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抗IL－6抗体、组合物、方法和用途

阅读：556发布：2020-10-21

专利汇可以提供抗IL－6抗体、组合物、方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及至少一种来源于鼠CLB－8 抗体 的新的嵌合、人源化或CDR嫁接的抗IL－6抗体，包括编码至少一种所述抗IL－6抗体的分离核酸、IL－6、载体、宿主细胞、转基因动物或 植物 、及其制备方法和用途，包括 治疗 组合物、方法和设备。，下面是抗IL－6抗体、组合物、方法和用途专利的具体信息内容。

1.一种能够抑制人IL-6的嵌合、人源化或CDR嫁接的抗体或 抗体片段，包含至少一个来源于抗IL-6鼠单克隆抗体CLB-8的重或 轻链互补决定区(CDR)和来源于一种或多种人抗体的恒定区。
2.根据权利要求1的IL-6抗体，包含至少一个包含SEQ ID NO： 7或8的重链或轻链可变区。
3.根据权利要求1的抗体，它在体内完全抑制抗IL-6鼠CLB-8 或与其具有基本相同的结合特征的抗体与人IL-6的结合。
4.根据权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗 体或特定部分或变体以至少10-9M的亲和力(Kd)与IL-6结合。
5.根据权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗 体或特定部分或变体以至少10-11M的亲和力(Kd)与IL-6结合。
6.根据权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗 体或特定部分或变体以至少10-12M的亲和力(Kd)与IL-6结合。
7.根据权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗 体是包含至少一个来源于抗IL-6鼠单克隆抗体CLB-8的重或轻链可 变区和来源于一种或多种人抗体的恒定区的嵌合抗体。
8.根据权利要求7的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗 体或特定部分或变体基本中和至少一种IL-6的至少一种活性。
9.根据权利要求8的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述活 性是选自下组的至少一种：抑制SKW6.4细胞分泌IgMμ、抑制IL- 6介导的MCP-1产生、抑制THP-1人单核细胞白血病细胞中的IL-6 信号传递、抑制IL-6诱导的HepG2细胞产生血清淀粉样蛋白A、抑 制rhIL-6诱导的细胞增殖。
10.一种编码分离的IL-6抗体的核酸，包含在严格条件下与编码 嵌合、人源化或CDR嫁接的抗体或其特定部分或变体杂交或与其具 有至少95％同一性的核酸，它包含至少一个相当于或互补于SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6中至少一个的至少90-100％连续核苷酸的互 补决定区(CDR)编码序列。
11.根据权利要求10的编码分离的IL-6抗体的核酸，其中所述 核酸由至少一个相当于或互补于SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6的 至少一个的至少90-100％连续核苷酸的互补决定区(CDR)编码序列 组成。
12.根据权利要求10的分离的核酸，编码至少一种具有至少一个 包含SEQ ID NO：7或8的可变区的抗IL-6抗体。
13.一种分离的IL-6抗体或特定部分或变体，包含由权利要求11 或12的核酸编码的分离的抗体或特定部分或变体。
14.一种编码IL-6抗体的核酸组合物，包含权利要求10的分离 核酸和载体或稀释剂。
15.一种抗体载体，包含权利要求10的核酸。
16.权利要求15的抗体载体，其中所述载体包含至少一种选自下 组的启动子：晚期或早期SV490启动子、CMV启动子、HSV tk启动 子、pgk(磷酸甘油酯激酶)启动子、人免疫球蛋白启动子或EF-1α 启动子。
17.权利要求15的抗体载体，其中所述载体包含至少一种选自下 组中至少一种的选择基因或其部分：氨甲喋呤(MTX)、绿色荧光蛋白 (GFP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、新霉素(G418)、或谷氨酰胺合成 酶(GS)。
18.包含权利要求10的分离核酸的宿主细胞。
19.根据权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一种 选自下组的细胞：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2，653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、 永生化或转化的细胞。
20.一种生产至少一种IL-6抗体或特定部分或变体的方法，包括 在体外、体内或原位条件下翻译权利要求10的核酸或在严格条件下 与其杂交的内源核酸，使得IL-6抗体或特定部分或变体以可检测或 可回收量表达。
21.一种IL-6抗体组合物或特定部分或变体组合物，包含权利要 求1的IL-6抗体或特定部分或变体，以及载体或稀释剂。
22.权利要求21的组合物，进一步包含至少一种选自下组的至少 一种化合物或蛋白：TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、 非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、 神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白 合成类固醇、糖尿病相关试剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、维生 素、钙相关激素、抗腹泻药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、 抗凝剂、促红细胞生成素、非尔司啶、沙拉斯、疫苗、免疫球蛋白、 免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、 睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射性药物、 抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、抗精神病药物、抗焦虑药、催 眠药、拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、他克林、抗哮喘药、β 激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、9-氨基四氢吖 啶、肾上腺素或类似物、α链道酶、细胞因子、细胞因子拮抗剂。
23.一种治疗细胞、组织、器官或动物中的免疫病症或疾病的方法， 包括：使所述细胞、组织、器官或动物接触或给予所述细胞、组织、 器官或动物至少一种选定的免疫调节有效量的至少一种权利要求1的 IL-6抗体或特定部分或变体。
24.权利要求23的方法，其中所述动物是灵长类动物。
25.权利要求24的方法，其中所述灵长类动物是猴或人。
26.权利要求25的方法，其中所述免疫状况是选自下组的至少一 种：类风湿性关节炎/血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、系统性 红斑狼疮、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系 统性血管炎/韦格纳肉芽肿、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除逆转程序、 过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、 过敏性结膜炎、过敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主疾 病、全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性菌脓毒症、革 兰氏阴性菌脓毒症、培养阴性菌脓毒症、真菌脓毒症、中性粒细胞减 少性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、离子辐射 暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、系统性红斑狼疮和类风湿 性关节炎、酒精诱导的肝炎、慢性炎性病变、肉样瘤病、克隆氏病、 镰状细胞贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、过敏反应、过敏性鼻炎、 枯草热、终年性肺炎、结膜炎、哮喘、风疹、全身过敏、皮炎、恶性 贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任何器官或组织的移植排斥、肾 移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、 骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种异体移植排斥、软骨移植排斥、骨移 植排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺移植排斥、任 何器官或组织的异种移植排斥、同种异体排斥、抗受体过敏反应、格 雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、哮喘、重症肌无力、 抗体介导的细胞毒性、III型过敏反应、系统性红斑狼疮、天疱疮、 硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动 性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心脏切开后综 合征、IV型过敏、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体排斥、细胞内 生物引起的肉芽肿、药物过敏、代谢性/特发性威尔逊氏病、血色素沉 着病、α-1-抗胰岛素缺陷、糖尿病肾病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松 症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、 脑脊髓炎、恶液质、囊性纤维化、家族性血巨噬细胞淋巴细胞组织细 胞增多症、皮肤病学状况、牛皮癣、斑秃、肾病综合征、肾炎、血液 透析、尿毒症、中毒、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子治疗、化疗、 放疗(如包括，但不限于虚弱、贫血、恶液质等)、慢性水杨酸盐中 毒。
27.权利要求23的方法，其中所述有效量是0.001-50mg/kg所述 细胞、组织、器官或动物。
28.权利要求28的方法，其中所述有效量是0.0001-50mg/kg所 述细胞、组织、器官或动物。
29.一种调节细胞、组织、器官或动物中的至少一种癌性病症或状 况的方法，包括：使所述细胞、组织、器官或动物接触或给予所述细 胞、组织、器官或动物至少一种选定的感染调节有效量的至少一种权 利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体。
30.权利要求29的方法，其中所述动物是灵长类动物。
31.权利要求30的方法，其中所述灵长类动物是猴或人。
32.权利要求29的方法，其中所述感染性或癌性病症或状况是选 自下组的至少一种：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病 (ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓细胞白血病(AML)、慢 性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、 骨髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非 何杰金氏淋巴瘤、布加氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西肉瘤、结直 肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺细胞癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增 多症、副癌综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤和恶性黑素瘤。
33.权利要求23的方法，其中所述有效量是0.01-100mg/kg所述 细胞、组织、器官或动物。
34.权利要求23-33的任一项的方法，其中所述接触或给药是通 过选自下组的至少一种模式：静脉内、肌内、快速注射、皮下、呼吸 道、吸入、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
35.权利要求23-33的任一项的方法，进一步包括在所述(1)接 触或给药之前、同时和/或之后，给予至少一种包含治疗有效量的至少 一种选自下组的至少一种化合物或蛋白的组合物：TNF拮抗剂、抗风 湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、 麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛 皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关试剂、矿物 质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙相关激素、抗腹泻药、止咳药、 抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗凝剂、促红细胞生成素、非尔司啶、 沙拉斯、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、 雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有 丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、 抗精神病药物、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药物、刺激剂、 donepezil、他克林、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑 制剂、甲基黄嘌呤、9-氨基四氢吖啶、肾上腺素或类似物、α链道酶、 细胞因子、细胞因子拮抗剂。
36.一种医学设备，包含至少一种权利要求1的IL-6抗体或特定 部分或变体，其中所述设备适用于通过选自下组的至少一种模式接触 或给予所述至少一种IL-6抗体或特定部分或变体：静脉内、肌内、 快速注射、皮下、呼吸道、吸入、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经 皮。
37.一种人抗体或其特定部分或变体，其中所述抗体或特定部分 或变体与权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体结合相同的表位 或抗原性区域。
38.一种制剂，包含至少一种权利要求1的IL-6抗体或特定部分 或变体和选自无菌水和无菌缓冲水的至少一种物质或至少一种选自下 组的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚 硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁、对羟基苯甲酸烷基 酯、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其 在一种水性稀释液中的混合物。
39.权利要求38的制剂，其中IL-6抗体或特定部分或变体的浓 度是大约0.1mg/ml-大约100mg/ml。
40.权利要求39的制剂，还包含等渗剂。
41.权利要求39的制剂，还包含生理可接受的缓冲剂。
42.一种制剂，包含第一容器中的冻干形式的至少一种权利要求 1的IL-6抗体或特定部分或变体和任选的第二容器，所述容器包含无 菌水、无菌缓冲水、或选自下组的至少一种防腐剂：苯酚、间甲酚、 对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、 氯丁醇、氯化镁、对羟基苯甲酸烷基酯、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢 乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其在一种水性稀释液中的混合物。
43.权利要求42的制剂，其中IL-6抗体或特定部分或变体的浓 度重构为大约0.1mg/ml-大约500mg/ml的浓度。
44.权利要求42的制剂，还包含等渗剂。
45.权利要求42的制剂，还包含生理可接受的缓冲剂。
46.一种治疗至少一种IL-6介导的状况的方法，包括给予有需要 的患者权利要求42的制剂。
47.一种治疗至少一种IL-6介导的状况的方法，包括给予有需要 的患者权利要求42的制剂。
48.一种人类药用制品，包含包装材料和容器，容器中含有溶液 或冻干形式的至少一种权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体。
49.权利要求49的制品，其中所述容器是具有用于多次使用给药 的停止器的玻璃或塑料容器。
50.权利要求49的制品，其中所述容器是起泡包装，能够被刺穿 并且用于静脉内、肌内、快速注射、皮下、呼吸道、吸入、阴道、直 肠、颊、舌下、鼻内或经皮给药。
51.权利要求49的制品，其中所述容器是静脉内、肌内、快速注 射、皮下、呼吸道、吸入、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送 设备或系统的一个成分。
52.权利要求49的制品，其中所述容器是用于静脉内、肌内、快 速注射、皮下、呼吸道、吸入、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮 给药的注射器或笔式注射器设备或系统的一个成分。
53.一种制备至少一种IL-6抗体或特定部分或变体的制剂的方 法，包括在至少一种含盐水或盐的缓冲液中混合至少一种权利要求1 的IL-6抗体或特定部分或变体。
54.一种制备至少一种权利要求1的IL-6抗体或特定部分或变体 的制剂的方法，包括提供能够以可回收量表达所述抗体或特定部分或 变体的宿主细胞或转基因动物或转基因植物或植物细胞。
55.权利要求54的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、植 物细胞或酵母细胞。
56.权利要求54的方法，其中所述转基因动物是哺乳动物。
57.权利要求56的方法，其中所述转基因哺乳动物选自山羊、牛、 绵羊、马和非人灵长类动物。
58.表达至少一种权利要求1的抗体的转基因动物或植物。
59.由权利要求54的方法制备的至少一种IL-6抗体或特定部分 或变体。
60.一种分离的IL-6嵌合、人源化或CDR嫁接的抗体或其特定 部分或变体，包含鼠可变区和人恒定区，其中所述抗体或特定部分或 变体特异性结合包含人IL-6的氨基酸Gln29-Lev34中至少1-3个 氨基酸的至少一种表位。
61.权利要求60的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗体 或特定部分或变体以至少10-9M的亲和力与IL-6结合。
62.权利要求60的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗体 或特定部分或变体以至少10-11M的亲和力与IL-6结合。
63.权利要求60的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗体 或特定部分或变体以至少10-12M的亲和力与IL-6结合。
64.权利要求60的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述抗体 或特定部分或变体基本中和至少一种活性。
65.权利要求64的IL-6抗体或特定部分或变体，其中所述活性 是选自下组的至少一种：抑制IL-6诱导的IFN-γ分泌、抑制LAK细 胞毒性、抑制IFNγmRNA转录、抑制细胞内IFNγCD3+细胞和CD95 表达。

说明书全文

发明领域

本发明涉及至少一种白介素-6(IL-6，也称作干扰素β2)蛋白或其 片段的特异性抗体，包括特定的部分或变体，以及编码所述抗IL-6 抗体的核酸、其互补核酸、载体、宿主细胞及其准备方法和用途，包 括治疗制剂、给药和设备。

背景技术

白介素-6(IL-6)是一种由多种不同的细胞类型产生的促炎细胞因 子。体内刺激的单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞代表了IL-6的主 要来源。其它细胞，如巨噬细胞、T和B淋巴细胞、粒细胞、角质形 成细胞、肥大细胞、成骨细胞、软骨细胞、胶质细胞和平滑肌细胞在 刺激后也产生IL-6(Kishimoto，T.，Blood 74：1-10(1989)和Kurihara，N. et al.，J.Immunology 144：4226-4230(1990))。一些肿瘤细胞也产生 IL-6(Smith，P.C.et al.Cytokine and Growth Factor Reviews 12：33- 40(2001)，并且最近表明IL-6是前列腺癌进展的预后因子(Nakashima， J.et al.Clinical Cancer Research 6：2702-2706(2000))。可以通过IL-6 自身调节IL-6产生，并且取决于细胞类型，IL-6可以刺激或抑制其 自身的合成。
IL-6可以与有丝分裂原激活的B细胞、T细胞、外周单核细胞和 某些肿瘤上表达的IL-6受体结合(Ishimi，Y.et al.，J.Immunology 145： 3297-3303(1990))。IL-6受体具有至少两种不同的成分，并且由负责 IL-6结合的称作gp80的α链和信号传导所需的称作gp130的β链组 成(Adebanjo，O.et al.，J.Cell Biology 142：1347-1356(1998)and Poli， V.et al.，EMBO 13：1189-1196(1994))。包括IL-6，LIF，制癌蛋白 M，IL-11，CNTF和CT-1的细胞因子家族在其受体中均具有gp130 亚基。此外，IL-6细胞因子的所有成员都可以诱导急性期蛋白的肝表 达(Bellido，T.et al.，J.Clin.Investigation 97：431-437(1996))。 87908790。
IL-6有至少两种主要的生物学功能：介导急性期蛋白和作为分化 和激活因子(Avvisti，G.et al.，Baillieres Clinical Hematology 8：815- 829(1995)和Poli，V.et al.，EMBO 13：1189-1196(1994))。已知急性 期蛋白调节免疫应答，介导炎症，并且在组织重塑中起作用。作为分 化和激活因子，IL-6诱导B细胞分化和分泌抗体，它诱导T细胞分 化为细胞毒性T细胞，激活细胞信号传递因子，并且促进造血(Ishimi， Y.et al.，J.Immunology 145：3297-3303(1990))。IL-6显著参与许多关 键的身体功能和过程。因此，可以采用抗体操作IL-6的体内生物活 性而增强、阻抑或防止包括骨代谢、肿瘤性转化以及免疫和炎性反应 的生理过程(Adebanjo，O.et al.，J.Cell Biology 142：1347-1356 (1998))。
尽管IL-6参与许多途径，IL-6剔除小鼠具有正常的表型，它们 可以存活并且是可育的，并且这些动物表现出T细胞数目的少量减少 以及对组织损伤的急性期蛋白反应的减少(Kopf M et al.，Impaired immune and acute-phase responses in interleukin-6-deficient mice， Nature；368(6469)：339-42，1994)。相反，超量表达IL-6的转基因小 鼠发生神经病，如神经退化、星形胶质细胞增多、脑血管发生，并且 这些小鼠不发育出血脑屏障(Campbell et al.，Neurologic Disease Induced in Transgenic Mice by cerebral Overexpresion of Interleukin 6PNAS 90：10061-10065.1993)。
最近的研究表明，IL-6的单克隆抗体可以抑制前列腺肿瘤(Smith， P.C.and Keller，E.T.，The Prostate in press和Okamoto，M.et al.， Cancer Research 57：141-146(1997)和肾癌(Weissglas，M.et al.，The Journal of Urology 153：554-557(1995))的体内生长。除了对肿瘤生长 的直接作用，阻断IL-6产生也可以化学致敏和增强细胞毒性效力 (Smith，P.C.et al.Cytokine and Growth Factor Reviews 12：33-40 (2001))。总体上，文献教导我们，阻断IL-6活性可以抑制骨降解、 肿瘤生长和癌症恶液质。
采用非人、多克隆(如抗血清)或单克隆抗体(Mabs)及其片段(如 其蛋白水解消化产物)的被动免疫是被开发为多种疾病的疗法的可能 治疗剂。然而，已知由非人部分组成的抗体在给予人时引发免疫应答。 该免疫应答使得重复的抗体给药通常不适于治疗，并且可能导致免疫 复合物介导的抗体从循环中的清除，从而降低了对患者的治疗益处。 由非人部分组成的抗体的重复给药可能导致的状况的例子是血清病和 过敏。
在尝试避免这些和其它问题的尝试中，已采用了包括嵌合和“人 源化”的许多方法，以降低抗体/其片段的免疫原性。这些方法产生了 具有降低的免疫原性的抗体。这些抗体基本是来源于人的，只有互补 决定区(CDR′s)和某些影响CDR构象的构架残基是来源于人的。因此， 新的人或人源化单克隆抗体特别可以单独或与现存的分子联合用于免 疫治疗用途。
因此，需要提供能够克服这些问题中的一个或多个的高度亲和的、 中和性嵌合或人抗IL-6抗体或片段，以及改进已知的抗体或其片段， 用于防止、治疗、缓解或诊断与IL-6相关的状况。
由杂交瘤细胞系产生的鼠单克隆抗IL-6抗体见例如，美国专利 5,618,700。美国专利5,856,135公开了来源于小鼠抗体SK2的人IL-6 的重塑的人抗体，其中来自于小鼠抗体SK2的可变区的互补决定区 (CDR′s)被移植到人抗体的可变区，并且与人抗体的恒定区连接。
已经描述了其它鼠单克隆抗体，并且分类为阻止受体结合的中和 性抗体或非中和性抗体(Brakenhoff et al，J.Immunol.(1990)(145： 561)。在该组抗体中，IL-6的中和性抗体可以分为两组；IL-6分子 上的推测表位称作位点I和位点II。位点I阻止与gp80(IL6R)的结合， 并因此阻止gp130活化。位点I表位进一步的特征在于包含L-6分子 的氨基末端和羧基末端部分。位点2结合物阻止gp130活化并因此可 以识别参与信号传递的构象表位。
称作CLB-8的鼠IL-6单克隆抗体是已知的，它具有高亲和力并 且结合位点Igp130表位(Brakenhoff et al supra)。但是，如上文所述， 鼠抗体在人体内是高度免疫原性的，因此它的治疗价值是有限的。仍 然需要具有高亲和力以及有利的药学曲线的IL-6抗体。
发明概述
本发明提供如这里所描述和实现的分离的人、灵长类、啮齿类、 哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR嫁接的抗IL-6抗体、免疫球蛋白、 其裂解产物及特定的部分和变体，以及抗IL-6抗体组合物、其编码 或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、设备、转基因动物、 转基因植物及其制备方法和用途，它们结合了本领域已知的成分。本 发明的抗体以高亲和力特异性中和人IL-6。
本发明提供了至少一种此处描述的分离的嵌合、人源化或CDR 嫁接的抗IL-6CLB-8抗体(“cCLB-8抗体”)。本发明的cCLB-8抗体 包括任何包含至少一种来源于鼠CLB-8单克隆抗体的重链或轻链互补 决定区(CDR)或其配体结合部分的蛋白或肽分子，它们与可以掺入本 发明的抗体的重链或轻链恒定区、构架区、或其任意部分结合。在一 种实施方案中，本发明涉及包含两个轻链和两个重链的抗IL-6嵌合 抗体，每条链包含人恒定区的至少一部分和来源于对人IL-6具有特 异性的鼠c-CLB8单克隆抗体可变区(v)的至少一部分，所述抗体以高 亲和力与人IL-6的抑制性和/或中和性表位结合，如抗体cCLB-8。本 发明还包括所述抗体的片段或衍生物，如抗体链的一个或多个部分， 如重链恒定区、连接区或可变区，或轻链恒定区、连接区或可变区。
所述抗体可以包含来源于鼠CLB-8单克隆抗体的至少一种互补决 定区(CDR)(如重链或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3)的至 少一个特定部分，和/或至少一种恒定区或可变区构架区或其任意部 分。抗体氨基酸序列可以进一步任选包含至少一种此处描述或本领域 公知的特定取代、插入或缺失。
本发明的优选抗体包括那些嵌合的、人源化的和/或CDR嫁接的 抗体，它们将竞争性抑制与人IL-6的体内结合，所述抗体包括抗IL- 6鼠CLB-8、嵌合抗IL-6 CLB-8、或具有基本相同的结合特征的抗体， 及其片段或区域。
本发明的优选抗体是那些结合由CLB-8和cCLB-8识别的表位的 抗体，所述表位包括在Brackenhoff等(上文)描述的位点I表位中。 用于通过竞争性抑制确定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可见 于Harlow，et al，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，在此引 入本申请中作为参考。本发明的至少一种抗体结合至少一种特异于至 少一种IL-6蛋白、其亚基、片段、部分或其任意组合的特定表位。 所述至少一种表位可以包含至少一种抗体结合区，它包含所述蛋白的 至少一部分，该表位优选由其至少一部分的至少1-5个氨基酸组成， 所述至少一部分例如，但不限于，所述蛋白的至少一个功能性、细胞 外、可溶的、亲水的、外部或细胞质结构域，或其任意部分。
一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗IL-6 cCLB-8 抗体，包含至少一种包含SEQ ID NO：7或8的可变区及其编码核苷 酸序列(SEQ ID NO：15或16)。
另一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗IL-6cCLB- 8抗体，包含(i)SEQ ID NOS：1，2和3的全部重链互补决定区(CDR) 氨基酸序列及其编码核苷酸序列(SEQ ID NO：9-11)；或(ii)SEQ ID NOS：4，5和6的全部轻链CDR氨基酸序列及其编码核苷酸序列(SEQ ID NO：12-14)。
另一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物抗IL-6cCLB- 8抗体，包含具有SEQ ID NOS：1，2，3，4，5或6的至少一种的氨 基酸序列的至少一种重链或轻链CDR及其编码核苷酸序列(SEQ ID NO：9-14)。
另一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物嵌合、人源化 或CDR嫁接的抗IL-6 cCLB-8抗体，包含至少一种人CDR，其中所 述抗体特异性结合于包含人IL-6的至少1-3个氨基酸的至少一种表 位，它结合cCLB-8抗体。
所述至少一种抗体可以任选进一步以至少10-9M、优选至少10-10M 的亲和力(Kd)结合IL-6，和/或基本上中和至少一种Il-6蛋白的至 少一种活性。在一种优选的实施方案中，所述抗体以至少1×10-11M 的亲和力(Kd)结合IL-6，优选以5×10-11M的亲和力中和人IL-6。
本发明的一方面提供了一种分离的核酸分子，它包含、互补于或 杂交于编码前述特异性抗IL-6抗体的多核苷酸，包括其至少一个特 定序列、结构域、部分或变体。本发明进一步提供了包含所述抗IL-6 抗体的核酸分子的重组载体，含所述核酸和/或重组载体的宿主细胞， 以及这种抗体核酸、载体和/或宿主细胞的制备方法和/或使用方法。 因此，本发明包括编码至少一种分离的哺乳动物抗IL-6cCLB-8抗体 的核酸；包含所述分离的核酸的分离的核酸载体，和/或包含所述分离 的核酸的原核或真核宿主细胞。所述宿主细胞可以任选是选自下组的 至少一种：COS-1，COS-7，HEK293，BHK21，CHO，BSC-1，Hep G2， 653，SP2/0，293，HeLa，骨髓瘤，或淋巴瘤细胞，或其任意衍生、永生 化或转化的细胞。还提供了产生至少一种抗Il-6 cCLB-8抗体的方法， 包括在体外、体内或原位条件下翻译抗体编码核酸，使得IL-6抗体 以可检测或可回收的量表达。
本发明进一步提供了本发明的至少一种cCLB-8抗IL-6抗体的至 少一种IL-6抗独特型抗体。该抗独特型抗体包括任何含有包含免疫 球蛋白分子的至少一部分的分子的蛋白或肽，所述部分可以是，但不 限于可以掺入本发明抗体的抗独特型抗体的至少一种重链或轻链或其 配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链 恒定区、构架区、或其任意部分。本发明的抗独特型抗体可以包括或 来源于任何哺乳动物，例如，但不限于人、小鼠、兔、啮齿类动物、 灵长类动物等。
本发明的一方面提供一种分离的核酸分子，它包含、互补于或杂 交于一种编码至少一种IL-6抗独特型抗体的多核苷酸，该抗体包含 至少一种其特定序列、结构域、部分或变体。本发明进一步提供了包 含所述IL-6抗独特型抗体的编码核酸分子的重组载体，含所述核酸 和/或重组载体的宿主细胞，以及这种抗独特型抗体核酸、载体和/或 宿主细胞的制备方法和/或使用方法。
本发明也提供了至少一种在宿主细胞中表达至少一种前述抗IL-6 抗体、或IL-6抗独特型抗体的方法，包括按照此处的描述在至少一 种抗IL-6抗体以可检测和/或可回收的量表达的条件下培养宿主细 胞。
本发明也提供了至少一种组合物，它包含(a)如此处描述的分离的 抗IL-6 cCLB-8抗体的编码核酸和/或抗体；和(b)合适的载体或稀释 液。载体或稀释液可以任选是药学可接受的已知载体或稀释液。该组 合物可以任选进一步包含至少一种其它的化合物、蛋白或组合物。
本发明进一步提供了至少一种抗IL-6 cCLB-8抗体方法或组合 物，用于在本领域已知的和/或这里所描述的相关状况之前、之后或之 时以治疗有效量给药，以便调节或治疗细胞、组织、器官、动物或病 人中的至少一种IL-6相关状况。因此，本发明还提供了一种诊断或 治疗细胞、组织、器官、或动物中的IL-6相关状况的方法，包括使 所述细胞、组织、器官、或动物接触或给予所述细胞、组织、器官、 或动物包含有效量的至少一种分离的本发明的抗IL-6 CLB-8抗体的 组合物。该方法可任选进一步包括使用0.001-50mg/kg细胞、组织、 器官、或动物的有效量。该方法可任选进一步包括通过选自下组的至 少一种方式进行接触或给药：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮。该方法可任选进一步包括进一步包括在所述接触 或给药之前、同时或之后给予至少一种包含有效量的选自下组的至少 一种化合物或蛋白的组合物：至少一种可检测标记或报道分子、TNF 拮抗剂、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、 镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物 剂、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成 素、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放 射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、 吸入性类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明进一步提供了至少一种抗IL-6 cCLB-8抗体方法，用于在 本领域已知的和/或这里所描述的相关状况之前、之后或之时诊断细 胞、组织、器官、动物或病人中的至少一种IL-6相关状况。
本发明也提供了至少一种用于诊断本发明的至少一种抗Il-6抗体 的至少一种组合物、设备和/递送或方法。
还提供了一种包含至少一种分离的嵌合抗Il-6 cCLB-8抗体和至 少一种药学可接受载体或稀释剂的组合物。所述组合物可以任选进一 步包含有效量的至少一种选自下组的至少一种化合物或蛋白：可检测 标记或报道分子、细胞毒性或其它抗癌剂、抗代谢药如氨甲喋呤、抗 增殖剂、细胞因子或细胞因子拮抗剂、TNF拮抗剂、抗风湿药物、肌 肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇 静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣药物、 皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、疫苗、免疫球蛋 白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、 抗精神病药物、刺激剂、抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、肾上 腺素或类似物。
本发明还提供了一种医学设备，包含本发明的至少一种分离的哺 乳动物抗IL-6抗体，其中所述设备适于所述至少一种抗IL-6抗体的 接触或给药，该接触或给药是通过选自下组的至少一种方式进行的： 肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软 骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、 肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、 肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、 膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮。
还提供了一种用于人药用或诊断用途的制品，包括包装材料和一 个容器，其中包含至少一种本发明的分离的哺乳动物抗IL-6抗体的 溶液或冷冻干燥形式。所述制品可以任选包含至少一个作为肠胃外、 皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔 内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心 肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、 直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、 快速注射、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮递送设备或系统的成 分的容器。
本发明进一步提供了此处描述的任何发明。
附图说明
图1：表示cCLB8与人重组IL-6的结合的曲线图。
图2：表示cCLB8抑制SKW6.4细胞分泌IL-6介导的IgM mu 分泌的曲线图。
图3：表示cCLB8抑制IL-6介导的MCP-1产生的曲线图。
图4：表示cCLB8抑制THP-1人单核细胞白血病细胞中的IL-6 信号传递的图像。
图5：表示cCLB8抑制IL-6诱导的HepG2细胞产生血清淀粉样 A的曲线图。
图6：表示cCLB8中和rhIL-6诱导的细胞增殖能力的曲线图。
图7：表示用抗人和抗小鼠IL-6抗体处理的携带人肿瘤的小鼠中 宿主体重损失的相对减少的曲线图。
图8A-C：表示7种抗独特型抗体的血清抑制研究曲线的曲线图。
图9：表示抗独特型单克隆抗体抑制cCLB8与人IL-6结合的曲 线图。
图10：表示抗独特型抗体与预先结合于人IL-6的cCLB-8的结合。
发明详述
引用文献
在此引入这里所引用的所有出版物或专利的完整内容作为参考， 它们显示了本发明时的技术状态和/或为本发明提供了说明并使本发明 成为可能。出版物是指任何科学或专利公开，或可以用任何媒体形式， 包括所有录音、电子或印刷形式获得的任何其它信息，在此全文引入 以下对比文献作为参考：Ausubel，et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)； Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，antibodies， a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，et al.， eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY (1994-2001)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2001)。
氨基酸代码
组成本发明的抗IL-6抗体的氨基酸通常以缩写表示，可以通过单 字母代码、三字母代码、名称或三核苷酸密码子表示氨基酸，这是本 领域公知的(见(see Alberts，B.，et al.，Molecular Biology of The Cell， Third Ed.，Garland Publishing，Inc.，New York，1994)。
定义
这里用到的“抗白介素6 CLB-8抗体”、“抗IL-6 CLB-8抗体”、 “抗IL-6 CLB-8抗体部分”或“抗IL-6 CLB-8抗体片段”和/或“抗 IL-6 CLB-8抗体变体”等包括任何含有一种分子的肽或多肽，该分子 包含免疫球蛋白分子的至少一部分，包括来源于鼠CLB-8单克隆抗体 的至少一种重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分，它与 可以掺入到本发明的抗体中的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定 区、构架区或其任意部分结合。这种抗体任选进一步影响特异性配体， 例如，但不限于，这些抗体调节、减少、增加、拮抗、激动、减轻、 缓解、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种IL-6活性或结合，或在 体外、原位和/或体外具有IL-6受体活性或结合。作为非限制性的例 子，本发明的适当抗IL-6抗体、特定部分或变体可以高亲和力结合 人IL-6的抑制和/或中和表位。适当的抗IL-6抗体、特定部分或变体 也可以任选影响至少一种IL-6活性或功能，例如，但不限于，RNA、 DNA或蛋白合成，IL-6释放，IL-6受体信号传递、膜IL-6裂解、IL-6 活性、IL-6产生和/或合成。
术语“抗体”进一步包含抗体、其消化片段、特定部分和变体， 包括抗体模拟物或包括模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能 的抗体部分，包括单链抗体及其片段；每一个均包含至少一个来源于 CLB-8单克隆抗体的CDR。功能性片段包括与哺乳动物IL-6结合的 抗原结合片段。例如，本发明也包括能够与IL-6或其部分结合的抗 体片段，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)，Fab′(如通 过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(如通过胃蛋白酶消化)，facb (如通过纤溶酶消化)，pFc′(如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)，Fd(如 通过胃蛋白酶消化、部分还原和再聚集)，Fv或scFv(如通过分子生 物学技术)片段(见例如，Colligan，Immunology，同上)。
这些片段可以通过如本领域公知的和/或这里描述的酶促裂解、合 成或重组技术而产生。也可以用抗体基因产生各种截短形式的抗体， 在这些基因中天然终止位点的上游导入了一个或多个终止密码子。例 如可以设计一种编码F(ab′)2重链部分的组合基因，使其包含编码重链 CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。可以通过常规技术将抗体的各 部分以化学方式连接在一起，或用基因工程技术制备作为连续蛋白的 抗体的各部分。
这里使用的“嵌合”抗体或“人源化”抗体或“CDR嫁接的”抗 体包括上述鼠CDR与一种或多种来源于非鼠，优选人抗体的蛋白或 肽的组合。根据本发明，提供了嵌合的或人源化的抗体，其中CDR 来源于能够结合人IL-6的鼠CLB-8抗体，并且抗体的至少一部分， 或其余部分来源于一种或多种人抗体。因此，抗体的人部分可以包括 构架区，CL，CH结构域(如CH1，CH2，CH3)，铰链区，(VL，VH)区，它们 在人类中基本是非免疫原性的。来源于人抗体的抗体区域不需要与人 抗体具有100％的同一性。在一种优选的实施方案中，包括尽可能多 的人氨基酸残基，以使免疫原性可忽略，但可以根据需要修饰人残基 以支持CDR形成的抗原结合位点，同时使抗体的人源化最大。这种 改变或变异相对于未修饰抗体任选并优选保留或减少人类在人或其它 物种中的免疫原性。已经指出，人抗体可以由能够表达功能性重排的 人免疫球蛋白(如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞 产生。此外，当人抗体是单链抗体时，它可以包含在天然人抗体中不 存在的连接肽。例如，Fv可以包含连接肽，例如大约2-8个甘氨酸 或其它氨基酸残基，它们连接重链可变区和轻链可变区。这种连接肽 被认为是来源于人的。
本发明的抗体
根据本发明，嵌合的抗IL-6 cCLB-8抗体是一种抗体，其中可变 区或CDRs来源于能够结合并抑制人Il-6的功能的鼠CLB-8抗体， 并且抗体的构架区和恒定区来源于一种或多种人抗体。来源于鼠 CLB-8抗体的可变区或CDRs优选与鼠CLB-8抗体的可变区或CDRs 具有约90％-100％的同一性，但也可以考虑任何和所有的修饰，包括 取代、插入和缺失，只要嵌合抗体保持结合和抑制组织因子的能力。 嵌合、人源化或CDR嫁接的抗体的来源于与人抗体的区域不需要与 人抗体具有100％的同一性。在一种优选的实施方案中，保留尽可能 多的人氨基酸残基，以使免疫原性可忽略，但人残基，特别是构架区 的残基根据需要并且根据本发明下文的教导被取代。此处公开的所述 修饰是支持CDR形成的抗原结合位点，同时使抗体的人源化最大所 必须的。
抗人IL-6的CLB-8鼠单克隆抗体是本领域公知的(Brakenhoff et al，上文)，但以前没有公开该抗体的CDR区。本发明第一次公开了 来源于CLB-8鼠单克隆抗体的CDR区的嵌合、人源化或CDR嫁接 的抗体以及制备所述抗体的方法。根据本发明，实施例2提供了鼠 CLB-8重链的cDNA(SEQ ID NO：15)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。 实施例2也提供了CLB-8轻链的cDNA(SEQ ID NO：16)和推定的 氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。重链和轻链可变区的每一个都含有组 合形成抗原结合位点的三个CDRs。这三个CDRs由主要功能是支持 CDRs的四个FR区围绕。可以根据Kabat et al.(1987)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th ed.，United States Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office， Washington，D.C.中的描述通过计算机辅助的比对，或通过例如使用 Levitt(1983)J.Mol.Biol.168：595描述的ENCAD程序的可变区分子 模拟而鉴定重链和轻链可变区的序列中的CDRs的序列。
在一种优选实施方案中，CDRs来源于鼠单克隆抗体CLB-8。优 选的重链CDRs具有以下序列：
CDR1 SFAMS(SEQ ID NO：1)
CDR2 EISSGGSYTYYPDTVTG(SEQ ID NO：2)
CDR3 GLWGYYALDY(SEQ ID NO：3)
优选的轻链CDRs具有以下序列：
CDR1 SASSSVSYMY(SEQ.ID NO：4)
CDR2 DTSNLAS(SEQ.ID NO：5)
CDR3 QQWSGYPYT(SEQ.ID NO：6)
可以通过插入、取代和缺失对鼠CLB-8抗体的CDRs的序列进行 修饰，使得CDR嫁接的抗体维持结合并抑制人类组织因子的能力。 普通技术人员可以通过进行下文描述的功能测定确定该活性的维持。 CDRs可以与SEQ ID NOS：1-6的CDRs具有例如约50％-100％的 同源性。在一种优选的实施方案中，CDRs与SEQ ID NOS：1-6的CDRs 具有约80％-100％的同源性。在一种更优选的实施方案中，CDRs 与SEQ ID NOS：1-6的CDRs具有约90％-100％的同源性。在一种 最优选的实施方案中，CDRs与SEQ ID NOS：1-6的CDRs具有约100％ 的同源性。
或者，如实施例2(SEQ.ID NOS.7和8)所示的鼠CLB-8抗体的 完整重链可变区和轻链可变区可以与人恒定区和构架区组合，以形成 本发明的嵌合cCLB-8抗体。
编码本发明的嵌合抗体、片段和区域的恒定(C)区的人基因可以通 过已知方法来源于人胎肝文库。人C区基因可以来源于任何人细胞， 包括表达和产生人免疫球蛋白的那些。人CH区可以来源于人H链的 任何已知类型或同种型，包括其γ，μ，α，δ，ε及其亚型，如G1， G2，G3和G4。由于H链同种型负责抗体的各种效应物功能，可以 通过所需的效应物功能指导CH区的选择，如补体固定，或抗体依赖 性细胞毒性(ADCC)中的活性。优选地，CH区来源于γ1(IgG1)。
人CL区可以来源于人L链同种型κ或λ，优选κ。
通过标准克隆技术从人细胞获得编码人免疫球蛋白C区的基因 (Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989) 和Ausubel et al，eds.Current Protocols in Molecular Biology(1987- 1993))。人C区基因容易从含有代表两类L链、五类H链及其亚类 的基因的已知克隆获得。嵌合抗体片段，如F(ab’)2和Fab可以通过 设计适合被截短的嵌合H链基因而制备。例如，编码F(ab’)2片段的 H链部分的嵌合基因将包括编码CH1结构域和H链的铰链区的DNA 序列，其后是翻译终止密码子，以产生截短的分子。
通常，本发明的鼠、人或鼠和嵌合抗体、片段和区域是通过克隆 编码TNF特异性抗体的H和L链抗原结合区的DNA片段，并且将 这些DNA片段分别与编码CH和CL区的DNA片段连接以产生鼠、人 或嵌合免疫球蛋白编码基因而产生的。
因此，在一种优选实施方案中，产生一种融合的嵌合基因，它包 含至少编码非人来源的抗原结合区的第一DNA片段，如与连接(J) 片段功能性重排的V区，它与编码人C区的至少一部分的第二DNA 片段连接。
可以通过插入、取代和缺失对鼠CLB-8抗体的可变区的序列进行 修饰，使得嵌合抗体维持结合并抑制人IL-6的能力。普通技术人员 可以通过进行下文描述的功能测定确定该活性的维持。可变区可以与 SEQ ID NOS：7-8的可变区具有例如约50％-100％的同源性。在一种 优选的实施方案中，可变区与SEQ ID NOS：7-8的可变区具有约80％ -100％的同源性。在一种更优选的实施方案中，可变区与SEQ ID NOS：7-8的可变区具有约90％-100％的同源性。在一种最优选的实施 方案中，可变区与SEQ ID NOS：1-6的CDRs具有约100％的同源性。
为了方便，在此采用Kabat等的编号方案。根据需要通过小写数字 或连字符表示残基，以使本发明的序列符合标准的Kabat编号的序列。
根据本发明，可以将残基保留在与亲本抗体如CLB-8异质的FR区 中。已经证明在其它抗体的人源化中关键的残基也可以保留。按照前面 的标准以支持CDRs形成的抗原结合位点同时最大化抗体的人源化。
下文实施例2中示出了来源于鼠单克隆抗体CLB-8和人抗体的代 表性重链可变区的氨基酸序列。
实施例2中也示出了来源于鼠单克隆抗体CLB-8和人抗体的代表 性嵌合轻链可变区的氨基酸序列。
根据本发明，证明含有来源于鼠CLB-8抗体的可变区的嵌合抗体 在结合Il-6方面与鼠单克隆抗体CLB-8同样有效。
也可以使用本领域公知的工程化或人源化非人或人抗体的方法。一 般地，人源化或工程化的抗体具有一个或多个非人来源的氨基酸，例如， 但不限于来源于小鼠、大鼠、非人灵长类或其它哺乳动物。这些人类氨 基酸残基一般称作“输入”残基。一般来自于已知人序列的“输入”可 变区、恒定区或其它结构域。已知的人IgG序列公开于，例如
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Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)， 在此全文引入作为参考。
这些输入序列可以用于减少免疫原性，或用于减少、增强或修饰 结合、亲和力、开率(on-rate)、闭率(off-rate)、亲和力、特异性、 半衰期或任意其它适当的特征，如本领域所公知的。保留非人或人CDR 序列的大部分或全部，用人氨基酸或其它氨基取代可变区和恒定区。 任选对抗体人源化，保留抗体对抗原的高亲和力和其它有利的生物学 特性。为了达到这一目的，通过采用母体和人源化序列的三维模型分 析母体序列和各种得到的人源化序列的过程任选制备人源化抗体。通 常可以得到三维免疫球蛋白模型，并且是本领域技术人员公知的。说 明和演示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构计算机程序 是可得到的。检查这些演示结果可以分析候选免疫球蛋白序列功能中 残基的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原的结合能力 的残基。以这种方式，可以选择FR残基，并且与共有序列和输入序 列结合，从而得到需要的抗体特征，如对靶抗原的亲和力增加。概言 之，CDR残基直接并最大程度参与抗原结合的影响。本发明抗体的 人源化或工程化可以采用任意已知的方法进行，例如，但不限于，以 下文献中描述的方法，Winter(Jones et al.，Nature 321：522(1986)； Riechmann et al.Nature 332：323(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239： 1534(1988))，Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993)， 美国专利5723323，5976862，5824514，5817483，5814476，5763192， 5723323，5,766886，5714352，6204023，6180370，5693762，5530101， 5585089，5225539；4816567，PCT/：US98/16280，US96/18978， US91/09630，US91/05939，US94/01234，GB89/01334，GB91/01134， GB92/01755；WO90/14443，WO90/14424，WO90/14430，EP 229246，在 此全文引入每一篇文献作为参考。
本发明的人抗体可以是任意类型(IgG，IgA，IgM，IgE，IgD等)或同 种型，可以包含κ或λ轻链。在一种实施方案中，人恒定区包含一个 IgG重链或限定的片段，例如，同种型IgG1，IgG2，IgG3或IgG4中的 至少一种。在另一种实施方案中，抗人IL-6人抗体包含一个IgG1重 链和一个IgG1轻链。本发明的分离抗体包含由任意适当的多核苷酸 编码的此处公开的抗体氨基酸序列，或任意分离的或制备的抗体。人 抗体或抗原结合片段优选结合人IL-6，并因此部分或基本上中和该蛋 白的至少一种生物活性。部分或基本上中和至少一种IL-6蛋白或其 片段的生物活性的抗体或其特定部分或变体可以结合该蛋白或片段， 从而抑制由IL-6与IL-6受体的结合介导的或其它IL-6依赖性或IL-6 介导的机制。此处用到的术语“中和抗体”是指根据所采用的测定， 可以抑制约20-120％，优选至少约10，20，30，40，50，55，60，65，70，75， 80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100％的IL-6依赖性活性的 抗体。抗IL-6抗体抑制IL-6依赖性活性的能力优选通过至少一种适 当的IL-6蛋白或受体测定方法进行评估，如此处的描述和/或本领域 公知。
本发明的至少一种抗体结合至少一种特异于IL-6蛋白、其亚基、 片段、部分或其任意组合的至少一种特定表位。所述至少一种表位包 含至少一个抗体结合区，该区包含所述蛋白的至少一部分，该表位优 选由所述蛋白的至少一个细胞外、可溶性、亲水性、外部或细胞质部 分组成。本发明的人抗体或抗原结合片段一般将包含一个抗原结合 区，该区包含至少一个重链可变区的至少一个SEQ ID NOS：1，2和3 的人互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)或变体和至少一个轻链可变 区的至少一个人互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)(或变体SEQ ID NOS：4，5和6)。作为非限制性的实例，抗体或抗原结合部分或变体 可以包含至少一种具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链CDR3， 和/或具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR3。在一种特定的 实施方案中，抗体或抗原结合片段可以具有一种抗原结合区，该区包 含具有相应CDR1，CDR2和/或CDR3的氨基酸序列(如SEQ ID NOS： 1，2和/或3)的至少一个重链CDR(即CDR1，CDR2和/或CDR3) 的至少一部分。在另一种特定实施方案中，抗体或抗原结合部分或变 体可以具有一种抗原结合区，该区包含具有相应CDR4，CDR5和/或 CDR6的氨基酸序列(如SEQ ID NOS：4，5和/或6)的至少一个轻链 CDR(即CDR4，CDR5和/或CDR6)的至少一部分。在一种优选实 施方案中，抗体或抗原结合片段的三种重链CDR和三种轻链CDR具 有此处描述的至少一种mAb cCLB8，嵌合抗IL-6Mab的相应CRD 的氨基酸序列。可以使用常规技术通过将抗体的各种部分(如CDR、 构架区)化学连接在一起而制备这些抗体，也可以通过常规重组DNA 技术或任何其它适当方法并且使用任何可能的导致本发明的多肽表达 的冗余密码子(例如SEQ ID NO：15或16)制备和表达一种(即一种 或多种)编码抗体的核酸分子而制备这些抗体。
结合于人IL-6的抗体和包含确定的重链和轻链可变区的抗体可以 用适当方法制备，例如噬菌体展示(Katsube，Y.，et al.，Int J Mol.Med，1 (5)：863-868(1998))或使用转基因动物的方法，如本领域所公知和/或 此处所描述。例如，可以在适当宿主细胞中用其编码核酸或其部分表 达抗体、其特定部分或变体。
本发明也涉及包含与此处描述的氨基酸序列基本相同的序列中的 氨基酸的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。这些抗体或 抗原结合片段和包含所述链或CDR的抗体可以以高亲和力(如KD小 于或等于约10-9M)与人IL-6结合。与此处描述的序列基本相同的氨 基酸序列包括含有保守氨基酸取代和氨基酸去除和/或插入的序列。保 守氨基酸取代是指，用具有与第一种氨基酸相似的化学和/或物理特性 (如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二种氨基酸代替第一种 氨基酸。保守氨基酸取代包括用下列各组中的一种氨基酸代替另一种 氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸 (E)；天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，酪氨酸(Y)，K， R，H，D和E；丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，脯氨 酸(P)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，甲硫氨酸(M)，半胱氨酸(C)和甘氨酸 (G)F，W和Y；C，S和T。
当然，技术人员所进行的氨基酸取代的数目将取决于许多因素， 包括前面提到的那些。一般说来，任何给定的抗IL-6抗体、片段或 变体的氨基酸取代、插入或去除的数目不超过40，30，20，19，18，17，16， 15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1，例如1-30或其中的任意 范围或任意值，如此处所规定。
可以通过本领域公知的方法鉴定对功能起关键作用的本发明的抗 IL-6抗体中的氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(如Ausubel， 同上，8，15章；Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085 (1989))。后一种程序在分子中每个残基处导入单个丙氨酸突变。然后 检测得到的突变分子的生物活性，例如，但不限于至少一种IL-6中 和活性。也可以通过结晶、核磁共振或光亲和力标记等结构分析鉴定 抗体结合的关键位点(Smith，et al.，J.Mol.Biol. 224：899-904(1992) and de Vos，et al.，Science 255：306-312(1992))。
本发明的抗IL-6抗体可以包括，但不限于选自SEQ ID NOS：1，2， 3，4，5，6中至少一个的5个至所有连续氨基酸的至少一种部分、序列 或组合。
本发明的抗IL-6抗体可以进一步任选包含SEQ ID NOS：7，8中 的至少一个的70-100％连续氨基酸中的至少一个的多肽。
在一种实施方案中，免疫球蛋白链的氨基酸序列或其部分(如可变 区、CDR)与SEQ ID NOS：7，8中的至少一个的相应链的氨基酸序列 具有约70-100％的同一性(如70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81， 82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100或 其中的任意范围或任意值)。例如，轻链可变区的氨基酸序列可以与 SEQ ID NO：8的序列相似，或重链CDR3的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：7相似。优选地，用本领域公知的适当计算机算法确定出具有 70-100％的氨基酸同一性(即90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100 或其中的任意范围或任意值)。
示例性的重链和轻链可变区序列见SEQ ID NOS：7，8。本发明的 抗体或其特定变体可以包含来源于本发明的一种抗体的任意数目的连 续氨基酸，其中该数目选自抗IL-6抗体中连续残基数目的10-100％。 该连续氨基酸的亚序列长度为至少约10，20，30，40，50，60，70，80，90， 100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240， 250或更多，或其中的任意范围或任意值。此外，这些亚序列的数目 可以是选自1-20的任意整数，例如至少为2，3，4或5。
本领域技术人员可以理解，本发明包括本发明的至少一种生物活 性抗体。生物活性抗体具有天然(非合成)、内源性或相关和已知抗 体的至少20％，30％或40％的特异活性，优选至少50％，60％或70％， 最优选具有天然、内源性或相关和已知抗体的至少80％，90％或95％ -1000％的特异活性。测定和定量测定酶活性和底物特异性的方法是 本领域技术人员公知的。
另一方面，本发明涉及此处描述的人抗体和抗原结合片段，它们 可以通过共价连接有机部分而得到修饰。这种修饰可以产生具有改进 的药代动力学特性(如增加的体内血清半衰期)的抗体或抗原结合片 段。有机部分可以是线性或分支的疏水聚合物基团、脂肪酸基团或脂 肪酸酯基团。在特定实施方案中，亲水聚合物基团的分子量可以为约 800-120000Da，并且可以是聚链烷醇(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二 醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮， 脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含约8-40个碳原子。
本发明的修饰抗体和抗原结合结合片段可以包含与抗体直接或间 接共价结合的一种或多种有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段 结合的每一种有机部分可以独立是亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂 肪酸酯基团。这里用到的“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸，这里用到 的“亲水聚合物基团”是指在水中比在辛烷中的溶解度更高的有机聚 合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中的溶解度更高。因此，本发 明包括通过共价连接聚赖氨酸而被修饰的抗体。适于修饰本发明的抗 体的亲水聚合物可以是线性的或分支的，可以包括，例如聚链烷醇(如 PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)，碳水化合物(如右旋 糖苷、纤维素、寡糖、多糖等)，亲水氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸、 聚精氨酸、聚天冬氨酸等)，聚环氧烷(如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷 等)和聚乙烯基吡咯烷酮。修饰本发明的抗体的亲水聚合物作为独立 分子实体的分子量优选为约800-150,000Da。例如，PEG5000和 PEG20,000，其中下标是以Da为单位表示的可以使用的聚合物的分子 量。可以用1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代亲水聚合物。 可以采用适当的方法制备用脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合 物。例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶联， 脂肪酸或脂肪酸酯的上的活化羧基(如用N，N-羰基二咪唑活化)可以 与聚合物上的羟基偶联。
适于修饰本发明的抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可以 包含一个或多个不饱和单元。适于修饰本发明的抗体的脂肪酸包括， 例如正十二烷酸(C12，月桂酸)，正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)，正十八 烷酸(C18，硬脂酸)，正二十烷酸(C20，花生酸)，正二十二烷酸(C22， 山嵛酸)，正三十烷酸(C30)，正四十烷酸(C40)，顺式-Δ9-十八烷酸(C18， 油酸)，全顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)，辛二酸， 十四烷二酸，十八烷二酸，二十二烷二酸等。适当的脂肪酸酯包括含 有线性或分支低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可以包含1个至约12 个，优选1个至约6个碳原子。
可以通过适当的方法，例如通过与一种或多种修饰剂反应而制备 修饰的人抗体和抗原结合片段。此处用到的“修饰剂”是指包括活化 基团的适当有机基团(如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基 团”是指在适当条件下，可以与第二种化学基团反应，从而形成修饰 剂与第二种化学基团之间的共价键的化学部分或官能团。例如，胺反 应性活化基团包括亲电子基团，如甲苯磺酸酯、甲磺酰酯、卤素(氯、 溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化 基团包括，例如，马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、二硫吡啶、 5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB硫醇)等。可以将醛官能团与含有酰胺 或酰肼的分子偶联，可以使叠氮基与三价磷酸基反应形成氨基磷酸酯 或亚氨代磷酸酯键。用于将活化基团导入分子的适当方法是本领域公 知的(见例如，Hermanson，G.T.，Bioconiugate Techniques.Academic Press：San Diego，CA(1996))。活化基团可以直接与有机基团(如亲 水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)结合，或通过接头部分与其结合，所 述接头部分例如为二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可以被氧、 氮或硫等杂原子取代。适当的接头部分包括，例如，四甘醇、-(CH2)3-， -NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。 例如，可以在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC) 存在下使单-Boc-烷基二亚胺(如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷) 与脂肪酸反应，在游离胺和脂肪酸羧基之间形成酰胺键，以便产生包 含接头部分的修饰剂。用四氟乙酸(TFA)处理产物，从而使伯胺暴 露，可以从产物去除Boc保护基，该伯胺可以与上述另一羧基偶联， 或可以与马来酸酐反应，将得到的产物环化可以产生被活化的脂肪酸 的马来酰亚胺衍生物。(见，例如。Thompson，et al.，WO 92/16221， 在此引入其完整教导作为参考。)
本发明的修饰抗体可以通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反 应而产生。例如，通过采用胺反应性修饰剂，例如，PEG的NHS酯， 有机部分可以与抗体以非位点特异性方式结合。也可以通过还原抗体 或抗原结合片段的二硫键(如链内二硫键)而制备修饰的人抗体或抗 原结合片段。然后可以使被还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性 修饰剂反应，以便产生本发明的修饰抗体。可以采用反向蛋白水解等 适当方法制备包含与本发明抗体的特异位点结合的有机部分的修饰人 抗体和抗原结合片段(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3：147-153 (1992)；Werlen et al.，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)； Kumaran et al.，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh et al.， Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas et al.，Biotechnol. Bioeng.，56(4)：456-463(1997))，也可以采用描述于Hermanson，G.T.， Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中的 方法。
本发明的抗体可以以宽范围的亲和力(KD)结合人IL-6。在一种优 选实施方案中，本发明的至少一种人单克隆抗体可以任选以高亲和力 结合人IL-6。例如，人单克隆抗体可以与人IL-6结合，其KD等于或 小于约10-7M，例如，但不限于0.1-9.9(或其中的任意范围或任意值) ×10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12，10-13或其中的任意范围或任意值。
抗体与抗原的亲和力或亲和力可以采用适当的方法进行实验室测 定。(见，例如，Berzofsky，et al.，″Antibody-Antigen Interactions，″In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York， NY(1984)；Kuby，Janis Imszlunolo，gy，W.H.Freeman and Company： New York，NY(1992)；及此处描述的方法)。如果在不同的条件(如盐 浓度，pH)下测定，所测定的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以 不同。因此，优选用标准抗体和抗原溶液、标准缓冲液，如此处描述 的缓冲液测量亲和力和其它抗原-抗体结合参数(例如KD，Ka，Kd)。
用于本发明的方法和组合物中的抗IL-6 CLB-8抗体的特征可以 任选在于与IL-6结合的高亲和力，并且任选并优选具有低毒性。具 体地，本发明中使用其中各个成分，如可变区、恒定区和构架区的和/ 或其集合任选和优选具有低免疫原性的本发明的抗体、特定片段或变 体。本发明中使用的抗体的特征任选在于它们能够在很长时间中治疗 患者，具有可测量的症状缓解和/或可接受的毒性。低或可接受的免疫 原性和/或高亲和力，以及其它适当的特性可以用于达到治疗结果。此 处定义的“低免疫原性”是指在约75％以下或优选50％的受治疗患 者中引起显著的HAHA，HACA或HAMA反应，和/或在受治疗患者 中产生低滴度(用双抗原酶免疫测定时小于约300，优选小于约100) (Elliott et al.，Lancet 344：1125-1127(1994)，在此引入其完整内容作为 参考)。
当把cCLB8与其它IL-6特异性抗体CLB.IL-6/14和CLB.IL-6/16 相比时，可以发现抗体亲和力和表位特异性的区别特征。结合于IL-6 并且通常阻断IL-6与其受体间相互作用的抗体cCLB8可以抑制几乎 100％的IL-6功能，这是IL-6依赖性7TD1细胞增殖生物测定和基于 IL-6结合于IL-6受体Luminex的测定所显示的。相反，结合于IL-6 但通过空间阻断IL-6/IL-6R复合物与gp130信号传递成分之间的相互 作用而进行中和的抗体CLB.IL-6/16，可以抑制62％结合的生物素- IL-6。最后，结合于IL-6但不像CLB.IL-6/14那样干扰其生物活性的 抗体，没有表现出对结合于固相sIL-6R/gp80的生物素-IL-6的抑制。
也可以使用双特异性、异特异性、异偶联或类似的抗体，它们是 对至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。在本申请中，一种结合 特异性是针对至少一种IL-6蛋白，另一种是针对任意其它抗原。制 备特异性抗体的方法是本领域中公知的。一般地，双特异性抗体的重 组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链 具有不同的特异性(Milstein and Cuello，Nature 305：537(1983))。由 于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤产生10中不同抗 体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常 通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化是繁杂的，产率很低。相似 的程序公开于，例如WO 93/08829，US Patent Nos，6210668，6193967， 6132992，6106833，6060285，6037453，6010902，5989530，5959084， 5959083，5932448，5833985，5821333，5807706，5643759，5601819， 5582996，5496549，4676980，WO 91/00360，WO 92/00373，EP 03089， Traunecker et al.，EMBO J.10：3655(1991)，Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)，在此引入其完整内容作为参考。
核酸分子
采用这里提供的信息，如编码SEQ ID NOS：1，2，3，4，5，6，7，8中的 至少一种、其特定片段、变体或共有序列的至少70-100％的连续氨 基酸的核苷酸序列，或包含这些序列中的至少一种的保藏载体，可以 根据此处描述或本领域公知的方法获得编码至少一种抗IL-6抗体的 本发明的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA，hnRNA，tRNA 或任意其它形式，或可以是DNA形式，包括，但不限于通过克隆或 合成产生，或其任意组合而产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以 是三链、双链或单链，或其任意组合。DNA或RNA的至少一条链的 任意部分可以是编码链，也称作有义链，或可以是非编码链，也称作 反义链。
本发明的分离核酸分子可以包括含有开放读码框(ORF)，任选具 有一种或多种内含子的核酸分子，例如，但不限于至少一种重链(如 SEQ ID NOS：1-3)或轻链(如SEQ ID NOS：4-6)的至少一种CDR，如 CDR1，CDR2和/或CDR3的至少一个特定部分；包含抗IL-6抗体或 可变区的编码序列的核酸分子(如SEQ ID NOS：15或16)；以及包含 基本不同于上述那些的核苷酸序列的核酸分子，但由于遗传密码简并 性，它们仍然编码此处描述和/或本领域公知的至少一种抗IL-6抗体。 当然，遗传密码是本领域公知的。因此，本领域技术人员制备这种编 码本发明的特异性抗IL-6抗体的简并核酸变体是常规的。见，例如， Ausubel，et al.，同上，这些核酸变体包括在本发明中。本发明的分离核 酸分子的非限制性例子包括SEQ ID NOS：9-16，它们分别对应于编 码HC CDR1，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2，LC CDR3， HC可变区和LC可变区的非限制性的核酸的例子。
如此处指出的，包含编码抗IL-6抗体的核酸的本发明的核酸分子 可以包括，但不限于自身编码抗体片段的氨基酸序列的核酸；完整抗 体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列，以及其它的 序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，它具有或不具 有前面提到的其它编码序列，如至少一种内含子，同时具有其它的非 编码序列，包括，但不限于非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加 工，包括剪接和聚腺苷酸化信号中起作用(例如mRNA的核糖体结 合和稳定性)的转录的、未翻译的序列；编码其它氨基酸，如提供其 它功能的氨基酸的其它序列。因此，编码抗体的序列可以与标记序列 融合，例如与促进包含抗体片段或部分的融合抗体纯化的肽的编码序 列融合。
选择性与此处描述的多核苷酸杂交的多核苷酸
本发明提供了在选择性杂交条件下与此处公开的多核苷酸杂交的 分离核酸。因此，该实施方案中的多核苷酸可以用于分离、检测和/或 定量包含所述多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可以用于在 保藏的文库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中， 多核苷酸是分离的基因组或cDNA序列，或者互补于来自于人或哺乳 动物核酸文库的cDNA。
优选地，cDNA文库包含全长序列的至少80％，优选包含全长序 列的至少85％或90％，更优选包含全长序列的至少95％。可以对cDNA 文库进行标准化，以增加稀有序列的代表性。低或中度严格杂交条件 一般、但不是专门用于相对于互补序列的序列同一性较低的序列。中 度和高度严格性条件任选用于具有更高同一性的序列。低严格性杂交 条件允许具有约70％的序列同一性的序列的选择性杂交，并且可以用 于鉴定直向同源序列或共生同源序列。
本发明的多核苷酸任选编码由此处描述的多核苷酸编码的抗体的 至少一部分。本发明的多核苷酸包括可以用于与编码本发明的抗体的 多核苷酸选择性杂交的核酸序列。见，例如Ausubel，同上；Colligan， 同上，在此全文引入作为参考。
核酸的构建
本发明的分离核酸可以利用本领域公知的(a)重组方法，(b)合成技 术，(c)纯化技术或其组合进行制备。
核酸可以方便地包含除本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可 以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸，以 帮助多核苷酸的分离。也可以插入可翻译的序列以帮助本发明的被翻 译的多核苷酸的分离。例如，一种六组氨酸标记序列提供了纯化本发 明的蛋白的方便方法。除编码序列外，本发明的核酸任选为用于克隆 和/或表达本发明的多核苷酸的载体、连接物或接头。
在这种克隆和/或表达序列中也可以加入其它序列，用于优化它们 在克隆和/或表达中的功能，用于帮助多核苷酸的分离，用于改进多核 苷酸向细胞中的导入。克隆载体、表达载体、连接物和接头的用途是 本领域中公知的。(See，例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
构建核酸的重组方法
本发明的分离核酸组合物，如RNA，cDNA，基因组DNA或其 任意组合可以用本领域技术人员公知的任何克隆方法从生物来源中获 得。在一些实施方案中，在严格条件下选择性与本发明的多核苷酸杂 交的寡核苷酸探针被用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序 列。RNA的分离和cDNA以及基因组文库的构建是本领域普通技术 人员所公知的。(见，例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
核酸筛选和分离方法
可以采用基于本发明的多核苷酸序列的探针筛选cDNA或基因组 文库，如此处所公开。可以用探针与基因组DNA或cDNA序列杂交， 以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将理解，在 测定中可以使用不同严格性程度的杂交，杂交或洗涤介质中的任意一 个都可以是严格的。当杂交条件更严格时，探针和靶序列之间的互补 性必须更高，这样才能形成双链体。严格性程度可以由温度、离子强 度、pH和甲酰胺等部分变性溶剂的存在中的一个或多个条件进行控 制。例如，杂交的严格性可以通过改变反应物溶液的极性而方便地改 变，反应物溶液的极性可以通过例如在0％-50％的范围内操作甲酰 胺的浓度而改变。可检测的结合所要求的互补性程度(序列同一性) 将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而改变。互补性程度最佳为 100％或70-100％，或其中的任意范围或任意值。然而，应该理解， 探针和引物中的小量序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格 性而补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域公知的，可以根据此处的教导 和指导用于本发明，而不需要过多的实验。
已知的扩增RNA或DNA的方法包括，但不限于聚合酶链式反应 (PCR)和相关的扩增方法(见，例如，Mullis等的美国专利4,683,195， 4,683,202,4,800,159,4,965,188；Tabor等的4,795,699和4,921,794；Innis 的5,142,033；Wilson等的5,122,464；Innis的5,091,310；Gyllensten 等的5,066,584；Gelfand等的4,889,818；Silver等的4,994,370；Biswas 的4,766,067；Ringold的4,656,134)和RNA介导的扩增，该扩增中 使用靶序列的反义RNA作为模板用于双链DNA合成(Malek等的美 国专利5,130,238，商品名为NASBA)，在此全文引入所有参考文献作 为参考。(见，例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA或cDNA 文库直接扩增本发明的多核苷酸序列和相关基因。也可以用PCR和 其它体外扩增方法克隆需要表达的蛋白的编码核酸序列，制备用于检 测样品中是否存在所需mRNA的探针，对核酸测序，或其它目的。 足够指导技术人员使用体外扩增方法的技术的例子见，Berger，同上， Sambrook，同上，和Ausubel，同上，以及Mullis等的美国专利 4,683,202(1987)；以及Innis等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，Eds.，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)。用于 基因组PCR扩增的商品化试剂盒是本领域已知的。见，例如， Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。此外，如T4基因32 蛋白(Boehringer Mannheim)可以用于改进长PCR产物的产率。
构建核酸的合成方法
本发明的分离核酸也可以根据已知方法通过直接化学合成而制备 (见，例如Ausubel等，同上)。化学合成一般产生单链核苷酸，该 单链核苷酸可以通过与互补序列杂交或通过用单链作为模板，采用 DNA聚合酶进行聚合而转化为双链DNA。本领域技术人员了解，尽 管DNA的化学合成可以限制在约100或更多碱基的序列，也可以通 过较短序列的连接获得较长的序列。
重组表达盒
本发明进一步提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的 核酸序列，例如，编码本发明的抗体的cDNA或基因组序列可以用于 构建重组表达盒，该表达盒可以被导入至少一种需要的宿主细胞。重 组表达盒一般包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作性连接于指 导多核苷酸在目的宿主中转录的转录起始调节序列。异源性和非异源 性(即内源性)启动子可以用于指导本发明的核酸分子的表达。
在一些实施方案中，作为启动子、增强子或其它元件的分离核酸 可以导入本发明的多核苷酸的非异源形式中的适当位置(位于内含子 上游、下游或内部)，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例 如，可以通过突变、去除和/或取代而体内或体外改变内源性启动子。
载体和宿主细胞
本发明也涉及包含本发明的分离核酸分子的载体，用重组载体基 因工程化的宿主细胞，以及通过本领域公知的重组技术产生至少一种 抗IL-6抗体。见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上， 在此全文引入作为参考。
多核苷酸可以任选与含有可选择标记的载体连接，用于在宿主中 增殖。一般地，将质粒载体导入一种沉淀物，例如磷酸钙沉淀，或导 入具有带电脂质的复合物。如果载体是病毒，可以用适当的包装细胞 系将其包装后转导至宿主细胞。
DNA插入物可以操作性与适当启动子连接。表达构建体进一步包 含转录起始位点、转录终止位点和转录区中的位点，以及用于翻译的 核糖体结合位点。由构建体表达的天然转录物的编码部分将优选包含 位于起始处的翻译起始密码子和位于被翻译的mRNA末端适当位置 的终止密码子(如UAA，UGA或UAG)，哺乳动物或真核细胞表达优 选采用UAA和UAG。
表达载体优选但任选包含至少一种可选择标记。这些标记包括， 例如，但不限于真核细胞培养物的氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶 (DHFR，美国专利4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288； 5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰 胺合成酶(GS，美国专利5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性基因， 以及大肠杆菌和其它细菌或原核生物的四环素或氨苄青霉素抗性基因 (上述专利在此全文引入作为参考)。上述宿主细胞的适当培养基和 培养条件是本领域公知的。适当的载体是本领域技术人员容易理解 的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阴离子脂质 介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知方法将载体构建体导入 宿主细胞。这些方法在本领域有描述，例如Sambrook，同上，1-4 和16-18章；Ausubel，同上，1，9，13，15，16章。
本发明的至少一种抗体可以以修饰的形式，例如以融合蛋白的形 式表达，并且可以包括分泌信号和其它异源功能区。例如，其它的氨 基酸区域，特别是带电氨基酸区域可以添加至抗体的N端以改进纯化 或随后的加工和储存过程中在宿主中的稳定性和耐受性。也可以将本 发明的肽部分添加至本发明的抗体，以促进纯化。这些区域可以在抗 体或其至少一个片段的最终制备之前去除。这些方法描述于许多实验 室手册，例如Sambrook，同上，17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel， 同上，16，17和18章。
本领域普通技术人员了解，许多表达系统都可以用于表达编码本 发明的蛋白的核酸。
作为选择，本发明的核酸可以通过在包含编码本发明的抗体的内 源性DNA的宿主细胞中打开(turning on)(通过操作)而在宿主细 胞中表达。这些方法是本领域公知的，如描述于美国专利5,580,734, 5,641,670,5,733,746,和5,733,761，在此引入每一篇专利作为参考。
用于产生抗体、其特定部分或变体的示例性的细胞培养物为哺乳 动物细胞。哺乳动物细胞系统一般是单层细胞的形式，但也可以使用 哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已经开发了许多能够表 达完整糖基化蛋白的适当宿主细胞系，包括COS-1(如ATCC CRL 1650)，COS-7(如ATCC CRL1651)，HEK293，BHK21(如ATCC CRL-10)，CHO(如ATCC CRL 1610)和BSC-1(如ATCC CRL-26)细 胞系，Cos-7细胞，CHO细胞，hep G2细胞，P3X63Ag8.653，SP2/0-Ag14， 293细胞，HeLa细胞等，它们可以容易从例如美国典型培养物保藏中 心Manassas，Va(www.atcc.org)获得。特别优选的宿主细胞是 P3X63Ag8.653细胞(ATCC保藏号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞 (ATCC保藏号CRL-1851)。在一种特别优选的实施方案中，重组细 胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
这些细胞的表达载体可以包含一种或多种以下表达控制序列，例 如，但不限于复制起点；启动子(如晚期或早期SV40启动子，CMV 启动子(美国专利5,168,062；5,385,839)、HSV tk、pgk(磷酸甘油 酯激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利5,266,491)、至少一种人 类免疫球蛋白启动子)；增强子和/或加工信号位点，例如核糖体结合 位点，RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(如SV40大T Ag聚腺苷酸 添加位点)和转录终止子序列。见，例如Ausubel等，同上；Sambrook， 等，同上。其它用于产生本发明的核酸或蛋白的细胞是已知的和/或可 得到的，例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录 (www.atcc.org)或商业来源得到。
当使用真核宿主细胞时，一般将聚腺苷酸化或转录终止子序列掺 入载体。终止子序列的一个例子是来自于牛生长激素基因的聚腺苷酸 化序列。也可以包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个例 子是SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，J.Virol.45：773-781 (1983))。此外，用于控制宿主细胞中复制的基因序列可以掺入本领域 公知的载体中。
抗体的产生
本发明的至少一种抗IL-6抗体可以任选通过本领域公知的细胞 系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群产生。见，例如， Ausubel，et al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，N Y，NY(1987-2001)；Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2 Edition，Cold Spring Harbor，NY (1989)；Harlow and Lane，antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan et al.， Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY， (1997-2001)，在此全文引入作为参考。
在一种方法中，可以通过融合适当的永生细胞系和抗体产生细胞 而产生。所述细胞系如骨髓瘤细胞系，例如，但不限于Sp2/0，Sp2/0- AG14，NSO，NS1，NS2，AE-1，L.5，＞243，P3X63Ag8.653，Sp2 SA3，Sp2 MAI，Sp2 SS1，Sp2 SA5，U937，MLA 144，ACT IV，MOLT4，DA-1， JURKAT，WEHI，K-562，COS，RAJI，NIH 3T3，HL-60，MLA 144， NAMAIWA，NEURO 2A等，或异骨髓瘤，或本领域已知的其它细胞 系。见，例如， www.atcc.org， www.lifetech.com等。所述抗体产生细 胞例如，但不限于分离的或克隆的脾细胞、外周血细胞、淋巴细胞、 扁桃体或其它免疫细胞或B细胞，或其它任何表达重链或轻链恒定区 或可变区或构架区或CDR序列的细胞，这些序列可以是内源性或异 源核酸，重组或内源性的、病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、 昆虫、爬行动物、鱼类、哺乳动物、啮齿类、马、山羊、绵羊、灵长 类、真核生物的基因组DNA，cDNA，rDNA，线粒体DNA或RNA，叶 绿体DNA或RNA，hnRNA，mRNA，tRNA，单链、双链或三链、杂交 序列等或其组合。见，例如Ausubel，同上，和Colligan，Immunology， 同上，第二章，在此引入作为参考。
抗体产生细胞也可以从用感兴趣的抗原免疫的人或其它适当动物 的外周血或优选脾或淋巴结获得。也可以用任何其它适当的宿主细胞 表达编码本发明的抗体、其特定片段或变体的异源或内源性核酸。可 以用选择性培养条件或其它适当的已知方法分离融合细胞(杂交瘤) 或重组细胞，并且用有限稀释或细胞分拣或其它公知方法进行克隆。 产生具有所需特异性的抗体的细胞可以通过适当的测定(如ELISA)进 行选择。
也可以使用至少一种编码抗IL-6抗体的核酸提供转基因动物或哺 乳动物，从而制备本发明的抗体，所述动物如山羊、牛、马、绵羊等， 它们在其乳汁中产生这些抗体。这些动物可以通过已知的方法提供， 见，例如，但不限于美国专利5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992； 5,994,616；5,565,362；5,304,489等，在此全文引入作为参考。
还可以使用至少一种编码抗IL-6抗体的核酸提供在植物部分或由 其培养的细胞中产生所述抗体、特定部分或变体的转基因植物并培养 植物细胞(例如，但不限于烟草和玉米)，从而制备本发明的抗体。 作为非限制性的实例，已经成功使用表达重组蛋白的烟叶提供大量重 组蛋白，如，使用诱导型启动子。见，例如，Cramer et al.，Curr.Top. Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其中引用的文献。同样，已 经采用转基因玉米以商业生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性等 于在其它重组系统产生或从天然来源纯化的蛋白。见，例如Hood et al.， Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其中引用的文献。也已经 从转基因植物种子，包括烟草种子和马铃薯块根中大量产生了抗体， 包括抗体片段，例如单链抗体(scFv′s)。见，例如Conrad et al.，Plant Mol. Biol.38：101109(1998)及其中引用的文献。这样，也可以根据已知 方法采用转基因植物产生本发明的抗体。也见Fischer et al.，Biotechnol. Appl.Biochem.30：99-108(Oct.，1999)，Ma et al.，Trends Biotechnol. 13：522-7(1995)；Ma et al.，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam et al.，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)；及其中引用的文献。 也见一般用于抗体的植物表达的方法，在此全文引用上述每一篇文献 作为参考。
抗体的纯化
可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化抗IL-6抗 体，所述方法包括，但不限于，蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸 提取、阴离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层 析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。也可以采用高效液相 层析(″HPLC″)进行纯化。见，例如，Colligan，Current Protocols in Immunology，或Current Protoeols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2001)，例如1，4，6，8，9，10章，在此全文引入作 为参考。
本发明的抗体包括天然纯化产物，化学合成程序产物，以及通过 重组技术从酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞等真核宿主产生的 产物。根据在重组产生程序中使用的宿主，本发明的抗体可以本发明 的抗体可以被糖基化或可以未糖基化，优选被糖基化。这些方法描述 于许多实验室手册，例如Sambrook，同上，17.37-17.42部分；Ausubel， 同上，10，12，13，16，18和20章；Colligan，Protein Science，同上，12 -14章，在此全文引入所有这些文献作为参考。
在哺乳动物细胞中克隆和表达IL-6抗体
典型的哺乳动物表达载体含有至少一种启动子元件，它介导 mRNA、抗体编码序列以及转录终止和转录物的聚腺苷酸化所需信号 的转录起始。其它元件包括增强子、Kozak序列和间插序列，其侧翼 具有RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的早期和晚期启 动子、逆转录病毒的长末端重复(LTRS)，如SV，HTLVI，HIVI和巨细 胞病毒(CMV)的早期启动子完成高度有效的转录。然而，也可以使用 细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适当表达载体 包括，例如，pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN或pLNCX (Clonetech Labs，Palo Alto，CA)，peDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)或 pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)，PSVL和PMSG(Pharmacia， Uppsala，Sweden)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC 37146) 和pBC12MI(ATCC 67109)等载体。可以使用的哺乳动物宿主细胞包 括人Hela 293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos 1， Cos 7和CV 1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞。
作为选择，可以在含有整合到染色体中的基因的稳定细胞系中表 达基因。用dhfr，gpt，新霉素或潮霉素等选择性标记共转染，可以鉴 定和分离被转染的细胞。
也可以扩增经转染的基因，使其表达大量被编码的抗体。用DHFR (二氢叶酸还原酶)标记开发携带几百或甚至几千拷贝目的基因的细 胞系。另一种有用的选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy，et al.， Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington，et al.，Bio/Technology 10： 169-175(1992))。采用这些标记，在选择性性培养基中培养哺乳动物 细胞，选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的 被扩增的基因。通常用中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞产生抗体。
表达载体pC1和pC4含有劳斯肉瘤病毒强启动子(LTR)(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))和CMV增强子的片段(Boshart， et al.，Cell 41：521-530(1985))。多个克隆位点，如具有限制酶裂解位 点BamHI，Xbal和Asp718的那些，促进了目的基因的克隆。这些载 体除3’内含子外，还含有大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信 号。
在CHO细胞中克隆和表达
用载体pC4表达IL-6抗体表达。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr (ATCC保藏号No.37146)的衍生物。该质粒含有SV40早期启动子控 制下的小鼠DHFR基因。可以通过在选择性培养基(如α-MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞而选择用这些质粒转染 的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺乏二氢叶酸活性的细胞，该培养基中补 加了化疗剂氨甲喋呤。抗氨甲喋呤(MTX)的细胞中的DHFR基因的扩 增已经有记载(见，例如F.W.Alt，et al.，J.Biol.Chem.253：1357-1370 (1978)；J.L.Hamlin and C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta 1097：107- 143(1990)；和M.J.Page and M.A.Sydenham，Biotechnology 9：64-68 (1991))。在不断增加的MTX浓度下培养的细胞通过靶酶DHFR的过 量产生发生了对药物的抗性，这是因为DHFR基因的扩增。如果将第 二种基因连接于DHFR基因，它通常被共扩增并且过度表达。本领域 公知该方法可以用于开发携带多于1000拷贝的被扩增基因的细胞系。 因此，当撤去氨甲喋呤时，获得了含有整合到宿主细胞的一个或多个 染色体的被扩增基因。
质粒pC4含有用于表达目的基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复(LTR) 的强启动子(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))和从人 巨细胞病毒(CMV)的立即早期基因的增强子分离的片段(Boshart，et al.， Cell 41：521-530(1985))。启动子下游是允许基因整合的BamHI，XbaI， 和Asp718限制酶裂解位点。该质粒在这些克隆位点之后含有3’内含 子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可以 用于表达，例如人β肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来 自于其它逆转录病毒，如HIV和HTLVI的长末端重复。Clontech的 Tet-Off和Tet-On基因表达系统和相似的系统可以用于在哺乳动物细 胞中以经调节的途径表达IL-6(M.Gossen，and H.Bujard，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对于mRNA的聚腺苷酸化， 也可以使用例如人生长激素或球蛋白基因的其它信号。携带整合到染 色体中的目的基因的稳定细胞系也可以通过用可选择标记如gpt，G418 或潮霉素共转染而进行选择。在开始时使用G418加氨甲喋呤等一种 以上的可选择标记是有利的。
用限制酶消化pC4质粒，然后通过本领域公知的程序用小牛肠磷 酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶分离载体。
根据已知的方法步骤，使用编码完整的IL-6抗体的DNA序列， 如SEQ ID NOS：7和8所示，相当于本发明的IL-6抗体的HC和LC 可变区。该构建体中也使用编码合适的人恒定区(即HC和LC区) 的分离的核酸。
然后用T4 DNA连接酶连接分离的可变区和恒定区编码DNA和 去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB 101或XL-1Blue细胞，并 且例如用限制酶分析鉴定含插入pC4质粒的片段的细菌。
用缺乏DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。用0.5 μg pSV2-neo质粒采用脂质转染共转染5μg表达质粒pC4。pSV2-neo 质粒含有显性可选择标记，即来自于Tn5的neo基因，它编码一种酶， 该酶赋予对包括G418的一组抗生素的抗性。将这些细胞种植在补加 1g/ml G418的α-MEM中。两天后，用胰蛋白酶消化细胞并且种植在 杂交瘤克隆板上(Greiner，Germany)，置于补加10、25或50n g/ml氨 甲喋呤的α-MEM中。大约10-14天后，用胰蛋白酶消化单个克隆， 然后种植在6孔培养皿或10ml烧瓶中，使用不同浓度的氨甲喋呤(50 nM，100nM，200nM，400nM，800nM)。然后将在最高浓度氨甲喋呤 下生长的细胞转染到新的6孔板中，该板含有更高浓度的氨甲喋呤(1 mM，2mM，5mM，10mM，20mM)。重复同样的程序，直到获得在 100-200mM的浓度下生长的克隆。例如，通过SDS-PAGE和蛋白印 迹或反相HPLC分析所需基因产物的表达。
抗IL-6抗体组分的抗独特型抗体
除单克隆抗体或嵌合抗IL-6抗体外，本发明还涉及特异于本发明 的这些抗体的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别独特决定簇 的抗体，所述决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。可以用抗 体或其含CDR的区域免疫与作为Id抗体来源的动物相同物种和基因 型(如小鼠株)的动物，从而制备抗Id。被免疫的动物将识别免疫抗 体的独特型决定簇并对其产生应答，并且产生抗Id抗体。抗Id抗体 也可以用作“免疫原”以诱导另一动物的免疫应答，产生所谓的抗-抗 独特型抗体。
抗IL-6抗体组合物
本发明也提供至少一种以天然存在的组合物、混合物或形式提供 的抗IL-6抗体组合物，其中包含此处描述的和/或本领域公知的至少 一种、至少两种、至少四种、至少五种、至少六种或更多抗IL-6抗 体。这些组合物包括天然存在的组分，包括抗IL-6抗体氨基酸序列 的至少一种或两种全长的序列、C和/或N端去除的变体、结构域、 片段、或特定变体，该抗IL-6抗体氨基酸序列选自SEQ ID NOS：1，2， 3，4，5，6，7，8的70-100％的连续氨基酸或其特定片段、结构域或变 体。优选的抗IL-6抗体组合物包括抗IL-6抗体氨基酸序列的至少一 种含CDR或LBR的部分的至少一种或两种全长的序列、片段结构域 或变体，该抗IL-6抗体氨基酸序列选自SEQ ID NOS：1，2，3，4，5，6 的70-100％的连续氨基酸或其特定片段、结构域或变体。更优选的 组合物包含选自SEQ ID NOS：1，2，3，4，5，6的70-100％的连续氨基 酸或其特定片段、结构域或变体中的至少一种的40-99％。组分百分 比是液体或干溶液、混合物、悬浮液、乳状液或胶体的重量、体积、 浓度、体积克分子浓度或重量克分子浓度百分比，如本领域所公知或 此处的描述。
本发明的抗IL-6抗体组合物可以进一步包含任意适当的有效量的 组分或药物组分中的至少一种，所述组合物包含需要这种调节、处理 或治疗的细胞、组织、器官、动物或病人的至少一种抗IL-6抗体， 该组合物任选进一步包含至少一种选自至少一种以下物质的组分： TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或 其片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药物(如氨甲 喋呤、金诺芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、etanercept、硫代苹果酸金 钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉 药(narcotic)、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂(anesthetic)、 镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如氨基糖苷、 抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、carbapenem、头孢菌素、 flurorquinolone、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗微生物 剂)、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关 试剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙相关激素、抗腹泻 药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗凝剂、促红细胞生成 素(如epoetinα)、非尔司啶(如G-CSF，Neupogen)、沙拉斯(GM- CSF，白细胞素)、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如basiliximab、 环孢霉素、daclizumab)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调 节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、 放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、抗精神病药物、 抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、他克林、 抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、 9-氨基四氢吖啶、肾上腺素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。细胞因子的非限制性实例包括，但不限于IL-1 至IL-23中的任意一种。适当的剂量是本领域公知的。见，例如，Wells et al.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Pu blishing，Loma Linda，CA(2000)，在此全文引入作为参考。
这些抗癌或抗感染试剂也可以包括与本发明的至少一种抗体缔 合、结合、共同制剂化或共同给药的毒素分子。毒素可以任选选择性 杀灭病变细胞或组织。病变细胞可以癌或其它细胞。这些毒素可以是， 但不限于，纯化或重组毒素或毒素片段，它包含如选自蓖麻毒素、白 喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素中的至少一种的毒素的至少一种功能性 细胞毒性结构域。毒素也包括由任意天然存在的、突变或重组细菌或 病毒的内毒素和外毒素，它们可以导致人类或其它哺乳动物中的任意 病理学状况，包括致死的毒素休克。这些毒素可以包括，但不限于， 产肠毒素的大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(LT)、热稳定性肠毒素(ST)、 志贺氏菌细胞毒素、Aeromonas肠毒素、中毒性休克综合征毒素- 1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)，B(SEB)或C(SEC)、链球菌肠 毒素等。所述细菌包括，但不限于，产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、肠 出血性大肠杆菌(如血清型0157:H7的菌株)、葡萄球菌物种(如金 黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌)、志贺氏菌物种(如痢疾志贺氏菌、 弗氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和索氏志贺氏菌)、沙门氏菌物种(如 伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)、梭菌物种(如产 气荚膜梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌)、弯曲杆菌物种(如空肠弯曲杆 菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌物种(如幽门螺杆菌)、气单胞菌物种(如 温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类志贺邻单孢菌、 小肠结肠盐耶尔森氏菌、Vibrios物种(如霍乱弧菌、副溶血弧菌)、 克雷白氏菌物种、铜绿假单孢菌和链球菌。见，例如，Stein，ed.， INTERNAL MEDICINE，3rd ed.，pp 1-13，Little，Brown and Co.， Boston，(1990)；Evans et al.，eds.，Bacterial Infections of Humans： Epidemiology and Control，2d.Ed.，pp 239-254，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)；Mandell et al，Principles and Practice of Infectious Diseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，New York(1990)； Berkow et al，eds.，The Merck Manual，16th edition，Merck and Co.， Rahway，N.J.，1992；Wood et al，FEMS Microbiology Immunology，76： 121-134(1991)；Marrack et al，Science，248：705-711(1990)，在此全文 引入这些参考文献的完整内容作为参考。
本发明的抗IL-6抗体化合物、组合物或其组合可以进一步包含任 意适当辅助物质，例如，但不限于稀释液、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、 盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等中的至少一种。优选药学可接受的辅 助物质。这些无菌溶液的非限制性的例子和制备方法是本领域公知 的，例如，但不限于Gennaro，Ed.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可以 常规选择药学可接受的载体，这些载体适于抗IL-6抗体、片段或变 体组合物的给药方式、溶解度和/或稳定性，如本领域公知或此处的描 述。
用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白、 肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如糖，包括单糖、双糖、三糖、四 糖和寡糖；衍生糖，如醛醇、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)， 可以单个或组合存在，单独或组合占重量或体积1-99.99％。示例性的 蛋白赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白 (rHA)、明胶、酪蛋白等。可以起缓冲作用的代表性氨基酸/抗体成分 包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、 半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨 酸、天冬酰胺等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，如果糖、麦 芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，如乳糖、蔗糖、 海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉籽糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋 糖苷、淀粉等；以及醛醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、 木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化 合物赋形剂是甘露醇、海藻糖和棉籽糖。
抗IL-6抗体组合物也可以包含缓冲剂或pH调节剂；一般地，缓 冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，例如 柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯 二甲酸的盐；Tris，盐酸tromethamine、或磷酸缓冲液。用于本发明 的组合物中的优选缓冲剂是有机酸盐如柠檬酸盐。
此外，本发明的抗IL-6抗体组合物可以包含聚合物赋形剂/添加 剂，如聚乙烯基吡咯烷酮、ficolis(一种聚合的糖)、dextrates(如环 糊精，例如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物剂、 增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(如聚山梨醇酯，例如 ″TWEEN 20″和″TWEEN 80″)、脂质(如磷脂、脂肪酸)、类固醇(如 胆固醇)和螯合剂(如EDTA)。
适用于抗IL-6抗体、部分或变体组合物的这些和其它已知药物赋 形剂和/或添加剂是本领域公知的，例如，列于″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams & Williams，(1995)，和 ″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，Medical Economics，Montvale， NJ(1998)，在此引入其完整公开内容作为参考。优选的载体或赋形剂 物质是碳水化合物(如糖和醛醇)和缓冲剂(如柠檬酸盐)或聚合剂。
制剂
如前面所指出的，本发明提供了稳定的制剂，优选为含有盐或选 择的盐的磷酸缓冲液，以及含有防腐剂的储存溶液和制剂，适于药用 或兽医用途的多用途储存制剂，它包含置于药学可接受制剂中的至少 一种抗IL-6抗体。储存制剂包含至少一种已知的防腐剂或任选选自 至少一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸 苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如六水合物)、对羟基 苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、 脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其在一种水性稀释液中的混合 物。可以使用本领域公知的任何适当浓度或混合物，例如0.001-5％， 或其中的任意范围或任意值，例如，但不限于，0.001，0.003，0.005，0.009， 0.01，0.02，0.03，0.05，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1， 1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8， 2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.3，4.5，4.6，4.7，4.8， 4.9，或其中的任意范围或任意值。非限制性实例包括，无防腐剂，0.1-2％ 间甲酚(如0.2，0.3，0.4，0.5，0.9，1.0％)，0.1-3％苯甲醇(如0.5，0.9，1.1， 1.5，1.9，2.0，2.5％)，0.001-0.5％乙基汞硫代水杨酸钠(如0.005，0.01)， 0.001-2.0％苯酚(如0.05，0.25，0.28，0.5，0.9，1.0％)，0.0005-1.0％对 羟基苯甲酸烷基酯(如0.00075，0.0009，0.001，0.002，0.005，0.0075， 0.009，0.01，0.02，0.05，0.075，0.09，0.1，0.2，0.3，0.5，0.75，0.9，1.0％) 等。
如前面所指出的，本发明提供了一种制品，包括包装材料和至少 一个管形瓶，其中包含至少一种抗IL-6抗体的溶液和规定的缓冲剂 和/或防腐剂，任选溶于一种水性稀释液，其中所述包装材料包括一种 标签，它指出所述溶剂可以保留1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、 24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长的时间。本发明 进一步包括一种制品，包括包装材料和含有至少一种冻干的抗IL-6 抗体的第一个管形瓶，和含有规定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的 第二个管形瓶，其中包装材料包括一种标签，它指导患者在水性稀释 液中重构至少一种抗IL-6抗体，以便形成可以保留24小时或更长时 间的溶液。
根据本发明而使用的至少一种抗IL-6抗体可以通过重组方法产 生，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂重组产生，或者从其它生物来 源纯化，如此处所描述或本领域公知。
在本发明的产品中的至少一种抗IL-6抗体的范围包括在湿/干体 系中重构时，产生约1.0μg/ml至约1000mg/ml的量，但更低和更高 的浓度也是可行的，并且依赖于准备使用的递送载体，例如，溶液制 剂将不同于经皮贴剂、肺、经粘膜或渗透或微泵方法。
优选地，水性稀释液任选进一步包含药学可接受的防腐剂，优选 的防腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、 对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯 索氯铵、脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物的那些。用 于制剂中的防腐剂的浓度为足以产生抗微生物作用的浓度。这些浓度 取决于选择的防腐剂，并且本领域技术人员很容易确定。
可以任选和优选将其它赋形剂，如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、 防腐增强剂加入稀释液中。甘油等等渗剂通常以公知的浓度使用。优 选加入生理耐受的缓冲剂以改进pH控制。制剂可以有宽范围的pH 值，例如pH约4-10，优选pH约5-9，最优选约6.0-8.0。本发 明的制剂的pH优选为约6.8-7.8。优选的缓冲剂包括磷酸缓冲液， 最优选为磷酸盐，特别是磷酸缓冲盐水(PBS)。
也可以任选向制剂或组合物中加入其它添加剂，如药学可接受的 增溶剂，如Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween 40 (聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)山 梨糖醇酐单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物) 和PEG(聚乙二醇)或非离子型表面活性剂，例如polysorbate20或 80、或poloxamer 184或188、Pluronic多元醇其它共聚物，以及螯 合剂如EDTA和EGTA，以减少聚集。如果用泵或塑料容器给予制剂， 则这些添加剂特别有用。药学可接受的表面活性剂的存在减少了蛋白 聚集的倾向。
可以通过以下方法制备本发明的制剂，包括将至少一种抗IL-6抗 体和选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基 苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、 脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠，或其混合物在一种水性稀释液中 混合。采用常规的溶解和混合步骤在一种水性稀释液中混合所述至少 一种抗IL-6抗体和防腐剂。为了制备适当的制剂，例如，可以将测 得量的溶于缓冲液中的至少一种抗IL-6抗体在其量足以提供需要浓 度的蛋白和防腐剂的缓冲液中混合。本领域技术人员可以了解该方法 的变化。例如，加入各成分的顺序、是否使用其它添加剂、制备该制 剂的温度和pH都是可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。
可以将本发明的制剂以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给 患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗IL-6抗体的管形瓶， 将其用含有水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸缓冲剂和/或盐水和溶 于水性稀释液中的选择的盐的第二个管形瓶重构。单一溶液的管形瓶 或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足病人治疗的 单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。
本发明的制品可用于在24小时左右或更长的时间内给药。因此， 本发明的制备为患者提供了显著的优势。本发明的制剂任选可以储存 在约2-40℃的温度下储存，并且在长时间保持蛋白的生物活性，因 此，包装标签指出，该溶液可以在超过6、12、18、24、36、48、72 或96小时的时间内保留和/或使用。如果使用了储存稀释液，该标签 指出，该溶液可以在1-12个月，半年，一年半和/或两年的时间内用 完。
本发明中的至少一种抗IL-6抗体溶液可以通过包括在水性稀释液 中混合至少一种抗体的方法而制备。采用常规的溶解和混合步骤进行 混合。为了制备适当的稀释液，例如，可以将测得量的溶于水或缓冲 液中的至少一种抗体以足以提供所需浓度的蛋白和任选的防腐剂或缓 冲液的量混合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入 各成分的顺序、是否使用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是 可以对使用的浓度和给药方式进行优化的因素。
本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患 者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗IL-6抗体的管形瓶， 将其用含有水性稀释液的第二个管形瓶重构。单一溶液的管形瓶或要 求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足病人治疗的单个 或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治疗方案。
本发明的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给药 店、诊所、或其它机构和设施，从而直接提供给患者，其中双管形瓶 包含一个装有至少一种冻干的抗IL-6抗体的管形瓶，将其用含有水 性稀释液的第二个管形瓶重构。此情况下的澄清溶液最多可达1升或 甚至更多，提供于大的储存容器，从中可以一次或多次取出至少一种 抗体溶液的更小部分，将其转移至更小的管形瓶中，由药店或诊所提 供给客户和/或病人。
公认的包括这些单个管形瓶体系的设备包括用于递送溶液的笔式 注射器，例如BD Pens，BD Autojector，Humaject，NovoPen，B- DPen，AutoPen，以及OptiPen，GenotropinPen，Genotronorm Pen， Humatro Pen，Reco-Peno，Roferon Pen，Biojeetor，iject，J-tip Needle-Free Injector，Intraject，Medi-Ject，如由以下公司生产： Becton Dickensen(Franklin，Lakes，NJ，www.bectondickenson.com)， Disetronic(Burgdorf，Switzerland，www.disetronic.com；Bioject， Portland，Oregon(www.bioject.com)；National Medical Products， Weston Medical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com)，Medi- Ject Corp(Minneapolis，MN，www.mediject.com)。公认的包括双管 形瓶的设备包括用于在药筒中递送重构的冻干药物的笔式注射器系 统，例如HumatroPen。
当前要求保护的产品包括包装材料。除了管理部门要求的信息， 包装材料提供了可以使用该产品的条件。本发明的包装材料为病人提 供了用两个管形瓶中的湿/干产品在水性稀释液中重构至少一种抗IL- 6抗体，以形成溶液，并且在2-24小时或更长的时间内使用该溶液 的说明。对于单一管形瓶中的溶液产品，该标签说明该溶液可以在2 -24小时或更长的时间内使用。当前要求保护的产品可以用于人类药 用产品用途。
本发明的制剂可以通过以下方法制备，包括混合至少一种抗IL-6 抗体和选定的缓冲液，优选含有盐水或选定的盐的磷酸缓冲液。用常 规溶解和混合步骤在水性缓冲液中混合至少一种抗体和缓冲剂。为了 制备适当的制剂，例如，可以将测得量的溶于水或缓冲液中的至少一 种抗体以足以提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的量与所需缓冲剂在水中 混合。本领域技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的 顺序、是否使用其它添加剂、制备该制剂的温度和pH都是可以对使 用的浓度和给药方式进行优化的因素。
要求保护的稳定或储存的制剂可以以澄清的溶液或作为双管形瓶 的形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗IL-6 抗体的管形瓶，将其用含有水性稀释液的第二个管形瓶重构。单一溶 液的管形瓶或要求重构的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足 病人治疗的单个或多个周期，因此比当前存在的方法提供更方便的治 疗方案。
可以根据本发明通过各种递送方法给予患者此处描述的至少一种 抗IL-6抗体的稳定或储存制剂或溶液；所述方法包括皮下或肌内注 射；经皮、肺部、经粘膜、植入、渗透泵、药筒、微泵，或其它本领 域公知的本领域技术人员了解的方法。
治疗用途
由于其多亲嗜性活性，IL-6参与多种疾病的病理学。因此，IL- 6的高亲和力的中和性嵌合或人抗体将是用于IL-6相关疾病，如癌症、 恶液质、SLE、类风湿关节炎、骨质疏松、脑创伤、脑水肿、抑郁和 CHF所需要的。cCLB8或该mAb的任何衍生物，包括嵌合或人源化 的衍生物或片段可以用于缓解骨痛、抑制肿瘤生长，所述肿瘤如骨髓 瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和多发性骨髓瘤、淋巴 细胞增殖性病症和IL-6所涉及的其它疾病。该抗体可以作为单一试 剂使用或与其它治疗剂联合。此外。该Mab可以用作化学增敏剂， 从而可以增加细胞毒性剂的疗效。该抗体可以用作放疗增敏剂，从而 可以改善放疗效率。也可以将其与其它肿瘤调节剂，如IL-2，IL-12和/ 或IFNα联合使用。
因此，本发明也提供了使用本发明的至少一种IL-6抗体调节或治 疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种本领域公知或此处描 述的IL-6相关疾病的方法。
已知IL-6通过涉及抑制恶性细胞凋亡的自分泌或旁分泌机制增强 多发性骨髓瘤(MM)中恶性浆细胞的增殖、分化和存活。MM是一 种可治愈的恶性浆细胞疾病，其中推断阻断IL-6是有效的治疗 (Anderson et al.，Multiple Myeloma：New Insights and Therapeutic Approaches.Hematology：147-165，2000)。IL-6在基底细胞癌中也具 有肿瘤发生作用，其中IL-6转染的细胞表现出通过抑制凋亡和活跃 促进而增加肿瘤生长速度(Jee et al.，Overexpression of interleukin-6in human basal cell carcinoma cell lines increases anti-apoptotic activity and tumorigenic potency.Oncogene，Vol.20，No.2pp.198-208， 2001)。IL-6也可以通过诱导mdrl基因表达(mdrl和金属硫蛋白途 径)而促进乳腺癌细胞对化疗的抗性(Conze et al，Autocrine Production of Interleukin 6 Causes Multidrug Resistance in Breast Cancer Cells. Cancer Res 61：8851-8858，2001)。
通过抗IL-6mAb在体外和体内对肿瘤细胞生长的抑制作用，证 实了IL-6介导肿瘤细胞存活和疾病进展的能力。已经报道阻断IL-6 可以体外抑制人脑肿瘤(成胶质细胞瘤)的生长(Goswami et al.， Interleukin-6-mediated autocrine growth promotion in human glioblastoma multiforme cell line U87MG.J Neurochem 71：1837- 1845，1998)。采用相同的方法，证明注射鼠CLB8抗-IL-6抗体延长了 携带人肿瘤的小鼠的存活(Mauray et al.，Epstein-Barr virus- dependent lymphoproliferative disease：critical role of IL-6.Eur J Immunol；30(7)：2065-73，2000)。也报道了CLB8抗-IL-6抗体逆转 人肾癌的生长并且降低了裸鼠中的血清钙浓度(Weisglass etal.，The role of interleukin-6 in the induction of hypercalcemia in renal cell carcinoma transplanted into nude mice.Endocrinology 138(5)：1879-8.， 1995)。CLB-8抗体也逆转小鼠中建立的人激素难治的前列腺肿瘤异 种移植物(Smith et al.2001)Anti-interleukin-6 monoclonal antibody induces regression of human prostate cancer xenografts in nude mice (Smith and Keller，Prostate；48(1)：47-53)。
IL-6也是恶性肿瘤的预测因子和指标。报道了在肾细胞癌(RCC) 中，高水平的IL-6与肿瘤转移相关，并且最终与预后差和存活短相 关(Jean-Yves Blay et al.1992)。此外，在RCC中，升高的血清IL-6 与对IL-2治疗的反应差相关(Fumagalli et al.1999)Pretreatment serum markers and lymphocyte response to interleukin-2therapy.Br J Cancer 80(3-4)：407-11，并且与IL-2相关毒性的程度相关(Capuron et al.2001)Association between immune activation and early depressive symptoms in cancer patients treated with interleukin-2-based therapy. Psychoneuroendocrinology；26(8)：797-808。
IL-6的水平升高也与预后差和乳腺癌中转移性疾病的存在相关 (Kurebayashi 2000 and Benoy 2002)Regulation of interleukin-6 secretion from breast cancer cells and its clinical implications.Breast Cancer；7(2)：124-9.Serum interleukin 6，plasma VEGF，serum VEGF， and VEGF platelet load in breast cancer patients.Clin Breast Cancer： 2(4)：311-5。
假定IL-6是癌症相关病，如虚弱/恶液质和骨重吸收的致病因素。 发现肿瘤诱导的恶液质(Cahlin et al.2000)和骨重吸收(随后的高钙血 症)(Sandhu et aI.1999)在IL-6敲除小鼠中减少。继发于脑肿瘤的癌 症相关抑郁和脑水肿也与高水平的IL-6相关(Musselman et al.2001)。 本发明的cCLB8抗IL-6抗体也在裸鼠中抑制人骨髓瘤和人前列腺癌 诱导的恶液质。
用抗IL-6剂的临床经验
在多种疾病，包括浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、B淋巴细胞增 殖性疾病、类风湿关节炎、肾癌和AIDS相关淋巴瘤中，采用抗IL-6 的单克隆抗体进行了一些临床试验。
采用本发明的抗IL-6 cCLB-8抗体治疗患有晚期多发性骨髓瘤的 难治患者(N＝12)进行的I期剂量递增研究证明了一些患者具有疾 病稳定化。终止治疗后，M蛋白水平的增加加速，提示治疗停止后的 疾病反弹。抗-IL-6 cCLB-8抗体抑制游离的循环IL-6。最重要的是 没有观察到毒性(除在两名严重的预先进行过治疗的患者中有短暂的 血小板减少)或过敏反应。在所有患者中C反应蛋白(CRP)减少到检 测水平以下。抗-IL-6 cCLB-8抗体表现出17.8天的长的循环半衰期， 并且没有观察到人抗嵌合抗体(HACA)免疫应答(van Zaanen et al. 1998)。给予CNTO 328没有导致血压、脉搏、体温、血红蛋白、肝 功能和肾功能的改变。除了两名严重的预先进行过治疗的患者中有短 暂的血小板减少，没有观察到毒性或过敏反应，并且没有观察到人抗 嵌合抗体(HACA)免疫应答。3名患者在治疗中发生了感染相关的并发 症，与抗-IL-6 cCLB-8抗体的可能联系是不太可能的，因为感染并发 症是晚期多发性骨髓瘤常见的，并且是死亡的主要原因。此外，所有 3名患者都能在存在抗-IL-6 cCLB-8抗体的条件下对他们的感染事件 有应答，提示抗IL-6治疗在感染中不能阻断IL-6。没有报道治疗相 关的死亡。总之，该研究的结果表明抗-IL-6 cCLB-8抗体在多发性骨 髓瘤患者中是安全的。
因此，本发明提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或 患者中的至少一种恶性疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下 疾病中的至少一种：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病 (ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓细胞白血病(AML)、慢 性髓细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、 骨髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非 何杰金氏淋巴瘤、布加氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西肉瘤、结直 肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多症、 副癌综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管 瘤、转移性疾病、癌相关骨重吸收、癌相关骨重吸收、癌相关骨痛等； 抑制癌症转移；改善癌症恶液质；治疗如系膜增殖性肾小球肾炎等炎 性疾病。所述方法可以任选在给予所述IL-6抗体之前、同时或之后， 联合给予放疗、抗血管发生剂、化疗剂、法尼基转移酶抑制剂等。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者 中的至少一种免疫相关疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下 疾病中的至少一种：类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、全身发 病的幼年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强制性脊柱炎、胃溃疡、 血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑 狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺 纤维化、系统性血管炎/韦格纳肉芽肿、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切 除逆转程序、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性 接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移 植物抗宿主疾病、全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性 菌脓毒症、革兰氏阴性菌脓毒症、培养阴性菌脓毒症、真菌脓毒症、 中性粒细胞减少性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧 伤、离子辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关 节炎、酒精诱导的肝炎、慢性炎性病变、肉样瘤病、克隆氏病、镰状 细胞贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、过敏反应、过敏性鼻炎、枯 草热、终年性肺炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、风疹、全身过敏、 皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任何器官或组织的移 植排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、 肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同种异体移植排斥、软骨移 植排斥、骨移植排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺 移植排斥、任何器官或组织的异种移植排斥、同种异体排斥、抗受体 过敏反应、格雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、哮喘、 重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、HI型过敏反应、系统性红斑狼 疮、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大、内分泌病、单克隆 γ球蛋白病和皮肤改变综合征)、多发性神经病、器官巨大、内分泌 病、单克隆γ球蛋白病和皮肤改变综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、 硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动 性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心脏切开后综 合征、IV型过敏、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体排斥、细胞内 生物引起的肉芽肿、药物过敏、代谢性/特发性威尔逊氏病、血色素沉 着病、α-1-抗胰岛素缺陷、糖尿病肾病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松 症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、 脑脊髓炎、恶液质、囊性纤维化、新生儿慢性肺疾病、慢性阻塞性肺 疾病(COPD)、家族性血巨噬细胞淋巴细胞组织细胞增多症、皮肤病 学状况、牛皮癣、斑秃、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰 竭、血液透析、尿毒症、中毒、惊厥前状态、okt3治疗、抗cd3治疗、 细胞因子治疗、化疗、放疗(如包括，但不限于虚弱、贫血、恶液质 等)、慢性水杨酸盐中毒等。见，例如the Merck Manual，12th-17th Editions，Merck & Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987， 1992，1999)，Pharmacotherapy Handbook，Wells et al.，eds.，Second Edition，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，在此引 入作为参考。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者 中的至少一种感染疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病 中的至少一种：急性和慢性细菌感染、急性和慢性寄生或感染过程， 包括细菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎 (甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、 大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒症综合征/血栓溶解性血小板减少性紫 癜、疟疾、登革热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌 肌炎、气性坏疽、分支杆菌结核、分支杆菌avium intracellulare、间 质性浆细胞肺炎、盆腔炎性疾病、睾丸酮/附睾炎、军团菌病、莱姆病、 甲型流感、epstein-barr病毒、生命体征相关的血巨噬细胞综合征、 致命性脑炎/无菌性脑膜炎等。
上述任何方法可以任选包括给予需要所述调节、处理或治疗的细 胞、组织、器官、动物或患者有效量的至少一种含有至少一种抗IL-6 抗体的组合物或药物组合物。用抗IL-6进行治疗的适应症公开于以 下文献，在此引入本申请作为参考：Van Snick，“interleukin-6：An overview，”Ann.Rev.Immunol.，8：253-278(1990)；Campbell et al.， “Essential Role for Interferon-gamma And interleukin-6 in Autoimmune Insulin-Dependent Diabetes in NOD/Wehi Mice.”J.Clin. Invest.，87：739-742(1991)；Heinrich et al.，“interleukin-6 Monoclonal Antibody Therapy for a Patient with Plasma Cell Leukemia，″Blood. 78(5)：1198-1204(1991)；Starnes et al.，“Anti-IL-6 Monoclonal Antibodies Protect Against Lethal Escherichia coli Infection and Lethal Tumor Necrosisi Factor-alpha.Challenge in Mice.” J.Immunol.，145(12)：4185-4191(1990)；Strassman et al.，“Evidence for the Involvement of Interleukin 6 in Experimental Cancer Cachexia.″J. Clin.Invest.，89：1681-1684(1992)。
本发明的任何方法可以包括，给予需要这种调节、处理或治疗的 细胞、组织、器官、动物、病人有效量的包含至少一种抗IL-6抗体 的组合物或药物组合物。所述方法可以任选进一步包括用于治疗这些 免疫疾病的共同给药或联合治疗，其中给予所述至少一种抗IL-6抗 体、其特定部分或变体，进一步包括在之前、同时和/或之后，给予至 少一种选自下组至少一种的药物：TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF 抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、其融合蛋白、或小分子TNF 拮抗剂)、抗风湿药物(如氨甲喋呤、金诺芬、金硫葡萄糖、硫唑嘌 呤、etanercept、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳氮 磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非甾体类抗炎药(NSAID)、镇痛药、 麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(如氨 基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、carbapenem、头孢菌素、 flurorquinolone、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗微生物 剂)、抗牛皮癣药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关 试剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙相关激素、抗腹泻 药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗凝剂、促红细胞生成 素(如epoetinα)、非尔司啶(如G-CSF，Neupogen)、沙拉斯(GM- CSF，白细胞素)、疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如basiliximab、 环孢霉素、daclizumab)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调 节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、 放射性药物、抗抑郁剂、抗精神病药物、抗躁狂药、抗精神病药物、 抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药物、刺激剂、donepezil、他克林、 抗哮喘药、β激动剂、吸入性类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、 9-氨基四氢吖啶、肾上腺素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、细胞 因子或细胞因子拮抗剂。细胞因子的非限制性实例包括，但不限于IL-1 至IL-23中的任意一种。适当的剂量是本领域公知的。见，例如，Wells et al.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，在此全文引入作为参考。
适用于本发明的组合物、联合治疗、共同给药、设备和/或方法的 TNF拮抗剂(进一步包括本发明的至少一种抗体、其特定片段和变体) 包括，但不限于，抗TNF抗体、其抗原结合片段、以及与TNF特异 性结合的受体分子；防止和/或抑制TNF合成、TNF释放或TNF作 用于靶细胞的化合物，如酞胺哌啶酮、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂 (如己酮可可碱、环戊苯吡酮)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受 体增强剂；防止和/或抑制TNF受体信号传递的化合物，如有丝分裂 原激活的蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化 合物，如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，如 血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利)；和阻断和/或抑制 TNF活性产生和/或合成的化合物，如MAP激酶抑制剂。
治疗处理
本发明的任何方法可以包括治疗IL-6介导的疾病，包括给予需要 这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物、病人有效量的包 含至少一种IL-6抗体的组合物或药物组合物。所述方法可以任选进 一步包括用于治疗这些免疫疾病的共同给药或联合治疗，其中给予所 述至少一种抗IL-6抗体、其特定部分或变体，进一步包括在之前、 同时和/或之后，给予至少一种上述试剂。
一般地，病理学状况的治疗是通过给予有效量或剂量的至少一种 抗IL-6抗体组合物而实现的，该组合物中平均总共含有至少约0.01 -500mg至少一种抗IL-6抗体/千克患者体重/剂，优选每单次或多次 给药约0.1-100mg抗体/千克患者体重，这取决于组合物中含有的比 活性。作为选择，有效血清浓度可以包括每单次或多次给药0.1-5000 μg/ml的血清浓度。适当的剂量是医学从业者已知的，当然，取决于 特定的疾病状态、给予的组合物的比活性、以及患者正在进行的具体 治疗。在一些情况下，为获得需要的治疗量，必须提供重复给药，即 重复特定监测或计量剂量的各次给药，其中重复各次给药，直到达到 需要的每日剂量或效果。
优选的剂量可以任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/给药，或其中的 任意范围、任意值或任意分数，或每单次或多次给药达到0.1、0.5、0.9、 1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、 5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、 9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、 13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、 8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、 12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、 16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、 20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、 4500、和/或5000μg/ml血清浓度，或其中的任意范围、任意值或任 意分数。
此外，给药剂量可以根据已知因素而改变，例如具体试剂的药代 动力学特征，以及其给药模式和途径；接受者的年龄、健康和体重； 症状的性质和范围；同时进行的治疗的类型、频率，以及需要的效果。
活性成分的剂量通常为约0.1-100mg/kg体重。通常为0.1-50，优 选0.1-10mg/kg/给药，或以有效获得需要的结果的持续释放形式。
作为非限制性实例，人或动物的治疗可以通过一次或周期剂量的 至少一种本发明的抗体而提供，其剂量为0.1-100mg/kg，例如0.5、 0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/日，在第1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、或40天中的至少一天给药，或作为选择或额外地 在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、或52周的至少一周给药，或作为选择或额外地在1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、或20年中的至少一年中给药，或其任意组合，采用单次输注或 重复给药。
适于内部给药的剂型(组合物)一般包含约0.1mg-约500mg活 性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，活性成分的量一般为组合 物总重量的约0.5-99.999wt％。
肠胃外制剂和给药
对于肠胃外给药，可以将抗体配制为与药学可接受的肠胃外载体 结合或分别提供的溶液、悬浮液、乳状液或冻干的粉末。这些载体的 例子为水、盐水、林格氏液、右旋糖溶液、和1-10％的人血清白蛋白。 也可以使用脂质体和非水性载体如固定的油。载体或冷冻干燥的粉末 可以含有维持等渗性(如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如缓冲剂 和防腐剂)。该制剂可以通过已知或适当技术灭菌。
适当的药物载体描述于本领域的标准参考文献Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol的最新版本。
肠胃外给药的制剂可以包含作为常规赋形剂的无菌水或盐水、聚 链烷醇如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。可以通过适当的乳化剂或润 湿剂和悬浮剂根据已知方法制备用于注射的水性或油性悬浮液。用于 注射的试剂可以是无毒的、非口服给药的稀释剂，如水溶液或无菌可 注射溶液或溶剂中的悬浮液。作为可使用的载体或溶剂，可以使用水、 林格氏液、等渗盐水等；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌的 不挥发油。对于这些目的，可以使用任意类型的不挥发油和脂肪酸， 包括天然或合成的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成的或半合 成的甘油单酯或二酯或三酯。肠胃外给药是本领域公知的，包括，但 不限于，常规注射工具、描述于美国专利No.5,851,198的气加压的无 针头注射设备，和描述于美国专利No.5,839,446的激光穿孔器设备， 在此全文引入上述专利作为参考。
作为选择的递送
本发明进一步涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、 支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、 结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、 腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱 内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速注射、阴道、直肠、颊、 舌下、鼻内或经皮设备而给予至少一种抗IL-6抗体。可以制备至少 一种抗IL-6抗体的组合物，用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或 任意其它给药，特别是以液体溶液或悬浮液给药；用于阴道或直肠给 药，特别是以半固体形式给药，例如，但不限于以霜和栓剂形式给药； 用于颊部或舌下给药，例如，但不限于以片剂或胶囊形式给药；或用 于鼻内给药，例如，但不限于以粉末、鼻滴液或气溶胶或某些制剂形 式给药；或用于经皮给药，例如，但不限于以凝胶、油膏、洗液、悬 浮液或贴剂递送系统给药，同时用化学增强剂如二甲基亚砜修饰皮肤 结构或增加经皮贴剂的药物浓度(Junginger，et al.In″Drug Permeation Enhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp.59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，)在此全文引入作为参考)，或使用氧化 剂以便将含有蛋白和肽的制剂应用于皮肤上(WO 98/53847)，或施加 电场以便产生电穿孔等瞬时转运途径，或增加带电药物通过皮肤的迁 移率，如离子电渗疗法，或应用超声，如超声电渗疗法(美国专利Nos. 4,309,989和4,767,402)(上述文献和专利在此全文引入作为参考)。
肺部/鼻部给药
对于肺部给药，至少一种抗IL-6抗体组合物优选以优选到达肺的 下气道或鼻窦的颗粒大小进行递送。根据本发明，至少一种抗IL-6 抗体可以通过本领域公知的各种吸入或鼻设备递送，用于通过吸入进 行治疗剂的给药。这些设备可以将气溶胶化的制剂沉积在患者的鼻窦 腔或肺泡中，所述设备包括计量吸入器、喷洒器、干粉产生器、喷雾 器等。其它适于指导抗体的肺或鼻给药的设备是本领域公知的。所有 这些设备可以使用适于以气溶胶形式给予分散抗体的制剂。这些气溶 胶可以由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。Ventolin等计量吸 入器一般使用推进气体并且在吸入时要求激活(见，例如WO 94/16970， WO 98/35888)。由Inhale Therapeutics出售的TurbuhalerTM(Astra)、 Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)等干粉吸 入器以及Spinhaler粉末吸入器使用呼吸激活的混合粉末(US 4668218 Astra，EP 237507Astra，WO 97/25086Glaxo，WO 94/08552Dura，US 5458135Inhale，WO 94/06498Fisons，在此全文引入作为参考)。AERxTM Aradigm、Ultravent喷洒器(Mallinckrodt)和Acorn II喷洒器 (Marquest Medical Products)((US 5404871Aradigm，WO 97/22376)，上述参考文献在此全文引入作为参考)从溶液产生气溶胶， 而计量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。这些商购吸入设备 的具体例子是用于代表适于本发明的实施的具体设备，不准备限制本 发明的范围。包含至少一种抗IL-6抗体的组合物优选通过干粉吸入 器或喷雾器递送。用于本发明的至少一种抗体的给药的吸入设备具有 一些需要的特征。例如，通过吸入设备递送是有利的，它可靠、可重 复并且准确。吸入设备可以任选递送小的干颗粒，例如小于约10μm， 优选约1-5μm，以便能够较好地呼吸。
作为喷雾给予IL-6抗体组合物
可以迫使至少一种抗IL-6抗体的悬浮液和溶液在压力下通过喷 嘴，从而产生包括IL-6抗体组合物的喷雾。可以选择喷嘴大小和构 型、施加的压力和填入液体的速度而达到需要的输出量和颗粒大小。 可以通过连接于毛细管或喷嘴的电场产生电喷雾。有利的是，由喷雾 递送的至少一种抗IL-6抗体组合物蛋白的颗粒大小小于约10μm， 优选约1-5μm，最优选约2-3μm。
适用于喷雾器的至少一种抗IL-6抗体组合物蛋白的制剂一般包含 溶于水溶液中的抗体组合物蛋白，其浓度为约每毫升溶液约0.1-100 mg至少一种抗IL-6抗体组合物蛋白或mg/gm，或其中的任意范围或 任意值，例如，但不限于1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、 80、90或100mg/ml或mg/gm。该制剂可以包含赋形剂、缓冲剂、 等渗试剂、防腐剂、表面活性剂和优选锌等试剂。该制剂也可以包含 赋形剂或用于稳定组合物蛋白的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大分子 蛋白或碳水化合物。用于配制抗体组合物蛋白的大分子蛋白包括白蛋 白、鱼精蛋白等。用于配制抗体组合物蛋白的典型碳水化合物包括蔗 糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。抗体组合物蛋白制剂也可以 包含表面活性剂，它可以减少或防止由于溶液形成气溶胶时的雾化导 致的表面诱导的抗体组合物蛋白的聚集。可以使用各种常规的表面活 性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。 其含量一般为制剂重量的约0.001-14％。用于本发明的特别优选的 表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、polysorbate 80、 polysorbate 20等。用于IL-6抗体或其特定部分或变体的蛋白制剂的 其它试剂是本领域公知的，也可以包含在制剂中。
通过喷洒器给予IL-6抗体组合物
可以通过喷洒器给予抗体组合物，例如喷射喷洒器或超声喷洒器。 一般地，在喷射喷洒器中，用压缩气体源通过一个孔而产生高速气体 喷射。当其它膨胀超过喷嘴时，产生低压区，该区将抗体组合物蛋白 溶液拉拽通过与液体储存器连接的毛细管。通过毛细管的液体流出管 时被剪切成不稳定的细丝和微滴，产生气溶胶。可以使用各种构型、 流速和挡板类型一般从给定的喷射喷洒去达到需要的性能特征。在超 声喷洒器中，采用高频电能产生振动、机械能，一般采用压电式换能 器。该能量被直接或通过耦合流体转移至抗体组合物制剂，产生包含 抗体组合物蛋白的气溶胶。有利地，由喷洒器递送的抗体组合物蛋白 的颗粒大小小于约10μm，优选约1-5μm，最优选约2-3μm。
喷射喷洒器或超声喷洒器中适用的至少一种抗IL-6抗体制剂的浓 度一般为每毫升溶液约0.1-100mg至少一种抗IL-6抗体蛋白。该制 剂可以包含赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、表面活性剂和优选 锌等试剂。该制剂也可以包含赋形剂或用于稳定至少一种抗IL-6抗 体组合物蛋白的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大分子蛋白或碳水化合 物。用于配制至少一种抗IL-6抗体的大分子蛋白包括白蛋白、鱼精 蛋白等。用于配制至少一种抗IL-6抗体的典型碳水化合物包括蔗糖、 甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一种抗IL-6抗体制剂也可 以包含表面活性剂，它可以减少或防止由于溶液形成气溶胶时的雾化 导致的表面诱导的至少一种抗IL-6抗体的聚集。可以使用各种常规 的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇 脂肪酸酯。其含量一般为制剂重量的约0.001-4％。用于本发明的特 别优选的表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、 polysorbate80、polysorbate20等。用于抗体蛋白等蛋白制剂的其它试 剂是本领域公知的，也可以包含在制剂中。
通过计量吸入器给予IL-6抗体组合物
在计量吸入器(MDI)中，在一个小罐中装有作为包含液化的压缩 气体的混合物的推进剂、至少一种抗IL-6抗体和任意赋形剂或其它 添加剂。计量阀的激活释放作为气溶胶的混合物，优选含有大小小于 约10μm，优选约1-5μm，最优选约2-3μm的可以。需要的气 溶胶颗粒大小可以通过使用由本领域技术人员公知的各种方法，包括 喷射研磨、喷雾干燥、临界点浓缩等方法产生的抗体组合物蛋白制剂 而获得。优选的计量吸入器包括由3M或Glaxo制造并且使用氢氟碳 推进剂的那些。
计量吸入器设备中使用的至少一种抗IL-6抗体一般包含精细分割 的粉末，其中含有作为非水介质中的悬浮物的至少一种抗IL-6抗体， 例如，在表面活性剂的帮助下悬浮于一种推进剂中。用于此目的的推 进剂可以是任何常规材料，如氨氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳或烃，包括 三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、 HFA-134a(氢氟链烷-134a)、HFA-227(氢氟链烷-227)等。推进剂 优选是氢氟碳。可以选择表面活性剂以稳定作为推进剂中的悬浮物的 至少一种抗IL-6抗体，从而保护活性试剂免受化学降解等。适当的 表面活性剂包括山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情 况下，溶液气溶胶优选使用乙醇等溶剂。本领域已知的用于蛋白制剂 的其它试剂，如蛋白，也可以包含在制剂中。
本领域的普通技术人员将认识到，本发明的方法可以通过此处没 有描述的设备对至少一种抗IL-6抗体组合物进行肺部给药而达到。
口服制剂和给药
口服制剂依赖于佐剂(如间苯二酚和非离子型表面活性剂如聚氧 乙烯油酯和正十六烷基聚乙烯酯)的共同给药而人工增加肠壁的通透 性，并且依赖于酶抑制剂(如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代硫酸酯 (DFF)和抑肽酶)的共同给药而抑制酶促降解。用于口服给药的固态 剂型的活性组成化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括 蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉籽糖、麦芽糖醇、右旋糖 苷、淀粉、琼脂、arginates、几丁质、脱乙酰壳聚糖、果胶、黄芪树 胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合 物和甘油酯。这些剂型也可以包含其它类型的添加剂，如非活性稀释 剂、润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血 酸、α生育酚、抗氧化剂如半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓 冲剂、增甜剂、矫味剂、芳香剂等。
片剂和丸剂可以进一步加工成肠衣制剂。用于口服给药的液体制 剂包括允许医学应用的乳状液、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制剂。这 些制剂可以含有所述领域常用的非活性稀释剂，如水。也已经描述将 脂质体用作胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利No.4,239,754)。 最近，已经使用混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物微球体来递送药 物(美国专利No.4,925,673)。此外，美国专利No.5,879,681和美国 专利No.5,5,871,753中描述的载体化合物也已经用于口服递送生物活 性试剂，这是本领域公知的。
粘膜制剂和给药
对于通过粘膜表面吸收，给予至少一种抗IL-6抗体的组合物和方 法包括含有多种亚微米颗粒、粘膜吸附性大分子、生物活性肽和水性 连续相的乳状液，它通过达到乳状液颗粒的粘膜吸附而促进通过粘膜 表面的吸收(美国专利Nos.5,514,670)。适于施加本发明的乳状液的 粘膜表面可以包括角膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和 直肠给药途径。用于阴道或直肠给药的制剂，如栓剂，可以包含赋形 剂，例如聚链烷醇、凡士林、可可油等。用于鼻内给药的制剂可以是 固体，包含赋形剂，例如乳糖，或可以是水性或油性的鼻滴液。对于 颊部给药，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美 国专利Nos.5,849,695)。
经皮制剂和给药
对于经皮给药，将至少一种抗IL-6抗体包被于递送载体，如脂质 体或聚合纳米颗粒、微颗粒、微胶囊或微球体中(除非特别指出，统 一称作微颗粒)。已知有许多适当的设备，包括由以下成分组成的微 颗粒：合成聚合物如多羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚 原酸酯、聚酐和聚磷腈，以及天然聚合物如胶原、聚氨基酸、铝和其 它蛋白、藻酸盐和其它多糖、及其组合(美国专利Nos.5,814,599)。
延长的给药和制剂
有时可能需要在延长的时间内向受试者递送本发明的化合物，例 如，单次给药在一周至一年的时间。可以使用各种缓释、储存或植入 剂型。例如，该剂型可以包含化合物的药学可接受的无毒盐，该化合 物在体液中具有低溶解度，例如，(a)多价酸的酸加成盐，所述酸例如 磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、pamoic酸、藻酸、聚谷氨酸、 萘单或二磺酸、聚半乳糖醛酸等；多价金属阳离子的盐，所述阳离子 如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或与有机阳离子如 N，N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的盐；或(c)，(a)和(b)的组合物，如 鞣酸锌。此外，本发明的化合物或优选相对不溶的盐，如前面描述的 化合物和盐，可以与芝麻油等适于注射的物质一起配制于单硬脂酸铝 凝胶等凝胶中。特别优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、pamoate盐等。用 于注射的缓释储存制剂的另一种类型包含用于包被于胶囊中的分散的 化合物或盐，所述化合物或盐位于缓慢降解、无毒、非抗原性的聚合 物中，如描述于美国专利No.3,773,919的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。 该化合物或优选相对不溶的盐，如前面描述的化合物和盐，也可以配 制于胆固醇基质硅橡胶丸，特别是用于动物。其它缓释、储存或植入 制剂，如气体或液体脂质体是本领域公知的(美国专利Nos.5,770,222 和″Sustained and Controlled Release Drug Delivery System s″，J.R. Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
缩写
BSA-牛血清白蛋白
EIA-酶免疫测定
FBS-胎牛血清
H2O2-过氧化氢
HRP-辣根过氧化物酶\
Ig-免疫球蛋白
IL-6-白介素-6
IP-腹膜内
IV-静脉内
Mab-单克隆抗体
OD-光密度
OPD-邻苯二胺二盐酸盐
PEG-聚乙二醇
PSA-青霉素，链霉素，两性霉素
RT-室温
SQ-皮下
v/v-体积/体积
w/v-重量/体积
实施例1
制备鼠CLB8 MAB
免疫
按照报道，产生鼠CLB-IL6-8抗体的杂交瘤来自于荷兰红十字会 输血服务机构的中心实验室，Lucein Aarden博士的实验室中进行的 融合(CLB)(Brackenhoff等，J.Immunol.(1990)145：561-568)。
用10μg乳化于弗氏完全佐剂的中的纯化重组白介素-6(rIL-6) (CLB)肌内(IM)免疫从CLB的指定的不含病原体的繁殖原种获得8 周龄的雌性Balb/c小鼠。以4-8周的间隔，用弗氏不完全佐剂中的 各10μg rIL-6进行随后三次IM注射。
细胞融合
最后一次IM加强注射后4天，处死小鼠；取出脾，切碎。在Earle’s 平衡盐溶液中获得单细胞悬浮液。洗涤细胞并计数。在Iscove’s改进 的Dulbecco’s培养基(IMDM)中的42％(w/v)聚乙二醇存在下以1∶3 的存活脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)的比例进行融合。非IgG 分泌性融合配偶体SP2/0是从在CLB维持的细胞库建立的。融合后， 将细胞重悬于IMDM，补加5％胎牛血清，50μM青霉素/链霉素，5 ×10-5M 2-巯基乙醇(2-ME)和HAT(6×10-4M次黄嘌呤，6.5×10-7M 氨基喋呤，6.4×10-5M胸腺嘧啶)。紧接于融合后的这些杂交瘤的增殖 依赖于IL-6，因此，向选择培养基中加入100U/mL的纯化鼠IL-6(Van Smick，Brussels)。然后将融合细胞以1×105细胞/100微升孔的密度分 布于96孔板中。
鼠IL-6杂交瘤的初步表征
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)选择 抗IL-6分泌性杂交瘤(Brackenhoff等(1990)145：561-568)。 采用固相ELISA筛选人IL-6的特异性单克隆抗体。室温下，以100 μL/孔将磷酸缓冲的盐溶液(PBS)中的纯化rIL-6(0.5μg/ml)包被 在平底板(Dynatech)上。用PBS、0.02％(v/v)Tween 20(PBS/Tween) 洗涤平板，并且在环境温度下用补加了0.2％明胶(PTG)的PBS/Tween 中的培养物上清液的1∶2稀释液温育2小时。洗涤后，用PTG中的辣 根过氧化物酶偶联的单克隆大鼠抗小鼠κ轻链226(Einstein University， NY)(2μg/mL)温育平板。洗涤平板，用0.1M乙酸钠，pH5.5中的 100μL/孔的3，5，3，5四甲基联苯胺/0.003％过氧化氢检测结合的过氧化 物酶。用2M H2SO4终止颜色反应，在Titertek，Multiscan读数器上 在450nM处读数。选择产生阳性OD的孔。
也采用固相RIA筛选抗IL-6杂交瘤。将山羊抗鼠Ig抗体偶联 于溴化氰活化的琼脂糖CL-4B(Pharmacia)。洗涤琼脂糖并且以 10mg/mL重悬于PBS，0.1％Tween 20，0.1％叠氮化钠。在大约20000 计数/分钟125I-rIL-6(CLB)存在下，在恒定搅拌下将杂交瘤上清液 加入琼脂糖珠6小时。在PBS/Tween存在下充分洗涤珠子，并且在γ 计数器中计数。选择产生最高比活性的孔。
确立在两种测定系统中均为阳性的杂交瘤，并且以有限稀释在补 加了2×10-5M 2-ME和5％FBS的IMDM(完全IMDM)中亚克隆 两次。选择IL-6非依赖性亚克隆CLB-IL6-8，在完全IMDM中维持。 在Vero76靶细胞上培养4天后，用间接Hoescht染色检验出支原体 阴性的原种培养物。通过Innogenetics Line ImmunoAssay(INNO-LIA) 小鼠单克隆抗体同种型试剂盒进行的上清液同种型测定，产生了单一 的小鼠同种型IgG1κ。该同种型测定是通过捕获EIA证实的。
如此产生了鼠杂交瘤和细胞系。CLBIL-6/8称作CLB8。按照下 文的描述进行嵌合化和进一步表征。
实施例2：嵌合和测序
cCLB8可变区基因的克隆和表达
从分泌人IL-6的特异性鼠单克隆抗体的鼠杂交瘤C143A分离基 因组DNA。
对于轻链，用限制性内切酶Hind III消化DNA，并且通过0.8％ 琼脂糖凝胶进行电泳。切除含有长度为大约3.4Kb的DNA片段的凝 胶部分，洗脱DNA。将片段连接至载体8charon27中，并且包装至噬 菌体颗粒中。对于重链，用限制性内切酶Eco RI消化DNA，并且通 过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳。切除含有长度为大约3.6Kb的DNA片 段的凝胶部分，洗脱DNA。将片段连接至载体8gt10中，并且包装至 噬菌体颗粒中。
将重链和轻链噬菌体文库铺于大肠杆菌上，生长过夜。将噬斑转 移到硝酸纤维素滤膜上，用32P标记的相当于鼠Jκ(轻链)或鼠JH 序列的DNA片段探测。鉴定阳性噬斑并且进行噬斑纯化。分离噬菌 体DNA，分离Hind III(轻链)或Eco RI(重链)插入片段并且克 隆至免疫球蛋白表达载体中。
用重链和轻链表达质粒共转染SP2/0细胞，并进行霉酚酸选择。 鉴定各个产生嵌合抗体的克隆，并且亚克隆以确保单克隆性并且产生 更高产者。
在Il-6依赖性B9细胞增殖测定中检测从各个细胞系纯化的抗体 的中和能力。在整个申请中将该抗体称作嵌合CLB8或cCLB8。
cCLB8重链可变区
E   V   Q   L   V   E   S   G   G   K   L   L   K   P   G   G   S   L   K   L
GAG GTG CAA CTG GTG GAA TCT GGA GGA AAA TTA CTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CT
S   C   A   A   S   G   F   T   F   S   S   F   A   M   S  W   F   R   Q   S
TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT GCC ATG TCT TGG TTT CGC CAG TC
                                                                 CDR 1
  P   E   K   R   L   E   W   V   A   E   I   S   S   G   G   S   Y   T   Y  Y
 CCA GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA GAA ATT AGT AGT GGT GGG AGT TAC ACC TAC TAT
      CDR 2
  P   D   T   V   T   G  R   F   T   I   S   R   D   N   A   K   N   T   L   Y
 CCT GAC ACT GTG ACG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC
  L   E   M   S   S   L   R   S   E   D   T   A   M   Y   Y   C   A   R   G   L
 CTG GAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TAT TGT GCA AGG GGT TTA
  W   G   Y   Y   A   L   D   Y  W   G   Q   G   T   S   V   T   V   S   S
 TGG GGG TAC TAT GCT CTT GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA
      CDR 3
cCLB8轻链可变区
 Q   I   V   L   I   Q   S   P   A   I   M   S   A   S   P   G   E   K   V   T
CAA ATT GTT CTC ATA CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC
 M   T   C   S   A   S   S   S   V   S   Y  M   Y   W   Y   Q   Q   K   P   G
ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA
                              CDR 1
 S   S   P   R   L   L   I   Y   D   T   S   N   L   A   S  G   V   P   V   R
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT
CGC
                                                         CDR 2
F   S   G   S   G   S   G   T   S   Y   S   L   T   I   S   R   M   E   A   E
TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAG
D   A   A   T   Y   Y   C   O   O   W   S   G   Y   P   Y   T  F   G   G   G
GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT GGT TAC CCA TAC ACG TTC GGA GGG GGG
                                                CDR 3
 T   K   L   E   I   K
ACC AAG CTG GAA ATA AAA
实施例3：通过固相EIA测量cCLB8与人IL-6的结合
用固相EIA评估cCLB8 Mab与人IL-6的结合特征。简言之， 用PBS中的1μg/mL重组人IL-6(RDI)包被平板。在含有0.02％(v/v) Tween 20的0.15M盐水中洗涤后，室温下用200μL/孔PBS中的1％ (w/v)BSA封闭孔1小时。37℃下从5μg/mL的起始浓度在2倍的系 列稀释液中温育纯化的抗体1小时。洗涤平板，然后用在1％BSA-PBS 中1∶20000稀释的50μL/孔HRP标记的山羊抗人IgG(Tago)探测。 再次洗涤平板，在室温下加入100μL/孔的柠檬酸-磷酸底物溶液 (0.1M柠檬酸和0.2M磷酸钠，0.01％H2O2和1mg/mL OPD)15分 钟。然后以25μL/孔加入终止溶液(4N硫酸)，采用自动化的平板光 度计在490nM下对吸光度进行定量。图1表示测量为OD 490nm的 cCLB8与IL-6的结合，证明cCLB8以浓度依赖性方式结合于重组人 IL-6。
实施例4：体外中和测定
通过cCLB8阻断IL-6抑制了IgM和MCP-1的分泌
以两种简单的生物测定形式评估嵌合的单克隆抗体cCLB8，以便 确定其对IL6诱导的人IgM和趋化因子MCP-1的分泌的中和性生物 活性。在这些研究中使用了两种人细胞系。SKW6.4细胞系最初来源 于EBV转化的Burkitt氏B细胞淋巴瘤并且反应于IL-6而分泌可溶 性IgM。U937细胞系是成单核细胞的，定型于单核细胞分化并且最 初是由患有弥散性组织细胞淋巴瘤的患者分离的。U937细胞反应于 IL6而分泌MCP-1。评价了cCLB8对这些特殊生物活性的抑制，因 为可以很容易采用EIA形式对它们进行监测。在测定前，使细胞脱离 血清过夜，然后在第二天单独、与IL-6一起，或与用各种浓度的抗 体或阴性对照抗体预先温育的IL6一起培养。在72小时的结束时间 时，收集温育上清液，并且用于IgM特异性和MCP-1特异性EIA。 结果如图2和3所示，证明cCLB8显著抑制IL6介导的IgM和MCP-1 的体外分泌。
在图2表示的实验中，在4℃下用10mM碳酸盐缓冲液，pH9.6 中的特异性山羊抗人IgM Fc5μ片段包被EIA板。采用含有0.02％v/v Tween 20的0.15M盐水洗涤平板，并且用PBS/1％ w/v BSA封闭1 小时。以系列2倍稀释液加入细胞培养上清液。在温育和随后用0.02％ Tween，0.15盐水洗涤后，用特异性的HRP标记的山羊抗人IgMμ链 探测平板。然后加入OPD底物，随后显色，在490nM下读出OD。 数据表明是cCLB8，而不是同种型匹配的阴性对照cK931，抑制IgM μ分泌。
在图3表示的实验中，在4℃下用10mM碳酸盐缓冲液，pH9.6 中的山羊抗人MCP-1包被EIA板。采用含有0.02％v/v Tween 20的 0.15M盐水洗涤平板，并且用PBS/1％w/v BSA封闭1小时。以系列 2倍稀释液加入细胞培养上清液。在2小时的温育和随后用0.02％ Tween，0.15盐水洗涤后，按照制造商的说明，用生物素化的抗人MCP-1 探测平板。再次洗涤平板，然后加入HRP标记的链亲和素1小时。 用TMB底物进行显色。在450nM下读出OD。数据表明是cCLB8， 而不是cK931，抑制IL-6介导的MCP-1产生。
IL-6介导的STAT3的磷酸化的中和
IL6受体由80kD的结合亚基、IL6Rα和信号转导亚基gp130组 成。IL6结合于IL6Rα亚基并且起始IL6Rα和gp130的缔合，导致 高亲和力受体和信号转导。IL6Rα也以可溶形式存在。IL6可以结合 于可溶的IL6R(sIL6R)，并且复合物可以作用于表达gp130的细胞。 也已经表明IL6激活STAT3。用人急性单核细胞白血病细胞系THP-1 证明了cCLB8抑制STAT3的磷酸化。用(IL6+sIL6R)+/-cCLB8或 作为阴性对照的无关抗体(K931)刺激细胞。用抗STAT3免疫沉淀 细胞裂解物，在7.5％SDS-PAGE上分辨样品，并且转移到Hybond- P膜，然后采用抗磷酸酪氨酸-HRP进行蛋白印迹。用ECLplus进 行检测。
图4示出的数据表明，在以下情况cCLB8可以抑制STAT3的磷 酸化：当a)在加入sIL6R前允许其与rhIL6结合，b)在加入rhIL6 前允许其与sIL6R结合，或c)在加入cCLB8和细胞前允许rhIL6与 sIL6R结合。在无血清的培养基中温育THP-1细胞16小时，从烧 瓶上刮下，并且重悬于0.5ml培养基。2-6道，IL6温育+/-抗体15 分钟，然后加入sIL6R并且温育15分钟。加入细胞，再温育15分钟。 第7道，用sIL6R温育IL615分钟，然后加入CLB-IL6，温育15 分钟。加入细胞，再温育15分钟。用抗STAT3[1μg/ml]免疫沉淀样 品，重悬于Laemmli样品缓冲液，在7.5％SDS-PAGE上分辨，并且 转移到Hybond-P。用抗磷酸酪氨酸-HRP温育膜。
cCLB8抑制血清淀粉样蛋白A
IL-1β是人IL-6存在下由HepG2人肝细胞瘤细胞产生血清淀粉 样蛋白A(SAA)的有效诱导物(Smith和McDonald，Clin Exp.Immunol. 90：293-9(1992))。因此，测定了cCLB8Mab抑制IL-1β/IL-6诱导的 这些细胞产生SAA的能力。简言之，将HepG2细胞以2.25×105/孔 接种24小时。预温育Il-6(100ng/ml，RDI)和IL-6sR(200ng/ml，S&D)30 分钟，并且与IL-1β(1ng/ml，R&D)混合。系列稀释cCLB8Mab和 阴性同种型对照Mab(cSF25)，然后用上述混合物再预温育30分钟。
对于图5所示的实验结果，用IL-6sR和IL-1β预温育cCLB8或 cSF25(同种型匹配的无关Mab)的系列稀释液，然后与HepG2细胞 一起培养24小时。然后通过ELISA分析细胞上清液的血清淀粉样蛋 白A产生水平。(人SAA ELISA试剂盒，Biosource，根据制造商的 说明进行)。误差柱表示重复样品的SEM。图5的数据表明cCLB8能 够以剂量依赖性方式抑制IL-1β/IL-6诱导的HepG2细胞的SAA产 生。
由vCLB Mab抑制IL-6诱导的细胞增殖
诱导鼠B骨髓瘤细胞系7TD1在IL-6存在下增殖。为了证明cCLB8 Mab中和IL-6活性的能力，37℃下将细胞在含有10％FBS和 0.5ng/mL重组人IL-6(R&D System)的IMDM中温育72小时，其中 含有cCLB8Mab或阴性对照Mab 17-1A的系列稀释液。通过荧光ATP 测定(ATPLite，Packard Bioscience)测量细胞增殖，它与细胞数直 接相关。
图6所示的数据证明IL-6显著刺激7TD1细胞的增殖，并且cCLB8 以浓度依赖性方式抑制该细胞增殖，EC50值为7.2ng/mL。误差柱表 示重复样品的SEM。*表示缺乏rIL-6的条件下细胞的增殖。
实施例5：表位作图
按照(Brakenhoff等，(1990)J.Immunology 145：561-568)中的描 述，采用结合于人IL-6突变蛋白的抗体表征了包括CLB8的一些中 和性抗IL-6Mabs的表位。制备了氨基和羧基末端缺失突变体，通过 抗体竞争实验分析IL-6的抗体组。在竞争研究的基础上，将中和性 Mabs分为2组(I和II)。在该方法中，包括在给定Mab的表位中的 残基是通过其不能识别抗原性蛋白的相应位点特异性单氨基酸取代变 体而描绘的。将CLB.IL-6/8作图于人IL-6分子上的位点I，它是由 紧密邻接于分子的羧基末端的氨基酸Gln29-Leu34组成的。其它研究 (Kalai，M等，Eur.J.Biochem.249，690-700(1997))表明，CLB.IL- 6/8识别对IL-6结合于IL-6R(gp80)来说是关键的氨基酸残基。这些 研究也表明，其表位包括IL-6分子的AB环的末端和D螺旋区。
实施例6：体内表征
将人骨髓瘤细胞(A375S2)接种至雌性裸鼠，并且在同一天开始 Mab治疗。以10mg/kg(2X/周)的剂量腹膜内注射抗体，将C57(抗 CMV)作为对照mAb。用cCLB8(抗人Il-6)和MP520F3(小鼠IL -6的单克隆抗体，R&D System)的联合产生了联合的阻断作用，与 对照抗体C57处理的动物相比，显著抑制了携带人骨髓瘤的动物的体 重减轻(图7)。抗体治疗不影响肿瘤生长或最终的肿瘤重量。这些结 果表明，IL6参与肿瘤诱导的动物体重减轻，并且IL-6的阻断可以延 缓该模型中的癌症恶病质。
图7.人和小鼠IL6的联合阻断(抗IL6mAbs cCLB8和MP520F3) 导致动物体重减轻的显著抑制。Y轴上的校正的动物体重减轻是研究 末(动物体重-肿瘤重量)减去研究开始时的动物体重。每个柱是来 自每组至少14只动物的平均值，误差柱表示标准差。双尾t检验分析 表明，IL-6组显著抑制体重减轻，p＝0.007。
实施例7：亲和力测量
从BIAcore2000、传感器芯片CM-5(芯片上为金表面，覆盖了 羧甲基化的右旋糖苷基质)、HBS(10mM HEPES，含有0.15M NaCl， 3.4mM EDTA和0.05％表面活性剂P20，pH7.4)、胺偶联剂(N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)、N-乙基-N’-(3-甲基氨基丙基)-碳二亚 胺(EDC)和1M乙醇胺HCl)获得自BIAcore，并且是根据制造商 的说明制备的。抗人Fc(Jackson AffiniPure山羊抗人IgG，Fc，目 录号109-005-098，批号48646)购自Jackson ImmunoResearch。
溶于5ml 0.15M氯化钠，0.01M磷酸钠，pH7.2的嵌合CLB8(批 号PD1F03)IgG单克隆抗体是由Centocor制造的。重组人IL-6(批 号A1197111)购自R&D Systems。
将抗人Fc(1.8mg/ml)在NaOAc缓冲液(10mM，pH4.8)中稀 释至50μg/ml的浓度，并且按照BIAcore系统手册中描述的制造商 的胺偶联化学偶联于CM-5传感器芯片的羧甲基化的右旋糖苷基 质。采用目标为1000RU的表面制备方法，首先用NHS/EDC，然后 加入抗人Fc活化传感器表面的羧基。通过注射1M的乙醇胺封闭剩 下的活化的基团。分别偶联每个流动的细胞。采用这些条件，制备4 个含有7554-9571共振单位(RU)的抗人Fc的流动细胞表面。在初 步实验中，确定了注射三次(15μl，30μl/min)100mM H3PO4/0.05 CHAPS将有效去除结合的免疫球蛋白并且保留固定化的抗人Fc的结 合能力。
在25℃下和30μL/min的流速下在BIAcore上进行两次实验。以 5μg/ml将cCLB溶解于HBS。将分析物IL-6以0.25，0.125，0.062，0.031 和0.015μg/ml的浓度溶解于HBS中。使指定量的抗体流过各自的流 动细胞，然后以30μL/min注射30μL的每一种IL-6浓度(缔合相)， 并且不间断地注射800秒地缓冲液流(解离相)。通过三次序贯注射 每次15μL 100mM的H3PO4/0.05CHAPS而再生芯片表面。注射HBS 作为参照(空白传感图)，用于扣除空白折射指数，以便进行分析。 在BIA分析3.0中采用1∶1模型，对于计算得到(kd/ka)的解离(Kd， [s-1])和缔合(Ka，[M-1s-1])以及缔合常数(KD，[M])进行局部拟合。
采用BIA评估版本3.0进行分析。通过将实验曲线拟合至来源于 相互作用机制的模型的速率方程，从传感图得到动力学常数。确定采 用具有的局部Rumax拟合，Ka，kd，KD的1∶1的结合模型进行的 总体分析(表1)。
表1：通过BIAcore进行的cCLB Mab的亲和力测量
  样品   ka(m-1s-1)(x106)   kd(s-1)(x10-5)  KD(M)(x10-11)   Chi2   cCLB8   1.1   6.2  5.7   0.111   cCLB8   0.37   5.2  14   0.236
实施例8：抗独特型抗体
cCLB8的有效测定系统(免疫组化和血清检测)的开发需要使用 抗独特型抗体。因此用cCLB8免疫Balb/c小鼠以产生cCLB8的抗独 特型抗体，该抗体可以用作血清检测和免疫组化测定的药代动力学探 针。
免疫
给予50μg IP和25μg SC的cCLB(Centocor，PD1F03)在12 周的时间段中免疫6-7周龄的5只Balb/c小鼠(Charles River实验 室)。每只小鼠接受IP和SC注射。在免疫方案中以2周的时间间隔 进行注射。用等体积的弗氏佐剂(Sigma)乳化腹膜内施用的注射物。 第一次腹膜内注射使用完全弗氏佐剂，总体积为200μl。随后的腹膜 内注射含有不完全弗氏佐剂。在PBS中稀释皮下施用的注射物，并且 以100μl/部位平分到两个注射部位。在第0、21、47和77天对小鼠 放血。通过眶后穿刺对麻醉的小鼠进行采血，收集血清，以便通过 cCLB8固相EIA进行滴度测定。免疫方案结束后三周，1号小鼠接受 稀释于125μl PBS中的100μg cCLB8的最后一次静脉内加强注射。 制备小鼠cCLB-8抗独特型单克隆抗体
采用cCLB8免疫的Balb/c小鼠脾进行一次融合，通过EIA鉴定 了cCLB8的7种特异性抗独特型抗体。发现这7种抗独特型抗体不 结合其它小鼠/人嵌合抗体，如C207A，C128A，C168J，C116J，C300A 和C301A。7种抗体中的6种是同种型IgG1κ，一种抗体是IgG2bκ。
表1概括了融合的结果。应该注意47天后在小鼠中获得了1∶800的最 大血清滴度，并且在免疫过程中保持恒定。
同种型分析
通过使用小鼠单克隆抗体同种型分析试剂盒(Life Technologies) 以蘸棒的形式完成了抗体的同种型测定。在室温下温育稀释缓冲液、 杂交瘤上清液和大鼠抗小鼠偶联物的混合物过夜，同时振荡含有预先 包被了各种捕获性鼠抗体同种型的棒的试管。从试管中取出棒，在 dH2O中轻柔洗涤，确定同种型。
表1.小鼠cCLB8抗独特型单克隆抗体的特性
  C代码   同种型   C433A   IgG1κ   C434A   IgG1κ   C435A   IgG1κ   C436A   IgG2bκ   C437A   IgG1κ   C438A   IgG1κ   C439A   IgG1κ
血清抑制测定
确定了合并的正常人血清(NHS)对7种抗独特型抗体结合cCLB8 的能力的影响。37℃下在0％，0.5％，5％，和50％(v/v)NHS存在下， 在从50μg/ml的终浓度开始的2倍系列稀释液中温育7种纯化的抗独 特型抗体。将混合物转移至cCLB8包被的板，在37℃下温育30分钟。 然后洗涤平板并且用山羊抗小鼠IgG Fc*HRP探测。0％和0.5％的NHS 不阻断任何抗独特型单克隆抗体结合cCLB8。5％的NHS部分抑制了 3种单克隆抗体(C433A，C435A和C437A)的结合。除C434A和C436A 外，所有的单克隆抗体都受浓度为50％的NHS的显著影响。(图8A- G)。
抗独特型单克隆抗体抑制cCLB8与HuIL-6的结合
测定7种抗独特型抗体抑制cCLB8与HuIL-6的结合的能力。以 前的EIA研究证明了cCLB8非常弱地与HuIL-6包被的平板结合。6 -25倍浓度过量的两种Mabs(C435A和C437A)表现出对cCLB8 与HuIL-6的结合的基本完全的抑制。C434A仅仅在25倍过量时表现 对cCLB8的抑制作用。在抑制cCLB8与HuIL-6的结合方面最佳的 两种抗体是C436A和C439A。这两种抗体能够在3-25倍的过量浓 度范围完全抑制cCLB8结合。C433A和C438A没有表现出抑制作用 (图9)。该测定证实初步研究中获得的结果。
抗独特型单克隆抗体与预结合于HuIL-6的cCLB8的结合
检测了7种抗独特型抗体结合已经与HuIL-6结合的cCLB8的能 力。37℃下在HuIL-6板上温育PBS中的10μg/ml的cCLB8。洗涤 平板，加入从10μg/ml开始的抗独特型单克隆抗体的3倍系列稀释液， 37℃下温育30分钟。洗涤平板，然后用山羊抗小鼠IgG Fc*HRP探 测。如初步研究，C436A和C438A是仅有的能够与预结合于HuIL-6 的cCLB8结合的抗体。图10说明了7种抗独特型抗体与预结合于 HuIL-6的cCLB8的结合能力。
总之，由鼠骨髓瘤细胞和来自于用嵌合抗人IL-6抗体(cCLB8) 免疫的Balb/c小鼠的脾细胞的融合物产生了7种单克隆抗独特型抗 体。这些抗独特型抗体中的5种(C434A，C435A，C436A，C437A，和 C439A)能够阻断cCLB8与HuIL-6的结合。两种抗体(C436A和 C438A)具有与预结合于HuIL-6的cCLB8结合的能力，两种抗体 (C434A和C436A)与cCLB8的结合基本不受任何检验的NHS浓度 的影响。这些cCLB8抗独特型抗体的宽范围的结合曲线使它们中的 一些成为用于血清检测和免疫组化测定中的药代动力学探针的潜在候 选物。
应该明确，本发明可以以前面的说明书和实施例中具体描述以外 的方式实施。
根据前面的教导，本发明的许多修饰和改变是可能的，因此，在 所附权利要求的范围内。

发明背景

序列表
<110>Centocor Inc.
     Giles-Komar，Jill
     Trikha，Mohit
     Peritt，David
     Knight，David M
<120>抗IL-6抗体、组合物、方法和用途
<130>CEN0270
<140>60/332743
<141>2001-11-14
<150>60/332743
<151>2001-11-14
<160>16
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>1
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1               5
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Gly
<210>3
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Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1             5               10
<210>4
<211>10
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<213>小鼠
<400>4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1               5                   10
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<210>7
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>7
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 Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
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 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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        115
<210>8
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<212>PRT
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