技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物组织学技术领域，尤其涉及一种
植物组织石蜡切片制备方法，具体涉及一种梨花组织的石蜡切片的制备方法。
背景技术
[0002] 石蜡
组织切片技术是组织学常规制片技术中最为广泛应用的一种方法。不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，已广泛应用于众多学科领域的研究中。但由于植物的组织结构特异性，不同材料的具体操作方法也不尽相同。
[0003] 目前，在梨花上开展的石蜡切片技术研究较少且效果并不理想，操作复杂。因此如何克服
现有技术的不足是目前
生物组织学技术领域亟需解决的问题。
发明内容
[0004] 本发明为了解决上述技术问题，提供了一种梨花组织的石蜡切片的制备方法。
[0005] 本发明包括以下技术方案：一种梨花组织的石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：
[0006] (1)将在4-5摄氏度
冰箱中保存的梨花取出，用蒸馏
水冲洗干净，将花蕊、雄蕊、花萼、花瓣以及花柄基部以下3mm全部去除，获得处理后的梨花组织；
[0007] 材料处理是石蜡切片的第一步，如何处理材料直接影响到后续的实验和最终石蜡片的
质量。传统的石蜡切片在材料处理方面并没有明确的要求，只需要大小能浸没在FAA固定液中即可。由于传统石蜡切片在材料处理方面没有严格要求，导致后期切片时组织太大，在后期操作中极不方便，对石蜡切片质量产生极大影响。因此本发明中在梨花组织处理时，将多余的组织去除。
[0008] (2)将步骤(1)中获得的梨花组织放入固定容器的FAA固定液中，对固定容器进行抽气，直至FAA固定液不再出现气泡，抽气结束后，固定1-2天；
[0009] 传统固定过程只是将材料放置于固定液中进行固定，却忽略了材料中细胞间隙的空气，这些空气如果不排除，在后期包埋过程中，由于受热会释放，导致包埋蜡
块中材料表面出现气泡，影响后期切片。本发明采用
真空泵将空气抽出，可以极大程度地去除细胞间隙的空气，提高后期包埋质量。
[0010] (3)将抽气后获得的梨花组织放置在纱布上吸干FAA固定液，并依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、
染色和去浮色处理。
[0011] 进一步地，所述步骤(3)中脱
水处理的步骤为：将吸干FAA固定液后的梨花组织在冻存管中按照70％、80％、85％、90％、95％
乙醇浓度逐级各脱水一次，每次2h，接着使用95％酒精脱水1h，重复两次，最后无水乙醇脱水两次，每次各45min。
[0012] 进一步地，所述步骤(3)中透明的步骤为：脱水完成后，依照1/2无数乙醇+1/2二
甲苯、纯二甲苯的顺序对样品进行重复处理两次，每次透明时间为1.5h。
[0013] 进一步地，所述步骤(3)中浸蜡处理的步骤为：
[0014] 将烘箱
温度调为80摄氏度，放入石蜡融化备用；
[0015] 准备冻存管，加入1/2二甲苯后，放入烘箱，30秒后将融化的石蜡加入到冻存管中，将冻存管
盖子封好，放置于60摄氏度烘箱中；
[0016] 从烘箱中取出冻存管打开，放入完成透明后的材料，封口，继续放入60摄氏度烘箱中时间为16h；
[0017] 将材料取出放入到纯蜡液中，在60摄氏度下，每2h换一次，更换两次。
[0018] 进一步地，所述步骤(3)中包埋处理的步骤为：使用
牛皮纸叠制包埋模具；
[0019] 水浴锅设置为80摄氏度，将烧杯放置于水浴锅中预热，然后在烧杯中加入80％纯蜡以及20％老蜡；在水浴锅上部放置一块纸板作为操作台，将包埋盒放在纸板上，倒入一半石蜡，将材料从烘箱中取出，放入包埋盒中；
[0020] 使用
镊子调整材料
角度，以花萼处向外，距离纸壁1cm，两材料相距2cm；调整结束后倒入另外一半石蜡，将包埋盒放置于桌面上冷却，冷却至上层出现一层膜时继续加入石蜡至最高处。
[0021] 该步骤(3)的过程称之为补蜡，包埋是石蜡切片制作的关键步骤之一，如果包埋质量较差，那后面的操作几乎无法进行。传统的包埋过程，只是简单介绍将材料包入石蜡中，却无法避免的出现包埋后产生的气泡、分层以及材料无法全部包埋的情况。石蜡是非晶体，其冷却方式与晶体不相同，如果仅一次倒蜡，冷却后蜡块表面会出现一个深坑，严重时会将材料露出；在包埋时如果无法将
温度控制好，分两次加蜡的过程势必会产生分层现象；固定时，如果不降气泡排空，后期会在材料表面产生大量气泡，影响切片。本发明将以上三个问题，通过补蜡，将操作过程放置在水浴锅上以及
真空泵处理得以解决。同时我们在包埋时并非使用纯蜡，而是使用纯蜡和老蜡配制而成，这样的蜡相比于传统的纯蜡具有很好的延展性，对后期切片时具有很好的连接作用。
[0022] 更进一步地，所述步骤(3)中切片的步骤为：
[0023] 将包埋盒打开，利用小刀将石蜡块修整为梯形，花萼处为下底，花柄处为上底，切片时用
力均匀，切口垂直，小梯形各面平整，花柄处留出1cm石蜡，花萼处石蜡尽可能少，其余各处均留出2mm石蜡；
[0024] 将花柄处留出的石蜡黏在小木块上，保证整个材料与粘
贴面垂直，然后固定于手动轮转式切片机上，设置好切片厚度为10微米，保持花萼处与刀片垂直；
[0025] 切片过程中，由于梨花组织较大，且各部位大小不均，摇动切片
手柄的力度适当，从上部向下切时迅速摇下，从下向上时缓慢但速度均匀。
[0026] 使用切片机进行切片时，传统的切片方法要求转速要均匀，用力要一致，可是这种切片方式，只是针对，组织较小，蜡质延展性好的情况。而梨花组织经过处理后，相对于其他组织依然比较大，如果匀速切片，无法获得完整的组织切片，在切刀一半时，切片就开始卷曲，无法进行下去。本发明所采用的方法是经过上万次的摇切，总结而来，效果甚好。
[0027] 进一步地，所述步骤(3)中粘片步骤为：
[0028] 使用蒸馏水冲洗
载玻片，烘箱烘干；鸡蛋清过滤得到粘片剂，放置于4摄氏度冰箱中保存；
[0029] 将粘片剂涂抹于载玻片上，同时加6-8滴蒸馏水，使用玻璃棒抹匀，保证载玻片上均有粘片剂，此时将石蜡切片的
反面朝下，放置于粘片剂上；
[0030] 放置好以后，使用酒精灯在载玻片下部
烘烤，发现切片周围的石蜡消失即可，切勿加热过度，使得组织被破坏；
[0031] 烘片后使用
滤纸吸去蒸馏水，此时组织在载玻片上平展，石蜡
覆盖在组织表层，且组织与载玻片紧紧结合。
[0032] 载玻片的制作是切片制作的最后一步，也是最为关键的步骤之一，如果效果不好，会严重影响后期观察效果。传统的粘片方法，是将蛋清涂抹在玻片上，待其干了以后，才添加蒸馏水，在酒精灯上进行烘烤，而且不可将组织周围的蜡融化。这样处理虽然对小组织切片具有较好的作用，但对于大组织而言，无法使其切片展平。本发明可以将组织完整的展平，即使是特别褶皱的切片也可展平，同时使得后期脱蜡效果相比于传统方式更好。
[0033] 进一步地，所述步骤(3)中脱蜡的步骤为：将载玻片放入纯二甲苯中，脱蜡4h、3h、2h；为了保证脱蜡效果，二甲苯使用4-5次后，需要更换。
[0034] 进一步地，所述步骤(3)中染色的步骤为：
[0035] 脱蜡完成后，将切片按照1/2石蜡+1/2无水乙醇、无水酒重复两次、95％酒精重复两次、90％酒精、85％酒精、80％酒精、70％酒精、50％酒精的顺序进行复水处理，每次3分钟；
[0036] 将复水后的载玻片放在1％番红溶液染色16h，取出载玻片放置于85％酒精中浸泡5秒，接着放入0.5％固绿溶液染色5秒。
[0037] 更进一步地，所述步骤(3)中去浮色的步骤为：染色完成后，将载玻片放于90％酒精、95％酒精重复两次、无水乙醇重复两次中去浮色，每次15秒；将载玻片放入到纯二甲苯中透明10分钟后，即可在光学
显微镜下观察梨花组织显微结构，可清晰发现，被染成红色的木质部和绿色的韧皮部。
[0038] 采用上述技术方案，包括以下有益效果：本发明所提供的梨花组织的石蜡切片的制备方法，解决了传统石蜡切片在材料处理方面没有严格要求，导致后期切片时组织太大，在后期操作中极不方便，对实验结果产生极大影响的
缺陷，并且对材料进行排气处理，所制得的石蜡切片质量较高。
附图说明
[0040] 图2为花柄处单个维管束示意图；
[0041] 图3为花萼处维管束分布示意图；
[0042] 图4为花萼处单个维管束示意图。
具体实施方式
[0043] 下面通过具体的
实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0044] 实施例：
[0045] 本实施例提供了一种梨花组织的石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：
[0046] S1、将在4-5摄氏度冰箱中保存的梨花取出，用蒸馏水冲洗干净，将花蕊、雄蕊、花萼、花瓣以及花柄基部以下3mm全部去除，获得处理后的梨花组织；
[0047] S2、将步骤S1中获得的梨花组织放入固定容器的FAA固定液中，对固定容器进行抽气，直至FAA固定液不再出现气泡，抽气结束后，固定1-2天；
[0048] S3、将抽气后获得的梨花组织放置在纱布上吸干FAA固定液，并依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、染色和去浮色处理。
[0049] 本实施例中，所述步骤S3具体为；
[0050] S301脱水：将吸干FAA固定液后的梨花组织在冻存管中按照70％、80％、85％、90％、95％乙醇浓度逐级各脱水一次，每次2h，接着使用95％酒精脱水1h，重复两次，最后无水乙醇脱水两次，每次各45min。
[0051] 进一步地，所述步骤(3)中透明的步骤为：脱水完成后，依照1/2无数乙醇+1/2二甲苯、纯二甲苯的顺序对样品进行重复处理两次，每次透明时间为1.5h。
[0052] S302浸蜡处理：将烘箱温度调为80摄氏度，放入石蜡融化备用；
[0053] 准备冻存管，加入1/2二甲苯后，放入烘箱，30秒后将融化的石蜡加入到冻存管中，将冻存管盖子封好，放置于60摄氏度烘箱中；
[0054] 从烘箱中取出冻存管打开，放入完成透明后的材料，封口，继续放入60摄氏度烘箱中时间为16h；
[0055] 将材料取出放入到纯蜡液中，在60摄氏度下，每2h换一次，更换两次。
[0056] S303包埋处理：使用牛皮纸叠制包埋模具；模具大小依据盛放所制得的石蜡切片的个数决定，若为两个材料，可以叠制长5cm，宽1cm，高1.5cm模具。
[0057] 水浴锅设置为80摄氏度，将烧杯放置于水浴锅中预热，然后在烧杯中加入80％纯蜡以及20％老蜡；老蜡可以用如下方法制得，在100ml纯蜡中加入3滴二甲苯冷却后再融化，反复三次即可制得，放置在烧杯中融化，为了防止包埋时石蜡太快
凝固。
[0058] 在水浴锅上部放置一块纸板作为操作台，将包埋盒放在纸板上，倒入一半石蜡，将材料从烘箱中取出，放入包埋盒中；
[0059] 使用镊子调整材料角度，以花萼处向外，距离纸壁1cm，两材料相距2cm；调整结束后倒入另外一半石蜡，将包埋盒放置于桌面上冷却，冷却至上层出现一层膜时继续加入石蜡至最高处。
[0060] S304中切片：将包埋盒打开，利用小刀将石蜡块修整为梯形，花萼处为下底，花柄处为上底，切片时用力均匀，切口垂直，否则容易导致石蜡块切碎；小梯形各面平整，花柄处留出1cm石蜡，花萼处石蜡尽可能少，其余各处均留出2mm石蜡；
[0061] 将花柄处留出的石蜡黏在小木块上，保证整个材料与粘贴面垂直，然后固定于手动轮转式切片机上，设置好切片厚度为10微米，保持花萼处与刀片垂直；
[0062] 切片过程中，由于梨花组织较大，且各部位大小不均，摇动切片手柄的力度适当，从上部向下切时迅速摇下，从下向上时缓慢但速度均匀，才可切出合适切片，此过程考验切片者耐心以及石蜡成分，否则会导致石蜡不成型且皱褶甚至石蜡
破碎；刚开始切片为石蜡，后面会出现组织切片，由于角度调整不合适，刚开始出现的切片组织不完成，待组织完整后(可肉眼观察)，使用解剖针在蜡片空白处轻轻扎一下即可取下，切记要区分切片正反面；
[0063] S305粘片：使用蒸馏水冲洗载玻片，烘箱烘干；鸡蛋清过滤得到粘片剂，放置于4摄氏度冰箱中保存；
[0064] 将粘片剂涂抹于载玻片上，同时加6-8滴蒸馏水，使用玻璃棒抹匀，保证载玻片上均有粘片剂，此时将石蜡切片的反面朝下，放置于粘片剂上，如果反放会发现切片无法粘在玻片上；
[0065] 放置好以后，使用酒精灯在载玻片下部烘烤，发现切片周围的石蜡消失即可，切勿加热过度，使得组织被破坏；
[0066] 烘片后使用滤纸吸去蒸馏水，此时组织在载玻片上平展，石蜡覆盖在组织表层，且组织与载玻片紧紧结合。
[0067] S306脱蜡：将载玻片放入纯二甲苯中，脱蜡4h、3h、2h；为了保证脱蜡效果，二甲苯使用4-5次后，需要更换。
[0068] S307染色：脱蜡完成后，将切片按照1/2石蜡+1/2无水乙醇、无水酒重复两次、95％酒精重复两次、90％酒精、85％酒精、80％酒精、70％酒精、50％酒精的顺序进行复水处理，每次3分钟；
[0069] 将复水后的载玻片放在1％番红溶液染色16h，取出载玻片放置于85％酒精中浸泡5秒，接着放入0.5％固绿溶液染色5秒。
[0070] S308去浮色：染色完成后，将载玻片放于90％酒精、95％酒精重复两次、无水乙醇重复两次中去浮色，每次15秒；将载玻片放入到纯二甲苯中透明10分钟后，即可在
光学显微镜下观察梨花组织显微结构，可清晰发现，被染成红色的木质部和绿色的韧皮部。
[0071] 参阅图1-4，以本实施例制作的梨花组织维管束石蜡切片，可以清晰的观察梨花组织任一部分的维管束性状。
[0072] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
