技术领域
[0001] 本
发明涉及高浓缩生长因子技术领域，具体为一种高浓缩生长因子的应用。
背景技术
[0002] 生长因子是一群由多种细胞分泌的可以刺激细胞生长、增殖以及分化的
蛋白质或类固醇
激素，它们能够严格调控细胞生长发育的
进程，对维持健康的
皮肤结构与功能起着至关重要的作用，一些特定类型的细胞可以分泌生长因子，如可以构成皮肤表皮层与真皮层的
角质细胞，然而生长因子的数量会随着年龄的增长而减少，因此，从理论上讲，皮肤需要生长因子的滋养，最近一些美容产品以及美容护理采用从自身提取的细胞因子直接涂抹在皮肤上从而获得一定的美容效果，而目前通过这种应用手段已达到至少以下几个效果:通过生长因子刺激面部
胶原蛋白的合成减轻了细纹、法令纹和皱纹等；改善了色斑以及色素沉淀；使肌肤更紧致顺滑；改善了皮肤粗糙的状况，使肌肤更加光泽饱满。
[0003] 但是由于皮肤表层的阻碍作用，使皮肤对于那些被包裹住的生长因子的吸收效果并不能达到预期设想，因此，制造一种稳定的、没有添加剂的和具有较长保质期的无包裹高浓缩生长因子就很有必要了。
发明内容
[0004] (一)解决的技术问题
[0005] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种高浓缩生长因子的应用，具备成本更低廉和效果更好等优点，解决了成本过高和提取效果一般的问题。
[0006] (二)技术方案
[0007] 为实现上述成本更低廉和效果更好目的，本发明提供如下技术方案：一种高浓缩生长因子及其应用，包括高浓度血小板
血浆和脂肪干细胞来源，包括以下步骤：
[0008] 1)高浓度血小板血浆提取生长因子的步骤如下：
[0009] (A)通过静脉抽血或者其他方法从自体身上取出30-60ml体积的血液，放置在
柠檬酸钠血液收集管中或其他便于运输的容器内，使血液和抗凝剂充分混匀。
[0010] (B)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，采用300g的离心速度，时间为5min，使血液基本上分成三层。
[0011] (C)然后将收集的血浆同白细胞层混合均匀，进行第二次离心，采用700g的离心速度，时间为17min。
[0012] (D)弃掉离心管80％左右的上层血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，收集到容器中即得血小板血浆，而生长因子就高度富集于分离好的高浓度血小板血浆中。
[0013] (E)从稳定的高浓度血小板血浆中释放生长因子，采取虹吸法过滤释放的生长因子。
[0014] (F)将已释放的生长因子保存在-80℃的冷藏环境中。
[0015] 其中步骤(D)中，步骤(D)所得血小板血浆中血小板的浓度是分离前
全血中血小板浓度的8～10倍。
[0016] 2)脂肪干细胞来源提取生长因子的步骤如下：
[0017] (A)通过抽脂或
微创手术抽取60-200ml体积的脂肪，加入运输液送到实验室。
[0018] (B)脂肪间质血管层(SVF)将通过2-3次预热的等体积(乳酸钠溶液：脂肪组织＝1：1)的乳酸钠溶液清洗(第一次用含有2％抗生素浓度的乳酸钠溶液清洗，第2-3次用纯净的乳酸钠溶液清洗)后获得。
[0019] 用预热的含有2％抗生素的等体积乳酸钠溶液清洗抽取的脂肪组织，大
力地用手晃动(或用600振幅/分钟的
振动筛)含有脂肪组织及清洗液的容器1-2分钟后，将悬浮的混合物静止10分钟或用300g的速度离心5分钟，然后弃掉乳酸钠溶液层；再使用纯净的乳酸钠溶液清洗脂肪组织1-2次，尽可能的吸掉残留的红细胞，最终都弃掉清洗液保留脂肪组织层；在清洗过的脂肪组织中加入等体积的浓度为1mg/ml的胶原酶溶液在37度、180RPM的振动筛上消化分解60分钟；将消化好的脂肪组织以600-800g的速度离心10分钟，消化后的脂肪组织将被分为三层：油质/脂肪细胞层，清夜层以及最下层沉淀。
[0020] (C)向所述脂肪干细胞来源施加选自低
氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦中的至少一种物理刺激，稳定高浓度血小板血浆内的
生物结构。
[0021] (D)从稳定后的脂肪间质血管层(SVF)中释放生长因子，用100μm的过滤筛过滤掉组织碎片。
[0022] (E)将已释放的生长因子保存在-80℃的冷藏环境中。
[0023] 对现有产品的进一步研发中，释放生长因子这一过程将通过反复冻融这一过程来完成，高浓度血小板血浆或脂肪间质血管层在零下55摄氏度的环境下至少冷冻30分钟，然后在37摄氏度的条件下复融10分钟，释放的生长因子通过
醋酸纤维素薄
膜过滤后储存在零下80摄氏度的环境中，通过这一操作过程，高浓缩生长因子将可以保存长至几年的时间。
[0024] 优选的，所述高浓度血小板血浆(PRP)和脂肪间质血管层(SVF)皆从自体中所获得。
[0025] 优选的，所述高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层反复冻融的操作步骤，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层在零下55摄氏度的环境中冷冻30分钟，在复融过程中，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层在零上37摄氏度的环境中复融10分钟。
[0026] 优选的，所述抗凝剂选自
乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸
钙钠、枸橼酸
葡萄糖或其组合。
[0027] 优选的，在过滤过程中，使用乙酸
纤维素薄膜过滤释放的生长因子。
[0028] 优选的，所述低氧培养在6％
碳和1％～6％氧的条件下进行，所述UV照射是通过用具有
波长为260nm～300nm的UV光以60mJ～100mJ的
能量剂量照射而进行的。
[0029] 优选的，将过滤后的生长因子冷冻于零下55摄氏度的环境中至少3个小时；最后将生长因子长时间保存于零下80摄氏度环境中。
[0030] 一种高浓缩生长因子的应用，通过上述方法所获得的最终产品可以对有需求的自体进行美容护理，可以通过与高浓缩生长因子等体积的生理盐
水混合后当作精华素使用，也可以直接用在伤口或溃疡处，与使用过程中新鲜释放出来的生长因子相比，将释放后的高浓缩生长因子直接涂抹于皮肤上可以更有效的刺激细胞，使细胞的增殖数量明显提高十倍左右，另外，现有研发产品要针对个体需求提供如上所述含有一定效用的高浓缩生长因子的抗衰老美容产品，个体肌肤复原包含以下步骤：
[0031] 1)首先清洁目标皮肤区域，油性肤质者洗脸时应用中指上下移动的手法进行按摩，仔细清洗两次，用温水铣净之后，可以用冷水再洗一遍，这样有利于毛孔收缩；干性皮肤不妨用
泡沫洗面奶温柔地洗净肌肤，使用时要特别注意，洗面奶用量过多或起泡不完全都会给肌肤带来负担，所以使用前要充分揉搓使其起泡，再轻轻地按摩肌肤，但不要用温水冲洗太久，以避免油脂流失过多。
[0032] 2)使用带有一定振幅
频率的微型探针在目标皮肤区域上产生微小信道。
[0033] 3)将产品突破于皮肤上，具有一定效用的高浓缩生长因子通过由微型探针所产生的微小通道渗透到皮肤更深层。
[0034] (三)有益效果
[0035] 与现有技术相比，本发明提供了一种高浓缩生长因子及其应用，具备以下有益效果：
[0036] 该高浓缩生长因子及其应用，使用一种新的方法从自体中获得的高浓度血小板血浆和脂肪干细胞来源中提取出可以应用在美容护理领域内的无包裹和高浓缩生长因子，这种提取技术成本更低廉以及效果更好。
具体实施方式
[0037] 下面将结合本发明的
实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038] 一种高浓缩生长因子及其应用，包括高浓度血小板血浆和脂肪干细胞来源，包括以下步骤：
[0039] 1)高浓度血小板血浆提取生长因子的步骤如下：
[0040] (A)通过静脉抽血或者其他方法从自体身上取出30-60ml体积的血液，放置在柠檬酸钠血液收集管中或其他便于运输的容器内，使血液和抗凝剂充分混匀，抗凝剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钙钠、枸橼酸葡萄糖或其组合。
[0041] (B)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，采用300g的离心速度，时间为5min，使血液基本上分成三层。
[0042] (C)然后将收集的血浆同白细胞层混合均匀，进行第二次离心，采用700g的离心速度，时间为17min。
[0043] (D)弃掉离心管80％左右的上层血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，收集到容器中即得血小板血浆，而生长因子就高度富集于分离好的高浓度血小板血浆中；在非常低的储存
温度下，血小板或脂肪间质血管层层细胞会很容易发生调亡现象，而这一过程中细胞会释放出各种
抑制剂并摧毁生长因子，另外，如前文所提到的，由于只有很少的一部分生长因子在使用过程中被释放出来，因此皮肤对于有限的生长因子的吸收率并不高，在我们的研发产品中，我们的目标是从高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层中尽可能多的释放出生长因子，因为释放后的生长因子被细胞产生的抑制剂所攻击的概率会大大降低，同时皮肤对于无包裹的生长因子的吸收率也会显著提高，释放生长因子的方法有很多种，如冻融
破碎法、机械裂解法、液体匀浆
研磨法、
声波降解法和手动研磨法等，在此我们采用冻融破碎法获得释放的细胞生长因子，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层在零下55摄氏度的条件下冷冻30分钟后，转到零上37摄氏度水浴锅中复融10分钟，此冷冻与复融的操作需要重复至少三次以上，经过低温冷冻，高浓度血小板血浆(PRP)和脂肪间质血管层(SVF)细胞的内部形成的
冰晶的体积会逐渐增大最终使得细胞膨胀而破裂，从而释放出生长因子，通过高浓度血小板血浆(PRP)和脂肪间质血管层(SVF)细胞释放出的生长因子的保存时间会显著延长，同时吸收率也会有明显的提高。
[0044] (E)从稳定的高浓度血小板血浆中释放生长因子，采取虹吸法过滤释放的生长因子，在过滤过程中，，一些病原体或者其他污染源，如细菌、红细胞或者细胞碎片，这些都会影响最终产品疗效以及其保质期时长，所以为了降低这些可能性，释放后的生长因子需要通过0.2μm的乙酸纤维素薄膜来过滤掉污染源以及细胞残渣。
[0045] (F)将已释放的生长因子保存在-80℃的冷藏环境中。
[0046] 其中步骤(D)中，步骤(D)所得血小板血浆中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的8～10倍。
[0047] 2)脂肪干细胞来源提取生长因子的步骤如下：
[0048] (A)通过抽脂或微创手术抽取60-200ml体积的脂肪，加入运输液送到实验室。
[0049] (B)脂肪间质血管层(SVF)将通过2-3次预热的等体积(乳酸钠溶液：脂肪组织＝1：1)的乳酸钠溶液清洗(第一次用含有2％抗生素浓度的乳酸钠溶液清洗，第2-3次用纯净的乳酸钠溶液清洗)后获得。
[0050] 用预热的含有2％抗生素的等体积乳酸钠溶液清洗抽取的脂肪组织，大力地用手晃动(或用600振幅/分钟的振动筛)含有脂肪组织及清洗液的容器1-2分钟后，将悬浮的混合物静止10分钟或用300g的速度离心5分钟，然后弃掉乳酸钠溶液层；再使用纯净的乳酸钠溶液清洗脂肪组织1-2次，尽可能的吸掉残留的红细胞，最终都弃掉清洗液保留脂肪组织层；在清洗过的脂肪组织中加入等体积的浓度为1mg/ml的胶原酶溶液在37度、180RPM的振动筛上消化分解60分钟；将消化好的脂肪组织以600-800g的速度离心10分钟，消化后的脂肪组织将被分为三层：油质/脂肪细胞层，清夜层以及最下层沉淀。
[0051] (C)向脂肪干细胞来源施加选自低氧培养、UV照射、营养缺乏和机械摩擦中的至少一种物理刺激，稳定高浓度血小板血浆内的生物结构，低氧培养在6％碳和1％～6％氧的条件下进行，UV照射是通过用具有波长为260nm～300nm的UV光以60mJ～100mJ的能量剂量照射而进行的。
[0052] (D)从稳定后的脂肪间质血管层中释放生长因子，用100μm的过滤筛过滤掉组织碎片。
[0053] (E)将已释放的生长因子保存在-80℃的冷藏环境中，将过滤后的生长因子冷冻于零下55摄氏度的环境中至少3个小时；最后将生长因子长时间保存于零下80摄氏度环境中。
[0054] 高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层皆从自体中所获得，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层反复冻融的操作步骤，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层在零下55摄氏度的环境中冷冻30分钟，在复融过程中，高浓度血小板血浆和脂肪间质血管层在零上37摄氏度的环境中复融10分钟。
[0055] 对现有产品的进一步研发中，释放生长因子这一过程将通过反复冻融这一过程来完成，高浓度血小板血浆或脂肪间质血管层在零下55摄氏度的环境下至少冷冻30分钟，然后在37摄氏度的条件下复融10分钟，释放的生长因子通过醋酸纤维素薄膜过滤后储存在零下80摄氏度的环境中，通过这一操作过程，高浓缩生长因子将可以保存长至几年的时间。
[0056] 一种高浓缩生长因子的应用，通过上述方法所获得的最终产品可以对有需求的自体进行美容护理，可以通过与高浓缩生长因子等体积的生理盐水混合后当作精华素使用，也可以直接用在伤口或溃疡处，与使用过程中新鲜释放出来的生长因子相比，将释放后的高浓缩生长因子直接涂抹于皮肤上可以更有效的刺激细胞，使细胞的增殖数量明显提高十倍左右，另外，现有研发产品要针对个体需求提供如上含有一定效用的高浓缩生长因子的抗衰老美容产品，个体肌肤复原包含以下步骤：
[0057] 1)首先清洁目标皮肤区域，油性肤质者洗脸时应用中指上下移动的手法进行按摩，仔细清洗两次，用温水铣净之后，可以用冷水再洗一遍，这样有利于毛孔收缩；干性皮肤不妨用泡沫洗面奶温柔地洗净肌肤，使用时要特别注意，洗面奶用量过多或起泡不完全都会给肌肤带来负担，所以使用前要充分揉搓使其起泡，再轻轻地按摩肌肤，但不要用温水冲洗太久，以避免油脂流失过多。
[0058] 2)使用带有一定振幅频率的微型探针在目标皮肤区域上产生微小信道。
[0059] 3)将产品突破于皮肤上，具有一定效用的高浓缩生长因子通过由微型探针所产生的微小通道渗透到皮肤更深层。
[0060] 本发明的有益效果是：该高浓缩生长因子及其应用，使用一种新的方法从自体中获得的高浓度血小板血浆和脂肪干细胞来源中提取出可以应用在美容护理领域内的无包裹和高浓缩生长因子，这种提取技术成本更低廉以及效果更好。
[0061] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
