抗间质-上皮细胞转化因子抗体及其用途
阅读：819发布：2021-03-07
专利汇可以提供抗间质-上皮细胞转化因子抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 间质-上皮细胞转化因子通过作为激动剂起作用的抗-间质-上皮细胞转化因子 抗体 诱导的细胞中的间质-上皮细胞转化因子活化来 预防 或 治疗 各种 疾病 的药剂学组合物。本发明涉及通过基于抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的间质-上皮细胞转化因子活化来预防或治疗各种疾病的方法。，下面是抗间质-上皮细胞转化因子抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种治疗方法，包括向有需要的受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物的步骤，其特征在于，上述多肽包含：
免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
2.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者处于缺血性障碍的风险或者患有缺血性障碍。
3.根据权利要求2所述的治疗方法，其特征在于，上述缺血性障碍选自由脑组织缺血、心脏组织缺血、肾组织缺血及肠组织缺血组成的组中。
4.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者处于中风的风险或者经历过中风。
5.根据权利要求4所述的治疗方法，其特征在于，上述中风为栓塞性中风或血栓性中风。
6.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者处于肾损伤或肾病的风险或者被诊断为肾损伤或肾病。
7.根据权利要求6所述的治疗方法，其特征在于，上述肾损伤或肾病为纤维化状态。
8.根据权利要求6所述的治疗方法，其特征在于，上述肾损伤或肾病选自由肾纤维化、慢性肾纤维化、与糖尿病相关的慢性肾病、狼疮、肾硬皮病、肾小球肾炎、局部段肾小球硬化、人慢性肾脏疾病相关的IgA肾病纤维化、慢性进行性肾病、肾小管间质纤维化、输尿管梗阻、慢性尿毒症、慢性间质性肾炎、放射性肾病、肾小球硬化症、进行性肾小球肾炎、内皮/血栓性微血管病、HIV相关肾病以及与暴露于毒素、刺激剂及化疗剂有关的纤维化组成的组中。
9.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者处于视网膜新生血管形成障碍的风险或者被诊断为视网膜新生血管形成障碍。
10.根据权利要求9所述的治疗方法，其特征在于，上述视网膜新生血管形成障碍是由选自由黄斑变性、组织胞浆菌病、病理性近视、血管样条纹症、前部缺血性视神经病变、细菌性心内膜炎、贝斯特病、视网膜脉络膜病变、脉络膜血管瘤、脉络膜痣、脉络膜无灌注、脉络膜骨瘤、脉络膜破裂、脉络膜缺损、慢性视网膜脱离、视网膜缺损、玻璃疣、内源性念珠菌眼内炎、视网膜色素上皮的乳头状错构瘤、黄斑眼底、特发性黄斑裂孔、恶性黑色素瘤、膜增生性肾小球肾炎、金属眼内异物、牵牛花盘综合症、多发性隐性白点综合征、锯齿状的新生血管形成、手术显微镜烧伤、视神经头坑、光凝固、内脉络膜病、风疹、肉状瘤病、匐行性或地图状脉络膜炎、视网膜下液排出、倾斜盘综合征、弓形虫视网膜脉络膜炎、结核病、伏格特-小柳-原田三氏综合征、糖尿病视网膜病、非糖尿病视网膜病、分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病变、虹膜新生血管、新生血管性青光眼、中心凹毛细血管扩张症、镰状红细胞性视网膜病变、视网膜静脉周围炎、视网膜血管炎、小脑视网膜血管瘤病、辐射性视网膜病变、视网膜冷冻损伤、色素性视网膜炎、视网膜脉络膜缺损、单纯疱疹性角膜炎引起的角膜新生血管化、角膜溃疡、角膜移植、翼状胬肉及创伤组成的组中的原因引起的。
11.根据权利要求9或10所述的治疗方法，其特征在于，上述视网膜新生血管形成障碍为脉络膜新生血管。
12.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者被诊断为神经障碍或神经疾病。
13.根据权利要求12所述的治疗方法，其特征在于，上述神经障碍或神经疾病选自由外伤性脑损伤、中风、脑动脉瘤、脊髓损伤、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏病、慢性脑皮质萎缩、路易体痴呆、匹克氏病、间皮皮质痴呆、丘脑变性、亨廷顿氏舞蹈病、皮质纹状体脊髓变性、皮层基底节变性、脑小脑变性、家族性痴呆伴痉挛性截瘫、多葡聚糖体病、夏-德综合征、橄榄桥小脑萎缩、进行性核上性麻痹、畸形性肌张力障碍、哈勒沃登-施帕茨病、麦杰氏综合征、家族性震颤、抽动秽语综合征、棘红细胞舞蹈病、弗里德赖希共济失调、家族性皮质小脑萎缩、吉斯特曼-施特劳斯综合征、进行性脊髓性肌萎缩、进行性巴尔巴麻痹、原发性侧索硬化、遗传性脊肌萎缩、痉挛性截瘫、腓骨肌萎缩、肥厚性间质性多神经病、多神经炎型遗传性共济失调、视神经病变、眼肌麻痹以及视网膜或视神经损伤组成的组中。
14.根据权利要求1所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者需要伤口愈合或需要进行伤口愈合。
15.根据权利要求14所述的治疗方法，其特征在于，上述伤口是由机械、化学、细菌或热量引起的伤口。
16.根据权利要求14或15所述的治疗方法，其特征在于，上述伤口选自由切口、裂伤、擦伤、刺伤、穿透伤及枪伤组成的组中。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述伤口为皮肤伤口。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述重链可变结构域包含序列1的序列，轻链可变结构域包含序列2的序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述多肽为抗体或其片段。
20.根据权利要求19所述的治疗方法，其特征在于，上述抗体或其片段为嵌合抗体或人源化抗体。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述多肽包含单链抗体。
22.根据权利要求21所述的治疗方法，其特征在于，上述单链抗体重链可变结构域包含序列1的序列，轻链可变结构域包含序列2的序列。
23.根据权利要求21或22所述的治疗方法，其特征在于，上述单链抗体包含序列3的序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述给药为静脉给药、玻璃体内给药、鞘内给药、肠胃外给药、皮下给药、经皮给药或注射给药。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的治疗方法，其特征在于，上述受试者不是癌症患者。
26.一种药剂学组合物，用于治疗缺血性障碍、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍、神经障碍或疾病、或者伤口，其特征在于，
上述药剂学组合物包含与间质-上皮细胞转化因子相结合的抗体或其片段及药剂学上可接受的载体作为有效成分，
上述抗体包含：
重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及
轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
27.根据权利要求26所述的药剂学组合物，其特征在于，上述重链可变结构域包含序列
1，轻链可变结构域包含序列2。
28.一种药剂学组合物，用于治疗缺血性障碍、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍、神经障碍或疾病、或者伤口，其特征在于，
上述药剂学组合物包含与间质-上皮细胞转化因子相结合的单链抗体及药剂学上可接受的载体，
上述单链抗体包含：
重链可变结构域，包含序列1；以及
轻链可变结构域，包含序列2。
29.根据权利要求28所述的药剂学组合物，其特征在于，上述单链抗体包含序列3的序列。
抗间质-上皮细胞转化因子抗体及其用途
技术领域
[0002] 本发明涉及使用与间质-上皮细胞转化因子蛋白质特异性结合的抗体的治疗方法，上述抗体的结合提高间质-上皮细胞转化因子的磷酸化和/或MDCK-2分散(scattering)活化等间质-上皮细胞转化因子活性。抗-间质-上皮细胞转化因子抗体可用于各种疾病以及疾病的预防及治疗。
背景技术
[0003] 在细胞表面上表达的间质-上皮细胞转化因子(c-Met，mesenchymal-epithelial transition factor)是由Met原癌基因(proto-oncogene)编码的受体酪氨酸激酶。在结构上，间质-上皮细胞转化因子是由细胞外α亚基(extracellular alpha subunit，50kDa)和跨膜β亚基(transmembrane beta subunit，140kDa)组成的二硫键结合的二聚体。间质-上皮细胞转化因子包括用于配体结合的细胞外结构域、跨膜部分及参与细胞内结构域内的酪氨酸残基的磷酸化的酪氨酸激酶催化基序(Dean et al.，Nature，4：318(6044)：385，1985；Park et al.，PNAS，84(18)：6379，1976；Maggiora et al.，J.Cell Physiol.，173:183，
1997)。
1997)。
[0004] 间质-上皮细胞转化因子当结合作为配体的肝细胞生长因子(HGF，hepatocyte growth factor)时，间质-上皮细胞转化因子的细胞质酪氨酸残基被二聚化并自身磷酸化(autophosphorylate)，然后与介导下位信号传导途径的各种蛋白质相互作用。间质-上皮细胞转化因子活化造成各种生物反应，上述生物反应诱导细胞生长、分散及运动性(motility)、侵袭(invasion)、从细胞凋亡的保护、分支形态形成(branching morphogenesis)及新生血管形成(angiogenesis)的增加。在病理条件下，间质-上皮细胞转化因子的不适当的活化可赋予癌细胞增殖、存活及侵袭/转移能力。考虑到受间质-上皮细胞转化因子活性影响的各种生物学和生理学功能，间质-上皮细胞转化因子蛋白质已成为多用途的治疗靶标。本发明提供一种间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白，通过与间质-上皮细胞转化因子蛋白质相结合并对其进行激活来使其在各种障碍或疾病中具有预防和/或治疗有效性。
发明内容
[0006] 以下说明和示出的发明的实施方式及实施例为示例性的，并不限定本发明的范围。
[0007] 本发明的一实施方式为一种治疗方法，其包括向受试者(subjects)给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物的步骤，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0008] 本发明的一实施方式涉及一种治疗方法，包括向有需要的受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物的步骤，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0009] 本发明的一实施方式涉及通过向受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物来治疗处于中风的风险或者经历过中风的受试者的方法，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0010] 本发明的一实施方式涉及通过向受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物来治疗处于肾损伤或肾病的风险或者被诊断为肾损伤或肾病的受试者的方法，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0012] 根据本发明的一实例，上述肾损伤或肾病可选自由肾纤维化(renal fibrosis)、慢性肾纤维化(chronic kidney fibrosis)、与糖尿病相关的慢性肾病(chronic nephropathy associated with diabetes)、狼疮(lupus)、肾硬皮病(scleroderma of the kidney)、肾小球肾炎(glomerular nephritis)、局部段肾小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis)、人慢性肾脏疾病相关的IgA肾病纤维化(IgA nephropathyrenal fibrosis associated with human chronic kidney disease，CKD)、慢性进行性肾病(chronic progressive nephropathy，CPN)、肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis)、输尿管梗阻(ureteral obstruction)、慢性尿毒症(chronic uremia)、慢性间质性肾炎(chronic interstitial nephritis)、放射性肾病(radiation nephropathy)、肾小球硬化症(glomerulosclerosis)、进行性肾小球肾炎(progressive
glomerulonephrosis，PGN)、内皮/血栓性微血管病(endothelial/thrombotic
microangiopathy injury)、HIV相关肾病(HIV-associated nephropathy)以及与暴露于毒素、刺激剂(irritant)及化疗剂有关的纤维化组成的组中。
glomerulonephrosis，PGN)、内皮/血栓性微血管病(endothelial/thrombotic
microangiopathy injury)、HIV相关肾病(HIV-associated nephropathy)以及与暴露于毒素、刺激剂(irritant)及化疗剂有关的纤维化组成的组中。
[0013] 本发明的实施例方式涉及一种伤口愈合(wound healing)增强方法，其包括向有需要的受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物的步骤，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0014] 根据本发明的一实例，上述伤口是由机械、化学、细菌或热量引起的伤口。
[0015] 根据本发明的一实例，上述伤口选自由切口(incision)、裂伤(laceration)、擦伤(abrasion)、刺伤(puncture wound)、穿透伤(penetration wound)及枪伤(gunshot wound)组成的组中。
[0016] 根据本发明的一实例，上述伤口为皮肤伤口。
[0017] 本发明的一实施方式涉及通过向受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物来治疗处于视网膜新生血管形成障碍(retinal neovascularization disorder)的风险或者被诊断为视网膜新生血管形成障碍的受试者的方法，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0018] 根据本发明的一实例，上述视网膜新生血管形成障碍可以是由黄斑变性(macular degeneration)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、病理性近视(pathological myopia)、血管样条纹症(angioid streaks)、前部缺血性视神经病变(anterior ischemic optic neuropathy)、细菌性心内膜炎(bacterial endocarditis)、贝斯特病(Best's disease)、视网膜脉络膜病变(birdshot retinochoroidopathy)、脉络膜血管瘤(choroidal hemangioma)、脉络膜痣(choroidal nevi)、脉络膜无灌注(choroidal nonperfusion)、脉络膜骨瘤(choroidal osteomas)、脉络膜破裂(choroidal rupture)、脉络膜缺损(choroideremia)、慢性视网膜脱离(chronic retinal detachment)、视网膜缺损(coloboma of the retina)、玻璃疣(Drusen)、内源性念珠菌眼内炎(endogenous Candida endophthalmitis)、视网膜色素上皮的乳头状错构瘤(extrapapillary hamartomas of the retinal pigmented epithelium)、黄斑眼底(fundus flavimaculatus)、特发性黄斑裂孔(idiopathic，macular hole)、恶性黑色素瘤(malignant melanoma)、膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis，type II)、金属眼内异物(metallic intraocular foreign body)、牵牛花盘综合症(morning glory disc syndrome)、多发性隐性白点综合征(multiple evanescent white-dot syndrome，MEWDS)、锯齿状的新生血管形成(neovascularization at ora serrata)、手术显微镜烧伤(operating microscope burn)、视神经头坑(optic nerve head pits)、光凝固(photocoagulation)、内脉络膜病(punctuate inner choroidopathy)、风疹(rubella)、肉状瘤病(sarcoidosis)、匐行性或地图状脉络膜炎(serpiginous or geographic choroiditis)、视网膜下液排出(subretinal fluid drainage)、倾斜盘综合征(tilted disc syndrome)、弓形虫视网膜脉络膜炎(Taxoplasma retinochoroiditis)、结核病(tuberculosis)、伏格特-小柳-原田三氏综合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)、糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)、非糖尿病视网膜病(non-diabetic retinopathy)、分支静脉阻塞(branch vein
occlusion)、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion)、早产儿视网膜病变(retinopathy in premature infants)、虹膜新生血管(rubeosis iridis)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、中心凹毛细血管扩张症(perifoveal telangiectasis)、镰状红细胞性视网膜病变(sickle cell retinopathy)、视网膜静脉周围炎(Eale's disease)、视网膜血管炎(retinal vasculitis)、小脑视网膜血管瘤病(Von Hippel Linau disease)、辐射性视网膜病变(radiation retinopathy)、视网膜冷冻损伤(retinal cryoinjury)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、视网膜脉络膜缺损
(retinochoroidal coloboma)、单纯疱疹性角膜炎引起的角膜新生血管化(corneal neovascularization due to herpes simplex keratitis)、角膜溃疡(corneal ulcers)、角膜移植(keratoplasty)、翼状胬肉(pterigyia)及创伤(trauma)组成的组中的原因引起的。
occlusion)、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion)、早产儿视网膜病变(retinopathy in premature infants)、虹膜新生血管(rubeosis iridis)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、中心凹毛细血管扩张症(perifoveal telangiectasis)、镰状红细胞性视网膜病变(sickle cell retinopathy)、视网膜静脉周围炎(Eale's disease)、视网膜血管炎(retinal vasculitis)、小脑视网膜血管瘤病(Von Hippel Linau disease)、辐射性视网膜病变(radiation retinopathy)、视网膜冷冻损伤(retinal cryoinjury)、色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)、视网膜脉络膜缺损
(retinochoroidal coloboma)、单纯疱疹性角膜炎引起的角膜新生血管化(corneal neovascularization due to herpes simplex keratitis)、角膜溃疡(corneal ulcers)、角膜移植(keratoplasty)、翼状胬肉(pterigyia)及创伤(trauma)组成的组中的原因引起的。
[0019] 根据本发明的一实例，上述视网膜新生血管形成障碍(retinal neovascularization disorder)为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization)。
[0020] 本发明的一实施方式涉及一种治疗方法，其包括向被诊断为神经障碍(neurological disorder)或神经疾病(neurological disease)的受试者给药治疗有效量的多肽或包含上述多肽的药剂学组合物的步骤，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0021] 根据本发明的一实例，上述神经障碍或神经疾病可选自由外伤性脑损伤(traumatic brain injury)、中风(stroke)、脑动脉瘤(cerebral aneurism)、脊髓损伤(spinal cord injury)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、慢性脑皮质萎缩(diffuse cerebral cortical atrophy)、路易体痴呆(Lewy-body dementia)、匹克氏病(Pick disease)、间皮皮质痴呆(mesolimbocortical dementia)、丘脑变性(thalamic degeneration)、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington chorea)、皮质纹状体脊髓变性(cortical-striatal-spinal degeneration)、皮层基底节变性(cortical-basal ganglionic degeneration)、脑小脑变性(cerebrocerebellar degeneration)、家族性痴呆伴痉挛性截瘫(familial dementia with spastic paraparesis)、多葡聚糖体病(polyglucosan body disease)、夏-德综合征(Shy-Drager syndrome)、橄榄桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、畸形性肌张力障碍(dystonia musculorum deformans)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz
disease)、麦杰氏综合征(Meige syndrome)、家族性震颤(familial tremors)、抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette syndrome)、棘红细胞舞蹈病(acanthocytic chorea)、弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia)、家族性皮质小脑萎缩(Holmes familial cortical cerebellar atrophy)、吉斯特曼-施特劳斯综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、进行性脊髓性肌萎缩(progressive spinal muscular atrophy)、进行性巴尔巴麻痹(progressive balbar palsy)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)、遗传性脊肌萎缩(hereditary muscular atrophy)、痉挛性截瘫(spastic paraplegia)、腓骨肌萎缩(peroneal muscular atrophy)、肥厚性间质性多神经病(hypertrophic
interstitial polyneuropathy)、多神经炎型遗传性共济失调(heredopathia atactica polyneuritiformis)、视神经病变(optic neuropathy)、眼肌麻痹(ophthalmoplegia)及视网膜或视神经损伤(retina or optic nerve damage)组成的组中。
disease)、麦杰氏综合征(Meige syndrome)、家族性震颤(familial tremors)、抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette syndrome)、棘红细胞舞蹈病(acanthocytic chorea)、弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia)、家族性皮质小脑萎缩(Holmes familial cortical cerebellar atrophy)、吉斯特曼-施特劳斯综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、进行性脊髓性肌萎缩(progressive spinal muscular atrophy)、进行性巴尔巴麻痹(progressive balbar palsy)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)、遗传性脊肌萎缩(hereditary muscular atrophy)、痉挛性截瘫(spastic paraplegia)、腓骨肌萎缩(peroneal muscular atrophy)、肥厚性间质性多神经病(hypertrophic
interstitial polyneuropathy)、多神经炎型遗传性共济失调(heredopathia atactica polyneuritiformis)、视神经病变(optic neuropathy)、眼肌麻痹(ophthalmoplegia)及视网膜或视神经损伤(retina or optic nerve damage)组成的组中。
[0022] 本发明的一实施方式涉及向受试者给药多肽的方法，上述多肽包含：免疫球蛋白重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及免疫球蛋白轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0023] 根据本发明的一实例，上述给药为通过静脉(intravenous)给药、玻璃体内(intravitreal)给药、鞘内(intrathecal)给药、肠胃外(parenteral)给药、皮下(subcutaneous)给药、经皮(transdermal)给药或注入(infusion)的给药。
[0024] 根据本发明的一实例，上述受试者不是癌症患者。根据本发明的另一实例，上述受试者不是被诊断患有癌症的人。
[0025] 根据本发明的一实例，上述多肽为抗体或其片段(fragment)。
[0026] 根据本发明的一实例，上述重链可变结构域包含序列1，上述轻链可变结构域包含序列2。
[0027] 根据本发明的一实例，上述抗体或其片段为人(human)、嵌合(chimeric)或人源化(humanized)抗体或其片段。
[0028] 根据本发明的一实例，上述多肽包含单链抗体(scFv)。根据本发明的再一实例，上述单链抗体重链可变结构域包含序列1的序列，上述轻链可变结构域包含序列2的序列。根据本发明的另一实例，上述单链抗体包含序列3的序列。
[0029] 本发明的一实施方式涉及一种药剂学组合物，用于治疗缺血性疾病、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍(retinal neovascularization disorder)、神经障碍或疾病、或者伤口，上述组合物包含与间质-上皮细胞转化因子相结合的抗体或其片段及药剂学上可接受的载体作为有效成分，上述抗体包含：重链可变结构域，序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及轻链可变结构域，序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0030] 根据本发明的一实例，上述重链可变结构域包含序列1，轻链可变结构域包含序列2。
[0031] 本发明的一实施方式涉及一种药剂学组合物，用于治疗缺血性障碍、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍、神经障碍或疾病、或者伤口，上述组合物包含与间质-上皮细胞转化因子相结合的单链抗体及药剂学上可接受的载体，上述单链抗体包含：重链可变结构域，包含序列1；以及轻链可变结构域，包含序列2。
[0032] 根据本发明的一实例，上述单链抗体包含序列3的序列。
[0033] 本发明的方法及组合物等额外的实施方式将通过以下说明、附图、实施例及发明要求保护范围变得明确。从前述的说明及后述的说明可知，本说明书中所说明的各自的所有特征及两个以上的特征的所有组合包括在本发明的范围内。并且，任何特征或其特征的组合可以从本发明的任何实施例中排除。参照所附实施例及附图，在以下说明及发明要求保护范围中对本发明的额外的实施方式及优点进行说明。
附图说明
[0034] 图1a～1b示出激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的伤口愈合促进效果。图1a为在小鼠引起伤口后第10天的表皮病变的照片。图1b为示出处理激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的小鼠中的14天的伤口缝合的速度的曲线图。
[0035] 图2a～2b示出激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体在由阿霉素(adriamycin，ADR)-诱导的肾病模型中的保护效果。图2a为示出给药激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的肾损伤的大鼠中的血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)浓度的变化的曲线图，图2b为示出给药激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的肾损伤的大鼠中的血肌酸酐(Crea)水平的变化的曲线图。Naive是指没有给药阿霉素和抗体的动物。磷酸盐缓冲液(PBS)是指处理阿霉素后给药磷酸盐缓冲食盐水(未给药抗体)的动物。
[0036] 图3a及图3b示出给药激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的大鼠中的肾损伤程度的组织切片的图像(图3a)及与此对应的曲线图(图3b)。
[0037] 图4a～4b示出抗-间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体在由单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)诱导的大鼠肾病模型中的肾保护效果。图4a示出由单侧输尿管梗阻诱导的受损肾组织的马松(Masson)3色-染色切片的代表性图像。图4b为示出在图4a的图像中测定的纤维化分数的曲线图。
[0038] 图5为示出在缺血性中风大鼠模型中利用激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体治疗时的梗塞大小的变化。
[0039] 图6为示出当利用激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体治疗由激光诱导的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的兔模型时，显示脉络膜新生血管的荧光的测定值的曲线图。
[0040] 图7a及图7b示出在细胞迁移分析(Transwell assay)中通过激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体对雪旺细胞(Schwann cells，iSc)的迁移促进效果。图7a示出被染色的细胞的图像。图7b为图7a图像的定量表示。
[0041] 图8a～8d示出激动剂抗-间质-上皮细胞转化因子抗体对B6SJL-Tg(SOD1-G93A)小鼠的运动功能和存活的效果。结果表示为转棒(Rotarod)(图8a)、握力强度(图8b)、体重(图8c)及存活率(图8d)的每周评价(weekly assessment)。
[0042] 序列1为1E4重链可变结构域的氨基酸序列。
[0043] 序列2为1E4轻链可变结构域的氨基酸序列。
[0044] 序列3为1E4单链抗体构建体(construct)的氨基酸序列。
[0045] 序列4为1E4单链抗体构建体内的连接肽结构域氨基酸序列。
[0046] 序列5为1E4重链可变结构域CDR1的氨基酸序列。
[0047] 序列6为1E4重链可变结构域CDR2的氨基酸序列。
[0048] 序列7为1E4重链可变结构域CDR3的氨基酸序列。
[0049] 序列8为1E4轻链可变结构域CDR1的氨基酸序列。
[0050] 序列9为1E4轻链可变结构域CDR2的氨基酸序列。
[0051] 序列10为1E4轻链可变结构域CDR3的氨基酸序列。
[0052] 序列11为1E4重链可变结构域的核酸序列。
[0053] 序列12为1E4轻链可变结构域的核酸序列。
[0054] 序列13为由GenBank Acc.No.NP_000236表示的人间质-上皮细胞转化因子蛋白质同种型b的氨基酸序列。
[0055] 序列14为由GenBank Acc.No.NP_001120972表示的人间质-上皮细胞转化因子蛋白质同种型a的氨基酸序列。
[0056] 序列15为由GenBank Acc.No.NP_032617表示的小鼠间质-上皮细胞转化因子蛋白质的氨基酸序列。
具体实施方式
[0057] 在下文中，对本发明的各种实施方式进行详细说明。然而，这种实施方式能够以许多不同的形式体现，并且不应被解释为限定于以下说明的实施例。以下实施例旨在向本领域普通技术人员传达本发明的范围，以便完整地实施本发明。
[0058] I.定义(DEFINITIONS)
[0059] 除非上下文另有明确说明，本说明书中所使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”及“该(the)”包括复数(plural)对象。因此，例如，对“聚合物”的提及不仅包括一种以上的聚合物而且还包括两种以上相同或不同的聚合物，“赋形剂(excipient)”不仅包括一种以上的赋形剂而且还包括两种以上的相同或不同的赋形剂。
[0060] 在提供值(value)的范围的情况下，还包括其范围的上限和下限之间的每个值(intervening value)以及提及的范围内的任意的其他明确表示的值或之间的值。例如，当提及1μm至8μm的范围时，明确地包括2μm、3μm、4μm、5μm、6μm及7μm，还包括1μm以上及8μm以下的值的范围。
[0061] 本说明书中的术语“间质-上皮细胞转化因子”是指MET原癌基因(proto-oncogene)，即，在本领域中作为肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor，HGFR)已知的受体酪氨酸激酶蛋白质产物。例如，间质-上皮细胞转化因子包括结合1E4多肽的、以基因库(GenBank)保藏编号NP_00236(人间质-上皮细胞转化因子同种型b，序列13)、NP_001120972(人间质-上皮细胞转化因子同种型a，序列14)及NP_032617(小鼠，序列15)记载的蛋白质产物及它们的变异体，但不限定于此。
[0062] 本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及具有抗原-结合活性的抗体片段，但包括不限定于此的各种抗体结构。
[0063] “人抗体(human antibody)”拥有人或者由人细胞产生的抗体或与来源于人抗体库(repertoires)或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列。人抗体的这种定义排除了包含非人抗原结合残基的人源化(humanized)抗体。
[0064] 术语“嵌合”(chimeric)”抗体是指重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源(source)或物种(species)，并且重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
[0065] 术语“全长抗体(full length antibody)”、“完整抗体(intact antibody)”及“全抗体(whole antibody)”可互换使用，上述抗体是指具有与天然(native)抗体结构实质上类似的结构的抗体或者具有包含Fc区域的重链的抗体。
[0066] 抗体的“种类(class)”是指重链具有的恒定结构域(constant domain)或恒定区域的类型。包括IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的5种主要种类，其中一些可细分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2等。与其他种类的免疫球蛋白相应的重链恒定结构域分别被命名为α、δ、ε、γ及μ。
[0067] “抗体片段(antibody fragment)”是指与完整(intact)抗体结合的抗原相结合的、包含未受损的抗体的部分的、除了完整(intact)抗体之外的分子。抗体片段的例子包括Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体(diabodies)；线性(linear)抗体；单链抗体分子(例如，单链抗体)；以及由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体，但不限定于此。当利用木瓜蛋白酶(papain)处理抗体时，产生分别具有一个抗原-结合部位的被称为“Fab”片段的两个相同的抗原-结合片段及剩余的“Fc”片段，Fc的名称反映了其易于结晶的能力。当利用胃蛋白酶(Pepsin)处理时，产生具有两个抗原-结合部位且仍然可交联结合抗原的F(ab')2片段。
[0068] “Fab”片段包含重链及轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域及重链的第一恒定结构域(first constant domain，CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在包含来自抗体铰链(hinge)部位的一个以上半胱氨酸的重链CH1结构域的羧基末端添加一些残基。Fab'-SH是指恒定结构域的半胱氨酸残基(多个)具有游离(free)巯基的Fab'。F(ab')2抗体片段由一对最初在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0069] “框架(Framework)”或“FR”表示超可变区域(hypervariable region，HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常有4个FR结构域FR1、FR2、FR3及FR4组成。因此，HVR及FR序列通常在VH(或VL)中以下列顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0070] “Fv”为包含完整抗原-结合部位的最小抗体片段。在本发明的一实例中，双链(two-chain)Fv物种(species)由牢固且非共价结合的一个重链及轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(single-chain Fv，单链抗体)物种中，一个重链及轻链可变结构域可通过柔性(flexible)肽连接肽共价结合，使得轻链及重链能够以“二聚体(dimeric)”结构相结合。其与双链Fv物种类似。在这种结构中，为了表示VHV-VL二聚体表面上的抗原结合部位，各可变结构域的3个HVR相互作用。总共6个HVR赋予抗体抗原-结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含3个对抗原特异的HVR的Fv的一半)表示低于整个结合位点的亲和度，也可识别并结合抗原。
[0071] 术语“可变区域(variable region)”或“可变结构域(variable domain)”是指将抗体与抗原相结合相关的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链及轻链的可变结构域(分别为VH及VL)通常具有类似的结构，各结构域包含4个保守的框架区域(framework regions，FR)及3个超可变区域(hypervariable regions，HVR)。(Kindt et al.，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原-结合特异性。并且，可从与抗原相结合并分别筛选互补VL或VH结构域的文库的抗体，通过使用VH或VL结构域来分离与特定抗原相结合的抗体。例如，(Portolano et al.，[0072] J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson et al.，Nature 352：624-628(1991))。
[0073] 术语“特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段或如单链抗体的其他结构物在生理条件下与相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合可被表征为至少约1×10-6M以下的平衡解离常数(例如，更小的KD可表示更硬的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。然而，与人间质-上皮细胞转化因子特异性结合的分离的抗体可表示与其他抗原的交叉反应性，例如其他物种(species)的间质-上皮细胞转化因子分子。
[0074] “亲和度(Affinity)”是指分子(例如，抗体)的单个结合部位和其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文中所使用，“结合亲和力(binding affinity)”是指反映结合对(例如，抗体及抗原)的成员之间的1：1相互作用的内在(intrinsic)结合亲和力。分子Y及其配偶体Y的亲和度通常可以通过解离常数(Kd)表示。亲和度可通过本领域已知的常规方法测定，包括本文所述的方法。用于测定结合亲和度的具体示例及示例性实施方式描述如下。
[0075] 如药学剂型的药物的“有效量”或“治疗有效量”是指在实现所需治疗或预防结果所需期间内给药的有效量。
[0076] 如本文所用，术语“治疗”用于表示预防疾病或障碍及治疗预先存在的(pre-existing)或诊断的状态。
[0077] II.利用激动剂间质-上皮细胞转化因子抗体的治疗方法
[0078] A.作为治疗靶标的间质-上皮细胞转化因子
[0079] 间质-上皮细胞转化因子受体蛋白质，也称为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)受体，在许多器官的上皮细胞表面表达，包括肝脏、胰腺、前列腺、肾脏、肌肉和骨髓。与间质-上皮细胞转化因子有关的配体为肝细胞生长因子。肝细胞生长因子作为在身体的各种组织中促进细胞增殖、存活、运动、散射(scattering)、分化及形态形成(morphogenesis)的多效因子(pleiotropic factor)及细胞因子起作用。并且，肝细胞生长因子似乎在多种疾病如肝硬化、肺纤维化及进行性肾病中起保护作用。当肝细胞生长因子与间质-上皮细胞转化因子的细胞外结构域结合时，间质-上皮细胞转化因子的细胞质结构域中的多个酪氨酸残基被磷酸化。Y1234及Y1235的磷酸化激活间质-上皮细胞转化因子酪氨酸激酶活性及随后出现的Y1349及Y1356残基的磷酸化(Matsumoto et al.，2014，Biomedicines，2：275-300)。磷酸化的酪氨酸残基聚集各种细胞内信号分子来显示生物活性，例如促进细胞分裂及迁移、抑制细胞凋亡及诱导上皮细胞的形态形成。肝细胞生长因子-间质-上皮细胞转化因子相互作用发生在各种生物系统，例如肝脏、肾脏、皮肤、胰腺、肺、神经系统、心脏、免疫系统，但并不限定于此。
[0080] 本发明提供一种治疗组合物及治疗方法，上述治疗有组合物用于向有需要的受试者(subject)给药与间质-上皮细胞转化因子蛋白质特异性结合并以类似于通过与肝细胞生长因子结合活化的方式激活间质-上皮细胞转化因子的多肽。下面，提供本文公开的间质-上皮细胞转化因子活化多肽在预防或治疗表示疾病状态的各种症状方面具有治疗效果的数据。
[0081] B.间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体
[0082] 与间质-上皮细胞转化因子蛋白质结合的免疫球蛋白记载于PCT申请第PCT/KR2015/007899号(其内容通过引用整个参考文献并入本文)。简而言之，通过使用用于生物淘选(biopanning)的完全人源化(fully humanized)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库(phage display library)来选择与人间质-上皮细胞转化因子结合的单链抗体物种。在本文中称为“1E4”单链抗体的单链抗体已显示以高亲和度与间质-上皮细胞转化因子结合，并且具有本文的序列3所示的氨基酸序列。如在下文中更详细地描述，1E4单链抗体或其变异体可用于治疗有此需要的受试者。
[0083] 并且，在第PCT/KR2015/007899号中记载了具有1E4单链抗体的重链可变结构域(序列1)及轻链可变结构域(序列2)并包含人IgG轻链恒定结构域及人IgG重链恒定结构域的全长(full-length)免疫球蛋白的制备方法。重链可变结构域包含CDR1(序列5)、CDR2(序列6)及CDR3(序列7)。轻链可变结构域包含CDR1(序列8)、CDR2(序列9)及CDR3(序列10)。
[0084] 对于本领域普通技术人员显而易见的是，免疫球蛋白的抗原结合特异性主要由CDR序列决定。因此，在一些实例中，本文公开的方法包括利用如下的抗体的治疗，即，上述抗体包含：重链可变结构域，包含序列5、序列6及序列7的CDR；轻链可变结构域，包含序列8、序列9及序列10的CDR。在另一个实例中，抗体包含含有序列1的IgG重链及含有序列2的IgG轻链。在表1中示出上述1E4构建体的氨基酸序列。
[0085] 表1
[0086]
[0087] 1E4抗体已显示在MDCK-2(Madin-Darby Canine Kidney epithelial Cells-2)中选择性诱导分散及间质-上皮细胞转化因子磷酸化(第PCT/KR2015/007899号)，因此用于本文所述的治疗方法的1E4抗体任选地被称为激动剂(agonist)抗体。
[0088] 并且，1E4抗体与人间质-上皮细胞转化因子及小鼠间质-上皮细胞转化因子均结合。具体地，对人间质-上皮细胞转化因子及小鼠间质-上皮细胞转化因子进行了1E4-IgG抗体的生物大分子相互作用分析系统(BIAcore)分析(第PCT/KR2015/007899号)。结合结果如下表2所示。
[0089] 表2
[0090]
[0091] 因此，在一些实例中，提供一种治疗方法，其包括向受试者给药以约3×10-10M以下的KD与人间质-上皮细胞转化因子蛋白质结合的抗体或以约7×10-10M以下的KD与小鼠间质-上皮细胞转化因子蛋白质结合的抗体的步骤。上述抗体为间质-上皮细胞转化因子功能的激动剂(作用剂)。
[0092] 除非另外特别说明，本说明书中的术语“抗体”不仅包含两个免疫球蛋白重链及两个免疫球蛋白轻链(即，“完整抗体分子”)而且包含含有抗原-结合片段的抗体分子(例如，术语“抗体”应理解为包含含有重链可变结构域及轻链可变结构域的多肽)。因此，本文所用的术语“抗体”可包含单链抗体结构物或其他免疫球蛋白蛋白质。抗体的“抗原-结合部位”、抗体的“抗原-结合片段”等术语包含通过与抗原结合来形成复合物的、可通过天然产生、酶处理获得的、合成或基因操作的任意的多肽或糖蛋白质。本说明书中的抗体的“抗原-结合部分”或“抗体片段”是指具有与间质-上皮细胞转化因子蛋白质特异性结合的能力的抗体的一个以上片段。抗体片段可包含含有Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、CDR的片段或分离的CDR。抗体的抗原-结合片段可通过任何合适的标准技术产生，例如包括基于蛋白质分解酶的分解或编码抗体可变结构域及(任选地)恒定结构域的DNA的操作及表达的重组基因工程技术来从完整抗体分子诱导出来。这种DNA是已知的和/或可容易地从商业来源，DNA文库(例如，包括噬菌体-抗体文库)获得或合成。DNA可被测序并通过化学方法或使用分子生物学技术进行操作。例如，可以在适当的位置排列一个以上的可变结构域和/或恒定结构域，或者引入密码子，制备半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸。
[0093] 抗原结合片段包括以下非限制性示例：包含(ⅰ)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(单链抗体)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)包含模拟抗体的超可变区域(hypervariable region)的氨基酸残基的最小识别单位(例如，如CDR3肽等分离的互补性决定区(complementarity determining region，CDR))或约束的(constrained)FR3-CDR3-FR4肽。如结构域特异性抗体、单个结构域抗体、结构域-缺失缺失抗体、嵌合抗体、CDR-结合(grafted)抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、微抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)(例如，一价纳米抗体、二价纳米抗体等)等其他操作的分子、小型模块化免疫药物(small modular
immunopharmaceuticals，SMIP)及鲨鱼可变IgNAR结构域(shark variable IgNAR domains)等还包含在本说明中所使用的“抗原结合片段(antigen-binding fragment)”内。
immunopharmaceuticals，SMIP)及鲨鱼可变IgNAR结构域(shark variable IgNAR domains)等还包含在本说明中所使用的“抗原结合片段(antigen-binding fragment)”内。
[0094] 抗体的抗原-结合片段通常包含一个以上的可变结构域。可变结构域可包含至少一个CDR，其可具有任意的大小或氨基酸组成，并且通常在具有一个以上的框架序列(framework sequences)的框架(frame)内或附近。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原-结合片段中，VH及VL结构域能够以任何合适的排列定位。例如，可变区域可以为二聚体并可包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。并且，抗体的抗原-结合片段可包含单体VH或VL结构域。
[0095] 与完整抗体分子一样，抗原-结合片段可以为单特异性(mono-specific)或多特异性(multi-specific)(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原-结合片段通常可包含至少两个不同的可变结构域，上述各可变结构域可与单独的抗原或相同的抗原上的其他表位特异性结合。包括本文公开的示例性双特异性抗体形式的任意的多特异性抗体形式可通过使用本领域可利用的常规技术来用于与本发明的抗体的抗原结合片段结合使用。
[0096] 在特定实例中，提供本发明所提供的抗体的氨基酸序列变异体。例如，优选地，改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学特性。可通过导入编码抗体的核苷酸序列导入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变异体。这种修饰包括例如抗体的氨基酸序列中的残基的缺失、和/或插入和/或取代。在一些实例中，根据本说明所述的方法使用的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含与序列1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性(identity)的重链可变结构域(heavy chain variable domain，VH)。在特定实例中，与序列1具有至少90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性(identity)的VH序列包括例如，与标准序列(reference sequence)有关的取代(保守的取代)、插入或缺失，抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含具有与间质-上皮细胞转化因子结合的能力的序列。在特定实例中，取代、插入或缺失发生在CDR外部区域(即，在框架区域中)。任选地，包含VH序列的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包括其序列的翻译后修饰(post-translational modifications)。
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性(identity)的VH序列包括例如，与标准序列(reference sequence)有关的取代(保守的取代)、插入或缺失，抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含具有与间质-上皮细胞转化因子结合的能力的序列。在特定实例中，取代、插入或缺失发生在CDR外部区域(即，在框架区域中)。任选地，包含VH序列的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包括其序列的翻译后修饰(post-translational modifications)。
[0097] 在本发明的另一方面，根据本说明书所述的方法使用的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含与序列2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性的轻链可变结构域(light chain variable domain，VL)。
在特定实例中，与序列2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％的相同性(identity)的VL序列包括与标准序列(reference sequence)有关的取代(保守的取代)、插入或缺失、插入/删除，抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含具有与间质-上皮细胞转化因子结合的能力的序列。在特定实例中，取代、插入或缺失发生在CDR外部区域(即，在框架区域中)。任选地，包含VL序列的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包括其序列的翻译后修饰(post-translational modifications)。
在特定实例中，与序列2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％的相同性(identity)的VL序列包括与标准序列(reference sequence)有关的取代(保守的取代)、插入或缺失、插入/删除，抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含具有与间质-上皮细胞转化因子结合的能力的序列。在特定实例中，取代、插入或缺失发生在CDR外部区域(即，在框架区域中)。任选地，包含VL序列的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包括其序列的翻译后修饰(post-translational modifications)。
[0098] 在一些实例中，根据本说明书所述的方法使用的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体包含与序列1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的VH序列以及与序列2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或99％的相同性的VL序列。上述抗体与具有序列13的序列的间质-上皮细胞转化因子蛋白质特异性结。在再一个实例中，上述抗体以约3×10-10M以下的KD与具有序列13的序列的间质-上皮细胞转化因子蛋白质结合。在另一个实例中，上述抗体以约7×10-10M以下的KD与序列15的间质-上皮细胞转化因子蛋白质结合。
[0099] 可进行缺失、插入及取代的任意的组合，使得最终的结构保留所需的特征，例如，抗原-结合。
[0100] 在特定实例中，提供具有一种以上氨基酸取代的抗体变异体。用于诱导取代突变的关注部位包括包含框架区域的可变区域。保守的取代记载于表3中。更优选的例子在表3中的标题“保守的取代(Preferred substitutions)”下提供，并在下文中结合氨基酸侧链等级(side chain classes)进一步描述。可将氨基酸取代导入受试者抗体中，并可筛选产物的所需活性，例如维持/改善的抗原结合，降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
[0101] 表3
[0102]
[0103]
[0104] 氨基酸可根据通常的侧链(side-chain)特征进行分类。
[0105] (1)疏水性(hydrophobic)：正亮氨酸(Norleucine)、Met、A la、Val、Leu、Ile；
[0106] (2)中性亲水性(neutral hydrophilic)：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
[0107] (3)酸性(acidic)：Asp、Glu；
[0108] (4)碱性(basic)：His、Lys、Arg；
[0109] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
[0110] (6)芳香族(aromatic)：Trp、Tyr、Phe。
[0111] 非保守(Non-conservative)取代可伴随将这些种类中的一个成员交换为另一个种类。
[0112] 在特定实例中，改变本发明中提供的抗体以增加或降低抗体糖基化(glycosylated)的程度。可通过改变氨基酸序列以便产生或去除一个以上糖基化部位，来容易地实现向抗体添加或缺失糖基化部位。
[0113] 当抗体包含Fc区域时，可改变附着于其的碳水化合物(carbohyd rate)。低聚糖不仅可包括例如双触角(biantennary)低聚糖结构的附着于“茎(stem)”中的GlcNAc的岩藻糖，而且还可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(G1cNAc)、半乳糖及唾液酸。在一些实例中，可对本发明的抗体中的低聚糖进行修饰以产生具有得到特定改善的特性的抗体变异体。抗体变异体可以为二等分(bisected)寡糖，并且附着于抗体的Fc区域的双触角(biantennary)低聚糖被Gl cNAc分成两半(bisected)。这种抗体变异体可具有降低的岩藻糖基化(fucosylation)和/或改善的ADCC功能。并且，可以为与Fc区域结合的寡糖中具有一个以上的半乳糖残基的抗体变异体。
[0114] C.治疗用途的1E4免疫球蛋白制备
[0115] 使用常规方法和组合物进行来自单链抗体构建体(序列3)的重链及轻链可变结构域的全长人1E4IgG抗体的产生。本说明书所述的方法使用的人1E4抗体的制备方法记载于以下实施例1及第PCT/KR2015/007899号中。编码如本说明书所述的1E4抗体的可变结构域的核酸(序列11及序列12及它们的变异体)可通过使用常规方法来用于产生全长抗体。在一些实例中，编码本发明的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的重链的核酸可包含与来自任意的来源的编码重链恒定结构域的核苷酸序列框内(in-frame)连接的、编码本发明的VH结构域的核苷酸序列(序列11)。类似地，编码本发明的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的轻链的的核酸分子可包含与来自任意的来源的编码轻链恒定结构域的核苷酸序列框内连接的、编码本发明的VL结构域的核苷酸序列(序列12)。
[0116] 在本发明的另一个实施方式中，编码重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)的核酸分子“转换(converted)”为全长抗体基因。在一个实例中，编码VH或VL结构域的核酸分子分别通过插入到编码重链恒定结构域(CH)或轻链恒定结构域(CL)的表达载体中来转换为全长抗体基因。VH片段(segment)与载体中的CH片段可操作地连接(operatively linked)，和/或VL片段与载体中的CL片段可操作地连接。在另一个实例中，编码VH和/或VL结构域的核酸分子通过使用标准分子生物学技术将编码VH和/或VL结构域的核酸分子与编码CH和/或CL结构域的核酸分子连接(linking)，例如结扎(l igating)来转换为全长抗体基因。人重链及轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核酸序列是本领域已知的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，NIH Publ.No.91-3242，1991)。可将编码全长重链和/或轻链的核酸分子导入细胞中并在细胞中表达后，分离抗-间质-上皮细胞转化因子抗体。
[0117] 核酸分子可用于重组表达大量的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体。如上所述，核酸分子也可用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素(immunoadhesins)、双抗体(diabodies)、突变的抗体及抗体衍生物。
[0118] 类似地，在一些实例中，编码重链可变结构域(序列1)及轻链可变结构域(序列2)的多核苷酸通过与连接肽(例如：序列4)编码多核苷酸连接来克隆到表达载体中，并通过从导入上述载体的细胞表达，来产生用于本说明书所述的治疗方法的单链抗体构建体。
[0119] D.伤口治疗
[0120] 本发明的一实施方式涉及一种促进伤口愈合的方法，其包括向有需要的受试者给药包含1E4抗体的重链及轻链可变结构域的多肽的治疗有效量。如下文实施例2所述，与未给药1E4抗体的小鼠的伤口愈合相比，当向小鼠伤口给药1E4抗体时，伤口治疗变快。如图1所示，与未给药1E4免疫球蛋白的情况相比，当向小鼠伤口局部给药3μg、6μg或12μg的1E4抗体时，伤口面积有效地减少至少20％。本领域技术人员可知，包含1E4的间质-上皮细胞转化因子结构域的免疫球蛋白分子的给药有效地促进受试者的伤口愈合。
[0121] 伤口愈合需要肝细胞生长因子-间质-上皮细胞转化因子途径。伤口可由多种原因引起，包括如裂伤(lacerations)、伤口、划痕、水疱、擦伤、烧伤、糖尿病性溃疡、压疮、手术伤口及其他伤口等皮肤或其他组织或器官的塌陷。所有伤口经历类似的伤口治疗过程。伤口愈合分为四个阶段。第一阶段为血小板到达伤口部位并促进凝固的血液凝固(止血)步骤。第二阶段，即炎症阶段(inflammatory phase)的特征在于，外伤部位的炎症。此阶段对于治疗是重要的并伴随广泛的细胞迁移。伤口愈合的第三阶段为增殖阶段(proliferative phase)，其特征在于，上皮形成(epithelialization)、血管新生、颗粒组织形成及胶原蛋白沉积。与新的毛细管形成相关的血管新生用于提供营养物质并维持颗粒化(granulation)。如果在伤口中没有形成新的毛细血管，则必需的营养成分不会到达伤口并成为长期未愈合的伤口。伤口愈合的第四阶段及最终阶段为成纤维细胞分化为胶原蛋白的成熟阶段(matur ational phase)。本发明的组合物及方法在伤口愈合的一个以上阶段中是有效的。在一实例中，本发明的组合物及方法伴随所有形态的伤口中所需的适当愈合过程，从而防止通常由伤口引起的破坏性生化反应。
[0122] 在本发明的一实例中，本发明的1E4抗体对烧伤有效。烧伤可以为由热量引起的烧伤、由热量引起的调节(controlled)烧伤、化学烧伤、放射线烧伤、电烧伤、冰烧伤或由暴露于闪电引起的烧伤。上述烧伤包括各种程度的烧伤，包括1度、2度、3度或4度烧伤或其组合。
[0123] 在其他实例中，本文的组合物及方法通过促进伤口愈合来直接或间接地防止微生物侵入伤口部位。因此，患者遭受的痛苦较少，因为没有与伤口相关的感染。因此，上述组合物防止伤口损伤变得更严重。本发明的组合物及方法的使用预防、治疗和/或改善组织损伤，上述组织损伤为大部分伤口中的微生物的增殖原因。可通过抑制感染循环来停止疾病的进展。降低的感染率可降低伤口的通常的结果的疾病，障碍及畸形的严重程度。
[0124] 根据本发明可成功治疗或预防的与伤口或炎症相关的其他状态包括炭疽伤口(anthrax wounds)、破伤风(tetanus)、气性坏疽(gas gangrene)、猩红热(scalatina)，丹毒(erysipelas)、须疮(sycosis barbae)、毛囊炎(folliculitis)、传染性脓痂疹(impetigo contagiosa)或大疱性脓疱疮(impetigo bullosa)等，但并不限定于此。
[0125] 在实施本发明的治疗方法时，治疗有效量的激动剂间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白向需要伤口愈合的受试者给药。根据本发明的方法，免疫球蛋白可以单独给药或与其他已知的治疗法组合给药。当与一种以上其他治疗法共同使用(co-administered)时，免疫球蛋白可以与其他治疗同时或依次进行。当依次进行时，主治医生可在第二次治疗前后确定适当的给药顺序。
[0126] E.肾组织损伤的预防或治疗
[0127] 本发明的一实施方式涉及一种预防或治疗肾组织损伤的方法，其包括向有需要的受试者给药包含上述1E4抗体的可变结构域的多肽的步骤。以下实施例3表示向动物给药1E4抗体减少了向动物给药化学疗法药物阿霉素(adriamycin，ADR)引起的肾组织损伤。具体地，将2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的1E4抗体向BALB/c小鼠的尾部静脉给药。第二天，通过单尾注入15mg/kg的阿霉素来诱导肾损伤。然后，在注射阿霉素后第二天及第五天，小鼠静脉注射2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的1E4抗体。如图2a及图2b所示，5mg/kg的1E4免疫球蛋白或其以上剂量有效地减少血尿素氮(BUN)及肌酸酐的增加。血液中的血尿素氮及肌酸酐水平的增加为肾功能丧失及损伤的指标。随着肾功能降低，肌酸酐和尿素(很大程度上取决于肾小球过滤)的血浆浓度开始非线性增加。最初，肌酸酐及尿素浓度几乎没有变化。然后肌酸酐及尿素浓度水平迅速增加，并且通常与全身表现(systemic manif estations)相关。
[0128] 在给药阿霉素后，尿素氮及肌酸酐仅在给药磷酸盐缓冲液的动物(与未给药阿霉素及抗体的“幼稚”动物进行比较的“磷酸盐缓冲液”组，图2a及图2b)中增加。然而，与未使用1E4抗体处理的动物相比，5mg/kg或10mg/kg的1E4抗体的给药均降低了尿素氮及肌酸酐水平。并且，组织学分析还显示，当存在至少5mg/kg的1E4免疫球蛋白时，肾组织损伤显著降低(参照实施例3)。
[0129] 肾纤维化(Renal fibrosis)是由几乎所有类型的慢性肾病中发生的细胞外基质的过度积累引起的，并最终导致末期肾衰竭。认为肾纤维化(renal fibrosis)在慢性和持续性损伤后肾组织的伤口愈合过程中失败。以下实施例4说明了肾纤维化的动物模型，并显示1E4抗体的给药降低了肾组织中纤维性病变的程度。因此，一些实例涉及治疗或预防肾组织损伤的方法，其包括给药1E4免疫球蛋白。
[0130] 本发明的方法及组合物可适用于原发性及继发性肾病及肾衰竭的治疗及预防。继发性肾病包括由诸如糖尿病或高血压等预先存在的(p re-existing)疾病引起的疾病。本发明的方法及组合物可用于慢性炎症及自身免疫疾病，尤其是通过肾小管间质肾病(tubulointerinterstitial n ephropathy)或肾小球肾病(glomerulonephropathy)的病理性变化及蛋白尿特征。疾病包括局灶性节段性肾小球硬化(focal segmental glome rulosclerosis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、糖尿病性肾病、高血压性肾病、肾衰竭、末期肾病及相关状态，但并不限定于此。
[0131] 并且，慢性肾衰竭可能是由肾功能障碍的主要原因引起的。末期肾病的最常见原因是糖尿病性肾病，其次是高血压性肾血管硬化症(h ypertensive nephroangiosclerosis)以及各种原发性及继发性肾小球肾炎。其他原因包括肾小球肾炎，例如，IgA肾病(IgA nephropathy)、局灶性肾小球硬化(focal glomerulosclerosis)、膜性肾病(membrano us nephropathy)、膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glome rulonephritis)、特发性新月体性肾小球肾炎(idiopathic crescentic gl
omerulonephritis)、糖尿病(diabetes mellitus)、感染后肾小球肾炎(postinfectious glomerulonephritis)、全身性红斑狼疮(systemic lup us erythematosus)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、溶血性-尿毒症综合征(hemolytic-uremic syndrome)、淀粉样变性(a myloidosis)；
omerulonephritis)、糖尿病(diabetes mellitus)、感染后肾小球肾炎(postinfectious glomerulonephritis)、全身性红斑狼疮(systemic lup us erythematosus)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、溶血性-尿毒症综合征(hemolytic-uremic syndrome)、淀粉样变性(a myloidosis)；
[0132] 慢性肾小管间质性肾病(tubulointerinterstitial nephropathy)；
[0133] 遗传性肾病(hereditary nephropathies)，例如，多发性肾病(po lycistic kidney disease)、阿尔波特氏综合征(Alport's syndrome)、髓质囊性病(medullary cystic disease)、指甲髌骨综合征(Nail-patel la syndrome)；
[0134] 高血压(hypertension)，例如，肾血管硬化症(nephroangioscler osis)、恶性肾小球硬化症(malignant glomerulosclerosis)；
[0135] 肾大血管病(renal macrovascular disease)；以及
[0136] 阻塞性尿路病(obstructive uropathy)，例如，输尿管梗阻(uret eral obstruction)、膀胱输尿管反流(vesicoureteral reflux)、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)；等，但并不限定于此。
[0137] 在实施本发明的治疗方法时，将治疗有效量的激动剂间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白向患有与肾功能丧失相关的疾病或障碍的受试者给药。根据本发明的方法，免疫球蛋白可以单独给药或与其他已知的治疗法组合给药。当与一种以上其他治疗法共同使用时，免疫球蛋白可以与其他治疗同时或依次进行。当依次进行时，主治医生可在第二次治疗前后确定适当的给药顺序。
[0138] F.通过缺血的组织损伤的治疗或预防
[0139] 本发明的一实施方式涉及一种预防或治疗组织缺血性损伤的方法，其包括向有需要的受试者给药包含上述1E4抗体的可变结构域的多肽的步骤。1E4抗体在动物模型中有效减少由缺血性中风引起的损伤(参照实施例5)。在1天前给药10mg/kg的1E4抗体的大鼠中使用具有大脑中动脉阻塞的动物模型。在阻塞后，在第3天、第10天、第17天及第24天向大鼠静脉内给药10mg/kg的1E4抗体。使用MRI分析脑组织并测定梗塞程度。1E4抗体给药在阻塞模型中有效降低梗塞大小(参照图5)。
[0140] 缺血(Ischemia)是指向组织的血液供应的减少或阻塞。本说明书所述的免疫球蛋白多肽及方法可用于治疗与缺血相关的损伤或“缺血性损伤”。缺血性损伤可包括例如肾脏、肝脏、肺、胰腺、骨骼肌、肠、心脏和脑的损伤。
[0141] 缺血性损伤可由中风、急性心肌梗死、选择性血管成形术、冠状动脉旁路移植术、心脏搭桥术或器官移植或组织移植(例如：心脏移植)、移植后组织排斥、移植物抗宿主疾病(graft versus host diseas e)、头部创伤(head trauma)、溺死(drowning)、败血症(sepsis)、心脏骤停(cardiac arrest)、休克(shock)、动脉粥样硬化(atherosc lerosis)、高血压(hypertension)、可卡因引起的心脏疾病(cocaine-i nduced heart disease)、吸烟引起的心脏病(smoking-induced heart d isease)、心力衰竭(heart failure)、肺动脉高血压(pulmonary hype rtension)、出血(hemorrhage)、毛细血管渗漏综合征(capillary lea k syndrome；例如，儿童和成人呼吸窘迫综合症)、多器官系统衰竭(multi-organ system failure)、低胶体渗透压的状态(a state of low colloid oncotic pressure；例如，饥饿、神经性厌食症或血清蛋白质生产减少的肝功能衰竭)、过敏症(anaphylaxis)、低体温症(hypother mia)、低温损伤(cold injury；例如，由低体温灌流或冻伤引起的)肝肾综合征(hepatorenal syndrome)、震颤性谵妄(delirium tremens)、挤压伤(crush injury)、肠系膜功能不全(mesenteric insufficiency)、外周血管疾病(peripheral vascular disease)、跛行(claudication)、烧伤(burn)、触电(electrocution)、药物过量引起的血管舒张(exc essive drug-induced vasodilation)、药物过量引起的血管收缩(excess ive drug-induced vasoconstriction)、辐射暴露(radiation exposure)，例如，荧光透视法或放射线照片拍摄或高能量暴露(exposure to high energy)，例如，与激光暴露相关引起的。药物过量引起的血管舒张可由硝普钠(nitroprusside)、腙(hydralazone)、二氮嗪(dyazoxide)、钙通道阻滞剂或全身麻醉等引起。药物过量引起的血管收缩可由例如新福林(neosynephrine)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、多巴胺(d opamine)、多巴酚丁胺(dobutamine)或可卡因(cocaine)引起。
[0142] 中风是由血管疾病或损伤引起的极性脑损伤的常用术语。中风可分为出血性中风(由正常血管外的血液渗漏引起的中风)和缺血性中风(由缺乏血液供应引起的脑缺血)。一些可引起缺血性中风的事件包括血栓形成、栓塞及全身性灌注不足(最后缺血及缺氧症)。由于缺氧及继发事件，中风通常会导致大脑中神经细胞的凋亡和损伤。因缺乏血液供应或其他损伤的结果而凋亡的大脑区域被称为梗塞(infarc t)。在一些情况下，本说明书所述的治疗方法减少或最小化梗塞的大小，例如，可减少导致神经细胞的凋亡或损伤的继发事件。
[0143] 由脑动脉壁中的血栓积累引起的脑动脉障碍通常被称为脑血栓形成(cerebral thrombosis)。在脑栓塞(cerebral embolism)中，阻塞脑动脉的阻塞物质发生在循环的下游(例如，栓塞从心脏转运到脑动脉)。由于难以识别中风是由血栓形成还是栓塞引起，术语血栓栓塞(thromboembolism)用于涵盖两种类型的中风。由于血中浓度的降低、血细胞压积(hematocrit)的降低、低血压或无法从心脏充分抽血，可发生全身性低灌注(Systemic hypoperfusion)。
[0144] 在实施本发明的治疗方法时，治疗有效量的激动剂间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白向需要伤口愈合的受试者给药。根据本发明的方法，免疫球蛋白可以单独给药或与其他已知的治疗法组合给药。当与一种以上其他治疗法共同使用时，免疫球蛋白可以与其他治疗同时或依次进行。当依次进行时，主治医生可在第二次治疗前后确定适当的给药顺序。
[0145] G.病理性视网膜血管新生的治疗
[0146] 本发明的一实施方式涉及一种预防或治疗与视网膜中的病理性血管新生(pathologic neovascularization)相关的新生血管视网膜疾病(n eovascular retinal disease)的方法，其包括向有需要的受试者给药包含上述1E4抗体的可变结构域的多肽的步骤。以下实施例6表示动物模型中病理性新生血管形成的成功的治疗。尤其，将激光诱导脉络膜新生血管模型(choroidal neovascularization，CNV)适用于具有视神经周围的光凝固斑点的毛丝鼠(Chinchilla)兔。当在玻璃体液(vitreous humor)中直接向兔子给药50μg的1E4抗体时，通过抑制激光诱导性脉络膜新生血管模型形成(参照图6)，来支持将需要治疗的受试者利用1E4免疫球蛋白组合物预防或治疗视网膜的病理性新生血管形成的实施方式。
[0147] 眼组织内及周围的心血管的病理性生长(心血管形成)与各种眼疾病(ancular diseases)相关。尤其，已知低氧(hypoxia)脉络膜和布鲁赫(Bruch)膜的病理性血管新生的主要刺激物，导致与糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病及AMD的湿润形态(wet form)相关的致命的视力丧失。
[0148] 本发明公开了治疗眼睛疾病或状态的方法，尤其视网膜病、眼睛水肿及眼新生血管的治疗方法。这些疾病或状态的非限制性示例包括糖尿病性黄斑水肿、年龄相关黄斑变性(age-related macular degenera tion；湿润状态)、脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization)、糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)、眼缺血(ocular ischemia)、葡萄膜炎(uveitis)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion；中心性或分支性)、眼外伤(ocular trauma)、手术引起的水肿(surgery i nduced edema)、手术引起的新生血管形成(surgery induced neovasc ularization)、囊样黄斑水肿(cystoid macular edema)、眼缺血(ocu lar ischemia)、葡萄膜炎(uveitis)等。这种疾病或状态的特征在于眼血管系统的变化取决于它是否是急性疾病或状态的结果、或慢性疾病或状态、进行性或非进行性。在其他实例中，患者患有缺血诱导的新血管形成。缺血诱导的新生血管形成(Ischemia-induced neovasculariza tion)不一定是由疾病引起的。例如，眼组织的损伤可导致眼组织的低氧状态，这可导致缺血诱导的新生血管形成，从而导致视力丧失。
[0149] 本发明的一实施方式涉及由包括糖尿病性黄斑水肿(diabetic mac ular edema)及糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)的糖尿病的直接或间接结果引起的与疾病相关的方法。可能发生的另一种症状为非增殖性视网膜病，例如微动脉瘤(microaneurysms)，血管变化可发生在眼睛的黄斑之外。这种状态可能或可能不会导致以新生血管为特征的糖尿病增殖性视网膜病(diabetic proliferative retinopathy)。通常，患有糖尿病性黄斑水肿的受试者经历糖尿病性视网膜病的非增殖期；然而，当增殖期开始时，黄斑水肿症状开始出现并不罕见。
[0150] 在实施本发明的治疗方法时，治疗有效量的激动剂间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白向需要伤口愈合的受试者给药。根据本发明的方法，免疫球蛋白可以单独给药或与其他已知的治疗法组合给药。当与一种以上其他治疗法共同使用时，免疫球蛋白可以与其他治疗同时或依次进行。当依次进行时，主治医生可在第二次治疗前后确定适当的给药顺序。
[0151] H.神经疾病的治疗
[0152] 本发明的一实施方式涉及一种预防或治疗神经疾病或障碍的方法，其包括向有需要的受试者给药包含上述1E4抗体的可变结构域的多肽的步骤。通过肝细胞生长因子的结合的间质-上皮细胞转化因子的激活在神经系统的发育及维持中起重要作用。间质-上皮细胞转化因子不仅在非神经细胞中表达，例如反应性星形胶质细胞(reactive astrocy tes)、少突胶质细胞先祖细胞(oligodendrocyte progenitors)、少突胶质细胞(oligodendrocytes)及小胶质细胞(microglia)等，而且在大脑皮质(cerebral cortex)、海马(hippocampus)、小脑(cerebellum)、脑干运动核(brainstem motor nucleus)、视网膜及感觉神经节(retin a and sensory ganglia)及包括脊髓(spinal cord)的成熟的大脑及发育中的大脑中表达(Funakoshi and Nakamura，2011，Current Signal Transduc Ther，6：156-167)。
[0153] 为了研究1E4激动剂抗体给药对雪旺(Schwann)细胞迁移的效果，进行了实施例7的实验。已知雪旺细胞在神经系统的发育、功能及维持中起到重要作用。例如，受损的神经的髓鞘再生(re-myelinatio n)需要将雪旺细胞迁移到受损神经。如实施例7中所述，如图7a及图7b所示，当将1E4抗体向培养中的大鼠雪旺细胞给药时，与单独用缓冲液处理的细胞相比，这些细胞的迁移性显著增加。
[0154] 另外，使用肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)动物模型研究了本发明的激动剂间质-上皮细胞转化因子抗体效果。表达人突变SOD1的B6SJL-T(SOD1-G93A)小鼠为用于研究药物对ALS及其他神经肌肉疾病的治疗效果的动物模型。如实施例8中所述，与仅给药缓冲液的小鼠相比，向鞘内(intrathecally)或腹腔内(intraperi toneally)给药1E4抗体的小鼠具有改善的运动功能(图8a及图8b)。1E4抗体治疗也提高了存活率(图8d)。
[0155] 实施例7及实施例8的实验数据表示，包含本发明的激动剂间质-上皮细胞转化因子抗体的组合物可用于治疗患有与神经细胞相关的障碍的受试者。
[0156] 神经系统中的肝细胞生长因子及间质-上皮细胞转化因子的潜在作用在Funakoshi and Nakamura，2011，Current Signal Transduc The r，6：156-167中进行了总结。例如，研究结果如下。肝细胞生长因子及间质-上皮细胞转化因子基因的突变与自闭症(autism)、精神分裂症(schizophrenia)及非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing loss)有关。增加的血清肝细胞生长因子水平与恐慌症患者的抗抑郁治疗的疗效有关。肝细胞生长因子在缺血性脑损伤后作为功能恢复的有效脑保护剂起作用。肝细胞生长因子通过抑制细胞凋亡来预防神经细胞的凋亡。肝细胞生长因子在体外及体内对运动神经元具有有益的效果，这种效果被视为在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，A LS)的治疗中显示潜在的治疗价值。在多种研究中报道了有益的效果以增加动物海马中的肝细胞生长因子水平，表明间质-上皮细胞转化因子激动剂在治疗阿尔茨海默氏病中具有治疗作用。
并且，报道了肝细胞生长因子对原代中脑多巴胺性神经细胞(primary midbrain dopamin ergic neurons)的神经营养效果(neurotrophic effects)及间质-上皮细胞转化因子激动剂对帕金森氏病的有益的效果。将外源性肝细胞生长因子基因适用于受损的脊髓来促进运动神经细胞的存活并减少损伤部位，这支持间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体可用于治疗脊髓损伤。
并且，报道了肝细胞生长因子对原代中脑多巴胺性神经细胞(primary midbrain dopamin ergic neurons)的神经营养效果(neurotrophic effects)及间质-上皮细胞转化因子激动剂对帕金森氏病的有益的效果。将外源性肝细胞生长因子基因适用于受损的脊髓来促进运动神经细胞的存活并减少损伤部位，这支持间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体可用于治疗脊髓损伤。
[0157] 间质-上皮细胞转化因子的激活与对神经疾病或损伤的各种有益的效果有关，因此在实施本发明的治疗或使用方法时，治疗有效量的激动剂间质-上皮细胞转化因子免疫球蛋白可向具有神经疾病、障碍或损伤的适应症(indications)的受试者(subject)给药。这种适应症包括缺血性脑损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓损伤、多发性硬化症、发作、水痘、视网膜损伤、听力损伤、周围神经损伤及神经病以及神经性疼痛，但并不限定于此。
[0158] I.药剂学组合物
[0159] 本发明的另一方面涉及药剂学组合物，其包含抗体或其缀合物(c onjugate)及药剂学上可接受的载体(carrier)。
[0160] 在一些实例中，提供了用于治疗缺血性疾病、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍、神经障碍或疾病、或者伤口的药剂学组合物，上述药剂学组合物包含与作为有效成分的间质-上皮细胞转化因子(mesenchymal-epithelial transition factor)结合的抗体或其片段，以及药剂学上可接受的载体，上述抗体包含：重链可变结构域，包含序列5的CDR1、序列6的CDR2及序列7的CDR3；以及轻链可变结构域，包含序列8的CDR1、序列9的CDR2及序列10的CDR3。
[0161] 在一些实例中，重链可变结构域包含序列1且轻链可变结构域包含序列2。
[0162] 在一些实例中，提供了用于治疗缺血性障碍、中风、肾损伤或疾病、视网膜新生血管形成障碍、神经障碍或疾病、或者伤口的药剂学组合物，上述药剂学组合物包含与作为有效成分的间质-上皮细胞转化因子结合的单链抗体及药剂学上可接受的载体，上述单链抗体包含含有序列1的重链可变结构域及含有序列2的轻链可变结构域。
[0163] 在一些实例中，上述单链抗体包含序列3。
[0164] 药剂学组合物可通过静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、骨髓内给药、脑脊髓内给药、心脏内给药、玻璃体内给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、舌下给药、皮下、经皮及局部给药等各种给药途径与身体接触。
[0165] 为了这种临床给药，可使用常规技术将本发明的药剂学组合物制备成合适的产物。
[0166] 本发明的抗-间质-上皮细胞转化因子抗体的药物制剂可通过将具有所需纯度的抗体与一种以上药剂学上可接受的载体(Remington's P harmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合来以冻干制剂或水溶液的形态制备。药剂学上可接受的载体在通常使用的剂量及浓度下对接受者无毒，包括但不限定于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及蛋氨酸；防腐剂(例如：十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及包括葡萄糖、甘露醇或糊精的其他碳水化合物；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成岩抗衡离子(counter-ions)，例如钠；金属络合物(例如：Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子性表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。另外，药剂学上可接受的载体还包括如可溶中性活性透明质酶糖蛋白(as soluble neutral-active hyaluronidase glycoproteins，s HASEGP)等间质药物分散剂(insterstitial drug dispersion agents)，例如rHuPH2O( Baxter
International，Inc.)等人可溶性PH-20透明质酶糖蛋白。在美国公开专利第2005/0260186号及第2006/0104968中记载了作为特定示例的包含sHASEGP及rHuPH2O的使用方法。在本发明的一个方面，sHASEGP与一种以上的额外的糖胺聚糖酶结合，例如软骨素酶
(chondroitinases)。
International，Inc.)等人可溶性PH-20透明质酶糖蛋白。在美国公开专利第2005/0260186号及第2006/0104968中记载了作为特定示例的包含sHASEGP及rHuPH2O的使用方法。在本发明的一个方面，sHASEGP与一种以上的额外的糖胺聚糖酶结合，例如软骨素酶
(chondroitinases)。
[0167] 可通过凝聚技术(coacervation techniques)或界面聚合技术(int erfacial polymerization)将活性成分配制成微胶囊。例如，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液(macroemulsions)下，可分别由羟甲基纤维素或明胶-微胶囊(gelatin-microcapsules)及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备。这种技术记载于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。
[0168] 可制备释放性制剂(Sustained-release preparations)。释放性制剂的合适的粒子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性(semiperme able)基质，此基质以成型产品如薄膜或微胶囊的形态存在。
[0169] 用于体内(in vivo)给药的制剂通常是无菌的。例如，可通过无菌过滤膜进行过滤来容易地实现无菌。
[0170] 为了更好的给药，上述组合物还可包含除了上述活性成分之外的至少一种药剂学上可接受的载体。这种载体的例子包括生理盐水、无菌水、林格液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精(水性)溶液、甘油、乙醇及它们的混合物。如果需要，可添加典型的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂(bacteriostatic agent)等。并且，可通过加入添加剂，例如稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂、润滑剂等，来在药剂学上以水溶液、悬浮液、乳液等形态制备。
[0171] J.给药
[0172] 用于给药1E4间质-上皮细胞转化因子抗体的有效地剂量及方案可凭经验确定，并且其在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，待给药的药物的剂量取决于药物的给药对象、给药途径、使用的特定类型的药物及对象。
[0173] 例如，用于选择合适剂量的抗体的指南记载于“Handbook of Mo noclonal Antibodies，Ferrone et al.，eds.，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，(1985)ch.22and pp.303-357；Smith et al.，Antib odies in Human Diagnosis and Therapy，Haber et al.，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389”的与抗体的治疗用途相关的文献中。单独使用的药物的典型剂量根据上述因素，可以为约0.01mg/kg至500mg/kg体重或约0.01mg/kg至约50mg/kg、或0.1mg/kg至约50mg/kg、或约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约0.1mg/kg至约5mg/kg、或约5mg/kg至约10mg/kg、或约0.2mg/kg至约1mg/kg。
[0174] 用于给药1E4抗体的方案包括每日一次、每周三次、每周两次、每周一次、三次、每月两次、每月一次及每月一次等，但并不限定于此。
[0175] 发明详述部分
[0176] IV.实施例
[0177] 以下实施例是示例性的，并不限定本发明的范围。
[0178] 实施例1
[0179] 间质-上皮细胞转化因子抗体的制备
[0180] 通过在HEK-293T细胞中重组表达来产生以下实施例中使用的1E4IgG1抗体。制备pIgGHD载体(阿普兰，韩国(Aprogen，South Ko rea))以包含编码全长1E4抗体重链的核酸。制备pIgGLD载体(阿普兰，韩国)以包含编码全长1E4抗体轻链的核酸。编码1E4抗体的重链及轻链可变结构域的核酸从通过噬菌体展示文库的生物淘选(bio panning)产生的单链抗体多肽获得。这种1E4重链及轻链可变结构域的产生记载于PCT申请号PCT/KR2015/007899中，其全部内容通过引用并入本文。1E4轻链可变结构域具有由序列2表示的氨基酸序列，
1E4重链可变结构域具有由序列1表示的氨基酸序列。将编码1E4轻链可变结构域的核酸插入于利用SfiI内切核酸酶处理的pIgGLD载体中，将编码1E4重链可变结构域的核酸插入于利用SfiI内切核酸酶处理的p IgGHD载体中。重组表达以下实施例中使用的全长1E4抗体，利用Sf iI内切核酸酶处理pIgGHD载体且利用BstXI内切核酸酶处理pIgGLD载体。为了产生
1E4IgG抗体，利用等量的轻链及重链表达载体转染H EK-293T细胞。
1E4重链可变结构域具有由序列1表示的氨基酸序列。将编码1E4轻链可变结构域的核酸插入于利用SfiI内切核酸酶处理的pIgGLD载体中，将编码1E4重链可变结构域的核酸插入于利用SfiI内切核酸酶处理的p IgGHD载体中。重组表达以下实施例中使用的全长1E4抗体，利用Sf iI内切核酸酶处理pIgGHD载体且利用BstXI内切核酸酶处理pIgGLD载体。为了产生
1E4IgG抗体，利用等量的轻链及重链表达载体转染H EK-293T细胞。
[0181] 将共转染(co-transfected)的细胞在无血清培养基293培养基(37℃，5％的CO2)中培养，然后收集培养基。根据制造商的方案，使用蛋白质A亲和性层析(通用医疗，美国(GE healthcare，US))，从培养基上清液中纯化1E4IgG抗体：利用20mM的磷酸钠(pH7.0)及100mM的NaCl平衡上清液，并注入到蛋白质A柱中。利用20mM的磷酸钠(pH7.0)、1mM的EDTA及500mM的NaCl清洗上述柱后，利用含有100mM的NaCl的0.1M的甘氨酸-HCl(pH 3.3)从柱子上洗脱抗体。利用1M的Tris溶液中和洗脱的蛋白质。将中和的蛋白质和5mM的磷酸钠(pH6.0)以1：1的比例混合后，利用含有50mM的Na Cl的5mM的磷酸钠(pH6.0)向平衡的填充SP-琼脂糖柱(通用医疗)注入。使用含有50mM的NaCl的磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱柱-结合蛋白质。从利用释放缓冲液(release buffer)平衡的填充Q-琼脂糖柱(通用医疗)获得未结合的蛋白质。将蛋白质洗脱液浓缩至30kDa的v ivaspin20(赛多利斯(Sartorius))并利用磷酸盐缓冲液进行透析。
[0182] 实施例2
[0183] 抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体对伤口愈合的效果
[0184] 在动物中测试1E4抗体对伤口愈合的促进效果。在无菌状态下麻醉小鼠(Balb/C，8周龄，雌性)。从背部去除毛后，使用6mm的活检穿孔器(Integra Miltex，cat#11L48)在小鼠的背部皮肤的两侧制造6mm的圆形伤口。为了保持伤口的原始形态并更准确地测定试验物质的伤口愈合效果，利用伤口夹板(内径7mm，Grace Bio-Labs，Cat#1213138)对伤口部位进行粘结及密封(Galiano et al.，Wound Rep air Regen Jul-Aug，12(4):485-92，2004；Li et al.，J Diabetes Res2015:512959，2015)。使用微量移液管以不同剂量(每个伤口每日3μg、6μg或12μg)将磷酸盐缓冲液(对照组)或20μl的1E4均匀地涂敷于伤口部位。为了保护伤口部位，利用TegaDerm(3M，Cat#2016-07PK)覆盖伤口部位。每天给药磷酸盐缓冲液或1E4，持续14天。为了分析伤口缝合的进展，每隔2～3天拍摄图像。
[0185] 图1a为治疗前及治疗期间的伤口的照片。伤口的缝合程度的测定在图1b中以曲线图示出。如图1a及图1b所示，在抗体的所有给药组中，抗间质-上皮细胞转化因子抗体使伤口面积与磷酸盐缓冲液给药组相比减少20％以上。因此，抗间质-上皮细胞转化因子抗体有效地改善伤口愈合。
[0186] 实施例3
[0187] 抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的神经保护效果
[0188] 由许多研究可知，抗癌治疗剂阿霉素(adriamycin，ADR)具有肾毒性，据报道，当向小鼠给药时，因肾内损伤而血尿素氮(BUN)及肌酸酐均增加。(Rossmann et al.J Pathol.169(1):99-108，1993；Wang et al.；Kidney Int.58(4):1797-1804，2000；Okuda et al Ki dney Int 29，502-510，1986.)。测试了激动剂抗间质-上皮细胞转化因子抗体的保护肾脏因化学疗法而受损的能力。
[0189] 在给药1E4抗体之前，BALB/c小鼠(6周，雄性)经历1周的适应期。此后，通过尾部静脉注射(第-1天)给药磷酸盐缓冲液(对照组)或1E4(2mg/kg、5mg/kg及10mg/kg)。第二天(第0天)，通过尾部注入15mg/kg的ADR来诱导所有动物的肾损伤。在注射阿霉素后的第2天及第
5天(分别为2天及5天)，分别向小鼠静脉内给药磷酸盐缓冲液或1E4。在注射阿霉素后的第7天，处死所有动物并收集血液样品以评价血液中的血尿素氮及肌酸酐水平。接着，打开小鼠腹部，切除肾脏并利用4％的甲醛固定。为了使用光学显微镜进行通常的组织检查，在每个肾脏中制备多个载玻片并利用苏木精和曙红(H&E)进行了染色。
5天(分别为2天及5天)，分别向小鼠静脉内给药磷酸盐缓冲液或1E4。在注射阿霉素后的第7天，处死所有动物并收集血液样品以评价血液中的血尿素氮及肌酸酐水平。接着，打开小鼠腹部，切除肾脏并利用4％的甲醛固定。为了使用光学显微镜进行通常的组织检查，在每个肾脏中制备多个载玻片并利用苏木精和曙红(H&E)进行了染色。
[0190] 在阿霉素-诱导的肾损伤的动物模型中，当给药5mg/kg的1E4抗体或其以上量时，有效地减少了增加的血尿素氮(图2a)及肌酸酐(图2b)。并且，观察到，在5mg/kg及10mg/kg的给药组中，1E4给药显著改善了组织损伤。示出了与非给药组(naive)、磷酸盐缓冲液给药组及10mg/kg的1E4抗体给药组的组织有关的H&E-染色的肾组织切片的图像(图3a)。如图3所示，组织学分析包括对成像组织进行评分。1分意味着损伤部位为总肾组织的10％以下。2分意味着损伤部位为总肾组织的10～40％之间。3分意味着损伤部位为总肾组织的40～70％之间。4分意味着损伤部位为总肾组织的70％以上。星号表示与给药磷酸盐缓冲液(未给药抗体)的情况相比，存在p>0.05的显著差异。虽然未示出与给药5mg/kg的1E4抗体的组的组织有关的图像，但是这些动物的组织学分析显示给药5mg/kg的1E4抗体的组的组织显示出p<0.05的显著差异的2.44的分数，其表示5mg/kg和10mg/kg的1E4均有效地减少ADR诱导的肾损伤。
[0191] 实施例4
[0192] 抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的抗-纤维化效果
[0193] 单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)众所周知为肾纤维化，并表示慢性肾病的病理特征(Klahr et al.，Am Physi ological Soc，Vol.283，No.5，F861-F875，2002；Klahr et.al Nephro logy Forum，Kidney Int 54：286-300，1998)。因此，使用该动物模型来研究抗间质-上皮细胞转化因子抗体对肾纤维化病变的激动剂效果。
[0194] 在单侧输尿管梗阻手术前一天，将10mg/kg的1E4向BALB/c小鼠尾部静脉内注射。第二天，在无菌状态下进行了单侧输尿管梗阻手术。解剖腹部的中间并在两个点处结扎(ligated)左输尿管(ureter)。之后，切除两个连接点之间的近端部分。切除后，闭合腹部。
之后，每周向尾部静脉给药1E4。手术后3周，取出左肾并利用4％的甲醛固定。接着，通过马森三色染色(Masson trichrome)及肾切片成像来评价组织样品的纤维病变面积。
之后，每周向尾部静脉给药1E4。手术后3周，取出左肾并利用4％的甲醛固定。接着，通过马森三色染色(Masson trichrome)及肾切片成像来评价组织样品的纤维病变面积。
[0195] 马森的三色染色的图像如图4a所示。将对应于图4a的定量分析结果在图4b中示出。如图4a及图4b所示，1E4的给药显示出在保护肾脏免于肾纤维化方面的有效的治疗效果。
[0196] 实施例5
[0197] 利用抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的中风治疗
[0198] 中间大脑动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion model，MCAO)为中风研究领域中广泛使用的模型。该模型被用作治疗缺血性中风的根本机制和疾病的试验物质或者被用作调查药物的治疗效果的优秀工具(Badr et al.，Am Physiological Soc，Vol.280no.3：R766-R770，2001；Zhao et al.，Blood，114(15)：3329-3334，2009)。测试了抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体1E4的效果以使由缺血性中风或其他缺血相关疾病引起的组织损伤最小化。
[0199] 实验在Wistar大鼠(7周龄)中进行。在诱导中间大脑动脉闭塞模型的前一天，通过尾部静脉向大鼠给药10mg/kg的1E4。第二天，麻醉动物并去除腹颈(ventral neck)的毛。脱毛后，将每只大鼠置于仰卧位(supine position)。在右锁骨上做右中线切口。从相邻的迷走神经分离出右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)。心脏中上行(ascending)右侧颈总动脉的远端分支与2-0丝绸松散结合。通常，颈总动脉分为两种类型：颈外动脉(external carotid artery，ECA)和颈内动脉(internal carotid artery，ICA)。使用丝绸在两点仅仅结扎颈外动脉，并且颈内动脉松散地打结。然后，颈外动脉切断结。将前部涂敷有硅酮的4-0尼龙探针插入到切割的血管中30分钟。去除探针后，完全缝合插入部位。在中间大脑动脉闭塞模型诱导1小时后，使用注入泵静脉内注射10mg/kg的1E4。在中间大脑动脉闭塞模型诱导3天后，再次静脉内给药相同剂量的1E4。然后，在第10天、第17天及第24天，以7天间隔注入相同剂量的1E4。在手术后第3天、第7天、第14天、第21天及第28天，使用磁共振成像(MRI)(MAGNETOM E SSENZA 1.5Tesla，西门子公司(SIEMENS Co.)，德国(Germany))来对梗塞的范围进行了定量化。
[0200] 通过磁共振成像测定的效果未经处理(untreated)或者表现为利用磷酸盐缓冲液或1E4处理的动物中的梗塞大小的测定值(图5)。该数据显示1E4有效地减少中间大脑动脉闭塞模型模型中的缺血性脑损伤。
[0201] 实施例6
[0202] 利用抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的新生血管视网膜疾病的治疗
[0203] 激光诱导的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)模型为研究药物对视网膜中的病原性血管新生的治疗效果提供了优秀的平台。(Marano et al.Gene Therapy，12，1544-1550，2005；Zha n et al.Arch Ophthalmol，Oct；127(10)：1329-35，2009)。激光诱导的脉络膜新生血管模型用于研究抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体对视网膜血管新生的效果。
[0204] 将1％的瞳孔滴眼液(Mydriacyl Eye Drops)局部涂敷并进行乳头扩张手术(papillary dilation)后，麻醉南美栗兔(雄性，2-2.5kg，有色)。使用激光系统(精英(Elite)，Lumenis，美国(USA))在眼睛中诱导光凝固(photocoagulation)(532nm的波长，150mW功率，0.1秒的持续时间)。结果，在视神经周围的6点位置处形成总共六个光凝固点。
在激光诱导的脉络膜新生血管诱导当天，向玻璃体液(vitr eous humor)直接给药50μg的
1E4。在第0天、第3天、第7天、第10天及第14天，向兔子的右眼滴入1％的瞳孔滴眼液后，进行麻醉。通过尾部静脉注射给药1ml的2％的荧光素钠盐溶液。使用检眼镜(T RC-50IX，TOPCON，日本(Japan))进行眼底(fundus)检查，并在给药后2分钟内拍摄照片。通过测定眼底照片中荧光的扩散程度来确定药物的激光诱导的脉络膜新生血管形成及功效。通过使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)来对区域内荧光强度进行定量化，并利用激光诱导的脉络膜新生血管评价眼底图像。在所有图像中，正常血管或没有血管的区域的荧光强度转换为相同的值。通过将每个值与初始对照组的值进行比较来获得最终激光诱导的脉络膜新生血管值的转换。
在激光诱导的脉络膜新生血管诱导当天，向玻璃体液(vitr eous humor)直接给药50μg的
1E4。在第0天、第3天、第7天、第10天及第14天，向兔子的右眼滴入1％的瞳孔滴眼液后，进行麻醉。通过尾部静脉注射给药1ml的2％的荧光素钠盐溶液。使用检眼镜(T RC-50IX，TOPCON，日本(Japan))进行眼底(fundus)检查，并在给药后2分钟内拍摄照片。通过测定眼底照片中荧光的扩散程度来确定药物的激光诱导的脉络膜新生血管形成及功效。通过使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)来对区域内荧光强度进行定量化，并利用激光诱导的脉络膜新生血管评价眼底图像。在所有图像中，正常血管或没有血管的区域的荧光强度转换为相同的值。通过将每个值与初始对照组的值进行比较来获得最终激光诱导的脉络膜新生血管值的转换。
[0205] 在图6中示出数据分析结果。图6表示1E4抗体对激光诱导的激光诱导的脉络膜新生血管形成具有抑制效果。
[0206] 实施例7
[0207] 利用抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的神经疾病的治疗
[0208] 已知雪旺细胞(Schwann cells)在神经系统的各个方面起到重要作用，例如神经发育、传导(通过髓鞘形成的)及再生。在病理条件下，雪旺细胞迁移以使受损神经重新髓鞘化(re-myelinate)(Whalley Katherine，2014，Nat Rev Neurosci.，15(11)：698-99，2014；Jes sen KR et al.，2015，Cold Spring Harb Perspect Biol.7(7)：a020487，2015)。为了研究抗-间质-上皮细胞转化因子抗体对1E4雪旺细胞迁移的影响，在含有10％的胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、青霉素/链霉素及HEPES的Dulbecco改良的鹰培养基(Dulbecco’s modified eagle’s medium)的完全培养基中，培养了大鼠雪旺细胞(Rat Schw ann cells，iSC)。为了迁移分析，将Transwell(科宁(Corning)，3422)插入物在细胞培养箱(37℃及5％的CO2)中利用0.1％的明胶(S igma，G1393)涂敷45分钟。利用0.25％的胰蛋白酶-EDTA处理大鼠雪旺细胞后，将细胞接种于100μl的Transwell系统的上隔室中的完全培养基。下部腔室由含有2％的FBS的600μl的完全生长培养基填充。将Transwell系统在37℃、5％的CO2的温度下培养50分钟以使细胞沉降。结果，下部腔室的生长培养基由50ng/ml的重组人肝细胞生长因子(研究系统(R&D systems)，294-HGF-025/CF)或各种浓度的1E4补充如下：900ng/ml、450ng/ml、90ng/ml及18ng/ml。
[0209] 使通过Transwell过滤器的细胞迁移进行4小时。将Transwell插入物(inserts)中的细胞利用4％的甲醛在4℃的温度下固定一天。固定后，利用0.2％的结晶紫染色细胞，并利用棉签去除过滤器顶端的未转移细胞。使用奥林巴斯(Olympus)显微镜拍摄五张图像，并且计算迁移过滤器的细胞数并取平均值。
[0210] 如图7a及图7b所示，在所有浓度下，与利用磷酸盐缓冲液(未给药1E4)处理的细胞相比，1E4显著增加雪旺细胞的迁移。
[0211] 实施例8
[0212] 利用抗间质-上皮细胞转化因子激动剂抗体的肌萎缩侧索硬化症的治疗
[0213] 表达人突变SOD1的B6SJL-Tg(SOD1-G93A)小鼠为用于评价肌萎缩侧索硬化症(ALS，Amyotrophic Lateral Sclerosis)及其他神经肌肉障碍治疗剂的治疗功效的转化的动物模型(Ji-Seon Seo et al.，Exp Neurobiol.，Dec；24(4)：341-350，2015；Gurney ME et al.，Scie nce.，264：1772-1775，1994)以及其他神经肌肉障碍。因此，测试了1E4抗体给药对该模型动物中的肌萎缩侧索硬化症症状发作的效果。基于转棒的行为评价方法，将小鼠分成组。
[0214] 分组后，每只小鼠鞘内(intra-thecally)给药20μg的1E4。一周后，向每只小鼠腹腔内给药10mg/kg的1E4。这种1E4的鞘内及腹腔内交替给药(alternate treatment)持续了2周。两周后，向小鼠腹膜(p eritoneally)内给药10mg/kg的1E4直至实验结束。通过转棒和握力强度测试每周测定一次运动功能，并且每周监测三次存活率。
[0215] 四周后，在预期发生肌萎缩侧索硬化症相关症状的发作时，与只进行磷酸盐缓冲液处理的情况相比，小鼠开始表现出响应于1E4给药(图8A及图8B)的改善的运动功能。并且，1E4处理增加了小鼠的存活率(图8d)。
[0216] 以上描述了许多示例性方面及实施例，本领域技术人员将理解它们的特定修改、替换、添加及子组合。因此，应理解，所附发明要求保护范围包括它们的技术精神及范围内的所有这些修改、替换、添加及子组合。
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