基于双氧水和PEG修饰的亲水铁碳复合纳米颗粒及其制备
方法
技术领域
背景技术
[0002] 磁共振成像(MRI)是一种收集
核磁共振现象产生的
信号，再重建图像的成像技术，它具有最高的软组织
分辨率，被广泛用于医学诊断和各种病理研究。在应用中常常需要造影剂改变周围环境中氢质子的弛豫时间，从而增强核磁共振成像的
对比度，以利于病灶组织与正常组织之间结构区分，进而提高诊断能
力。因此，开发核磁共振成像造影剂成为了医学界的热点问题。依据改变弛豫时间的不同可以分为两类：一类是钆螯合剂为代表的T1造影剂，特异性影响氢质子的纵向弛豫时间，使核磁共振成像信号正增强。另一类是以四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒为代表的T2造影剂，特异性影响氢质子的横向弛豫时间，使核磁共振成像信号负增强。
[0003] 与钆配位化合物相比，Fe3O4
纳米粒子的优点在于无毒以及磁学性质较强。然而，Fe3O4纳米颗粒直接用于造影剂具有以下缺点：①在水溶液中极易被氧化和发生团聚；②某些化学方法制备的Fe3O4纳米粒表面含有大量的
有机溶剂，不适合直接在
生物体内使用；③粒径较大、
水溶性差。因此，提高Fe3O4纳米粒的抗氧化性、
生物相容性及在水中的分散
稳定性，是其成功用作MRI造影剂的关键。
[0004] 碳元素是构成生命体的重要元素之一，碳材料具有良好的生物相容性和化学稳定性，如在纳米颗粒的外周紧密包覆而形成碳壳层，则可大幅提高纳米颗粒的化学稳定性，也有望降低潜在的生物毒性。由此产生的问题是碳包覆的纳米颗粒表面有很强的疏水性，不利于MRI成像应用。因此，需要后期修饰手段提高铁碳纳米颗粒的亲水性。
[0005] 聚乙二醇(PEG)是高亲水性
聚合物，它对纳米颗粒的修饰可以提高纳米颗粒的水溶性和生物相容性，并延长其在体内的血液循环时间(Peng et al.,Biomaterials 2012,33,1107-1119)。这是由于PEG本身具备大量亲水性的醚键，并且PEG的毛刷作用可以有效屏蔽体内蛋白与纳米颗粒作用。但是，由于铁碳纳米粒中碳壳的化学稳定性高，不易再外接修饰基团，从而限制了铁碳
纳米材料的应用。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服
现有技术中存在的问题，提供一种基于双氧水和PEG修饰的亲水铁碳复合纳米颗粒及其制备方法，制得的铁碳复合纳米颗粒化学稳定性高、不易团聚，且核磁共振响应信号强。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 包括以下步骤：
[0009] (1)将铁盐和碳源加入水中，采用水热反应合成Fe3O4@C颗粒；
[0010] (2)使用双氧水氧化处理Fe3O4@C颗粒；
[0011] (3)使用PEG接枝经双氧水氧化处理后的Fe3O4@C，接枝反应结束后，对反应液进行
透析、分离、洗涤和干燥，得到基于双氧水和PEG修饰的亲水铁碳复合纳米颗粒。
[0012] 进一步地，步骤(1)中，铁盐包括三氯化铁、
硝酸铁或
硫酸铁；碳源包括
葡萄糖、
蔗糖、果糖或
淀粉。
[0013] 进一步地，步骤(1)中，铁盐和碳源之间的摩尔比为0.1～1；每0.01mol的碳源加入0.04～0.4L的去离子水中。
[0014] 进一步地，步骤(1)中在水热反应之前，水中还加入有尿素，尿素和碳源之间的摩尔比例为5～50。
[0015] 进一步地，步骤(1)的水热反应是在180～300℃反应10～24h。
[0016] 进一步地，步骤(1)的水热反应结束后，冷却并收集沉淀，将沉淀洗涤干燥后得到Fe3O4@C颗粒。
[0017] 进一步地，步骤(2)中，双氧水氧化处理Fe3O4@C颗粒的具体步骤是：将Fe3O4@C颗粒和双氧水按
质量比为0.01～0.1混合，在20～100℃搅拌1～12h，分离后洗涤干燥，完成氧化处理；其中双氧水的质量分数为30％。
[0018] 进一步地，步骤(3)中，使用PEG接枝经双氧水氧化处理后的Fe3O4@C的具体步骤包括：先将双氧水氧化处理后的Fe3O4@C加入到含有1-乙基-(3-二甲基
氨基丙基)碳酰二亚胺
盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的超纯水中，在10～100℃搅拌均匀，得到
混合液A；再向混合液A中加入PEG，搅拌反应2～48h，完成接枝；其中，双氧水氧化处理后的Fe3O4@C、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、超纯水和PEG之间的比例为(0.1～1)g：(20～400)mg：(10～200)mg：(5～50)ml：(0.1～1)g。
[0019] 进一步地，步骤(3)中，PEG包括氨基PEG或羟基PEG，其分子量为100～10000。
[0020] 进一步地，该纳米颗粒是以纳米四氧化三铁颗粒为核心，纳米四氧化三铁颗粒上包裹碳壳层，碳壳层上连接PEG；碳壳包覆的纳米四氧化三铁的粒径在20～300nm之间，碳壳厚度在5～100nm之间。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0022] 本发明首先以水热法合成碳层包裹的Fe3O4纳米颗粒；再利用简单的双氧水氧化处理，使碳层暴露羧基基团，可有效提高Fe3O4@C纳米粒碳壳表面-COOH基团数量，为下一步PEG接枝提供更多的结合位点，增强修饰效果。使用PEG与碳层上羧基基团反应，通过化学键接枝修饰在Fe3O4@C表面，实现纳米颗粒的亲水改性。其中碳铁
核壳结构为MRI成像功能基团，聚乙二醇为亲水基团。本发明通过水热条件下自组装合成具有核壳结构的Fe3O4@C
磁性纳米粒，接着利用双氧水氧化和PEG接枝两种后期修饰手段，改变Fe3O4@C碳壳表面官能团种类和数目，成功将大量PEG修饰在碳壳上，从而获得具有高度亲水性和生物相容性的Fe3O4@C纳米颗粒。本发明方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低，经“双氧水+PEG”修饰后的Fe3O4@C纳米粒亲水性和生物相容性显著提高，可长时间在水中均匀稳定分散，具备增强的核磁共振成像性能，。检索国内外文献，尚没有发现基于"双氧水+PEG"修饰的高度亲水的Fe3O4@C纳米颗粒的制备方法，及其用于MRI造影剂研究的相关报道。
[0023] 本发明纳米颗粒具有以下优点：
[0024] (1)其结构是以纳米四氧化三铁颗粒为核心，外围包裹碳壳层，碳壳层上连接PEG，借助于碳的包裹，Fe3O4@C的稳定性和分散性要好于无包碳的Fe3O4纳米粒子，并且本发明制备的Fe3O4@C粒径分布较窄，碳层厚度均匀。
[0025] (2)本发明制备的亲水Fe3O4@C磁性纳米颗粒粒径较小、弛豫率高、造影效果显著，同时具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性，对生物体无不良影响，在核磁共振成像诊断领域有潜在的应用价值。
[0026] (3)本发明碳壳包覆的纳米四氧化三铁的整体粒径在20～300nm之间，碳壳厚度在5～100nm之间；经超声分散后静置1h仍均匀分散，无聚集沉淀；应用于T2及T2*的核磁共振成像模式，成像TR时间在50～200ms之间，成像TE时间在1000～3500ms之间。
附图说明
[0027] 图1是本发明Fe3O4@C纳米颗粒的结构图。
[0028] 图2是本发明Fe3O4@C的透射电镜图像。
[0029] 图3是Fe3O4@C(右)和商用Fe3O4纳米粒(左)的不同浓度的核磁共振T2成像结果。
[0030] 图4是Fe3O4@C的横向弛豫计算。
具体实施方式
[0031] 下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
[0032] 本发明是以碳水化合物为碳源合成具有核壳结构的磁性铁碳纳米粒，利用双氧水氧化和PEG接枝修饰两个步骤提高Fe3O4@C的亲水性，得到亲水核壳型Fe3O4@C纳米粒，用于核磁共振成像造影剂。其制备方法具体步骤如下：
[0033] (1)以水热法合成碳层包裹的Fe3O4纳米颗粒：将作为铁源的铁盐和作为碳源的碳水化合物按照摩尔比0.1～1溶解于去离子水中，并加入与碳源的摩尔比为5～50的尿素，完全溶解后将混合溶液转移入高压反应釜中，于180～300℃反应10～24h。其中，铁盐包括三氯化铁、硝酸铁或硫酸铁；碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖或淀粉，每0.01mol的碳源溶解于0.04～0.4L的去离子水中。
[0034] (2)冷却后将反应器内的溶液倒出，收集不溶物，
乙醇和水洗涤干燥，得到
纳米级Fe3O4@C颗粒。
[0035] (3)利用双氧水氧化处理Fe3O4@C，提高碳壳表面羧基基团数量。将Fe3O4@C和双氧水的按照质量比为0.01～0.1加入烧杯中，20～100℃机械搅拌，反应时间1～12h，离心分离，乙醇洗涤后干燥。
[0036] (4)利用PEG接枝经双氧水氧化后的Fe3O4@C，提高其亲水性。将0.1～1g双氧
水处理后的Fe3O4@C加入到含有20～400mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10～200mg N-羟基丁二酰亚胺的5～50ml超纯水中，10～100℃机械搅拌0.5～5h；再加入0.1～
1g PEG，继续搅拌反应2～48h。PEG的种类包括氨基PEG或羟基PEG；PEG分子量100～10000；
Fe3O4@C与PEG的质量比为0.1～1。使用透析袋透析反应液，离心分离，乙醇洗涤后干燥，最终获得高度亲水Fe3O4@C纳米颗粒。
[0037] 本发明提供了一种基于双氧水和PEG修饰的化学稳定性高、不易团聚，且核磁共振响应信号强的Fe3O4@C纳米粒及制备方法。该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低，具有良好的核磁共振成像能力。本发明的核磁共振成像造影剂由纳米四氧化三铁、碳和PEG组成，其结构如图1所示，是纳米四氧化三铁颗粒为核心，外围包裹碳壳层，碳壳层上连接PEG。
[0039] 一、亲水性Fe3O4@C的制备方法：
[0040] (1)Fe3O4@C的合成
[0041] 0.01mol葡萄糖，0.006mol三氯化铁，0.1mol尿素溶解在40ml水中，搅拌均匀后置于密封反应釜中。反应
温度180℃，反应20小时。冷却后过滤分离磁性纳米粒子Fe3O4@C，分别用去离子水和乙醇冲洗至滤液中性。100度干燥Fe3O4@C。
[0042] (2)Fe3O4@C的亲水性修饰
[0043] 利用双氧水处理Fe3O4@C，提高纳米粒子表面炭层上羧基数量，以增加用于PEG修饰位点。将300mg干燥的Fe3O4@C加入10g 30wt％的H2O2溶液中，于60℃下机械搅拌1h，转速1000rmp。将处理后的Fe3O4@C从溶液中离心分离，转速4000rpm持续5min，并用乙醇离心冲洗三次，
真空干燥。干燥后的Fe3O4@C进一步通过接枝氨基聚乙二醇(NH2-PEG)以提高其亲水性。将300mg双氧水处理后的Fe3O4@C加入到20ml超纯水中混入197mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和115mg N-羟基丁二酰亚胺，在50℃反应0.5h使羧基活化，再加入
300mg的NH2-PEG(分子量5000MW)，室温搅拌反应24h。使用截留分子量10000MW的透析袋透析，纯化纳米粒，最终获得高度亲水Fe3O4@C纳米颗粒。
[0044] 二、亲水性Fe3O4@C的性质表征：
[0045] (1)亲水性Fe3O4@C的形态及大小尺寸
[0046] 图2是亲水性Fe3O4@C的高分辨透射
电子显微镜照片，照片显示亲水性Fe3O4@C为核壳结构，Fe3O4球形壳外均匀包裹修饰PEG的碳层，粒径为100nm±10nm，碳壳厚度在5～15nm。
[0047] (2)亲水性Fe3O4@C的亲水性能评价
[0048] 将亲水性Fe3O4@C与商品化100nm Fe3O4纳米粒超声分散后静置1h后进行对比。结果显示，静止后亲水性Fe3O4@C在水相仍然均匀分散，无聚集沉淀，较商品化100nm Fe3O4纳米粒亲水性提升。而商品化100nm Fe3O4纳米粒基本完全沉淀，固液分离明显。
[0049] 三、亲水性Fe3O4@C的核磁共振成像性能评价：
[0050] 图3为Fe3O4@C浓度分别为100/50/25/12.5/6.25/3.125mg/L与同浓度商品化100nm四氧化三铁纳米粒对比的核磁共振成像结果对比，成像条件为T2成像条件(TR＝100ms,TE＝1500ms)。结果显示，未亲水性修饰的四氧化三铁纳米粒由于无法在水相中长时间稳定分散，因此T2成像能力弱，并且无法显示浓度依赖的信号改变；而亲水性Fe3O4@C由于可以长时间稳定分散在水相，因此具备优异的核磁共振成像能力，表现出明显的信号强度具有浓度依赖。图4显示，通过将弛豫时间倒数与铁元素浓度拟合，获得7T的横向弛豫率为122.8mM-1*-1s 。
[0051] 实施例2
[0052] (1)Fe3O4@C的合成
[0053] 0.01mol蔗糖，0.01mol三氯化铁，0.5mol尿素溶解在400ml水中，搅拌均匀后置于密封反应釜中。反应温度220℃，反应24小时。冷却后过滤分离磁性纳米粒子Fe3O4@C，分别用去离子水和乙醇冲洗至滤液中性。100℃干燥Fe3O4@C。
[0054] (2)Fe3O4@C的亲水性修饰
[0055] 利用双氧水处理Fe3O4@C，提高纳米粒子表面炭层上羧基数量，以增加用于PEG修饰位点。将300mg干燥的Fe3O4@C加入30g 30wt％的H2O2溶液中，于80℃下机械搅拌3h。将处理后的Fe3O4@C从溶液中离心分离，并用乙醇离心冲洗三次，真空干燥。干燥后的Fe3O4@C进一步通过接枝氨基聚乙二醇(NH2-PEG)以提高其亲水性。将100mg双氧水处理后的Fe3O4@C加入到30ml超纯水中混入300mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和200mg N-羟基丁二酰亚胺，在10℃反应0.5h使羧基活化，再加入1000mg的NH2-PEG(分子量10000MW)，室温搅拌反应2h。使用截留分子量10000MW的透析袋透析，纯化纳米粒，最终获得高度亲水Fe3O4@C纳米颗粒。所得纳米颗粒Fe3O4球形壳外均匀包裹修饰PEG的碳层，粒径为50～80nm，碳壳厚度在20～30nm；T2成像条件TR＝50ms，E＝1000ms。
[0056] 实施例3
[0057] (1)Fe3O4@C的合成
[0058] 0.01mol果糖，0.004mol硝酸铁，0.1mol尿素溶解在100ml水中，搅拌均匀后置于密封反应釜中。反应温度260℃，反应15小时。冷却后过滤分离磁性纳米粒子Fe3O4@C，分别用去离子水和乙醇冲洗至滤液中性。100℃干燥Fe3O4@C。
[0059] (2)Fe3O4@C的亲水性修饰
[0060] 利用双氧水处理Fe3O4@C，提高纳米粒子表面炭层上羧基数量，以增加用于PEG修饰位点。将300mg干燥的Fe3O4@C加入10g 30wt％的H2O2溶液中，于20℃下机械搅拌12h。将处理后的Fe3O4@C从溶液中离心分离，并用乙醇离心冲洗三次，真空干燥。干燥后的Fe3O4@C进一步通过接枝氨基聚乙二醇(NH2-PEG)以提高其亲水性。将500mg双氧水处理后的Fe3O4@C加入到5ml超纯水中混入20mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10mg N-羟基丁二酰亚胺，在80℃反应3h使羧基活化，再加入800mg的羟基PEG(分子量2000MW)，室温搅拌反应15h。使用截留分子量10000MW的透析袋透析，纯化纳米粒，最终获得高度亲水Fe3O4@C纳米颗粒。所得纳米颗粒Fe3O4球形壳外均匀包裹修饰PEG的碳层，粒径为120～140nm，碳壳厚度在50～60nm；T2成像条件TR＝120ms，E＝2000ms。
[0061] 实施例4
[0062] (1)Fe3O4@C的合成
[0063] 0.01mol淀粉，0.001mol硫酸铁，0.05mol尿素溶解在40ml水中，搅拌均匀后置于密封反应釜中。反应温度300℃，反应10小时。冷却后过滤分离磁性纳米粒子Fe3O4@C，分别用去离子水和乙醇冲洗至滤液中性。100℃干燥Fe3O4@C。
[0064] (2)Fe3O4@C的亲水性修饰
[0065] 利用双氧水处理Fe3O4@C，提高纳米粒子表面炭层上羧基数量，以增加用于PEG修饰位点。将300mg干燥的Fe3O4@C加入3g 30wt％的H2O2溶液中，于100℃下机械搅拌1.5h。将处理后的Fe3O4@C从溶液中离心分离，并用乙醇离心冲洗三次，真空干燥。干燥后的Fe3O4@C进一步通过接枝氨基聚乙二醇(NH2-PEG)以提高其亲水性。将1000mg双氧水处理后的Fe3O4@C加入到50ml超纯水中混入400mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和150mg N-羟基丁二酰亚胺，在100℃反应5h使羧基活化，再加入1000mg的羟基PEG(分子量100MW)，室温搅拌反应48h。使用截留分子量10000MW的透析袋透析，纯化纳米粒，最终获得高度亲水Fe3O4@C纳米颗粒。所得纳米颗粒Fe3O4球形壳外均匀包裹修饰PEG的碳层，粒径为190～300nm，碳壳厚度在80～100nm；T2成像条件TR＝200ms，E＝3500ms。
