包含修饰核苷的寡核苷酸
专利汇可以提供包含修饰核苷的寡核苷酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的多核苷酸，诸如适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶不同。还提供选择和使用此类多核苷酸诸如适配体的方法。，下面是包含修饰核苷的寡核苷酸专利的具体信息内容。
1.一种包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。
2.如权利要求1所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。
3.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。
4.如权利要求1至3中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、
2NapdC、TyrdC和PPdC。
5.如权利要求1至4中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、
2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
6.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。
7.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。
8.如权利要求6或权利要求7所述的适配体，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。
9.如权利要求1至8中任一项所述的适配体，其中所述适配体结合选自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28和PPIB的靶标蛋白。
10.如权利要求1至9中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至
30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
11.如权利要求1至10中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至
30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
12.如权利要求1至11中任一项所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至
80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
13.一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。
14.如权利要求13所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
15.如权利要求14所述的组合物，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
16.如权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
17.如权利要求16所述的组合物，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
18.如权利要求13至17中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。
19.如权利要求13至18中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。
20.如权利要求13至19中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自
NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。
21.如权利要求13至20中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自
NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
22.如权利要求13至17中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
23.如权利要求13至17中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。
24.如权利要求22或权利要求23所述的组合物，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。
25.如权利要求13至24中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸包含无规区域。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至
80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
27.如权利要求13至26中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸为20至100个、或20至
90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或
40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
28.一种包含适配体和靶标的组合物，其中所述适配体和所述靶标能够形成复合物，并且其中所述适配体为如权利要求1至12中任一项所述的适配体。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述靶标选自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28和PPIB。
30.一种包含第一适配体、第二适配体和靶标的组合物，
其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；
其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；
其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且
其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
31.如权利要求28所述的组合物，其中所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
32.如权利要求30或权利要求31所述的组合物，其中所述第一适配体为如权利要求1至
12中任一项所述的适配体。
33.如权利要求30至32中任一项所述的组合物，其中所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰尿嘧啶核苷。
34.如权利要求30至32中任一项所述的组合物，其中所述第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且所述第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。
35.如权利要求33或权利要求34所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自
BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC和TyrdC，并且所述5位修饰尿嘧啶核苷选自BndU、NapdU、PEdU、IbdU、FBndU、2NapdU、NEdU、MBndU、BFdU、BTdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
36.如权利要求30至35中任一项所述的组合物，其中所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
37.如权利要求30至35中任一项所述的组合物，其中所述靶标为选自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28和PPIB的靶标蛋白。
38.一种方法，其包括：
(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；
(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；
(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及
(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；
其中所述适配体为如权利要求1至12中任一项所述的适配体。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、DNA、肝素和dNTP。
42.如权利要求41所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且DNA为鲱精DNA或鲑鱼精DNA。
43.如权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
44.如权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。
45.一种用于检测样品中的靶标的方法，其包括
a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；
b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；
c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；
d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；
e)检测所述混合物中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；
其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；
其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶，或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述第一适配体为如权利要求1至12中任一项所述的适配体。
47.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
48.如权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰尿嘧啶核苷。
49.如权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且所述第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。
50.如权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC和TyrdC，并且所述5位修饰尿嘧啶核苷选自BNdU、NapdU、PedU、IbdU、FbndU、2NapdU、NedU、MbndU、BfdU、BtdU、PpdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
51.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
52.如权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述靶标为选自PCSK9、PSMA、ErbB1、ErbB2、FXN、KDM2A、IGF1R、pIGF1R、a1-抗胰蛋白酶、CD99、MMP28和PPIB的靶标蛋白。
53.如权利要求45至52中任一项所述的方法，其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。
54.一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：
(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；
(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；
(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及
(d)鉴别所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体；
其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。
55.如权利要求54所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
56.如权利要求55所述的方法，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少
10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
58.如权利要求57所述的方法，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
59.如权利要求54至58中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。
60.如权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。
61.如权利要求54至60中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、
2NapdC、TyrdC和PPdC。
62.如权利要求54至61中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
63.如权利要求54至58中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。
64.如权利要求54至58中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
65.如权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。
66.如权利要求54至65中任一项所述的方法，其中各多核苷酸包含无规区域。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至
70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
68.如权利要求54至67中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至
80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
69.如权利要求54至68中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。
70.如权利要求54至69中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
71.如权利要求54至70中任一项所述的方法，其中所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体被扩增。
72.如权利要求54至71中任一项所述的方法，其中所述混合物包含聚阴离子竞争分子。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、DNA、肝素和dNTP。
74.如权利要求73所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且DNA为鲱精DNA或鲑鱼精DNA。
75.如权利要求54至74中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
76.如权利要求1至12中任一项所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。
77.如权利要求13至37中任一项所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二
5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。
78.如权利要求38至75中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。
79.如权利要求1至12和76中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。
80.如权利要求1至12、76和79中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长半衰期。
81.一种结合PCSK9蛋白的适配体，其中所述适配体包含序列5’-yGpppG-3’，其中各y为TyrdU并且各p为NapdC。
82.如权利要求81所述的适配体，其中所述适配体还包含序列5’-yEAyGAnpAp-3’，其中E选自y、A和G；并且n为0或1。
83.如权利要求82所述的适配体，其中n为0。
84.如权利要求82或权利要求83所述的适配体，其中所述序列5’-yEAyGAnpAp-3’位于所述序列5’-yGpppG-3’的5’。
85.如权利要求82至84中任一项所述的适配体，其中E为y。
86.一种结合PCSK9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-FnpppAAGRJrpRppWm-3’(SEQ ID NO：81)，其中F选自r和G；各R独立地选自G和A；J选自r和A；W选自r、G和A；n为0或1；
m为0或1；r为PpdC；并且p为NapdU。
87.如权利要求86所述的适配体，其中m为1。
88.如权利要求86或权利要求87所述的适配体，其中F为r。
89.如权利要求86至88中任一项所述的适配体，其中J为r。
90.如权利要求86至89中任一项所述的适配体，其中W为G。
91.一种结合PCSK9蛋白的适配体，其中所述适配体包含序列5’-TTppGGpp-3’，其中各p为NapdC。
92.如权利要求81至91中任一项所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至
90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或
40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
93.如权利要求81至92中任一项所述的适配体，其中所述适配体抑制PCSK9结合LDL-R。
94.如权利要求93所述的适配体，其中所述适配体抑制PCSK9与LDL-R的结合，其中IC50小于30nM、小于20nM或小于15nM。
95.一种降低受试者中的胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如权利要求81至94中任一项所述的适配体。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述胆固醇为低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)。
97.如权利要求95或权利要求96所述的方法，其中所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)。
1.一种包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；
其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。
2.如权利要求1所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
3.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
4.如权利要求1至3中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、
2NapdC、TyrdC和PPdC。
5.如权利要求1至4中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、
2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
6.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。
7.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。
8.如权利要求6或权利要求7所述的适配体，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。
9.如权利要求1至8中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
10.如权利要求1至9中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至
30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
11.如权利要求1至10中任一项所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至
80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
12.一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；
其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。。
13.如权利要求12所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
14.如权利要求13所述的组合物，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
15.如权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
16.如权利要求15所述的组合物，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
17.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
18.如权利要求12至17中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
19.如权利要求12至18中任一项所述的组合物，
其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。
20.如权利要求12至19中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自
NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
21.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
22.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。
23.如权利要求21或权利要求22所述的组合物，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。
24.如权利要求12至23中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸包含无规区域。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至
80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
26.如权利要求12至25中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸为20至100个、或20至
90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或
40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
27.一种包含适配体和靶标的组合物，其中所述适配体和所述靶标能够形成复合物，并且其中所述适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。
28.一种包含第一适配体、第二适配体和靶标的组合物，
其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；
其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；
其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且
其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；并且
其中所述第一适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
30.一种方法，其包括：
(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；
(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；
(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及
(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；
其中所述适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。
32.如权利要求33所述的方法，其中所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、DNA、肝素和dNTP。
34.如权利要求33所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且DNA为鲱精DNA或鲑鱼精DNA。
35.如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。
37.一种用于检测样品中的靶标的方法，其包括
a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；
b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；
c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；
d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；
e)检测所述混合物中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；
其中所述第一适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶，或者其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。
40.一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：
(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；
(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；
(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及
(d)鉴别所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体；
其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者
其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；
其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。
41.如权利要求40所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
42.如权利要求41所述的方法，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少
10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
44.如权利要求43所述的方法，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
45.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
46.如权利要求40至45中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
47.如权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、
2NapdC、TyrdC和PPdC。
48.如权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
49.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。
50.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
51.如权利要求40至50中任一项所述的方法，其中各多核苷酸包含无规区域。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至
70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
53.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至
80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
54.如权利要求40至53中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。
55.如权利要求40至54中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
56.如权利要求40至55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体被扩增。
57.如权利要求40至56中任一项所述的方法，其中所述混合物包含聚阴离子竞争分子。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、DNA、肝素和dNTP。
59.如权利要求58所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且DNA为鲱精DNA或鲑鱼精DNA。
60.如权利要求40至59中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
61.如权利要求1至11中任一项所述的适配体或如权利要求12至29中任一项所述的组合物或如权利要求30至60中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。
62.如权利要求1至11中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性和/或人类血清中更长的半衰期。
包含修饰核苷的寡核苷酸
并入本文中来达成任何目的。
技术领域
SELEX方法涉及从寡核苷酸的随机混合物中选择和鉴别寡核苷酸以实际上实现结合亲和力
和选择性的任何所需标准。通过将特定类型的修饰核苷引入至在所述SELEX方法的过程中
鉴别的寡核苷酸中，可改变核酸酶稳定性、静电荷、亲水性或亲脂性以提供寡核苷酸的三维结构和靶标结合能力的差异。
发明内容
中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰
胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所
述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶
和所述第二5位修饰嘧啶能够通过KOD DNA聚合酶并入。
啶。在一些实施方案中，所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至
20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至
50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。在一些实施方案中，与具有相同长度和包含替代第
一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的
核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长半衰期。
述第二5位修饰嘧啶不同。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在各多核苷酸的5’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在所述多核苷酸的3’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷
并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一
些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、色胺酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二
5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、
2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过
KOD DNA聚合酶并入。
60个、或40至50个核苷酸长度。
修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的
5位修饰嘧啶。
饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，
所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基
部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自
NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些
实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过KOD DNA聚合酶并入。
位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC和TyrdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自
BNdU、NapdU、PEdU、IbdU、FBndU、2NapdU、NEdU、MBndU、BFdU、BTdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；
所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。在一些实施方案中，所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。在一些实施方案中，所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、DNA、肝素和dNTP。在一些实施方案中，葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且DNA为鲱精DNA或鲑鱼精DNA。在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。
饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，
所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基
部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自
NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方
案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过KOD DNA聚合酶并入。
位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自BndC、PEdC、PPdC、NapdC、2NapdC、NEdC、2NEdC和TyrdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自
BNdU、NapdU、PedU、IbdU、FbndU、2NapdU、NedU、MbndU、BfdU、BtdU、PpdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。
嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，
所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基
部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自NapdC、2NapdC、TyrdC和PPdC。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为NapdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、
2NapdU、PPdU、MOEdU、TrydU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为PPdC并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自NapdU、2NapdU、PPdU、MOEdU、TyrdU、TrpdU和ThrdU。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为TyrdU。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方
案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过KOD DNA聚合酶并入。
提供的适配体。在一些实施方案中，所述胆固醇为低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)。在一些实施方案中，所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾
病(CVD)。
结合曲线上在32nM最高浓度下无可检测结合。各文库上的黑线指示关于该文库中的所有适
配体的中值。
点为单一修饰适配体并且绿点(空心和填充)为两种修饰适配体。填充绿点表示一些Nap-
dC/Tyr-dU和PP-dC/Tyr-dU适配体。
个别文库的单一碱基修饰和两种碱基修饰适配体的亲和力比较和可截短性。具有≥1nM的
亲和力的适配体以灰色阴影突出显示，最高平均亲和力是针对具有PP-dC与PP-dU、Nap-dU
和Tyr-dU的两种修饰碱基组合的适配体。
一修饰碱基(即，三种适配体具有Nap-dC/dT；三种适配体具有dC/Nap-dU；三种适配体具有dC/Pp-dU并且两种适配体具有dC/Ty-dU)并且二十二种适配体具有双重修饰碱基(亦即，三
种适配体具有Nap-dC/Nap-dU；三种适配体具有Nap-dC/Pp-dU；三种适配体具有Nap-dC/
Moe-dU；三种适配体具有Nap-dC/Tyr-dU；三种适配体具有Pp-dC/Pp-dU；三种适配体具有
Pp-dC/Nap-dU；三种适配体具有Pp-Ty-dU，并且一种适配体具有Pp-dC/Moe-dU)。在100nM亲和力处的虚线下方的适配体指示在100nM浓度下无可检测结合。未测试与剩余PC(PCSK5、
PCSK6和PCSK8)的亲和力。
于50倍的信号的夹心对。所述夹心分析中测试的所有适配体均为Kd≤1nM的40聚体。总计70对显示≥50倍的信号。当各对的各适配体选自单一修饰文库时，鉴别三种夹心对(3种夹心
适配体对/3种单一碱基修饰文库)。相比之下，当各对的一种适配体选自三种单一碱基修饰文库并且所述对的另一适配体选自四种双重碱基修饰文库时，鉴别22种夹心对(即，22种夹心适配体对/3种单一碱基修饰文库和4种双重碱基修饰文库)并且当各对的两种适配体均
选自双重修饰文库时，鉴别45种夹心对(45种夹心适配体对/5种双重碱基修饰文库)。(C)关于源于具有单一碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有单一碱基修饰适配体的检测适
配体文库；具有单一碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有两种碱基修饰适配体的检测
适配体文库；以及具有两种碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有两种碱基修饰适配体
的检测适配体文库的靶标蛋白PCSK9的夹心对数目的比较。
号。(B)用与所选一次或捕捉适配体配对的表现最好的二次或检测适配体观察浓度依赖性
信号。(C)主要夹心对dC/PP-dU适配体(一次)和Nap-dC/Nap-dU适配体(二次)，当所述适配
体的取向转换时显示信号。(D)用重组野生型PCSK9和功能获得型突变体PCSK9D374Y获得的
标准曲线。用检测野生型PCSK9(圆形)和功能获得型突变体PCSK9D374Y(三角形)蛋白的夹
心对获得线性浓度依赖性信号。
(LLOQ)的定量下限的适配体夹心测定观察线性浓度依赖性信号。(B)用具有约10ng/mL
(ULOQ)的定量上限的适配体夹心测定观察线性浓度依赖性信号。
PCSK9(经填充蓝色圆形)、人类功能获得型突变体PCSK9D374Y(经填充红色圆形)、恒河猴
PCSK9(经填充绿色正方形)、大鼠PCSK9(经填充粉色六边形)、小鼠PCSK9(经填充倒三角形)的亲和力以及混合型对照适配体(空心黑色菱形)。(B)物种交叉反应性潜在治疗性的两种
碱基修饰适配体显示对PCSK9与LDL-R相互作用的抑制。适配体潜在地以2.1nM的EC50值(蓝
色经填充圆形)抑制PCSK9与LDL-R相互作用并且以3.6nM的EC50值(红色经填充三角形)抑制
PCSK9D374Y并且混合型对照适配体显示对野生型PCSK9(绿色经填充正方形)和功能获得型
突变体PCSK9D374Y(空心黑色正方形)无抑制。
到。
NapdC(Nap)或PPdC(PP)；并且Y表示dU或dT(未修饰核苷酸、TyrdU(Tyr)、NapdU(Nap)、PPdU(PP)或MOEdU(MOE))。
320nM亲和力显示的适配体表示在结合曲线上在32nM最高浓度下无可检测结合。各文库上
的黑线指示关于该文库中的所有适配体的中值。
(例如Bn、PE和PP)、萘基部分(例如Nap、2Nap、NE)、丁基部分(例如iBu)、氟苯甲基部分(例如FBn)、酪氨酰基部分(例如Tyr)、3，4-亚甲基二氧基苯甲基(例如MBn)、吗啉代部分(例如
MOE)、苯并呋喃基部分(例如BF)、吲哚部分(例如Trp)和羟丙基部分(例如Thr)。
(例如Bn、PE和PP)、萘基部分(例如Nap、2Nap、NE和2NE)和酪氨酰基部分(例如Tyr)。
854287-9)；Kendrew等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.公布，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，
Inc.公布，1995(ISBN 1-56081-569-8)中。
并且为了描述而提供。
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围(以及其分数，除非本文另外清楚地规定)。除非另外指示，否则任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数范围均应理解为包括在所陈述的范围内的任何整数值并且当适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一
和百分之一)。而且，除非另外指示，否则本文中关于任何物理特征(诸如聚合物亚基、尺寸或厚度)所陈述的任何数字均应理解为包括在所陈述的范围内的任何整数。除非另外指示，否则如本文所用，“约”或“基本上由......组成”意指所指示的范围、值或结构的±20％。如本文所用，术语“包括”和”包含”为开放式并且同义使用。
2’-甲氧基等。类似地，除非另外特定地指示，否则术语“修饰胞嘧啶核苷”或特定修饰胞嘧啶核苷也是指包含修饰胞嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸(诸如2’-氟、2’-甲氧基等)。除非另外特定地指示，否则术语“尿嘧啶核苷”一般地用于是指包含尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸。术语“尿嘧啶核苷”包括
2’-修饰尿嘧啶核苷，诸如2’-氟、2’-甲氧基等。类似地，除非另外特定地指示，否则术语“修饰尿嘧啶核苷”或特定修饰尿嘧啶核苷也是指包含修饰尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核
糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸(诸如2’-氟、2’-甲氧基等)。
甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“BndC”并且显示于图21中)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-
2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“PedC”并且显示于图21中)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“PPdC”并且显示于图21中)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“NapdC”并且显示于图21中)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“2NapdC”并且显示于图21中)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作
“NEdC”并且显示于图21中)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作
“2NEdC”并且显示于图21中)；以及5-(N-酪氨酰基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作TyrdC并且显示于图21中)。在一些实施方案中，所述C5修饰胞嘧啶核苷(例如，呈其三磷酸酯形
式)能够通过聚合酶(例如KOD DNA聚合酶)并入寡核苷酸中。
非限制性示例性5位修饰尿嘧啶核苷包括：
电键的那些(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具有嵌入剂的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷基化剂的那些以及具有修饰键的那些(例如，α异头核酸等)。此外，通常存在于核苷酸的糖上的任何羟基均可通过膦酸酯基或磷酸酯基置换；通过标准保护基保护；或被活化以制备额外核苷酸或固体支撑物上
的额外键。5′和3′端OH基团可被磷酸化或用胺、具有约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中介于约10至约80kDa范围内的聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一个实施
方案中介于约20至约60kDa范围内的PEG聚合物或其他亲水性或疏水性生物或合成聚合物
取代。
由P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NRX2(“酰胺化物”)、P(O)RX、P(O)ORX′、CO或CH2(“甲缩醛”)置换，其中各RX或RX′独立地为H或任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代烷基(C1-C20)。并非多核苷酸中的所有键均需要相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代可有利于设计最终产物，例如，如替代性主链结构(像聚酰胺主链)也可如此。
的机制结合适配体的多核苷酸之外的三维化学结构，其中所述适配体并非具有由靶标分子
结合的已知生理学功能的核酸。给定靶标的适配体包括通过如下方法由核酸的候选混合物
鉴别的核酸，其中所述适配体为靶标的配体，所述方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中相对于候选混合物中的其他核酸对靶标具有增加的亲和力的核酸可从候选混合物的
剩余部分分配；(b)从候选混合物的剩余部分分配亲和力增加的核酸；以及(c)扩增亲和力
增加的核酸以生成核酸的配体富集混合物，由此鉴别靶标分子的适配体。应认识到亲和力
相互作用为程度问题；然而，在此背景下，适配体对其靶标的“特异性结合亲和力”意指所述适配体一般以比其结合混合物或样品中的其他、非靶标组分高得多的亲和力程度结合其靶
标。“适配体”、“SOMA聚体”或“核酸配体”为一种类型或种类的具有特定核苷酸序列的核酸分子的拷贝集合。适配体可包括任何合适数目的核苷酸。“适配体”是指分子的超过一种此类集合。不同的适配体可具有相同或不同数目的核苷酸。适配体可为DNA或RNA并且可为单
链、双链或含有双链或三链区域。在一些实施方案中，适配体使用如本文所述或本领域中已知的SELEX方法制备。
TyrdU、NapdC和ThrdU、PPdC和PPdU、PPdC和NapdU、PPdC和MOEdU、PPdC和TyrdU、PPdC和
ThrdU、NapdC和2NapdU、NapdC和TrpdU、2NapdC和NapdU、和2NapdC和2NapdU、2NapdC和PPdU、
2NapdC和TrpdU、2NapdC和TyrdU、PPdC和2NapdU、PPdC和TrpdU、PPdC和TyrdU、TyrdC和
TyrdU、TrydC和2NapdU、TyrdC和PPdU、TyrdC和TrpdU、TyrdC和TyrdU、以及TyrdC和TyrdU。在一些实施方案中，适配体包含至少一种修饰尿嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶核苷和至少一种修
饰胞嘧啶核苷，其中所述至少一种修饰尿嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶核苷在5位处用选自萘基
部分、苯甲基部分、氟苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3，4-亚甲基二氧基苯甲基部分、苯并噻吩基部分以及苯并呋喃基部分的部分修饰，并且其中所
述至少一种修饰胞嘧啶核苷在5位处用选自萘基部分、酪氨酰基部分和苯甲基部分的部分
修饰。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
成时实质上不含化学前体或其他化学品。
饰嘧啶在所述第二5位修饰嘧啶的5位处包含萘基部分或苯甲基部分。在一个相关实施方案
中，所述第一5位修饰嘧啶为尿嘧啶。在一个相关实施方案中，所述第二5位修饰嘧啶为胞嘧啶。在一个相关实施方案中，所述适配体的尿嘧啶的至少10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％在5位处被修饰。在一个相关实施方案中，所述适配体的胞嘧啶的至少10％、15％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％在5位处被修饰。
苷。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含两种不同的C5修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含两种不同的C5修饰尿嘧啶核苷。非限制性示例性C5修饰尿嘧啶核苷
和胞嘧啶核苷显示于例如下式I中和图20中。某些非限制性示例性C5修饰尿嘧啶核苷显示
于图21中，并且某些非限制性示例性C5修饰胞嘧啶核苷显示于图22中。
(COOR )，其中R 为支链或直链低级烷基(C1-C20)；以及环烷基，其中R 和R 一起形成取代或未取代的5元或6元环；
Acids Res.18：5433-5441，其内容由此以引用的方式整体并入)。如本文所注，亚磷酰胺适用于通过化学合成将修饰核苷并入寡核苷酸中，并且三磷酸酯适用于通过酶促合成将修饰
核苷并入寡核苷酸中。(参见例如Vaught，J.D.等人(2004)J.Am.Chem.Soc.，126：11231-
11237；Vaught，J.V.等人(2010)J.Am.Chem.Soc.132，4141-4151；Gait，M.J.
“Oligonucleotide Synthesis a practical approach”(1984)IRL Press (Oxford，UK)；
Herdewijn，P“.Oligonucleotide Synthesis”(2005)(Humana Press，Totowa，N.J.(其各自以引用的方式整体并入本文中)。
合。所述SELEX方法可用于鉴别对特定靶标分子或生物标记物具有高亲和力的适配体。
亲和力复合物、纯化核酸、以及鉴别特定适配体序列。所述方法可包括多轮以进一步细化所选适配体的亲和力。所述方法可在所述方法的一个或多个点处包括扩增步骤。参见例如标
题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利第5,475,096号。所述SELEX方法可用于产生共价结合其靶标的适配体以及非共价结合其靶标的适配体。参见例如标题为“Systematic
Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX”的美
国专利第5,705,337号。
核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置处的化学取代。SELEX方法鉴别的含有修饰核苷酸的适配
体描述于标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing
ModifiedNucleotides”的美国专利第5,660,985号中，所述专利描述含有在嘧啶的5′和2′位置处以化学方式修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号(参见上文)
描述含有用2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的一种或多种核苷酸的高度特异性适配体。还参见标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公开第
20090098549号，所述公开描述具有扩展的物理和化学特性的核酸文库以及其在SELEX和光
交联SELEX中的用途。
以引用的方式整体并入本文中，其描述用于产生可结合靶标分子的适配体的改进SELEX方
法。描述了用于产生具有较慢的与其相应靶标分子解离的速率的适配体和光适配体的方
法。所述方法涉及使候选混合物与靶标分子接触、允许发生核酸-靶标复合物的形成、以及执行缓慢解离速率富集方法，其中具有快速解离速率的核酸-靶标复合物解离且不会再形
成，而具有缓慢解离速率的复合物保持完整。另外，所述方法包括在候选核酸混合物的产生中使用修饰核苷酸以产生具有改进解离速率性能的适配体(参见标题为“SELEX and
PhotoSELEX”的美国专利第8,409,795号)。(还参见美国专利第7,855,054号和美国专利公
开第20070166740号)。这些申请各自以引用的方式整体并入本文中。
任何微小变化，诸如在蛋白的情况下，氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合，其不会实质上改变分子身份。“靶标分子”或“靶标”为一种类型或种类的能够结合适配体的分子或多分子结构的拷贝的集合。“靶标分子”或“靶标”是指分子的超过一种此类集合。其中靶标为肽的SELEX方法的实施方案描述于标题为“ModifiedSELEX Processes Without Purified Protein”的美
国专利第6,376,190号中。在一些实施方案中，靶标为蛋白。
所述缓慢解离速率富集方法为基于溶液的缓慢解离速率富集方法。在此实施方案中，基于
溶液的缓慢解离速率富集方法在溶液中发生，使得混合物中形成适配体亲和力复合物的靶
标和核酸均未在所述缓慢解离速率富集方法期间固定于固体支撑物上。在多个实施方案
中，所述缓慢解离速率富集方法可包括一个或多个步骤，包括添加竞争分子和用竞争分子
孵育、稀释混合物或这些步骤的组合(例如，在竞争分子存在下稀释混合物)。因为缓慢解离速率富集方法的效应一般取决于不同适配体亲和力复合物(即，在靶标分子与候选混合物
中的不同核酸之间形成的适配体亲和力复合物)的不同解离速率，所以选择所述缓慢解离
速率富集方法的持续时间以便保持高比例的具有缓慢解离速率的适配体亲和力复合物，同
时实质上降低具有快速解离速率的适配体亲和力复合物的数目。所述缓慢解离速率富集方
法可在SELEX方法期间以一个或多个循环使用。当稀释和添加竞争剂组合使用时，其可同时或以任何次序依序执行。当混合物中的总靶标(蛋白)浓度低时，可使用所述缓慢解离速率
富集方法。在一个实施方案中，当所述缓慢解离速率富集方法包括稀释时，所述混合物可尽量可行地加以稀释，注意将适配体保持的核酸回收用于SELEX方法中的后续循环。在一个实施方案中，所述缓慢解离速率富集方法包括使用竞争剂以及稀释，从而允许所述混合物以
低于不使用竞争剂时可能所必需的程度加以稀释。
于鉴别特定适配体。然而，在此类方法中，肝素或葡聚糖在其中靶标和适配体结合形成复合物的平衡步骤期间存在。在此类方法中，因为肝素或葡聚糖的浓度增加，所以高亲和力靶
标/适配体复合物与低亲和力靶标/适配体复合物的比率增加。然而，高浓度的肝素或葡聚
糖可由于在核酸与竞争剂之间竞争靶标结合而降低平衡时高亲和力靶标/适配体复合物的
数目。相比之下，目前描述的方法在已允许靶标/适配体复合物形成之后添加竞争剂并且因此不会影响所形成的复合物的数目。在平衡结合已在靶标与适配体之间发生之后添加竞争
剂会产生非平衡状态，其适时发展为具有较少靶标/适配体复合物的新平衡。在新平衡已实现之前捕捉靶标/适配体复合物会富集用于缓慢解离速率适配体的样品，因为快速解离速
率复合物将首先解离。
物不太可能在也含有所述聚阴离子抵抗性材料的溶液中解离的适配体/靶标复合物的适配
体。以此方式，聚阴离子抵抗性适配体可用于执行分析方法以检测样品中靶标的存在或量
或浓度，其中所述检测方法包括使用适配体所抵抗的聚阴离子材料(例如硫酸葡聚糖)。
大多数快速解离速率适配体与靶标分子解离。而且，候选混合物中可在聚阴离子竞争剂存
在下解离的适配体将从靶标分子释放。所述混合物被分配以离析已保持与靶标分子缔合的
高亲和力、缓慢解离速率适配体并且从溶液中移除任何未复合材料。所述适配体可接着从
靶标分子释放并且被离析。离析适配体也可被扩增并且应用额外数轮选择以增加所选适配
体的总体性能。如果缓慢解离速率适配体的选择不是特定应用所需要的，则此方法也可与
最少孵育时间一起使用。
段足以在靶标分子与候选混合物中所含的核酸之间发生平衡结合。在平衡结合之后，过量
竞争分子(例如，聚阴离子竞争剂)添加至混合物中并且所述混合物与过量竞争分子一起孵
育一个预定时间段。大部分具有低于此预定孵育时间段的解离速率的适配体将在所述预定
孵育时间段期间从靶标解离。这些“快速”解离速率适配体与靶标的再缔合由于过量可非特异性结合靶标并占据靶标结合位点的竞争分子而减至最少。大部分具有较长解离速率的适
配体将在所述预定孵育时间段期间保持复合至靶标。在孵育时间段结束时，从所述混合物
的剩余部分分配核酸-靶标复合物会允许分离缓慢解离速率适配体的群体与具有快速解离
速率的那些群体。解离步骤可用于解离缓慢解离速率适配体与其靶标并且允许对靶标分子
具有高亲和力和特异性的缓慢解离速率适配体(个别适配体或一组缓慢解离速率适配体)
离析、鉴别、测序、合成和扩增。如同常规SELEX，从一轮修改的SELEX方法鉴别的适配体序列可用于合成新的候选混合物，使得接触、平衡结合、添加竞争分子、与竞争分子一起孵育和分配缓慢解离速率适配体的步骤在必要时可重做/重复许多次。
适配体群体。
育时间段可选自：至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时。
1nM、小于约100pM、小于约10pM、小于约1pM。
30-40个随机化位置。在一些实施方案中，寡核苷酸文库的各寡核苷酸包含侧接所述随机化位置的固定序列。此类固定侧接序列可彼此相同或不同(即，5’侧接序列和3’侧接序列可相同或不同)，并且在一些实施方案中可对于所述文库的所有成员均相同(即，所述文库的所
有成员可具有相同5’侧接序列，和/或所述文库的所有成员可具有相同3’侧接序列)。
是修饰或未修饰的(例如，所述随机化区域中的所有胞嘧啶核苷或修饰，或全部未修饰)。在一些实施方案中，所述随机化区域中一种类型的核苷酸碱基以修饰和未修饰形式存在。在
一些此类实施方案中，所述随机化位置由两种修饰和两种未修饰核苷酸碱基构成。在一些
此类实施方案中，所述随机化位置由腺嘌呤、鸟嘌呤、C5修饰胞嘧啶核苷和C5修饰尿嘧啶核苷构成。非限制性示例性C5修饰胞嘧啶核苷和C5修饰尿嘧啶核苷示出在图19至21中。寡核
苷酸文库及其制备方法进一步描述于例如本文的实施例中。
5’-yEAyGAnpAp-3’，其中E选自y、A和G；并且n为0或1。在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，序列5’-yEAyGAnpAp-3’位于序列5’-yGpppG-3’的5’。在一些实施方案中，E为y。
提供的适配体。在一些实施方案中，所述胆固醇为低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(LDL-C)。在一些实施方案中，所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾
病(CVD)。
Acceptable Salts”J.Pharm.Sci.66：1-19中。
5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；
以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)
之后。
嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
列。
每一种的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。
啶中每一种的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长
半衰期。
实施例
物，而不偏离本发明的精神。
括类似于氨基酸上的疏水性侧链的疏水性芳族侧链。还测试dU上的亲水性侧链(MOE-dU和
Thr-dU)。所述18种文库各自含有30种随机化核苷酸，从而允许≥1015种不同序列。所述文库使用天然和/或修饰核苷酸三磷酸酯使用外切KOD DNA聚合酶酶促合成(数据未示)。
在各种情况下，所述无规区域侧接用于杂交PCR扩增引物(表2)的固定序列，在5’末端处和在3’末端处具有额外间隔区。主合成模板用于产生所有dU和或dC位置均匀地在替换性引物延伸反应中修饰的修饰文库。
应中，20pmol生物素化反义文库与40pmol 5’冷引物(2X)和痕量32P标记的5’引物、1X SQ20缓冲液(120mM Tris-HCl，pH 7.8；10mM KCl；6mM(NH4)2SO4；7mM MgSO4、0.1％Triton X-100和0.1mg/mL BSA)中的0.5mM天然或修饰dNTP和0.25U/mL KOD聚合酶(外切)混合。将所述混
合物热冷却，随后添加DNA聚合酶并且在68℃下进行所述反应2h，接着在10℃下冷却。来自各文库反应的部分连同游离标记引物在10％TBU脲凝胶上运行。小的等分试样在变性凝胶
上运行，所述变性凝胶暴露至荧光屏并且用Fuji磷相仪成像，使用ImageGauge4.0软件对色带定量并且结果以Graph pad Prism软件6.05绘制曲线。关于制备初始文库，使用在
PierceTM高容量抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒(Life Technologies)上捕捉的主生物素化反
义无规文库进行大规模引物延伸反应。与100％未修饰文库DNA(dC/dT)对照物相比，对于某些两种修饰核苷的组合获得较低文库产率，例如对于Nap-dC/Nap-dU为28％±1.3％，对于
Nap-dC/MOE-dU为40％±5.2％，并且对于PP-dC/Nap-dU为43％±2.7％。由测序结果计算各
核苷酸的频率，所述结果获自初始文库和用于产生各单一和两种碱基修饰文库的主反义无
规模板。主无规反义模板(30N)在1μM规模下用1∶1∶1∶1比率的dA∶dG∶dC∶dT(TriLink Biotechnologies)以化学方式合成。初始无规单一碱基和两种碱基修饰文库在大规模反应
中酶促合成并且用于选择实验中。这些文库连同富集池一起测序并且对于30N无规区域中
的所有四种碱基以总计100％对核苷酸频率绘制曲线。与起始合成性天然DNA模板文库和酶
促合成的未修饰DNA对照初始文库相比，当使用深度测序测定文库的碱基组成时在核苷酸
频率方面未观察到显著偏差(数据未示出)。
靶标稀释。参见表1(R1＝第1轮，R2＝第2轮等)。选择通过将修饰无规文库(或对照未修饰)(≥1000pmol)和人类重组His标记的靶标蛋白PCSK9混合来开始，所述靶标蛋白在100μL体
积中以0.5μM浓度存在。所选择的复合物分配在磁性His标签捕捉 上，洗涤未
结合序列，洗脱所选择的适配体并且使用所有天然核苷酸和3’生物素-引物进行PCR扩增。
在3’末端处生物素化的天然双链DNA捕捉在 MyOneTM抗生蛋白链菌素C1珠粒
上，通过碱性变性消除有义链并且在引物延伸反应中用修饰dC和或dU置换以再生富集池并
且用稀释蛋白重复选择循环。用于下一轮SELEX的蛋白浓度基于由每种样品的临界循环时
间(Ct)值计算的信号：背景比率来测定。
据证明了两种修饰文库组合导致与单一修饰文库相比富集序列的多样性更高(数据未示
出)。为了测试适配体的结合亲和力，选择序列的广泛集合，其不仅表示高拷贝独特序列，而且表示来自不同家族的低拷贝序列(数据未示出)。所有适配体均通过标准固相亚磷酰胺化
学使用修饰/未修饰亚磷酰胺试剂以化学方式合成。所有适配体最初在溶液中用放射性标
记的过滤器结合测定筛选为截短的40聚体，其含有30核苷酸无规区域和来自5’和3’末端的用于其PCSK9结合亲和力的固定引物区域的额外5个核苷酸。所述截短适配体(40聚体)包含
来自固定区域的10个核苷酸。未修饰对照DNA文库(dC/dT)不会产生任何活性序列(Kd＜
32nM)，这是预期的，因为对此文库的池亲和力为单调的(数据未示出)并且另外深度测序数据不会产生任何富集的多拷贝序列(数据未示出)。在dC或dU上具有Nap(萘基)修饰的单一
修饰文库产生对靶标具有亲和力的适配体，然而，对靶标具有最大亲和力的适配体由具有
Tyr(酪氨酰基部分)修饰的dU的Nap(萘基部分)或PP(苯甲基部分)修饰的dC获得(图2)。用
dT置换Tyr-dU会取消与靶标的结合，这指示酪氨酰基部分对与PCSK9的靶标表面的结合相
互作用的重要性(数据未示出)。亲和力数据证明两种修饰核苷酸的适配体一般具有大于单
一修饰核苷酸适配体的亲和力，并且当与单一修饰核苷酸适配体相比时还提供更大数目的
结合PCSK9的适配体(图3)。此外，高拷贝单一修饰核苷酸的适配体具有在0.1-100nM之间的平均亲和力，而高拷贝两种修饰核苷酸的适配体具有≤0.1nM的平均亲和力。
分比低于21％，并且所有单一修饰适配体的平均Kd为5，2nM。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)的适配体的百分比为43％。此外，具有Kd≤10nM的所有两种修
饰的适配体的百分比为47％，并且所有两种修饰的适配体的平均Kd为0.12nM。
PP-dU、Nap-dU或Tyr-dU的两种碱基修饰组合，可能截短至30聚体的40聚体的百分比和数目与其他文库相比也更高(图4B)。测试较少的来自单一碱基修饰文库的适配体，因为在三种
文库中仅有14种适配体具有≤1nM的亲和力(40聚体，对于单一修饰在图4B中的灰色区域
中)。相比之下，来自具有高亲和力的两种碱基修饰文库的适配体的数目为93(40聚体，对于两种修饰在图4B的灰色区域中)，对于具有修饰dU的Nap-dC为48并且对于具有修饰dU的PP-
dC为45。各文库上的黑色水平线指示关于该文库中的所有适配体的中值。不意图受任何特
定理论束缚，有可能的是，PP修饰碱基中的延长碳链(与其他修饰相比)帮助到达在靶标表
面上难以接近的表位并且无需用于结构折叠和有效蛋白结合相互作用的固定引物区域。
结果证明所述适配体对PCSK9具有特异性并且在100nM浓度下用其他PC(图5)未观察到可检
测结合。
PP-dC/Tyr-dU)的适配体结合大鼠和小鼠PCSK9(同一性约76％)。这些结果证明某些两种碱
基修饰文库(例如PP-dC/Nap-dU和PP-dC/Tyr-dU)产生可以相似亲和力结合啮齿动物和人
类/猴PCSK9的适配体(图6)。
现结合非竞争性信号传导表位的第二适配体。为了证明在选择可结合靶标表面上的不同表
位的适配体时通过dC和dU合起来的修饰的多重性所产生的化学多样性是否扩展，开发基于
珠粒的夹心对筛选测定，其中使用 抗生物素蛋白偶合的磁性珠粒
来捕捉生物素化一级适配体(图7A)。将具有个别适配体的捕捉珠粒混合在一起使用以搜索
多重成对组合中的第二结合配对物(图7A)。关于此实验，使用来自单一和两种碱基修饰文
库的具有亲和力Kd≤1nM的40聚体适配体(n＝96，9216对)。简言之，将个别适配体(每种样品0.05pmol)捕捉于单一MagPlex抗生物素蛋白珠粒类型上并且混合在一起(在一个实验中
为24个珠粒，每种样品1000个珠粒)并且在室温下在1850rpm下在震荡下捕捉持续20min。将珠粒用1X SBT洗涤持续2min，随后在1XSBT中用0.5mM游离生物素洗涤持续5min，随后用1X SBT洗涤3次，每次持续2min。将珠粒用游离抗生蛋白链菌素阻断持续5min并且再次用1X
SBT洗涤持续2min。将具有个别适配体的24种不同珠粒类型混合在一起用于筛选各捕捉适
配体的夹心配对物。将检测或二级适配体在1XSBT中稀释至500nM，热冷却并且与PCSK9(最
终10nM)混合，在25℃下孵育1h。添加1000个捕捉珠粒并且进一步在震荡下孵育1h。接着将珠粒捕捉于磁体上，用1X SBT洗涤三次每次持续2min并且再悬浮于具有0.1％BSA和100uM
DxSO4的75μL 1X SBT中。向其中添加75μL抗生蛋白链菌素藻红蛋白(最终5μg/mL)并且在25℃下在震荡下孵育20min。将珠粒最终再次用1X SBT洗涤持续2min并且在Luminex 3D xMAP
机器上读数。
7C，图7B)。
(10nM PCSK9浓度；所测试的所有对的0.75％，9216对中的70对；图7C)的PCSK9浓度依赖性反应，其中结果的子集示出在图8A(示出针对单一碱基修饰一级适配体dC/PP-dU的浓度依
赖性信号并且良好起作用的最佳二级为两种碱基修饰适配体Nap-dC/Nap-dU[三角形])和
8B(示出针对两种碱基修饰二级适配体Nap-dC/Nap-dU的浓度依赖性信号并且良好起作用
的最佳一级为单一碱基修饰适配体dC/PP-dU[闭合正方形])中。有趣的是，构成单一碱基修饰一级(PP-dU，亲和力Kd 175pM)和两种碱基修饰二级(Nap-dU/Nap-dC，亲和力Kd 531pM)
的一个特异性对在一种取向中产生比任何其他对高得多的稳固信号(图8C)。然而，当此单
一碱基修饰一级适配体转换为二级适配体时，信号丧失，这指示所述适配体的取向对此夹
心对而言为重要的。此适配体夹心对也可测量功能获得型突变蛋白PCSK9D374Y的活性(图
8D)，所述突变蛋白对LDL-R的亲和力高于野生型PCSK9并且据报告在患有重度形式的家族
性高胆固醇血症(FH)的患者中过度表达。关于突变体PCSK9 D374Y的敏感性和MFU值高于野
生型蛋白。
浆样品(n＝5)连续地用测定缓冲液稀释以拟合所述测定的动态范围内的值。
示出，其定义为可使用应用于标准曲线的4参数逻辑(4PL)拟合定量的最低和最高PCSK9浓
度，导致已知靶标浓度的80％-120％恢复。为了确定测定内变异性，在单一板中测试已知浓度的五种血浆样品16次。参见表7。所述测定内的变异系数(CV)介于4.3％至6％范围内。为了确定分析间变异性，在五个独立测定中测量已知浓度的五种血浆样品。参见表8。测定之间的CV介于2.3％至9.8％范围内。最终，为了确定靶标测量值的准确性，使五种血浆样品掺加不同量的PCSK9并且进行测量。评价在所述测定的范围内掺加的PCSK9水平的恢复。参见
表9。样品的恢复百分比平均为掺加的靶标的83.1％至137.5％。
两组之间进行统计学区分，因为已知使用司他汀会增加PCSK9的血浆浓度。使用捕捉或一级SOMA聚体(11723-5)作为单一碱基修饰适配体(PP-dU/dC)并使用二级或检测适配体
(11727-20)作为两种碱基修饰适配体(Nap-dC/Nap-dU)来开发所述夹心测定。
PCSK9疗法的人。
System Biosciences LentiViral系统(LV300A-1)使PCSK9在HepG2细胞中过度表达。所述
HepG2细胞系用获自Origene(RC220000L1)的用于野生型人类PCSK9的慢病毒表达克隆转导
以产生稳定细胞系。总计96种个别克隆针对其分泌PCSK9的能力进行筛选。在培养基中分泌的PCSK9的相对量通过用于各种克隆的适配体夹心测定来测量并且与来自野生型HepG2细
胞的表达进行比较。用于产生重组蛋白的细胞的数目使用Cell 发光细胞活力
测定来归一化。克隆数目45分泌比野生型HepG2细胞多约100倍的PCSK9。
物通过化学发光试剂检测生物素化PCSK9的结合(图13)。将重组LDL-R(Acro Biosystems)
在4℃下涂布于ELISA板上(2.5μg/mL)过夜，并且接着在室温下洗涤各孔并用Super Block
(Invitrogen)阻断持续1h。将生物素化PCSK9(Acro Biosystems，Avi标记)和适配体混合在一起并且在室温下孵育1h，接着添加至ELISA板中并进一步在室温下在震荡下孵育2h。最高PCSK9浓度为0.5nM并且适配体的最高浓度为100nM，并且接着将这些浓度针对抑制曲线通
过1/2log连续地稀释。将抗生蛋白链菌素结合的HRP(Invitrogen，1μg/ml)添加至各孔中并且在室温下在震荡下孵育30min，添加Pico敏感性化学发光底物(Invitrogen)，在光度计
(Hidex Plate Chameleon)中测量发光，并且将数据在Graph Pad Prism 6.0软件中绘制曲
线以计算EC50值。将PCSK9中和抗体(BPS Bioscience)用作对照物。
PCSK9与LDL-R的相互作用(数据未示出)。进一步针对剂量-反应曲线评价适配体以测定其
用于抑制的EC50值。结果指示许多抑制剂潜在地以0.1-1nM范围内的EC50抑制PCSK9与LDL-R的相互作用(图14)。为了证明两种修饰适配体的潜在治疗价值，选择一种物种交叉反应性
PCSK9适配体(30聚体，Seq ID.11733-915(11733-198))来测量靶标与来自多种物种的
PCSK9的亲和力。此适配体分别对人类(野生型)、恒河猴、人类(GOF突变体D374Y)、小鼠和大鼠PCSK9具有14.7、11.3、5.2、77和165pM的亲和力(图15A)。此适配体也以2.1nM的EC50阻断野生型人类PCSK9LDL-R相互作用并且以3.6nM的EC50阻断GOF突变体PCSK9D374Y LDL-R相互
作用(图15B)。评价与其他PC相比此适配体对PCSK9的特异性，并且结果显示此适配体仅结
合PCSK9并且不结合其他PC(数据未示出)。
添加萤光标记的LDL持续3h。结果显示出所述适配体可以159nM的EC50逆转LDL摄取(图16和
图17)。此外，适配体处理可增加PCSK9过度表达的HepG2细胞中的LDL-R水平，如通过FACS所测量(图17。由物种交叉反应性、高亲和力、截短、特异性并高度有效适配体获得的这些结果表明两种碱基修饰适配体的潜在治疗价值可通过SELEX后修饰针对长度和生物稳定性进一
步最佳化。
0.03％、EDTA钠20mM、二甲苯蓝0.05％、溴酚蓝0.05％、Orange G 0.1％)。然后将等分试样混合物储存于-20℃下。在分析之前，将40μL等分试样混合物用100μL H2O稀释并且用150μL
25∶24∶1苯酚∶氯仿∶异戊醇萃取。将所述样品在16，100xg下离心持续15分钟，并且移出含适配体的水相并储存于-20℃下直至凝胶分析。
期通过线性回归拟合使用凝胶定量的数据以GraphPad Prism 7软件计算。图18示出随时间
剩余的全长适配体的百分率。一般而言，双重修饰适配体证明人类血清中随时间的稳定性
大于单一修饰适配体。
dT；以及dC/Tyr-dU文库；以及双重修饰Nap-dC/Tyr-dU和PP-dC/Tyr-dU文库。对于PSMA，使用未修饰dC/dT文库；单一修饰Nap-dC/dT；PP-dC/dT；dC/Nap-dU、dC-PP-dU、dC-MOE-dU和dC/Tyr-dU文库；以及双重修饰Nap-dC/Nap-dU、Nap-dC/PP-dU、Nap-dC/MOE-dU、Nap-dC/
Tyr-dU、PP-dC/PP-dU、PP-dC/Nap-dU和PP-dC/Tyr-dU文库。
百分比为12％，并且所有单一修饰适配体的平均Kd为12.3nM。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为54％。此外，具有Kd≤10nM的所有两种修饰
适配体的百分比为20％，并且所有两种修饰的适配体的平均Kd为6.6nM。
百分比低于2％，并且所有单一修饰适配体的平均Kd为15.1nM。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为44％。此外，具有Kd≤10nM的所有两种修
饰适配体的百分比为25％，并且所有两种修饰的适配体的平均Kd为0.7nM。
百分比为40％，并且所有单一修饰适配体的平均Kd为6nM。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为24％。此外，具有Kd≤10nM的所有两种修饰适
配体的百分比为69％，并且所有两种修饰适配体的平均Kd为0.02nM。
15
10 种不同序列。所述文库可使用天然和/或修饰核苷酸三磷酸酯使用外切KOD DNA聚合酶
酶促合成。在一些实施方案中，所述无规区域侧接用于杂交PCR扩增引物的固定序列，在5’末端处和在3’末端处具有或不具有额外间隔区。在一些情况下，主合成模板用于产生所有dU和或dC位置均匀地在替换性引物延伸反应中修饰的修饰文库。文库合成可实质上如实施
例1中所述执行。
11730-6(SEQ ID No：4，Kd＝0.1nM)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。
0.2nM)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。
83)，其中r＝Pp-dC并且P＝Nap-dU。适配体11733-44(SEQ ID NO：44，SL1063)为野生型人类PCSK9(IC50＝2.8nM)的最有效30聚体抑制剂。适配体11733-198(SEQ ID No：46，Kd＝
0.07nM)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。
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