发明背景

对特异细胞的分析可以有助于理解多种疾病。这些分析能够提供非侵 入性检查用于疾病的检测、诊断和预后，进而避免侵入性诊断的风险。例 如，社会发展引起数量增加的产前检查。然而，现有的方法，羊膜穿刺术 和绒毛膜绒毛取样(CVS)可能对产妇和胎儿不利。在羊膜穿刺术中孕妇 的流产率增加0.5-1％，而CVS中还要高一些。由于羊膜穿刺术和CVS本 身的危险，这些操作主要提供给年纪较大的妇女，比如35岁以上的妇女， 统计数字表面她们孕育先天性缺陷儿的可能性更大。因此，35岁的孕妇就 必须在羊膜穿刺术中0.5-1％的平均流产率和与年龄相关的小于0.3％的21 三体的可能性之间进行衡量。

已经开发出一些非侵入性方法诊断特异性先天缺陷症。例如，产妇血 清甲胎蛋白，以及未结合雌三醇和人绒毛膜促性腺激素的水平可以用来鉴 定患唐氏综合征胎儿的比例，然而这些检测并不是百分百准确。类似地， 超声波检查法用于确定包括神经管缺陷、四肢缺陷在内的先天性缺陷，但 只在15周妊娠期之后有效。

胎儿细胞在孕妇血液内的存在提供了开发一种产前诊断方法的可能， 其替代羊膜穿刺术并且由此消除现今侵入性诊断的风险。然而，血液中相 对于大量的母体细胞而言胎儿细胞仅占少数，这使得分析既耗时且易出 错。

有几种方法用于分离细胞群。这些细胞分离技术可以被分成两类：(1) 利用各种细胞特异性标记物选择染色细胞的分离方法，如荧光激活细胞分 选术(FACS)和磁性激活细胞分选术(MACS)；和(2)利用针对感兴 趣细胞群的生物物理参数分离活细胞的方法，如电荷流式分离法。这些方 法有许多局限性，如成本高，产出低，需要熟练的操作人员以及一些方法 中缺少特异性。因此，目前还没有发明出临床可以接受的方法用来从外周 血样本中分离富集稀有细胞群，尤其是胎儿细胞，以获取足以实现临床诊 断的细胞群。这样，就需要有一种方法突破现有技术的局限从混合物中分 离和富集特定细胞类型。

发明概述

本发明涉及一种包含一个或多个基于尺寸的分离组件和分析仪的系 统，所述组件适合将样本中第一分析物的浓度提高至少10,000倍，其中所 述第一分析物在所述样本中的初始浓度小于1x 10-3分析物/μL，所述分析 仪任选包含计算机可执行逻辑，用于分析富含第一分析物的基质中的第一 分析物。

在一些实施方案中，分析仪还包括显微镜、微阵列或细胞计数器。

在一些实施方案中，计算机可执行逻辑检测胎儿血红蛋白、γ球蛋白、 ε球蛋白、GPA、i抗原、CD46、选择蛋白、CD45或其组合存在时的颜色 变化。

在一些实施方案中，计算机可执行逻辑检测选择性结合第一分析物的 探针的强度。在一些实施方案中，计算机可执行逻辑进行第一分析物的三 维图像分析。

在一些实施方案中，分析仪具有双重扫描的功能。

在一些实施方案中，计算机可执行逻辑显像第一分析物。

在一些实施方案中，尤其当第一分析物是来自母体血液的胎儿细胞 时，计算机可执行逻辑分析胎儿细胞以测定一种或多种胎儿细胞中的胎儿 性别、三体性或染色体异常。

在一些实施方案中，一个或多个基于尺寸的分离组件包括隔离物二维 障碍物阵列，所述阵列决定性地以第一方向引导第一分析物，并以第二方 向引导流体动力学尺寸(Hydrodynamic size)小于第一分析物的第二分析 物。

在一些实施方案中，两个或多个基于尺寸的分离组件相互并联流体连 接(fluidly coupled)。

在一些实施方案中，系统适合每小时至少10mL流体样本的高通量分 析。

在一些实施方案中，系统还包括一个或多个与分离区流体连接的捕获 区，其从流体样本选择性地捕获第一分析物或第二分析物。

在一些实施方案中，系统包括一个或多个捕获组件，其中一个捕获组 件包括二维障碍物阵列。

在一些实施方案中，捕获组件与抗体偶联。这些抗体选择性结合样本 中第二分析物以外的红细胞、白细胞、胎儿血细胞、胎儿有核血细胞、癌 细胞、上皮细胞、或干细胞、祖细胞、泡沫细胞、或血小板。在一些实施 方案中，抗体选自抗CD71、抗CD36、抗碳水化合物、抗选择蛋白、抗 CD451、抗GPA、抗I抗原和抗EpCaM。

在一些实施方案中，流体样本是母体血液样本，第一分析物为有核胎 儿红细胞。

在一些实施方案中，流体样本是血液样本，第一分析物选自上皮细胞、 内皮细胞、祖细胞、干细胞、泡沫细胞或癌细胞。

在一些实施方案中，样本是血液样本且小于5mL。

在一些实施方案中，流体样本是来自妊娠期小于12周的雌性的血液 样本。

在一些实施方案中，基于尺寸的分离组件或捕获组件中的障碍物间的 间隙小于1000微米。

在一些实施方案中，系统还包括含磁性颗粒的贮器。该贮器与基于尺 寸的分离组件或捕获组件流体连接。

在另外一些实施方案中，本发明提供含分离组件的系统，所述分离组 件适合从血液样本中除去大于99.5％的无核细胞并截留血液样本中超过 99％的有核细胞。在一些实施方案中，本系统还包括与所述分离组件流体 连接的适合分析一种或多种有核细胞的分析仪以及存储分析数据的数据 库。

本发明还提供对分析物(比如样本中所选类型的细胞)的富集有用的 系统，以及基于对病例和对照样本中分析物的分析来分析患者疾患的方 法。本发明特别涉及一种系统，该系统包括：一个或多个第一富集区，其 中所述富集区包含界定第一分析物的第一流体流路和第二分析物的第二 流体流路的多个障碍物，其中所述第一分析物和第二分析物具有不同的流 体动力学直径；与所述一个或多个富集区流体连接的分析仪，用于获取关 于所述第一分析物或第二分析物的数据；以及存储所述数据的数据库。

本发明包含一些实施方案，其中所述第一分析物选自红细胞(RBC)、 胎儿RBC、滋养母细胞、胚胎成纤维细胞、白细胞(WBC)、被感染的 WBC、干细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、肿瘤细胞、病毒细胞、细 菌细胞和原生动物，还有一些实施方案，其中所述细胞类型在体内存在浓 度小于1x10-3细胞/μL。

在某些实施方案中，系统的所述第一富集区中障碍物之间的间隙最大 为1000微米。此外一些实施方案中，系统包含一个或多个第二富集区， 其中所述第二富集区捕获所述第一分析物或所述第二分析物，并且其中所 述第二富集区与所述第一富集区流体相通。

在实施方案中，所述一个或多个第一富集区适合截留至少99％的所述 第一分析物。在相关实施方案中，所述一个或多个富集区适合将所述第一 分析物的浓度增高至少100,000倍。

本发明还涉及鉴定与患者疾患相关联的特征的方法，该方法包括：获 取多个对照样本；获取多个病例样本；将每个所述样本应用于一种包括多 个障碍物的设备，所述障碍物使所述样本中第一分析物以远离所述血液样 本中第二分析物的方向偏转，其中所述第一分析物和所述第二分析物具有 不同的流体动力学直径；分析来自所述样本的所述第一分析物以确定所述 第一分析物的特征；并且根据所述特征进行关联研究。

在一些实施方案中，所述特征为所述第一分析物的存在或不存在，在 其它一些实施方案中，所述特征为所述第一分析物的数量。在所涵盖的不 同实施方案中，所述特征为所述第一分析物的形态、所述第一分析物的基 因型、所述第一分析物的蛋白质组、所述第一分析物的RNA组成和/或所 述第一分析物的基因表达水平。

在某些实施方案中，所述多个对照样本包含至少100个对照样本。在 某些其它实施方案中，所述多个病例样本包括至少100个病例样本。在其 它实施方案中，所述对照样本和病例样本为血液样本。还包括其中每个血 液样本含至少100mL血液的实施方案。

本发明包括其中所述分析物为细胞类型的实施方案，并且在特别是所 述分析物为上皮细胞、癌细胞或胎儿细胞的实施方案。

在其它实施方案中，本发明涉及检测生物危害性分析物的方法，所述 分析物包括但不限于环境或其它样本中的细菌、原生动物、病毒病原体和 毒素。

本发明特别涉及用于检测样品中生物危害性分析物的方法，其中所述 生物危害性分析物的浓度小于1x10-3个分析物/μL样品，所述方法包括将 所述样本施用至富集设备/组件并分析所述富集的生物危害性分析物。

在一些实施方案中，富集设备包括二维障碍物阵列，其决定性地以第 一方向引导生物危害性分析物以及以第二方向引导一种或多种非生物危 害性分析物。在一些实施方案中，除了上述障碍物阵列以外或者替代上述 障碍物阵列，富集设备包括选择性捕获生物危害性分析物的二维障碍物阵 列。上述阵列中障碍物之间的间隙优选小于1000微米、500微米、100微 米、50微米或10微米。

在一些实施方案中，富集设备适合截留至少99％的所述生物危害性分 析物。

在一些实施方案中，所述富集适合将所述生物危害性分析物富集至少 10,000倍。

本发明包括一些实施方案，其中富集设备具有至少98％的特异性和至 少98％的灵敏度，以便浓缩器可以。

本发明包括一些实施方案，其中所述生物危害性分析物为选自细菌、 原生动物、和病毒的病原体。更具体说，本发明的实施方案中所述生物危 害分析物为选自以下组的病原体：鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒 梭菌、兔热病杆菌、立克次氏体、布鲁氏菌、鼻疽伯氏菌、类鼻疽伯氏菌、 链球菌、埃博拉病毒、拉沙病毒、SARS、重型天花病毒、甲病毒、普氏 立克次氏体、鹦鹉热衣原体、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌、 小球隐孢子虫、尼帕病毒(Nipah virus)、汉坦病毒和它们的嵌合体。

在一些实施方案中，生物危害性分析物为细胞类型或毒素。

在本发明的某些实施方案中，所述样本为水样本、空气样本、植物或 动物样本或土壤样本。在一些特别实施方案中，所述样本为流体样本。在 相关实施方案中，本发明还包括包含液化样本以使其转化为流体样本的步 骤的方法。

在本发明的其他实施方案中，本发明包括其中所述富集从样本中移走 至少99％的第二分析物的方法。

一方面，本发明涉及根据母体血液样本鉴定胎儿异常的方法，通过： 将来自孕妇的母体血液样本递送到分析仪上，该分析仪适合捕获一种或多 种从所述血液样本中富集的胎儿细胞的图像；分析来自与胎儿核酸结合的 一个或多个核酸探针的信号；分析所述信号；并且根据所述分析步骤产生 诊断结果。所述探针可以特异性针对染色体，如X染色体、Y染色体、21 号染色体、13号色体和18号染色体。

在一些实施方案中，分析包括确定所述探针信号的数量、确定所述探 针信号的尺寸、确定所述探针信号的形状、确定所述探针信号的长宽比 (aspect ratio)或确定所述信号的分布。在一些实施方案中，分析包括捕 获从母体血液样本中获取的胎儿有核红细胞的图像；输入与感兴趣胎儿核 酸结合的多个核酸探针的探针强度；分析所述探针强度；并且根据分析结 果产生诊断结果。在一个实施方案中，探针是染色体特异性的。在一个实 施方案中，染色体选自X染色体、Y染色体、21号染色体、13号染色体 和18号染色体。在一个实施方案中，分析步骤包括确定探针数量。

一方面，本发明涉及检测胎儿疾患的计算机程序产品，其包括用以检 测样本中的胎儿有核红细胞(fnRBC)的计算机编码；接收一个或多个与 感兴趣胎儿核酸结合的核酸探针的探针强度的计算机编码；分析接收的强 度的计算机编码；根据探针强度的分析结果生成指令(call)的计算机编码； 和储存计算机编码的计算机可读介质。在一个实施方案中，计算机可读介 质为内存、硬盘、软盘、CD-ROM、闪存或磁带。在一个实施方案中，探 针是染色体特异性的。在一个实施方案中，染色体选自X染色体、Y染色 体、21号染色体、13号染色体和18号染色体。在一个实施方案中，探针 为比色探针。在一个实施方案中，探针为荧光探针。

本发明提供一种用于产前检测的试剂盒，该试剂盒包括：适合从母体 血液样本中分离一种或多种第一细胞类型的细胞的基于尺寸的分离组件， 其中所述第一细胞类型在孕妇体内存在的浓度小于全部血细胞的1％；以 及一套分析所述一种或多种富集细胞以进行产前诊断的说明书。

在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种试剂(在管形瓶或贮器 中)。这些试剂可以选自RCR试剂、裂解试剂、核酸探针和标记试剂。 标记试剂的一个示例为FISH试剂或FISH探针。优选地，FISH探针选择 性地与选自X染色体、Y染色体、13号染色体、18号染色体和21号染色 体的染色体结合。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括微阵列。

一方面，基于尺寸的分离组件可以包括二维障碍物阵列，其决定性地 以第一方向引导第一细胞类型的所述一种或多种细胞并以第二方向引导 第二细胞型的一种或多种细胞。所述第一细胞类型可以是胎儿细胞(对于 用于癌症诊断的试剂盒，所述第一细胞类型可以是上皮细胞或循环癌细 胞)。在一些实施方案中，第二细胞类型为无核红细胞或血小板。

在这里的任一实施方案中，基于尺寸的分离组件可以截留多于99％的 所述第一细胞型并且除去大于99％的所述无核的红细胞。

本发明在此还包括：基于尺寸的分离组件可以与障碍物阵列流体连 接，其中所述障碍物与抗体偶联，该抗体选自抗CD71、抗CD36、抗选择 蛋白、抗GPA、抗CD45和抗i抗原。

胎儿诊断可以针对：胎儿性别，13三体、18三体、21三体(唐氏综 合征)、特纳综合征(X染色体受损)、克兰费尔特综合征(XXY)或另 一不规则数目的性染色体或常染色体的存在，或者选自下述组的疾患的存 在：沃尔夫综合征(WoIf-Hirschhorn syndrome，4p-)、猫叫综合征 (Cri-du-chat)(5p-)、威廉斯综合征(7q11.23)、帕-魏二氏综合征 (15q11.2-q13)、安裘曼氏综合征(Angehnan syndrome，15q11.2-q13)、米 -迪综合征(17p13.3)、史密斯-马吉利氏综合征(17p11.2)、戴乔治和软腭- 心-面综合征(22q11.2)、卡尔曼综合征(Xp22.3)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS) (Xp22.3)、X连锁鱼鳞病(Xp22.3)和眼癌(13q14)。

本发明涉及一种诊断动物疾患的方法，其通过：获取动物流体样本， 富集所述样本中浓度小于1x10-3个分析物/μL的第一分析物至少10,000 倍；并且分析一种或多种富集的第一分析物以确定所述动物的疾患。优选 利用一个或多个基于尺寸的分离组件进行富集。基于尺寸的分离组件包括 二维障碍物阵列，所述阵列产生流体样本中第一分析物的决定性流体流路 和流体样本中第二分析物的第二决定性流路，其中第一分析物和第二分析 物具有不同的流体动力学尺寸。在一些实施方案中，第一通路通向第一出 口而第二通路通向第二出口。这里的方法还可以包括分析一种或多种富集 的第一分析物以确定动物疾患的步骤。在一些实施方案中，第一分析物为 癌细胞、胎儿细胞或病原体。

在一些实施方案中，动物可以是驯养动物。在一些实施方案中，驯养 动物选自牛、鸡、猪、马、鱼、兔、狗、猫和山羊。在一个实施方案中， 第一分析物为癌细胞。在一些实施方案中，第一分析物为胎儿细胞。在一 些实施方案中，第一分析物为病原体。在一个实施方案中，病原体为细菌、 病毒或原生动物。在一些实施方案中，分析步骤包括进行DNA分析。在 一些实施方案中，分析步骤包括进行RNA分析。在一些实施方案中，分 析步骤包括进行蛋白分析。在一个实施方案中，流体样本为血液样本。

在一些实施方案中，方法还包括将试剂应用于样本的步骤，其中试剂 将第一分析物的尺寸提高至少10％。在一个实施方案中，应用试剂的步骤 发生在将样本应用至障碍物阵列之前。在一些实施方案中，应用试剂的步 骤与将样本应用至障碍物阵列同时进行。在一些实施方案中，所述试剂包 括量子点(quantum dot)、抗体、噬菌体、适体、荧光基团、酶或微珠。 在一个实施方案中，试剂包括微珠。

在一些实施方案中，分析步骤包括计数所富集的第一分析物。在一些 实施方案中，所述状况为动物胎儿的性别。在一些实施方案中，所述状况 包括动物细菌感染。在一些实施方案中，所述状况包括癌症。在一些实施 方案中，第一出口与一个或多个包含选择性捕获第一分析物的多个障碍物 的捕获区流体连接。在一些实施方案中，可以选择性捕获的多个障碍物与 选择性结合红细胞、胎儿细胞、癌细胞或上皮细胞的一种或多种结合部分 偶联。在一些实施方案中，所述捕获部分包括抗体或抗体片段。

本发明还涉及其中提供了用于分析胎儿状况的筛选服务和诊断的企 业方法。本发明特别涉及企业提供胎儿筛选服务的企业方法，所述方法包 括：获取怀孕哺乳动物的血液样本；筛选所述血液样本以鉴定来自所述哺 乳动物的胎儿的胎儿细胞；分析所述胎儿细胞以确定所述胎儿的状况；并 且提供有关所述状况的报告来换取服务费。在相关实施方案中，所述企业 实施该服务。

在本发明的另一些实施方案中，所述企业授权CLIA实验室进行所述 分析步骤。本发明还包括其中所述报告为健康护理提供者或健康保险公司 所作的实施方案。

在本发明的某些实施方案中，筛选在流体系统中进行，所述系统适合 根据尺寸以不同方向引导所述细胞而从母体细胞中分离所述胎儿细胞。

在其它实施方案中，所要确定的胎儿状况选自13三体、18三体、21 三体(唐氏综合征)、特纳综合征(X染色体受损)、克兰费尔特综合征 (XXY)以及其中存在不规则数目的性染色体或常染色体的其他状况。在 特定实施方案中，所述的状况从以下组中选择：沃尔夫综合征 (WoIf-Hirschhorn syndrome，4p-)、猫叫综合征(Cri-du-chat)(5p-)、威 廉斯综合征(7q11.23)、帕-魏二氏综合征(15q11.2-q13)、安裘曼氏综合征 (Angehnan syndrome，15q11.2-q13)、米-迪综合征(17p13.3)、史密斯-马吉 利氏综合征(17p11.2)、戴乔治和软腭-心-面综合征(22q11.2)、卡尔曼综合 征(Xp22.3)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS)(Xp22.3)、X连锁鱼鳞病(Xp22.3) 和眼癌(13q14)。

本发明还涉及用于企业提供诊断的企业方法，其包括使进行胎儿遗传 缺陷产前筛选的诊断产品商业化，其中所述诊断产品分析母体血液。在相 关实施方案中，所述企业生产所述诊断产品。在其它相关实施方案中，所 述诊断产品由聚合物材料生产。在某些实施方案中，该诊断产品是一次性 的。

在特定实施方案中，诊断产品通过将胎儿有核红细胞(fnRBC)从母体 无核红细胞分开来分析母体血液。在一些实施方案中，所述诊断产品检测 所述fnRBC中的遗传异常。在相关实施方案中，包括其中使用与核酸结合 的标记来检测所述遗传异常的企业方法。在另外一些相关实施方案中，所 述标记为荧光标记或比色标记。

本发明还涉及从母体血液样本中分离胎儿细胞的企业方法，该方法以 换取费用或交叉许可的方式实施。这种企业方法包括：获取怀有胎儿的哺 乳动物(如人类)的血液样本；并且从所述血液样本中富集一种或多种胎 儿细胞。该服务的进行可以换取费用或交叉许可。

附图说明

图1显示基于尺寸的分离组件的一个实施方案。

图2显示基于尺寸的分离组件的一个实施方案，各自具有不同流体动 力学尺寸的三个单独分析物流过所述组件。

图3显示具有乳酪楔形旁路障碍物的基于尺寸的分离组件的一个实施 方案。

图4显示相互并联的多个基于尺寸的分离组件的一个实施方案。

图5为描述基于尺寸的分离组件的一个实施方案的分离能力的表格。

图6是描述捕获组件所捕获的细胞的图片。

图7A-7C显示捕获组件的不同实施方案。

图8显示捕获组件的一个实施方案。

图9A-9D显示检测组件的不同方面。

图10A-B显示这里所阐述的商业方法的实施方案。

图11A-11F显示本发明的一个示例的基于尺寸的分离组件。

图12A-F显示由设备产生的、血液样本中血液分析物的典型直方图。

图13A-13D显示基于尺寸的分离组件的不同实施方案。

图14A-14D显示基于尺寸的分离组件的不同实施方案。

图15A-15B显示产物和废物组分的细胞涂片。

图16A-16F显示产物和废物组分的细胞涂片。

图17显示所分离的胎儿有核红细胞中21三体的病理。

图18A-18D显示用于制造基于尺寸的分离组件的一个示例掩膜 (mask)。

图19A-19G显示基于尺寸的分离组件的示例SEM(扫描电子显微照 片)。

图20A-20D显示用于制造基于尺寸的分离组件的掩膜的一个实施方 案。

图21A-21F显示基于尺寸的分离组件的示例SEM。

图22A-22F显示基于尺寸的分离组件的示例SEM。

图23A-23D显示基于尺寸的分离组件的不同部分和掩膜。

图24A-24S显示基于尺寸的分离组件的示例SEM。

图25A-25C显示示例的基于尺寸的分离组件。

通过引用并入

本说明书中提到的所有出版物和专利申请都通过引用结合入本文，如 同明确且单独指明每个单独的出版物或专利申请通过引用结合入本文。

发明详述

虽然本发明的优选实施方案已经在此进行了显示和阐述，但显然对于 本领域的技术人员来说这些实施方案仅以示例的方式被提供。现在本领域 的技术人员会想到很多不脱离本发明的变更、变化和替代。应该理解可以 采用这里所阐述的本发明的实施方案的不同替代方案来实施本发明。以下 权利要求界定了本发明的范围，由此涵盖了这些权利要求范围内的方法和 结构以及它们的等同物。

本发明提供系统、设备和方法，用于从样本、流体样本或更优选的全 血液样本中分离、分选和富集稀有分析物(如生物体、细胞和细胞组分)。 下表1显示各种细胞类型的实例以及它们在体内血液中的浓度和平均尺 寸。

表1

细胞类型、浓度和血细胞尺寸

  细胞类型   浓度(细胞/μL)   尺寸(μM)   红细胞(RBC)   4.2-6.1×106   4-6   分叶中性粒细胞(WBC)   3600   ＞10   杆状中性粒细胞(WBC)   120   ＞10   淋巴细胞(WBC)   1500   ＞10   单核细胞(WBC)   480   ＞10   嗜酸性粒细胞(WBC)   180   ＞10   嗜碱性粒细胞(WBC)   120   ＞10   血小板   500×103   1-2

  胎儿有核红细胞   2-50×103   8-12

在一些实施方案中，这里的装置用于分离或富集流体混合物中的分析 物或细胞，其中所述分析物或细胞在流体样本中浓度小于1x10-3、1x10-4、 1x10-5、1x10-6或1x10-6个细胞/μL。在一些实施方案中，这里的装置用 于分离或富集流体混合物中的分析物或细胞，其中所述分析物或细胞相对 于样本中所有细胞的比例小于1∶100、1∶1000、1∶10,000、1∶100,000、 1,000,000、1∶10,000,000或1∶100,000,000。

在优选实施方案中，本发明提供用于分离和富集一种或多种来自血液 样本的细胞的系统或装置。例如，胎儿细胞可以利用这里的系统和方法从 母体血液样本进行富集或分离。上皮细胞、内皮细胞、祖细胞、泡沫细胞、 干细胞和癌细胞也可以从血液样本中富集。从流体样本中分离和/或富集这 些和/或其它分析物或稀有细胞之后，此系统可以用于检测这些分析物并分 析这些分析物。分析物的分析可以用于这里公开的各种应用。

I样本收集/制备

这里的系统和方法涉及从待分析源获取一个或多个样本。样本可以从 水源、食物、土壤、空气、动物等获取。如果获取的是固态样本(如组织 样本或土壤样本)，这些固态样本可以在富集和/分析之前进行液化或溶解。 如果获得的是气态样本，也可以进行液化或溶解。

在一些实施方案中，当样本来源于动物时，优选来自哺乳动物或更优 选来自人类。来源于动物的流体样本实例包括但不局限于：全血、汗液、 泪液、耳朵流出液、痰、血清、骨髓沉淀、尿液、唾液、精液、阴道流出 液、脑脊液、脑液腹水、乳液、呼吸道分泌物、肠和生殖泌尿道和羊水。 优选地，来自动物的流体样本是血液样本。当分析来自动物的流体样本时， 所述动物可以是例如驯养动物，如奶牛、鸡、猪、马、兔、狗、猫、山羊。 在优选实施方案中，所述动物是人类，所述血液样本是全血样本。来自动 物的血液样本可以用来例如筛选/诊断该动物的状况，或者当其来源于怀孕 动物时可以用来进行产前筛选。在优选实施方案中，这里的系统涉及获取 孕妇血液样本以筛选胎儿的状况或异常。

可以利用本领域已知的任何技术从动物获取流体样本。例如为了抽取 血液，可以使用注射器或其它真空抽吸设备。流体样本如血液优选抽入真 空管或真空袋中。

在一些实施方案中，从动物获取的流体样本直接用于这里的装置，然 而在另外一些实施方案中，样本在递送本发明的装置之前进行预处理或加 工。例如，从动物抽取的血液在递送至本发明的设备之前可以使用一种或 多种试剂进行处理，或者也可以将其收集到预装有这些试剂的容器中。这 里所关注的试剂包括但又不局限于：稳定剂、防腐剂、固定剂、裂解液、 稀释液、抗凋亡剂、抗凝剂、抗血栓形成剂、磁性能调节剂、缓冲试剂、 渗透压调节剂、pH调节剂和/或交联剂。

流体样本的处理方法和将其递送至分析设备的方法的示例在提交日 期为2004年3月3日的、题为“传送稀释液的系统”的11/071,270号以及提 交日期为2005年9月15日的未指定序列号的题为“液体传递的方法和系 统”的美国专利中有阐述，这两个专利都通过引用结合入本文。

当从动物获取血液样本时，血液量可以根据动物的大小、妊娠期、所 要筛选的状况等而变化。在一些实施方案中，从动物获取的流体样本(如 血液)的量小于50mL、40mL、30mL、20mL、10mL、9mL、8mL、7 mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL或1mL。在一些实施方案中，从 个体获得的血液量为1-50mL、2-40mL、3-30mL、或4-20mL。在其它实 施方案中，从动物体内获取的流体样本量大于5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mL。

收集的全部样本可用于这里的设备以富集和/或分离稀有分析物，如胎 儿细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，样本可以以连续的时间间隔获取 并且用于这里的装置来进一步分析。

在一些实施方案中，这里的系统和方法可以从少于10mL、5mL或3 mL的血液样本中富集、分离和分析稀有细胞(如胎儿细胞、上皮细胞或 癌细胞)。在一些实施方案中，这里的系统和方法可以从更大体积血液中 富集稀有细胞，如大于20mL、50mL或100mL。上面所述任一功能可以 在小于例如1天或12、10、11、9、8、7、6、5、4、3、2小时或小于60、 50、40、30、20或10分钟内发生。

当筛选胎儿时，血液样本可以从怀孕哺乳动物或孕妇妊娠24周内， 或更优选20、16、12、8周内或者更优选4周内获取。在其它实施方案中， 筛选和检测胎儿细胞可以在妊娠结束后进行。

在一些实施方案中，血液样本可以与溶胞物质混合，所述溶胞物质选 择性裂解血液样本中的一种或多种细胞或组分，如胎儿细胞或血细胞组 分。例如，含胎儿细胞的母体血液样本在利用这里的系统分离和富集胎儿 细胞的细胞组分之前，可以与水或另一种选择性裂解胎儿细胞的渗透压调 节剂混合。

优选在获取血液1周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、 6小时、3小时、2小时或1小时内将血液样本用于这里的系统。在一些实 施方案中，血液样本一经从动物抽取出来就用于这里的系统。优选在 4-37C温度下将样本用于这里的系统。

II富集

本发明包括从样本中富集稀有分析物。在一些实施方案中，稀有分析 物为细胞或细胞组分。稀有细胞的示例包括但不局限于：血小板、白细胞、 来自母体血液的胎儿有核红细胞、上皮细胞、内皮细胞、祖细胞、癌细胞、 肿瘤细胞、细菌、病毒、原生动物细胞或它们的嵌合体。示例细胞组分包 括但不局限于：线粒体、核酶、溶酶体、内质网、高尔基体、蛋白、蛋白 复合体和核酸。这种分离优选根据尺寸进行。本发明的样本可以是固态、 气态或液态样品。在进行富集步骤之前，优选将固态样本进行溶解或液化。

富集可以利用一种或多种本领域已知的方法和装置进行，并且尤其是 公开在2004/029221和2004/113877号国际公布，2004/0144651号美国公 布，5,641,628、5,837,115和6,692,952，号美国专利，以及60/703,833、 60/704,067、60/668,415、10/778,831、11/071,679和11/146,581号美国专利 上的那些，这里所有这些都通过引用结合入本文。在优选实施方案中，分 析物的富集或分离利用一个或多个基于尺寸的分离组件(如滤网、基质、 电泳组件)；和任选的一个或多个捕获组件(如亲和分离组件、抗体和磁 性微珠)。

1.基于尺寸的分离

基于尺寸的分离组件可以根据样本中分析物的流体动力学尺寸从流 体样本中分离分析物。在优选实施方案中，基于尺寸的分离组件包括一个 或多个形成间隙阵列的二维障碍物阵列。障碍物阵列优选是二维的，并且 具有优选为交错的障碍物/间隙。布置所述阵列，以使经过阵列间隙的流体 不均等地分配入随后间隙。偏转角度可以是例如至少10、20、30、40、50、 60或70％的程度(pitch)。优选地，分离组件可以适合将大于临界尺寸的 分析物偏离障碍物阵列而进入旁路通道。在一些实施方案中，基于尺寸的 分离组件包含的障碍物大于10、100、1,000、10,000或100,000个。当障 碍物以二维阵列排列时，阵列可以有例如多于2、10、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、400、600、800或1000 排的障碍物。

在优选实施方案中，间隙或障碍物任一或者两者可以为中等尺寸(在 一个方向小于1mm)。图1显示示例的基于尺寸的分离组件。障碍物(可 以为任一形状)和平坦的基底偶联形成间隙阵列。可以用透明的覆盖物或 盖子覆盖所述阵列。障碍物形成二维阵列，每一连续的排与前排和后排错 开。平均液体流动由场阵列(field array)确定。在一些实施方案中，障碍 物阵列被设计为每小时可以通过和处理至少1mL、2mL、5mL、10mL、 20mL、50mL、100mL、200mL或500mL的流体样本。样本流入基于尺 寸的分离组件，可以与阵列瞄准线(Line of sight)成小角度(流动角度) 来进行。任选地，基于尺寸的分离组件可以与输入泵偶联，以使样本流经 障碍物。

可以装配这里的基于尺寸的分离组件，以使：流体动力学尺寸大于临 界尺寸的分析物(如细胞)沿着阵列的瞄准线移动，而流体动力学尺寸小 于临界值的那些分析物以不同的方向流动。分析物的流体动力学尺寸部分 取决于分析物的物理尺寸、流体基质的渗透压以及分析物的形状和可变形 性。

图2显示这样一个实施方案；第一通路A是具有第一流体动力学尺寸 的第一分析物的决定通路。障碍物中更弯曲的第二通路为流体动力学尺寸 小于所述第一分析物的第二分析物的决定通路。发现第二分析物比第一分 析物更多地以平均流动方向流过阵列。它沿着决定通路B流动。另外流体 动力学尺寸小于所述第一分析物和第二分析物的第三分析物沿通路C流 动，其完全在障碍物阵列和平均流路内。

多重技术(multiplexing)

在这里的任一实施方案中，一个或多个障碍物阵列串联或并联流体连 接。

在一些实施方案中，多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个的分离组件并联流体 连接。优选大约10-20个这样的组件并联流体连接。将超过1个的分离组 件并联流体连接，可以实现所测样本的高通量分析(如每小时流体样本量 大于1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、15、20、30、40、50、60、 70、80、90或100mL，或者更优选为每小时流体样本大于5mL)。

图3显示多重技术的一个实施方案。图3中，两个障碍物阵列并列放 置，例如成镜像。在这种排列中，两个阵列的临界尺寸可以一样或不同。 另外，可以排列阵列使主流流向两个阵列的边界、每个阵列的边缘或两者。 这种二重阵列还可以包括位于两个阵列之间的中心区域以收集大于临界 尺寸的物质或用来改造样本(例如通过缓冲液更换、反应或标记)。图3 中，中心区域或旁路通道置于乳酪楔形障碍物内，以防止逆流。

将多个阵列并列放在一个设备上，提高了样本处理量，并且允许平行 处理多个样本或样本部分的不同组分或操作。它还可以提高分离组件所处 理的样本的流速。当进行相同样本的平行处理时，出口可以是或可以不是 流体连接。例如，当多个阵列具有同一临界尺寸的时候，可以连接出口以 获得高通量的样本处理。在另一实例中，阵列可以具有不同的临界尺寸或 阵列中的颗粒可以不同的方式处理，因此出口可以不流体连接。在一些实 施方案中，通过将多个二重阵列放在单个设备上可以实现多重技术。多个 阵列，二重或单阵列，可以相互以任何可能的三维关系放置。在一些实施 方案中，多重设备包括两个或多个串联的流体连接的障碍物阵列。例如， 来自一个设备的主流的输出可以和第二个设备的输入偶联。或者，一个设 备的次要溶剂的输出可以和第二个设备的输入偶联。

在另一个实施方案中，多个阵列用于分离宽尺寸范围内的分析物。例 如，一个设备可以有三个流体连接的串联阵列，或者其它数目也可以。通 常，第一阵列(最上游的阵列)的截留尺寸(cut-offsize)比第二阵列(与 第一阵列相邻或下游)的截留尺寸大，并且第一阵列的截留尺寸比第二阵 列的最大流过尺寸小。任何随后的阵列也都如此。第一阵列偏转(或移走) 可能堵塞第二阵列的分析物。同样地，第二阵列偏转(或移走)可能堵塞 第三阵列的分析物。

正如所阐述的那样，在一个多阶段阵列(多重阵列)中，首先偏转可 能引起下游堵塞的大颗粒如细胞，并且这些被偏转的颗粒需要绕过下游阶 段以避免堵塞。因此，本发明的设备可以包括旁路通道以移走阵列中的输 出物。虽然这里表明旁路通道用于移走大于临界尺寸的颗粒，但是它也可 以用于移走阵列任何部分的输出物。

在这里的每个实施方案中，为了分离流体样本中感兴趣的分析物(尤 其是胎儿细胞或上皮细胞)，分离组件的特异性最好大于50％、60％、70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.95％。在这里的每个实施方案 中，为了分离流体样本中感兴趣的分析物(尤其是胎儿细胞或上皮细胞)， 分离组件的灵敏度最好大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％、99.9％或99.95％。

另外，在这里的每个实施方案中，可以浓缩的感兴趣分析物在流体样 本中的初始浓度小于5、2、1、5x10-1、2x10-1、1x10-1、5x10-2、2x10-2、 1x10-2、5x10-3、2x10-3、1x10-3、5x10-4、2x10-4、1x10-4、5x10-5、 2x10-5、1x10-5、5x10-6、2x10-6、1x10-6、5x10-7、2x10-7或1x10-7 个分析物/μL。同时，在这里的每个实施方案中，分离组件可以分离的分析 物(如细胞)占样本中总分析物的比例小于1％，或者占样本(如来自动 物如人类的的血液样本)中总分析物(如细胞)的比例小于1％、0.5％、 0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％、0.002％、0.001％、0.0005％、 0.0002％、0.0001％、0.00005％、0.00002％、0.00001％、0.000005％、0.000002％ 或0.000001％。这里的分离组件可以通过将这种感兴趣分析物从流体样本 转入到富集样本(有时为新的流体基质，如缓冲液)来提高它们的浓度。 在富集样本中的分析物的新浓度与初始样本中的浓度相比浓缩为至少为 10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、 100,000、200,000、500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、 20,000,000、50,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000、 1,000,000,000、2,000,000,000或5,000,000,000倍。

进口/出口

另外，进口和/或出口的数量可以根据设备的预期用途变化。在一个优 选的实施方案中，单个障碍物阵列包括两个或多个出口。图4显示这种阵 列的一个示例，其中14对阵列以彼此镜像的方式放置。这样每个阵列具 有递送样本的第一进口和递送试剂如缓冲液至该阵列的第二进口。每个阵 列还有针对废物(不需要的产物)的第一出口和用于产物(感兴趣分析物) 的第二出口。

在一些实施方案中，基于尺寸的分离组件包括用于移走被引导远离平 均流动方向的较大分析物的第一出口，以及移走以平均流动方向流过障碍 物阵列的较小分析物的第二出口。可以提供附加出口用于收集分离过程中 不同点的组分。另外，在一些实施方案中，二维阵列包括多于一个的进口。 这些进口可以提供附加的样本和/或试剂，包括例如稳定剂、防腐剂、固定 剂、裂解试剂、稀释液、抗凋亡剂、标记试剂、抗凝剂、抗血栓剂、缓冲 试剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、PCR试剂、洗液和/或交联剂。

在一些实施方案中，感兴趣细胞(如胎儿细胞)可以选择性的被裂解， 这样包括感兴趣细胞的细胞组分的流体样本可以流过分离组件。利用这里 阐述的或本领域已知的方法，感兴趣的细胞组分可以根据尺寸与血液样本 中的其它细胞分离开来。当裂解试剂与样本同时被递送到分离设备时，或 者当裂解试剂与样本先混合后被递送到本文公开的分离设备时，该设备可 以偏转/分离一个或多个细胞器如细胞核、线粒体、核酶、内质网或高尔基 体。例如，在一些实施方案中，母体血液与可以选择性裂解胎儿有核红细 胞的裂解试剂混合。这些裂解试剂可以是如水或其它一些本领域已知的可 以选择性裂解胎儿细胞的试剂。然后这样血液样本被递送到这里的设备 中，该设备选择性地偏离来自血液样本的所有或大多数其它分析物，进而 使胎儿红细胞的细胞器(如细胞核)的浓度得到富集。在这样一个实施方 案中，细胞核将从“废物”出口流出。在其它实施方案中，裂解液与血液样 本被递送到第二进口。在这个实施方案中，裂解与分离同时在设备中发生。

在一些实施方案中，一个或多个分析物可以与结合性部分(如磁性微 珠)接触，其可以选择性与这些分析物结合进而增大它们的尺寸(流体动 力学尺寸)。未被结合的分析物和未被结合的结合性部分可以根据它们较 小的尺寸被移出(如通过“废物”出口)，同时被结合的分析物可以根据它 们的尺寸被偏转进而从另一个不同的出口移出。

设备构造和/或几何形状可以以不同的方式设计。例如，环状进口和出 口(图4为环状进口的示例)。这样设计就引入没有障碍物的进口区域以 确保当血细胞到达障碍物区域时是均匀分布的。类似地，出口设计为没有 障碍物的出口区域以均匀无损伤地收集流出的细胞。

旁路通道

当流体样本中的分析物和/或细胞流过障碍物阵列时，那些流体动力学 尺寸大于临界尺寸的分析物将被偏转至旁路通道。旁路通道的特征是具有 比障碍物间平均间隙更宽的通道。另外，旁路通道的宽度等于或大于样本 中分离出的最大组分(最大细胞)。例如，在一些实施方案中，分离组件 的旁路通道的宽度可以大于50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150微米。在一些实施方案中，主要通道的宽度小于100、90、80、 70、60、50、40、30或20微米。

旁路通道的特征还在于围绕它的或形成其外部边缘的障碍物。优选情 况是，这些障碍物适合防止已经到达旁路通道的大细胞或分析物的逆流或 湍流。在一些实施方案中，旁路通道的障碍物具有与主要通道和流动方向 平行的直边缘。在一些实施方案中，旁路通道的障碍物具有楔形的横断面， 其中的楔尖末端指向下游(见图3)。

在一些实施方案中使用单个旁路通道，并且一个或多个阶段(阵列) 共同使用该旁路通道。在一些实施方案中使用多个旁路通道。例如，大多 数阶段中的每个都可以拥有自己的旁路通道。在一个实施方案中，较大的 分析物(如胎儿细胞、上皮细胞、癌细胞)被偏转到主流，接着进入旁路 通道以防止堵塞。不会引起堵塞的较小细胞进入第二阶段在此根据尺寸进 行进一步分离。这种设计可以根据需要的阶段数进行重复。在每一阶段， 旁路通道都可以与出口流体连接，这样可以从样本中收集多个部分。旁路 通道可以设计为：保持通过设备的恒定流量，移走一定流量以便不扰乱阵 列中的流动，或者增加在某些区域的流量。类似地，阵列边缘部分可以设 计用以产生独特的流动模式(如流动供给(flow-feeding)，流动提取(flow extracting)，等)。

在这里的任何实施方案中，每个阵列都有一个最大流过尺寸，其比截 留尺寸大数倍。这可以通过较大间隙和较小分叉比(bifurcation ratio)ε的 组合实现。在某些实施方案中，ε最大为1/2、1/3、1/10、1/30、1/100、1/300 或1/1000。并且在这些实施方案中，障碍物的形状可能影响间隙中的流态 (Flow profile)；然而，可以在流动方向压缩障碍物，目的是使阵列变短。 单阶段阵列可以包括本文所述旁路通道。

障碍物的形状

基于尺寸的分离组件中障碍物的尺度和几何形状可以统一或变化，以 形成统一或不统一的模式。例如，障碍物可以有圆柱状、月亮状或正方形 的横截面。在优选实施方案中，障碍物为圆柱状，这样障碍物形成一个圆 形的横截面。障碍物的直径(最长横截面长度)优选在4-40微米、5-30 微米、6-20微米或7-10微米。在一些实施方案中，分离障碍物的直径大于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、30、40或50微米。在一些实施方案中，分离障碍物的直径小于 100、90、80、70、60、50、40、30、20或10微米。障碍物之间的距离也 可以变化。在一些实施方案中，障碍物之间的距离至少为10、25、50、75、 100、250、500或750μm。在一些实施方案中，障碍物之间的距离至多为 1000、750、500、250、100、75、50或25μm。另外，直径、宽度或障碍 物的长度也可以最小为5、10、25、50、75、100或250μm且最大为500、 250、100、75、50、25或10μm。障碍物的高度可以变化，但是优选等于 或大于分离的至大分析物的高度。在一些实施方案中，分离障碍物的高度 的变化范围为10-500微米、20-200微米、30-100微米或40-50微米。在一 些实施方案中，分离障碍物的高度小于1500、1000、500、400、300、200、 100、90、80、70、60、50、40、30、20或10微米。

分析物尺寸

在一些实施方案中，分离组件具有适合从流体样本中分离分析物(稀 有细胞)的第一分离区，其中所述分析物的流体动力学尺寸大于20、19、 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微 米。更优选的情况是，分离组件有适合从流体样本中分离分析物的第一分 离区，其中所述分析物的流体动力学尺寸大于15、14、13、12、11、10、 9、8、7、6、5或4微米。更优选的情况是，分析组件有适合从流体样本 中分离分析物的第一分离区，其中所述分析物的流体动力学尺寸大于10、 9、8、7或6微米。

在一个实施方案中，分析组件有第一分离区和第二分离区，其中第一 分离区适合并且被装配为分离流体动力学尺寸至少为15、20、25、30、35 或40微米或更大的分析物，第二分离区适合并且被装配为分离流体动力 学尺寸至少为10、15、20、25、30或35微米或更大的分析物，其中的第 一区域临界尺寸大于第一区域的临界尺寸。第一分离区和第二分离区可以 彼此处于流体相通(流体连接)，这样第二分离区处于下游且与第一区域 串联。在一些实施方案中，分离组件也可以包括适合分离流体动力学尺寸 至少5、10、15、20、25或30微米或者更大的的组分的第三分离区，并 且其中的第二区域临界尺寸大于第三区域的临界尺寸。第三分离区和所述 第二分离区流体连接且位于第二分离区的下游。分离组件可以任选包括如 上所述附加区域，其每个从样本中分离越来越小的组分。

在一个实施方案中，分离组件适合引导样本中流体动力学尺寸(如直 径)为15微米或更大的分析物远离较小组分的流动方向并且进入主要通 道；第二分离区适合引导样本中流体动力学尺寸(如直径)为7.5微米或 更大的分析物远离较小组分的流动方向并且进入主要通道；第三分离区适 合引导样本中流体动力学尺寸(如直径)为5微米或更大的分析物远离较 小组分的流动方向并且进入主要通道。以上实施方案对从血液样本中分离 红细胞尤其有用。

当然，以上分离组件可以进行调整以适合分离流体样本中更小或更大 的组分。例如，在一些实施方案中分离组件可以被装配以分离尺寸大于4 微米的所有组分(如胎儿有核RBC、有核RBC和WBC)。在一些实施方 案中，分离组件适合将血液样本中的有核细胞同无核细胞分离开来。

在一些实施方案中，分离设备可以用于从流体样本中(如血液样本、尿 液样本或其它身体样本)浓缩感兴趣的细胞类型或组分，其中所述感兴趣的 细胞类型或组分在体内存在的浓度为小于全部血液细胞的50、40、30、20 或10％，或者更优选小于全部血液细胞的9、8、7、6、5、4、3、2或1％， 或者更优选小于全部血液细胞的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 或0.1％，或者更优选小于全部血液细胞的0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、 0.04、0.03、0.02或0.01％，或者更优选小于全部血液细胞的0.009、0.008、 0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001％，或者更优选小于全 部血液细胞的0.0009、0.0008、0.0007、0.0006、0.0005、0.0004、0.0003、 0.0002或0.0001％，或者更优选小于全部细胞或组分的0.00009、0.00008、 0.00007、0.00006、0.00005、0.00004、0.00003、0.00002或0.00001％。

特异性/灵敏度

在这里的任一项实施方案中，基于尺寸的分离设备可以用于更高效率 地从混合细胞群(如全血)中分离一种或多种细胞类型。例如，尺寸分离 设备在分离后优选截留全血样本中≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、 ≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.9％ 的所有有核细胞，或更优选超过母体血液样本中大于≥50％、≥60％、≥70％、 ≥80％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、 ≥99％、≥99.9％的所有有核胎儿红细胞。相类似地，以上所述设备可以在 分离后截留血液样本中≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥91％、≥92％、 ≥≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.9％的所有上皮 细胞或血液样本中≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、 ≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.9％的所有癌细胞。同时， 这里的分离组件还可以从流体样本如全血中移走≥95％、≥96％、≥97％、 ≥98％、≥99％、≥99.9％的所有不需要的分析物(如红细胞和血小板)。图 8显示这里的基于尺寸的分离组件的一个实施方案中获得的特异性和灵敏 度的一些示例。

以上任何或所有步骤可以用于产物的最小稀释。在一些实施方案中， 感兴趣的期望分析物被截留并且被分离到初始样本的小于50、40、30、20、 10、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0或 0.5倍稀释的溶液。在一些实施方案中，以上任何或所有步骤可以用于需 要产物的浓缩。例如，富集的感兴趣分析物在最终的富集溶液中比在初始 样本中浓缩了至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、 6000、7000、8000、9000、10,000、100,000、500,000或1,000,000倍。例 如，血液样本中第一细胞类型浓度提高10倍，这意味着在样本用于这里 的设备后样本中第一细胞型与总细胞的比例是原来的10倍。这种浓缩可 以用于总体积大于10ml或20ml的含感兴趣稀有组分的流体样本(如血 液样本)，并且可以将这种感兴趣的稀有组分浓缩至总体积小于5ml的浓 缩液里。

在一个实施方案中，加入一些试剂以选择性或非选择性地增加样本中 分析物的流体动力学尺寸。然后，将这种经改变的样本递送通过本发明的 障碍物阵列。由于分析物是溶胀的且有增加的流体动力学尺寸，因此可能 会使用具有较大的且较易加工的间隙尺寸的障碍物阵列。在一个优选的实 施方案中，溶胀和基于尺寸富集的步骤可以在设备上以一种整合方式进 行。合适的试剂包括任何低渗溶液，如去离子水、2％的蔗糖溶液或纯的非 水溶剂。其它试剂包括微珠，例如磁性或多聚微珠，选择性地(如通过抗 体或抗生物素蛋白-生物素)或非选择性地结合。

在另一个实施方案中，在样本中加入一些试剂以选择性或非选择性地 减小样本中分析物的流体动力学尺寸。样本中颗粒尺寸的非统一减小将提 高分析物流体动力学尺寸之间的差异。例如，通过高渗收缩细胞将有核细 胞同无核细胞分开。无核细胞可以收缩成非常小的颗粒，而有核细胞不能 收缩到细胞核尺寸以下。示例收缩试剂包括高渗溶液。

在一个替代实施方案中，利用亲合性功能化的微珠提高感兴趣颗粒相 对于样本中其它颗粒的体积，藉此允许带有较大的且较易加工的间隙尺寸 的障碍物阵列进行操作。

在这里的任一个实施方案中，流体可以主动或被动地驱动通过设备。 可以通过电场或磁场、离心场、压力驱动的流体流动、电渗流动和毛细管 作用将流体泵入。在本实施方案中，所述场的平均方向将与含阵列的通道 壁平行。

捕获分离

这里的系统可以任选包括一个或多个捕获组件。捕获组件富集流体样 本中感兴趣的分析物(如细胞)，通过限制或抑制所述分析物的迁移或运 动或通过将其与捕获性部分络合。在一些实施方案中，捕获组件利用基于 亲和的分离，然而基于亲和的分离并不是唯一选择。

这里的捕获组件为高度特异和选择性的。在这里的任一个实施方案 中，优选捕获组件从流体样本中分离感兴趣的分析物(如胎儿细胞或上皮 细胞)的特异性大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、 99.9％或99.95％。在这里的任一个实施方案中，优选捕获组件从流体样本 中分离感兴趣的分析物(如胎儿细胞或上皮细胞)的灵敏度大于50％、60％、 70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、 99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.95％。

另外，在这里的任一个实施方案中，感兴趣分析物可以通过捕获组件 从初始浓度小于5、2、1、5x10-1、2x10-1、1x10-1、5x10-2、2x10-2、1 x10-2、5x10-3、2x10-3、1x10-3、5x10-4、2x10-4、1x10-4、5x10-5、2 x10-5、1x10-5、5x10-6、2x10-6、1x10-6、5x10-7、2x10-7或1x10-7个 分析物/μL流体样本中分离(如浓缩)。同时，在这里的任一个实施方案 中，捕获组件可以分离分析物(如细胞)，所述分析物占样本中总分析物 的比例小于1％或者占样本(例如来自动物如人的血液样本)中总分析物 (如细胞)的比例小于1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、 0.005％、0.002％、0.001％、0.0005％、0.0002％、0.0001％、0.00005％、 0.00002％、0.00001％、0.000005％、0.000002％或0.000001％。捕获组件可 以提高感兴趣分析物的浓度至少为初始样本浓度的10、20、50、100、200、 500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、 500,000、1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、 50,000,000、100,000,000、200,000,000、500,000,000、1,000,000,000、 2,000,000,000或5,000,000,000倍。

在一些实施方案中，捕获组件包括带有障碍物阵列通道。这些障碍物 可以为一种或多种形状。阵列优选为二维的，且障碍物可以根据需要统一 或不统一。在优选实施方案中，阵列包括二维的统一的交错障碍物阵列。

捕获组件的示例在2004/029221号国际公布以及5,641,628、5,837,115 和6,692,952号美国专利中公开，它们都通过引用结合入本文。

形状和尺寸

为了提高结合量，可能期望增加障碍物表面积或样本与障碍物的接触 时间。因此，本发明的捕获障碍物可以具有不同的形状和结构以提高它们 的表面积和/或与样本的接触时间。另外，障碍物形状和尺寸根据待捕获的 分析物、样本浓度等等改变。捕获组件欲捕获的分析物越大，捕获障碍物 就将越高。在一些实施方案中，障碍物的高度小于1500、1400、1300、1200、 1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100微米。在 一些实施方案中，障碍物的高度大于20、30、40、50、60、70、80、90、 100、200、300、400或500微米。

类似地，障碍物之间的间隙的尺寸将根据欲捕获障碍物的尺寸而变 化。在一些实施方案中，障碍物之间的间隙小于50、40、30、20或10微 米。在一些实施方案中，障碍物之间的间隙小于10、9、8、7、6、5、4、 3或2倍的感兴趣分析物的流体动力学尺寸。在一些实施方案中，障碍物 之间的间隙小于感兴趣分析物的流体动力学尺寸。在这种实施方案中，感 兴趣分析物被捕捉在障碍物之间。本发明包括间隙宽于感兴趣分析物或窄 于感兴趣分析物的阵列。在一些实施方案中，受限间隙(宽度等于或小于 感兴趣分析物)均匀或不均匀地分散在障碍物阵列的各处。优选情况是， 受限间隙均匀地分散在障碍物阵列的各处。

在一些实施方案中，每个障碍物的直径都小于1500、1400、1300、1200、 1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、 70、60、50、40、30或20微米。在其它实施方案中，每个障碍物的直径 都大于5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100微米。

在一些实施方案中，捕获阵列中的障碍物适合可逆地或不可逆地选择 性地(和任选可逆地)结合流体样本中的一个或多个的组分。障碍物可以 包括如，对流体样本中所选细胞或组分具有亲合性的捕获性部分。这种捕 获性部分可以包括抗体，其可以特异性地结合感兴趣的细胞或组分，如胎 儿细胞、红细胞、白细胞、血小板、上皮细胞、癌细胞、内皮细胞或其它 稀有细胞。例如，在一些实施方案中，捕获性部分包括特异性结合红细胞 或上皮细胞的抗体(或其片段)。这些抗体包括例如抗CD71和抗EpCAM。 在优选实施方案中，这种抗体为单克隆抗体。其它可以引入到捕获性部分 的抗体包括但不局限于抗CD235a、抗CD36、抗选择蛋白、抗碳水化合物、 抗CD45、抗GPA和抗i抗原。图6显示本发明的一个实施方案，其中胎 儿细胞与偶联有结合性部分(抗CD71)的障碍物结合。图7A显示第一分析 物通过柱阵列的通路，其中不特异性地与柱结合的分析物继续迁移穿过阵 列，而与柱结合的分析物被阵列捕获。图7B被抗体包被的柱的图片。图 7C显示本发明包括的抗体和底物(如障碍物、侧壁等)的偶联。

和分离组件一样，捕获组件可以有多个区域，每个区域可以选择性地 结合不同的感兴趣细胞和/或组分。含多区域捕获组件的系统将包括两个或 多个相互流体连接的串联的捕获区。另外，系统可以包含多个流体连接的 并联分离组件以提高同时分析的样本的量。

当从混合细胞群(如血液)中富集第一细胞类型时，优选从混合液中 移走至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的能够结合到捕获组 件表面的细胞。优选设计捕获组件的包被表面使细胞的非特异结合最小 化。例如，至少99％、98％、95％、90％、80％或70％的不能结合到结合 性部分的细胞或分析物不与捕获组件的表面结合。捕获组件内的选择性结 合促成特异分析物(如活细胞群)从细胞混合液中分离出来。本设备中存 在障碍物以增加同分析物(如细胞)接触的表面积，同时在小室中还有障 碍物这样提高了结合的可能性。流动条件使分析物细胞在设备中轻柔地进 行处理而不需要机械变形以进入障碍物之间。可以利用正压力或负压力泵 或来自流体柱的流动，以将细胞传送到和传送出本发明的微流体设备(如 捕获组件)。

优选情况是，这里的方法截留相对于初始混合物至少50％、60％、70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或99.95％的期望分析物(如细胞)， 同时期望细胞群相对于样本中的分析物的量可能浓缩至少100、1000、 10,000、100,000或1,000,000倍。

在一些实施方案中，捕获组件包括的障碍物数目大于10、100、1,000、 10,000或100,000。当这种障碍物在二维阵列中排列时，阵列可以有，例 如大于2、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、 180、200、400、600、800或1000排的障碍物。

磁性

在一些实施方案中，为了分离和/或富集一个或多个分析物，捕获组件 涉及磁性颗粒、磁场和/或磁性设备/设备组件的使用。

本发明的磁性颗粒可以为任何尺寸和/或任何形状。在一些实施方案 中，磁性颗粒的直径小于500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90 nm、80nm、70nm、60nm或50nm。在一些实施方案中，磁性颗粒的直 径在10-1000nm、20-800nm、30-600nm、40-400nm或50-200nm之间。 在一些实施方案中，磁性颗粒的直径大于10nm、50nm、100nm、200nm、 500nm、1000nm或5000nm。磁性颗粒可以是干燥的或悬浮在液体中。 流体样本和含磁性颗粒的第二流体基质的混合可以使用本领域已知的任 何方法，包括2005年9月15日提交的题为“流体递送的方法和系统”的美 国专利，序列号未给定。

在一些实施方案中。当样本中的分析物(如感兴趣或不感兴趣的分析 物)是强磁性的或有磁性，可以利用磁场将这种分析物从一种或多种其他 分析物(如感兴趣或不感兴趣的分析物)或者从已清除分析物的样本中分 离出来或移出来。图8显示这种捕获机理的实施方案，其中第一分析物与 第一分析物特异性结合抗体偶联并且其中的抗体还和纳米微珠偶联。当含 有第一分析物-纳米微珠复合物的分析物混合液和第二分析物被递送到磁 场时，第一分析物-纳米微珠复合物将被捕获，同时其它细胞继续在场中迁 移。这样可以通过移走磁场得到第一分析物。

磁场可以在这里的设备的内部或外部。这里关注的外磁场的磁源在这 里的设备(如容器、通道、障碍物)的外部。这里关注的内磁场的磁源在 这里的设备的内部。

在一些实施方案中，当期望分离的分析物(如感兴趣或不感兴趣的分 析物)不是强磁性的或不具有磁性时，磁性颗粒可以和选择性结合这种分 析物的结合性部分相偶联。结合性部分的示例包括但不局限于：多肽、抗 体、核酸等。在优选实施方案中，结合性部分为选择性结合感兴趣的分析 物(如红细胞、癌细胞或上皮细胞)的抗体。因此，在一些实施方案中， 磁性颗粒可以用抗体(优选单克隆)进行修饰，所述抗体可以选自抗CD71、 抗CD45、抗EpiCAM或其它这里公开的抗体。

磁性颗粒可以在与样本接触前与任何一个或多个这里的设备偶联，或 者在样本递送至设备之前与样本混合。

在一些实施方案中，这里的系统包括贮器，该贮器含有能够改变捕获 或未捕获分析物磁性的试剂(如磁性颗粒)。该贮器优选与一个或多个这 里的设备/组件流体连接。例如，在一些实施方案中，磁性贮器和基于尺寸 的分离组件偶联，在其它实施方案中磁性贮器和尺寸捕获组件偶联。

试剂的确切性质依赖于分析物的性质。示例试剂包括过渡金属氧化或 还原试剂，血红蛋白氧化或还原试剂，能够结合分析物的磁性微粒，或者 能够螯合、氧化或以其他方式结合铁的试剂，或其它磁性物质或颗粒。试 剂可以用于改变分析物的磁性而实现或提高磁场对它的吸引，实现或提高 磁场对它的斥力，或者消除磁性以使分析物不受磁场的影响。

任何感应磁场的磁性颗粒都可以在本发明的设备和方法中使用。期望 的颗粒具有表面化学作用可以进行化学或物理改性，如通过化学反应、物 理吸附、纠缠或静电相互作用。

捕获性部分可以通过本领域已知的任何方法与磁性颗粒结合。示例包 括化学反应、物理吸附、纠缠或静电相互作用。捕获性部分与磁性颗粒的 结合将依赖于目标分析物的性质。捕获性部分的示例包括但不局限于：蛋 白(如抗体、抗生素蛋白和细胞表面受体)、带电或不带电聚合物(如多 肽、核酸和合成高分子)、疏水或亲水聚合物、小分子(如生物素、受体 配体和螯合剂)、碳水化合物和离子。这些捕获性部分可以特异性地结合 细胞(如细菌、病原体、胎儿细胞、胎儿血细胞、癌细胞和血细胞)、细 胞器(如细胞核)、病毒、肽、蛋白、碳水化合物聚合物、核酸、超分子 复合物、其它生物分子(如有机或无机分子)、小分子、离子或其结合体 (嵌合体)或片断。用于胎儿细胞的捕获性部分的具体示例包括抗CD71、 抗CD36、抗选择蛋白、抗GPA、抗碳水化合物和全转铁蛋白。因此在另 外一个实施方案中，捕获性部分为胎儿细胞特异性的。

一旦分析物的磁性被改变，它可以用来实现相对于样本中其它组分的 分析物的分离或富集。所述富集或分离可以包括利用磁场将期望分析物吸 引至磁场的正选择，或者可以采用负选择来吸引不感兴趣的分析物。无论 那种情况，都可以收集含有期望分析物的分析物群，用于分析或进一步处 理。

进行磁性分离的设备可以为任何产生磁场的设备(如这里所述设备或 贮器)。在一个实施方案中，用MACS柱实现改变磁性的分析物的分离。 如果通过试剂(例如使用这里所述任何试剂)使分析物产生了磁性应答， 它可以结合到MACS柱上，从而进行期望分析物相对于样本中其它组分的 富集。

在另一个实施方案中，分离可以通过使用设备实现，所述设备优选包 含多个磁性障碍物的微流体设备(rnicrofluidic device)。如果样本中的分 析物被改性为磁性应答的(如利用增强分析物本身磁性的试剂或分析物与 磁性应答颗粒结合)，样本就可以结合障碍物，由此可以实现被结合分析 物的富集。另一种选择是使用负选择。在这个示例中，可以使期望分析物 磁性不应答，或者将不期望的分析物与磁性应答颗粒结合。这种情况下， 不期望的一个或多个分析物被截留在障碍物上，而期望分析物不被截留， 这样可以富集样本获得期望分析物。

设备的磁性区域可以利用硬的或软的磁性材料制造，所述磁性材料包 括但不局限于：稀土元素材料、钕-铁-硼、亚铁-铬-钴、镍-亚铁、钴-铂和 锶亚铁盐。设备的一些部分可以直接利用磁性材料材料制造，或所述磁性 材料可以应用至另一材料。使用硬磁性材料可以简化设备的设计，因为它 们可以不需要其它刺激而产生磁场。然而，软磁性材料通过使其消磁，能 够使被结合的分析物的释放和下游处理变得简单。根据磁性材料，所述应 用过程可以包括阴极溅射、烧结、电解沉淀、粘合剂聚合体-磁性粉末复合 体的薄膜包被。优选实施方案为微机械加工的障碍物(如硅柱)的薄膜包 被，其通过利用多聚物复合体如聚酰亚胺-锶亚铁盐(聚酰亚胺作为结合剂， 锶亚铁盐为磁性填料)旋转浇铸。包被之后，固化聚合物磁性涂层以获得 稳定的机械特性。固化后，将设备短时间置于外部感应场，其决定设备中 优选的永久磁性方向。来自柱的磁性区域的磁通密度和本身的矫顽磁性可 以通过磁性填料的体积百分比控制。

在另一个实施方案中，电传导材料微图形处理(micropattemed)在所 围绕的微流体设备的外表面上。这种图形可以由空间周期性大约100微米 的单个电路组成。通过控制这个电路的布局和经过该电路的电流强度，可 以在所围绕的微流体设备内产生较高和较低磁场强度的周期区域。

磁性颗粒可以不均匀地放置于设备各处或放置于空间上被分辨的区 域。此外，磁性颗粒可以用来在设备内部形成某种结构。例如，通道相对 侧的两个空间区域可以用来吸引磁性颗粒形成连接所述两个区域的“桥”。

正如所阐述的，本发明的特征在于分析设备用于富集分析物如细菌、 病毒、真菌、细胞、细胞组分、核酸、蛋白、蛋白复合体、碳水化合物和 以上的片段或组合(嵌合体)。除了改变磁性之外，本设备可以用于实现 对样本中多种分析物的操作。这些操作包括富集或浓缩颗粒，包括基于尺 寸的分级或颗粒本身或携带有颗粒的流体的改造。优选情况是，所述设备 用于从异质混合物中富集稀有分析物(稀有细胞)或者用于改变稀有分析 物，例如通过更换混悬液内的液体或者通过将分析物与试剂接触的方式。 这些设备允许高度富集以及对细胞有限的压力，例如减少的细胞机械裂解 或细胞内激活作用。

虽然主要以细胞为例进行了阐述，本发明的设备可以用于任何其尺寸 在本发明的设备内可以分离的分析物。

本发明的设备可以用于已经浓缩的样本，例如其中分析物彼此接触、 水动力相互作用，或者对其它分析物周围的流动分布产生影响。例如本方 法能够从血液样本中将红细胞和白细胞分离开来。人类血液通常含有45％ 体积的细胞。当细胞流过阵列时，它们彼此水动力地物理接触和/或偶联。

本发明的方法可以包括根据一个或多个分析物的磁性从样本中分离 一个或多个分析物。在一个实施方案中，用改变分析物磁性的试剂处理样 本。这种改变可以由磁性颗粒介导。在一个示例中，颗粒(如磁性颗粒) 可以结合到设备的表面，样本中的期望分析物(如稀有细胞胎儿细、病原 体细胞、癌细胞或细菌细胞)可以被截留到设备内。这样，一种或多种感 兴趣的分析物就被结合到设备的表面。在另一个实施方案中，期望分析物 根据基于尺寸、形状或可变形性的机制被截留到设备内。在另外一个实施 方案中，利用负选择，在此期望颗粒不被磁性颗粒结合。任一实施方案都 可以使用MACS柱贮留分析物(如结合到磁性颗粒上的分析物)。在正选 择的情况下，需要至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的分析 物被截留在设备内。需要设计设备表面使非目的分析物的非特异性结合最 小化。例如，至少99％、98％、95％、90％、80％或70％的非目标分析物 不被截留在设备内。设备中的选择性截留可以促成来自混合物如血液、唾 液、以及土壤、空气或水样的特异性分析物群的分离。

分析物的选择性贮留可以通过在本发明的设备中引入磁性颗粒来实 现。捕获性部分可以结合到磁性颗粒上以影响目标分析物的特异性结合。 在另一个实施方案中，可以排列磁性颗粒使其仅允许具有所选尺寸、形状 或可变性的分析物通过设备。也可以考虑这些实施方案的组合。例如，可 以装配设备使其根据尺寸截留某些分析并且根据结合截留其它分析物。另 外，还可以设计设备使其结合的感兴趣分析物多于一种，其结合的区域为 设备内串联、并联或散布排列的区域，或者其中两个或多个捕获性部分排 列在同一个或相邻的磁性颗粒上，例如结合在相同的障碍物或区域内。另 外，可以在设备中使用特异针对一个分析物的多个捕获性部分(如抗CD71 和抗CD36)，其在同一个或在不同的磁性颗粒上，例如位于同一个或不同 的障碍物或区域内。

磁性颗粒可以被附着在设备中存在的障碍物(或操作所产生的障碍 物)上，以增加与分析物相互作用的表面积，提高结合的可能性。流动条 件通常为使分析物在设备中被轻柔处理以防遭到损伤。可以利用正压力或 负压力泵或来自流体柱的流动将分析物转移到和转移出本发明的微流体 设备。设备能够轻柔处理，同时使每个分析物与一个或多个磁性颗粒的碰 撞频率最大化。目标分析物与任何与磁性颗粒碰撞的捕获性部分相互作 用。捕获性部分可以作为磁场吸引的设定结果与障碍物共定位于设备内。 这种相互作用引起目标分析物在特定位置的捕获和截留。或者，分析物由 于不能流过设备而被截留，例如由于尺寸、形状或变形性。被捕获的颗粒 可以通过截留磁性颗粒的磁性区域的去磁而被释放。为了分析物从区域内 选择性释放，去磁可以限定在选择的障碍物或区域内。例如，磁场可以设 计为电磁，这样能够按需要为每个单独的区域或障碍物打开和关闭磁场。 在其它实施方案中，可以通过破坏分析物和捕获性部分的结合，如通过化 学裂解或破坏非共价相互作用，释放分析物。例如，一些亚铁颗粒通过DNA 连接子连接到单克隆抗体上，使用DNA酶可以将分析物从亚铁颗粒上分 开并且释放出来。或者，使用抗体片段化蛋白酶(如木瓜酶)进行选择性 释放。提高磁性颗粒上的剪切力(sheer force)也可以用于从磁性区域释放 磁性颗粒，尤其是硬磁性区域。在其它实施方案中，被捕获的分析物不被 释放且能够在截留时被催化或做进一步处理。

在一个实施方案中，装配设备以从复杂的混合物中捕获和分离表达转 铁蛋白受体的细胞。容易获取现货的CD71的单克隆抗体，其与磁性物质 偶联，所述磁性物质例如但不限于掺亚铁聚苯乙烯和亚铁颗粒或亚铁-胶体 (例如来自Miltenyi和Dynal公司)。结合到磁性颗粒上的CD71的mAB 流入到设备中。该抗体包被颗粒被送至障碍物(如柱)、底部和边缘壁并 且被颗粒和磁场的之间的磁场相互作用力截留。通过清洗去除障碍物之间 的以及被远离障碍物的局部磁场的作用松散截留的颗粒(可以调整流速这 样离开障碍物的分析物的流体剪切应力大于磁场强度)。

除了以上实施方案之外，设备可以用于分离和检测血源性病原体、细 菌和病毒载量、溶液基质中溶解的气传病原体、食品工业的病原体检测以 及化学和生物危害的环境取样。另外，磁性颗粒可以和捕获性部分以及候 选药物化合物共定位。可以进一步分析感兴趣细胞的捕获以了解捕获细胞 和固定药物化合物的相互作用。因此本设备可以用于从复杂混合物中分离 细胞亚群以及分析它们同候选药物化合物之间的反应，以用于药物发现过 程中候选化合物的高通量和基于细胞的二级筛选。在其它实施方案中，用 于药物发现的受体-配体相互作用研究可以在本设备中完成，方法是将捕获 性部分如受体定位至磁性颗粒上并送入候选配体(或激动剂或拮抗剂)的 复杂混合物中。感兴趣受体被捕获并且可以检测结合，例如通过荧光探针 的二级染色。本实施方案能够迅速鉴定从组织或细胞消化液中抽提的复杂 混合物中已知配体的存在与否以及候选药物化合物的鉴定。

与尺寸分离偶联的捕获

在这里的实施方案中，优选基于尺寸的分离组件和捕获组件流体连 接。例如分离组件的第一出口可以与捕获组件流体连接。样本通过捕获组 件的平均流速可以与其在分离组件中的平均流速相同或不同。在一些实施 方案中。通过捕获组件的平均流速大于1、2、3、4、5、10、15、20、30、 40、50、60、70、80、90或100mL/小时。

在一些实施方案中，可以整合分离组件和捕获组件，以使大多数障碍 物既可以根据尺寸偏转某些分析物并以不同于感兴趣分析物的方向的通 路引导它们，还可以作为捕获组件根据尺寸、亲合性、磁性或其它物理性 质去捕获、截留或结合某些分析物。

III检测/分析

在这里的任何实施方案中，富集分析物(如稀有细胞)或它们的组分 (如细胞核或染色体)的检测和/或分析可以通过完全或部分由人员或分析 仪进行。当富集分析物为细胞时，可以在检测/分析前对细胞进行渗透或裂 解。本发明的分析仪可以自动地高通量分析/检测富集分析物(如血液中的 稀有细胞或生物危险分析物)。利用分析仪的检测和分析可以以连续的步 骤进行或者可以整合为一个步骤。优选情况是，检测和分析在一个步骤中 进行。

分析仪可以包括本领域已知的任何样本分析设备，如显微镜、微阵列、 细胞计数器等。分析仪还可以包括一个或多个计算机、数据库、存储系统 和输出系统(如计算机屏幕或打印机)。在优选实施方案中，分析仪包括 计算机可读介质如软盘、CD-ROM、硬盘、闪存、磁带或其它数字存储介 质，和包含针对富集分析物进行的检测或分析的一套指令的程序编码。在 一些实施方案中，分析仪的计算机可执行逻辑或程序编码存储在存储介质 中，通过计算机装载和/或执行，或者传送到一些传送介质中，如电气配线 或接线电缆、光纤、或电磁辐射。当应用在普通的微处理器上时，计算机 可执行逻辑装配微处理器以产生特定逻辑电路，优选计算机可执行逻辑执 行一些或所有这里阐述的任务包括分离、富集、检测和/或分析。

在一些实施方案中，分析仪与基于尺寸的分离组件或捕获组件流体连 接。在一些实施方案中，富集分析物(如感兴趣细胞)从捕获组件/基于尺 寸的分离组件上移出并且被传送至载玻片或细胞分离设备以便分析。在优 选实施方案中，细胞分离设备允许将大多数分析物(例如细胞)中每个保 持在一个可寻址的位置。这种实施方案的实例公开于6,692,952，号美国专 利，其通过引用结合入本文。这种组件还可以包括适合从可寻址位置选择 性释放细胞的执行器。

在一些实施方案中，装配分析仪以执行检测步骤，如肉眼观察一个或 多个分析物。感兴趣分析物的肉眼观察可以通过透明掩蔽物或盖子发生， 其掩盖在基于尺寸的分离组件和/或捕获组件中的障碍物上。在一些实施方 案中，分析仪包含显微镜如光学显微镜、明视野光学显微镜、荧光显微镜、 电镜等(优选其与捕获组件偶联)。在一些实施方案中，分析仪具有双重 扫描功能(如利用光学显微镜和荧光显微镜)。优选分析仪提供富集分析 物(包括感兴趣分析物)的三维图像。例如，计算机编码可以检测富集样 本中包括胎儿红细胞在内的所有有核红细胞。在一些实施方案中，分析仪 包括显像设备如照相机或摄影机。例如，显像设备可以捕获一个或多个从 母体血液样本中获取的fhRBC的图像。以上任何都可以通过影像和保留富 集分析物图像的计算机可执行逻辑得到控制。

在一些实施方案中，装配分析仪以执行分析步骤如计算如癌细胞、内 皮细胞、上皮细胞等的感兴趣分析物。这种分析仪可以包括例如细胞计数 器。样本中检测的感兴趣分析物的数量可以被分析仪或者使用者用于病情 (如肿瘤)诊断和预测。在一些实施方案中，分析仪比较(和随意储存) 所收集的数据和已知数据。在一些实施方案中，分析仪比较(和任选储存) 从病例样本数据的数据和对照数据并且进行关联性研究。

在一些实施方案中，分析仪包括计算机可执行逻辑，其检测来自与富 集分析物、感兴趣分析物或它们的组分特异性结合的一个或多个探针的探 针信号。在一些实施方案中，针对信号的强度、尺寸、形状、长宽比和/ 或分布，计算机可执行逻辑对这些信号进行分析。然后计算机可执行逻辑 可以产生基于探针信号分析结果的命令。

其信号可以被分析仪检测/分析的探针的示例包括但不限于荧光探针 (如用于胎儿细胞中X、Y、13、18和21号染色体的染色)、生色探针、 间接免疫物质(如与二级酶偶联的未标记一级抗体)、量子点或其它发射 光子的探针。在一些实施方案中，这里的分析仪检测比色探针，与荧光探 针相比其能够提供显著增快的阅读时间。在一些实施方案中，分析仪包含 计算机可执行逻辑，其进行核型分型、原位杂交(ISH)(如荧光原位杂 交(FISH)、显色原位杂交(CISH)、纳米金原位杂交(NISR))、限制性 片段长度多态性(RFLP)分析、聚合酶链式反应(PCR)、流式细胞术、 电镜技术、量子点和检测单核苷酸多态性(SNP)或RNA水平的核酸阵列。 在一些实施方案中，使用两个或多个探针。例如，多个FISH探针或其它 DNA探针可以用于分析感兴趣的单个细胞或组分。使用FISH检测稀有细 胞的方法公开在Zhen、D.K等人1999年在Prenatal Diagnosis 18(11)：1181 -1185页发表的文章和Cheung、MC1996年在Nature Genetics 14：264-268 发表的文章，其均通过引用结合入本文。CISH的使用方法公开在Arnould 和L.等人2003年在Journal of Cancer 88：1587-1591页发表的文章和 2002/0019001号美国申请案，其均通过引用结合入本文。

例如，当分析从母体血液中富集的胎儿细胞时，装配分析仪以检测胎 儿细胞或它们的组分。在一些实施方案中，利用胎儿细胞或其组分的分析 确定胎儿性别，遗传异常的存在与否(如染色体/DNA/RNA异常)，或者 一个或多个SNP。可以通过这里的分析仪检测常染色体异常的示例包括但 不限于帕-魏二氏综合征(15q 11.2-q13)、猫叫综合征(Cri-du-chat，5p-)、 戴乔治综合征和软腭-心-面综合征(22q11.2)、米-迪综合征(17p13.3)、安裘 曼氏综合征(Angehnan syndrome，15q11.2-q13)、眼癌(13q14)、史密斯-马 吉利氏综合征(17p11.2)、13三体、16三体、18三体、21三体(唐氏综 合征)、三倍体、威廉斯综合征(7q 11.23)、沃尔夫综合征(WoIf-Hirschhorn syndrome，4p-)。可以通过这里的分析仪检测性染色体异常的示例包括但 不限于卡尔曼综合征(Xp22.3)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS)(Xp22.3)、X 连锁鱼鳞病(Xp22.3)、克兰费尔特综合征(XXY)、脆性X染色体综合征、 特纳综合征、超雌或x三体、X单体等。可以通过这里的分析仪检测/分析 的其它不太常见的染色体异常的示例包括但不限于缺失(小片段丢失)、 微缺失(小量丢失可能包括单个基因的物质)、异位(部分染色体附着到 另外一个染色体上)和倒位(部分染色体被剪掉并重新颠倒插入)。

在一些实施方案中，分析仪检测的分析物(如细胞)被选自γ和ε球 蛋白、血型糖蛋白A(GPA)、i抗原和CD35的抗原染色。特别地，这里 的分析仪可以检测被抗6或抗γ球蛋白抗体或者它们的组合染色的细胞。 在95-100％的10-24周妊娠的fNRBC上发现γ和ε球蛋白的组合。Al Mufti 等人2001年Haematologica 85：357-362；Choolani等人2003年MoI.Hum. Reprod 9：227-235。已经表明ε-γ组合或γ球蛋白独自染色fNRBC。参见 See Bohmer(1998)；hoolani等人(2003)；Christensen等人，2005年Fetal Diagn.Ther.20：106-112，和Hennerbichler等人2002年Cytometry 48： 87-92。针对两种球蛋白的抗体已经为本领域内的专业人员所熟知并且可以 从多个供应商那里获得。染色可能导致二进制得分如阳性或阴性或者表明 分析物中抗原数量的各种强度。

在一些实施方案中，分析仪检测GPA和/或CD71染色的分析物(如 细胞)。GPA存在于整个红细胞系中。因此，它可以不顾有核红细胞的成 熟水平而对它们进行鉴定。认为GPA仅存在于红细胞系细胞上，通常发 现其存在于极少的循环细胞上，并且在妊娠过程中增加。FACS分选已经 表明妊娠过程中CD71和GPA共同存在于至少0.15％的单核细胞上。Price 等人1991年Am.J.Obstet Gynecol 165：1713-1717；Sohda等人1997年 Prenat.Diagn 17：743-752。在一些实施方案中，装配分析仪用于检测特异 性针对CD71和GPA的探针。

在一些实施方案中，分析仪检测i抗原染色的分析物(如细胞)。20 世纪50年代利用病人的多克隆血清首次对i抗原进行了阐述。随后的数据 表明成人和胎儿细胞中分别表达两种形式的“i”或“I”抗原。最新的结构方面 的证据已经将这些抗原定义为直链和支链重复的N-乙酰基乳糖胺。“i”结构 是两个酶作用的结果，β-1，3-N-乙炔葡萄糖氨基转移酶和β-1，4-半乳糖转移 酶。″i″抗原向“I”抗原的转变通过β-1，6-N-乙炔葡萄糖氨基转移酶完成。最 近已经鉴定出这些酶的基因和染色体位点。Yu等人2001年Blood 98： 3840-3845。最近已经产生了i抗原的抗体。i抗原的抗体已经用于胎儿细 胞领域的前期工作中。Kan等人，1974年Blood 43：411-415。它们最近 也被用于差异密度离心获得的胎儿细胞的筛选。Sitar等人，2005年Exp. Cell.Res.302：153-161。因此，特异性与i抗原结合的抗体或抗体片段通 过这里的方法和混合物可以用于富集、分离和检测胎儿细胞。另外，i抗 原在母体血液样本中鉴定出更多的胎儿细胞(Sitar等人)并且提高了结果读 取的速度。

在一些实施方案中，分析仪包括计算机可执行逻辑或计算机程序编 码，其提供一套鉴定/表征稀有分析物的指令，如富集样本中的稀有细胞。 该编码可以进一步提供用于影像这些稀有分析物和存储这些图像的指令。 在一个示例中，计算机可执行逻辑引导显微镜鉴定稀有细胞(如胎儿相比 或上皮细胞)。该编码还可以提供一套指令用于鉴定与这些稀有细胞或其 组分选择性结合的探针，如特异性结合ε球蛋白、γ球蛋白、胎儿血红蛋 白、GPA、i抗原、CD71、EpCAM或它们的组合的抗体。

例如，在一些实施方案中，计算机可执行逻辑提供指令以鉴定样本中 胎儿有核红细胞；鉴定和计数稀有细胞的组分如染色体；检测与13、18、 21、X和/或Y染色体特异性结合的探针；检测一个或多个单核苷酸多态性 (SNP)；检测基因序列中的突变；检测mRNA的水平；检测小RNA的 水平等等。计算机可执行逻辑也可以包括检测和/或比较探针强度的指令的 编码，如来自结合胎儿感兴趣核酸(如染色体X、Y、13、18或21)的一 个或多个探针

图9A-D显示本发明的一个实施方案。图9A显示与显微镜偶联的计 算机，该显微镜与载玻片或细胞阵列组件偶联。该显微镜分析载玻片或细 胞阵列中的细胞。图9B显示明视野显微镜下观察到的细胞。图9C显示一 种XXY细胞。图9D显示视野下的细胞的图像。它也显示这里的检测各种 水平的探针强度的编码的各种特征。

在任何实施方案中，分析仪包含控制样本流过一个或多个这里的组件 的流速的计算机可执行逻辑。

IV应用

这里的设备/组件和方法可以用于多种应用，包括但不限于那些已经公 开的应用。

产前诊断

在一些实施方案中，这里的系统和方法可以用来进行产前诊断。例如， 可以获取来自妊娠动物(优选人)的外周血样本并且利用这里所公开的一 个或多个方法和设备进行富集。母体血液样本优选利用一个或多个尺寸组 件进行第一次富集以将血液样本中流体动力学尺寸大于4微米的分析物 (如胎儿有核红细胞和母体白细胞)从其它分析物(如无核红细胞和血小 板)分离开来。接着，含胎儿有核血细胞和母体白细胞的富集样本进一步 利用一个或多个捕获组件进行分离。优选情况是，捕获组件正选择(选择 性地可逆结合)白细胞以外的胎儿血细胞。这种捕获组件最好不使用磁性 颗粒。在一些实施方案中，捕获组件包括一个或多个抗CD71单克隆抗体 包被的障碍物阵列。被这种阵列捕获的细胞接着利用一个或多个FISH试 验、PCR扩增、RNA分析、DNA分析等进行基因分析。在一些实施方案 中，可利用FISH试验检测富集胎儿细胞中一个或多个SNP或检测mRNA 水平。包含检测所述分析物胎儿细胞的计算机可执行逻辑的分析仪可以用 于系统自动化。分析仪还可以包括显微镜或微阵列。

b、癌症诊断

在一些实施方案中，这里的系统和方法可以用于进行癌症诊断。例如， 可以从怀疑或已知患有癌症的动物体内获取外周血样本或其它流体样本。 该样本可以流过一个或多个基于尺寸的分离组件以从流体动力学尺寸大 于8、10、12、14、16、18或20微米的样本分析物中分离分析物。在一 些实施方案中，富集细胞可以是选自WBC、干细胞、祖细胞、上皮细胞、 内皮细胞、子宫内膜细胞、肿瘤细胞和癌细胞的一种或多种细胞。在一些 实施方案中，富集分析物可以任选流过一个或多个这里所述捕获组件。

然后富集细胞可以进行分析以确定如样本中上皮细胞的数量、样本中 内皮细胞的数量、样本中上皮/内皮细胞的比例、大于临界尺寸的细胞的分 布、大于临界尺寸的所有细胞的移动模式和不同时间点获取的至少一个第 二样本的这些特征的变化。

在一些实施方案中，分析可以包括将所富集的细胞应用于一个或多个 捕获组件，其选择性捕获某种特殊尺寸范围的细胞或选择性结合感兴趣细 胞(如表面表达一个或多个癌标记的癌细胞或上皮细胞)。在一些实施方 案中，可以进一步分析富集细胞以确定细胞内癌标记的存在与否。这里的 任何实施方案都可以进一步包含使用分析仪检测、计数和分析细胞。

其诊断和预测为本发明所关注的肿瘤病症包含从以下组中选出的肿 瘤病症：乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、 胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织 癌、头癌、颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、扁平细 胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细 胞癌、小细胞肺肿瘤、胆石瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性以及慢 性淋巴和粒细胞瘤、毛样细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘 膜神经瘤、间质神经节瘤增生的角膜神经瘤、马方体质瘤、威尔姆氏肿瘤、 精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、颈发育异常和原位瘤、成神经细胞瘤、 眼癌、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、真菌瘤、横纹肌肉瘤、 卡波济肉瘤、成骨性肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、 腺癌、成胶质细胞瘤多样性、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、 骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、恶性黑色素瘤和表皮样癌。

c、兽医诊断

在一些实施方案中，这里的系统和方法可以用来进行兽医诊断。兽医 诊断可以包括从动物获取流体样本(如血液样本)，优选驯养动物。驯养 动物包括但不限于牛、鸡、猪、马、兔、狗、猫、鱼、和山羊。然后样本 通过一个或多个基于尺寸的分离组件进行富集，以从单一流体动力学尺寸 如大于4、6、8、10、12、14、16、18或20微米或一个流体动力学尺寸 范围内(如6-12微米或8-10微米，等)的样本分析物中分离分析物。在 分析之前被富集的分析物可以任选进行一个或多个附加的富集步骤。例 如，在一些实施方案中，被富集的分析物可以任选流经一个或多个这里阐 述的捕获组件。

在一些实施方案中，从样本中富集的分析物为胎儿细胞。然后分析这 种细胞确定胎儿的性别或胎儿的疾患。

在一些实施方案中，从样本中富集的分析物为病原体。可以从动物体 内富集的病原体实例包括但不限于细菌、病毒和原生动物(当然这些应用 不限于驯养动物，也可以用于人类)。富集之后，利用这里关注的检测/ 分析仪分析细胞。这种分析仪可以进行革兰氏阳性试验、病毒载量试验、 FISH试验、PCR试验等以确定感染的病原体的类型、来源、治疗方案等。

在一些实施方案中。从样本中富集的分析物为上皮细胞或循环癌细 胞。可以进一步分析这种细胞以确定动物的癌症、疾患的严重程度和治疗 处理的效果等。

d、生物防御

在一些实施方案中，这里的系统和方法可以作为生物防御或检测生物 危害物质的存在(如生物危害性分析物)。生物危害性分析物包括但不限 于对人类、动物或植物有传染性的有机体(如寄生虫、病毒、细菌、真菌、 蛋白感染素、立克次氏体)；细胞组分(如重组DNA)；可以在其它活体 中引起疾病的或对环境或公众产生显著影响的生物活性物质(如毒素、变 态反应原、毒液)。可能为生物危害性分析物的病原体包含从以下组中选 择的病原体：鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌、兔热病杆菌、 立克次氏体、布鲁氏菌、鼻疽伯氏菌、类鼻疽伯氏菌、链球菌、埃博拉病 毒、拉沙病毒、SARS、重型天花病毒、甲病毒、普氏立克次氏体、鹦鹉 热衣原体、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌、小球隐孢子虫、尼 帕病毒(Nipah virus)、汉坦病毒和它们的嵌合体。可以利用这里的系统 和方法检测生物危害性物质，例如食物样本、水样本、空气样本、土壤样 本或来自动物或植物的生物样本。

在一些实施方案中，利用这里的方法和系统分析的样本可以含生物危 害性分析物，其相对于样本中总分析物的比例小于1％、0.1％、0.01％、 0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％。另外，在任何实施方案中， 生物危害性分析物的初始浓度可以小于5、2、1、5x10-1、2x10-1、1x10-1、 5x10-2、2x10-2、1x10-2、5x10-3、2x10-3、1x10-3、5x10-4、2x10-4、 1x10-4、5x10-5、2x10-5、1x10-5、5x10-6、2x10-6、1x10-6、5x10-7、 2x10-7或1x10-7生物危害性分析物/μL流体样本。当分析非流体样本时， 优选通过本领域已知的任何方法溶解或液化所述样本。

针对生物危害性分析物的分析样本流过一个或多个这里的基于尺寸 的分离组件。优选情况是，所述基于尺寸的分离组件提高生物危害性分析 物的浓度至少1000或10,000倍。富集分析物还可以任选流过一个或多个 这里阐述的捕获组件。

富集之后，利用分析仪进一步分析生物危害性分析物。分析仪随意包 含显微镜、微阵列、细胞计数器、进行革兰氏试验的试剂、进行病毒载量 分析的试剂(如PCR试剂)等。

e、研究

这里的系统和方法还可以用于进行研究。例如，在一些实施方案中， 这里的系统和方法根据从多个对照样本和多个病例样本收集的数据用来 进行关联性研究。例如，可以从大于10、20、50或100的病例个体(带 有表型症状的个体)和大于10、20、50或100的对照个体(不呈现表型 症状的个体)中收集流体样本(如血液)。然后可以富集每个个体的样本 以获取第一或多个分析物。接着这些分析物可以被计数和/或特征化。收集 以上步骤的数据并且接着用来进行关联性研究。数据优选存储于电子数据 库中。可以利用计算机可执行逻辑进行关联性分析以鉴定与病例或对照样 本相关的一个或多个特征。

在优选实施方案中，从个体获取的用于关联性研究的流体样本为血液 样本。在优选实施方案中，从这些样本中富集的分析物的流体动力学尺寸 大于4微米，或大于6、8、10、12、14或16微米。在一些实施方案中， 从个体获取的样本被富集以得到选自RBC、胎儿RBC、滋养母细胞、胚 胎成纤维细胞、白细胞(WBC)、被感染的WBC、干细胞、上皮细胞、 内皮细胞、肿瘤细胞、病毒细胞、细菌细胞和原生动物的一种或多种细胞。 富集的细胞优选那些体内浓度小于1x10-1、1x10-2或1x10-3个细胞/μL. 的细胞。优选情况是，至少99％的来自样本的感兴趣细胞(那些被富集的 细胞)被截留。为了进行关联性研究的富集可以提高感兴趣第一细胞类型 的浓度至少10,000倍。

然后分析富集分析物以确定一个或多个特征。所述特征可以包括例如 样本中分析物的存在或不存在，分析物的数量，两种分析物(如内皮细胞 和上皮细胞)的比例，一种或多种分析物的形状，分析物的基因型，分析 物的蛋白质组，分析物的RNA组成，分析物中的基因表达，小RNA的水 平或富集分析物的其它特征特性，其接着用于进行关联性研究。

当特征与对照样本相关联时，这种特征可以接着用做受检患者不存在 表型疾患的诊断。当特征与病例样本相关联时，它可以接着用做受检患者 存在表型疾患的诊断。

本发明关注的表型疾患的示例包括但不限于癌症、子宫内膜异位、感 染(如HIV、细菌等)、炎症、局部缺血、外伤、胎儿异常等。

V试剂盒

本发明关注从流体样本中富集分析物的试剂盒。在一些实施方案中， 这种试剂盒可以包括例如一种或多种分离组件，所述分离组件任选同适合 从母体血液样本中富集胎儿血液的捕获组件偶联。

富集胎儿细胞的分离组件优选的灵敏度和灵敏度大于98％或99％。在 一些实施方案中，一个或多个捕获组件与分离组件流体连接。优选地，分 离组件和捕获组件在同一个基底上。这里的试剂盒还可以包括一套分析富 集胎儿细胞的指令，以做出产前诊断。可以利用这里的试剂盒进行的产前 诊断的示例包括但不限于胎儿性别、13三体、18三体、21三体(唐氏综 合征)、特纳综合征(X染色体受损)、克兰费尔特综合征(XXY)或其 它的性染色体或常染色体数目不规则的存在，或者存在选自沃尔夫综合征 (4p-)、猫叫综合征(5p-)、威廉斯综合征(7q11.23)、帕-魏二氏综合征 (15q11.2-q13)、安裘曼氏综合征(15q11.2-q13)、米-迪综合征(17p13.3)、 史密斯-马吉利氏综合征(17p11.2)、戴乔治和软腭-心-面综合征(22q11.2)、 卡尔曼综合征(Xp22.3)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS)(Xp22.3)、X连锁鱼 鳞病(Xp22.3)和眼癌(13q14)的疾患。

在一些实施方案中，这里的试剂盒包含一个或多个分离组件，所述分 离组件任选与适合富集来自血液样本的上皮细胞或癌细胞的捕获组件偶 联。这些组件优选具有灵敏度和特异性大于98％或大于99％。优选分离组 件和捕获组件在同一个基底上，这里的试剂盒还可以包括设计的一个或多 个标记以检测癌症起源、癌症转移、治疗的效果、预后等。这些试剂可以 包括与细胞表面癌标记特异性结合的抗体。这里的试剂盒还可以包括一套 分析富集胎儿细胞的指令以进行癌症诊断。

利用这里的方法可以诊断的癌症的示例包括但不限于乳腺癌、皮肤 癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠 癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头癌、颈癌、结肠 癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、扁平细胞癌、转移性皮肤癌、 骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞癌、小细胞肺肿瘤、 胆石瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性以及慢性淋巴和粒细胞瘤、毛 样细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、间质神经节 瘤增生的角膜神经瘤、马方体质瘤、威尔姆氏肿瘤、精原细胞瘤、卵巢肿 瘤、平滑肌瘤、颈发育异常和原位瘤、成神经细胞瘤、眼癌、软组织肉瘤、 恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、真菌瘤、横纹肌肉瘤、卡波济肉瘤、成骨性 肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、成胶质细胞 瘤多样性、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、骨髓增生异常综 合征、淋巴瘤、恶性黑色素瘤和表皮样癌。

V企业方法

这里的系统和方法可以用于进行诊断服务和/或销售诊断产品。诊断产 品可以包括例如一个或多个基于尺寸的分离组件、一个或多个捕获组件、 检测器、分析仪或它们的组合。

诊断服务-产前

在一些实施方案中，这里的企业方法包括提供产前筛选服务。这种企 业关注于从受诊胎儿的母体内获取血液样本。在一些实施方案中，企业或 者可以从妊娠患者(动物)体内抽取血液或者接收来源于妊娠患者的血液 样本。这里的企业富集来自血液样本的细胞并且针对胎儿细胞进行一个或 多个筛选试验以确定胎儿的疾患。可以确定的疾患的示例包括但不限于沃 尔夫综合征(4p-)、猫叫综合征(5p-)、威廉斯综合征(7q11.23)、帕-魏二 氏综合征(15q11.2-q13)、安裘曼氏综合征(15q11.2-q13)、米-迪综合征 (17p13.3)、史密斯-马吉利氏综合征(17p11.2)、戴乔治和软腭-心-面综合 征(22q 11.2)、卡尔曼综合征(Xp22.3)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(STS) (Xp22.3)、X连锁鱼鳞病(Xp22.3)和眼癌(13q14)。本发明还关注所有其它遗 传疾患。

企业方法然后提供一份疾患报告来换取服务费。该报告可以或者直接 提供给受检患者、健康护理提供者或患者的保险公司或政府。

在一些实施方案中，企业批准CLIA实验室进行富集和分析步骤。在 其它实施方案中，企业进行富集步骤并且批准第三方(如CLIA实验室) 进行分析步骤(如基因检测)。

图10A显示这里公开的试验化方法的一个示例。这里的企业、CLIA 实验室或者患者的健康护理提供者从孕妇体内抽取血液样本(如16-20mL 血液)。这里的企业或CLIA实验室进行以下一个或多个步骤：(a)使样 本从适合从样本中移走红细胞和血小板的基于尺寸的分离组件中流过； (b)将样本流过与抗CD71抗体偶联的捕获组件，并且相对于白细胞而选 择性结合红细胞；(c)利用磁性微珠富集样本(如包被CD71重复之前进 行的富集步骤)；(d)排列被富集的细胞(如cytospin二维载玻片)；(e) 在富集细胞中加入一个或多个FISH探针，如那些特异性结合X和/或Y染 色体的探针；(f)利用分析仪/检测组件检测FISH探针；(g)鉴定来自富集 细胞的有核红细胞或更优选胎儿有核红细胞，并且任选对它们进行表征； 并且(h)例如为受检患者、健康护理提供者或保险公司提供诊断胎儿是 否存在胎儿异常的报告。

图10B显示这里公开的企业方法的另一个示例。从孕妇体内抽取32-40 mL血液样本。使样本从适合从样本中移走红细胞和血小板的自动的基于 尺寸的分离组件中流过。自动的基于尺寸的分离组件与传送设备偶联。然 后样本流过与抗GPA抗体偶联的捕获组件。然后利用磁性微珠(如包被 CD71重复之前进行的富集步骤)富集样本。剩余的富集细胞被排列到具 有针对X、Y、13、18和21号染色体的FISH探针的cytospin二维载玻片 上。然后FISH探针利用这里阐述的分析仪/检测组件或优选多谱成像系统 自动读数，以对有核RBC进行鉴定和分类。最后，为受检患者、健康护 理提供者或保险公司产生诊断胎儿是否存在胎儿异常与否的报告。

诊断服务-肿瘤

在一些实施方案中，这里的企业方法关注于提供肿瘤筛选服务。企业 关注于从受诊患者体内获取流体样本(如血液)。然后企业针对样本进行 一个或多个富集步骤以富集来自样本的一种或多种癌细胞、肿瘤细胞上皮 细胞、内皮细胞或其它表明癌症存在的细胞。可以利用这里公开的任何系 统和方法富集来自流体样本中的上述细胞。富集之后，可对细胞进行进一 步分析(如计数，针对特异生物标记的化验等)，以确定患者是否患癌症、 癌症的起源、患者的有效治疗、癌症的转移等。这里的企业可以直接提供 一份报告给受检患者或健康护理提供者或患者的保险公司。

诊断服务-感染

在一些实施方案中，这里的企业方法关注于提供感染筛选服务。这种 服务包括从待诊断感染的哺乳动物体内获取流体样本(如尿液或血液)。 在一些实施方案中，企业可以直接从患者(动物)体内抽取血液。在一些 实施方案中，样本被传送至企业。企业可以对样本进行筛选试验以从所述 样本中富集一种或多种受感染的细胞(如受感染白细胞)或感染生物体如 细菌细胞、病毒或原生动物。企业可以利用这里公开的方法和系统富集感 染生物体。可以利用这里的方法分离/富集的循环病原体的示例包括病毒 (如HIV、流感、SARS)，细菌(大肠杆菌、流行性感冒嗜血杆菌、肺 炎链球菌、脑膜炎球菌等)，和原生动物(疟原虫、布氏锥虫等)。在一 些实施方案中，这里的方法用于分离和检测血液样本中HIV感染的细胞。 这里的企业生成的报告可以直接提供给患者或健康护理提供者或患者的 保险公司。

诊断产品

在一些实施方案中，本发明的企业方法对适合从流体样本中富集一种 或多种分析物的试剂盒进行了商业化。例如，这里的一个企业方法关注于 单独地或以带有一个或多个试剂(如标记试剂)的试剂盒的方式销售这里 一个或多个设备/组件，以分离和任选分析胎儿细胞。这种试剂盒可以包括 做出产前诊断的说明书。这里的另一个企业方法关注于单独地或以带有一 个或多个试剂(如标记试剂)的试剂盒的方式销售一个或多个这里的/组件， 以分离和任选分析循环癌细胞。这种试剂盒可以包括做出癌症诊断的说明 书。这里的另一个企业方法关注于单独地或以带有一个或多个试剂(如标 记试剂)的试剂盒的方式销售一个或多个这里的/组件，以分离和任选分析 循环上皮细胞。这种试剂盒可以包括做出癌症诊断的说明书。这里的另一 个企业方法关注于单独地或以带有一个或多个试剂(如标记试剂)的试剂 盒的方式销售一个或多个这里的/组件，以分离和任选分析循环内皮细胞。 这种试剂盒可以包括做出癌症诊断的说明书。

在优选实施方案中，诊断产品包括一个或多个分离组件和任选的一个 或多个捕获组件。这种诊断产品可以任选包括检测疾患的检测/分析工具 (如计算机编码或软件)。

在一些实施方案中，这里的企业方法制造所述诊断工具。在一些实施 方案中，企业方法批准第三方制造所述诊断工具。这里的任一个实施方案 中，诊断工具优选用聚合材料制造，并且任选为一次性的。

分析物的分离

在一些实施方案中，企业方法利用这里的系统和方法分离一种或多种 分析物来换取费用或交叉许可。样本可以为例如血液样本或其它身体样 本。在一些实施方案中，CLIA实验室或其它第三方实体提供血液样本给 企业，利用这里的系统和方法从血液样本中分离稀有细胞如胎儿细胞、上 皮细胞或癌细胞。在一些实施方案中，企业从一个或多个个体获取血液样 本并且从血液样本分离一种或多种治疗性血液成份如血小板、白细胞、循 环干细胞等。这种血液成份然后可以由企业出售获取费用。这种血液产品 可以用于研究和/或治疗目的。

VII制造

在这个示例中，利用标准的光刻技术在绝缘体上硅晶片 (Silicon-on-insulator wafer，SOI)上生成障碍物的光致抗蚀剂图形 (photoresist pattern)。SOI晶片由100μm厚Si(100)顶层、1μm厚的 SiO2层和其下的500μm厚Si(100)晶片组成。为了优化光致抗蚀剂的粘连， 可以在光致抗蚀剂涂布之前将SOI晶片暴露在六甲基二硅烷基胺的高温气 体中。UV敏感的光致抗蚀剂被旋转涂布在晶片上，90℃烘烤30分钟，通 过接触式铬掩膜在UV光线下曝光300秒，在显影剂中显影5分钟，并且 90℃后烘(post-baked)30分钟。该过程的参数可以根据光致抗蚀剂的性 质和厚度改变。接触式铬掩膜的图形被转移到光致抗蚀剂上并且决定障碍 物的几何形状。

一旦形成与障碍物图形相同的光致抗蚀剂图形。就开始蚀刻。SiO2可 以作为蚀刻过程的终止剂。也可不使用终止层来控制蚀刻在某一个深度终 止。可以在电浆蚀刻系统中将光致抗蚀剂图形转移到100μm厚的Si层上。 多重深度蚀刻可以用于得到均匀的障碍物。例如，将基底(substrate)暴 露在富有氟的SF6电浆中15秒，然后将系统移到富有碳氟化合物的仅有 C4F8的电浆中保持10秒，这样使所有表面涂布有保护膜。在随后的蚀刻 循环中，暴露于离子轰击中将聚合物优选从水平表面清除，并且重复循环 直至例如到达SiO2。

为了在障碍物表面偶联结合性部分，基底可以在表面改性之前暴露在 氧电浆中以形成二氧化硅层，结合性部分可以附着在其上。然后可以用去 离子蒸馏水洗涤基底两次，并且空气中干燥。硅烷在暴露的玻片上的固定 可以通过将样本浸入新鲜配制的2％v/v的[3-(2-氨乙基)氨丙基]三甲 氧基硅烷水溶液中30秒，然后再用去离子蒸馏水洗涤。然后基底放于氮 气中干燥并烘烤。接着，基底浸入到2.5％v/v的戊二醛磷酸盐缓冲盐溶液 中1小时。然后再次清洗基底，并在常温下将其浸入到0.5mg/mL的结合 性部分如抗CD71的去离子蒸馏水溶液中15分钟以将结合性部分偶联到障 碍物上。然后可以用去离子蒸馏水洗涤基底两次，并且用70％的乙醇浸泡 过夜以杀菌。

除了以上阐述的方法之外，还有很多方法用于将结合性物质固定在障 碍物上和设备表面。为了简单化和成本，简单的物理吸附至表面也可以作 为一种选择。另一种方法可以使用利用各种结合性部分功能化的自装配单 层膜(如金上硫醇)。根据被结合的结合性部分和制造设备的材料也可以 用另外的一些方法。表面改性的方法为本领域已知的方法。另外，某些细 胞可能优选结合材料的未改性的表面。例如，一些细胞优选结合至带正电 荷、带负电荷或疏水表面或者与某种聚合物中存在的化学基团结合。

下面的步骤包括通过顶层与含有障碍物的单晶硅片结合产生流动设 备。基底的顶层可以为玻璃，以在捕获过程中和捕获之后视觉观察细胞。 热结合或UV固化环氧树脂都可用来产生流动小室。顶层和底层也可以为 压缩配合，例如，利用硅橡胶衬垫。这种压缩配合可以为可逆的。其它结 合(如水结合)的方法为本领域内已知的方法。可以根据所用材料的性质 运用方法。

可以用不同的材料制造细胞清除设备。根据所选择的材料也可以使用 不同的制造技术。该设备可以用塑料(如聚苯乙烯)通过热压印技术(hot embossing technique)制造。障碍物和必需的其它结构被压印入塑料内以形 成底面。顶层可以结合至底层上。注射成型为另一种可以用于制造这种设 备的方法。软刻蚀技术也可用于形成由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的整个 小室，或者仅用PDMS制造障碍物，然后将其结合到玻璃基底上形成封闭 的小室。另一种方法包括通过环氧树脂铸型技术利用UV或温度固化环氧 树脂在具有预期结构的阴模(negative replica)的模型上形成障碍物。激光 或其它类型的微加工方法也可以用于产生流体小室。其它可以用于制造所 述设备的合适聚合物为聚碳酸酯、聚乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。另外，金 属如钢、镍也可以用于制造本发明的设备，如通过传统的金属加工。三维 制造技术(如激光快速成型技术(stereolithography))可以用于制造一体 设备。其它制造方法为本领域已知的方法。

实施例

实施例1、14个三阶段阵列复体的多重硅设备

图11A-11F显示本发明基于尺寸的示例分离组件，其特征为以下：

尺寸：90mm x 34mm x 1mm

阵列设计：3个阶段，第一、第二和第三阶段的间隙大小分别＝18、12 和8μm。分支比(Bifurcation ratio)＝1/10。复体；单个旁路通道

设备设计：14个阵列复体的多重化；为了流动稳定性的流阻器

设备制造：利用硅通过标准的光刻技术和深度硅反应蚀刻技术制造阵 列和通道。刻蚀深度为150μm。利用KOH湿刻蚀产生流体进入孔。使用 与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795、3M、St Paul、MN)将硅基底密封 在被蚀刻的面上，以形成封闭的流体通道。

设备包装：该设备与带有外部流体贮器的塑料歧管(manifold)机械 配对，以将血液和缓冲液传送到设备中并抽提所产生的部分。

设备操作：利用外部压力源将2.4PSI的压力应用到缓冲液和血液贮 器，以调整液体的传送和来自成套设备的抽提物。

试验条件：收集同意的成人供体的人类血液至K2EDTA真空采血管中 (366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。利用以上阐述的示例设备 在抽血9小时内室温下处理未稀释的血液。将来自血液的有核细胞同无核 细胞(红细胞和血小板)分离，血浆递送到含1％牛血清白蛋白(BSA) (A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的无钙、镁离子的杜氏磷酸缓 冲盐溶液(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中。

测量技术：利用犁铧阻抗血液分析仪(Coulter impedance hematology analyzer)(COULTERAcT diffTM，Beckman Coulter，Fullerton，CA)确定全 血细胞数。

性能：图12A-12F显示血液分析仪产生的由本设备形成的血液样本和 废物(缓冲液、血浆、红细胞和血小板)和产物(缓冲液和有核细胞)部 分的典型直方图。下表显示针对5种不同血液样本的性能。

实施例2、14个单阶段阵列复体的多重硅设备

图13A-13D显示本发明的示例设备，其特征为以下：

尺寸：90mm x 34mm x 1mm

阵列设计：1个阶段，间隙大小＝24μm。分支比(Bifurcation ratio) ＝1/60。复体；双旁路通道。

设备设计：14个阵列复体的多重化；为了流动稳定性的流阻器

设备制造：利用硅通过标准的光刻技术和深度硅反应蚀刻技术制造阵 列和通道。刻蚀深度为150μm。利用KOH湿刻蚀产生流体进入孔。使用 与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795、3M、St Paul、MN)将硅基底密封 在被蚀刻的面以形成封闭的流体通道。

设备包装：该设备与带有外部流体贮器的塑料歧管机械配对，以将血 液和缓冲液传送到设备中并抽提所产生的部分。

设备操作：利用外部压力源将2.4PSI的压力应用到缓冲液和血液贮 器，以调整液体的传送和来自成套设备的抽提物。

试验条件：收集同意的成人供体的人类血液至K2EDTA真空采血管中 (366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。利用以上阐述的示例设备 在抽血9小时内室温下处理未稀释的血液。将来自血液的有核细胞同无核 细胞(红细胞和血小板)分离，血浆被传送到含1％牛血清白蛋白(BSA) (A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的无钙、镁离子的杜氏磷酸缓 冲盐溶液(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液流中。

测量技术：利用犁铧阻抗血液分析仪(Coulter impedance hematology analyzer)(COULTERAcT diffTM，Beckman Coulter，Fullerton，CA)确定全 血细胞数。

性能：以17mL/hr的速度操作本设备，并且达到＞99％的红细胞的移 出，＞95％的有核细胞的截留和＞98％的血小板的移出。

实施例3、胎儿脐带血的分离

图14A-14D显示用于从胎儿脐带血中分离有核细胞的设备的图式。

尺寸：100mm x 28mm x 1mm

阵列设计：3个阶段，第一、第二和第三阶段的间隙大小分别＝18、12 和8μm。分支比(Bifurcation ratio)＝1/10。复体；单个旁路通道.

设备设计：10个阵列复体的多重化；为了流动稳定性的流阻器

设备制造：利用硅通过标准的光刻技术和深度硅反应蚀刻技术制造阵 列和通道。刻蚀深度为140μm。利用KOH湿刻蚀产生流体进入孔。使用 与血液相容的压力敏感性粘合剂(9795、3M、St Paul、MN)将硅基底密封 在被蚀刻的面以形成封闭的流体通道。

设备包装：该设备与带有外部流体贮器的塑料歧管机械配对，以将血 液和缓冲液传送到设备中并抽提所产生的部分

设备操作：利用外部压力源将2.0PSI的压力应用到缓冲液和血液贮器， 以调整液体的传送和来自成套设备的抽提物。

试验条件：抽取人胎儿脐带血至含枸橼酸葡萄糖抗凝剂的磷酸缓冲盐 溶液中。利用以上阐述的设备在抽血48小时内室温下以3mL/hr处理1ml 的血液。将来自所述血液的有核细胞同无核细胞(红细胞和血小板)分离， 血浆被传送到含1％牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和2mM EDTA(15575-020，Invitrogen，Carlsbad，CA)的无钙、镁 离子的杜氏磷酸缓冲盐溶液(14190-144，Invitrogen，Carlsbad，CA)的缓冲液 流中。

测量技术：制备所述产物和废物部分的细胞涂片(图15A-15B)并且用 改性的瑞氏-姬姆萨染色(Wright-Giemsa)(WGl 6，Sigma Aldrich，St.Louis， MO)。

性能：在产物部分中观察到胎儿有核红细胞(图15A)，而废物部分中 不存在(图15B)。

实施例4、从母体血液中分离胎儿细胞。

实施例1中详细阐述的设备和程序与免疫磁性亲和富集技术组合使 用，证明从母体血液中分离胎儿细胞的可行性。

试验条件：收集同意的孕有男性胎儿的母方供体的血液至K2EDTA真 空采血管中(366643，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)随后可选择妊娠 终止。利用实施例1中阐述的设备在抽血9小时内室温下处理未稀释的血 液。将来自血液的有核细胞同无核细胞(红细胞和血小板)分离，血浆分 离被传送到含1％牛血清白蛋白(BSA)(A8412-100ML，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的无钙、镁离子的杜氏磷酸缓冲盐溶液(14190-144，Invitrogen， Carlsbad，CA)的缓冲液流中。接着，有核红细胞被抗CD71微珠(130-046-201， Miltenyi Biotech Inc.，Auburn，CA)标记，并且根据生产商的说明书利用 MiniMACSTM MS柱(130-042-201，Miltenyi Biotech Inc.，Auburn，CA)对其进 行富集。最后，CD-71阳性的部分被点到玻片上。

测量技术：根据生产商的说明书通过荧光原位杂交(FISH)技术利用V ysis探针对点样的玻片进行染色(Abbott实验室，Downer′s Grove，IL)。样本 根据X和Y染色体的存在被染色。一种病例中，制备的样本来自已知21 三体的妊娠，其21号染色体也被染色。

性能：通过由有核细胞部分制备的CD-71阳性群中雄细胞的可靠存在 确认胎儿细胞的分离(图16)。在被检查的单个异常病例中，21三体的 病状也被鉴定出来(图17)。

以下实施例为本发明设备的特殊实施例。每个设备说明都提供了串联 的阶段数，每个阶段的间隙的大小，ε(流角)和每个设备的通道的数量(阵 列/芯片)。每种设备都由硅利用DRIE工艺制造，并且每种设备都有热氧 化层。

实施例5

该设备包括单个阵列的5个阶段。

实施例6

该设备包括多个阶段，其中每个阶段为一个有旁路通道的复体。设备 的高度为125μm。

图18A显示用于制造阵列的基于尺寸的分离组件的掩膜。图18B-18D 为放大的掩膜部分，其界定了进口、阵列和出口。图19A-19G显示这里的 基于尺寸的分离组件的SEM。

实施例7

该设备包括多个阶段，其中每个阶段为一个有旁路通道的复体。在旁 路通道的侧面设计翅片(Fins)防止来自旁路通道的液体重新进入阵列。 芯片还包括芯片上流阻器，例如进口和出口比阵列具有更大的流动阻力。 设备的高度为117μm。

图20A显示用于制造阵列的基于尺寸的分离组件的掩膜。图20B-20D 为放大的掩膜部分，其界定了进口、阵列和出口。图21A-21F显示本实施 例中使用的基于尺寸的分离组件的SEM。

实施例8

该设备包括多个阶段，其中每个阶段为一个有旁路通道的复体。在旁 路通道的侧面设计翅片(Fins)防止来自旁路通道的液体重新进入阵列。 模仿阵列的形状设计最靠近阵列翅片的边缘。芯片还包括芯片上流阻器， 例如进口和出口比阵列具有更大的流动阻力。设备的高度为138μm。

图14A显示用于制造设备的掩膜。图14B-14D为放大的掩膜部分，其 界定了进口、阵列和出口。图22A-22F显示这里阐述的设备的SEM。

实施例9

该设备包括多个阶段，其中每个阶段为一个有旁路通道的复体。利用 Femlab对翅片(Fins)进行优化使其守在旁路通道的侧面以防止来自旁路 通道的液体重新进入阵列。模仿阵列的形状设计最靠近阵列翅片的边缘。 芯片还包括芯片上流阻器，例如进口和出口比阵列具有更大的流动阻力。 设备的高度为139或142μm。

图23A显示用于制造设备的掩膜。图23B-23D为放大的掩膜部分，其 界定了进口、阵列和出口。图24A-24S显示以上设备的SEM。

实施例10

该设备包括单个阶段，排列具有一个旁路通道的复体设备以接收来自 两个阵列的末端的排出物。该过滤设备中的障碍物为椭圆形。阵列的边缘 利用Femlab做模型。芯片还包括芯片上流阻器，例如进口和出口比阵列 具有更大的流动阻力。设备的高度为152μm。

图13A显示用于制造设备的掩膜。图13B-13D为放大的掩膜部分，其 界定了进口、阵列和出口。图25A-25C显示实际设备的SEM。

所有在以上说明书中提及的出版物、专利和专利申请都通过引用结合 入本文。对于本领域的技术人员来说，显然本发明所述方法和系统的各种 变形和变更将不脱离本发明的范围和精神。虽然结合具体实施方案对本发 明进行了阐述，但是应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于在 这些具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本 发明的所述模式的各种变形预期包括在本发明的范围内。

其它实施方案在权利要求中。