中的至少一种是重组基因；并且
其中所述重组宿主细胞能够在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类。
36.在细胞培养物中产生一种或更多种甜菊醇糖苷类的方法，其包括在一种或更多种基因表达的条件下使权利要求35所述的重组宿主细胞在所述细胞培养物中生长，并且其中由所述重组宿主细胞产生所述一种或更多种甜菊醇糖苷类。
甜菊醇糖苷类的重组生产
[0001] 本申请是申请日为2012年8月8日、申请号为“201280038853.3”、发明名称为“甜菊醇糖苷类的重组生产”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2012/050021的中国国家阶段申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求以下申请的优先权：2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,084；2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,203；2011年8月8日提交的美国申请序列号61/521,051；2011年8月15日提交的美国申请序列号61/523,487；2011年12月7日提交的美国申请序列号61/567,929以及2012年2月27日提交的美国申请序列号61/603,639，其全部通过引用整体并入本文。
技术领域
[0004] 本公开内容涉及甜菊醇糖苷类(steviol glycosides)的重组生产。具体地，本公开内容涉及通过重组宿主例如重组微生物、植物或植物细胞来生产甜菊醇糖苷类例如莱鲍迪苷(rebaudioside)D。本公开内容还提供了包含甜菊醇糖苷类的组合物.本公开内容还涉及用于通过调节角鲨烯(squalene)途径的类萜前体之生物合成来生产类萜的工具和方法。
背景技术
[0005] 甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以从常青灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及共混或单独地作为佐餐甜味剂。
[0006] 甜菊植物的提取物含有莱鲍迪苷和其他带来甜味的甜菊醇糖苷类，但不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其他糖苷，例如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，例如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或应用选择可能会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜、半日花烷型二萜、单萜、癸酸、8,11,14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆留醇(stigmasterol)、β-谷留醇(β-sitosterol)、α-和β-香树素(α-and β-amyrin)、羽扇豆醇酯(lupeol)、β-香树醇乙酸酯(β-amryin acetate)、五环三萜、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、carophyllenes和衍生物、β-蒎烯(beta-pinene)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)以及赤霉素(gibberellin)。
发明内容
[0007] 本发明提供了重组宿主，例如微生物、植物或植物细胞，其包含一个或更多个生物合成基因，这些基因的表达导致产生甜菊醇糖苷类，例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷(dulcoside)A。特别地，EUGT11(本文所述的一种尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶)可单独使用或者与一种或更多种其他UDP糖基转移酶例如UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2和UGT91D2e组合使用以允许莱鲍迪苷D在重组宿主中产生和累积或者使用体外系统。如本文所述，EUGT11具有强1，2-19-O-葡萄糖糖基化活性，其为莱鲍迪苷D产生的一个重要步骤。
[0008] 通常来说，甜菊苷(stevioside)和莱鲍迪苷A是在商业上生产的甜菊提取物中的主要化合物。据报道，甜菊苷的味道比莱鲍迪苷A更苦并且甜味更小。根据种植植物的土壤和气候，甜菊提取物的组成可大不相同。据报道，根据植物来源、气候条件和提取工艺，商业制备物中莱鲍迪苷A的量为甜菊醇糖苷类总含量的20％至97％不等。在甜菊提取物中，其他甜菊醇糖苷类以多种量存在。例如，莱鲍迪苷B通常以小于1％至2％存在，而莱鲍迪苷C可以以高至7％-15％的水平存在。莱鲍迪苷D通常以2％或更低的水平存在，莱鲍迪苷F通常在组合物中以总甜菊醇糖苷类的3.5％或更低存在。次要甜菊醇糖苷类的量影响甜菊提取物的风味特征(flavor profile)。此外，认为莱鲍迪苷D和其他较高糖化甜菊醇糖苷类是与莱鲍迪苷A相比质量更高的甜味剂。因此，本文所述的重组宿主和方法特别可用于生产具有增加量的莱鲍迪苷D的甜菊醇糖苷类组合物，该甜菊醇糖苷类组合物例如用作无热量的甜味剂，其功能特性和感觉特性优于许多高效甜味剂。
[0009] 在一个方面中，本文描述了这样的重组宿主，其包含编码与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列具有至少80％同一性之多肽的重组基因。
[0010] 本文的特征还在于这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜叶悬钩子苷(rubusoside)之19-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因.本文的特征还在于这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜菊苷(stevioside)之19-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因。
[0011] 在另一个方面中，本文描述了这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至甜叶悬钩子苷之19-O-葡萄糖的C-2'处和转移至甜叶悬钩子苷之13-O-葡萄糖的C-2'处之能力的多肽的重组基因。
[0012] 本文还描述了这样的重组宿主，其包含编码具有将第二糖部分转移至莱鲍迪苷A之19-O-葡萄糖的C-2'处以产生莱鲍迪苷D之能力的多肽的重组基因，其中当反应在相应条件下进行时，该多肽的催化速率比具有SEQ ID NO：5中给出之氨基酸序列的91D2e多肽快至少20倍(例如，快25倍或30倍)。
[0013] 在本文所述的任意重组宿主中，所述多肽与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列可以具有至少85％的序列同一性(例如，90％、95％、98％或99％序列同一性)。所述多肽可以具有SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列。
[0014] 本文所述的任意宿主还可以包含编码与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有至少90％同一性之UGT85C多肽的重组基因。UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID NO：3的第9、10、
13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、
418、420、440、441、444以及471位残基处的一个或更多个氨基酸替换。
13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、
418、420、440、441、444以及471位残基处的一个或更多个氨基酸替换。
[0015] 本文所述的任意宿主还可以包含编码与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有至少90％同一性之UGT76G多肽的重组基因。UGT76G多肽可以具有位于SEQ ID NO：7的第29、74、
87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、
207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处的一个或更多个氨基酸替换。
87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、
207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处的一个或更多个氨基酸替换。
[0016] 本文所述的任意宿主还可以包含编码UGT74G1多肽的基因(例如，重组基因)。
[0017] 本文所述的任意宿主还可以包含编码功能性UGT91D2多肽的基因(例如，重组基因)。UGT91D2多肽与SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列可以具有至少80％的序列同一性。UGT91D2多肽可以具有位于SEQ ID No：5的第206、207或343位处的突变。UGT91D2多肽还可以具有位于SEQ ID NO：5的第211和286位处的突变(例如，L211M和V286A，称为UGT91D2e-b)。UGT91D2多肽可以具有SEQ ID NO：5、10、12、76、78或95中所示氨基酸序列.
[0018] 本文所述的任意宿主还可以包含以下中的一个或更多个：
[0019] (i)编码香叶基香叶基二磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase)的基因；
[0020] (ii)编码柯巴基二磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase)和贝壳杉烯合酶(kaurene synthase)双功能的基因、或者编码柯巴基二磷酸合酶的基因和编码贝壳杉烯合酶的基因；
[0022] (iv)编码甜菊醇合成酶(steviol synthetase)的基因。
[0023] (i)、(ii)、(iii)和(iv)基因中的每一个都可以是重组基因。
[0024] 本文所述的任意宿主还可以包含以下中的一个或更多个：
[0025] (v)编码截短的HMG-CoA的基因；
[0026] (vi)编码CPR的基因；
[0027] (vii)编码鼠李糖合成酶的基因；
[0028] (viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；以及
[0029] (ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)基因中的至少一个可以是重组基因。
[0030] 香叶基香叶基二磷酸合酶与SEQ ID NO：121-128中所示氨基酸序列之一可以具有大于90％的序列同一性.柯巴基二磷酸合酶与SEQ ID NO：129-131中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性。贝壳杉烯合酶与SEQ ID NO：132-135中所示氨基酸序列之一可以具有大于90％的序列同一性。贝壳杉烯氧化酶与SEQ ID NO：138-141中所示氨基酸序列之一可以具有大于90％的序列同一性。甜菊醇合成酶与SEQ ID NO：142-146中所示氨基酸序列之一可以具有大于90％的序列同一性.
[0031] 当任意重组宿主被培养在使每个基因都能得以表达的条件下时可以产生至少一种甜菊醇糖苷类。所述甜菊醇糖苷类可以选自：甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A、甜菊苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷(steviol-1，2-bioside)、甜菊醇-1，3-二糖苷(steviol-1，3-bioside)、1，3-甜菊苷(1，3-stevioside)以及其他鼠李糖化或木糖化(xylosylated)中间体。当在所述条件下培养时，甜菊醇糖苷类(例如，莱鲍迪苷D)可以累积到至少1mg/升(例如至少10mg/升、20mg/升、100mg/升、200mg/升、300mg/升、400mg/升、500mg/升、600mg/升或700mg/升或更大)的培养基。
[0032] 本文还描述了生产甜菊醇糖苷类的方法。该方法包括：在基因能得以表达的条件下，将本文所述的任意宿主培养在培养基中；和回收由宿主产生的甜菊醇糖苷类。培养步骤可以包括诱导一个或更多个基因表达.甜菊醇糖苷类可以是13-O-1，2-二糖基化的和/或19-O-1，2-二糖基化的甜菊醇糖苷类(例如，甜菊苷、甜菊醇1，2二糖苷、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E)。例如，甜菊醇糖苷类可以是莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。甜菊醇糖苷类的另一些实例可以包括莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A.
[0033] 本文还描述了重组宿主。该宿主包含：(i)编码UGT74G1的基因；(ii)编码UGT85C2的基因；(iii)编码UGT76G1的基因；(iv)编码具有将第二糖部分转移至莱鲍迪苷或甜菊苷之19-O-葡萄糖的C-2'处之能力的糖基化转移酶的基因；以及(v)任选的编码UGT91D2e的基因，其中所述基因中的至少一个是重组基因。在一些实施方案中，每个所述基因都是重组基因。当宿主在每个基因(例如，重组基因)都能得以表达的条件下培养时，可以产生至少一种甜菊醇糖苷类(例如，莱鲍迪苷D)。宿主还可以包含：(a)编码柯巴基二磷酸合酶和贝壳杉烯合酶双功能的基因、或者编码柯巴基二磷酸合酶的基因和编码贝壳杉烯合酶的基因；(b)编码贝壳杉烯氧化酶的基因；(c)编码甜菊醇合成酶的基因；(d)编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因。
[0034] 本文还描述了由本文所述的任意宿主产生的甜菊醇糖苷类组合物。相对于甜菊提取物，该组合物具有降低水平的来源于甜菊植物的杂质。
[0035] 在另一个方面中，本文描述了本文所述的任意宿主所产生的甜菊醇糖苷类组合物。相对于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷类组成，该组合物具有富含莱鲍迪苷D的甜菊醇糖苷类组成。
[0036] 在另一个方面中，本文描述了生产甜菊醇糖苷类组合物的方法。该方法包括：在每个基因都能得以表达的条件下，将本文所述的宿主培养在培养基中；和回收由宿主(例如，微生物)产生的甜菊醇糖苷类组合物。相对于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷类组成，该组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。相对于甜菊提取物，所述宿主(例如微生物)所产生的甜菊醇糖苷类组合物可以具有降低水平的来源于甜菊植物的杂质。
[0037] 本文还描述了用于将第二糖部分转移至甜菊醇糖苷类中的19-O-葡萄糖之C-2'处或13-O-葡萄糖之C-2'处的方法。该方法包括使甜菊醇糖苷类与本文所述的EUGT11多肽或本文所述的UGT91D2多肽(例如，UGT91D2e-b)与UDP-糖在适合第二糖部分转移到甜菊醇糖苷类上的反应条件下接触.甜菊醇糖苷类可以是甜叶悬钩子苷，其中第二糖部分是葡萄糖，并且在第二葡萄糖部分转移后产生甜菊苷。甜菊醇糖苷类可以是甜菊苷，其中第二糖部分是葡萄糖，并且在第二葡萄糖部分转移后产生莱鲍迪苷E。甜菊醇糖苷类可以是莱鲍迪苷A，并且在第二葡萄糖部分转移后产生莱鲍迪苷D。
[0038] 在如本文所公开的改进的下游甜菊醇糖苷类途径之另一个实施方案中，提供了用于蔗糖合酶之重组生产的材料和方法；和用于在宿主中增加UDP-葡萄糖之产生的材料和方法，特别是在体内增加UPD-葡萄糖的利用率，其目的是促进细胞中的糖基化反应；以及提供了用于降低细胞中之UDP浓度的方法。
[0039] 本文还提供了重组宿主，其包含一个或更多个编码蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的外源核酸，其中具有葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase)的一个或更多个外源核酸的表达导致宿主中升高水平的UDP-葡萄糖。任选地，所述一个或更多个外源核酸包含SUS1序列。任选地，所述SUS1序列来自小果咖啡(Coffea arabica)，或编码由小果咖啡SUS1序列编码的蔗糖合酶的功能同源物，但如本文所述可以等同地使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)或甜叶菊SUS。在本发明的重组宿主中，所述一个或更多个外源核酸可以包含编码具有SEQ ID NO：180中给出之序列的多肽的序列，或者与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且任选地，所述一种或更多种外源核酸包含SUC1序列。在一个实施方案中，SUC1序列来自拟南芥，或者SUC1序列编码由拟南芥SUC1序列编码的蔗糖转运蛋白的功能同源物。在重组宿主中，所述一个或更多个外源核酸可以包含编码具有SEQ ID NO：179中给出之序列的多肽的序列，或者与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。与缺乏所述一种或更多种外源核酸的相应宿主相比，所述重组宿主降解外源蔗糖的能力降低。
[0040] 所述重组宿主可以是微生物，例如酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。或者，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一个替选实施方案中，所述重组宿主是植物或植物细胞。
[0041] 本发明还提供了用于在细胞中提高UDP-葡萄糖水平和降低UDP水平的方法，该方法包括：在包含蔗糖的介质中，于细胞中表达重组蔗糖合酶序列和重组蔗糖转运蛋白序列，其中所述细胞是蔗糖降解缺陷的.
[0042] 本发明还提供了用于在细胞中促进糖基化反应的方法，其包括在包含蔗糖的介质中，于细胞中表达重组蔗糖合酶序列和重组蔗糖转运蛋白序列，其中该表达导致细胞中降低水平的UDP和细胞中升高水平的UDP-葡萄糖，使得细胞中的糖基化增加。
[0043] 在用于提高UDP-葡萄糖水平的方法或促进糖基化的方法中，所述细胞可以产生香草醛葡萄糖苷(vanillin glucoside)，导致细胞的香草醛葡萄糖苷产生增加，或者可产生甜菊糖苷，导致细胞的甜菊糖苷产生增加。任选地，SUS1序列是拟南芥、甜叶菊或小果咖啡SUS1序列(参见例如图17，SEQ ID NO.175-177)，或者是编码由拟南芥、甜叶菊或小果咖啡SUS1序列编码的蔗糖合酶之功能同源物的序列。重组蔗糖合酶序列任选地包含编码具有SEQ ID NO：180中给出之序列的多肽的核酸，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中任选地，重组蔗糖转运蛋白序列是SUC1序列，或者其中任选地，SUC1序列是拟南芥SUC1序列，或者是编码由拟南芥SUC1序列编码的蔗糖转运蛋白之功能同源物的序列，或者其中任选地，重组蔗糖转运蛋白序列包含编码具有SEQ ID NO：179中给出之序列的多肽的核酸，或者与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。在任一种方法中，所述宿主是微生物，例如酵母，任选地例如酿酒酵母。或者所述宿主可以是大肠杆菌.或者所述宿主可以是植物细胞。
[0044] 本文还提供了重组宿主，例如微生物，其包含一种或更多种生物合成基因，所述基因的表达导致类二萜的产生。这样的基因包括编码对映-柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase)(CDPS)(EC 5.5.1.13)的基因、编码对映-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase)的基因、编码对映-贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase)的基因；或编码甜菊醇合成酶的基因.所述基因中的至少之一是重组基因。所述宿主可以是植物细胞。
这些基因在甜菊植物中的表达可能导致所述植物中提高的甜菊醇糖苷类水平.在一些实施方案中，所述重组宿主还包含编码CDPS多肽(EC5.5.1.13)(缺少叶绿体转运肽
(chloroplast transit peptide)序列)之重组基因的多个拷贝。CDPS多肽与图14中所示截短的CDPS氨基酸序列可以具有至少90％、95％、99％或100％的同一性。所述宿主还可以包含编码KAH多肽之多个拷贝的重组基因，例如，与图12中所示KAH氨基酸序列具有至少90％、
95％、99％或100％同一性的KAH多肽。所述宿主还可以包含以下中的一个或更多个：(i)编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因；(ii)编码对映-贝壳杉烯氧化酶的基因；和(iii)编码对映-贝壳杉烯合酶的基因。所述宿主还可以包含以下中的一个或更多个：(iv)编码截短的HMG-CoA的基因；(v)编码CPR的基因；(vi)编码鼠李糖合成酶的基因；(vii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；和(viii)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。例如，可以存在两种或更多种外源CPR。这样的基因中的一个或更多个的表达可以是可诱导的。基因(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)或(viii)中的至少一个可以是重组基因。在一些情况下，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)基因中的每一个都是重组基因。香叶基香叶基二磷酸合酶与SEQ ID NO：127中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；贝壳杉烯氧化酶与SEQ ID NO：138中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；CPR与SEQ ID NO：168中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；CPR与SEQ ID NO：170中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；并且贝壳杉烯合酶与SEQ ID NO：156中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性。
这些基因在甜菊植物中的表达可能导致所述植物中提高的甜菊醇糖苷类水平.在一些实施方案中，所述重组宿主还包含编码CDPS多肽(EC5.5.1.13)(缺少叶绿体转运肽
(chloroplast transit peptide)序列)之重组基因的多个拷贝。CDPS多肽与图14中所示截短的CDPS氨基酸序列可以具有至少90％、95％、99％或100％的同一性。所述宿主还可以包含编码KAH多肽之多个拷贝的重组基因，例如，与图12中所示KAH氨基酸序列具有至少90％、
95％、99％或100％同一性的KAH多肽。所述宿主还可以包含以下中的一个或更多个：(i)编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因；(ii)编码对映-贝壳杉烯氧化酶的基因；和(iii)编码对映-贝壳杉烯合酶的基因。所述宿主还可以包含以下中的一个或更多个：(iv)编码截短的HMG-CoA的基因；(v)编码CPR的基因；(vi)编码鼠李糖合成酶的基因；(vii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；和(viii)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。例如，可以存在两种或更多种外源CPR。这样的基因中的一个或更多个的表达可以是可诱导的。基因(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)或(viii)中的至少一个可以是重组基因。在一些情况下，(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)和(viii)基因中的每一个都是重组基因。香叶基香叶基二磷酸合酶与SEQ ID NO：127中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；贝壳杉烯氧化酶与SEQ ID NO：138中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；CPR与SEQ ID NO：168中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；CPR与SEQ ID NO：170中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性；并且贝壳杉烯合酶与SEQ ID NO：156中所示氨基酸序列可以具有大于90％的序列同一性。
[0045] 在一个方面中，本文描述了编码具有SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列之多肽的分离的核酸，其中所述多肽含有SEQ ID NO：5的第211和286位处的替换。例如，所述多肽可以包含第211位处的甲硫氨酸和第286位处的丙氨酸.
[0046] 在一个方面中，本文描述了编码与图12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：164)具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％或99％同一性)之多肽的分离的核酸。所述多肽可以具有图12C中所示氨基酸序列。
[0047] 在另一个方面中，本文描述了包含调节区的核酸构建体，所述调节区与编码与图12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：164)具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％或99％同一性)之多肽的核酸有效连接。所述多肽可以具有图12C中所示氨基酸序列。
[0048] 本文还描述了重组宿主，其包含编码与图12C中所示氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、90％、95％或99％同一性)之KAH多肽的重组基因(例如，重组基因的多个拷贝)。所述多肽可以具有图12C中所示氨基酸序列。所述宿主可以是微生物例如酵母菌(例如，酿酒酵母)或大肠杆菌。所述宿主可以是植物或植物细胞(例如，甜菊(Stevia)、小立碗藓(Physcomitrella)或者烟草植物或植物细胞)。甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞.当重组宿主在每个基因都能得以表达的条件下培养时，可以产生甜菊醇。所述重组宿主还可包含编码UGT74G1多肽的基因；编码UGT85C2多肽的基因；编码UGT76G1多肽的基因；编码UGT91D2多肽的基因；和/或编码EUGT11多肽的基因。当这样的宿主在每个基因都能得以表达的条件下培养时，可以产生至少一种甜菊醇糖苷类。所述甜菊醇糖苷类可以是甜菊醇-13-葡萄糖苷、甜菊醇-19-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和/或杜尔可苷A。所述重组宿主还可包含以下中的一种或更多种：编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因；编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因；编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因；编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因；编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶(MCS)的基因；编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)的基因；以及编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)的基因。所述重组宿主还可以包含以下中的一个或更多个：编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因；编码截短的HMG-CoA还原酶的基因；编码甲羟戊酸激酶的基因；编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因；以及编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。在另一个方面中，本文描述了这样的重组宿主，其还包含编码对映-贝壳杉烯合酶(EC 4.2.3.19)的基因和/或编码赤霉素20-氧化酶(EC 1.14.11.12)的基因。当这样的宿主培养在每个基因都能得以表达的条件下时产生赤霉素GA3。
[0049] 本文还描述了分离的核酸，其编码与图13中所示甜叶菊CPR氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少85％、90％、95％或99％序列同一性)的CPR多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有图13中所示甜叶菊CPR氨基酸序列(SEQ ID NO：169和170)。
[0050] 在本文所述的任意宿主中，一个或更多个基因的表达可以是可诱导的。
[0051] 在本文所述的任意宿主中，可以缺失或破坏一个或更多个编码内源磷酸酶的基因以使内源磷酸酶的活性降低。例如，可以破坏或缺失酵母基因DPP1和/或LPP1以使法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)向法尼醇的降解减少，并且香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate，GGPP)向香叶基香叶醇(geranylgeraniol，GGOH)的降解减少。
[0052] 在另一个方面中，如本文所述，可以按照下文所定义来修饰ERG9，导致角鲨烯合酶(SQS)的产生减少和类萜前体的累积.所述前体可以分泌到培养基中或者可以不分泌到培养基中，并且可以进而用作能够将类萜前体代谢为期望的类萜的酶的底物。
[0053] 因此，在一个主要的方面中，本发明涉及包含核酸序列的细胞，所述核酸包含：
[0054] i)启动子序列，其有效连接至
[0055] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0056] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0058] 其中异源插入序列具有通式(I)：
[0059] -X1-X2-X3-X4-X5-，
[0060] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补并且形成发夹二级结构的至少4个连续核苷酸，并且
[0061] 其中X3是任选的，并且如果存在的话，包含参与在X2与X4之间形成发夹环的不成对核苷酸，并且
[0062] 其中X1和X5独立地且任选地包含一个或更多个核苷酸，并且
[0063] 其中开放阅读框通过表达编码与角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)具有至少70％同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段与所述角鲨烯合酶具有至少70％序列同一性的片段在至少100个氨基酸重叠的范围内.
[0064] 本发明的细胞可用于提高工业上令人关注的类萜的产率。因此，在另一个方面中，本发明涉及用于在细胞培养物中生产通过鲨烯途径合成的类萜化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0065] (a)提供如上文所定义的细胞；
[0066] (b)培养(a)的细胞；
[0067] (c)回收类萜产物化合物。
[0068] 通过提供如上文所定义的包含经遗传修饰构建体的细胞，增加类萜前体的累积(参见，例如，图20)。
[0069] 因此，在另一个方面中，本发明涉及用于生产来源于选自以下的类萜前体的类萜的方法：法尼基焦磷酸(FPP)、异戊二烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和/或香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，所述方法包括：
[0070] (a)使所述前体与角鲨烯合酶途径的酶相接触，
[0071] (b)回收所述类萜产物。
[0072] 本发明可以通过至少部分地、空间上阻止核糖体与RNA的结合从而减少角鲨烯合酶的翻译来进行。因此，在一个方面中，本发明涉及用于降低功能性角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)之翻译速率的方法，所述方法包括：
[0073] (a)提供上文所定义的细胞，
[0074] (b)培养(a)的细胞。
[0075] 类似地，在另一个方面中，本发明涉及用于减少法尼基-pp周转(turnover)为角鲨烯的方法，所述方法包括：
[0076] (a)提供上文所定义的细胞，
[0077] (b)培养(a)的细胞。
[0078] 如图20所示，ERG9的敲减导致前体到角鲨烯合酶的累积。因此，在一个方面中，本发明涉及用于增加选自以下之化合物的累积的方法：法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸以及香叶基香叶基焦磷酸，所述方法包括以下步骤：
[0079] (a)提供上文所定义的细胞，和
[0080] (b)培养(a)的细胞。
[0081] 在一个实施方案中，本发明涉及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)以及可以由香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)制备的其他类萜的生产。
[0082] 在本发明的该实施方案中，上述角鲨烯合酶(SQS)生产的减少可以与香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)活性的升高组合，其将FPP转化为香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，导致GGPP产生增加。
[0083] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含核酸序列的微生物细胞，所述核酸包含：
[0084] i)启动子序列，其有效连接至
[0085] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0086] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0087] iv)转录终止信号；
[0088] 其中，异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0089] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接。
[0090] 此外，本文还涉及用于生产甜菊醇或甜菊醇糖苷类的方法，其中所述方法包括使用上述微生物细胞中的任意一种。
[0091] 本文所述的任意宿主可以是微生物(例如，酵母例如酿酒酵母或大肠杆菌)或植物或植物细胞(例如，甜菊例如甜叶菊、小立碗藓或者烟草植物或植物细胞)。
[0092] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然在下文中描述了合适的方法和材料，但与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于实施本发明。所有出版物、专利申请、专利和本文中提及的其他参考文献均通过引用整体并入本文。在存在矛盾的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅用于举例说明的目的而无意于限制。本发明的其他特征和优点将由以下详述而明显。申请人保留按照专利法的标准实践，使用过渡短语“包含”、“基本由...组成”或者“由...组成”替代地要求保护任意公开的发明的权利。附图说明
[0093] 图1是多种甜菊醇糖苷类的化学结构。
[0094] 图2A-D示出由甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷类的代表性途径。
[0095] 图3是用EUGT11和UGT91D2e进行的19-O-1，2-二糖基化反应的示意性图。数字是来自液相色谱-质谱(LC-MS)层析图的反应底物或产物的平均信号密度。
[0096] 图4包含LC-MS层析图，其示出使用体外转录和翻译的UGT91D2e(SEQ ID NO：5)(左图)或EUGT11(SEQ ID NO：152)(右图)由莱鲍迪苷A(RebA)生产莱鲍迪苷D(RebD)。LC-MS设置为检测某些对应于甜菊醇+5个葡萄糖(例如RebD)、甜菊醇+4个葡萄糖(例如RebA)等的质量。每个“泳道”根据最高峰来标度(scaled)。
[0097] 图5包含LC-MS层析图，其示出用UGT91D2e(左图)和EUGT11(右图)来将甜叶悬钩子苷转化成甜菊苷和化合物′2′和′3′(RebE).
[0098] 图6是EUGT11(SEQ ID NO：152，上面的行)的氨基酸序列与UGT91D2e(SEQ ID NO：5，下面的行)的氨基酸序列的比对。
[0099] 图7包含EUGT11(SEQ ID NO：152)的氨基酸序列、编码EUGT11的核苷酸序列(SEQ ID NO：153)以及密码子经过优化用于在酵母中表达的编码EUGT11的核苷酸序列(SEQ ID NO：154)。
[0100] 图8是UGT91D2e与UGT85H2和UGT71G1的二级结构预测的比对。通过在互联网站(world wide web)cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/，对三种UGT的氨基酸序列进行
NetSurfP ver.1.1-蛋白质表面可及性和二级结构预测(Protein Surface Accessibilitv and Secondary Structure Predictions)来进行二级结构预测。这预测蛋白质中α螺旋、β折叠和卷曲的存在和位置。后来将这些标记为UGT91D2e所示。例如，第一N-末端β折叠标记为Nβ1。y轴代表预测的确定性，确定性越高，则置信度越高，x轴代表氨基酸位置。尽管这些UGT之间的一级序列同一性非常低，但二级结构示出非常高的保守度。
NetSurfP ver.1.1-蛋白质表面可及性和二级结构预测(Protein Surface Accessibilitv and Secondary Structure Predictions)来进行二级结构预测。这预测蛋白质中α螺旋、β折叠和卷曲的存在和位置。后来将这些标记为UGT91D2e所示。例如，第一N-末端β折叠标记为Nβ1。y轴代表预测的确定性，确定性越高，则置信度越高，x轴代表氨基酸位置。尽管这些UGT之间的一级序列同一性非常低，但二级结构示出非常高的保守度。
[0101] 图9是UGT91D1和UGT91D2e(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列的比对。
[0102] 图10是UGT91D2e的双氨基酸替换突变体之活性的柱状图.实心柱代表甜菊苷产生，空心柱代表1，2-二糖苷产生。
[0103] 图11是用于甜菊醇糖苷类之生物合成的UDP-葡萄糖再产生的示意图。SUS＝蔗糖合酶；甜菊醇＝甜菊醇或甜菊醇糖苷类底物；UGT＝UDP糖基转移酶。
[0104] 图12A是编码甜叶菊KAH的核苷酸序列(SEQ ID NO：163)，在本文中命名为SrKAHe1。
[0105] 图12B是经过密码子优化用于在酵母中表达的编码甜叶菊KAHe1的核苷酸序列(SEQ ID NO：165)。
[0106] 图12C是甜叶菊KAHe1的氨基酸序列(SEQ ID NO：164)。
[0107] 图13A包含来自以下之CPR多肽的氨基酸序列：酿酒酵母(由NCP1基因编码)(SEQ ID NO：166)、拟南芥(由ATR1编码和由ATR2编码)(SEQ ID NO：148和168)以及甜叶菊(由CPR7编码和由CPR8编码)(SEQ ID NO：169和170)。
[0108] 图13B包含：密码子经过优化用于在酵母中表达的ATR1核苷酸序列(登录号CAA23011)(SEQ ID NO：171)；密码子经过优化用于在酵母中表达的ATR2核苷酸序列(SEQ ID NO：172)；甜叶菊CPR7核苷酸序列(SEQ ID NO：173)；以及甜叶菊CPR8核苷酸序列(SEQ ID NO：174)。
[0109] 图14A包含编码来自玉米(Zea mays)的CDPS多肽(SEQ ID NO：158)的核苷酸序列(SEQ ID NO：157)。可以缺失以粗体和下划线示出的序列以移除编码叶绿体转运肽序列的序列。
[0110] 图14B包含来自玉米的CDPS多肽(SEQ ID NO：158)的氨基酸序列。可以缺失以粗体和下划线示出的序列以移除叶绿体转运肽序列。
[0111] 图15A包含密码子经过优化的编码来自藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)的双功能CDPS-KS多肽(SEQ ID NO：162)的核苷酸序列(SEQ ID NO：161)。图15B包含来自藤仓赤霉的双功能CDPS-KS多肽(SEQ ID NO：162)的氨基酸序列。
[0112] 图16是两种酿酒酵母菌株(增强的EFSC1972(命名为T2)和拟南芥贝壳杉烯合酶(KS-5)进一步过表达的增强的EFSC1972(命名为T7，正方形)的生长图。Y轴上的数字是细胞培养物的OD600值，而x轴上的数字代表在30℃下，在合成的完全培养基(synthetic
complete based medium)中培养的小时数。
complete based medium)中培养的小时数。
[0113] 图17包含编码拟南芥、甜叶菊(来自重叠群10573选择_ORF S11E，具有以粗体、小写字母示出的S11至谷氨酸(E)之改变的突变)和咖啡(小果咖啡)蔗糖合酶的核酸序列，分别为SEQ ID NO：175、176和177。
[0114] 图18是通透化酿酒酵母中rebD产生的柱状图，所述酿酒酵母已转化有EUGT11或空质粒(“空”)。将细胞培养至对数生长期，在PBS缓冲液中洗涤，然后在30℃下，用Trition X-100(0.3％或0.5％在PBS中)处理30分钟。在通透化之后，在PBS中洗涤细胞，并在包含100μM RebA和300μM UDP-葡萄糖的反应混合物中重悬。在30℃下，反应进行20小时。
[0115] 图19A是拟南芥UDP-糖基转移酶UGT72E2的氨基酸序列(SEQ ID NO：178)。
[0116] 图19B是来自拟南芥的蔗糖转运蛋白SUC1的氨基酸序列(SEQ ID NO：179)。
[0117] 图19C是来自咖啡的蔗糖合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：180)。
[0118] 图20是酵母中的类异戊二烯途径的示意图，其示出ERG9的位置。
[0119] 图21包含酿酒酵母Cyc1启动子(SEQ ID NO：185)和酿酒酵母Kex2启动子(SEQ ID NO：186)的核苷酸序列。
[0120] 图22是包含两个区HR1和HR2的PCR产物的示意图，HR1和HR2分别与ERG9开放阅读框(ORF)之5’端或ER9启动子中的基因组序列的一部分同源。此外，PCR产物上有抗生素标记NatR，其可以嵌入两个Lox位点(L)之间用于后续用Cre重组酶切除。PCR产物还可以包含启动子，例如野生型ScKex2、野生型ScCyc1，并且该启动子还可以包含其3’端的异源插入序列例如发夹(SEQ ID NO：181-184)(参见图23)。
[0121] 图23是启动子和在翻译起始位点(箭头)的紧上游处具有发夹茎环的ORF的示意图，以及野生型酿酒酵母Cyc1启动子序列之一部分和ERG9OPR的初始ATG的比对，所述比对为不含异源插入序列(SEQ ID NO：187)和含有四个不同的异源插入序列(SEQ ID NO.188-
191)的比对。75％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：184的构建体(SEQ ID NO：191)；
50％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：183的构建体(SEQ ID NO：190)；20％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：182的构建体(SEQ ID NO：189)；5％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：181的构建体(SEQ ID NO：188)。
191)的比对。75％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：184的构建体(SEQ ID NO：191)；
50％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：183的构建体(SEQ ID NO：190)；20％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：182的构建体(SEQ ID NO：189)；5％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：181的构建体(SEQ ID NO：188)。
[0122] 图24是示出用在宿主基因组的ERG9基因之前插入的不同启动子构建体在酵母菌株中产生的紫穗槐二烯的柱状图。CTRL-ADS是指没有修饰的对照菌株；ERG9-CYC1-100％是指包含ScCyc1启动子且没有插入序列的构建体；ERG9-CYC1-50％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：183的构建体(SEQ ID NO：190)；ERG9-CYC1-20％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：182的构建体(SEQ ID NO：189)。ERG9-CYC1-5％是指包含ScCyc1启动子接着SEQ ID NO：181的构建体(SEQ ID NO：188)。ERG9-KEX2-100％是指包含ScKex2启动子的构建体。
[0123] 图25包含来自以下的角鲨烯合酶多肽的氨基酸序列：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、Cyberlindnera jadinii、白色念珠菌(Candida albicans)、酿酒酵母、智人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)以及褐家鼠(Rattus norvegicus)(SEQ ID NO：192-202)；和来自构巢曲霉(Aspergilus nidulans)和酿酒酵母的香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)的氨基酸序列(SEQ ID NO 203和167)。
[0124] 图26是在72小时后ERG9-CYC1-5％菌株和ERG9-KEX2菌株中香叶基香叶醇(GGOH)累积的柱状图。
[0125] 图27是示出对于通过UGT91D2e和EUGT11来生产RebF的甜叶悬钩子苷转化为木糖化中间体的代表性层析图。
[0126] 在不同的附图中，相同的附图标记表示相同的元件。
具体实施方式
[0127] 本文基于这样的发现，即可以开发重组宿主例如植物细胞、植物或微生物来表达可用于生物合成甜菊醇糖苷类的多肽，所述甜菊醇糖苷类例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。本文所述的重组宿主特别地可用于生产莱鲍迪苷D。这样的宿主可以表达一种或更多种适合产生甜菊醇糖苷类的尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基转移酶。这些生物合成多肽在多种微生物类别(classis)中的表达使得可以由能量和碳源(例如糖、甘油、CO2、H2和阳光)以持续、可重复的方式产生甜菊醇糖苷类。重组宿主产生的每种甜菊醇糖苷类的比例可以通过将预先选定的生物合成酶引入宿主并以合适的水平表达这些酶来调整，从而产生具有一致口味特征谱的甜味剂组合物。此外，重组宿主产生的甜菊醇糖苷类的浓度预期比甜菊植物中产生的甜菊醇糖苷类水平更高，这样可以提高下游纯化的效率。相对甜菊提取物中存在的杂质的量，这样的甜味剂组合物含有极少甚至没有植物基杂质。
[0128] 所述基因中至少有一个是重组基因，具体的重组基因取决于所选用于使用的物种或菌株.为了提高甜菊醇糖苷类的产量，提高能量和碳源转化为甜菊醇及其糖苷的效率，和/或提高细胞培养物或植物的产率，可以包含进其他基因或生物合成模块。这样的其他生物合成模块包括参与合成类萜前体、异戊二烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸的基因。其他生物合成模块包括萜合酶和萜环化酶基因，例如编码香叶基香叶基二磷酸合酶和柯巴基二磷酸合酶的基因；这些基因可以是内源基因或重组基因。
[0129] I.甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成多肽
[0130] A.甜菊醇生物合成多肽
[0131] 甜菊提取物中发现的几种化合物包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷类的化学结构示于图1中。下表A中示出了它们的CAS编号。另参见Harriet Wallin，Food Agric.Org.(2007)准备的Steviol Glycosides Chemicaland Technical Assessment第69届JECFA。
[0132] 表A
[0133]化合物 CAS编号
甜菊醇 471-80-7
莱鲍迪苷A 58543-16-1
甜菊醇二糖苷 41093-60-1
甜菊苷 57817-89-7
莱鲍迪苷B 58543-17-2
莱鲍迪苷C 63550-99-2
莱鲍迪苷D 63279-13-0
莱鲍迪苷E 63279-14-1
莱鲍迪苷F 438045-89-7
甜叶悬钩子苷 63849-39-4
杜尔可苷A 64432-06-0
甜菊醇 471-80-7
莱鲍迪苷A 58543-16-1
甜菊醇二糖苷 41093-60-1
甜菊苷 57817-89-7
莱鲍迪苷B 58543-17-2
莱鲍迪苷C 63550-99-2
莱鲍迪苷D 63279-13-0
莱鲍迪苷E 63279-14-1
莱鲍迪苷F 438045-89-7
甜叶悬钩子苷 63849-39-4
杜尔可苷A 64432-06-0
[0134] 已发现，宿主例如微生物中某些基因的表达可以赋予所述宿主合成甜菊醇糖苷类的能力。如在下文中更详细地讨论的，宿主中可能天然存在一个或更多个这样的基因。但是通常来说，一个或更多个这样的基因是被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主中的重组基因。
[0135] 产生甜菊醇的生化途径涉及香叶基香叶基二磷酸的形成、环化形成(-)柯巴基二磷酸，接着氧化和羟化形成甜菊醇。因此，在重组微生物中香叶基香叶基二磷酸转化为甜菊醇涉及编码贝壳杉烯合酶(KS)的基因、编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的基因以及编码甜菊醇合成酶(KAH)的基因的表达.甜菊醇合成酶也被称为异贝壳杉烯酸13-羟化酶。
[0136] 合适的KS多肽是已知的。例如，合适的KS酶包括由甜叶菊、玉米、杨树(Populus trichocarpa)和拟南芥所产生的那些。参见表1和SEQ ID NO：132-135和156.SEQ ID NO：40-47和155中给出了编码这些多肽的核苷酸序列.SEQ ID NO：40-43中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达，而SEQ ID NO：44-47中所示核苷酸序列来自从其中鉴定出KS多肽的生物来源。
[0137] 表1.KS克隆
[0138]
[0139] 合适的KO多肽是已知的。例如，合适的KO酶包括甜叶菊、拟南芥、藤仓赤霉和变色栓菌(Trametes versicolor)所产生的那些。参见表2和SEQ ID NO：138-141。SEQ ID NO：52-59中给出了编码这些多肽的核苷酸序列.SEQ ID NO：52-55中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达。SEQ ID NO：56-59中所示核苷酸序列来自从其中鉴定出KO多肽的生物来源.
[0140] 表2.KO克隆
[0141]
[0142]
[0143] 合适的KAH多肽是已知的。例如，合适的KAH酶包括甜叶菊、拟南芥、欧亚种葡萄(Vitis vinifera)和蔡藜苜猜(Medicago trunculata)所产生的那些.参见例如，表3、SEQ ID NO：142-146；美国专利公开No.2008-0271205；美国专利公开NO.2008-0064063和Genbank登录号gi189098312.来自拟南芥的甜菊醇合成酶被分类为CYP714A2。SEQ ID NO：
60-69中给出了编码这些KAH酶的核苷酸序列.SEQ ID NO：60-64中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达，而SEQ ID NO：65-69中所示核苷酸序列来自从其中鉴定出多肽的生物来源。
60-69中给出了编码这些KAH酶的核苷酸序列.SEQ ID NO：60-64中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达，而SEQ ID NO：65-69中所示核苷酸序列来自从其中鉴定出多肽的生物来源。
[0144] 表3.KAH克隆
[0145]
[0146] *＝序列示于美国专利公开No.2008-0064063中.
[0147] 此外，在本文中鉴定的来自甜叶菊的KAH多肽特别地可用于重组宿主。图12A中给出了编码甜叶菊KAH(SrKAHe1)(SEQ ID NO：164)的核苷酸序列(SEQ ID NO：163)。图12B中给出了编码密码子经过优化用于在酵母中表达的甜叶菊KAH的核苷酸序列(SEQ ID NO：165)。图12C中给出了甜叶菊KAH的氨基酸序列。当在酿酒酵母中表达时，与Yamaguchi等(美国专利公开No.2008/0271205A1)所述的拟南芥-异贝壳杉烯酸羟化酶相比，甜叶菊KAH示出显著较高的甜菊醇合酶活性。图12C中所示甜叶菊KAH多肽与美国专利公开No.2008/
0271205的KAH具有小于20％的同一性，并且与美国专利公开No.2008/0064063的KAH具有小于35％的同一性。
0271205的KAH具有小于20％的同一性，并且与美国专利公开No.2008/0064063的KAH具有小于35％的同一性。
[0148] 在一些实施方案中，重组微生物含有编码KO和/或KAH多肽的重组基因。这样的微生物通常还含有编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的重组基因，因为某些KO和/或KAH多肽的组合需要外源CPR多肽的表达.特别地，通过包含进编码外源CPR多肽的重组基因可以显著地提高植物来源的KO和/或KAH多肽的活性。合适的CPR多肽是已知的。例如，合适的CPR酶包括甜叶菊和拟南芥所产生的那些。参见例如，表4和SEQ ID NO：147和148。SEQ ID NO：70、71、73和74中给出了编码这些多肽的核苷酸序列.SEQ ID NO：70-72中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达.SEQ ID NO：73-75中给出了来自从其中鉴定出多肽的生物来源的核苷酸序列。
[0149] 表4.CPR克隆
[0150]
[0151] 例如，由SrKAHe1编码的甜菊醇合酶由基因NCP1(YHR042W)编码的酿酒酵母CPR来活化。当共表达由基因ATR2编码的拟南芥CPR或由基因CPR8编码的甜叶菊CPR时，观察到了由SrKAHe1编码的甜菊醇合酶的甚至更佳的活化。图13A包含酿酒酵母、拟南芥(来自ATR1基因和ATR2基因)和甜叶菊CPR多肽(来自CPR7基因和CPR8基因)的氨基酸序列(SEQ ID NO：166-170)。图13B包含编码拟南芥和甜叶菊CPR多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：171-174)。
[0152] 例如，可以破坏或缺失酵母基因DPP1和/或酵母基因LPP1以使法尼基焦磷酸(FPP)向法尼醇的降解减少，并且香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)向香叶基香叶醇(GGOH)的降解减少。或者，可以改变编码磷酸酶之内源基因的启动子或增强子元件，以使得改变其编码蛋白的表达。可以采用同源重组来破坏内源基因。例如，可以以这样的方式构建“基因取代”载体以包括可选择标记基因。可选择标记基因可以在其5’端和3’端二者处有效连接具有足以介导同源重组之长度的基因部分。可选择标记可以是任意数目的补充宿主细胞营养缺陷体、提供抗生素抗性或导致颜色改变的基因之一。于是，使用本领域中公知的方法将基因替代载体的线性DNA片段引入细胞中(参见下文)。线性片段整合入基因组中和基因的破坏可以基于选择标记来确定，并且可以通过例如Southern印迹分析来验证。在选择标记在选择中使用之后，可以通过例如Cre-loxP系统(参见，例如Gossen等(2002)Ann.Rev.Genetics 36：153-173和美国申请公开No.20060014264)来从宿主细胞的基因组中移除可选择标记。或者，可以以这样的方式构建基因替代载体，即：包含待破坏基因的一部分或基因编码序列的无活性片段，其中所述部分不含任何内源基因启动子序列并且不进行编码。“无活性片段(inactive fragment）”是编码蛋白质之基因的片段，所述蛋白的活性是由基因之全长编码序列所产生的蛋白质之活性的例如小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或0％)。这样的基因部分以下述方式插入载体中，即：没有已知启动子序列与基因序列有效连接，但终止密码子和转录终止序列与基因序列部分有效连接.随后，可以将该载体在基因序列部分中线性化并转化入细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合入基因的内源对映体
(counterpart)中。
(counterpart)中。
[0153] 这些基因在重组微生物中的表达导致香叶基香叶基二磷酸转化为甜菊醇。
[0154] B.甜菊醇糖苷类生物合成多肽
[0155] 本文所述的重组宿主可以将甜菊醇转化为甜菊醇糖苷类。这样的宿主(例如微生物)含有编码一个或更多个UDP糖基转移酶(也称为UGT)的基因。UGT将活化的核苷酸糖上的单糖单元转移到受体部分，在这种情况下，即甜菊醇或甜菊醇衍生物上的-OH或-COOH部分。基于序列同源性，UGT被划分为家族和亚家族(Li等.J.Biol.Chem.276：4338-4343(2001))。
[0156] B.1 甜叶悬钩子苷生物合成多肽
[0157] 甜叶悬钩子苷的生物合成涉及甜菊醇13-OH和19-COOH的糖基化。参见图2A。重组宿主(例如微生物)中甜菊醇转化为甜叶悬钩子苷可以通过编码UGTs85C2和74G1之基因的表达来实现，其分别向13-OH或者19-COOH转移葡萄糖单元。
[0158] 合适的UGT85C2作为尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-OH转移酶和尿苷-5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇-19-O-葡萄糖苷13-OH转移酶起作用。功能性UGT85C2多肽还可以催化葡萄糖基转移酶反应，该反应使用甜菊醇和甜菊醇-19-O-糖苷以外的甜菊醇糖苷类底物。
[0159] 合适的UGT74G1多肽作为尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷-5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷19-COOH转移酶起作用。功能性UGT74G1多肽还可以催化糖基转移酶反应，该反应使用甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡萄糖苷以外的甜菊醇糖苷类底物，或者转移来自尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体的糖部分。
[0160] 当将甜菊醇用作培养基中的原料时，表达功能性UGT74G1和功能性UGT85C2的重组微生物可以产生甜叶悬钩子苷和两种甜菊醇单糖苷(即，甜菊醇13-O-单葡萄糖苷和甜菊醇19-O-单葡萄糖苷)。宿主中可能天然存在一个或更多个这样的基因。但通常来说，这样的基因是被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主(例如微生物)中的重组基因。
[0161] 本文使用的术语“重组宿主”意在指这样的宿主，其基因组增加了至少一个整合的DNA序列。这样的DNA序列包括但不限于天然情况下不存在的基因、通常不会被转录为RNA或翻译为蛋白质(“表达”)的DNA序列，以及希望引入非重组宿主中的其他基因或DNA序列。应理解，通常来说，本文所述重组宿主的基因组通过稳定引入一个或更多个重组基因来增大。一般来说，引入的DNA本来不存在于DNA受体宿主中，但本发明的范围包括从给定宿主中分离DNA区段，并随后将该DNA的一个或更多个额外拷贝引入同一宿主中，例如以提高基因产物的产量或者改变基因的表达模式。在一些情况下，所引入的DNA会通过例如同源重组或定点诱变来修饰或者甚至取代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物、植物细胞和植物。
[0162] 术语“重组基因”是指被引入受体宿主的基因或DNA序列，无论这样的宿主中是否可能已经存在相同或类似的基因或DNA序列.上下文中的“引入”或“增加”在本领域中已知意为人为引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一个物种的DNA序列；或者可以是来源于相同物种或存在于相同物种中但已通过重组方法整合入宿主中从而形成重组宿主的DNA序列。应理解，被引入宿主的重组基因可以与转化宿主中正常存在的DNA序列相同，并且引入它是为了提供该DNA的一个或更多个额外拷贝，从而使得能够过表达或者修饰该DNA之基因产物的表达。
[0163] 合适的UGT74G1和UGT85C2多肽包括甜叶菊产生的那些。Richman等，Plant J.41：56-67(2005)中报道了来自甜菊的编码功能性UGT74G1和UGT85C2多肽的基因。SEQ ID NO：1和3中分别给出了甜叶菊UGT74G1和UGT85C2多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO：2和4中分别给出了经过优化用于在酵母中表达的编码UGT74G1和UGT85C2的核苷酸序列。SEQ ID NO：82、
84、83和85中分别给出了UGT 85C2、91D2e、74G1和76G1的DNA2.0密码子经过优化的序列。另参见在下文的“功能性同源物”部分描述的UGT85C2和UGT74G1变体。例如，可以使用在第65、
71、270、289和389位处包含替换的UGT85C2多肽(例如，A65S、E71Q、T270M、Q289H和A389V).[0164] 在一些实施方案中，所述重组宿主是微生物。可以将重组微生物培养在含有甜菊醇的培养基中以产生甜叶悬钩子苷。但在另一些实施方案中，重组微生物表达一个或更多个参与甜菊醇生物合成的重组基因，例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。合适的CDPS多肽是已知的.例如，合适的CDPS酶包括甜叶菊、正棒状链霉菌(Streptomyces
clavuligerus)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、玉米和拟南芥所产生的那些。参见，例如表5和SEQ ID NO：129-131、158和160。SEQ ID NO：34-39、157和159中给出了编码这些多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO：34-36中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达。SEQ ID NO：37-39中给出了来自其中鉴定出多肽的生物来源的核苷酸序列。
84、83和85中分别给出了UGT 85C2、91D2e、74G1和76G1的DNA2.0密码子经过优化的序列。另参见在下文的“功能性同源物”部分描述的UGT85C2和UGT74G1变体。例如，可以使用在第65、
71、270、289和389位处包含替换的UGT85C2多肽(例如，A65S、E71Q、T270M、Q289H和A389V).[0164] 在一些实施方案中，所述重组宿主是微生物。可以将重组微生物培养在含有甜菊醇的培养基中以产生甜叶悬钩子苷。但在另一些实施方案中，重组微生物表达一个或更多个参与甜菊醇生物合成的重组基因，例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。合适的CDPS多肽是已知的.例如，合适的CDPS酶包括甜叶菊、正棒状链霉菌(Streptomyces
clavuligerus)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、玉米和拟南芥所产生的那些。参见，例如表5和SEQ ID NO：129-131、158和160。SEQ ID NO：34-39、157和159中给出了编码这些多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO：34-36中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达。SEQ ID NO：37-39中给出了来自其中鉴定出多肽的生物来源的核苷酸序列。
[0165] 在一些实施方案中，可以使用在未经修饰多肽的氨基末端处缺少叶绿体转运肽的CDPS多肽。例如，可以移除图14所示之玉米CDPS编码序列(SEQ ID NO：157)之5’端的前150个核苷酸.这样做移除图14所示之氨基酸序列(SEQ ID NO：158)的氨基末端的50个残基，所述残基编码叶绿体转运肽。截短的CDPS基因可以适合新的ATG翻译起始位点并且与启动子有效连接，所述启动子通常为组成型启动子或高表达启动子。当将截短的编码序列的多个拷贝引入微生物中时，CDPS多肽由启动子表达导致朝向对映-贝壳杉烯生物合成增加的碳流.
[0166] 表5.CDPS克隆
[0167]
[0168] 还可以使用CDPS-KS双功能蛋白质(SEQ ID NO：136和137).表6中示出的编码CDPS-KS双功能酶的核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达(参见，SEQ ID NO：48和49)。SEQ ID NO：50和51中给出了来自其中本来鉴定出多肽的来源生物的核苷酸序列。还可以使用来自藤仓赤霉(SEQ ID NO：162)的双功能酶。编码藤仓赤霉双功能CDPS-KS酶的核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达(参见图15A，SEQ ID NO：161)。
[0169] 表6.CDPS-KS克隆
[0170]
[0171] 因此，除了UGT74G1和UGT85C2基因外还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物不需要使用甜菊醇作为原料就能够产生甜菊醇单糖苷和甜叶悬钩子苷二者.
[0172] 在一些实施方案中，重组微生物还表达编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)的重组基因。合适的GGPPS多肽是已知的。例如，合适的GGPPS酶包括甜叶菊、藤仓赤霉、小家鼠、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、正棒状链霉菌、嗜酸热硫化叶菌(Sulfulobus acidocaldarius)、聚球藻(Synechococcus sp.)以及拟南芥所产生的那些。
参见表7和SEQ ID NO：121-128。SEQ ID NO：18-33中给出了编码这些多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18-25中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达，而SEQ ID NO：26-33中给出了来自其中鉴定出多肽的来源微生物的核苷酸序列。
参见表7和SEQ ID NO：121-128。SEQ ID NO：18-33中给出了编码这些多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18-25中所示核苷酸序列被修饰用于在酵母中表达，而SEQ ID NO：26-33中给出了来自其中鉴定出多肽的来源微生物的核苷酸序列。
[0173] 表7.GGPPS克隆
[0174]
[0175]
[0176] 在一些实施方案中，重组微生物还可表达参与二萜生物合成或类萜前体产生的重组基因，例如下文中讨论的甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径中的基因或者甲羟戊酸(MEV)途径中的基因，所述重组基因具有降低的磷酸酶活性和/或表达如本文所讨论的蔗糖合酶(SUS)。
[0177] B.2莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷E生物合成多肽
[0178] 莱鲍迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体地，莱鲍迪苷A的形成可以通过甜菊醇的13-OH的葡糖基化形成13-O-甜菊醇单糖苷、甜菊醇单糖苷之13-O-葡萄糖的C-2'的葡糖基化形成甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷之C-19羧基的葡糖基化形成甜菊苷、以及甜菊苷之C-13-O-葡萄糖的C-3'的葡糖基化。各个葡糖基化反应发生的顺序可以改变。参见图2A。
[0179] 莱鲍迪苷E和/或莱鲍迪苷D的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体地，莱鲍迪苷E的形成可以通过甜菊醇的13-OH的葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化形成甜菊醇-1，2-二糖苷、1，2-二糖苷之C-19羧基的葡糖基化形成1，2-甜菊苷、以及1，2-甜菊苷之19-O-葡萄糖的C-2'的葡糖基化形成莱鲍迪苷E.莱鲍迪苷D的形成可以通过莱鲍迪苷E的C-13-O-葡萄糖之C-3'的葡糖基化。各个糖基化反应发生的顺序可以改变。例如19-O-葡萄糖的C-2'的葡糖基化可以是该途径的最后一个步骤，其中莱鲍迪苷A是该途径的中间体。参见图2C。
[0180] 已经发现，重组宿主中甜菊醇转化为莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E可以通过表达以下功能性UGT来实现：EUGT11、74G1、85C2和76G1，以及任选的91D2。因此，当使用甜菊醇作为原料时，表达这四种或五种UGT之组合的重组微生物可以产生莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D。通常来说，这些基因中的一个或更多个是被转化到天然情况下不具备这些基因的微生物中的重组基因。还发现在本文命名为SM12UGT的UGT可以替换成UGT91D2。
[0181] 在一些实施方案中，宿主中表达少于5种(例如，1种、2种、3种或4种)UTG。例如，当使用莱鲍迪苷A作为原料时，表达功能性EUGT11的重组微生物可以产生莱鲍迪苷D。当使用甜叶悬钩子苷或1，2-甜菊苷作为原料时，表达两种功能性UGT(EUGT11和76G1)和任选的功能性91D12的重组微生物可以产生莱鲍迪苷D。作为另一个替选，当在培养基中供给单糖苷、甜菊醇-13-O-糖苷时，表达三种功能性UGT(EUGT11、74G1、76G1)和任选的91D2的重组微生物可以产生莱鲍迪苷D。类似地，在供给甜菊醇-19-O-糖苷时，甜菊醇-19-O-糖苷在重组微生物中转化为莱鲍迪苷D可以通过编码UGT EUGT11、85C2、76G1和任选的91D2之基因的表达来实现。通常来说，这些基因中的一个或更多个是被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主中的重组基因。
[0182] 合适的UGT74G1和UGT85C2多肽包括在上文中讨论过的那些。合适的UGT76G1向受体分子(甜菊醇1，2糖苷)的C-13-O-葡萄糖的C-3’添加葡萄糖部分。因此，UGT76G1例如作为尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-O-1，2葡萄糖苷C-3’葡萄糖基转移酶和尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇-19-O-葡萄糖、13-O-1，2二糖苷C-3’葡糖基转移酶起作用。功能性UGT76G1多肽还可以催化糖基转移酶反应，所述反应利用含有葡萄糖以外的糖的甜菊醇糖苷类底物，例如甜菊醇鼠李糖苷和甜菊醇木糖苷。参见图2A、2B、2C和2D。合适的UGT76G1多肽包括甜叶菊产生的和Richman等，Plant J.41：56-67(2005)中报道的那些。SEQ ID NO：7中给出了甜叶菊UGT76G1多肽的氨基酸序列。编码SEQ ID NO：7的UGT76G1多肽的核苷酸序列经过优化用于在酵母菌中的表达，并且在SEQ ID NO：8中给出。另参见“功能同源物”部分中给出的UGT76G1变体.
[0183] 合适的EUGT11或UGT91D2多肽作为尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶(也称为甜菊醇-13-单葡萄糖苷1，2-糖基化酶)起作用，将葡萄糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2'处。
[0184] 合适的EUGT11或UGT91D2多肽还作为尿苷5’-二磷酸葡糖基：甜叶悬钩子苷转移酶起作用，将葡萄糖部分转移至受体分子甜叶悬钩子苷之13-O-葡萄糖的C-2’处，以产生甜菊苷。EUGT11多肽还可将葡萄糖部分转移至受体分子甜叶悬钩子苷之19-O-葡萄糖的C-2’处，以产生19-O-1，2-二糖基化甜叶悬钩子苷(图3中的化合物2)。
[0185] 功能性EUGT11或UGT91D2多肽还可以催化利用除甜菊醇-13-O-葡萄糖苷和甜叶悬钩子苷以外的甜菊醇糖苷类底物的反应。例如，功能性EUGT11多肽可以利用甜菊苷作为底物，将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'处从而产生莱鲍迪苷E(参见图3中的化合物3)。功能性EUGT11和UGT91D2多肽还可以利用莱鲍迪苷A作为底物，将葡萄糖部分转移至莱鲍迪苷A之19-O-葡萄糖残基的C-2'处从而产生莱鲍迪苷D。如在实施例中给出的，当反应在类似的条件(即，类似的时间、温度、纯度和底物浓度)下进行时，EUGT11可以以比UGT91D2e(SEQ ID NO：5)的相应速率快至少20倍的速率(例如，快至少25倍或至少30倍)将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。因此，当在类似的条件下孵育时，EUGT11产生与UGT91D2e相比更大量的RebD。
[0186] 此外，在使用甜叶悬钩子苷或甜菊苷作为底物时，功能性EUGT11表现出显著的C-2’19-O-二糖基化活性，而在使用这些底物时，UGT91D2e未检测到二糖基化活性。因此，可以通过甜菊醇糖苷类底物特异性的差异来区分功能性EUGT11与UGT91D2e。图3提供了用
EUGT11和UGT91D2e进行的19-O-1，2二糖基化反应的示意性概述(schematic overview)。
EUGT11和UGT91D2e进行的19-O-1，2二糖基化反应的示意性概述(schematic overview)。
[0187] 功能性EUGT11或UGT91D2多肽通常不将葡萄糖部分转移至甜菊醇化合物(在C-13位处具有1，3结合的葡萄糖)，即，不发生葡萄糖部分转移至甜菊醇1，3-二糖苷和1，3-甜菊苷。
[0188] 功能性EUGT11和UGT91D2多肽可以转移除尿苷二磷酸葡萄糖以外的来自供体的糖部分。例如，功能性EUGT11或UGT91D2多肽可以充当尿苷5'-二磷酸D-木糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶，将木糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2'处。作为另一实例，功能性EUGT11或UGT91D2多肽可以充当尿苷5’-二磷酸L-鼠李糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶，将鼠李糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2'处。
[0189] 本文中描述了合适的EUGT11多肽，并且可以包括来自稻(Oryza sativa)的EUGT11多肽(GenBank登录号：AC133334)。例如，EUGT11多肽可以具有与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列(参见图7)。SEQ ID NO：153中给出了编码SEQ ID NO：152之氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO：154是密码子经过优化用于在酵母中表达的编码SEQ ID NO：152之多肽的核苷酸序列。
[0190] 合适的功能性UGT91D2多肽包括在本文中公开的那些，例如命名为UGT91D2e和UGT91D2m的多肽。SEQ ID NO：5中给出了来自甜叶菊的示例性UGT91D2e多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是密码子经过优化用于在酵母中表达的编码SEQ ID NO：5之多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO：9中给出了编码SEQ ID NO：5之多肽的甜叶菊核苷酸序列。SEQ ID NO：10和
12中给出了来自甜叶菊的示例性UGT91D2m多肽的氨基酸序列，它们分别由SEQ ID NO：11和
13中所示核酸序列编码。还可以使用在SEQ ID NO：5的第206、207和343位氨基酸残基处包含替换的UGT91D2变体。例如，可以使用SEQ ID NO：95中所示并且具有相对于野生型
UGT92D2e(SEQ ID NO：5)具有以下突变的氨基酸序列：G206R、Y207C和W343R。还可以使用在第211和286位氨基酸残基处包含替换的UGT91D2变体。例如，UGT91D2变体可以包括SEQ ID NO：5(UGT91D2e-b)的第211位处的甲硫氨酸替换为亮氨酸和第286位处的丙氨酸替换为缬氨酸。
SEQ ID NO：6是密码子经过优化用于在酵母中表达的编码SEQ ID NO：5之多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO：9中给出了编码SEQ ID NO：5之多肽的甜叶菊核苷酸序列。SEQ ID NO：10和
12中给出了来自甜叶菊的示例性UGT91D2m多肽的氨基酸序列，它们分别由SEQ ID NO：11和
13中所示核酸序列编码。还可以使用在SEQ ID NO：5的第206、207和343位氨基酸残基处包含替换的UGT91D2变体。例如，可以使用SEQ ID NO：95中所示并且具有相对于野生型
UGT92D2e(SEQ ID NO：5)具有以下突变的氨基酸序列：G206R、Y207C和W343R。还可以使用在第211和286位氨基酸残基处包含替换的UGT91D2变体。例如，UGT91D2变体可以包括SEQ ID NO：5(UGT91D2e-b)的第211位处的甲硫氨酸替换为亮氨酸和第286位处的丙氨酸替换为缬氨酸。
[0191] 如上文所表明的，在本文中命名为SM12UGT的UGT可以替换为UGT91D2。合适的功能性SM12UGT多肽包括圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)(日本牵牛花)产生的和Morita等.Plant J.42，353-363(2005)中所述的那些。SEO ID NO：76中给出了编码圆叶牵牛IP3GGT多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO：77是经过密码子优化用于在酵母中表达的编码SEQ ID NO：76之多肽的核苷酸序列。另一种合适的SM12UGT多肽是含有R25S突变的Bp94BN1多肽。参见Osmani等.Plant Phys.148：1295-1308(2008)和Sawada等.J.Biol.Chem.280：899-906(2005)。SEO ID NO：78中给出了雏菊(Beilis perennis)(红色雏菊)UGT94B1多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO：79是经过密码子优化用于在酵母中表达的编码SEQ ID NO：78之多肽的核苷酸序列。
[0192] 在一些实施方案中，为了生产莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D，将重组微生物培养在含有甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-19-O-葡萄糖苷的培养基上。在这样的实施方案中，微生物含有并表达编码功能性EUGT11、功能性UGT74G1、功能性UGT85C2、功能性UGT76G1以及任选的功能性UGT91D2的基因，并且能够在使用甜菊醇、甜菊醇单糖苷或甜叶悬钩子苷中之一或二者作为原料时累积莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D。
[0193] 在另一些实施方案中，为了生产莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D，将重组微生物培养在含有甜叶悬钩子苷的培养基上。在这样的实施方案中，微生物含有并表达编码功能性EUGT11、功能性UGT76G1和任选的功能性UGT91D2的基因，并且能够在使用甜叶悬钩子苷作为原料时产生莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D。
[0194] 在另一些实施方案中，重组微生物表达一个或更多个参与甜菊醇生物合成的基因，例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因.因此，例如，除了EUGT11、UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1以及任选的功能性UGT91D2(例如，UGT91D2e)外，还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物不需要在培养基中包含甜菊醇即能够产生莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E。
[0195] 在一些实施方案中，为了提供提高水平的二萜前体香叶基香叶基二磷酸，所述重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因，以便提高经甜菊醇生物合成途径的流量。在一些实施方案中，所述重组宿主还含有构建体以沉默消耗香叶基香叶基二磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼基焦磷酸的非甜菊醇途径的表达，从而提供增加的经甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成途径的流量.例如，可以通过下调ERG9基因来减少向固醇产生途径(例如麦角固醇)的流量。参见下文中的ERG9部分和实施例24至25。在产生赤霉素的细胞中，可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在产生类胡萝卜素的生物中，通过下调一个或更多个类胡萝卜素生物合成基因可以提高到甜菊醇的流量。在一些实施方案中，重组微生物还可以表达参与二萜生物合成或者类萜前体产生的重组基因，例如在下文中讨论的MEP或MEV途径中的基因，所述重组微生物具有降低的磷酸酶活性，和/或表达SUS。
[0196] 本领域技术人员将理解，通过调节不同UGT基因的相对表达水平，可以使重组宿主适合特异地以期望比例产生甜菊醇糖苷类产物。甜菊醇生物合成基因和甜菊醇糖苷类生物合成基因的转录调控可以利用本领域技术人员已知的技术，结合转录的活化和抑制来实现。就体外反应而言，本领域技术人员可以认识到，加入不同水平的UGT酶组合或者在影响组合中不同UGTS相对活性的条件下，会使合成反应朝向每种甜菊醇糖苷类按照期望比例的方向进行。本领域技术人员将理解，可以使用与13-O-葡萄糖苷反应(底物莱鲍迪苷A和甜菊苷)相比对19-O-葡萄糖苷反应具有较高活性的二糖基化酶获得较高比例的莱鲍迪苷D或E或者更高效地转化为莱鲍迪苷D或E。
[0197] 在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生富含莱鲍迪苷D的甜菊醇糖苷类组合物，其含有占甜菊醇糖苷类总重量的大于至少3％的莱鲍迪苷D，例如至少4％的莱鲍迪苷D、至少5％的莱鲍迪苷D、10％至20％的莱鲍迪苷D、20％至30％的莱鲍迪苷D、30％至40％的莱鲍迪苷D、40至50％的莱鲍迪苷D、50％至60％的莱鲍迪苷D、60％至70％的莱鲍迪苷D、70％至80％莱鲍迪苷D。在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生的甜菊醇糖苷类组合物含有至少90％的莱鲍迪苷D，例如90％至99％的莱鲍迪苷D。其他存在的甜菊醇糖苷类可能包括图2C中示出的那些，例如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷E和甜菊苷。在一些实施方案中，可以进一步纯化宿主(例如微生物)产生的富含莱鲍迪苷D的组合物，然后可以将这样纯化的莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E其他甜菊醇糖苷类、矫味剂或甜味剂混合从而得到期望的矫味体系或甜味组合物。例如，可以将重组宿主产生的富含莱鲍迪苷D的组合物与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、C或F的组合物、与从甜菊提取物纯化的莱鲍迪苷A、F或C、或者与在体外产生的莱鲍迪苷A、F或C组合。
[0198] 在一些实施方案中，可以在提供合适的UDP糖和/或无细胞系统用于UDP糖再生的同时使用体外方法来生产莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷B、甜菊醇单葡萄糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱鲍迪苷E。参见，例如，Jewett MC等.Molecular Systems Biology，第4卷，article 220(2008)；Masada S等.FEBS Letters，第581卷，2562-
2566(2007)。在一些实施方案中，可以在反应容器中提供蔗糖和蔗糖合酶以由糖基化反应期间产生的UDP再生UDP-葡萄糖。参见图11。蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将编码来自拟南芥、甜叶菊或小果咖啡之序列的蔗糖合酶在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主例如微生物或植物中表达。
2566(2007)。在一些实施方案中，可以在反应容器中提供蔗糖和蔗糖合酶以由糖基化反应期间产生的UDP再生UDP-葡萄糖。参见图11。蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将编码来自拟南芥、甜叶菊或小果咖啡之序列的蔗糖合酶在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主例如微生物或植物中表达。
[0199] 需要多个反应的转化可以一起进行，或者逐步进行。例如，莱鲍迪苷D可以由作为富集提取物市售的莱鲍迪苷A生产或者通过生物合成生产，其中添加化学计算量的或过量的UDP-葡萄糖和EUGT11。作为替选，可以使用EUGT11和合适的UGT76G1酶由富含甜菊苷和莱鲍迪苷A的甜菊醇糖苷类提取物生产莱鲍迪苷D。在一些实施方案中，使用磷酸酶来除去次级产物并提高反应产量。UGT和其他用于体外反应的酶可以以可溶性形式或固定化形式提供。
[0200] 在一些实施方案中，可以使用供给包含前体分子例如甜菊醇和/或甜菊醇糖苷类之原料(包括来自植物提取物的甜菊醇糖苷类的混合物)的全细胞来生产莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。所述原料可以在细胞生长期间或细胞生长之后供给。所述全细胞可以是悬浮的或固定化的。所述全细胞可以截留在珠中，例如藻酸钙珠或藻酸钠珠。所述全细胞可以与中空纤维管反应器系统相连。所述全细胞可以浓缩并截留在膜反应器系统中。所述全细胞可以在发酵液中或者在反应缓冲液中。在一些实施方案中，使用通透剂(permeabilizing)来使底物高效转移入细胞中。在一些实施方案中，使用溶剂例如甲苯或去污剂例如Triton-X或Tween来使细胞通透化。在一些实施方案中，使用表面活性剂来使细胞通透化，所述表面活性剂例如阳离子表面活性剂例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方案中，用周期性机械冲击(例如电穿孔或轻微渗透冲击)来使细胞通透化.所述细胞可以含有一个重组UGT或多个重组UGT。例如，所述细胞可含有UGT76G1和EUGT11，使得甜菊苷和RebA的混合物高效地转化为RebD。在一些实施方案中，所述全细胞是III A部分中所述的宿主细胞。在一些实施方案中，所述全细胞是革兰氏阴性菌例如大肠杆菌。在一些实施方案中，所述全细胞是革兰氏阳性菌例如芽孢杆菌(Bacillus)。在一些实施方案中，所述全细胞是真菌物种，例如曲霉菌(Aspergillus)，或酵母例如酵母菌(Saccharomyces)。在一些实施方案中，术语“全细胞生物催化”用于指如下过程：按照如上所述培养全细胞(例如，在培养基中并且任选地通透化)，提供底物例如rebA或甜菊苷，并使用来自细胞的酶转化成终产物。所述细胞可以是活的或者可以不是活的，并且在生物转化反应期间可以生长或者可以不生长。相比之下，在发酵中，将细胞培养在生长培养基中，并供给碳和能量源例如葡萄糖，例如用活细胞生产终产物。
[0201] B.3杜尔可苷A和莱鲍迪苷C生物合成多肽
[0202] 莱鲍迪苷C和/或杜尔可苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化和鼠李糖基化。具体来说，形成杜尔可苷A可以通过甜菊醇之13-OH的葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2'的鼠李糖基化形成1，2鼠李二糖苷、以及1，2鼠李二糖苷之C-19羧基的葡糖基化.形成莱鲍迪苷C可以通过杜尔可苷A之C-13-O-葡萄糖的C-3’的葡糖基化。每个糖基化反应发生的顺序可以改变。参见图2B。
[0203] 已经发现，重组宿主中甜菊醇转化为杜尔可苷A可以通过编码以下功能性UGT之基因的表达来实现：85C2、EUGT11和/或91D2e以及74G1。因此，表达这三种或四种UGT和鼠李糖合成酶的重组微生物可以在培养基中供给甜菊醇时产生杜尔可苷A.或者，表达两种UGT(EUGT11和74G1)以及鼠李糖合成酶的重组微生物可以在培养基中供给单糖苷-甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时产生杜尔可苷A。类似地，实现重组微生物中甜菊醇向莱鲍迪苷C的转化可以通过在供给甜菊醇时编码UGT 85C2、EUGT11、74G1、76G1、任选的91D2e以及鼠李糖合成酶之基因的表达；在供给甜菊醇-13-O-葡萄糖苷时，编码UGT EUGT11和/或91D2e、74G1和76G1以及鼠李糖合成酶之基因的表达；在供给甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时，编码UGT 85C2、EUGT11和/或91D2e、76G1以及鼠李糖合成酶之基因的表达；或者在供给甜叶悬钩子苷时，编码UGT EUGT11和/或91D2e、76G1以及鼠李糖合成酶之基因的表达。通常来说，这些基因中的一个或更多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的微生物中的重组基因。
[0204] 合适的EUGT11、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2多肽包括本文讨论的功能性UGT多肽。鼠李糖合成酶给甜菊醇化合物受体的鼠李糖基化提供了增加量的UDP-鼠李糖供体。合适的鼠李糖合成酶包括拟南芥产生的那些，例如拟南芥RHM2基因的产物。
[0205] 在一些实施方案中，用UGT79B3多肽替代UGT91D2多肽。合适的UGT79B3多肽包括拟南芥产生的那些，它们能够将甜菊醇13-O-单糖苷在体外鼠李糖基化。拟南芥UGT79B3可以将糖基化的化合物鼠李糖基化形成1，2-鼠李糖苷。SEQ ID NO：150中给出了拟南芥UGT79B3的氨基酸序列。SEQ ID NO：151中给出了编码SEQ ID NO：150之氨基酸序列的核苷酸序列.[0206] 在一些实施方案中，可以在提供合适的UDP-糖和/或无细胞系统来再生UDP-糖的同时采用体外方法生产莱鲍迪苷C。参见例如，Jewett MC，Calhoun KA，VoloshinA，Wuu JJ和Swartz JR的“An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology”，Molecula r Systems Biology，4，article 220(2008)；Masada S等.FEBS Letters，第581卷，2562-2566(2007)。在一些实施方案中，蔗糖和蔗糖合酶可以在反应器中提供以在糖基化反应期间由UDP再产生UDP-葡萄糖。参见图11。
蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将来自拟南芥、甜叶菊或小果咖啡的蔗糖合酶编码序列在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主(例如，微生物或植物)中表达。在一些实施方案中，还可以提供RHM2酶(鼠李糖合成酶)，使用NADPH由UDP-葡萄糖产生UDP-鼠李糖。
蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将来自拟南芥、甜叶菊或小果咖啡的蔗糖合酶编码序列在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主(例如，微生物或植物)中表达。在一些实施方案中，还可以提供RHM2酶(鼠李糖合成酶)，使用NADPH由UDP-葡萄糖产生UDP-鼠李糖。
[0207] 反应可以一起进行或者分步进行。例如，可以由甜叶悬钩子苷，加入化学计算量的UDP-鼠李糖和EUGT11，然后加入UGT76G1和过量的或化学计算量的UDP-葡萄糖来生产莱鲍迪苷C。在一些实施方案中，使用磷酸酶来除去次级产物和提高反应产量。UGT和其他用于体外反应的酶可以以可溶性形式或固定化形式提供。在一些实施方案中，可以使用如上所讨论的全细胞来生产莱鲍迪苷C、杜尔可苷A或其他甜菊醇鼠李糖苷。所述细胞可以含有一种重组UGT或多种重组UGT。例如，所述细胞可以含有UGT 76G1和EUGT11，使得甜菊苷和RebA的混合物高效地转化为RebD。在一些实施方案中，所述全细胞是IH A部分所述的宿主细胞。
[0208] 在另一些实施方案中，所述重组宿主表达一个或更多个参与甜菊醇生物合成的基因，例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此，例如除了UGT85C2、UGT74G1、EUGT11基因、任选的UGT91D2e基因和UGT76G1基因，还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物能够在不需要培养基中包含甜菊醇的情况下产生莱鲍迪苷C.所述重组宿主通常还表达编码鼠李糖合成酶的内源或重组基因。这样的基因可用于给甜菊醇化合物受体的鼠李糖基化提供增加量的UDP-鼠李糖供体。合适的鼠李糖合成酶包括拟南芥产生的那些，例如拟南芥RHM2基因的产物.
[0209] 本领域技术人员可以认识到通过调节不同UGT基因的相对表达水平以及调节UDP-鼠李糖的可得性，可以使重组宿主适合以期望比例特异地产生甜菊醇和甜菊醇糖苷类产物。甜菊醇生物合成基因和甜菊醇糖苷类生物合成基因的转录调控可以利用本领域技术人员已知的技术，结合转录的活化和抑制来实现。就体外反应而言，本领域技术人员可以认识到，加入不同水平的UGT酶组合或者在影响组合中不同UGTS相对活性的条件下，会使合成反应朝向每种甜菊醇糖苷类按照期望比例的方向进行。
[0210] 在一些实施方案中，为了提供提高水平的二萜前体香叶基香叶基二磷酸，所述重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因，以便提高经莱鲍迪苷A生物合成途径的流量。在一些实施方案中，所述重组宿主还含有构建体以沉默或者减少消耗香叶基香叶基二磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼基焦磷酸的非甜菊醇途径的表达，从而提供增加的经甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成途径的流量。例如，可以通过下调ERG9基因来减少向固醇产生途径(例如麦角固醇)的流量。参见下文中的ERG9部分和实施例24至25。在产生赤霉素的细胞中，可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在产生类胡萝卜素的生物中，通过下调一个或更多个类胡萝卜素生物合成基因可以提高到甜菊醇的流量。
[0211] 在一些实施方案中，所述重组宿主还含有并表达参与二萜生物合成或类萜前体产生的重组基因，例如在下文中讨论的MEP或MEV途径中的基因，所述重组宿主具有降低的磷酸酶活性，和/或表达SUS。
[0212] 在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生的甜菊醇糖苷类组合物含有占总甜菊醇糖苷类的大于至少15％的莱鲍迪苷C，例如至少20％的莱鲍迪苷C、30至40％的莱鲍迪苷C、40至50％的莱鲍迪苷C、50％至60％的莱鲍迪苷C、60％至70％的莱鲍迪苷C、70％至80％莱鲍迪苷C、80％至90％的莱鲍迪苷C。在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生的甜菊醇糖苷类组合物含有至少90％的莱鲍迪苷C，例如90％至99％的莱鲍迪苷C。其他存在的甜菊醇糖苷类可包括图2A和B中示出的那些，例如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、甜菊醇鼠李二糖苷、莱鲍迪苷A和杜尔可苷A。在一些实施方案中，可以进一步纯化宿主产生的富含莱鲍迪苷C的组合物，然后可以将这样纯化的莱鲍迪苷C或杜尔可苷A与其他甜菊醇糖苷类、矫味剂或甜味剂混合从而得到期望的矫味体系或者甜味组合物.例如，可以将重组微生物产生的富含莱鲍迪苷C的组合物与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、F或D的组合物、与从甜菊提取物纯化的莱鲍迪苷A、F或D、或者与在体外产生的莱鲍迪苷A、F或D组合。
[0213] B.4 莱鲍迪苷F生物合成多肽
[0214] 莱鲍迪苷F的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化和木糖基化。具体来说，莱鲍迪苷F的形成可以通过：甜菊醇之13-OH的葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷之13-O-葡萄糖的C-2’的木糖基化形成甜菊醇-1，2-木二糖苷1、1，2-木二糖苷之C-19羧基的葡糖基化形成1，2-甜菊木糖苷、以及1，2-甜菊木糖苷之C-13-O-葡萄糖的C-3’的葡糖基化形成莱鲍迪苷F。每个糖基化反应发生的顺序可以改变。参见图2D。
[0215] 已经发现，重组宿主中甜菊醇转化为莱鲍迪苷F可以通过表达编码以下功能性UGT-85C2、EUGT11和/或91D2e、74G1和76G1以及内源或者重组表达的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因来实现。因此，表达这四种或五种UGT以及内源或者重组UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶的重组微生物可以在培养基中供给甜菊醇时产生莱鲍迪苷F。或者，表达两种功能性UGT(EUGT11或91D2e和76G1)的重组微生物在培养基中供给甜叶悬钩子苷时可以产生莱鲍迪苷F。作为另一替选，表达功能性UGT 76G1的重组微生物在供给1，2甜菊鼠李糖苷时可以产生莱鲍迪苷F。作为另一替选，表达74G1、EUGT11和/或91D2e、
76G1的重组微生物在培养基中供给单糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷时可以产生莱鲍迪苷F。
类似地，重组微生物中甜菊醇-19-O-葡萄糖苷转化为莱鲍迪苷F可以通过在供给甜菊醇-
19-O-葡萄糖苷时表达编码UGT85C2、EUGT11和/或91D2e以及76G1的基因来实现。通常来说，这些基因中的一个或更多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主中的重组基因。
76G1的重组微生物在培养基中供给单糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷时可以产生莱鲍迪苷F。
类似地，重组微生物中甜菊醇-19-O-葡萄糖苷转化为莱鲍迪苷F可以通过在供给甜菊醇-
19-O-葡萄糖苷时表达编码UGT85C2、EUGT11和/或91D2e以及76G1的基因来实现。通常来说，这些基因中的一个或更多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主中的重组基因。
[0216] 合适的EUGT11、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2多肽包括本文讨论的功能性UGT多肽。在一些实施方案中，如上文所讨论的，用UGT79B3多肽替换UGT91。UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶给甜菊醇化合物受体的木糖基化提供了增加量的UDP-木糖供体.合适的UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶包括拟南芥或新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)产生的那些。例如，合适的UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶多肽可以分别由拟南芥UGD1基因和UXS3基因编码。参见Oka和Tigami，FEBS J.273：2645-2657(2006)。
[0217] 在一些实施方案中，可以在提供合适的UDP-糖和/或无细胞系统来再生UDP-糖的同时采用体外方法来生产莱鲍迪苷F。参见例如Jewett MC等.Molecular Systems Biology，第4卷，article 220(2008)；Masada S等.FEBS Letters，第581卷，2562-2566(2007)。在一些实施方案中，在反应容器中提供蔗糖和蔗糖合酶以在糖基化反应期间由UDP再生UDP-葡萄糖。参见图11。蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将编码来自拟南芥、甜叶菊或小果咖啡之序列的蔗糖合酶在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主例如微生物或植物中表达。在一些实施方案中，可以通过提供合适的酶(例如，拟南芥UGD1(UDP-葡萄糖脱氢酶)和UXS3(UDP-葡糖醛酸脱羧酶)酶)和NAD+辅因子来由UDP-葡萄糖产生UDP-木糖。
[0218] 反应可以一起进行或者逐步进行。例如，可以由甜叶悬钩子苷，加入化学计算量的UDP-木糖和EUGT11，随后加入UGT76G1和过量或者化学计算量的UDP-葡萄糖来产生莱鲍迪苷F。在一些实施方案中，使用磷酸酶来去除次级产物和提高反应产量。UGT和其他用于体外反应的酶可以以可溶性形式或固定化形式提供。在一些实施方案中，可以使用如上所讨论的全细胞来产生莱鲍迪苷F或其他甜菊木糖苷。例如，所述细胞可以含有UGT 76G1和EUGT11，使得甜菊苷和RebA的混合物高效地转化为RebD.在一些实施方案中，所述全细胞是III A部分所述的宿主细胞。
[0219] 在另一些实施方案中，所述重组宿主表达一个或更多个参与甜菊醇生物合成的基因，例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此例如，除了EUGT11、UGT85C2、UGT74G1、任选的UGT91D2基因以及UGT76G1基因，还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物无需在培养基中包含甜菊醇就能够产生莱鲍迪苷F。此外，所述重组宿主通常还表达编码UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶的内源或重组基因。这样的酶可用于给甜菊醇化合物受体的木糖基化提供增加量的UDP-木糖供体。合适的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶包括拟南芥或新型隐球菌产生的那些。例如，合适的UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶多肽可以分别由拟南芥UGD1基因和UXS3基因编码。参见Oka和Jigami，FEBS J.273：2645-2657(2006)。
[0220] 本领域技术人员可以认识到通过调节不同UGT基因的相对表达水平和调节UDP-木糖的可得性，可以使重组微生物适合以期望比例特异地产生甜菊醇和甜菊醇糖苷类产物。甜菊醇生物合成基因的转录调控可以利用本领域人员已知的技术，结合转录的活化和抑制来实现。就体外反应而言，本领域技术人员可以认识到，加入不同水平的UGT酶组合或者在影响组合中不同UGTS相对活性的条件下，会使合成反应朝向每种甜菊醇糖苷类期望比例的方向进行。
[0221] 在一些实施方案中，为了提供提高水平的二萜前体香叶基香叶基二磷酸，所述重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因，以便提高经甜菊醇生物合成途径的流量。在一些实施方案中，所述重组宿主还含有构建体以沉默消耗香叶基香叶基二磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼基焦磷酸的非甜菊醇途径的表达，从而提供增加的经甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成途径的流量。例如，可以通过下调ERG9基因来减少向固醇产生途径(例如麦角固醇)的流量。参见下文中的ERG9部分和实施例24至25。在产生赤霉素的细胞中，可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在产生类胡萝卜素的生物中，可以通过下调一个或更多个类胡萝卜素生物合成基因来提高到甜菊醇的流量。在一些实施方案中，重组宿主还含有并表达参与二萜生物合成的重组基因，例如在下文中讨论的MEP途径中的基因。
[0222] 在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生的富含莱鲍迪苷F的甜菊醇糖苷类组合物含有占甜菊醇糖苷类总重量的大于至少4％的莱鲍迪苷F，例如至少5％的莱鲍迪苷F、至少6％的莱鲍迪苷F、10％至20％的莱鲍迪苷F、20％至30％的莱鲍迪苷F、30至40％的莱鲍迪苷F、40至50％的莱鲍迪苷F、50％至60％的莱鲍迪苷F、60％至70％的莱鲍迪苷F、70％至80％的莱鲍迪苷F.在一些实施方案中，重组宿主(例如微生物)产生的甜菊醇糖苷类组合物含有至少90％的莱鲍迪苷F，例如90％至99％的莱鲍迪苷F。其他存在的甜菊醇糖苷类可包括图2A和D中示出的那些，例如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、甜菊醇木糖二糖苷、莱鲍迪苷A、甜菊醇木糖苷、甜叶悬钩子苷以及甜菊苷。在一些实施方案中，可以将宿主产生的富含莱鲍迪苷F的组合物与其他甜菊醇糖苷类、矫味剂或甜味剂混合从而得到期望的矫味体系或者甜味组合物。例如，可以将重组微生物产生的富含莱鲍迪苷F的组合物与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、C或D的组合物、与从甜菊提取物纯化的鲍迪苷A、C或D、或者与在体外产生的莱鲍迪苷A、C或D组合。
[0223] C.其他多肽
[0224] 还可以向重组宿主中引入那些其表达便于更有效或更大规模地产生甜菊醇或甜菊醇糖苷类的其他多肽的基因。例如，重组微生物、植物或植物细胞还可以含有一个或更多个编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS，也称为GGDPS)的基因。作为另一个实例，所述重组宿主可以含有一个或更多个编码鼠李糖合成酶的基因，或者一个或更多个编码UDP-葡萄糖脱氢酶和/或UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。作为另一个实例，重组宿主还可以含有一个或更多个编码细胞色素P450还原酶(CPR)的基因.重组CPR的表达有助于NADP+循环再生NADPH，NADPH被用作类萜生物合成中的辅因子。也可以采用其他方法来再生NADHP水平。在NADPH变得有限的情况下，可以将菌株进一步改造为包含外源的转氢酶(transhydrogenase)基因。参见例如，Sauer等，J.Biol.Chem.279：6613-6619(2004)。用于减少或者以其他方式改变NADH/NADPH的比率从而提高期望的辅因子的水平的其他方法是本领域技术人员已知的。
[0225] 作为另一个实例，所述重组宿主可以含有一个或更多个编码MEP途径或甲羟戊酸途径中的一个或更多个酶的基因。这样的基因是有用的，因为它们可以提高碳进入二萜生物合成途径的流量，从而由所述途径产生的异戊二烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸生成香叶基香叶基二磷酸。由于甜菊醇生物合成多肽和甜菊醇糖苷类生物合成多肽的表达，这样产生的香叶基香叶基二磷酸可以被引导向甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成。
[0226] 作为另一个实例，所述重组宿主可以含有一个或更多个编码蔗糖合酶的基因，并且还可以在需要时含有蔗糖摄取基因。蔗糖合酶反应可用于在发酵宿主或在全细胞生物转化过程中增加UDP-葡萄糖池(pool)。这使得由在糖基化期间产生的UDP和蔗糖再生UDP-葡萄糖，使得能够进行高效的糖基化。在一些生物中，内源转化酶的破坏有利于防止蔗糖降解。例如，可以破坏酿酒酵母SUC2转化酶。蔗糖合酶(SUS)可以来自任何合适的生物。例如，可以将来自但不限于拟南芥、甜叶菊或小果咖啡的蔗糖合酶编码序列在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主(例如，微生物或植物)中表达。蔗糖合酶可以在这样的菌株中与蔗糖转运蛋白(例如，拟南芥SUC1转运蛋白或其功能同源物)和一种或更多种UGT(例如，UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1和UGT91D2e、EUGT11或其功能同源物中的一个或更多个)组合表达。在含有蔗糖的培养基中培养宿主可以促进UDP-葡萄糖以及一种或更多种葡萄糖苷(例如，甜菊醇糖苷类)的产生。
[0227] 此外，如本文所讨论的，重组宿主可以具有降低的磷酸酶活性。
[0228] C.1 MEP生物合成多肽
[0229] 在一些实施方案中，重组宿主含有一个或更多个编码参与类异戊二烯生物合成的甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径之酶的基因。MEP途径中的酶包括脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)以及1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)。可以将一个或更多个DXS基因、DXR基因、CMS基因、CMK基因、MCS基因、HDS基因和/或HDR基因并入重组微生物中。参见Rodríguez-Concepci6n and Boronat，Plant Phys.130：1079-1089(2002)。
[0230] 合适的编码DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDS和/或HDR多肽的基因包括由大肠杆菌、拟南芥和聚球藻(Synechococcus leopoliensis)产生的那些。例如美国专利No.7,335,815中描述了编码DXR多肽的核苷酸序列。
[0231] C.2 甲羟戊酸生物合成多肽
[0232] 在一些实施方案中，重组宿主含有一个或更多个编码参与类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸途径之酶的基因。适合转化到宿主中的基因编码甲羟戊酸途径中的酶例如截短的3-羟基-3-甲基-戊二酰基(HMG)-CoA还原酶(tHMG)和/或基因编码甲羟戊酸激酶(MK)；和/或基因编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；和/或基因编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPPD)。因此，可以向重组宿主(例如微生物)中整合入一个或更多个HMG-CoA还原酶基因、MK基因、PMK基因和/或MPPD基因。
[0233] 合适的编码甲羟戊酸途径多肽的基因是已知的。例如，合适的多肽包括大肠杆菌、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、酿酒酵母、拟南芥、Kitasatospora griseola、智人、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、原鸡(Gallus gallus)、链霉菌KO-3988、渐窄叶烟草(Nicotiana attenuate)、Kitasatospora griseola、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)以及雨生红球藻(Haematococcus
pluvialis)产生的那些。参见例如表8和美国专利No.7,183,089、5,460,949以及5,306,
862。
pluvialis)产生的那些。参见例如表8和美国专利No.7,183,089、5,460,949以及5,306,
862。
[0234] 表8.HMG CoA还原酶及其他甲羟戊酸基因的来源
[0235]
[0236]
[0237] C.3蔗糖合酶多肽
[0238] 蔗糖合酶(SUS)可以用作用于产生UDP-糖的工具。SUS(EC2.4.1.13)催化由蔗糖和UDP形成UDP-葡萄糖和果糖(图11)。因此，在蔗糖的存在下，可以将由UGT的反应产生的UDP转化为UDP-葡萄糖。参见例如，Chen等.(2001)J.Am.Chem.Soc.123：8866-8867；Shao等.(2003)Appl.Env.Microbiol.69：5238-5242；Masada等.(2007)FEBS Lett.581：2562-2566；以及Son等.(2009)J.Microbiol.Biotechnol.19：709-712。
[0239] 蔗糖合酶可用于产生UDP-葡萄糖并除去UDP，在多种系统中促进化合物的高效糖基化。例如，可以通过引入蔗糖转运蛋白和SUS，将利用蔗糖的能力有缺陷的酵母培养在蔗糖上。例如，酿酒酵母不具有高效的蔗糖摄取系统，并且依赖于胞外SUC2来利用蔗糖。破坏内源酿酒酵母SUC2转化酶与表达重组SUS的组合导致能够代谢胞内蔗糖但不能代谢胞外蔗糖的酵母菌株(Riesmeier等.((1992)EMBOJ.11：4705-4713)。使用该菌株来通过转化cDNA表达文库和选择获得了摄取蔗糖之能力的转化株来分离蔗糖转运蛋白。
[0240] 如本文所述，重组蔗糖合酶与蔗糖转运蛋白在体内的组合表达可能导致提高的UDP-葡萄糖可得性并且除去非期望的UDP.例如，重组蔗糖合酶、蔗糖转运蛋白和糖基转移酶的功能性表达与天然蔗糖降解系统(在酿酒酵母情况下的SUC2)敲除的组合可用于产生能够生产增加量的糖基化化合物例如甜菊醇糖苷类的细胞。所述较高的糖基化能力至少是由于(a)较高的以更节能的方式生产UDP-葡萄糖的能力和(b)从培养基中去除UDP，因为UDP可以抑制糖基化反应。
[0241] 蔗糖合酶可以来自任何合适的生物。例如，可以将来自但不限于拟南芥、甜叶菊或小果咖啡的蔗糖合酶编码序列(参见例如图19A-19C，SEQ ID No.178、179和180)在合适的启动子的控制下克隆入表达质粒中，并在宿主(例如，微生物或植物)中表达。如在本文的实施例中所述的，SUS编码序列可以在SUC2(蔗糖水解酶)缺陷型酿酒酵母菌株中表达，以避免胞外蔗糖被酵母降解。蔗糖合酶可以在这样的菌株中与蔗糖转运蛋白(例如，拟南芥SUC1转运蛋白或其功能同源物)以及一个或更多个UGT(例如，UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1、EUGT11和UGT91D2e或其功能同源物中的一个或更多个)组合表达。在含有蔗糖的培养基中培养宿主可以促进UDP-葡萄糖以及一种或更多个葡萄糖苷(例如，甜菊醇糖苷类)的产生。应注意，在一些情况下，蔗糖合酶和蔗糖转运蛋白可以与UGT一起在宿主细胞(其还重组用于产生特定化合物，例如甜菊醇)中表达。
[0242] C.4 ERG9活性的调节
[0243] 本公开内容的一个目的是基于增加角鲨烯途径之类萜前体的累积的概念产生类萜。类萜的非限制性实例包括：半萜系化合物(Hemiterpenoid)，1个异戊二烯单元(5个碳)；单萜系化合物(Monoterpenoid)，2个异戊二烯单元(10个C)；倍半萜系化合物
(Sesquiterpenoid)，3个异戊二烯单元(15个C)；双萜系化合物(Diterpenoid)，4个异戊二烯单元(20个C)(例如，银杏内酯)；三萜系化合物(Triterpenoid)，6个异戊二烯单元(30个C)；四萜系化合物(Tetraterpenoid)，8个异戊二烯单元(40个C)(例如，类胡萝卜素)；以及具有大量异戊二烯单元的多萜系化合物(polyterpenoid)。
(Sesquiterpenoid)，3个异戊二烯单元(15个C)；双萜系化合物(Diterpenoid)，4个异戊二烯单元(20个C)(例如，银杏内酯)；三萜系化合物(Triterpenoid)，6个异戊二烯单元(30个C)；四萜系化合物(Tetraterpenoid)，8个异戊二烯单元(40个C)(例如，类胡萝卜素)；以及具有大量异戊二烯单元的多萜系化合物(polyterpenoid)。
[0244] 半萜系化合物包括异戊二烯、异戊二烯醇和异戊酸。单萜系化合物包括香叶基焦磷酸、桉叶油素、苎烯和蒎烯。倍半萜系化合物包括法尼基焦磷酸、青蒿素和红没药醇.双萜系化合物包括香叶基香叶基焦磷酸、甜菊醇、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素和阿非迪霉素(aphidicolin)。三萜系化合物包括角鲨烯和羊毛甾醇(Lanosterol)。四萜系化合物包括番茄红素和胡萝卜素。
[0245] 萜是由若干异戊二烯单元组合产生的烃.可以将类萜(terpenoid)看作萜烯衍生物。术语萜有时用于广义地包括类萜使用.正如萜，类萜可根据所用异戊二烯单元的数目来分类。本发明关注类萜并且特别是通过角鲨烯途径由前体法尼基焦磷酸(FPP)、异戊二烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和/或香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)衍生的类萜。
[0246] 应将类萜理解为：半萜系化合物类的类萜，例如但不限于异戊二烯、异戊二烯醇和异戊酸；单萜系化合物类的类萜，例如但不限于香叶基焦磷酸、桉叶油素、苎烯和蒎烯；倍半萜系化合物类的类萜，例如但不限于法尼基焦磷酸、青蒿素和红没药醇；双萜系化合物类的类萜例如但不限于香叶基香叶基焦磷酸、甜菊醇、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素和阿非迪霉素；三萜系化合物类的类萜例如但不限于羊毛甾醇；四萜系化合物类的类萜例如但不限于番茄红素和胡萝卜素。
[0247] 在一个实施方案中，本发明涉及类萜的产生，所述类萜由香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)生物合成。特别地，这样的类萜可以是甜菊醇。
[0248] 在一个实施方案中，本发明涉及类萜的产生，所述类萜由香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)生物合成。特别地，这样的类萜可以是甜菊醇。
[0249] 细胞
[0250] 本发明涉及细胞，例如第III部分中所述的改造为包含图22所示构建体的任意宿主。因此，在一个主要的方面中，本发明涉及包含核酸的细胞，所述核酸包含：
[0251] i)启动子序列，其有效连接至
[0252] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0253] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0254] iv)转录终止信号；
[0255] 其中异源插入序列具有通式(I)：
[0256] -X1-X2-X3-X4-X5-，
[0257] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补并且形成发夹二级结构元件的至少4个连续核苷酸，并且
[0258] 其中X3是任选的，并且如果存在的话，包含参与在X2与X4之间形成发夹环的核苷酸，并且
[0259] 其中X1和X5独立地并且任选地包含一个或更多个核苷酸，并且
[0260] 其中所述开放阅读框在表达之后编码角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)，例如，与角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)具有至少70％同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段在至少100个氨基酸重叠的范围内与所述角鲨烯合酶具有至少70％序列同一性的片段。
[0261] 除上述包含异源插入序列的核酸以外，所述细胞还可以包含一个或更多个额外的异源核酸序列(例如，编码第I部分的任意甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成多肽的核酸)。在一个优选的实施方案中，所述细胞含有编码GGPPS的异源核酸，其与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接.
[0262] 异源插入序列
[0263] 所述异源插入序列可以使发夹的二级结构元件适于发夹环。发夹部分包含区段X2和X4，X2和X4彼此互补并杂交。区段X2和X4侧接区段X3，X3含有形成环-发夹环的核苷酸。本领域技术人员将术语互补理解为意指两条序列从5’端至3’端计逐个核苷酸彼此相配(compared)，或者反之亦然。
[0264] 异源插入序列足够长从而使得完成发夹，但也足够短从而使得存在于框内和异源插入序列的紧靠3’处之ORF的受限翻译。因此，在一个实施方案中，异源插入序列含有10至50个核苷酸，优选10至30个核苷酸，更优选15至25个核苷酸，更优选17至22个核苷酸，更优选18至21个核苷酸，更优选18至20个核苷酸，更优选19个核苷酸。
[0265] X2和X4可以独立地由任何合适数目的核苷酸组成，只要X2的至少4个核苷酸的连续序列与X4的至少4个核苷酸的连续序列互补。在一个优选的实施方案中，X2和X4由相同数目的核苷酸组成。
[0266] X2可以例如由4至25个、例如4至20个、例如4至15个、例如6至12个、例如8至12个、例如9至11个核苷酸组成。
[0267] X4可以例如由4至25个、例如4至20个、例如4至15个、例如6至12个、例如8至12个、例如9至11个核苷酸组成。
[0268] 在一个优选的实施方案中，X2由与X4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成，即，优选X2的全部核苷酸与X4的核苷酸序列互补。
[0269] 在一个优选的实施方案中，X4由与X2的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成，即，优选X4的全部核苷酸与X2的核苷酸序列互补。非常优选地，X2和X4由相同数目的核苷酸组成，其中X2与X4在X2和X4的全长范围互补。
[0270] 可以不存在X3，即，X3可以由零个核苷酸组成。X3还可能由1至5(例如，1至3)个核苷酸组成。
[0271] 可以不存在X1，即，X1可以由零个核苷酸组成。X1还可能由1至25(例如1至20、例如1至15、例如1至10、例如1至5、例如1至3)个个核苷酸组成。
[0272] 可以不存在X5，即，X5可以由零个核苷酸组成。X5还可能由1至5(例如，1至3)个核苷酸组成。
[0273] 所述序列可以是任何合适的实现上文所定义的需要的序列.因此，异源插入序列可以含有选自以下的序列：SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184。在一个优选的实施方案中，所述插入序列选自：SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184。
[0274] 角鲨烯合酶
[0275] 角鲨烯合酶(SQS)是第一个指定用于生物合成途径的酶，其导致固醇的产生。其催化由法尼基焦磷酸经中间体角鲨烯焦磷酸合成角鲨烯。该酶是类萜/类异戊二烯生物合成中的关键临界点酶，并且认为其调节异戊二烯中间体经固醇途径的流量。有时将该酶称为法尼基二磷酸法尼基转移酶(FDFT1)。
[0276] SQS的机制是将两个法尼基焦磷酸单元转化为角鲨烯。
[0277] 认为SQS是真核细胞或高级生物的酶，但至少一种原核细胞已示出具有功能上类似的酶。
[0278] 在结构和机制方面，角鲨烯合酶与八氢番茄红素合酶(phytoene syntase)最为相似，八氢番茄红素合酶在许多植物的八氢番茄红素(许多类胡萝卜素的前体)之精制(elaboration)中起类似的作用。
[0279] 高水平的序列同一性表明第一序列衍生自第二序列的可能性。氨基酸序列同一性要求两个比对的序列之间相同的氨基酸序列.因此，与参考序列有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对之后，候选序列中有70％的氨基酸与参考序列中的对应氨基酸相同。可以借助于计算机分析来确定同一性，例如但不限于D部分所述的ClustalW计算机比对程序。使用该程序及其缺省设置，将查询的成熟(生物活性)部分与参考多肽进行比对。计算完全保守的残基的数目并除以参考多肽的长度。ClustalW算法可以类似地用于比对核苷酸序列。可以按照与氨基酸序列所示类似的方式计算序列同一性.
[0280] 在一个重要的实施方案中，本发明的细胞包含如本文所定义的表达之后编码角鲨烯合酶的核酸序列，其中所述角鲨烯合酶与选自SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：202的角鲨烯合酶具有至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少99.5％、例如至少99.6％、例如至少99.7％、例如至少99.8％、例如至少99.9％、例如100％的同一性。
[0281] 启动子
[0282] 启动子是促进特定基因转录的DNA区域。启动子位于与它们所调控的基因相同的链上所述基因的附近并且通常在上游(朝向有义链的5’区)。为了使转录发生，合成RNA的酶(称为RNA聚合酶)必须附着于基因附近的DNA。启动子含有特定DNA序列和应答元件，应答元件为RNA聚合酶和称为转录因子的蛋白质(其募集RNA聚合酶)提供可靠的初始结合位点。这些转录因子具有相应核苷酸的特定活化序列或抑制序列，这些序列与特定启动子相连并调节基因表达.
[0283] 在细菌中，启动子被RNA聚合酶和相关的σ因子识别，其常常是通过活化蛋白与附近其自身DNA结合位点相结合而被带至启动子DNA的。在真核细胞中，该过程更复杂，并且RNA聚合酶II与启动子的结合需要至少7种不同的因子。启动子代表可以与其他调控区(增强子、沉默子、边界元件/绝缘子)一起合作以指导给定基因之转录水平的关键元件。
[0284] 因为启动子通常紧邻所讨论的开放阅读框(ORF)，所以启动子中的位置相对于转录起始位点来指定，其中RNA的转录针对特定基因开始(即，上游的位置是从-1向后数的负数，例如-100是碱基对上游第100位)。
[0285] 启动子元件
[0286] ·核心启动子-正确起始转录所需的最小部分的启动子
[0287] o转录起始位点(TSS)
[0288] o起始位点上游和/或下游的约-35bp
[0289] o RNA聚合酶的结合位点
[0290] ·RNA聚合酶I：转录编码核糖体RNA的基因
[0291] ·RNA聚合酶II：转录编码信使RNA和某些小核RNA的基因
[0292] ·RNA聚合酶III：转录编码tRNA和其他小RNA的基因
[0293] o一般转录因子结合位点
[0294] ·近端启动子-在倾向于含有一级调控元件的基因之上游的近端序列
[0295] o在起始位点上游约-250bp
[0296] o特异性转录因子结合位点
[0297] ·远端启动子-在可以含有其他调控元件的基因之上游的远端序列，与近端启动子相比常常具有较弱的影响
[0298] o更上游的任何序列(但并非增强子或其影响具有位置/方向非依赖性的其他调控区)
[0299] o特异性转录因子结合位点
[0300] 原核启动子
[0301] 在原核细胞中，所述启动子由在转录起始位点上游的第-10和-35位处的两条短序列组成。σ因子不仅有助于促进RNAP与启动子结合，还有助于RNAP靶向特异性基因以转录.[0302] 将在-10位处的序列称为普利布诺盒(Pribnow box)或-10元件，并且其通常由六个核苷酸TATAAT组成。普利布诺盒对于在原核细胞中起始转录而言是必要的。
[0303] 在-35处的其他序列(-35元件)通常由7个核苷酸TTGACAT组成。其存在允许非常高的转录速率。
[0304] 虽然上述两条共有序列通常是保守的，但发现其在大多数启动子中不是完整(intact)的。在任何给定的启动子中平均仅发现每个共有序列中6个碱基对的3对.至今尚未鉴定出在-10和-35二者处都有完整序列的启动子；已发现-10/-35六聚体完全保守的人工启动子以非常高的效率促进RNA链启动.
[0305] 一些启动子含有以-50为中心的UP元件(共有序列5'-AAAWWTWTTTTNNNAAANNN-3'；W＝A或T；N＝任何碱基)；-35元件的存在似乎对于由含UP元件的启动子转录而言不重要。
[0306] 真核启动子
[0307] 真核启动子通常位于基因(ORF)的上游，并且可具有与转录起始位点相距几千个碱基(kb)的调控元件。在真核细胞中，转录复合物可以导致DNA自身反折，这使得调控序列位于远离转录的实际位点。许多真核启动子含有TATA盒(序列TATAAA)，这进而结合有助于RNA聚合酶转录复合物形成的TATA结合蛋白。TATA盒通常的位置通常非常接近于转录起始位点(常常在50个碱基以内)。
[0308] 本发明的细胞包含含有启动子序列的核酸序列。启动子序列不限于本发明并且可以是适于所选宿主细胞的任何启动子。
[0309] 在本发明的一个实施方案中，所述启动子是组成型或诱导型启动子。
[0310] 在本发明的另一个实施方案中，所述启动子选自：内源启动子、PGK-1、GPD1、PGK1、ADH1、ADH2、PYK1、TPI1、PDC1、TEF1、TEF2、FBA1、GAL1-10、CUP1、MET2、MET14、MET25、CYC1、GAL1-S、GAL1-L、TEF1、ADH1、CAG、CMV、人UbiC、RSV、EF-1a、SV40、Mt1、Tet-On、Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mx1、黄体酮、RU486以及雷帕霉素诱导型启动子。
[0311] 转录后调控
[0312] 转录后调控是RNA水平基因表达的控制，因此在基因的转录和翻译之间。
[0313] 第一种调控情况为转录(转录调控)，其中由于核染色质排列以及由于转录因子的活性，基因有差异地转录。
[0314] 在产生之后，不同转录物的稳定性和分布通过RNA结合蛋白(RBP)来调控(转录后调控)，所述RNA结合蛋白(RBP)控制转录的多个步骤和速率：事件例如可变剪接、核降解(外来体)、加工、核输出(三个替选途径)、在用于贮存或降解的DCP2体中分离以及最终进行翻译。这些蛋白质借助于RNA识别基序(RRM)来实现这些事件，RRM与转录物的特定序列或二级结构结合，通常在转录物的5’UTR和3'UTR处。
[0315] 调控加帽、剪接、聚腺苷酸尾的添加、序列特异性核输出速率以及在一些情况下RNA转录物的分离在真核细胞中发生，但不在原核细胞中发生。该调控是由于蛋白质或转录物，其进而被调节并且可对某些序列具有亲和力。
[0316] 加帽
[0317] 加帽通过5′-5′连接将mRNA的5’端变为3’端，这保护mRNA免受降解外源RNA的5’核酸外切酶攻击。该帽还有助于核糖体结合。
[0318] 剪接
[0319] 剪接移除转录为RNA的内含子、非编码区，以制备能够产生蛋白质的mRNA。细胞通过以下来完成剪接：在内含子的两侧进行剪接体结合、使内含子成环然后将其剪切掉。然后，将外显子的两端连接在一起。
[0321] 多聚腺苷酸化是向3’端添加多聚腺苷酸尾，即多聚腺苷酸尾由多个单磷酸腺苷组成。多聚腺苷酸序列充当3’核酸外切酶的缓冲序列，因而提高mRNA的半衰期。此外，长多聚腺苷酸尾可以增加翻译。因此，多聚腺苷酸尾可用于进一步调控本发明构建体的翻译，以实现最佳翻译速率。
[0322] 在真核细胞中，多聚腺苷酸化是产生用于翻译之成熟信使RNA(mRNA)之过程的一部分。
[0323] 多聚腺苷酸尾还对于mRNA的核输出、翻译和稳定性而言是重要的.
[0324] 在一个实施方案中，如上文所定义的，本发明细胞的核酸序列还包含多聚腺苷/多聚腺苷化序列，优选地，所述多聚腺苷/多聚腺苷化序列的5’端与开放阅读框的3’端有效连接，以使与编码角鲨烯合酶的开放阅读框有效连接。
[0325] RNA编辑
[0326] RNA编辑(RNA editing)是导致RNA分子序列改变的过程，并且由酶催化.这些酶包括作于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，其通过水解脱氨基作用将mRNA分子中的特定腺苷残基转化为肌苷。已经克隆了三种ADAR酶-ADAR1、ADAR2和ADAR3，但只有前两种亚型已示出具有RNA编辑活性。许多mRNA容易受RNA编辑影响，包括谷氨酸受体亚单位GluR2、GluR3、GluR4、GluR5以及GluR6(其为AMPA和红藻氨酸受体的组件)、血清素2C受体、GABA-α3受体亚单位、色氨酸羟化酶TPH2、丁型肝炎病毒以及大于16％的小RNA。除ADAR酶以外，还存在CDAR酶，并且它们将特定RNA分子中的胞嘧啶转化为尿嘧啶。这些酶被称为“APOBEC”并且具有22q13处的基因座，该区接近于发生在颚心面综合征(velocardiofacial syndrome)(22q11)中并且与精神病相关的染色体缺失。因为编辑过程改变病毒功能，所以与传染性疾病相关地对RNA编辑进行了广泛的研究。
[0327] 转录后调控元件
[0328] 为了获得用于某些应用的具有充分性能的载体，使用转录后调控元件(PRE)往往是有必要的。Schambach等在Gene Ther.(2006)13(7)：641-5中报道了向逆转录病毒和慢病毒基因转移载体的3’非翻译区中引入土拔鼠肝炎病毒(WHV)的转录后调控元件(PRE)增强滴度和转基因表达二者。PRE的增强活性取决于其序列的精确构造和载体的情况以及向其中引入PRE的细胞。
[0330] 因此，在一个实施方案中，本文所定义的细胞之核酸序列还包含转录后调控元件.[0331] 在另一个实施方案中，所述转录后调控元件是土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
[0332] 末端重复序列(terminal repeat)
[0333] 为了向宿主DNA中插入基因序列，病毒常常使用重复多至上千次的DNA序列，即所谓的重复序列或末端重复序列，包括长末端重复序列(LTR)和反向末端重复序列(ITR)，其中所述重复序列可以是5’端重复序列和3’端重复序列二者。ITR有助于在单链载体DNA通过宿主细胞DNA聚合酶复合物转化为双链DNA之后在核中形成多联体.ITR序列可以来自病毒载体，例如AAV，例如AAV2。
[0334] 在一个实施方案中，本文所定义之细胞的核酸序列或载体含有5’末端重复序列和3’末端重复序列.
[0335] 在一个实施方案中，所述5’末端重复序列和3’末端重复序列选自反向末端重复序列[ITR]和长末端重复序列[LTR]。
[0336] 在一个实施方案中，所述5’末端重复序列和3’末端重复序列是AAV反向末端重复序列[ITR]。
[0337] 香叶基香叶基焦磷酸合酶
[0338] 在一些优选的实施方案中，本发明的微生物细胞可以含有编码香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的异源核酸序列。参见例如表7。GGPPS是催化将一个法尼基焦磷酸(FFP)分子转化为一个香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)分子之化学反应的酶。编码GGPPS的基因可以例如见于含有甲羟戊酸途径之生物中。
[0339] 本发明将使用的GGPPS可以是任何能够催化法尼基焦磷酸(FPP)分子转化为香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)分子的有用的酶。特别地，本发明将使用的GGPPS可以是任何能够催化下述反应的酶：
[0340] (2E，6E)-法尼基二磷酸+异戊二烯基二磷酸-＞二磷酸+香叶基香叶基二磷酸.
[0341] 优选本发明使用的GGPPS是EC 2.5.1.29分类的酶。
[0342] GGPPS可以是来自多种来源的GGPPS，例如细菌、真菌或哺乳动物。GGPPS可以是任何种类的GGPPS，例如GGPPS-1、GGPPS-2、GGPPS-3或GGPPS-4.GGPPS可以是野生型GGPPS或其功能同源物。
[0343] 例如，GGPPS可以是嗜酸热硫化叶菌的GGPPS-1(SEQ ID NO：126)、构巢曲霉(A.nidulans)的GGPPS-2(SEQ ID NO：203)、酿酒酵母的GGPPS-3(SEQ ID NO：167)或小家鼠的GGPPS-4(SEQ ID NO：123)或任意前述的功能同源物。
[0344] 编码所述GGPPS的异源核酸可以是编码所述GGPPS的任意核酸序列。因此，在本发明的一些其中GGPPS是野生型蛋白质的实施方案中，核酸序列可以例如是编码所述蛋白质的野生型cDNA序列。但是，通常的情况是异源核酸是编码任何特定GGPPS的核酸序列，其中所述核酸的密码子已经优化用于特定微生物细胞。因此，例如，如果微生物细胞是酿酒酵母，则优选编码GGPPS的核酸之密码子已经优化用于在酿酒酵母中最佳地表达。
[0345] GGPPS的功能同源物优选为具有上述活性并且与参考GGPPS的序列共有至少70％的氨基酸同一性的蛋白质。在上文的“角鲨烯合酶”部分和D部分中描述了用于确定序列同一性的方法。
[0346] 在一个实施方案中，所述细胞(例如，本发明的微生物)包含编码GGPPS或其功能同源物的核酸序列，其中所述功能同源物与选自SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：203的GGPPS具有至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少
84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少99.5％、例如至少
99.6％、例如至少99.7％、例如至少99.8％、例如至少99.9％、例如100％的同一性。
84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如至少99.5％、例如至少
99.6％、例如至少99.7％、例如至少99.8％、例如至少99.9％、例如100％的同一性。
[0347] 所述编码GGPPS的异源核酸序列一般与在微生物细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接.在微生物细胞中指导GGPPS表达的核酸序列序列可以是启动子序列，优选地根据特定微生物细胞来选择所述启动子序列.所述启动子可以例如是在上文的“启动子”部分中描述的任意启动子。
[0348] 载体
[0349] 载体是用作运载体以将外源遗传物质转移到另一个细胞中的DNA分子。载体的主要类型是质粒、病毒、粘粒和人工染色体。所有经改造的载体的共同点是复制起点、多克隆位点和可选择标记。
[0350] 载体本身一般是由插入序列(转基因)和充当载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移至另一个细胞之载体的目的通常是在靶细胞中分离、扩增或表达插入序列。称为表达载体(表达构建体)的载体特异地用于表达靶细胞中的转基因，并且一般具有驱动转基因表达的启动子序列.称为转录载体的较为简单的载体仅能够被转录，但不能被翻译：它们可以在靶细胞中复制但不能表达，这与表达载体不同.转录载体用于扩增其插入序列。
[0351] 就细菌细胞而言，将载体插入靶细胞中通常被称为转化，而就真核细胞而言称为转染，但通常将病毒载体的插入称为转导。
[0352] 质粒
[0353] 质粒载体一般是双链的环状DNA序列，其能够在宿主细胞中自主复制。质粒载体最低限度地由允许质粒在宿主中半依赖性地复制的复制起点及转基因插入序列组成。现在的质粒一般具有更多特征，特别地包括“多克隆位点”，其包括用于插入序列插入的核苷酸突出和插入序列各侧的多限制酶共有位点。在用作转录载体之质粒的情况下，用质粒孵育细菌在数小时内于细菌中产生数百或数千个拷贝的载体，并且可以从细菌中提取载体，可以通过限制酶切割多克隆位点以剪切数百倍或数千倍扩增的插入序列。这些质粒转录载体特征性地缺少编码聚腺苷酸化序列的关键序列和翻译mRNA中的翻译终止序列，使得不能在转录载体中进行蛋白质表达。质粒可以是接合的/传递的和非接合的：
[0354] -接合的(conjugative)：通过接合介导DNA转移，因此在细菌细胞群体之间快速传播；例如，F质粒，许多R质粒和一些col质粒。
[0355] -非接合的(nonconjugative)-不通过接合介导DNA，例如，许多R质粒和col质粒。
[0356] 病毒载体
[0357] 病毒载体一般是携带经修饰病毒DNA或RNA的经遗传改造的病毒，已经使其无感染性，但仍含有病毒启动子和转基因，从而使得通过病毒启动子翻译转基因。但是，因为病毒载体常常缺少感染性序列，所以它们需要辅助病毒或包装系(packaging line)来大规模转染。病毒载体通常设计成向宿主基因组中永久整合入插入序列，因而在整合入转基因之后在宿主基因组中留下明显的遗传标记。例如，在插入之后，逆转录病毒留下可检测的并且表明病毒载体已整合入宿主基因组中的特征性逆转录病毒整合模式。
[0358] 在一个实施方案中，本发明涉及能够转染宿主细胞的病毒载体，例如可以培养的细胞，例如酵母细胞或任何其他合适的真核细胞。然后，所述载体能够转染所述具有包含如本文所述的异源插入序列之核酸的细胞。
[0359] 病毒载体可以是任何合适的病毒载体，例如选自以下的病毒载体：来自逆转录病毒家族包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV的载体。
[0360] 病毒载体还可以选自：α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV以及腺相关病毒。
[0361] 在本发明的一些其中微生物细胞包含编码GGPPS之异源核酸的实施方案中，所述异源核酸可以位于还包含编码角鲨烯合酶之核酸的载体上，或者编码GGPPS之异源核酸可以位于不同载体上。所述编码GGPPS的异源核酸可以包含在本文上述的任何载体中.
[0362] 在本发明的一些其中微生物细胞包含编码HMCR之异源核酸的实施方案中，所述异源核酸可以位于还包含编码角鲨烯合酶之核酸的载体上，或者所述编码HMCR之异源核酸可以位于不同载体上。所述编码HMCR之异源核酸可以包含在本文上述的任何载体中。本发明还包括编码GGPPS的异源核酸和编码HMCR的异源核酸可以位于相同的或不同的载体上.
[0363] 转录
[0364] 转录在所有载体中都是必要组成：载体的前提是扩增插入序列(但之后表达载体还驱动所扩增插入序列的翻译)。因此，甚至稳定的表达也通过稳定的转录来确定，这一般取决于载体中的启动子.但是，表达载体具有多种表达模式：组成型(一致性表达)或诱导型(仅在某些条件或化学品存在下表达)。该表达基于不同的启动子活性而非转录后活性。因此，这两种不同类型的表达载体取决于不同类型的启动子.
[0365] 在质粒和病毒载体中，病毒启动子常常用于组成型表达，因为在许多细胞系和类型中，它们常常可靠地促使恒定转录。
[0366] 诱导型表达依赖于响应诱导条件的启动子：例如，鼠类乳腺肿瘤病毒启动子只在施用地塞米松之后启动转录，果蝇热休克启动子只在高温之后启动。转录是mRNA的合成。遗传信息从DNA拷贝至RNA。
[0367] 表达
[0368] 表达载体需要编码例如多聚腺苷酸尾的序列(参见上述)：在所转录的前mRNA之末端产生多聚腺苷酸尾，其保护mRNA免受核酸外切酶攻击，并确保转录和翻译终止：稳定mRNA产生。
[0369] 最小UTR长度：UTR含有可以阻止转录或翻译的特定特征，因而就在最佳表达载体中而言，编码了最短的UTR或根本未编码UTR。
[0370] Kozak序列：载体应在mRNA中编码Kozak序列，其装配核糖体用于mRNA的翻译。
[0371] 上述条件对于真核细胞中的表达载体来说是必要的，但对于原核细胞不必要。
[0372] 现有载体可以包括除转基因插入序列和骨架(例如启动子(如上所述))之外的额外特征遗传标记以例如使得能够证实载体已整合入宿主基因组DNA、用于抗生素选择的耐抗生素基因以及用于纯化的亲和标签中。
[0373] 在一个实施方案中，本发明的细胞包含整合入载体例如表达载体中的核酸序列.[0374] 在一个实施方案中，所述载体选自质粒载体、粘粒、人工染色体和病毒载体.
[0375] 质粒载体应能够在细菌、真菌和酵母中维持和复制。
[0376] 本发明还涉及包含质粒和粘粒载体以及人工染色体载体的细胞。
[0377] 重要因素是所述载体是功能性的并且所述载体至少包含含有如本文所述的异源插入序列的核酸序列.
[0378] 在一个实施方案中，所述载体在真菌和哺乳动物细胞中是功能性的。
[0379] 在一个实施方案中，本发明涉及转化或转导有如本文所定义之载体的细胞。
[0380] 用于产生类萜的方法
[0381] 如上文所提到的，本发明的细胞(例如，重组宿主细胞)可用于增加工业上相关类萜的产量。
[0382] 因此，本发明的细胞可用于多种设置以增加类萜前体的累积，因而提高由所述(上游)类萜前体之酶促转化导致的类萜产物的产量.
[0383] 因此，在一个方面中，本发明涉及用于在细胞培养物中产生通过角鲨烯途径合成的类萜化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0384] (a)提供如上文所定义的细胞；
[0385] (b)培养(a)的细胞；
[0386] (c)回收类萜产物化合物。
[0387] 通过提供包含上文所定义之经遗传修饰构建体的细胞，增加了类萜前体的累积(图20)。
[0388] 因此，在另一个方面中，本发明涉及用于产生得自选自以下之类萜前体的类萜的方法：法尼基焦磷酸(FPP)、异戊二烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和/或香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，所述方法包括：
[0389] (a)使所述前体与角鲨烯合酶途径的酶相接触，
[0390] (b)回收类萜产物。
[0391] 在一个实施方案中，如上文所定义的本发明方法的类萜(产物)选自：半萜系化合物、单萜系化合物、倍半萜系化合物、双萜系化合物、二倍半萜系化合物、三萜系化合物、四萜系化合物以及多萜系化合物。
[0392] 在另一个实施方案中，类萜选自：法尼基磷酸(farnesyl phosphate)、法尼醇、香叶基香叶基、香叶基香叶醇、异戊二烯、戊二烯醇、异戊酸、香叶基焦磷酸、桉树脑、柠檬烯、蒎烯、法尼基焦磷酸、青蒿素、红没药醇、香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素、阿非迪霉素、羊毛甾醇、番茄红素以及胡萝卜素。
[0393] 类萜产物可在额外的精制过程中用作起始点。因此，在一个实施方案中，所述方法还包括使法尼基磷酸脱去磷酸以产生法尼醇。
[0394] 用于制备靶产物类萜化合物之方法的酶优选为“位于以下类萜前体之下游”的酶：法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸以及香叶基香叶基焦磷酸，例如图20的角鲨烯途径中所示的位于类萜前体法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸以及香叶基香叶基焦磷酸之下游的酶。因此，基于通过本发明获得的前体的累积，用于制备靶产物类萜之方法中的酶可以选自：二甲基烯丙基转移酶(EC 2.5.1.1)、异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)和香叶基转移酶(EC 2.5.1.10)。
[0395] 本发明可以通过至少部分地、空间地妨碍核糖体与RNA结合因而减少角鲨烯合酶的翻译来进行。因此，在一个方面中，本发明涉及用于降低功能性角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)之翻译速率的方法，所述方法包括：
[0396] (a)提供上文所定义的细胞，
[0397] (b)培养(a)的细胞。
[0398] 类似地，在另一个方面中，本发明涉及用于减少法尼基焦磷酸转化为角鲨烯的方法，所述方法包括：
[0399] (a)提供上文所定义的细胞，
[0400] (b)培养(a)的细胞。
[0401] 如图20所示，ERG9的敲减导致角鲨烯合酶前体的累积。因此，在一个方面中，本发明涉及用于增加选自以下之化合物的累积的方法：法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸以及香叶基香叶基焦磷酸，所述方法包括以下步骤：
[0402] (a)提供上文所定义的细胞，和
[0403] (b)培养(a)的细胞。
[0404] 在一个实施方案中，如上文所定义的本发明方法还包括回收法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸或香叶基香叶基焦磷酸化合物。所回收的化合物可在用于产生期望的类萜产物化合物的其他方法中使用。在上文所定义和进行的过程中，相同的细胞培养物中还可发生其他过程，例如本发明细胞之类萜前体的累积.或者，可以向另一种细胞培养物或无细胞系统中添加回收的前体以产生期望的产物.
[0405] 但是，因为前体是中间体(主要是稳定的中间体)，所以基于类萜前体底物可能发生类萜产物的某些内源产生.此外，本发明的细胞可具有额外的遗传修饰，使得它们能够进行类萜前体(本发明细胞的构建体)的累积和全部或基本上全部用以产生期望类萜产物的后续生物合成过程。
[0406] 因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包括回收通过角鲨烯途径合成的化合物，所述化合物衍生自所述法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸和/或香叶基香叶基焦磷酸。有时，可能有利的是在培养本发明的细胞时包括角鲨烯合酶抑制剂。角鲨烯合酶的化学抑制(例如通过拉帕司他)在本领域中是公知的，并且正在进行研究，例如作为在预防心血管疾病中作为降低胆固醇水平的方法。还提出，该酶的变体可以是与高胆固醇血症在遗传上相关的一部分。其他角鲨烯合酶抑制剂包括Zaragozic酸和RPR 107393。
[0407] 因此，在一个实施方案中，在角鲨烯合酶抑制剂的存在下进行上文所定义之方法的培养步骤。
[0408] 可以进一步对本发明的细胞进行遗传修饰以进一步增强某些关键类萜前体的产生。在一个实施方案中，另外对所述细胞进行遗传修饰以提高一种或更多种选自以下之酶的活性和/或过表达一种或更多种选自以下的酶：磷酸甲羟戊酸激酶(EC2.7.4.2)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC4.1.1.33)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(EC1.17.7.1)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC1.17.1.2)、异戊二烯基-二磷酸Δ-异构酶1(EC5.3.3.2)、短链Z-异戊二烯基二磷酸合酶(EC2.5.1.68)、二甲基烯丙基转移酶
(EC2.5.1.1)、香叶基转移酶(EC2.5.1.10)以及香叶基香叶基焦磷酸合成酶(EC2.5.1.29)。
(EC2.5.1.1)、香叶基转移酶(EC2.5.1.10)以及香叶基香叶基焦磷酸合成酶(EC2.5.1.29)。
[0409] 如上文所述，在本发明的一个实施方案中，微生物细胞包含编码如上所述的角鲨烯合酶的核酸和编码GGPPS的异源核酸二者.这样的微生物细胞特别可用于制备GGPP以及类萜，其中GGPP在其生物合成中是中间体。
[0410] 因此，在一个方面中，本发明涉及用于制备GGPP的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0411] a.提供包含核酸序列的微生物细胞，所述核酸含有：
[0412] i)启动子序列，其有效连接至
[0413] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0414] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0415] iv)转录终止信号；
[0416] 其中，所述异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0417] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS之表达的核酸序列有效连接；
[0418] b.培养a的微生物细胞；
[0419] c.回收GGPP。
[0420] 在另一个方面中，本发明涉及用于制备类萜的方法，其中GGPP是生物合成途径中的中间体，其中所述方法包括以下步骤：
[0421] a.提供微生物细胞，其中所述微生物细胞包含核酸序列，所述核酸包含：
[0422] i)启动子序列，其有效连接至
[0423] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0424] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0425] iv)转录终止信号；
[0426] 其中，所述异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0427] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS之表达的核酸序列有效连接；
[0428] b.培养a的微生物细胞；和
[0429] c.回收类萜，
[0430] 其中所述类萜可以是在上文的“类萜”部分中描述的任何以GGPP作为其生物合成之中间体的类萜；所述微生物细胞可以是在上文的“细胞”部分中描述的任意微生物细胞；所述启动子可以是任何启动子，例如在上文的“启动子”部分中描述的任意启动子；所述异源插入序列可以是在上文的“异源插入序列”部分中描述的任意异源插入序列；所述开放阅读框编码角鲨烯合酶，其可以是在上文的“角鲨烯合酶”部分中描述的任意角鲨烯合酶；所述GGPPS可以是在上文的“香叶基香叶基焦磷酸合酶”部分中描述的任意GGPPS。
[0431] 在该实施方案中，所述微生物细胞还可以任选地含有一个或更多个额外的编码参与所述萜类之生物合成途径的一个或更多个酶的异源核酸.
[0432] 在一个特定方面中，本发明涉及用于制备甜菊醇的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0433] a.提供微生物细胞，其中所述微生物细胞包含核酸序列，所述核酸包含：
[0434] i)启动子序列，其有效连接至
[0435] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0436] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0437] iv)转录终止信号；
[0438] 其中所述异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0439] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接；
[0440] b.培养a的微生物细胞；
[0441] c.回收甜菊醇，
[0442] 其中所述微生物细胞可以是在上文的“细胞”部分中描述的任意微生物细胞；所述启动子可以是任何启动子，例如在上文的“启动子”部分中描述的任意启动子；所述异源插入序列可以是在上文的“异源插入序列”部分中描述的任意异源插入序列；所述开放阅读框编码角鲨烯合酶，其可以是在上文的“角鲨烯合酶”部分中描述的任意角鲨烯合酶；所述GGPPS可以是在上文的“香叶基香叶基焦磷酸合酶”部分中描述的任意GGPPS。
[0443] 在该实施方案中，所述微生物细胞还可以任选地含有一个或更多个额外的异源核酸，其编码参与甜菊醇之生物合成途径的一个或更多个酶。
[0444] 在另一个方面中，本发明涉及用于制备类萜的方法，其中GGPP是生物合成途径的中间体，其中所述方法包括以下步骤：
[0445] a.提供微生物细胞，其中所述微生物细胞包含核酸序列，所述核酸包含：
[0446] i)启动子序列，其有效连接至
[0447] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0448] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0449] iv)转录终止信号；
[0450] 其中所述异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0451] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接；
[0452] 并且其中所述微生物细胞还包含编码HMCR的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导HMCR表达的核酸序列有效连接；
[0453] b.培养a的微生物细胞；
[0454] c.回收所述类萜，
[0455] 其中所述类萜是在上文的“类萜”部分中描述的任何以GGPP作为其生物合成之中间体的类萜；所述微生物细胞可以是在上文的“细胞”部分中描述的任意微生物细胞；所述启动子可以是任何启动子，例如在上文的“启动子”部分中描述的任意启动子；所述异源插入序列可以是在上文的“异源插入序列”部分中描述的任意异源插入序列；所述开放阅读框编码角鲨烯合酶，其可以是在上文的“角鲨烯合酶”部分中描述的任意角鲨烯合酶；所述GGPPS可以是在上文的“香叶基香叶基焦磷酸合酶”部分中描述的任意GGPPS；并且所述HMCR可以是在上文的“HMCR”部分中描述的任意HMCR。
[0456] 在该实施方案中，所述微生物细胞还可以任选地含有一个或更多个额外的异源核酸，其编码一个或更多个参与所述类萜之生物合成途径的酶。
[0457] 在一个特定方面中，本发明涉及用于制备甜菊醇的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0458] a.提供微生物细胞，其中所述微生物细胞包含核酸序列，所述核酸包含：
[0459] i)启动子序列，其有效连接至
[0460] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0461] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0462] iv)转录终止信号；
[0463] 其中所述异源插入序列和开放阅读框如上文所定义，
[0464] 其中所述微生物细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，该异源核酸与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接；
[0465] b.培养a的微生物细胞；
[0466] c.回收甜菊醇，
[0467] 其中所述微生物细胞可以是在上文的“细胞”部分中描述的任意微生物细胞；所述启动子可以是任何启动子，例如在上文的“启动子”部分中描述的任意启动子；所述异源插入序列可以是在上文的“异源插入序列”部分中描述的任意异源插入序列；所述开放阅读框编码角鲨烯合酶，其可以是在上文的“角鲨烯合酶”部分中描述的任意角鲨烯合酶；所述GGPPS可以是在上文的“香叶基香叶基焦磷酸合酶”部分中描述的任意GGPPS；并且所述HMCR可以是在上文的“HMCR”部分中描述的任意HMCR.
[0468] 在该实施方案中，所述微生物细胞还可以任选地包含一个或更多个额外的异源核酸，其编码一个或更多个参与甜菊醇之生物合成途径的酶.
[0469] 在一个实施方案中，另外对所述细胞进行遗传修饰以提高一种或更多种选自以下的酶的活性和/或过表达一种或更多种选自以下的酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA还原酶或其催化结构域、HMG-CoA合酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶以及1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶以及法尼基焦磷酸合酶。
[0470] 在本发明方法的一个实施方案中，所述细胞在ERG9开放阅读框中包含突变。
[0471] 在本发明方法的另一个实施方案中，所述细胞包含ERG9[Δ]：：HIS3缺失/插入等位基因。
[0472] 在另一个实施方案中，在本发明的方法中回收化合物的步骤还包括纯化所述来自细胞培养基的化合物。
[0473] D.功能同源物
[0474] 上文中描述的多肽的功能同源物也适合用于在重组宿主中产生甜菊醇或甜菊醇糖苷类。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性，并且执行参考多肽的一项或更多项生化或生理功能的多肽。功能同源物和参考多肽可以是天然多肽，并且它们的序列相似性可能是由于趋同或趋异进化事件。因此，功能同源物在文献中有时被称为同源物或直系同源物或旁系同源物。天然功能同源物的变体，例如由野生型编码序列的突变体编码的多肽可能自身就是功能同源物。还可以通过对多肽的编码序列进行定点突变，或者通过将来自不同天然多肽的编码序列的结构域合并(“结构域互换(domain swapping）”)来生成功能同源物。用于修饰编码本文所述的功能性UGT多肽之基因的技术是已知的，包括尤其是定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可以用于以期望的方式提高多肽的比活、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或者修饰多肽：多肽相互作用.认为这样的经修饰多肽是功能同源物。术语“功能同源物”有时用于指编码功能上同源的多肽的核酸。
[0475] 通过对核苷酸和多肽序列比对的分析可以鉴定功能同源物.例如，对核苷酸或多肽序列数据库进行查询可以鉴定出甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及用GGPPS、CDPS、KS、KO或KAH氨基酸序列作为参考序列，对非冗余数据库进行的BLAST-Reciprocal BLAST或PS1-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推测出的。数据库中那些具有大于40％序列同一性的多肽是进一步评估是否适合作为甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成多肽的候选分子。氨基酸序列相似性允许保守性氨基酸替换，例如一个疏水残基替换成另一个，或者一个极性残基替换成另一个。如果期望的话，可以对这类候选分子进行人工检查，以便缩小需要进一步评估的候选分子的数量。人工检查可以通过选择似乎具有甜菊醇生物合成多肽中存在的结构域(例如保守的功能结构域)的那些候选分子来进行。
[0476] 保守区的鉴定可以通过找出甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成多肽的氨基酸一级序列中那些重复序列、形成一些二级结构(例如螺旋和β折叠)、形成带正电或负电的结构域、或者代表蛋白质基序或结构域的区域。参见例如，在互联网上描述多种蛋白质基序和结构域之共有序列的Pfam网站，位于互联网sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janeIia.org/。Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；以及Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)中描述了Pfam数据库中包含的信息。保守区还可以通过将来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列进行比对来确定。密切相关的物种优选来自相同的家族。在一些实施方案中，来自两个不同物种的序列的比对是足够的。
[0477] 通常来说，显示出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可以用于鉴定保守区.相关多肽的保守区显示出至少45％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区显示出至少
92％、94％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
92％、94％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
[0478] 例如，适合用于在重组宿主中产生甜菊醇糖苷类的多肽包括EUGT11、UGT91D2e、UGT91D2m、UGT85C和UGT76G的功能同源物。这样的同源物与EUGT11(SEQ ID NO：152)、UGT91D2e(SEQ ID NO：5)、UGT91D2m(SEQ ID NO：10)、UGT85C(SEQ ID NO：3)或UGT76G(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列具有大于90％(例如，至少95％或99％)的序列同一性。EUGT11、UGT91D2、UGT85C和UGT76G多肽的变体在氨基酸一级序列中通常有10个或更少的氨基酸替换，例如7个或更少的氨基酸替换、5个或保守的氨基酸替换、或者1至5个替换。但在一些实施方案中，EUGT11、UGT91D2、UGT85C和UGT76G多肽的变体可以含有10个或更多个氨基酸替换(例如10、15、20、25、30、35、10-20、10-35、20-30或25-35个氨基酸替换)。替换可以是保守的，或者在一些实施方案中，是非保守的。UGT91D2e多肽中的非保守性变化的非限制性实例包括甘氨酸替换成精氨酸和色氨酸替换成精氨酸。UGT76G多肽中的非保守性替换的非限制性实例包括缬氨酸替换成谷氨酸、甘氨酸替换成谷氨酸、谷氨酰胺替换成丙氨酸以及丝氨酸替换成脯氨酸。UGT85C多肽中的变化的非限制性实例包括组氨酸替换成天冬氨酸、脯氨酸替换成丝氨酸、赖氨酸替换成苏氨酸以及苏氨酸替换成精氨酸。
[0479] 在一些实施方案中，有用的UGT91D2同源物可以在预测的环以外的多肽区域含有氨基酸替换(例如，保守性氨基酸替换)，例如SEQ ID NO：5中的第20-26、39-43、88-95、121-124、142-158、185-198和203-214位残基是预测的N末端结构域中的环，第381-386位残基是预测的C末端结构域中的环。例如，有用的UGT91D2同源物可以在SEQ ID NO：5的第1-19、27-
38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473位残基处包含至少一个氨基酸替换。在一些实施方案中，UGT91D2同源物可以在SEQ ID NO：5中选自第30、93、99、
122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427以及438位残基的一个或更多个残基处含有氨基酸替换。例如，UGT91D2功能同源物可以在SEQ ID NO：5的第206、207和343位的一个或更多个残基处含有氨基酸替换，例如第206位残基处的精氨酸、第207位处的半胱氨酸和第343位处的精氨酸。参见SEQ ID NO：95。UGT91D2的其他功能同源物可以含有下述中的一个或更多个：SEQ ID NO：5的第30位残基处的酪氨酸或苯丙氨酸、第
93位残基处的脯氨酸或谷氨酰胺、第99位残基处的丝氨酸或缬氨酸、第122位残基处的酪氨酸或苯丙氨酸、第140位残基处的组氨酸或酪氨酸、第142位残基处的丝氨酸或半胱氨酸、第
148位残基处的丙氨酸或苏氨酸、第152位残基处的甲硫氨酸、第153位残基处的丙氨酸、第
156位残基处的丙氨酸或丝氨酸、第162位残基处的甘氨酸、第195位残基处的亮氨酸或甲硫氨酸、第196位残基处的谷氨酸、第199位残基处的赖氨酸或谷氨酸、第211位残基处的亮氨酸或甲硫氨酸、第213位残基处的亮氨酸、第221位残基处的丝氨酸或苯丙氨酸、第253位处的缬氨酸或异亮氨酸、第286位处的缬氨酸或丙氨酸、第427位处的赖氨酸或天冬酰胺、第
438位残基处的丙氨酸以及第462位残基处的丙氨酸或苏氨酸。在另一个实施方案中，
UGT91D2功能同源物含有第211位残基处的甲硫氨酸和第286位残基处的丙氨酸。
38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473位残基处包含至少一个氨基酸替换。在一些实施方案中，UGT91D2同源物可以在SEQ ID NO：5中选自第30、93、99、
122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427以及438位残基的一个或更多个残基处含有氨基酸替换。例如，UGT91D2功能同源物可以在SEQ ID NO：5的第206、207和343位的一个或更多个残基处含有氨基酸替换，例如第206位残基处的精氨酸、第207位处的半胱氨酸和第343位处的精氨酸。参见SEQ ID NO：95。UGT91D2的其他功能同源物可以含有下述中的一个或更多个：SEQ ID NO：5的第30位残基处的酪氨酸或苯丙氨酸、第
93位残基处的脯氨酸或谷氨酰胺、第99位残基处的丝氨酸或缬氨酸、第122位残基处的酪氨酸或苯丙氨酸、第140位残基处的组氨酸或酪氨酸、第142位残基处的丝氨酸或半胱氨酸、第
148位残基处的丙氨酸或苏氨酸、第152位残基处的甲硫氨酸、第153位残基处的丙氨酸、第
156位残基处的丙氨酸或丝氨酸、第162位残基处的甘氨酸、第195位残基处的亮氨酸或甲硫氨酸、第196位残基处的谷氨酸、第199位残基处的赖氨酸或谷氨酸、第211位残基处的亮氨酸或甲硫氨酸、第213位残基处的亮氨酸、第221位残基处的丝氨酸或苯丙氨酸、第253位处的缬氨酸或异亮氨酸、第286位处的缬氨酸或丙氨酸、第427位处的赖氨酸或天冬酰胺、第
438位残基处的丙氨酸以及第462位残基处的丙氨酸或苏氨酸。在另一个实施方案中，
UGT91D2功能同源物含有第211位残基处的甲硫氨酸和第286位残基处的丙氨酸。
[0480] 在一些实施方案中，有用的UGT85C同源物可以含有位于SEQ ID NO：3的第9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、
418、420、440、441、444和471位残基处的一个或更多个氨基酸替换。有用的UGT85C同源物的非限制性实例包括这样的多肽，所述多肽含有(相对SEQ ID NO：3)位于以下的替换：第65位残基(例如，第65位残基处的丝氨酸)；第65位残基与第15(第15位残基处的亮氨酸)、270(例如，第270位残基处的甲硫氨酸、精氨酸或丙氨酸)、418(例如，第418位残基处的缬氨酸)、
440(例如，第440位残基处的天冬氨酸)或441(例如，第441位残基处的天冬酰胺)位残基组合；位于第13(例如，第13位残基处的苯丙氨酸)、15、60(例如，第60位残基处的天冬氨酸)、
270、289(例如，位于第289位残基处的组氨酸)和418位残基；位于第13、60和270位残基处的替换；位于第60和87(例如，第87位残基处的苯丙氨酸)位残基处的替换；位于第65、71(例如，第71位残基处的谷氨酰胺)、220(例如，第220位残基处的甲硫氨酸)、243(例如，第243位残基处的色氨酸)和270位处的替换；位于第65、71、220、243、270和441位残基处的替换；位于第65、71、220、389(例如，第389位残基处的缬氨酸)和394(例如，第394位残基处的缬氨酸)位残基处的替换；位于第65、71、270和289位残基处的替换；位于第220、243、270和334(例如，第334位残基处的丝氨酸)位残基处的替换；或者位于第270和289位残基处的替换.以下氨基酸突变不导致85C2多肽活性的损失：v13F、F15L、H60D、A65S、E71Q、I87F、K220T、R243W、T270M、T270R、Q289H、L334S、A389V、I394V、P397S、E418V、G440D以及H441N。在活性克隆中看到的其他突变包括K9E、K10R、Q21H、M27V、L91P、Y298C、K350T、H368R、G420R、L431P、R444G以及M471T。在一些实施方案中，UGT85C2包含位于第65(例如，丝氨酸)、71(谷氨酰胺)、270(甲硫氨酸)、289(组氨酸)以及389(缬氨酸)位的替换。
418、420、440、441、444和471位残基处的一个或更多个氨基酸替换。有用的UGT85C同源物的非限制性实例包括这样的多肽，所述多肽含有(相对SEQ ID NO：3)位于以下的替换：第65位残基(例如，第65位残基处的丝氨酸)；第65位残基与第15(第15位残基处的亮氨酸)、270(例如，第270位残基处的甲硫氨酸、精氨酸或丙氨酸)、418(例如，第418位残基处的缬氨酸)、
440(例如，第440位残基处的天冬氨酸)或441(例如，第441位残基处的天冬酰胺)位残基组合；位于第13(例如，第13位残基处的苯丙氨酸)、15、60(例如，第60位残基处的天冬氨酸)、
270、289(例如，位于第289位残基处的组氨酸)和418位残基；位于第13、60和270位残基处的替换；位于第60和87(例如，第87位残基处的苯丙氨酸)位残基处的替换；位于第65、71(例如，第71位残基处的谷氨酰胺)、220(例如，第220位残基处的甲硫氨酸)、243(例如，第243位残基处的色氨酸)和270位处的替换；位于第65、71、220、243、270和441位残基处的替换；位于第65、71、220、389(例如，第389位残基处的缬氨酸)和394(例如，第394位残基处的缬氨酸)位残基处的替换；位于第65、71、270和289位残基处的替换；位于第220、243、270和334(例如，第334位残基处的丝氨酸)位残基处的替换；或者位于第270和289位残基处的替换.以下氨基酸突变不导致85C2多肽活性的损失：v13F、F15L、H60D、A65S、E71Q、I87F、K220T、R243W、T270M、T270R、Q289H、L334S、A389V、I394V、P397S、E418V、G440D以及H441N。在活性克隆中看到的其他突变包括K9E、K10R、Q21H、M27V、L91P、Y298C、K350T、H368R、G420R、L431P、R444G以及M471T。在一些实施方案中，UGT85C2包含位于第65(例如，丝氨酸)、71(谷氨酰胺)、270(甲硫氨酸)、289(组氨酸)以及389(缬氨酸)位的替换。
[0481] SEQ ID NO：90、88、94和92中分别给出了甜叶菊UGT 74G1、76G1和91D2e的氨基酸序列(其含有人MDM2蛋白的前158个氨基酸的N末端符合读框的融合)和甜叶菊UGT85C2(其含有PMI合成肽的4条重复序列之N末端符合读框的融合，4X TSFAEYWNLLSP，SEQ ID NO：86)的氨基酸序列；编码融合蛋白的核苷酸序列参见SEQ ID NO：89、92、93和95。
[0482] 在一些实施方案中，有用的UGT76G同源物可以含有位于SEQ ID NO：7的第29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、
207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处的一个或更多个氨基酸替换。有用的UGT76G同源物的非限制性实例包括这样的多肽，所述多肽含有(相对SEQ ID NO：
7)位于以下的替换：第74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、
200、203、204、205、206、207、208和291位残基；第74、87、91、116、123、125、126、130、145、
192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285以及
291位残基；或者第74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、
203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基。参见表9。
207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基处的一个或更多个氨基酸替换。有用的UGT76G同源物的非限制性实例包括这样的多肽，所述多肽含有(相对SEQ ID NO：
7)位于以下的替换：第74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、
200、203、204、205、206、207、208和291位残基；第74、87、91、116、123、125、126、130、145、
192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285以及
291位残基；或者第74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、
203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331以及346位残基。参见表9。
[0483] 表9
[0484]
[0485] 改造例如EUGT11或UGT91D2e的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于定点/推理性诱变方法、随机定向进化方法和组合方法，其中在酶的活性位点附近进行随机诱变/饱和技术。例如参见Sarah A.Osmani等.Phytochemistry 70(2009)325-347.
[0486] 候选序列的长度通常是参考序列长度的80％至200％，例如参考序列长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、
140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。功能同源物多肽的长度通常是参考序列长度的95％至105％，例如参考序列长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、
110％、115％或120％，或者期间的任意范围。任一种候选核酸或多肽相对参考核酸或多肽的同一性百分比可以按照如下来确定。使用计算机程序ClustalW(1.83版本，缺省参数)将参考序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)与一条或更多条候选序列进行比对，该程序使核酸或多肽序列能够在全长上进行比对(全局比对)。Chenna等.，Nucl.Acids Res.，31(13)：
3497-500(2003)。
140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。功能同源物多肽的长度通常是参考序列长度的95％至105％，例如参考序列长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、
110％、115％或120％，或者期间的任意范围。任一种候选核酸或多肽相对参考核酸或多肽的同一性百分比可以按照如下来确定。使用计算机程序ClustalW(1.83版本，缺省参数)将参考序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)与一条或更多条候选序列进行比对，该程序使核酸或多肽序列能够在全长上进行比对(全局比对)。Chenna等.，Nucl.Acids Res.，31(13)：
3497-500(2003)。
[0487] ClustalW计算参考序列与一条或更多条候选序列之间的最佳匹配，并将它们对位排列，从而可以确定同一性、相似性和差异。可以向参考序列、候选序列或者两者中插入一个或更多个残基缺口以实现序列对位排列的最大化。对于核酸序列的快速逐对比对，使用以下缺省参数：序列长度：2；窗口大小：4；打分方法：百分比；top diagonals的数量：4；以及空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位设置罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0以及加权转换：是。对于蛋白质序列的快速逐对比对，使用以下参数：序列长度：1；窗口大小：5；打分方法：百分比；top diagonals的数量：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：加权矩阵：Blosum；空位设置罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg以及Lys；残基特异性空位罚分：开。ClustalW的输出是反映序列之间的关系的序列比对。ClustalW可以在例如Baylor College of MedicineSearch Launcher互联网站(searchlauncher，bcm.tmc.edu/mult1-align/mult1-align.html)和European Bioinformatics Institute互联网站(eb1.ac.uk/clustalw)运行。
[0488] 为了确定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性百分比，将序列用ClustalW进行比对，比对中相同匹配的数量除以参考序列的长度，结果乘以100。注意可以将同一性百分比数值取到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到78.2。
[0489] 可以理解，功能性UGT可以包含不参与葡糖基化或者所述酶执行的其他酶促活性的额外氨基酸，因此这样的多肽可以比不含额外氨基酸的更长。例如，EUGT11多肽可以包含纯化标签(例如，HIS标签或GST标签)、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或者添加在氨基或羧基末端的分泌标签。在一些实施方案中，EUGT11多肽包含具有报告分子作用的氨基酸序列，例如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
[0490] II.甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成核酸
[0491] 编码本文所述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列，该序列与适合表达多肽之一个或更多个调控区按照有义方向有效连接。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达出多个基因产物，因此如果期望的话，可以将这些微生物在单一调控区的控制下表达多个多肽。当调控区和编码序列的位置使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区有效连接。通常来说，对于单顺反子基因，编码序列的翻译读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸。
[0492] 在许多情况下，本文所述的多肽之编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的，即编码序列是外源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其他原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况下，编码序列是宿主先天具有的被重新引入该生物的序列。先天序列(native sequence)与天然存在的序列常常可以通过与外源核酸连接的非天然序列来区分，例如重组核酸构建体中侧接先天序列的非天然调控序列。此外，稳定转化的外源核酸通常整合到发现先天序列之位点外的位点。
[0493] “调控区”是指具有影响转录或翻译的起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或迁移性之核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基本)启动子。调控区还可以包含至少一个调控元件，例如增强子序列、上游元件或者上游激活区(UAR)。通过安排调控区与编码序列的位置使得调控区能够有效地调节序列的转录或翻译，从而调控区与编码序列有效连接。例如，为了有效连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游的1到约50个核苷酸。但调控区也可能被安排在翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸，或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。
[0494] 对要包含的调控区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平，以及在某些培养阶段期间优先表达。对于本领域技术人员而言，通过恰当地选择调控区和安排调控区相对编码序列的位置来调整编码序列的表达是一项常规操作。可以理解可能存在多于一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
[0495] 可以将一个或更多个基因组合在重组核酸构建体中形成“模块(modules)”，其可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷类生产的一个独立方面。在模块中组合多个基因，特别是多顺反子模块，便于在多种物种中使用所述模块.例如，可以将甜菊醇生物合成基因簇或者UGT基因簇组合在多顺反子模块中，从而使得在插入合适的调控区后，能够将模块引入众多的物种中。作为另一个实例，可以将UGT基因簇组合，使每个UGT编码序列有效连接独立的调控区从而形成UGT模块。这样的模块可以用在那些必须或者期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷类产生有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和一个或更多个选择标记用于将构建体保持在合适的物种中。
[0496] 可以理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即对于许多氨基酸，有多于一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用特定宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表格，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而实现在所述宿主中的最佳表达。SEQ ID NO：18-25、34-36、40-43、48-49、52-55、60-64和70-72以及154给出了编码用于甜菊醇和甜菊醇糖苷类生物合成的某些酶的核苷酸序列，经过修饰后在酵母中的表达提高。作为分离的核酸，这些经过修饰的序列可以作为纯化分子存在，并且可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块.
[0497] 在一些情况下，为了将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成，期望抑制内源多肽的一个或更多个功能。例如，可能期望通过例如下调鲨烯氧化酶来下调酵母菌株中的固醇合成以便进一步提高甜菊醇或甜菊醇糖苷类产量。作为另一个实例，可能期望抑制某些内源基因产物(例如，去除次级代谢物的葡萄糖部分的糖基水解酶或如本文所述的磷酸酶)的降解功能.作为另一个实例，可以抑制参与甜菊醇糖苷类转运的膜转运蛋白的表达，从而抑制糖基化甜菊苷的分泌。这种调控可以是有益的，因为可以在微生物的培养过程中将甜菊醇糖苷类的分泌抑制期望的一段时间，从而提高收获时糖苷产物的产量。在这种情况下，可以在转化到菌株中的重组构建体中包含抑制多肽或基因产物之表达的核酸。替代地，可以利用诱变来生成期望抑制其功能的基因的突变体。
[0498] II1.宿主
[0499] A.微生物
[0500] 有许多原核细胞和真核细胞适用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、酵母菌和真菌。首先对选中用作甜菊醇或甜菊醇糖苷类生产菌株的种类和菌株进行分析，以确定哪些生产基因对于该菌株而言是内源的，哪些基因不存在。将菌株中不含有其内源对应物的那些基因装配在一个或更多个重组构建体中，然后转化到菌株中以提供缺少的功能.
[0501] 示例性原核物种和真核物种在下文中有更详细的描述。但可以理解其他种类可能也是合适的。例如，合适的种类可能属于选自以下的属：蘑菇属(Agaricus)、曲霉属、芽孢杆菌属、假丝酵母属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、镰孢菌/赤霉属、克鲁维酵母(Kluyveromyce)属、硫磺菌(Laetiporus)属、香燕(Lentinus)属、发夫酵母(Phaffia)属、平革菌(Phanerochaete)属、毕赤氏酵母属(Pichia)、中欧葫芦藓(Physcomitrella)属、红酵母(Rhodoturula)属、糖酵母属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、痂圆孢(Sphaceloma)属、发夫酵母(Xanthophyllomyces)属以及耶氏酵母。来自这些属的示例性种包括虎皮香燕(Lentinus tigrinus)、硫磺菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌
(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、小立碗藓、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)32、Rhodoturula mucilaginosa、红发夫酵母(Phaffia
rhodozyma)UBV-AX、红发夫酵母(XanthophyIlomyces dendrorhous)、Fusarium
fujikuroi/腾仓赤霉、产朊假丝酵母(Candida utilis)和解脂亚罗酵母。在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉或者酿酒酵母。在一些实施方案中，微生物可以是原核生物，例如大肠杆菌、类球红细菌
(Rhodobacter sphaeroides)或者荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。可以理解，某些微生物可以用于以高通量的方式对目的基因进行筛选和测试，而其他具有期望的产率或生长特性之微生物可以用于大规模生产甜菊醇糖苷类.
(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、小立碗藓、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)32、Rhodoturula mucilaginosa、红发夫酵母(Phaffia
rhodozyma)UBV-AX、红发夫酵母(XanthophyIlomyces dendrorhous)、Fusarium
fujikuroi/腾仓赤霉、产朊假丝酵母(Candida utilis)和解脂亚罗酵母。在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉或者酿酒酵母。在一些实施方案中，微生物可以是原核生物，例如大肠杆菌、类球红细菌
(Rhodobacter sphaeroides)或者荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。可以理解，某些微生物可以用于以高通量的方式对目的基因进行筛选和测试，而其他具有期望的产率或生长特性之微生物可以用于大规模生产甜菊醇糖苷类.
[0502] 酿酒酵母
[0503] 酿酒酵母是合成生物学中广泛使用的经典生物，并且可以用作重组微生物平台。酿酒酵母拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息，因此能够推理性设计各种模块来提高产物的产量。制备重组微生物的方法是已知的。
[0504] 利用多种已知启动子中的任一种都可以在酵母中表达甜菊醇生物合成基因簇。过量产生萜的菌株是已知的，并且可以用于提高香叶基香叶基焦磷酸的量，以供甜菊醇和甜菊醇糖苷类的生产。
[0505] 曲霉属物种
[0506] 曲霉属的种例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和酱油曲霉(A.sojae)是广泛用于食品生产的微生物，也可以用作重组微生物平台。构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组核苷酸序列是可得的，因此能够推理性设计和改造内源途径以增加流量和提高产物产量。已经开发了曲霉属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白组学研究.黑曲霉被培养用于工业生产多种食物成分，例如柠檬酸和葡糖酸，因此例如黑曲霉的物种通常适合食品成分例如甜菊醇和甜菊醇糖苷类的生产。
[0507] 大肠杆菌
[0508] 另一种合成生物学中广泛使用的平台生物大肠杆菌也可以用作重组微生物平台.与酵母类似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型以及其他信息，因此能够推理性设计各种模块来增强产物的产量。与以上描述的用于酵母属的方法类似的方法可以用来制备重组大肠杆菌微生物。
[0509] 蘑菇属、赤霉属和平革菌属物种
[0510] 蘑菇、赤霉和平革菌已知在培养物中产生大量的赤霉素，因此可能是有用的.因此用于大量生产甜菊醇和甜菊醇糖苷类的萜烯前体已由内源基因产生。所以可以将含有甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的种，而无需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。
[0511] Arxula adeninivorans(Blastobotrys adeninivorans)
[0512] Arxula adeninivorans是具有特殊生物化学特征的二态酵母(在高至42℃的温度下，其生长为出芽酵母例如面包酵母，在高于该阈值，其以丝状生长)。Arxula adeninivorans可以在广泛范围的底物上生长，并且可以吸收硝酸盐.其已成功地应用于能够产生天然塑料之菌株的生产或者用于环境样品中雌激素之生物传感器的开发.
[0513] 解脂亚罗酵母
[0514] 解脂亚罗酵母是可以在广泛范围的底物上生长的二态酵母(参见Arxula adeninivorans)。其具有高的工业应用的潜力，但目前尚没有市售的重组产物。
[0515] 红细菌属物种
[0516] 红细菌(Rhodobacter)可以用作重组微生物平台。与大肠杆菌类似，该菌拥有可供使用的突变体文库以及合适的质粒载体，使得可以推理性设计各种模块以增加产物产量。红细菌的膜状细菌种类的类异戊二烯途径经过基因工程改造，类胡萝卜素和CoQ10的产量得到了提高。参见美国专利公开No.20050003474和20040078846。与以上描述的用于大肠杆菌的方法相似的方法可以用于制备重组红细菌微生物。
[0517] 博伊丁假丝酵母
[0518] 博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(其可以在甲醇上生长)。如同其他甲基营养型物种例如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母，博伊丁假丝酵母为异源蛋白质的产生提供优良的平台。已报道了多克范围的外源分泌蛋白的产量。计算方法IPRO近来预测了在实验上由NADPH至NADH改变(switch)博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性的突变。
[0519] 多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母，Pichia angusta)
[0520] 多形汉逊酵母是另一种甲基营养型酵母(参见，博伊丁假丝酵母)。其还可以在广泛范围的其他底物上生长；其耐热并且可以吸收硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母，Kluyveromyces lactis)。其已应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和干扰素α-2a用于治疗丙型肝炎，还用于一系列技术酶。
[0521] 乳酸克鲁维酵母
[0522] 乳酸克鲁维酵母是常规地用于生产kefir的酵母。其可以在若干种糖上生长，最重要是在存在于牛奶和乳清中的乳糖上生长。其已成功地应用于生产凝乳酶(通常存在于牛的胃中的酶)等以生产奶酪。生产以40,000L的规模在发酵罐中进行。
[0523] 巴斯德毕赤酵母
[0524] 巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。其为外源蛋白质的产生提供高效平台。平台元件可以作为试剂盒获得并且在世界范围内在学术界中适用于产生蛋白质。可以对菌株进行改造使得可以产生复杂的人N-多糖(酵母多糖是类似的但不等同于在人中见到的那些)。
[0525] 小立碗藓属
[0526] 当在混悬培养基中培养小立碗藓时，小立碗藓具有与酵母或其他真菌培养物类似的特征。该属成为用于产生在其他细胞类型中难以产生的植物次级代谢物的重要细胞类型。
[0527] B.植物细胞或植物
[0528] 在一些实施方案中，本文描述的核酸和多肽被引入植物或植物细胞以提高总的甜菊醇糖苷类产量，或者相对其他甜菊醇糖苷类富集特定甜菊醇糖苷类的生产。因此，宿主可以是包含至少一个本文所述的重组基因的植物或植物细胞.植物或植物细胞可以通过将重组基因整合到它们的基因组中而被转化，即可以被稳定地转化。被稳定转化的细胞通常在每次细胞分裂时可以保持引入的核酸.植物或植物细胞还可以被瞬时转化，使得重组基因不被整合到其基因组中。被瞬时转化的细胞通常在每次细胞分裂时丢失全部或一些部分的所引入的核酸，使得在足够数量的细胞分裂后，子代细胞中不能检测到所引入的核酸。被瞬时转化和稳定转化的转基因植物和植物细胞都可以用于本文描述的方法中。
[0529] 本文所述的方法中使用的转基因植物细胞可以构成整个植物的部分或全部。可以将这样的植物以适合所述物种的方式在培养室、温室或田野的条件下培养。可以根据具体目的来培育转基因植物，例如将重组核酸引入其他系、将重组核酸转移到其他物种，或者用于进一步选择其他期望的性状。或者，可以对那些适合这样的技术的转基因植物进行营养繁殖。本文中使用的转基因植物也指初始转基因植物的后代，前提是所述后代继承了转基因.由转基因植物产生的种子可以生长然后自交(或者异型杂交和自交)从而获得对于核酸构建体纯化的种子。
[0530] 转基因植物可以在混悬培养物、或组织或器官培养物中培养。为了本发明的目的，可以使用固体和/或液体组织培养技术。当使用固体培养基时，可以将转基因植物细胞直接放置到培养基上或者可以放置到过滤器上，然后将过滤器与培养基接触放置。当使用液体培养基时，可以将转基因植物细胞放置到助浮装置上，例如与液体培养基接触的多孔膜。
[0531] 当使用瞬时转化的植物细胞时，可以在转化过程中包含编码具有报告分子活性之报告分子多肽的报告分子序列，并在转化后的合适时机进行报告分子活性或表达的测定。进行测定的合适时机通常是转化后约1至21天，例如约1至14天、约1至7天或者约1至3天。对于在不同物种中的快速分析而言，或者为了确认异源多肽在那些以前不曾被确认可以表达该多肽的特定受体细胞中有表达，使用瞬时法特别方便。
[0532] 将核酸引入单子叶和双子叶植物的技术是本领域已知的，包括但不限于农杆菌介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和粒子枪转化，美国专利No.5,538,880；5,204,253；6,329,571；以及6,013,863。如果使用细胞或培养组织作为转化的受体组织，则在期望时，可以通过本领域技术人员已知的技术，由被转化的培养物再生植物。
[0533] 可以对转基因植物群进行筛选和/或选择群体中那些具有了由于转基因的表达而被赋予的性状或表型的成员。例如，可以筛选单一转化事件的子代群体中那些具有甜菊醇或甜菊醇糖苷类生物合成多肽或核酸之期望表达水平的植物。可以采用物理和生化方法来鉴定表达水平。这些方法包括用于检测多核苷酸的Southern分析或者PCR扩增；用于检测RNA转录物的Northern印迹、SIRNase保护法、引物延伸或者RT-PCR扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定法；以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术例如原位杂交、酶染色和免疫染色也可以用于检测多肽和/或核酸的存在与否或者表达情况。所有提及的这些技术的实施方法都是已知的。或者，可以对包含独立转化事件的植物群体进行筛选以得到那些具有期望性状(例如生产甜菊醇糖苷类或者调控地生物合成甜菊醇糖苷类)的植物。选择和/或筛选可以在一个或更多个世代和/或多于一个地理位置进行。在一些情况下，可以将转基因植物在这样的条件下生长和选择，所述条件能够在转基因植物中诱导期望的表型或者以其他方式对产生期望的表型是必须的.此外，可以在植物预期展现出表型的特定发育阶段进行选择和/或筛选。可以进行选择和/或筛选来挑选那些与缺少转基因的对照植物相比，甜菊醇糖苷类水平有显著统计学差异的转基因植物。
[0534] 本文所述的核酸、重组基因和构建体可以用于转化许多单子叶和双子叶植物和植物细胞系统。合适的单子叶植物的非限制性实例包括例如粮食作物，例如大米、黑麦、高梁、小米、小麦、玉米和大麦。植物可以是非谷类单子叶，例如芦笋、香蕉或洋葱。植物还可以是双子叶的，例如甜菊(甜叶菊)、大豆、棉花、向日葵、豌豆、天竺葵、菠菜或烟草。在一些情况下，植物可能含有产生磷酸苯酯的前体途径，例如通常在细胞质和线粒体中可见的甲羟戊酸途径。非甲羟戊酸途径更经常在植物质体中看到[Dubey等.，2003 J.Biosci.28，637-646]。本领域技术人员可以通过使用前导序列将甜菊醇糖苷类生物合成多肽的表达靶向合适的细胞器，使得甜菊醇糖苷类生物合成发生在植物细胞中期望的位置。如果期望的话，本领域技术人员将使用合适的启动子将合成引导到例如植物的叶子.如果期望的话，表达还可以发生在组织培养物中，例如愈伤组织培养物或毛状根培养物中。
[0535] 在一个实施方案中，将本文所述的一个或更多个核酸或多肽引入到甜菊(例如，甜叶菊)中，使得整体甜菊醇糖苷类生物合成提高或者整个甜菊醇糖苷类组合物选择性地富集一种或更多种特定甜菊醇糖苷类(例如，莱鲍迪苷D)。例如，可以将一个或更多个重组基因引入甜菊中，使得EUGT11酶(例如，SEQ ID NO：152或其功能同源物)单独表达或者与下述中的一个或更多个组合表达：UGT91D酶，例如UGT91D2e(例如，SEQ ID NO：5或其功能同源物)、UGT91D2m(例如SEQ ID NO：10)；UGT85C酶，例如“功能同源物”部分中所述的变体，UGT76G1酶例如“功能同源物”部分中所述的变体，或者UGT74G1酶。核酸构建体通常包含与编码UGT多肽的核酸有效连接的合适的启动子(例如35S、e35S或ssRUBISCO启动子)。核酸可以通过农杆菌介导的转化、电穿孔介导的基因转移到叶绿体，或者通过颗粒轰击引入甜菊。参见例如，Singh等，Compendium of Transgenic Crop Plants：Transgenic Sugar，Tuber and Fiber，由Chittaranjan Kole和Timothy C.Hall编著，Blackwell Publishing Ltd.(2008)，第97-115页。对于来源于甜菊叶子的愈伤组织之颗粒轰击而言，参数如下：6cm距离、1100 psi赫压力、金颗粒和一次轰击。
[0536] 甜菊植物可以按照Singh等(2008，同前)的描述通过体细胞胚发生来再生。具体地，从5至6周龄体外培养的植物取叶子节段(约1至2cm长)，在补充了B5维生素、30g蔗糖和3g Gelrite的MS培养基上孵育(近轴面朝下)。可以将2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)与6-苄基腺嘌呤(BA)、激动素(KN)或玉米素组合使用。传代培养8周后出现原胚团。在传代培养2至3周内，培养物表面会出现体细胞胚。胚可以在含有BA与2，4-D、a-萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)之组合的培养基中成熟.从愈伤组织上切除发芽并形成小苗的成熟体细胞胚。待小苗达到3至4周龄后，将苗转移到含有蛭石的盆中，在培养室中生长6至8周以适应环境然后转移到温室中。
[0537] 在一个实施方案中，甜菊醇糖苷类是在大米中产生的。利用例如农杆菌介导的转化之技术可以容易地转化大米和玉米。双元载体系统常用于农杆菌将外源基因引入单子叶植物中。参见例如，美国专利No.6,215,051和6,329,571.在双元载体系统中，一个载体含有包含目的基因(例如本文描述的UGT)的T-DNA区，另一个载体是含有vir区的非致瘤Ti质粒(disarmed Ti plasmid)。还可以使用共整合载体和可移动载体。待转化组织的类型和预处理、所用的农杆菌菌株、接种的持续时间、农杆菌引起的过度生长和坏死的预防可以由本领域技术人员容易地进行调节。可以制备未成熟的大米胚细胞，利用双元载体借助农杆菌进行转化。所用的培养基中补充了酚类化合物。或者，可以采用真空渗入在植物体内进行转化。参见例如，WO 2000037663、W02000063400和WO 2001012828。
[0538] IV.生产甜菊醇糖苷类的方法
[0539] 本文所述的重组宿主可以用于生产甜菊醇或甜菊醇糖苷类的方法中。例如，如果重组宿主是微生物，则该方法可以包括将重组微生物在甜菊醇和/或甜菊醇糖苷类生物合成基因能够得以表达的条件下培养在培养基中。重组微生物可以分批培养或者连续培养。通常来说，将重组微生物在限定的温度下在发酵罐中培养期望的一段时间。根据方法中使用的特定微生物，还可以含有并表达其他重组基因，例如异戊二烯生物合成基因和萜烯合酶，还可以存在并表达环化酶。底物和中间体(例如异戊二烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、香叶基香叶基二磷酸、贝壳杉烯和异贝壳杉烯酸)的水平可以通过从培养基中提取样品按照公开的方法分析来确定。
[0540] 重组微生物已经在培养基中培养期望的一段时间后，可以采用本领域已知的多种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或更多种甜菊醇糖苷类。在一些实施方案中，可以添加通透剂以辅助原料进入宿主并引起甜菊醇和/或一种或更多种甜菊醇糖苷类出来。如果重组宿主是植物或植物细胞，则可以采用本领域中的多种已知技术从植物组织中提取甜菊醇或甜菊醇糖苷类。例如，可以将经过培养的微生物或植物组织的粗裂解物离心，以获得上清液.然后将所得上清液加样到层析柱(例如C-18柱)中，用水洗涤来去除亲水性化合物，之后用溶剂(例如甲醇)来洗脱目的化合物。然后可以通过制备型HPLC将化合物进一步纯化。另参见WO2009/140394。
[0541] 产生的甜菊醇糖苷类(例如，莱鲍迪苷D)的量可能为约1mg/L至约1500mg/L，例如约1mg/L至约10mg/L、约3mg/L至约10mg/L、约5mg/L至约20mg/L、约10mg/L至约50mg/L、约10mg/L至约100mg/L、约25mg/L至约500mg/L、约100mg/L至约1,500mg/L，或者约200mg/L至约1,000mg/L。一般来说，培养时间越长，产物的量越大。因此，可以将重组微生物培养1天至
7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或者约5天。
7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或者约5天。
[0542] 可以理解，本文讨论的各种基因和模块可以存在于两个或更多个重组微生物中，而不是单个微生物中。当使用多种重组微生物时，可以将它们培养在混合培养物中来产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷类。例如，第一微生物可以包含一个或更多个用于产生甜菊醇的生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷类生物合成基因。或者，两个或更多个微生物可以各自培养在独立的培养基中，可以将第一培养基中的产物(例如甜菊醇)引入第二培养基中以转化为后续的中间体或者终产物(例如莱鲍迪苷A)。然后回收第二微生物或者最终的微生物所产生的产物。同样可以理解，在一些实施方案中，重组微生物的培养使用了营养源而不是培养基，利用的是发酵罐以外的系统。
[0543] 甜菊醇糖苷类在不同食品系统中不必然有等同的性能。因此期望的是有能力指导合成所选甜菊醇糖苷类组合物。本文描述的重组宿主可以产生选择性富集了特定甜菊醇糖苷类(例如，莱鲍迪苷D)并具有一致的口味的组合物。因此，本文所述的重组微生物、植物和植物细胞可以有助于生产这样的组合物，所述组合物能够适于满足给定食品所期望的甜化特性并且批次之间每种甜菊醇糖苷类的比例是一致的。本文所述的微生物不会产生甜菊提取物中存在的不需要的植物副产品。因此，本所描述的重组微生物所产生的甜菊醇糖苷类组合物与来自甜菊植物的组合物是有区别的。
[0544] V.食品
[0545] 通过本文所公开的方法获得的甜菊醇糖苷类可以用于制作食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。例如，可以将基本纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷类(例如莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷D)包含在食品中，例如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘培食品、口香糖、硬糖和软糖以及调味汁.还可以将基本纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷类包含在非食物产品中，例如医药产品、药品、膳食补充剂和营养补充剂。还可以在农业和陪伴动物业二者的动物饲料中包含基本纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷类。或者，可以通过以下来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷类的混合物：分开培养重组微生物或者培养不同的植物/植物细胞，所述重组微生物或植物/植物细胞各自产生特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷类；从每个微生物或植物/植物细胞中回收基本纯形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷类；然后将化合物组合以得到含有处于期望比例的每种化合物的混合物.本文所述的重组微生物、植物和植物细胞使得可以获得比现有甜菊产品更精确和一致的混合物。在另一种替代方法中，可以将基本纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷类与其他甜味剂一起加入食品中，所述甜味剂例如糖精、葡聚糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、蔗糖素、monatin或乙酰磺胺酸钾。可以改变甜菊醇或甜菊醇糖苷类相对其他甜味剂的重量比以实现最终食品中的满意口味。参见例如，美国专利申请No.2007/0128311。在一些实施方案中，可以将甜菊醇或甜菊醇糖苷类与调味品(例如，相橘)一起提供作为调味品的调整剂。例如，特别是对于基于碳水化合物的甜味剂，可以使用莱鲍迪苷C作为甜味增强剂或者甜味调整剂，使得可以减少食品中糖的用量.
[0546] 可以将本文所述的重组微生物、植物或植物细胞产生的组合物加入食品中。例如，可以根据甜菊醇糖苷类和食品的类型，将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物按照基于干重约20mg甜菊醇糖苷类/kg食品至约1800mg甜菊醇糖苷类/kg食品的量加入食品中。例如，可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入甜点、冷的甜品(例如冰淇淋)、奶制品(例如酸奶)或者饮料(例如碳酸饮料)中，使食品含有基于干重的最多500mg甜菊醇糖苷类/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入烘培食品(例如，饼干)中，使食品含有基于干重的最多300mg甜菊醇糖苷类/kg食物.可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入调味汁(例如，巧克力糖浆)或蔬菜制品(例如，腌菜)中，使食品含有基于干重的最多1000mg甜菊醇糖苷类/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入面包中，使食品含有基于干重的最多160mg甜菊醇糖苷类/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入硬糖或软糖中，使食品含有基于干重的最多1600mg甜菊醇糖苷类/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷类组合物加入加工过的水果制品(例如，果汁、果馅、果酱和果冻)中，使食品含有基于干重的最多1000mg甜菊醇糖苷类/kg食物。
[0547] 例如，这样的甜菊醇糖苷类组合物可以含有90％至99％莱鲍迪苷A和不可检出量的来自甜菊植物的杂质，所述组合物可以按照基于干重的25mg/kg至1600mg/kg加入食品中，例如100mg/kg至500mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、250mg/kg至1000mg/kg、50mg/kg至500mg/kg或者500mg/kg至1000mg/kg。
[0548] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是含有大于3％的莱鲍迪苷B的富含莱鲍迪苷B的组合物，并且可以加入食品中使产品中莱鲍迪苷B的量为基于干重25mg/kg至1600mg/kg，例如100mg/kg至500mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、250mg/kg至1000mg/kg、50mg/kg至500mg/kg或500mg/kg至1000mg/kg。通常来说，富含莱鲍迪苷B的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0549] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是含有大于15％的莱鲍迪苷C的富含莱鲍迪苷C的组合物，并且可以加入食品中使产品中莱鲍迪苷C的量为基于干重20mg/kg至600mg/kg，例如100mg/kg至600mg/kg、20mg/kg至100mg/kg、20mg/kg至95mg/kg、20mg/kg至250mg/kg、50mg/kg至75mg/kg或50mg/kg至95mg/kg。通常来说，富含莱鲍迪苷C的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0550] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是含有大于3％的莱鲍迪苷D的富含莱鲍迪苷D的组合物，并且可以加入食品中使产品中莱鲍迪苷D的量基于干重为25mg/kg至1600mg/kg，例如100mg/kg至500mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、250mg/kg至1000mg/kg、50mg/kg至500mg/kg或500mg/kg至1000mg/kg。通常来说，富含莱鲍迪苷D的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0551] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是大于含有3％莱鲍迪苷E的富含莱鲍迪苷E的组合物，并且可以加入食品中使产品中莱鲍迪苷E的量基于干重为25mg/kg至1600mg/kg，例如100mg/kg至500mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、250mg/kg至1000mg/kg、50mg/kg至500mg/kg或
500mg/kg至1000mg/kg。一般来说，富含莱鲍迪苷E的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
500mg/kg至1000mg/kg。一般来说，富含莱鲍迪苷E的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0552] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是含有大于4％的莱鲍迪苷F的富含莱鲍迪苷F的组合物，并且可以加入食品中使产品中莱鲍迪苷F的量基于干重为25mg/kg至1000mg/kg，例如100mg/kg至600mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、25mg/kg至95mg/kg、50mg/kg至75mg/kg或50mg/kg至95mg/kg。通常来说，富含莱鲍迪苷F的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0553] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是含有大于4％的杜尔可苷A的富含杜尔可苷A的组合物，并且可以加入食品中使产品中杜尔可苷A的量基于干重为25mg/kg至1000mg/kg，例如100mg/kg至600mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、25mg/kg至95mg/kg、50mg/kg至75mg/kg或50mg/kg至95mg/kg。通常来说，富含杜尔可苷A的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0554] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是在两个位置-13-O-葡萄糖或19-O-葡萄糖处富含木糖基化甜叶悬钩子苷的组合物。这样的组合可以含有大于4％的木糖化甜叶悬钩子苷化合物，并且可以加入食品中使产品中木糖化甜叶悬钩子苷化合物的量基于干重为25mg/kg至1000mg/kg，例如100mg/kg至600mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、25mg/kg至95mg/kg、50mg/kg至75mg/kg或50mg/kg至95mg/kg。通常来说，富含木糖化甜叶悬钩子苷的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0555] 这样的甜菊醇糖苷类组合物可以是在两个位置-13-O-葡萄糖或19-O-葡萄糖处富含鼠李糖化化合物或含有一个鼠李糖和多个葡萄糖(例如，甜菊醇13-O-1，3-二糖苷-1，2-鼠李糖苷)的组合物。这样的组合物可以含有大于4％的鼠李糖化化合物，并且可以加入食品中使产品中鼠李糖化化合物的量基于干重为25mg/kg至1000mg/kg，例如100mg/kg至600mg/kg、25mg/kg至100mg/kg、25mg/kg至95mg/kg、50mg/kg至75mg/kg或50mg/kg至95mg/kg。通常来说，富含鼠李糖化化合物的组合物含有不可检出量的来自甜菊植物的杂质。
[0556] 在一些实施方案中，将基本纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷类加入佐餐甜味剂或“代糖(cup-for-cup)”产品中。这样的产品通常用本领域技术人员已知的一种或更多种膨化剂(例如麦芽糊精)稀释到合适的甜度。可以将富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、杜尔可苷A或鼠李糖化或木糖化化合物的甜菊醇糖苷类组合物以例如基于干重10,000mg至30，000mg甜菊醇糖苷类/kg产品的量包装在小袋中供佐餐。
[0557] 在一些实施方案中，本公开涉及下述条目：
[0558] 1.重组宿主细胞，其包含核酸序列，所述核酸包含与开放阅读框有效连接的异源插入序列，其中所述异源插入序列具有通式(I)：
[0559] -X1-X2-X3-X4-X5-，
[0560] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补的至少4个连续核苷酸，
[0561] 其中X3包含零个核苷酸，或者形成发夹环的一个或更多个核苷酸，
[0562] 其中X1和X5各自独立地由零个核苷酸或者一个或更多个核苷酸组成，
[0563] 其中所述开放阅读框编码角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)。
[0564] 2.根据条目1所述的重组细胞，所述核酸以5’到3’的顺序包含启动子序列，与所述启动子序列有效连接的异源插入序列，与所述异源插入序列有效连接的开放阅读框，其中所述异源插入序列和所述开放阅读框如条目1所定义.
[0565] 3，细胞，其包含核酸序列，所述核酸序列包含：
[0566] i)启动子序列，其有效连接至
[0567] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0568] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0569] iv)转录终止信号；
[0570] 其中所述异源插入序列具有通式(I)：
[0571] -X1-X2-X3-X4-X5-，
[0572] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补并且形成发夹二级结构的至少4个连续核苷酸，并且
[0573] 其中X3包含不成对的核酸从而在X2与X4之间形成发夹环，并且
[0574] 其中X1和X5独立地和任选地包含一个或更多个核苷酸，并且
[0575] 其中开放阅读框在表达之后编码与角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)具有至少70％同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段在至少100个氨基酸重叠的范围与所述角鲨烯合酶具有至少70％序列同一性。
[0576] 4.根据条目1至3中任一项所述的细胞，其中所述异源插入序列包含10至50个核苷酸、优选10至30个核苷酸、更优选15至25个核苷酸、更优选17至22个核苷酸、更优选18至21个核苷酸、更优选18至20个核苷酸、更优选19个核苷酸。
[0577] 5.根据条目1至4中任一项所述的细胞，其中X2和X4由相同数目的核苷酸组成。
[0578] 6.根据条目1至5中任一项所述的细胞，其中所有X2由4至25个例如4至20个、例如4至15个、例如6至12个、例如8至12个、例如9至11个核苷酸组成。
[0579] 7.根据条目1至6中任一项所述的细胞，其中所有X4由4至25个例如4至20个、例如4至15个、例如6至12个、例如8至12个、例如9至11个核苷酸组成。
[0580] 8.根据条目1至7中任一项所述的细胞，其中X2由与X4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。
[0581] 9.根据条目1至8中任一项所述的细胞，其中X4由与X2的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。
[0582] 10.根据条目1至9中任一项所述的细胞，其中不存在X3，即，X3由零个核苷酸组成。
[0583] 11.根据条目1至9中任一项所述的细胞，其中X3由1至5个、例如1至3个核苷酸组成。
[0584] 12.根据条目1至11中任一项所述的细胞，其中不存在X1，即，X1由零个核苷酸组成。
[0585] 13.根据条目1至11中任一项所述的细胞，其中X1由1至25个例如1至20个、例如1至15个、例如1至10个、例如1至5个、例如1至3个核苷酸组成。
[0586] 14.根据条目1至13中任一项所述的细胞，其中不存在X5，即，X5由零个核苷酸组成。
[0587] 15.根据条目1至11中任一项所述的细胞，其中X5由1至5个、例如1至3个核苷酸组成。
[0588] 16.根据条目1至15中任一项所述的细胞，其中所述异源插入序列包含选自以下的序列：SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184.
[0589] 17.根据条目1至16中任一项所述的细胞，其中所述异源插入序列选自：SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184。
[0590] 18.根据条目1至17中任一项所述的细胞，其中所述角鲨烯合酶与选自SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：
202的角鲨烯合酶具有至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少87％、例如至少
90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
202的角鲨烯合酶具有至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少87％、例如至少
90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0591] 19.根据条目1至18中任一项所述的细胞，其中所述启动子是组成型或诱导型启动子。
[0592] 20.根据条目1至19中任一项所述的细胞，其中所述启动子选自：内源启动子、GPD1、PGK1、ADH1、ADH2、PYK1、TPI1、PDC1、TEF1、TEF2、FBA1、GAL1-10、CUP1、MET2、MET14、MET25、CYC1、GAL1-S、GAL1-L、TEF1、ADH1、CAG、CMV、人UbiC、RSV、EF-1α、SV40、Mt1、Tet-On、Tet-Off、Mo-MLV-LTR、Mx1、黄体酮、RU486以及雷帕霉素诱导型启动子。
[0593] 21.根据条目1至20中任一项所述的细胞，其中所述核酸序列还包含多腺苷酸序列。
[0594] 22.根据条目21所述的细胞，其中所述多腺苷酸序列的5’端与条目1之核酸的3’端有效连接。
[0595] 23.根据条目1至22中任一项所述的细胞，其中所述核酸序列还包含转录后调控元件。
[0596] 24.根据条目23所述的细胞，其中所述转录后调控元件是土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
[0597] 25.根据条目1至24中任一项所述的细胞，其中所述核酸包含5’端重复序列和3’端重复序列。
[0598] 26.根据条目25所述的细胞，其中所述5’端和3’端重复序列选自：反向末端重复序列[ITR]和长末端重复序列[LTR]。
[0599] 27.根据条目1至26中任一项所述的细胞，其中所述核酸序列整合在载体中.
[0600] 28.根据条目27所述的细胞，其中所述载体是表达载体。
[0601] 29.根据条目27所述的细胞，其中所述载体选自：质粒载体、粘粒、人工染色体和病毒载体。
[0602] 30.根据条目29所述的细胞，其中所述质粒载体可以在细菌、真菌和酵母菌中维持和复制。
[0603] 31.根据条目29所述的细胞，其中所述病毒载体选自：来自逆转录病毒科的载体，所述逆转录病毒科包括慢病毒、HIv、SIV、FIV、EAIV、CIV。
[0604] 32.根据条目31所述的细胞，其中所述病毒载体选自：α病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、HSV、冠状病毒、牛乳头瘤病毒、Mo-MLV以及腺相关病毒。
[0605] 33.根据条目27至32中任一项所述的细胞，其中所述载体在哺乳动物细胞中有功能。
[0606] 34.根据前述条目中任一项所述的细胞，其中所述细胞转化或转导有条目27至33中任一项所述的载体。
[0607] 35.根据条目1至34中任一项所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
[0608] 36.根据条目1至34中任一项所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
[0609] 37.根据条目35所述的细胞，其中所述细胞选自：真菌细胞例如酵母和曲霉；微藻例如小球藻(Chlorella)和原藻(Prototheca)；植物细胞；以及哺乳动物细胞，例如人细胞、猫细胞、猪细胞、猿猴细胞、犬细胞、鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞以及兔细胞.
[0610] 38.根据条目37所述的细胞，其中所述酵母选自：酿酒酵母、裂殖酵母、解脂亚罗酵母、光滑假丝酵母、棉囊阿舒氏酵母、Cyberlindnera jadinii以及白色念珠菌(Candida albicans)。
[0611] 39.根据条目37所述的细胞，其中所述细胞选自：CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、BHK细胞。
[0612] 40.根据条目36所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌、棒状杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌或链霉菌。
[0613] 41.根据条目35至40中任一项所述的细胞，其中所述原核细胞或所述真菌细胞已经过遗传修饰以表达甲羟戊酸非依赖途径之酶的至少一部分。
[0614] 42.根据条目1至41中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码GGPPS的异源核酸序列，其与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接。
[0615] 43.根据条目42所述的细胞，其中所述GGPPS选自：SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：167，以及与任意前述具有至少75％序列同一性的功能同源物。
[0616] 43.用于在细胞培养物中生产通过角鲨烯途径合成的类萜化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0617] (a)提供条目1至42中任一项所述的细胞；
[0618] (b)培养(a)所述的细胞；
[0619] (c)回收所述类萜产物化合物.
[0620] 44.用于生产衍生自类萜前体之类萜的方法，所述类萜前体选自：法尼基焦磷酸(FPP)、异戊二烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和/或香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，所述方法包括：
[0621] (a)使所述前体与所述角鲨烯合酶途径的酶相接触，
[0622] (b)回收所述类萜产物。
[0623] 45.根据条目44和45中任一项所述的方法，其中所述类萜产物选自：半萜系化合物、单萜系化合物、倍半萜系化合物、二萜系化合物、二倍半萜系化合物、三萜系化合物、四萜系化合物以及多萜系化合物。
[0624] 46.根据条目44所述的方法，其中所述类萜选自：法尼基磷酸、法尼醇、香叶基香叶基、香叶基香叶醇、异戊二烯、戊二烯醇、异戊酸、香叶基焦磷酸、桉树脑、柠檬烯、蒎烯、法尼基焦磷酸、青蒿素、红没药醇、香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、叶绿醇、紫杉醇、毛喉素、阿非迪霉素、羊毛甾醇、番茄红素以及胡萝卜素。
[0625] 47.根据条目46所述的方法，其中所述方法还包括使所述法尼基磷酸盐脱磷酸以产生法尼醇。
[0626] 48.根据条目44所述的方法，其中所述角鲨烯合酶途径的酶选自：二甲基烯丙基转移酶(EC 2.5.1.1)、异戊二烯合成酶(EC4.2.3.27)以及香叶基转移酶(EC 2.5.1.10)。
[0627] 49.用于降低功能性角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)之翻译速率的方法，所述方法包括：
[0628] (a)：提供条目1至42中任一项所述的细胞，
[0629] (b)培养(a)所述的细胞。
[0630] 50.用于减少法尼基焦磷酸周转为角鲨烯的方法，所述方法包括：
[0631] (d)提供条目1至42中任一项所述的细胞，
[0632] (e)培养(a)所述的细胞。
[0633] 51.用于增强选自以下之化合物的累积的方法：法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸以及香叶基香叶基焦磷酸，所述方法包括以下步骤：
[0634] (a)提供条目1至42中任一项所述的细胞，和
[0635] (b)培养(a)所述的细胞。
[0636] 52.根据条目51所述的方法，其还包括回收法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸或香叶基香叶基焦磷酸化合物。
[0637] 53.根据条目51和52中任一项所述的方法，其还包括回收通过角鲨烯途径合成的化合物，所述化合物衍生自所述法尼基焦磷酸、异戊二烯基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸、香叶基焦磷酸和/或香叶基香叶基焦磷酸。
[0638] 54.根据条目43至53中任一项所述的方法，其中在角鲨烯合酶抑制剂的存在下进行所述培养所述细胞的步骤。
[0639] 55.根据条目43至54中任一项所述的方法，其中还对所述细胞进行遗传修饰以增强选自以下的一种或更多种酶的活性和/或过表达选自以下的一种或更多种酶：磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(EC1.17.7.1)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC1.17.1.2)、异戊二烯基-二磷酸Δ-异构酶1(EC5.3.3.2)、短链Z-异戊二烯基二磷酸合酶(EC2.5.1.68)、二甲基烯丙基转移酶(EC2.5.1.1)、香叶基转移酶(EC2.5.1.10)以及香叶基香叶基焦磷酸合成酶(EC2.5.1.29)。
[0640] 56.根据条目43至55中任一项所述的方法，其中另外对所述细胞进行遗传修饰以增加选自以下的一种或更多种酶的活性和/或过表达选自以下的一种或更多种酶：乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA还原酶或其催化结构域、HMG-CoA合酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯基焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶以及1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶以及法尼基焦磷酸合酶。
[0641] 57.根据条目43至56中任一项所述的方法，其中所述细胞在ERG9开放阅读框中包含突变。
[0642] 58.根据条目43至57中任一项所述的方法，其中所述细胞包含ERG9[Δ]：：HIS3缺失/插入等位基因。
[0643] 59.根据条目43至58中任一项所述的方法，其中所述回收所述化合物的步骤包括从所述细胞培养基中纯化所述化合物。
[0644] VI.实施例
[0646] 1)甜菊醇糖苷类的分析
[0647] LC-MS分析的进行采用装配有 kinetex C18柱(150×2.1mm，2.6μm颗粒， 孔径)的Agilent 1200 Series HPLC系统(Agilent Technologies，
Wilmington，DE，USA)，其连接到具有加热电喷雾离子(HESI)源的TSQ Quantum Access(ThermoFisher Scientific)三重四极杆质谱。使用含有洗脱剂B(含有0.1％甲酸的MeCN)和洗脱剂A(含有0.1％甲酸的水)的流动相，通过增加梯度来进行洗脱，所述增加梯度为：
0.0至1.0分钟10-＞40％B；1.0至6.5分钟40-＞50％B；6.5至7.0分钟50-＞100％B；以及最后洗涤并再平衡。流速为0.4ml/min，柱温度为30℃。采用SIM(单离子监测Single Ion Monitoring)以正离子模式(positive mode)用下述m/z跟踪来检测甜菊醇糖苷类.
Wilmington，DE，USA)，其连接到具有加热电喷雾离子(HESI)源的TSQ Quantum Access(ThermoFisher Scientific)三重四极杆质谱。使用含有洗脱剂B(含有0.1％甲酸的MeCN)和洗脱剂A(含有0.1％甲酸的水)的流动相，通过增加梯度来进行洗脱，所述增加梯度为：
0.0至1.0分钟10-＞40％B；1.0至6.5分钟40-＞50％B；6.5至7.0分钟50-＞100％B；以及最后洗涤并再平衡。流速为0.4ml/min，柱温度为30℃。采用SIM(单离子监测Single Ion Monitoring)以正离子模式(positive mode)用下述m/z跟踪来检测甜菊醇糖苷类.
[0648]
[0649] 通过与用来自LGC标准的真正标准获得的校准曲线进行比较来定量甜菊醇糖苷类的水平。例如，通常使用0.5μM至100μM莱鲍迪苷A的标准溶液来构建校准曲线。
[0650] 2)甜菊醇和对映-异贝壳杉烯酸的分析
[0651] 在上述系统上进行甜菊醇和对映-异贝壳杉烯酸的LC-MS分析。对于分离而言，使用Thermo Science Hypersil Gold(C-18，3μm，100×2.1mm)柱，使用20mM醋酸铵水溶液作为洗脱剂A，使用乙腈作为洗脱剂B。梯度条件为：0.0至1.0分钟20-＞55％B；1.0至7.0分钟55-＞100％以及最后洗涤并再平衡。流速为0.5ml/min，柱温度为30℃。采用SIM(单离子监测)以负离子模式(negative mode)用下述m/z跟踪来检测甜菊醇和对映异贝壳杉烯酸。
[0652]
[0653]
[0654] 3)UDP-葡萄糖的HPLC鉴定
[0655] 就UDP-葡萄糖的鉴定而言，采用Agilent 1200 Series HPLC系统，和Waters XBridge BEH酰胺-2.5μm，3.0×50mm)柱。洗脱剂A是10mM醋酸铵水溶液(pH 9.0)，洗脱剂B是乙腈。梯度条件为：0.0至0.5分钟保持为95％B；0.5至4.5分钟由95％B降低至50％B；4.5至6.8分钟保持在50％B，最终再平衡为95％B。流速为0.9ml/min，柱温度为20℃。通过UV262nm吸光度来检测UDP-葡萄糖。
[0656] 通过与用市售标准品(例如，来自Sigma Aldrich)获得的校准曲线进行比较来对UDP-葡萄糖的量进行定量。
[0657] 实施例1-EUGT11的鉴定
[0658] 测试15个基因的RebA 1，2-糖基化活性。参见表10。
[0659] 表10
[0660]
[0661]
[0662] 进行这些基因的体外转录和翻译，并用RebA和UDP-葡萄糖孵育所得UGT。在孵育之后，通过LC-MS分析反应。含有EUGT11(大米，AC133334，SEQ ID NO：152)的反应混合物示出将大量的RebA转化为RebD。参见图4中的LC-MS层析图。如图4的左图所示，当将RebA用作原料时，UGT91D2e产生痕量的RebD。如图4的右图所示，当使用RebA作为原料时，EUGT11产生大量的RebD。所产生RebD之量的初始定量表明，在将RebA转化为RebD时，EUGT11的效率比UGT91D2e之效率高约30倍。
[0663] 为了进一步表征EUGT11和与UGT91D2e的定量比较，将编码EUGT11的核苷酸序列(SEQ ID NO：153，未经密码子优化，图7)克隆到两个大肠杆菌表达载体中，一个包含N-末端HIS-标签，一个包含N-末端GST-标签。使用两种系统表达EUGT11并纯化。当用UDP-葡萄糖和RebA孵育经纯化的酶时，产生了RebD。
[0664] 实施例2-EUGT11反应的鉴定
[0665] 通过体外转录和翻译产生EUGT11，并用RebD途径中的多种底物进行孵育。使用体外转录和翻译的UGT91D2e实施类似的实验。图3示出通过EUGT11和UGT91D2e进行的19-O-1，2-二糖基化反应的示意图。通过质量和期望的驻留时间单独鉴定化合物1至3。图3中示出的数字是所述获自LC-MS层析图的甜菊醇糖苷类的平均峰高度，并且虽然不是定量的，但可以用于比较两种酶的活性。EUGT11和UGT91D2e不能使用甜菊醇作为底物。两种酶能够将甜菊醇19-O-单糖苷(SMG)转化为化合物，其中在将19-SMG转化为化合物1时，EUGT11的效率比UGT91D2e的效率高约10倍。
[0666] 两种酶能够以相当的活性将甜叶悬钩子苷转化为甜菊苷，但只有EUGT11能够将甜叶悬钩子苷转化为化合物2和化合物3(RebE)。参见图5。图5的左图包含甜叶悬钩子苷转化为甜菊苷的LC-MS层析图。图5的右图包含甜叶悬钩子苷转化为甜菊苷、化合物2和化合物3(RebE)的层析图。甜叶悬钩子苷转化为化合物3需要在甜菊醇的19位和13位处的两个连续的1，2-O-糖基化。在一个实验中，UGT91D2e能够产生痕量的化合物3(RebE)，而EUGT11产生大量的化合物3.
[0667] 两种酶都能够将RebA转化为RebD。但是，在将RebA转化为RebD时，EUGT11为约30倍更佳。总之，似乎在所有反应中，EUGT11都比UGT91D2e产生更多的产物(以类似的时间、浓度、温度和酶纯度)，甜叶悬钩子苷转化为甜菊苷除外。
[0668] 实施例3-酵母中EUGT11的表达
[0669] 对编码EUGT11的核苷酸序列进行密码子优化(SEQ ID NO：154)，并且与编码全部四种UGT(UGT91D2e、UGT74G1、UGT76G1以及UGT85C2)的核酸一起转化入酵母中。通过LC-MS分析培养在包含累积的甜菊醇和甜菊醇糖苷类的培养基中的所得酵母菌株。EUGT11为RebD的产生所需。在其他实验中，用UGT91D2e、UGT74G1、UGT76G1以及UGT85C2观察到了RebD的产生。
[0670] 实施例4-UGT对19-O-1，2-二糖基化甜菊醇糖苷类的活性
[0671] 通过EUGT11产生的19-O-1，2-二糖基化甜菊醇糖苷类需要进一步糖基化以转化为RebD。进行下述实验以确定其他UGT是否使用这些中间体作为底物。
[0672] 在一个实验中，在UDP-葡萄糖的存在下，在体外通过EUGT11或UGT91D2e由19-SMG在体外产生化合物1。在煮沸样品之后，添加UGT85C2和UDP-葡萄糖。通过LC-MS分析样品，并且检测化合物2。该实验表明，UGT85C2可以使用化合物1作为底物。
[0673] 在另一个实验中，用UGT91D2e和UDP-葡萄糖孵育化合物2。通过LC-MS分析反应。UGT91D2e不能将化合物2转化为化合物3(RebE)。化合物2与EUGT11和UDP-葡萄糖孵育导致产生化合物3。UGT76G1能够使用RebE作为底物以产生RebD。
[0674] 这表明，甜菊醇糖苷类的19-O-1，2-二糖基化能够在RebD的产生期间的任何时间发生，因为下游的酶能够代谢19-O-1，2-二糖基化中间体。
[0675] 实施例5-EUGT11和UGT91D2e序列的比较
[0676] 使用FASTA算法(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：2444-2448(1998))比对EUGT11的氨基酸序列(SEQ ID NO：152，图7)与UGT91D2e的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。参见图6。EUGT11和UGT91D2e在457个氨基酸上具有42.7％同一性。
[0677] 实施例6-UGT91D2e之19-1，2-二糖基化活性的修饰
[0678] 多种UGT可得到结晶结构。一般来说，UGT的N-末端这一半主要涉及底物结合，而C-末端那一半参与结合UDP-糖供体。
[0679] 在已结晶之UGT的二级结构上对UGT91D2e的二级结构建模披露了二级结构的保守模式，尽管存在如图8所示的高度可变的一级序列.已报道了UGT71G1和UGT85H2的结晶结构(参见，例如，H.Shao等，The Plant Cell November 2005，第17卷no 11 3141-3154和L.Li等，J Mol Biol.2007 370(5)：951-63)。图8中的UGT91D2e上示出了已知的环、α螺旋和β折叠。虽然这些UGT在一级结构水平的同源性非常低，但二级结构似乎是保守的，使得能够基于UGT85H2和UGT71G1中参与底物与UGT91D2e结合之氨基酸的位置来预测这样的氨基酸的位置。
[0680] 将通常参与底物结合的区域与UGT91D2e重叠，大体示出与不同于UGT91D1(GenBank登录号：蛋白质登录号AAR06918，GI：37993665)的22个氨基酸相符。UGT91D1在甜叶菊中高表达，并且认为是功能性UGT。但是，其底物并非甜菊醇糖苷类。这表明，UGT91D1具有不同的底物，这可以由其不同于UGT91D2e的22个氨基酸定义。图9是UGT91D1与UGT91D2e之氨基酸序列的比对。框代表据报道参与底物结合的区域。以暗灰色突出的氨基酸示出UGT91D1与UGT91D2e不同的22个氨基酸。星代表已示出参与其结晶结构已解析的UGT之底物结合的氨基酸(一个特定氨基酸下方的更多个星表示多于一种结构已解析的UGT示出底物结合)。两种UGT91之间不同的22个氨基酸、已知参与底物结合的区域与实际参与结晶结构已解析的UGT中之底物结合的氨基酸之间关系密切。这表明，两种UGT91之间的22个不同氨基酸参与底物结合。
[0681] 全部22个改变的91D2e在XJb自我分解大肠杆菌菌株中由pGEX-4T1载体表达。为了评定酶的活性，进行了两个底物供给实验-体内和体外。大多数突变体具有低于野生型的活性，但是有5种突变体示出提高的活性。通过体外转录和翻译(IVT)对其进行重复，表明与野生型UGT91D2e相比，C583A、C631A和T857C具有高约3倍的甜菊苷形成活性，而C662t和A1313C具有约2倍的甜菊苷形成活性(核苷酸编号)。这些变化导致分别对应于L195M、L211M、V286A和S221F以及E438A的氨基酸突变。提高的活性根据底物而不同，使用13-SMG作为底物，C583A和C631A示出约10倍的提高，使用甜叶悬钩子苷作为底物示出约3倍的提高，而当使用13-SMG或甜叶悬钩子苷作为底物时，T857C示出3倍的提高。
[0682] 为了研究这些突变是否为加成性的，制备一系列双突变体，并分析其活性(图10).在该特定实验中，与之前的四个实验相比，观察到了较高的野生型活性水平；但是，突变的相对活性仍相同。随着甜叶悬钩子苷在许多表达4种UGT(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2e)的酿酒酵母菌株中累积，甜菊苷形成活性可能对提高甜菊醇糖苷类生产更重要。这样，双突变体C631A/T857C(核苷酸编号)可能是有用的。将该突变体命名为UGT91D2e-b，其含有氨基酸修饰L211M和V286A。使用表达UGT91D2e突变体的酿酒酵母在体外重复该实验。
[0683] 为了提高UGT91D2e的19-1，2-二糖基化活性，进行了UGT91D2e与UGT91D1之间不同的22个氨基酸的UGT91D2e之定向饱和诱变筛选(directed saturated mutagenic screen)。采用 (Life Technologies，Carlsbad，CA)位点饱和诱变来获得包
含各突变的文库。将该文库克隆到pGEX4T1细菌表达质粒的BamHI和NotI位点，所述pGEX4T1细菌表达质粒表达作为GST融合蛋白的91D2e的突变版本，导致新的文库(Lib#116)。将Lib#
116转化到XJb自我分解大肠杆菌菌株(ZymoResearch，Orange，CA)中，以产生约1600个包含
418个期望突变(即，22个位置，其中各位置处有19个不同的氨基酸)的克隆。还转化了其他表达91D2e(EPCS1314)、91D2e-b(EPSC1888)或EUGT11(EPSC1744)之GST-标记版本的质粒以及还转化空pGEX4T1(PSB12)。
含各突变的文库。将该文库克隆到pGEX4T1细菌表达质粒的BamHI和NotI位点，所述pGEX4T1细菌表达质粒表达作为GST融合蛋白的91D2e的突变版本，导致新的文库(Lib#116)。将Lib#
116转化到XJb自我分解大肠杆菌菌株(ZymoResearch，Orange，CA)中，以产生约1600个包含
418个期望突变(即，22个位置，其中各位置处有19个不同的氨基酸)的克隆。还转化了其他表达91D2e(EPCS1314)、91D2e-b(EPSC1888)或EUGT11(EPSC1744)之GST-标记版本的质粒以及还转化空pGEX4T1(PSB12)。
[0684] 通过LC-MS筛选
[0685] 为了分析UGT91D2e的约1600个突变体，在96孔形式下，将大肠杆菌转化体在30℃在1ml的含氨苄西林(100mg/l)和氯霉素(33mg/ml)的NZCYM中培养过夜。次日，在24孔形式下，将150μl的每种培养物接种到3ml含氨苄西林(100mg/l)、氯霉素(33mg/ml)、阿拉伯糖3mM、IPTG 0.1mM和乙醇2％ v/v的NZCYM中，并在20℃以200rpm孵育约20小时。在次日，对细胞进行离心，将沉淀在100μl的含10mM Tris-HCl(pH 8)、5mM MgCl2、1mM CaCl2以及全小蛋白酶抑制剂无EDTA(3片/100ml)(Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)的裂解缓冲液中重悬，并在-80℃冷冻至少15分钟以促进细胞裂解。在室温下将沉淀解冻，并向每孔中添加50μl的DNase混合物(1μl的1.4mg/ml DNase在H2O(约80000u/ml)中、1.2μl的MgCl2 500mM和47.8μl的4×PBS缓冲液)。在室温下，将板以500rpm振摇5分钟，以使得基因组DNA降解。在
4℃，以4000rpm对板进行离心30分钟，并使用甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A作为底物，在如上针对GST-91D2e-b所述的体外反应中，在UGT中使用6μl的裂解物.在每种情况下，通过LC-MS测量所得化合物甜菊苷或莱鲍迪苷D(rebD)。与由表达相应对照(91D2e、91D2e-b、EUGT11和空质粒)的裂解物产生的甜菊苷或rebD相比，对结果进行分析。选择其活性类似于表达
91D2e-b的那些克隆或高于表达91D2e-b的那些克隆的克隆作为初级命中。
4℃，以4000rpm对板进行离心30分钟，并使用甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A作为底物，在如上针对GST-91D2e-b所述的体外反应中，在UGT中使用6μl的裂解物.在每种情况下，通过LC-MS测量所得化合物甜菊苷或莱鲍迪苷D(rebD)。与由表达相应对照(91D2e、91D2e-b、EUGT11和空质粒)的裂解物产生的甜菊苷或rebD相比，对结果进行分析。选择其活性类似于表达
91D2e-b的那些克隆或高于表达91D2e-b的那些克隆的克隆作为初级命中。
[0686] 测定1600个克隆的一半和相应对照之对甜叶悬钩子苷和莱鲍迪苷A进行糖基化的能力。通过LC-MS对甜菊苷和RebD进行定量.在所用条件下，来自表达天然UGT91D2e之克隆的裂解物示出以两种底物(约0.5μM的甜菊苷和1μM的RebD)仅仅大约背景的活性，而表达UGT91D2e-b的克隆示出持续增加的产物形成(＞10μM甜菊苷；＞1.5μM RebD)。表达EUGT11的克隆一致地表现出较高水平的活性，特别是使用RebA作为底物时。就两种产物而言，考虑克隆作为筛选中的初级命中的截断(cut-off)设置为1.5μM，但在一些情况下针对各独立测定进行调节。
[0687] 实施例7-EUGT11同源物
[0688] 使用EUGT11蛋白质序列进行NCBI nr数据库的Blastp搜索披露了来自14种植物物种(其中之一是甜叶菊UGT91D1，在UGT保守区具有与EUGT11约67％的同一性，但总体小于45％)的约79种潜在UGT同源物.从玉米、大豆、拟南芥、葡萄和高粱中鉴定出了保守区具有大于90％同一性的同源物。在氨基酸水平方面，全长EUGT11同源物的总体同源物仅为28％至68％。
[0689] 用Iandolino等.(Iandolino等，Plant Mol Biol Reporter 22，269-278，2004)所述的方法、RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书或者使用Fast RNA Pro Green Kit(MP Biomedicals)根据制造商的说明书从植物材料中提取RNA。用AffinityScript QPCR cDNA合成试剂盒(Agilent)根据制造商的说明书产生cDNA。使用FastDNA试剂盒(MP biomedicals)根据制造商的说明书提取基因组DNA.使用Dream Taq聚合酶(Fermentas)或Phusion聚合酶(New England Biolabs)以及一系列设计为扩增同源物的引物来对cDNA进行PCR。
[0690] 通过含琼脂糖-TAE凝胶的SyberSafe中的电泳来分析PCR反应。在透射仪中通过UV照射来对DNA进行可视化。切取大小正确的条带，通过自旋柱根据制造商的说明进行纯化，并克隆到TOPO-Zero blunt(对于Phusion聚合酶产生的产物)或TOTO-TA(对于Dream Tag-产生的产物)中。将含有PCR产物的TOPO载体转化到大肠杆菌DH5Ba中，并平板接种到含合适的选择性抗生素的LB-琼脂板上。通过以下来切取具有正确序列的基因：用SbfI和AscI限制性消化，克隆到类似地消化的IVT8载体中，并转化到大肠杆菌中，对全部克隆基因进行PCR以扩增基因和侧接体外转录和翻译所需的区域。使用Promega L5540，TNT T7 Quick for PCR DNA试剂盒根据制造商的说明书，通过体外转录和翻译由PCR产物产生蛋白质。通过并入35S-甲硫氨酸接着通过SDS-PAGE分离和在Typhoon磷光成像器上进行可视化来评价蛋白质的产生。
[0691] 活性测定设置为总计20％(按体积计)的各体外反应，0.1mM甜叶悬钩子苷或RebA、5％DMSO、100mM Tris-HCl(pH 7.0)、0.01单位快速碱性磷酸酶(Fermentas)以及0.3mM UDP-葡萄糖(终浓度)。在30℃孵育1小时之后，如上所述的通过LC-MS分析样品的甜菊苷和RebD的产生。使用UGT91D2e和UGT91D2e-b(实施例6中所述的双突变体)用作阳性对照，以及EUGT11。在初始测定条件下，使用甜叶悬钩子苷和RebA，克隆P64B(参见表11)产生痕量的产物。表11列举了与EUGT11相比，整个UGT长度在氨基酸水平的同一性百分比，其为28％至
58％。在序列的较短延伸范围内观察到了高同源性(96％至100％)，其可以表明高度保守的植物UGT结构域。
58％。在序列的较短延伸范围内观察到了高同源性(96％至100％)，其可以表明高度保守的植物UGT结构域。
[0692] 表11
[0693] 克隆的EUGT11同源物及其与EUGT11的氨基酸同一性百分比的列表
[0694]
[0695]
[0696]
[0697] 实施例8 Reb-D的无细胞生物催化产生
[0698] 无细胞方法是这样体外系统，其中RebA、甜菊苷或甜菊醇糖苷类混合物酶促地转化为RebD。该系统需要化学计算量(stoichiometric amount)的UDP-葡萄糖，因此可以使用采用蔗糖合酶由UDP和蔗糖再生的UDP-葡萄糖.此外，蔗糖合酶在反应期间除去所产生的UDP，这通过降低糖基化反应中观察到的产物抑制来增加向糖基化产物的转化。参见WO2011/153378。
[0699] 酶表达和纯化
[0700] UGT91D2e-b(实施例6中所述)和EUGT11是催化RebA糖基化产生RebD的关键酶。这些UGT在细菌(大肠杆菌)中表达，但本领域普通技术人员将理解，这样的蛋白质还可以使用不同的方法和宿主(例如，其他细菌例如芽孢杆菌属、酵母例如毕赤酵母属或酿酒酵母属、或其他真菌(例如，曲霉菌)、或其他生物)来制备.例如，可以通过体外转录和翻译或者通过蛋白质合成来产生蛋白质.
[0701] 将UGT91D2e-b和EUGT11基因克隆到pET30a或pGEX4T1质粒中。将所得载体转化入XJb(DE3)自我分解大肠杆菌菌株(ZymoResearch，Orange，CA)中。最初，在30℃下于NZCYM培养基中将大肠杆菌转化体培养过夜，接着用3mM阿拉伯糖和0.1mM IPTG诱导，再在30℃孵育过夜。使用6HIS-标签或GST-标签和标准方法通过亲和层析来纯化相应的融合蛋白。本领域技术人员将理解，还可以使用其他蛋白质纯化方法例如凝胶过滤或其他层析技术，以及用例如硫酸铵沉淀/结晶或分级分离。尽管使用初始条件良好表达了EUGT11，UGT91D2e-b需要对基础方案作出一些修改以提高蛋白质溶解度，包括将过夜表达的温度从30℃降低至20℃，并向表达培养基中添加2％的乙醇。一般来说，用该方法纯化2mg/L至4mg/L的可溶性GST-EUGT11和400μg/l至800μg/l的GST-UGT91D2e-b。
[0702] EUGT11的稳定性
[0703] 在多种RebA至RebD反应条件下进行反应以探索EUGT11的稳定性。省略来自反应混合物的底物，将EUGT11预孵育多个时间段，然后添加底物.在100mM Tris-HCl缓冲液中预孵育酶之后，添加底物(100μM RebA)和其他反应成分(300μM UDP-葡萄糖和10U/mL碱性磷酸酶(Fermentas/Thermo Fisher，Waltham，MA))(在开始孵育之后0、1、4或24小时)。然后使反应进行20小时，之后终止反应，并测量RebD产物形成.在不同的温度下重复实验：30℃、32.7℃、35.8℃和37℃。
[0704] 当在37℃预孵育酶时，EUGT11的活性快速下降，在1小时后达到约一半的活性，并且在4小时后几乎没有活性。在30℃，在4小时后和在24小时后活性并未显著降低，保留了约三分之一的活性。这表明EUGT11是热不稳定性的。
[0705] 为了评定EUGT11的热稳定性和将其与甜菊醇糖苷类途径中的其他UGT进行比较，使用不同的差示扫描量热法(DSC)来确定蛋白质的变性温度。例如E.Freire在Methods in Molecular Biology 1995，第40卷，191-218中描述了DSC热分析图在变性温度(TD)中的用途。使用经6HIS纯化的EUGT11进行DSC得到39℃的表观TD；而当使用经GST纯化的91D2e-b时，所测量的TD为79℃.作为参考，在所有情况下，在使用经6HIS纯化的UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2时，所测量的TD为86℃。本领域技术人员将理解，酶固定化或热保护剂的添加可以加入反应中以提高蛋白质的稳定性。热保护剂的非限制性实例包括海藻糖、甘油、硫酸铵、甜菜碱、三甲胺氧化物以及蛋白质.
[0706] 酶动力学
[0707] 进行一系列的实验以确定EUGT11和91D2e-b的动力学参数.就两种酶而言，在反应中使用100μM RebA、300μM UDP-葡萄糖和10U/mL碱性磷酸酶(Fermentas/Thermo Fisher，Waltham，MA)。就EUGT11而言，在37℃使用100mM Tris-HCl(pH 7)和2％酶进行反应。就91D2e-b而言，在30℃使用20mM Hepes-NaOH，pH7.6，20％(以体积计)酶进行反应。在产物相对于时间图的线性范围内计算初始速率(V0)。
[0708] 为了首先研究线性区间，对每种酶进行初始时程。在37℃以100μM RebA和300μM UDP-葡萄糖的浓度将EUGT11测定48小时。在37℃以200μM RebA和600μM UDP-葡萄糖的浓度将UGT91D2e-b测定24小时。基于这些寻找范围的研究，确定了在EUGT11的情况下的前10分钟和在UGT91D2e-b的情况下的前20分钟对于产物形成来说处于线性范围内，因此，在这些间隔内计算了每种反应的初始速率。在EUGT11的情况下，RebA浓度测定为30μM、50μM、100μM、200μM、300μM以及500μM。UDP葡萄糖的浓度总是RebA浓度的三倍，并在37℃进行孵育。通过将所计算的V0绘制为底物浓度的函数，生成米氏曲线。通过绘制V0的倒数和[S]的倒数，获得了Lineweaver-Burk图，其中y＝339.85x+1.8644；R2＝0.9759。
[0709] 由曲线拟合Lineweaver-Burk数据确定Vmax和KM参数，由x截距和y截距(x＝0，y＝1/Vmax)和(y＝0，x＝-1/KM)来计算。此外，还通过非线性最小二乘回归，在Excel中使用SOLVER函数来计算相同的参数。用针对EUGT11和RebA二者的两种方法获得结果示于表12中，该表中还有该实施例的全部动力学参数。来自非线性最小二乘拟合方法和Lineweaver-Burk图二者的结果示于表12中。基于Vmax除以测定蛋白质的适当量来计算Kcat。
[0710] 表12
[0711] 使用RebA或UDP-葡萄糖作为底物，EUGT11和UGT 91D2e-b之动力学参数的比较
[0712]
[0713] 为了研究UDP-葡萄糖浓度在糖基化反应中的影响以及EUGT11对UDP-葡萄糖的亲和力，进行了类似的动力学分析。用增加量的UDP-葡萄糖(20μM、50μM、100μM和200μM)孵育EUGT11，维持过量的RebA(500μM)。动力学参数按照上述进行计算，并示于表12中。
[0714] 在UGT91D2e-b的情况下，RebA浓度测定为50μM、100μM、200μM、300μM、400μM以及500μM。在上述UGT91D2e-b的反应条件下，UDP-葡萄糖的浓度总是RebA之浓度的三倍，并且孵育在30℃下进行。按照前述计算动力学参数；所得动力学参数示于表12中。此外，确定了UGT91D2e-b对UDP-葡萄糖的动力学参数。用增加量的UDP-葡萄糖(30μM、50μM、100μM和200μM)孵育UGT91D2e-b，维持过量的RebA(1500μM)。孵育在对于UGT91D2e-b而言的最优条件下于30℃进行。按照上述计算动力学参数，结果示于表12中。
[0715] 通过比较EUGT11和91D2e-b的动力学参数，得出结论，91D2e-b具有较低的Kcat和对RebA较低的亲和力(较高的KM)，但91D2e-b之UDP-葡萄糖的KM低于EUGT11。UGT91D2e-b具有较低的Kcat/KM，其为催化效率的测量，结合关于对特定底物之催化速率(Kcat)和酶-底物结合强度(KM)的信息。
[0716] 确定反应中的限制性因素
[0717] 在就EUGT11而言的上述条件下，约25％的所施用RebA转化为RebD.在这些条件下，限制性因素可以是酶、UDP-葡萄糖或RebA.将实验设置为区分这些可能性。使标准测定在4小时期间运行其过程.接着添加额外的RebA底物、额外的酶、额外的UDP-葡萄糖或额外的酶以及UDP-葡萄糖。额外的酶的添加导致约50％之相对增加的转化，单独添加额外的RebA或UDP-葡萄糖不显著提高转化，但同时添加酶和UDP-葡萄糖增加约2倍的转化。
[0718] 进行实验以检查对添加一次性(bolus)量的UDP-葡萄糖和新鲜的酶在RebA转化为RebD反应中之益处的限制。在1、6、24和28小时后，添加额外的酶或酶和UDP-葡萄糖。在添加额外的EUGT11和UDP-葡萄糖二者的情况下，实现了大于70％的转化.没有对该转化具有显著作用的其他成分。这表明，EUGT11是该反应的主要限制因素，但UDP-葡萄糖也是限制性的。因为UDP-葡萄糖以比RebA高3倍的浓度存在，所以这表明至少在EUGT11的存在下，UDP-葡萄糖可能在反应混合物中有些不稳定。或者，如下文所解释的，EUGT11可以代谢UDP-葡萄糖。
[0719] 抑制研究
[0720] 进行实验以确定因素例如蔗糖、果糖、UDP、产物(RebD)和纯度较低的甜叶菊提取物原料中的杂质是否抑制甜菊醇糖苷类底物向RebD转化的程度。在一个标准反应混合物中，添加了过量的潜在抑制剂(蔗糖、果糖、UDP、RebD或市售甜菊醇糖苷类共混物(甜叶菊，Steviva Brands，Inc.，Portland，OR))。在孵育之后，对RebD产生进行定量。未发现500g/ml的市售甜叶菊混合物(约60％1，2-甜菊苷、30％RebA、5％甜叶悬钩子苷、2％1，2-二糖苷、小于1％的RebD、RebC以及其他，如通过LC-MS评价的)的添加是抑制性的，但提高了RebD总体产量(从无任何添加的30μM至60μM，)，远远超过在共混物中初始添加的(约5μM)的RebD。由所测试的分子，仅有UDP示出在所用浓度(500μM)对RebD产生抑制作用，如由LC-MS测量的。所产生的RebD低于7μM。通过包含将UDP循环成UDP-葡萄糖的系统(其通过酵母或者通过添加的SUS(蔗糖合酶)联合蔗糖)可以在用于RebD生产的体内或体外反应中降低该抑制。此外，当与较低量的UDP-葡萄糖(300μM)一起工作时，添加碱性磷酸酶以除去UDP-G不显著增加体外糖基化中产生的RebD的量，这表明所产生的UDP在这些浓度下可以是非抑制性的.[0721] RebA相对于粗制甜菊醇糖苷类混合物
[0722] 在一些实验中，使用粗制甜菊醇糖苷类混合物作为RebA的来源代替经纯化的RebA。因此，粗制甜菊醇糖苷类混合物包含高百分比的甜菊苷和RebA，UGT76G1包括在反应中。使用作为底物的0.5g/l的 混合物和酶(UGT76G1和/或EUGT11)按照上述进行
体外反应，并在30℃下孵育.通过LC-MS分析甜菊醇糖苷类的存在。
体外反应，并在30℃下孵育.通过LC-MS分析甜菊醇糖苷类的存在。
[0723] 当只向反应中添加UGT76G1时，甜菊苷被非常高效地转化为RebA。还检测到了未知的五糖苷(驻留时间峰在4.02分钟)。当只向反应中添加EUTG11时，发现了大量的RebE、RebA、RebD和未知的甜菊醇五糖苷(驻留时间峰在3.15分钟)。当向反应中添加EUGT11和UGT76G1二者时，甜菊苷峰降低，并且几乎全部转化为RebA和RebD。存在痕量的未知甜菊醇五糖苷(在4.02分钟成峰)。未检测到RebE，也未检测到未知的甜菊醇五糖苷(在3.15分钟成峰)。该结果表明，当联合使用EUGT11和UGT76G1时，使用甜菊提取物作为底物在体外产生RebD是有可能的。非特异性UDP-葡萄糖代谢
[0724] 为了确定EUGT11是否能够独立于RebA转化为RebD而代谢UDP-葡萄糖，在存在或不存在RebA底物的条件下孵育经GST纯化的EUGT11，使用TR-FRET 试剂盒(BellBrook Labs)，以UDP释放测量UDP-葡萄糖使用。该 试剂盒基于与抗
体结合的示踪分子。该示踪分子以高敏感性和定量的方式被UDP或ADP所取代。FP试剂盒包含与抗体结合的Alexa633示踪剂。该示踪剂被UDP/ADP所取代。该取代的示踪剂自由地旋转导致荧光偏振降低。因此，UDP产生与偏振降低成比例。FI试剂盒包含与抗体结合的淬灭的Alexa594示踪剂，其与 QC-1淬灭剂缀合。该示踪剂被UDP/ADP所取代，而取代的示
踪剂是未淬灭的，导致荧光强度正增加。因此，UDP产生与荧光增加成比例.TR-FRET试剂盒包含与抗体-Tb缀合物结合的HiLyte647示踪剂.在UV范围内(ca.330nm)铽复合物的激发导致能量转移到示踪剂以及在一段时间延迟之后较高的波长(665nm)。示踪剂被UDP/ADP所取代，导致TR-FRET减少.
体结合的示踪分子。该示踪分子以高敏感性和定量的方式被UDP或ADP所取代。FP试剂盒包含与抗体结合的Alexa633示踪剂。该示踪剂被UDP/ADP所取代。该取代的示踪剂自由地旋转导致荧光偏振降低。因此，UDP产生与偏振降低成比例。FI试剂盒包含与抗体结合的淬灭的Alexa594示踪剂，其与 QC-1淬灭剂缀合。该示踪剂被UDP/ADP所取代，而取代的示
踪剂是未淬灭的，导致荧光强度正增加。因此，UDP产生与荧光增加成比例.TR-FRET试剂盒包含与抗体-Tb缀合物结合的HiLyte647示踪剂.在UV范围内(ca.330nm)铽复合物的激发导致能量转移到示踪剂以及在一段时间延迟之后较高的波长(665nm)。示踪剂被UDP/ADP所取代，导致TR-FRET减少.
[0725] 观察到了所测量的UDP-葡萄糖同样不依赖于RebA底物的存在.在不存在酶时检测不到UDP释放。这表明EUGT11非特异性地降解UDP-葡萄糖.但是，当添加RebA时，仍然产生RebD，表明EUGT11会在非特异性UDP-葡萄糖降解期间优先催化RebA糖基化。
[0726] 实验设置为在不存在RebA或其他明显糖基化底物的条件下寻找葡萄糖分子的归宿。在所有前述反应中一个常见的因素是Tris缓冲液和/或痕量的谷胱甘肽的存在，其二者都含有潜在的糖基化位点。在存在或不存在RebA的条件下，使用经GST纯化的EUGT11(含谷胱甘肽)和经HIS纯化的酶(不含谷胱甘肽)在体外反应中测定这些分子对非特异性UDP-葡萄糖消耗的作用。使用TR-FRET 试剂盒以UDP释放测量UDP-葡萄糖使用。UDP释放在所有情况下发生并且独立于RebA的存在。当使用经HIS纯化的酶时，UDP释放较慢，但在RebA转化为RebD中酶的总体催化活性也较低，表明测定中存在较低量的活性可溶性酶。因此，似乎在所测试条件下，通过EUGT11代谢UDP-葡萄糖独立于底物的存在并且独立于反应中谷胱甘肽的存在。
[0727] 为了测试Tris对通过EUGT11代谢UDP-葡萄糖的影响，使用用于洗脱的Tris基缓冲剂或PBS基缓冲剂来纯化GST-EUGT11，在两种情况下获得了类似量的蛋白质。在存在或不存在RebA的条件下以与上述类似的方式，分别使用Tris和HEPES作为缓冲剂，在体外反应中使用经Tris和PBS纯化的酶。在两种条件下，无论是否添加RebA，在两种条件下反应中的UDP释放都相同，表明EUGT11对UDP-葡萄糖的代谢独立于反应中RebA的存在和Tris的存在二者。这表明，所检测到的UDP释放在某种程度上可以是由EUGT11的特性导致的人为结果，或者EUGT11可以水解UDP-葡萄糖。EUGT11在优先将RebA转化为RebD中仍然是高效的，并且UDP-G的损失可以通过添加下述蔗糖合酶回收系统来补偿。
[0728] RebA溶解性
[0729] RebA的溶解性决定可用于全细胞方法和无细胞方法二者中的浓度。制备了若干不同的RebA水溶液，并在室温存放数天。在贮存24小时之后，50mM的浓度或更高浓度的RebA发生沉淀。25mM的RebA在4至5天后开始沉淀，而10mM或更低的浓度则保留在溶液中，甚至在4℃贮存时也如此.
[0730] RebD溶解性
[0731] 通过以下来评定RebD的溶解性：制备若干不同的RebD水溶液，并在30℃下孵育72小时。发现在开始的1mM或更低的浓度时，RebD可溶，同时发现在0.5mM或更低的浓度时其稳定较长的一段时间。本领域技术人员将理解，溶解性可能受多种条件影响，例如pH、温度或不同的基质。
[0732] 蔗糖合酶
[0733] 蔗糖合酶(SUS)已被用于由UDP和蔗糖(图11)再生UDP-葡萄糖用于其他小分子的糖基化(Masada Sayaka等.FEBS Letters 581(2007)2562-2566.)。将来自拟南芥、甜叶菊和咖啡(小果咖啡)的三种SUS1基因克隆到pGEX4T1大肠杆菌表达载体中(序列请参见图11)。使用针对EUGT11所述相类似的方法，纯化约0.8mg/l的GST-AtSUS1(拟南芥SUS1)。
CaSUS1(小果咖啡SUS1)和SrSUS1(甜叶菊SUS1)的初始表达和接下来的GST纯化未产生显著量的蛋白质，但当通过western印迹分析时，验证了GST-SrSUS1的存在。当GST-SrSUS1在20℃于2％乙醇的存在下表达时，产生了约50μg/l的酶.
CaSUS1(小果咖啡SUS1)和SrSUS1(甜叶菊SUS1)的初始表达和接下来的GST纯化未产生显著量的蛋白质，但当通过western印迹分析时，验证了GST-SrSUS1的存在。当GST-SrSUS1在20℃于2％乙醇的存在下表达时，产生了约50μg/l的酶.
[0734] 进行了实验以评价经纯化GST-AtSUS1和GST-SrSUS1的UDP-葡萄糖再生活性。在100mM Tris-HCl(pH＝7.5)和1mM UDP(终浓度)中进行体外测定.还添加了约2.4μg的经纯化GST-AtSUS1、约0.15μg的GSTSrSUS1或者约1.5μg市售BSA(New England Biolabs，Ipswich，MA)。在存在或不存在约200mM蔗糖的条件下进行反应，并在37℃孵育24小时。按照分析部分所述，通过HPLC测量产物UDP-葡萄糖。当存在蔗糖时，AtSUS1产生了约0.8mM UDP-葡萄糖。当使用SrSUS1或阴性对照(BSA)时未观察到UDP-葡萄糖。针对SrSUS1所观察到的活性的缺少可以由所纯化之酶的不良质量和浓度来解释。通过AtSUS1产生UDP-葡萄糖是蔗糖依赖性的，因此得出结论，AtSUS1可用于偶联反应中以再生被EUGT1或其他UGT利用的UDP-葡萄糖用于小分子糖基化(图11，上述)。
[0735] 如图11所示，SUS催化由蔗糖和UDP形成DUP-葡萄糖和果糖。然后该UDP-葡萄糖可以被EUGT11利用以糖基化RebA从而产生RebD。进行如上所述的体外测定，添加约200mM蔗糖、1mM UDP、100uM RebA、约1.6μg纯化的GST-AtSUS1以及约0.8μg GST-EUGT11.通过LC-MS来评价产物RebD的形成.当将AtSUS、EUGT11、蔗糖和UDP与RebA混合时，形成81±5μM的RebD。该反应独立于AtSUS、EUGT11和蔗糖的存在。该转化速率类似于之前使用外源提供的UDP-葡萄糖观察到的转化速率。这表明，AtSUS可用于再生UDP-葡萄糖用于通过EUGT11形成RebD。
[0736] 实施例9：RebD的全细胞生物催化生产
[0737] 在该实施例中，研究了若干参数，其为用于使用全细胞生物催化系统由RebA或其他甜菊醇糖苷类生产RebD的因素。原材料跨过细胞膜的能力和UDP-葡萄糖的可得性是两个这样的因素。研究了通透剂以及不同的细胞类型以确定哪些系统可以最有益于RebD生产。
[0738] 通透剂
[0739] 数种不同的通透剂之前已示出允许正常情况下不能跨过细胞膜的多种化合物的胞内酶促转化(Chow和Palecek，Biotechnol Prog.2004Mar-Apr；20(2)：449-56)。在若干种情况下，该方法类似于细胞的部分裂解，在酵母中常常依赖于通过去污剂去除细胞膜和将酶包封在残留细胞壁的内侧，细胞壁对于较小的分子来说是通透的。这些方法中常见的是暴露于通透剂，接着进行离心步骤以沉淀细胞，然后添加底物。关于酵母的通透，参见例如Flores等，Enzyme Microb.Technol.，16，第340至346页(1994)；Presecki & Vasic-Racki，Biotechnology Letters，27，第1835至1839页(2005)；Yu等，JInd Microbiol Biotechnol，34，151-156(2007)；Chow和Palecek，Cells.Biotechol.Prog.，20，第449至456页(2004)；
Fernandez等，Journal of Bacteriology，152，第1255至1264页(1982)；Kondo等，Enzyme and microbial technology，27，第806-811页(2000)；Abraham和Bhat，J Ind Microbiol Biotechnol，35，第799至804页(2008)；Liu等，Journal of bioscience and
bioengineering，89，第554-558页(2000)；以及Gietz和Schiestl，Nature Protocols，2，第
31至34页(2007)。关于细菌的通透，参见Naglak和Wang，Biotechnology and
Bioengineering，39，第732至740页(1991)；Alakomi等，Applied and environmental Microbiology，66，第2001至2005页(2000)以及Fowler和Zabin，Journal of
bacteriology，92，第353至357页(1966)。如实施例中所述，确定细胞是否可以保持活力，并且因此可以保留从头UDP-葡萄糖生物合成。
Fernandez等，Journal of Bacteriology，152，第1255至1264页(1982)；Kondo等，Enzyme and microbial technology，27，第806-811页(2000)；Abraham和Bhat，J Ind Microbiol Biotechnol，35，第799至804页(2008)；Liu等，Journal of bioscience and
bioengineering，89，第554-558页(2000)；以及Gietz和Schiestl，Nature Protocols，2，第
31至34页(2007)。关于细菌的通透，参见Naglak和Wang，Biotechnology and
Bioengineering，39，第732至740页(1991)；Alakomi等，Applied and environmental Microbiology，66，第2001至2005页(2000)以及Fowler和Zabin，Journal of
bacteriology，92，第353至357页(1966)。如实施例中所述，确定细胞是否可以保持活力，并且因此可以保留从头UDP-葡萄糖生物合成。
[0740] 进行实验以建立用于在大肠杆菌和酵母中通透化的条件。用不同浓度/组合的通透剂处理培养的细胞(酿酒酵母或大肠杆菌)：甲苯、氯仿和乙醇用于通透化酿酒酵母；胍、乳酸、DMSO和/或Trition X-100用于通透化大肠杆菌.还评价了两种模式生物对高浓度的RebA和其他潜在底物的耐受。在含RebA的培养基中孵育(供给实验(feeding experiment))之后，通过由表达EUGT11的生物产生的RebD的量来测量通透化。通过在体外测定中裂解细胞和分析所释放UGT的活性，在暴露于通透剂之前和之后监测酶活性.
[0741] 在酵母中，所测试的通透条件均未导致高于所检测背景(即，用于供给的RebA原料中存在的杂质RebD水平)的RebD增加。这表明，在所测试条件下，酵母细胞仍不可通透RebA和/或由溶剂导致的降低的细胞活力也导致EUGT11活性下降。
[0742] 在大肠杆菌中，所测试的条件均未导致细胞的通透和后续高于背景水平的RebD生产。当在体外反应中使用来自表达EUGT11之菌株的裂解物时，测量RebD的可检测水平(数据未示出)，表明存在EUGT11酶和甚至在所有通透化处理后的活性(但活性的水平变化)。通透处理对细胞活力作用很小或者没有作用，用0.2M胍和0.5％Triton X-100处理培养物(其严重降低活力)除外。
[0743] 还使用Triton X-100、N-十二烷基肌氨酸(LS)或醋酸锂+聚乙二醇(LiAc+PEG)对酿酒酵母进行了通透化测定，不允许细胞进一步生长。即，在这些条件下，通过除去细胞膜同时保留细胞壁作为屏障以保持酶和gDNA在内侧，通透化使得细胞没有活力。在这样的方法中，如上所述，UDP-葡萄糖可以是补充的或再循环的。通透化相对于纯体外方法的优点是各酶不需要分开产生和分离.
[0744] N-十二烷基肌氨酸处理导致EUGT11失活，并且当施用LiAc/PEG时，仅检测到少量的RebD增加(数据未示出)。但是，用Triton X-1000.3％或0.5％处理将RebD的量提高为高于背景水平(参见图18)，同时维持EUGT11的活性。就Trixon X-100测定而言，将过夜培养物在PBS缓冲剂中洗涤3次。将对应于6 OD600单位的细胞重悬在分别含有0.3％或0.5％Triton X-100的PBS中。涡旋经处理的细胞，并在30℃下孵育30分钟.处理之后，在PBS缓冲剂中洗涤细胞.如针对GST-EUGT11所述，将对应于5 OD600单位的细胞用于体外测定，如针对经LS处理之样品所述，将0.6 OD600单位重悬于反应缓冲剂中并在30℃孵育过夜。使用未经处理的样品作为对照。
[0745] 当细胞未经处理或者在用LiAC/PEG或Triton X100处理之后，来自表达EUGT11之转化体的裂解物能够将一些RebA转化为RebD(在反应中测量的8μM至50μM)。但是，在经LS处理的细胞沉淀的裂解物中未测量到RebD。当用0.3％或0.5％Triton X-100(图18)处理时，经通透化但未裂解的细胞能够产生一些RebD(测量的1.4μM至1.5μM)，而在经LS或LiAC/PEG处理的样品中未发现RebD。这些结果表明，使用全细胞并且使用Triton X100作为通透剂，可以由RebA生物催化地产生RebD。
[0746] 实施例10-经过密码子优化的UGT序列的评定
[0747] 采用两种方法-由GeneArt(Regensburg，Germany)(分别为SEQ ID NO：6、2、8和4)提供的或DNA 2.0(Menlo Park，CA)(分别为SEQ ID NO：84、83、85和82)设计并合成UGT 91d2e、74G1、76G1和85C2的最佳编码序列。UGT 91d2e、74G1、76G1和85C2的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：5、1、7和3)未改变。
[0748] 测定野生型、DNA 2.0和GeneArt序列的体内活性以比较在甜菊醇糖苷类合成途径中对底物的反应性。UGT被插入高拷贝(2μ)载体中，并由强组成型启动子(GPD1)(载体P423-GPD、P424-GPD、P425-GPD和P426-GPD)表达。将质粒单独地转化入通用Watchmaker菌株EFSC301(在WO2011/153378的实施例3中有述)中，使用由等量的细胞(8OD单位)制备的细胞裂解物实施测定。就酶促反应而言，在30μL反应中用0.25mM甜菊醇(终浓度)孵育6μL的各细胞裂解物以测试UGT74G1和UGT85C2克隆，并且用0.25mM 13-SMG(13SMG)(终浓度)来测试76G1和91D2e UGT。测定在30℃下实施24小时。在LC-MS分析之前，向各反应中添加1体积的
100％DMSO，以16000g离心样品，并分析上清液.
100％DMSO，以16000g离心样品，并分析上清液.
[0749] 在所测试的条件下，表达GeneArt优化基因的裂解物提供较高水平的UGT活性。表示为野生型酶的百分比，GeneArt裂解物对UGT74G1示出和野生型相当的活性，对UGT76G1示出170％的活性，对UGT85C2示出340％的活性，对UGT91D2e示出130％的活性.当在酿酒酵母中表达时，使用UGT85C2可提高细胞的Reb-A和Reb-D的总体流量和产率。
[0750] 还进行了实验以确定密码子优化的UGT85C2是否可以降低19-SMG累积和增加甜叶悬钩子苷和较高糖基化的甜菊醇糖苷类生产。在酿酒酵母菌株BY4741的甜菊醇供给实验中分析19-SMG和甜叶悬钩子苷的生产，所述酿酒酵母菌株BY4741表达野生型UGT74G1以及在强组成型启动子(GPD1)(分别为载体P426-GPD和P423-GPD)下由高拷贝(2μ)载体密码子优化的UGT85C2。获取全培养物样品(没有移除细胞)并在等体积的DMSO中煮沸以得到总糖苷水平。通过沉淀细胞并在50％DMSO中重悬至所获取原始培养物样品的体积，接着煮沸来获得所报道的胞内浓度。然后采用LC-MS测量“总”糖苷水平和归一化胞内水平。使用野生型UGT74G1和野生型UGT85C2，以约7μM的最大归一化胞内浓度总计产生约13.5μM的甜叶悬钩子苷。相比之下，当使用野生型UGT74G1和密码子优化的UGT85C2时，产生最大为26μM的甜叶悬钩子苷，或者使用野生型UGT85C2产生其约两倍。此外，甜叶悬钩子苷的最大归一化胞内浓度为13μM，是使用野生型UGT85C2的约2倍。19-SMG的胞内浓度从使用野生型UGT85C2的最大35μM显著降低至使用密码子优化的UGT85C2的19μM。因此，对于密码子优化的UGT85C2，测得低至约10μM的总19-SMG。这表明，更多的19-SMG被转化为甜叶悬钩子苷并证实野生型UGT85C2是瓶颈。
[0751] 在多样性筛选过程中，在甜叶菊cDNA克隆期间发现了UGT85C2的另一个同源物。该同源物具有保守氨基酸多态性的以下组合(相对于登记号AY345978.1中所示野生型甜叶菊UGT85C编码序列的氨基酸编号)：A65S、E71Q、T270M、Q289H和A389V。通过联合PCR产物(Quick for PCR DNA kit，Promega)的体外转录-翻译表达被称为UGT85C2D37的该克隆。按照WO/2011/153378中所述，使用甜菊醇(0.5mM)作为糖受体来测定表达产物的糖基化活性，允许测定孵育24小时除外。与野生型UGT85C2对照测定相比，D37酶似乎具有高出约30％的糖基化活性。
[0752] 实施例11-新的甜叶菊KAH的鉴定
[0753] 在甜叶菊EST数据库中鉴定与甜叶菊KAH具有一些同源性的部分序列(GenBank登录号BG521726).使用CLC主工作台软件对所述部分序列与原甜叶菊焦磷酸测序读取序列进行blast。鉴定出与部分序列之末端部分重叠的读取序列，并用于增加部分序列的长度。进行数次直至序列包括起始密码子和终止密码子二者。分析完整序列的移码突变和核苷酸替换，其可以通过将全序列与原焦磷酸测序读取进行blast来引入。将所得序列称为SrKAHe1。参见图12。
[0754] 在体内于酿酒酵母背景菌株CEN.PK 111-61A中测定由SrKAHe1编码的KAH的活性，其表达编码构成从酵母次级代谢物异戊二烯基焦磷酸(IPP)和法尼基焦磷酸(FPP)至甜菊醇-19-O-单糖苷整个生物途径之酶的基因，对应异贝壳烯酸转化为甜菊醇的甜菊醇合酶除外。
[0755] 简言之，修饰酿酒酵母菌株CEN.PK 111-61A以由染色体整合基因拷贝表达构巢曲霉GGPPS，150nt截短的玉米CDPS(具有新的起始密码子，参见下文)；甜叶菊KS；甜叶菊KO以及甜叶菊UGT74G1，其中TPI1和GPD1酵母启动子驱动转录。将表达所有这些基因的CEN.PK111-61A酵母菌株命名为EFSC2386。因此，菌株EFSC2386包含下述整合的基因：构巢曲霉香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)；玉米对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)；甜叶菊对映-贝壳杉烯合酶(KS)；甜叶菊对映-贝壳杉烯氧化酶(KO)；以及甜叶菊UGT74G1；与从IPP和FPP至甜菊醇-19-O-单糖苷的途径组合，不含甜菊醇合酶(KAH)。
[0756] 在菌株EFSC2386中测试不同甜菊醇合酶(来自附加型表达质粒)的表达和多种CPR(来自附加型表达载体)的表达，通过培养物样品提取物的LC-MS分析来检测甜菊醇-19-O-单糖苷的产生。将编码CPR的核酸插入p426GPD基本质粒的多克隆位点中，同时将编码甜菊醇合酶的核酸插入p415TEF基本质粒(Mumberg等.，Gene 156(1995)，119-122的p4XX基本质粒系列)多克隆位点中。在存在功能性甜菊醇合酶时发生甜菊醇-19-O-单糖苷的产生。
[0757] 在菌株EFSC2386中由附加型表达质粒表达的KAH是“indKAH”(Kumar等，登录号DQ398871；Reeja等，登录号EU722415)；“KAH1”(甜叶菊甜菊醇合酶，Brandle等，美国专利公开No.2008/0064063 A1)；“KAH3”(拟南芥甜菊醇合酶，Yamaguchi等，美国专利公开No.2008/0271205 A1)；“SrKAHe1”(如上所述，从甜叶菊cDNA克隆的甜叶菊甜菊醇合酶)；以及“DNA2.0.SrKAHe1”编码甜叶菊甜菊醇合酶的密码子优化的序列(DNA2.0)参见图12B).[0758] 在菌株EFSC2386中由附加型表达质粒表达的CPR是“CPR1”(甜叶菊NADPH依赖性细胞色素P450还原酶(Kumar等，登录no.DQ269454)；“ATR1”(拟南芥CPR，登录号CAA23011，另参见图13)；“ATR2”(拟南芥CPR，登录号.CAA46815，另参见图13)；“CPR7”(甜叶菊CPR，参见图13，CPR7与“CPR1”相似)；“CPR8”(甜叶菊CPR，与青蒿素CPR相似，参见图13)；以及“CPR4”(甜叶菊NCP1(登录号YHR042W，另参见图13)。
[0759] 表13提供在菌株EFSC2386中甜菊醇-19-O-单糖苷(μM)与甜菊醇合酶和CPR的多种组合的水平。
[0760] 表13
[0761] 19-SMG产生
[0762]
[0763]
[0764] 当在酿酒酵母中表达时，只有KAH3和由SrKAHe1编码的甜菊醇合酶具有活性。编码甜菊醇合酶的DNA2.0密码子优化的SrKAHe1序列导致：在与优化CPR共表达时甜菊醇-19-O-单糖苷积累的水平比密码子优化的KAH3高约1个数量级。在该实施例中示出的实验中，KAH1和ATR2CPR的组合未导致产生甜菊醇-19-O-单糖苷.
[0765] 实施例12-CPR和KO的配对
[0766] 在实施例11(“甜叶菊KAH的鉴定”)中描述了该实施例中提到的CEN.PK酿酒酵母EFSC2386菌株和CPR。EFSC2386包含以下整合基因：构巢曲霉香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)；玉米对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)；甜叶菊对映贝壳杉烯合酶(KS)；以及甜叶菊对映-贝壳杉烯氧化酶(KO)。该菌株产生通过LC-MS分析检测到的对映-异贝壳杉烯酸.
[0767] 在菌株EFSC2386中表达和测试细胞色素P450还原酶(CPR)的收集；“CPR1”(甜叶菊NADPH依赖性细胞色素P450还原酶，Kumar等，登录号.DQ269454)；“ATR1”(拟南芥CPR，登录号CAA23011)；“ATR2”(拟南芥CPR，登录号CAA46815)；“CPR7”(甜叶菊CPR，CPR7类似于“CPR1”)；“CPR8”(甜叶菊CPR，类似于青蒿素CPR；以及“CPR4”(酿酒酵母NCP1，登录号YHR042W)。
[0768] 酿酒酵母内源天然CPR(在表14中称为CPR4)的过表达并且特别地拟南芥CPR之一(即，ATR2)的过表达提供甜叶菊贝壳杉烯氧化酶(后者在表14中称为KO1)的良好活化，并且导致对映异贝壳杉烯酸的累积增加。参见表14，其代表LC-MS层析图中对映异贝壳杉烯酸峰之曲线下方的面积(AUC)。KO1是没有CPR之额外过表达的产生对映异贝壳杉烯酸的酵母对照菌株。
[0769] 表14-不同细胞色素P450还原酶对KO-1的作用
[0770]
[0771]
[0772] 实施例13-评价甜菊醇途径中的KS-5和KS-1
[0773] 酵母菌株EFSC1972是具有由IPP/FPP至由编码以下的整合基因拷贝表达的甜叶悬钩子苷的生物合成途径的CEN.PK 111-61A酿酒酵母菌株，其编码：构巢曲霉GGPPS(内部名称GGPPS-10)、甜叶菊KS(KS1，SEQ ID NO：133)、拟南芥KAH(KAH-3，SEQ ID NO：144)、甜叶菊KO(KO1，SEQ ID NO：138)、甜叶菊CPR(CPR-1，SEQ ID NO：147)、全长玉米CDPS(CDPS-5，SEQ ID NO：158)、甜叶菊UGT74G1((SEQ ID NO：1)以及甜叶菊UGT85C2(SEQ ID NO：3)。此外，EFSC1972通过用铜诱导型启动子CUP1替换内源启动子来下调ERG9基因表达.
[0774] 当EFSC1972转化有基于CEN/ARS的质粒(由TEF1启动子表达甜叶菊SrKAHe1)并且同时转化有表达聚球藻属GGPPS(GGPPS-7)的2μ基质粒和由GPD启动表达的玉米CDPS的截短变体(截短的CDPS-5)，结果是生长受损的生产甜叶悬钩子苷(和19-SMG)的酿酒酵母。在下文中将该菌株称为“增强的EFSC1973”。为了确定缓慢的生长速率是否是由毒性途径中间体对映柯巴基二磷酸的累积引起的，在“增强的EFSC1972”菌株中表达一些贝壳杉烯合酶(KS)基因，然后进行培养并测定甜菊醇糖苷类产生。
[0775] 拟南芥KS(KS5)的表达导致“增强的EFSC1972”菌株的改进的生长和甜菊醇糖苷类产生。参见图16。通过在增强的EFSC1972中进一步过表达甜叶菊贝壳杉烯合酶(KS-1)不能实现对生长的相同积极作用(数据未示出)。
[0776] 实施例14-酵母菌株EFSC1859
[0777] 酿酒酵母菌株EFSC1859含有整合入基因组中并且由强组成型GPD1和TPI启动子表达的GGPPS-10、CDPS-5、KS-1、KO-1、KAH-3、CPR-1以及UGT74G1编码序列。参见表15。此外，用铜诱导型启动子CUP1代替酵母ERG9基因的内源启动子以下调ERG9角鲨烯合酶。在表征的酵母培养基中，ERG9基因以非常低的水平转录，因为在这样的培养基中铜的浓度非常低。该菌株中麦角固醇产生的减少导致可用于类异戊二烯生物合成的增加量的异戊二烯。此外，菌株EFSC1859还使用GPD1启动子由2微米多拷贝载体表达UGT85C2。EFSC1859产生甜叶菊悬钩子苷和甜菊醇19-O-糖苷。
[0778] 使用GPD启动子由2微米多拷贝质粒表达具有和没有叶绿体信号肽的玉米CDPS DNA。图14中所示玉米的核苷酸序列和氨基酸序列。叶绿体信号肽由1至150位核苷酸编码，并且对应于氨基酸序列的第1至50位残基。
[0779] 表15
[0780]
[0781] 将EFSC1859+玉米全长CDPS质粒和EFSC+玉米截短的CDPS质粒培养在具有4％葡萄糖的选择性酵母培养基中。通过LC-MS测量甜叶悬钩子苷和19-SMG产生以评价产生水平。与野生型序列相比，质体前导序列的移除似乎未提高甜菊醇糖苷类产量，并且表明可以移除CDPS转运肽而不导致损失甜菊醇糖苷类生物合成。
[0782] 实施例15-酵母菌株EFSC1923
[0783] 通过在多种生物中引入甜菊醇糖苷类途径的酶来修饰酿酒酵母菌株CEN.PK 111-61A以产生甜菊醇糖苷类。将经修饰的菌株命名为EFSC1923。
[0784] 菌株EFSC1923含有在酿酒酵母PRP5-YBR238C基因间区中的构巢曲霉GGPP合酶基因表达盒、在MPT5-YGL176C基因间区中的玉米全长CDPS和甜叶菊CPR基因表达盒、在ECM3-YOR093C基因间区中的甜叶菊贝壳杉烯合酶和CDPS-1基因表达盒、在KIN1-INO2基因间区中的拟南芥KAH和甜叶菊KO基因表达盒、在MGA1-YGR250C基因间区中的甜叶菊UGT74G1基因表达盒以及通过替换TRP1基因ORF整合的甜叶菊UGT85C2基因表达盒。参见表15。此外，用铜诱导型启动子CUP1替换酵母ERG9基因的内源启动子。
[0785] 菌株EFSC1923在具有4％葡萄糖的选择性酵母培养基上产生约5μM的甜菊醇糖苷类，甜菊醇19-O-单糖苷。
[0786] 实施例16-酵母菌株EFSC1923中截短的玉米CDPS的表达
[0787] 缺失表15中玉米CDP合酶编码序列之5’端处的150个核苷酸(SEQ ID NO：157，参见图14)，剩余的编码序列提供有新的翻译起始ATG，使该截短的序列与酿酒酵母EFSC1923中的多拷贝质粒p423GPD中的GPD1启动子有效连接。Mumberg，D等，Gene，156：119-122(1995)中描述了质粒p423GPD。将EFSC1923和EFSC1923加p423GPD-Z.m.tCDPS在含4％葡萄糖的选择性酵母培养基中培养96小时。在这些条件下，由EFSC1923+p423GPD-Z.m.tCDPS(截短的CDPS)产生的甜菊醇19-O-单糖苷的量比由不含质粒的EFSC1923产生的量多约2.5倍。
[0788] 在GPD1启动子的控制下，在命名为p426GPD的多拷贝质粒中插入来自表15的拟南芥KAH编码序列。Mumberg，D等，Gene，156：119-122(1995)中描述了质粒p426GPD。在由EFSC1923+p426GPD-A.t.KAH与缺乏质粒的EFSC1923产生的19-O-单糖苷之量之间没有观察到了显著差异。
[0789] 用p423GPD-Z.m.tCDPS和p426p426GPD-A.t.KAH二者转化EFSC1923。出乎意料地，在这些条件下，由具有两种质粒(即，截短的玉米CDPS和拟南芥KAH)的EFSC1923产生的甜菊醇19-O-单糖苷的量比单独由EFSC1923产生的量大6倍。
[0790] 克隆来自藤仓赤霉(NCBI登录号：Q9UVY5.1，图15)的双功能CDPS-KS，并与截短的CDPS-5进行比较。将双功能藤仓赤霉CDPS-KS克隆到具有GPD启动子的2μ质粒中，并用来自2μ基质粒之表达拟南芥KAH-3的质粒由GPD启动子转化到EFSC1923中。在摇瓶研究中，该双功能CDPS-KS在产生甜菊醇19-O-单糖苷方面的活性比具有仅仅KAH-3的菌株EFSC1923高约5.8倍。但是，发现在所测试的条件下，与KAH-3和截短的CPDS组合相比，其优化较低。因此，用KS-5和截短的CDPS构建了其他菌株。
[0791] 实施例17-中间体的毒性
[0792] 通过在实验室酿酒酵母菌株CEN.PK背景下表达单独的聚球藻属GGPPS(GGPP产生)、同时表达GGPPS和50个氨基酸N末端截短的玉米CDPS(参见实施例16)(CDP产生)或者同时表达GGPPS、截短的CDPS和拟南芥贝壳杉烯合酶(KS5)(对映-贝壳杉烯产生)来研究香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、对映-柯巴基二磷酸(CDP)或对映-贝壳杉烯产生对酿酒酵母活力的作用。由2μ质粒表达基因，所述质粒具有GPD启动子，其驱动截短的CDPS和KS5的转录，而ADH1启动子驱动GGPPS的转录。观察了转化有这些质粒之多种组合(单独的GGPPS；GGPPS+截短的CDPS；或GGPPS+截短的CDPS+KS5)或不含基因插入之质粒的酿酒酵母CEN.PK的生长。当GGPP产生并且尤其是CDP产生作为终产物产生时，其对酿酒酵母是有毒性的。有趣的是，在本实验中产生的量的对映-贝壳杉烯似乎对酵母无毒性。
[0793] 实施例18-内源磷酸酶活性的破坏
[0794] 酵母基因DPP1和LPP1分别编码可以将FPP和GGPP降解为法尼醇和香叶基香叶醇的磷酸酶。在菌株EFSC1923(实施例15中所述)中缺失编码DPP1的基因以确定是否存在对甜菊醇糖苷类产生的作用。当用于表达缺乏叶绿体转运肽序列的玉米CDPS(实施例16)的质粒进一步转化该dpp1突变体菌株时，出现小转化体和大转化体二者。在所测试的条件下，与“小菌落”型和非DPP1缺失菌株相比，“大菌落”型产生多出约40％的19-SMG。这些结果表明，DPP1的缺失可以对甜菊醇糖苷类的产生具有积极的作用，因此，酵母中异戊二烯基焦磷酸的降解可以不利地影响甜菊醇糖苷类产生。
[0795] 实施例19-具有破坏的SUC2基因由葡萄糖产生香叶醛葡萄糖苷的遗传稳定酵母报告菌株的构建
[0796] 基本上按照Brochado等.((2010)Microbial Cell Factories 9：84-98)(菌株VG4)中所述产生由葡萄糖产生香叶醛葡萄糖苷的酵母菌株，但还在酵母基因组中ECM3基因座内区额外整合有由酵母TPII启动子控制的大肠杆菌EntGD PPT酶的表达盒(如Hansen等.(2009)Appl.Environ.Microbiol.75(9)：2765-2774中所述)，通过用MET15表达盒替换编码序列来破坏SUC2和用Tn5ble表达盒替换编码序列来破坏LEU2以赋予对腐草霉素的耐性.将所得酵母菌株称为V28。该菌株还编码重组拟南芥UDP-葡萄糖基转移酶(UGT72E2，GenBank登录号：Q9LVR1)，其具有图19(SEQ ID NO：178)中所示氨基酸序列。
[0797] 实施例20-在已生物合成香草醛葡萄糖苷的酵母中蔗糖转运蛋白和蔗糖合酶的表达
[0798] 通过使用校正(proof-reading)PCR聚合酶，通过由制备自拟南芥的cDNA进行PCR扩增来分离来自拟南芥的蔗糖转运蛋白SUC1。通过用SpeI和EcoRI进行限制性消化来转移所得PCR片段并插入相应的低拷贝数酵母表达载体p416-TEF(基于CEN-ARS的载体)中，基因可以从该载体中由强TEF启动子表达。将所得质粒命名为pVAN192。图19B中给出了所编码蔗糖转运蛋白的序列(GenBank登记号：AEE35247，SEQ ID NO：179)。
[0799] 通过使用校正PCR聚合酶，通过由制备自拟南芥的cDNA进行PCR扩增来分离来自小果咖啡(登记号：CAJ32596)的蔗糖合酶SUS1。通过用SpeI和SalI进行限制性消化来转移该PCR片段并插入高拷贝数酵母表达载体p425-GPD(基于2μm的载体)中相应的位置处，基因可以从该载体中由强GPD启动子表达。将所得质粒命名为pMUS55。图19C中给出了所编码蔗糖合酶的序列(GenBank登记号：CAJ32596；SEQ ID NO：180)。
[0800] 采用醋酸锂转化方案，通过基因转化将pVAN192和pMUS55引入酵母菌株V28中，产生酵母菌株V28：：pVAN192：：pMUS55。通过用空质粒P146-TEF和P425-GPD转化V28来制备对照菌株。
[0801] 使用不含芳族氨基酸并且补充有2％葡萄糖和2％蔗糖的SC(合成完全)培养基(调节为pH5.0)，将这两个酵母菌株培养在500 ml Erlenmeyer摇瓶中的200 ml培养物中。在30℃，将培养物以适中的旋转(150 rpm)孵育72小时。在72小时时取出样品，并确定香草醛葡萄糖苷的含量。如从下表可见，对照菌株(含空质粒p416-TEF和p425-GPD)中的VG产生为330 mg/L VG，而表达蔗糖合酶和蔗糖转运蛋白的酵母菌株V28：：pVAN192：：pMUS55产生445 mg/l VG，其对应于VG产生34.8％的增加。
[0802]菌株 香草醛葡萄糖苷(72小时后的g/L)
V28(p416-TEF+P425-GPD) 330
V28：：pVAN192：：pMUS55 445
V28(p416-TEF+P425-GPD) 330
V28：：pVAN192：：pMUS55 445
[0803] 这表明，蔗糖合酶和蔗糖转运蛋白与葡萄糖基转移酶的共表达提高了糖基化小分子糖苷配糖的能力，并且糖基化糖苷配糖的浓度显著提高.在这种情况下，实现了香草醛糖基化的显著提高，导致终产物香草醛-O-β-葡萄糖苷的滴度提高。
[0804] 实施例21-改进的产生甜菊醇糖苷类的菌株
[0805] 酿酒酵母EFSC2763的菌株构建
[0806] EFSC2763酵母菌株来自含三种营养缺陷型修饰(即，URA3、LEU2和HIS3的缺失)的野生型酿酒酵母菌株。菌株的遗传学已稳定并且可以用作常规的二倍体或单倍体酵母菌株。通过四种DNA构建体的基因组整合来将EFSC2763转化为产生甜菊醇糖苷类的酵母。每种构建体含有通过同源重组引入酵母基因组的多个基因.此外，通过同源重组装配构建体一和二。
[0807] 第一构建体含有八个基因，并且插入DPP1基因座中，破坏和部分地缺失DPP1(参见实施例18)。所插入的DNA包含：棉囊阿舒氏酵母TEF启动子表达MatMX基因(可选标记)，接着是棉囊阿舒氏酵母的TEF终止子；由天然酵母GPD1启动子表达的Gene Art密码子优化的甜叶菊UGT85C2(参见实施例10)，接着是天然酵母CYC1终止子；使用TPI1启动子表达的甜叶菊CPR-8(参见图13)，接着是天然酵母TDH1终止子；由PDC1启动子表达的拟南芥贝壳杉烯合酶(KS-5，参见实施例13，SEQ ID NO：156)，接着是天然酵母FBA1终止子；使用TEF2启动子表达的聚球藻属GGPPS(GGPPS-7)，接着是天然酵母PFI1终止子；由TEF1启动子编码的DNA2.0密码子优化的甜叶菊KAHe1(参见实施例11，SEQ ID NO：165)，接着是ENO2终止子；使用FBA1启动子表达的甜叶菊KO-1，接着是天然酵母TDH1终止子；以及使用PGK1启动子表达的玉米截短的CDPS(参见实施例14)，接着是天然酵母ADH2终止子。
[0808] 第二构建体插入在YPRCΔ15基因座处，并且含有在表达KanMX基因(可选择标记)之前的来自棉囊阿舒氏酵母的天然酵母TEF启动子，接着是来自棉囊阿舒氏酵母的TEF终止子；由PGK1启动子表达的Gene Art密码子优化的拟南芥ATR2(参见图13B)，接着是酵母ADH2终止子；由TPI1启动子表达的甜叶菊UGT74G1，接着是酵母TDH1终止子；由TEF1启动子表达的Gene Art密码子优化的甜叶菊UGT76G1，接着是酵母ENO2终止子；以及由GPD1启动子编码的GeneArt密码子优化的甜叶菊UGT91D2e-b(参见实施例6)，接着是酵母CYC1终止子。
[0809] 通过接合和分离在相同的孢子克隆中将第一构建体和第二构建体组合。然后在两个依次事件中用构建体三和四转化酵母菌株。
[0810] 构建体三整合在基因PRP5与YBR238C之间，并且在表达K.lactisLEU2基因中包含棉囊阿舒氏酵母的TEF启动子，接着是棉囊阿舒氏酵母的TEF终止子；GPD1启动子表达DNA2.0优化的甜叶菊KAHe1，接着是CYC1终止子；以及TPI1启动子表达玉米截短的CDPS。构建体四整合在基因组的ECM3与YOR093C之间，其中表达盒包含表达K.pneumoniae hph基因的棉囊阿舒氏酵母的TEF启动子，接着是棉囊阿舒氏酵母的TEF终止子，由GPD1启动子表达的聚球藻GGPPS，随后是CYC1终止子，以及表达拟南芥贝壳杉烯合酶的TPI1启动子。然后移除四种所用遗传标记。
[0811] 如通过LC-MS分析的，在从细胞和培养液中对总甜菊醇糖苷类进行DMSO提取之后，在30℃于3ml SC(合成完全)培养基中在深孔培养板中以320RPM振荡培养四天之后，EFSC2772产生40μM至50μM或2μM至3μM/OD600的莱鲍迪苷A。
[0812] 酿酒酵母EFSC2772的菌株构建
[0813] EFSC2772非常类似于菌株2763，区别在于未移除遗传标记，并且通过转化引入两种质粒p413TEF(具有HIS3标记的公共结构域CEN/ARS穿梭质粒)和p416-TEF(具有URA3标记的公共结构域CEN/ARS穿梭质粒)来使菌株成为原养型，并命名为EFSC2772.
[0814] 如通过LC-MS分析的，在从细胞和培养液中对总甜菊醇糖苷类进行DMSO提取之后，EFSC2772在深孔培养板中培养后产生与2763的水平类似的莱鲍迪苷A。通过在2L(工作体积)发酵器中厌氧分批培养获得了较高的光学密度和较高的滴度，所述培养包括在基础培养基(合成完全培养基)中约16小时的生长期，接着约100小时的供给用作碳源和能量源的葡萄糖与微量金属、维生素、盐和酵母氮源(YNB)和/或氨基酸补充组合。将pH保持在接近pH5，将温度设置为30℃。如通过LC-MS所证实的，在两个不同的实验中，组合的细胞和胞外产物浓度为920mg/L至1660mg/L的Reb-A和约300mg/L至320mg/L的Reb-D，当获得了较高的滴度结果时，在培养液中检测到了约700mg/L的Reb-A。此外，对于Reb-B见到了大峰，并且本领域技术人员将理解，UGT74G1的额外拷贝或UGT74G1的上调将进一步增加RebB转化为RebA。
[0815] 以与上述类似的方式制备菌株EFSC2743，但是不用赋予原养型的两种质粒，并且添加由TEF启动子表达EUGT11的基于p416(CEN/ARS)的质粒。按照上述以分批发酵来培养菌株。该菌株产生总量为920mg/L的RebD，并且还见到约9：1的RebD：RebA。在培养液中见到了约360mg/L的RebD。
[0816] 实施例22-UDP-葡萄糖容量
[0817] 在实施例21中，示出酵母可以将1mM甜菊醇完全糖基化为例如RebD、RebB和RebA。类似地，酵母菌株能糖基化多至60mM的其他小分子产物(数据未示出)。但是，酵母天然UDP-葡萄糖再生系统的糖基化限度是未知的，或者其补充细胞壁合成所需之UDP-葡萄糖池的速率是未知的。因此，设计了实验以研究UDP.葡萄糖产生的增加是否会提高酵母中糖基化速率。用具有编码蔗糖转运蛋白UGT74G1和拟南芥SUS的拟南芥sucl基因的质粒转化suc2缺失突变体。UGT74G1能够快速地将甜菊醇糖基化为甜菊醇19-O-单葡萄糖苷(19-SMG)。在含有
4ml的缺乏亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的SC培养基的13ml培养管中将转化体预培养过夜。次日，离心对应于2OD600单位的细胞，并在2ml的新鲜培养基中重悬，所述新鲜培养基含有2％蔗糖和或100μM甜菊醇。在30℃，将培养物在培养管中振荡3天。1小时、3小时、6小时、21小时和46小时之后，获取等分试样。离心100μl的等分试样培养物，并添加等体积的DMSO.涡旋样品，在80℃加热15分钟，离心，通过LC-MS分析19-SMG含量。在所测试时间点，野生型和SUS1增强的菌株之间未观察到甜菊醇糖基化速率的显著差异。这表明，UGT74G1对甜菊醇的糖基化以低于酵母再生UDP-葡萄糖的速率进行，并且可能不需要额外的UDP-葡萄糖以在体内实现高滴度的小分子糖基化。尽管如此，在实施例8中示出了SUS在体外回收UDP-葡萄糖的用途，因此，如果UDP-葡萄糖成为限制的话，则期望其在体内系统中的使用提高甜菊醇糖苷类的产生速率.
4ml的缺乏亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的SC培养基的13ml培养管中将转化体预培养过夜。次日，离心对应于2OD600单位的细胞，并在2ml的新鲜培养基中重悬，所述新鲜培养基含有2％蔗糖和或100μM甜菊醇。在30℃，将培养物在培养管中振荡3天。1小时、3小时、6小时、21小时和46小时之后，获取等分试样。离心100μl的等分试样培养物，并添加等体积的DMSO.涡旋样品，在80℃加热15分钟，离心，通过LC-MS分析19-SMG含量。在所测试时间点，野生型和SUS1增强的菌株之间未观察到甜菊醇糖基化速率的显著差异。这表明，UGT74G1对甜菊醇的糖基化以低于酵母再生UDP-葡萄糖的速率进行，并且可能不需要额外的UDP-葡萄糖以在体内实现高滴度的小分子糖基化。尽管如此，在实施例8中示出了SUS在体外回收UDP-葡萄糖的用途，因此，如果UDP-葡萄糖成为限制的话，则期望其在体内系统中的使用提高甜菊醇糖苷类的产生速率.
[0818] 实施例23-在体内由葡萄糖产生Reb-C和Reb-F
[0819] 由甜菊醇产生RebC
[0820] 之前的实验(公开号：WO/2011/153378)已表明，重组表达的拟南芥RHM2(鼠李糖合成酶，基因座标签AT1G53500)能够将UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖。当在体外用UGT91D2e和甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷孵育时，该UDP-鼠李糖可用于产生甜菊醇-13-O-吡喃糖基-1，2-鼠李糖苷。
[0821] 进行其他实验以确认通过在体内于酵母中表达全部4种UGT和RHM2由甜菊醇产生了RebC，接着进行甜菊醇供给。用表达野生型基因序列的以下质粒转化EFSC301菌株(MATa，lys2ADE8his3ura3leu2trpl)：表达野生型UGT74G1的p424GPD(登录号：AY345982)；表达野生型85C2的p423GPD(登录号：AY345978.1)；以及在GPD启动子控制下的表达野生型UGT76G1和UGT91D2e的得自p426GPD的质粒(登录号：AY345974)。用UGT共转化表达RMH2或空p425GPD对照质粒的质粒p425GPD。在含有2ml至3ml的缺乏亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶的SC培养基的13ml培养管中将转化体预培养过夜。次日，在生长达到0.4OD600单位后，离心细胞，在含有25μM甜菊醇的新鲜培养基中重悬。在30℃，将培养物在培养管中振荡3天。离心100μl的等分试样培养物。向该样品的上清液中添加等体积的DMSO，同时向沉淀中添加200μL的50％DMSO。涡旋样品，在80℃加热15分钟，离心，通过LC-MS分析甜菊醇糖苷类含量。只有在RHM2基因与所述UGT共表达时，才在培养基和细胞提取物中检测到的RebC。定量表明，产生了约等量的RebA和RebC。这表明，RHM2能够在体内产生显著量的UDP-鼠李糖，并且UGT91D2e能够在体内高效鼠李糖基化。通过LC-MS观察到了两种其他化合物，其中驻留时间分别为5.64分钟和5.33分钟，并且m/z对应于甜菊醇和1个葡萄糖-和1个鼠李糖(甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷(steviol-1，2rhamnobioside))和2个葡萄糖和1个鼠李糖(杜尔可苷A)。这表明，甜菊醇糖苷类途径中保留的UGT能够接受鼠李糖化中间体，即，鼠李糖化步骤不需要在最后发生。
[0822] 此外，进行一系列依次的体外实验来确定是否任何尽头(dead-end)反应都发生在莱鲍迪苷C途径中。参见图2B。例如，通过采用体外反应来证实UGT91D2e对甜叶悬钩子苷的鼠李糖化活性和或产物通过UGT76G1向RebC的后续转化。在该实验中，用甜叶悬钩子苷、NADPH、NAD+和UDP-葡萄糖与在大肠杆菌中重组地表达和纯化的UGT91D2e和RHM2一起孵育过夜.然后煮沸反应混合物以使酶变性.向具有UDP-葡萄糖的UGT76G1酶制剂中添加反应物等分试样。在UGT91D2e和RHM2的存在下将甜叶悬钩子苷转化为具有对应于含2-葡萄糖和1-鼠李糖之甜菊醇的m/z的化合物。然后，在UGT76G1的存在下，将该化合物转化为RebC，这表明，该中间体是杜尔可苷A。因此，该实验表明，UGT91D2e能够对甜叶悬钩子苷进行鼠李糖基化，并且UGT76G1能够将该产物转化为RebC。
[0823] 类似地，通过体外反应示出通过UGT91D2e鼠李糖化13-SMG(形成具有一个葡萄糖和一个鼠李糖的甜菊醇化合物)，以及后续的通过UGT76G1形成具有2个葡萄糖和1个鼠李糖的化合物.该化合物具有特殊的驻留时间(4.56分钟)，并且认为它是甜菊醇13-O-1，3-二糖苷-1，2-鼠李糖苷(steviol 13-O-1，3-diglycoside-1，2-rhamnoside)。当将甜菊醇进料给表达四种UGT和RHM2的酵母时也观察到了该化合物。
[0824] 从现有数据中显示UGT91D2e能够鼠李糖化13-SMG和甜叶悬钩子苷。还示出，UGT74G1和UGT76G1能够代谢由UGT91D2e从13-SMG产生的鼠李糖化化合物。当用其余UGT(UGT74G1或UGT76G1，取决于之前步骤所用的UGT)孵育这些化合物时，RebC形成。这表明，糖基化的顺序不太重要，因为UGT74G1和UGT76G1能够将鼠李糖化底物糖基化。
[0825] 由葡萄糖产生RebC
[0826] 将表达RHM2和UGT 76G1与91D2e的质粒转化到稳定的生产甜叶悬钩子苷的EFSC1923菌株(参见实施例15)中。该酵母是具有整合入基因组的UGT85C2(登录号：
AY345978.1)和74G1(登录号：AY345982)以及营养缺陷型修饰的酿酒酵母CEN.PK 111-61A衍生物。在菌株EFSC1923(参见实施例15)中，通过用CUP1铜诱导型启动子替换内源启动子来下调由ERG9编码的角鲨烯合酶的表达。菌株EFSC1923还含有在酿酒酵母PRP5-YBR238C基因间区中的构巢曲霉GGPPS合酶(GGPPS-10)表达盒、在MPT5-YGL176C基因间区中的玉米全长CDPS(CDPS-5)和甜叶菊CPR(CPR-1)基因表达盒、在ECM3-YOR093C基因间区中的甜叶菊贝壳杉烯合酶和CDPS(KS-1/CDPS-1)基因表达盒、在KIN1-INO2基因间区中的拟南芥KAH(KAH-
3)和甜叶菊KO(KO-1)基因表达盒、在MGA1-YGR250C基因间区中的甜叶菊UGT74G1基因表达盒以及通过替换TRP1基因ORF20整合的甜叶菊UGT85C2基因表达盒。公开的PCT WO/2011/
153378的表11中描述了插入甜菊醇途径基因。
AY345978.1)和74G1(登录号：AY345982)以及营养缺陷型修饰的酿酒酵母CEN.PK 111-61A衍生物。在菌株EFSC1923(参见实施例15)中，通过用CUP1铜诱导型启动子替换内源启动子来下调由ERG9编码的角鲨烯合酶的表达。菌株EFSC1923还含有在酿酒酵母PRP5-YBR238C基因间区中的构巢曲霉GGPPS合酶(GGPPS-10)表达盒、在MPT5-YGL176C基因间区中的玉米全长CDPS(CDPS-5)和甜叶菊CPR(CPR-1)基因表达盒、在ECM3-YOR093C基因间区中的甜叶菊贝壳杉烯合酶和CDPS(KS-1/CDPS-1)基因表达盒、在KIN1-INO2基因间区中的拟南芥KAH(KAH-
3)和甜叶菊KO(KO-1)基因表达盒、在MGA1-YGR250C基因间区中的甜叶菊UGT74G1基因表达盒以及通过替换TRP1基因ORF20整合的甜叶菊UGT85C2基因表达盒。公开的PCT WO/2011/
153378的表11中描述了插入甜菊醇途径基因。
[0827] 使用以下转化EFSC1923菌株：使用GPD启动子表达野生型UGT74G1和UGT85C2序列的p426GPD-衍生质粒，和表达处于GPD启动子控制下的野生型UGT76G1(登录号：AY345974)和UGT91D2e(参见SEQ ID NO：5)的p423GPD-衍生质粒。共同转化表达拟南芥RHM2(酶基因座标签AT1G53500)或空p425GPD对照质粒的质粒p425GPD。在含有2ml至3ml的缺乏亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的SC培养基的13ml培养管中将转化体预培养过夜。次日，在生长达到0.4OD600单位时，离心细胞，在新鲜培养基中重悬。在30℃于培养管中振荡3天。离心100μl的培养物。向该上清液中添加等体积的DMSO，同时向沉淀中添加200μL的50％DMSO。涡旋样品，在80℃加热15分钟，离心，通过LC-MS分析甜菊醇糖苷类含量。
[0828] 培养基的分析和该菌株的归一化胞内含量表明RebC的产生。如通过LC-MS确定的，产生了约8μM RebC和4μM RebA。此外，在该实验中，未检测到在甜菊醇供给之后产生的中间体。RebC的累积严格依赖于RHM2的表达。该实施例证明了由葡萄糖从头生物合成RebC。
[0829] 由甜菊醇和葡萄糖产生额外的甜菊醇糖苷类
[0830] 使用于上述相同的GPD基质粒，用产生RebB(UGT76G1和UGT91D2e/EUGT11)、RebE(UGT91D2e/EUGT11)和杜尔可苷A(RHM2、UGT91D2e/EUGT11)所需的UGT转化含有UGT74G1和UGT85C2的稳定的产生甜菊醇的菌株EFSC1923。将发现具有较高二糖基化活性的野生型EUGT11(NCBI：NP_001051007)克隆到p424GPD中用于该实验。在含有2ml至3ml的缺乏亮氨酸、组氨酸、色氨酸和尿嘧啶的SC培养基的13ml培养管中将转化体预培养过夜。次日，在生长达到0.4OD600单位后，离心细胞，在含有25μM甜菊醇的新鲜培养基中重悬(葡萄糖实验除外)，在30℃于培养管中振荡3天。离心100μl的等分试样培养物。向该样品的上清液中添加等体积的DMSO，同时向沉淀中添加200μL的50％DMSO。涡旋样品，在80℃加热15分钟，离心，通过LC-MS分析甜菊醇糖苷类含量。LC-MS分析确认了在酿酒酵母中由葡萄糖或甜菊醇在体内产生RebB、RebE和杜尔可苷A。参见，例如图2A和2B。在甜菊醇供给之后观察到了较高浓度的甜菊醇糖苷类(如通过层析图所判断的)。
[0831] 使用EUGT11来表征RebF途径中间体
[0832] 在体外比较UGT91D2e和EUGT11的木糖基化性质。通过使用UDP-木糖作为糖供体，UGT91D在之前示出甜将菊醇-13-O-单糖苷木糖基化，形成RebF生物合成中的关键中间体(公开号：WO/2011/153378)。使用EUGT11和UGT91D2e的类似体外实验示出，这些UGT能够将甜叶悬钩子苷木糖基化。当使用UGT91D2e时，LC-MS分析示出新的峰，其m/z比对应于具有2个葡萄糖分子和1个木糖的甜菊醇.参见图26。因为驻留时间的移动，认为该峰对应于在13-O-葡萄糖上木糖化的甜叶悬钩子苷。当使用EUGT11时，LC-MS分析在驻留时间3.99分钟和4.39分钟处示出两个新的、类似大小的峰，其中m/z比对应于具有2个葡萄糖和1个木糖的甜菊醇。这些产物最可能对应于在两个位置13-O-葡萄糖或19-O-葡萄糖任一处木糖化的甜叶悬钩子苷。
[0833] 由葡萄糖产生RebF
[0834] RebF的体内产生需要从拟南芥克隆UGD1(UDP-葡萄糖脱氢酶)和USX3(UDP-葡糖醛酸脱氢酶)用以产生UDP-木糖。将UGD1和UXS3插入衍生自P425-GPD的高拷贝(2μ)载体中，该载体含有两个表达盒，并由强组成型启动子(分别为TPI1和GPD1)表达。将该质粒转化入生产RebA的菌株EFSC2763(实施例21中有述)中，并在选择培养基(SC-leu)中培养3天的时间。LC-MS结果清楚地示出在驻留时间4.13分钟处出现新的峰，其m/z比对应于具有3个葡萄糖和1个木糖的甜菊醇，并且鉴定为RebF(基于市售RebF标准品)，以及其他新的峰，其m/z比对应于具有2个葡萄糖和1个木糖的甜菊醇(如上所述)，表明UGT91D2e能够在体内实施木糖基化。在阴性对照中未见到这些峰。
[0835] 实施例24-使用异源插入物下调角鲨烯合酶(ERG9)的作用
[0836] 在酵母例如酿酒酵母中，甲羟戊酸途径产生角鲨烯合酶生物合成途径中的类异戊二烯磷酸中间体(参见图20)。酵母中的角鲨烯合酶是ERG9.酿酒酵母角鲨烯合酶参见GenBank登录号：P29704.2；粟酒裂殖酵母角鲨烯合酶参见P36596；解脂亚罗酵母角鲨烯合酶参见Q9Y753；光滑假丝酵母角鲨烯合酶参见Q9HGZ6；棉囊阿舒氏酵母角鲨烯合酶参见Q752X9；Cyberlindnera jadinii角鲨烯合酶参见O74165；白色念珠菌角鲨烯合酶参见P78589；酿酒酵母羊毛甾醇合酶参见P38604；智人角鲨烯合酶参见P37268；小家鼠角鲨烯合酶参见P53798；以及褐家鼠角鲨烯合酶参见Q02769。参见图25(SEQ ID NO：192-202)。
[0837] 在ERG9基因的5’UTR中引入茎环结构
[0838] 通过同源重组用CYC1启动子序列和5'UTR序列代替野生型ERG9启动子区。该5'UTR区包含可以形成茎环结构的序列。参见SEQ ID NO.181-183。SEQ ID NO：184是可以使用的另一条序列。
[0839] SEQ ID NO：181(异源插入序列1)：TGAATTCGTTAACGAATTC
[0840] SEQ ID NO：182(异源插入序列2)：TGAATTCGTTAACGAACTC
[0841] SEQ ID NO：183(异源插入序列3)：TGAATTCGTTAACGAAGTC
[0842] SEQ ID NO：184(异源插入序列4)：TGAATTCGTTAACGAAATT
[0843] 不受特定机制约束，茎环可以部分地阻断5’-3’方向的AUG核糖体扫描，并减少转录物的翻译。对具有不同碱基配对程度的茎环进行测试以寻找充分地减少ERG9转录物翻译以提高FPP水平而不会影响酵母菌株生长的茎环。
[0844] 通过PCR生成包含以下的DNA片段：ERG9启动子上游序列(用于同源重组)、赋予对诺尔丝菌素之耐性的基因(NatR)的表达盒、CYC1启动子(SEQ ID NO：185，图21)、具有茎环结构的5’UTR序列以及ERG9ORF序列(用于同源重组)。还生成了包含CYC1启动子或KEX2启动子(SEQ ID NO：186)而没有茎环的DNA片段作为对照。通过PCR寡核苷酸引入用于重组的侧接ERG9序列以及茎环结构。图22中示出了用于同源重组之构建体的综述。将DNA片段转化入酿酒酵母宿主菌株中，然后在含诺尔丝菌素之生长培养板上选择所述菌株。鉴定出具有天然ERG9启动子与CYC1启动子和含茎环5'UTR序列的成功交换的克隆。图23中提供了茎环区的综述和序列。鉴定为5％的序列对应于具有SEQ ID NO：181的异源插入序列；鉴定为20％的序列对应于具有SEQ ID NO：182的异源插入序列；鉴定为50％的序列对应于具有SEQ ID NO：183的异源插入序列。
[0845] FPP累积的评定(增强作用)
[0846] 紫穗槐-4，11-二烯合酶(amorpha-4，11-diene Synthase，ADS)基因催化在植物黄花蒿(Artemisia annua)中将一个FPP分子转化成紫穗槐-4，11-二烯的化学反应。该基因在酿酒酵母中有功能并且是高效的，其可用于使用在ERG9基因的异源5'UTR中引入的茎环结构直接评定菌株中FPP的累积。将编码ADS(GenBank登录号：AAF61439)的酿酒酵母密码子优化的核酸在PGK1启动子的控制下克隆到多拷贝质粒(2μ)上，并在野生型中转化和改造酿酒酵母菌株。如(Ro等.2006.Nature440(7086)：940-943；Paradise等.Biotechnol Bioeng.2008年6月1日；100(2)：371-8；Newman等.Biotechnol Bioeng 95(4)：684-691)所述测量紫穗槐-4，11-二烯产生，并与标准的化合物石竹烯进行比较。
[0847] 化学品
[0848] 十二烷和石竹烯购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。用于形成合成的完全(SC)培养基的完全补充混合物购自Formedium(UK)。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich。
[0849] 酵母培养
[0850] 将改造的酵母菌株培养在除去尿嘧啶的SC2％葡萄糖中。将培养物在30℃培养过夜，然后用于在含25mL SC培养基的250mL摇瓶中接种主培养物，并培养至在600nm处的光密度为0.1。将主培养物在30℃培养72小时。因为非常低的浓度的紫穗槐二烯可以从水性培养物中挥发，所以向每个培养瓶中添加2.5mL十二烷，以截留和保留所产生的紫穗槐二烯。取10μl的十二烷层作为样品并在乙酸乙酯中稀释100倍用于通过GC-MS定量。
[0851] 紫穗槐二烯的GC-MS分析
[0852] 采用GC-MS来测量酵母培养物的紫穗槐二烯产量。使用下述方法分析样品：使用80℃的GC烘箱温度程序2分钟，然后以30℃/分钟渐升(ramping)至160℃，然后以3℃/分钟升至170℃，最后以30℃/分钟升至300℃，并最后保持2分钟。注射器和MS四极检测器温度分别为250℃和150℃。以较小分流模式注入1μL。在全扫描模式下操作MS。采用总离子，使用石竹烯标准曲线以(-)-反式-石竹烯当量计算紫穗槐二烯浓度。
[0853] 当使用具有SEQ ID NO：181中所示核苷酸序列的异源插入物时，与没有插入物或者具有SEQ ID NO：182和183中所示核苷酸序列的插入相比，包括不同启动子构建体的不同菌株的分析示出增加的紫穗槐二烯产量(2.5×)。SEQ ID NO：181中所示异源插入序列具有最稳定的二级结构。为了进行比较，还分析列具有非经修饰ERG9的野生型酵母(图24：CTRL-ADS)，并且该菌株示出甚至更低的紫穗槐二烯产量。相反，包含非常弱的启动子ScKex2的构建体示出甚至更高水平的紫穗槐二烯(6×)。
[0854] 实施例25-角鲨烯合酶(ERG9)下调和GGPPS过表达对GGPP产生的作用的分析
[0855] GGPP累积的评定
[0856] 酿酒酵母含有GGPPS(BTS1)。除了BTS1以外，还有在酿酒酵母中有功能并且有效的数种异源GGPPS酶.当功能性GGPPS在酿酒酵母中过表达时，其导致GGPP累积，GGPP可以通过酿酒酵母酶DPP1和LPP1转化为香叶基香叶醇(GGOH)。GGOH部分地输出到酵母培养基中。可以通过GC-MS来测量GGOH，并且其积累可直接用于评定可用于使用GGPP作为底物之酶的GGPP潜在合并物。
[0857] 对四种不同的GGPPS(GGPPS-1(嗜酸热硫化叶菌，参见表7)、GGPPS-2(构巢曲霉，图25，SEQ ID NO：203)、GGPPS-3(酿酒酵母BTS1，图25，SEQ ID NO：167)和GGPPS-4(小家鼠，参见表7))进行了评定。编码GGPPS-1、GGPPS-2和GGPPS-4的核苷酸序列是酿酒酵母密码子优化的.在PGK1启动子的控制下将全部编码GGPPS多肽的核酸克隆到多拷贝质粒(2μ)上，并转化进两种不同的ERG9下调菌株：KEX2-ERG9和CYC1(5％)-ERG9(参见实施例24)。
[0858] 将改造的酵母菌株培养在除去尿嘧啶的SC2％葡萄糖中。用于配制合成完全(SC)培养基的完全补充混合物购自Formedium(UK)。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。所有光学密度测量都在OD600nm处进行。将培养物在30℃培养过夜，然后用于接种包含25ml培养基的250ml无挡板的培养瓶(在OD600处为0.1)中。将主培养物在30℃培养72小时。
[0859] 为了测量GGOH累积，分开提取酵母细胞(沉淀)和酵母培养基(上清液)，然后组合，并通过GC-MS分析。以1∶1的比例用己烷萃取上清液。首先，在包含20％KOH和50％KOH以及50％乙醇的溶液中对沉淀进行皂化，最后以1∶1的比例用己烷萃取裂解的细胞。使用80℃的GC烘箱温度程序2分钟，然后以30℃/分钟渐升(ramping)至160℃，然后以3℃/分钟升至170℃，最后以30℃/分钟升至300℃，并最后保持2分钟。注射器和MS四极检测器温度分别为250℃和150℃。以较小分流模式注入2μL.在全扫描模式下操作MS。
[0860] 当GGPPS在CYC1(5％)-ERG9菌株或KEX2-ERG9菌株中过表达时，与未表达GGPPS的对照相比，使用四种GGPPS多肽全部都观察到了GGOH(GGPP)产量的显著增加。特别地，CYC1(5％)-ERG9菌株示出比KEX2-ERG9菌株高出2至4倍的GGOH(GGPP)累积。结果示出图26中。
[0861] 其他实施方案
[0862] 应当理解，虽然结合详细的说明书对本发明进行了描述，但是以上描述旨在举例说明并且不限制由所附权利要求书之范围限定的本发明的范围。其他方面、优点和改进都在所附权利要求的范围内。
[0863] 本发明还涉及以下实施方案：
[0864] 1.重组宿主，其包含编码与SEQ ID NO：152中所示氨基酸序列具有至少约80％同一性之多肽的重组基因；
[0865] 所述宿主任选地包含以下中的一个或更多个：
[0866] (a)重组基因，其编码UGT91d2e或UGT91d2m多肽，例如，在SEQ ID NO：5的第211和286位残基处具有替换的UGT91d2e多肽，例如UGT91D2e-b，其在SEQ ID NO：5的第211位残基处具有甲硫氨酸和在第286位残基处具有丙氨酸；
[0867] (b)重组基因，其编码与图12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：164)(KAHe1)具有约80％同一性之甜菊醇合酶多肽；
[0868] (c)重组基因，其编码缺少叶绿体转运肽之对映-柯巴基二磷酸合酶(EC 5.5.1.13；CDPS)多肽；
[0869] (d)一种或更多种外源核酸，其编码蔗糖转运蛋白例如拟南芥的SUC1序列和蔗糖合酶例如小果咖啡、拟南芥或甜叶菊的SUS1序列，特别地，其中所述一种或更多种外源核酸的表达和糖基转移酶的表达导致所述宿主中尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)水平提高；
[0870] (e)重组基因，其编码与图13中所示甜叶菊CPR氨基酸序列(SEQ ID NO：170)具有至少约80％序列同一性之CPR多肽；
[0871] (f)核酸序列，所述核酸包含与开放阅读框有效连接的异源插入序列，其中所述异源插入序列具有通式(I)：
[0872] -X1-X2-X3-X4-X5- (I)，
[0873] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补的至少4个连续核苷酸，其中X3包含零个核苷酸或者形成发夹环的一个或更多个核苷酸，其中X1和X5各自独立地由零个核苷酸或者一个或更多个核苷酸组成，其中所述开放阅读框编码角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)；
[0874] (g)一个或更多个外源核酸，其编码甜叶菊KO多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：138具有至少约80％同一性的序列，和拟南芥CPR多肽例如SEQ ID NO：168；
[0875] (h)重组基因，其编码拟南芥KS多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：156具有至少约80％同一性的序列；
[0876] (i)经过密码子优化的重组基因，其编码UGT85C；和
[0877] (j)重组基因，其编码GGPPS。
[0878] 2.重组宿主，其包含编码与图12C中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：164)具有至少约80％同一性之多肽的重组基因，例如约85％同一性、约90％同一性、约95％同一性或约
100％同一性。
100％同一性。
[0879] 3.重组宿主细胞，其包含核酸序列，所述核酸序列包含与开放阅读框有效连接的异源插入序列，其中所述异源插入序列具有通式(I)：
[0880] -X1-X2-X3-X4-X5-
[0881] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补的至少4个连续核苷酸，
[0882] 其中X3包含零个核苷酸或者形成发夹环的一个或更多个核苷酸，
[0883] 其中X1和X5各自独立地由零个核苷酸或者一个或更多个核苷酸组成，
[0884] 其中所述开放阅读框编码角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)。
[0885] 4.根据实施方案3所述的细胞，其中所述核酸序列包含：
[0886] i)启动子序列，其有效连接至
[0887] ii)异源插入序列，其有效连接至
[0888] iii)开放阅读框，其有效连接至
[0889] iv)转录终止信号；
[0890] 其中所述异源插入序列具有通式(I)：
[0891] -X1-X2-X3-X4-X5- (I)，
[0892] 其中，X2包含与X4的至少4个连续核苷酸互补并且形成茎二级结构元件的至少4个连续核苷酸，并且其中X3包含在X2与X4之间形成发夹环的核苷酸，并且其中X1和X5独立地并且任选地包含一个或更多个核苷酸，并且
[0893] 其中所述开放阅读框通过表达编码与角鲨烯合酶(EC 2.5.1.21)具有至少约70％同一性的多肽序列或其生物活性片段，所述片段在至少100个氨基酸重叠的范围内与所述角鲨烯合酶具有至少约70％序列同一性。
[0894] 5.根据实施方案3或4中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码GGPPS的异源核酸，其与在所述细胞中指导GGPPS表达的核酸序列有效连接。
[0895] 6.重组宿主，其包含重组基因，所述重组基因编码缺少叶绿体转运肽的对映-柯巴基二磷酸合酶(EC 5.5.1.13；CDPS)多肽。
[0896] 7.根据实施方案6所述的宿主，其中所述多肽是玉米CDPS，其从未经修饰的玉米CDPS多肽的羧基末端缺少50个氨基酸。
[0897] 8.根据实施方案1至7中任一项所述的宿主，所述宿主还包含以下中的一个或更多个：
[0898] 编码与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有约90％或更大同一性之UGT85C多肽的重组基因；
[0899] 编码与SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列具有约90％或更大同一性之UGT76G多肽的重组基因；
[0900] 编码UGT74G1多肽的基因例如重组基因；以及
[0901] 编码UGT91D2功能性同源物的基因。
[0902] 9.根据实施方案1至8中任一项所述的宿主，所述宿主还包含以下中的一个或更多个：
[0903] (i)编码香叶基香叶基二磷酸合酶的基因；
[0904] (ii)编码柯巴基二磷酸合酶和贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基二磷酸合酶例如与SEQ ID NO：129-131中所示氨基酸序列具有至少约90％序列同一性之柯巴基二磷酸合酶的基因以及编码贝壳杉烯合酶例如与SEQ ID NO：132-135或SEQ ID NO：156中所示氨基酸序列之一具有至少约90％序列同一性之贝壳杉烯合酶的基因；
[0905] (iii)编码贝壳杉烯氧化酶例如与SEQ ID NO：138-141中所示氨基酸序列之一具有至少约90％序列同一性之贝壳杉烯氧化酶的基因；
[0906] (iv)编码甜菊醇合成酶例如与SEQ ID NO：142-146和164中所示氨基酸序列之一具有至少约90％序列同一性之甜菊醇合成酶的基因；
[0907] (v)编码截短的HMG-CoA的基因；
[0908] (vi)编码CPR的基因；
[0909] (vii)编码鼠李糖合成酶的基因；
[0910] (viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；以及
[0911] (ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因，特别地，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)之基因中的至少之一是重组基因。
[0912] 10.根据实施方案1至9中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物，例如酵母例如酿酒酵母。
[0913] 11.一种产生甜菊醇糖苷类的方法，其包括：
[0914] a)在所述基因得以表达、例如诱导所述基因中一种或更多种表达的条件下，在培养基中培养实施方案1至10中任一项所述的宿主，
[0915] b)回收由所述宿主产生的所述甜菊醇糖苷类。
[0916] 12.根据实施方案11所述的方法，其中在转化有EUGT11多肽的通透化宿主细胞中产生所述甜菊醇糖苷类.
[0917] 13.根据实施方案12所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷类是莱鲍迪苷A，并且其中通过从糖供体转移葡萄糖部分至莱鲍迪苷A产生莱鲍迪苷D。
[0918] 14.一种用于在细胞中提高UDP-葡萄糖水平和降低UDP水平的方法，所述方法包括在含有蔗糖的培养基中于所述细胞中表达重组蔗糖合酶和重组蔗糖转运蛋白，其中所述细胞是蔗糖降解缺陷型的，或者其中所述表达导致所述细胞中UDP水平降低和UDP-葡萄糖水平提高，使得所述细胞中的糖基化增加。
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