一种羊水细胞培养基
阅读：797发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种羊水细胞培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种 羊 水 细胞培养基。本发明培养基包括以下添加成分： 基础 培养基RPMI1640，胰岛素，血小板来源生长因子，表皮生长因子，转化生长因子， 成 纤维 细胞 生长因子，神经生长因子，集落刺激因子，黄芩甙元，大豆异黄 酮 ，β‑胡萝卜素，虾青素，雌二醇，腐胺，亚硒酸钠， 硝酸 铁 ， 柠檬酸 铁，环庚三烯酚酮， 碳 酸氢钠和小 牛 血清。本发明培养基细胞培养周期缩短，抑菌效果明显，不易被 微 生物 感染，同时降低了由 小牛 血清带来的 质量 不均一和 病毒感染 地 风 险。，下面是一种羊水细胞培养基专利的具体信息内容。
1.一种羊水细胞培养基，其特征在于，包括以下成分：基础培养基RPMI164020-40g/L，胰岛素1-30mg/L，血小板来源生长因子5-15μg/L，表皮生长因子10-30μg/L，转化生长因子
1-10μg/L，成纤维细胞生长因子0.25-0.75μg/L，神经生长因子0.1-1μg/L，集落刺激因子
0.32-0.68μg/L，黄芩甙元0.15-5mg/L，大豆异黄酮3.65-14.58mg/L，β-胡萝卜素1-10mg/L，虾青素5-8mg/L，雌二醇0.1-0.56μg/L，腐胺1-10mg/L，亚硒酸钠0.1-5mg/L，硝酸铁0.5-
1.6g/L，柠檬酸铁0.2-0.8mg/L，环庚三烯酚酮0.1-2μM，碳酸氢钠1-3g/L和小牛血清0.1-
2％。
2.根据权利要求1所述羊水细胞培养基，其特征在于，所述羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164025-35g/L，胰岛素15-25mg/L，血小板来源生长因子
10-12μg/L，表皮生长因子18-24μg/L，转化生长因子6-9μg/L，成纤维细胞生长因子0.5-0.7μg/L，神经生长因子0.85-0.9μg/L，集落刺激因子0.4-0.62μg/L，黄芩甙元1-3.5mg/L，大豆异黄酮7.8-13.2mg/L，β-胡萝卜素6.5-7.8mg/L，虾青素5.5-6.5mg/L，雌二醇0.32-0.48μg/L，腐胺3.7-5.6mg/L，亚硒酸钠2.2-3.8mg/L，硝酸铁0.88-1.2g/L，柠檬酸铁0.43-0.75mg/L，环庚三烯酚酮0.84-1.58μM，碳酸氢钠1.8-2.5g/L和小牛血清0.5-1％。
3.根据权利要求1或2所述羊水细胞培养基，其特征在于，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164030g/L，胰岛素23mg/L，血小板来源生长因子11.5μg/L，表皮生长因子
19.2μg/L，转化生长因子7.8μg/L，成纤维细胞生长因子0.65μg/L，神经生长因子0.89μg/L，集落刺激因子0.56μg/L，黄芩甙元2.15mg/L，大豆异黄酮10.42mg/L，β-胡萝卜素7.13mg/L，虾青素6.27mg/L，雌二醇0.42μg/L，腐胺4.73mg/L，亚硒酸钠3.18mg/L，硝酸铁1.05g/L，柠檬酸铁0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
一种羊水细胞培养基
技术领域
[0001] 本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种羊水细胞培养基。
背景技术
[0002] 羊水细胞主要来源于胎儿皮肤、消化、呼吸道等脱落细胞，细胞大部分是衰老和固缩的，脱落细胞中活性细胞数量较少，体外培养相对困难；且影响羊水细胞培养成功率的因素很多，其培养周期长、分裂相少、形态差、不稳定、细胞损耗大等诸多难点，给大部分实验室实际应用带来很多困难。
[0003] 传统的羊水培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基培养的成功率低，成功率低于30％，而且平均培养周期长，培养周期需要20天，且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在基础培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。
[0004] 中国专利(CN101705207B)公开了一种羊水细胞培养基，包含下列组份：基础培养，转铁蛋白，亚硒酸钠，胰岛素，三碘甲状腺氨酸，胰高血糖，碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，睾酮，雌二醇和孕酮；并添加抗氧化剂，抗氧化剂是维生素E和L-抗坏血酸的混合物，同时添加体积百分比为4-15％的胎牛血清。此培养基在较短的7、8天时间内可培养得到能够满足临床诊断和科研要求的大量的处于分裂期的羊水细胞。
[0005] 中国专利申请(CN105039244A)公开了一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(Alpha Tocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种能加快羊水细胞体外增殖速度，促进细胞贴壁生长，缩短培养周期，获得分裂相染色体数目多，提供羊水细胞体外培养成功率的羊水细胞培养基。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现：
[0008] 一种羊水细胞培养基，包括以下成分：基础培养基RPMI164020-40g/L，胰岛素1-30mg/L，血小板来源生长因子5-15μg/L，表皮生长因子10-30μg/L，转化生长因子1-10μg/L，成纤维细胞生长因子0.25-0.75μg/L，神经生长因子0.1-1μg/L，集落刺激因子0.32-0.68μg/L，黄芩甙元0.15-5mg/L，大豆异黄酮3.65-14.58mg/L，β-胡萝卜素1-10mg/L，虾青素5-
8mg/L，雌二醇0.1-0.56μg/L，腐胺1-10mg/L，亚硒酸钠0.1-5mg/L，硝酸铁0.5-1.6g/L，柠檬酸铁0.2-0.8mg/L，环庚三烯酚酮0.1-2μM，碳酸氢钠1-3g/L和小牛血清0.1-2％。
8mg/L，雌二醇0.1-0.56μg/L，腐胺1-10mg/L，亚硒酸钠0.1-5mg/L，硝酸铁0.5-1.6g/L，柠檬酸铁0.2-0.8mg/L，环庚三烯酚酮0.1-2μM，碳酸氢钠1-3g/L和小牛血清0.1-2％。
[0009] 优选地，所述羊水细胞培养基由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164025-35g/L，胰岛素15-25mg/L，血小板来源生长因子10-12μg/L，表皮生长因子18-24μg/L，转化生长因子6-9μg/L，成纤维细胞生长因子0.5-0.7μg/L，神经生长因子0.85-0.9μg/L，集落刺激因子0.4-0.62μg/L，黄芩甙元1-3.5mg/L，大豆异黄酮7.8-13.2mg/L，β-胡萝卜素6.5-
7.8mg/L，虾青素5.5-6.5mg/L，雌二醇0.32-0.48μg/L，腐胺3.7-5.6mg/L，亚硒酸钠2.2-
3.8mg/L，硝酸铁0.88-1.2g/L，柠檬酸铁0.43-0.75mg/L，环庚三烯酚酮0.84-1.58μM，碳酸氢钠1.8-2.5g/L和小牛血清0.5-1％。
7.8mg/L，虾青素5.5-6.5mg/L，雌二醇0.32-0.48μg/L，腐胺3.7-5.6mg/L，亚硒酸钠2.2-
3.8mg/L，硝酸铁0.88-1.2g/L，柠檬酸铁0.43-0.75mg/L，环庚三烯酚酮0.84-1.58μM，碳酸氢钠1.8-2.5g/L和小牛血清0.5-1％。
[0010] 优选地，所述羊水细胞培养基由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164030g/L，胰岛素23mg/L，血小板来源生长因子11.5μg/L，表皮生长因子19.2μg/L，转化生长因子7.8μg/L，成纤维细胞生长因子0.65μg/L，神经生长因子0.89μg/L，集落刺激因子0.56μg/L，黄芩甙元2.15mg/L，大豆异黄酮10.42mg/L，β-胡萝卜素7.13mg/L，虾青素6.27mg/L，雌二醇0.42μg/L，腐胺4.73mg/L，亚硒酸钠3.18mg/L，硝酸铁1.05g/L，柠檬酸铁
0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
[0011] 本发明技术方案根据羊水细胞的生长特性，将血小板来源生长因子，表皮生长因子，转化生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子和集落刺激因子按不同浓度组合加入基础培养基RPMI1640中，能够有效地促进羊水细胞的增殖，缩短细胞生长周期。
[0012] 虾青素(C40H52O4，CAS号：472-61-7)世界上最强的天然抗氧化剂之一，有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，由内而外保护细胞和DNA健康，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力。大豆异黄酮(CAS号：486-66-8)是黄酮类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。大豆异黄酮对整体动物也有比较明确的抗氧化作用，大豆异黄酮提取物对阿霉素引起的小鼠过氧化水平提高和抗氧化酶活性的降低也有明显的抑制作用。黄芩甙元(C15H10O5，CAS号：491-67-8)属于生物类黄酮，具有显著抗菌作用。本发明培养基将虾青素、β-胡萝卜素、大豆异黄酮和黄芩甙元加入到培养基中不仅能够起到抗氧化、有效抑制培养基中微生物及病毒的感染的作用，同时能够保护细胞，促进羊水细胞的增殖。
[0013] 研究证明硝酸铁能够促进羊水细胞的增殖，在本发明中，硝酸铁，柠檬酸铁和环庚三烯酚酮相互作用，能够促进细胞内铁的运输，不仅起到替代转铁蛋白的作用，并且能够更好地维持羊水细胞的生长。
[0015] 本发明培养基与现有培养基相比具有以下优势：
[0016] (1)本发明培养基采用多种生长因子，并加入黄芩甙元，大豆异黄酮，β-胡萝卜素，虾青素，取得了显著效果，细胞培养周期缩短，培养5-6天即可获得满足临床诊断所需的大量处于分裂期的羊水细胞。
[0017] (2)本发明培养基具有很好地抑菌效果，不易被微生物感染。
[0018] (3)本发明培养基小牛血清与传统培养基相比用量极大地减少，降低了由小牛血清带来的质量不均一和病毒感染地风险。
具体实施方式
[0020] 实施例1一种羊水细胞培养基
[0021] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164030g/L，胰岛素23mg/L，血小板来源生长因子11.5μg/L，表皮生长因子19.2μg/L，转化生长因子7.8μg/L，成纤维细胞生长因子0.65μg/L，神经生长因子0.89μg/L，集落刺激因子0.56μg/L，黄芩甙元2.15mg/L，大豆异黄酮10.42mg/L，β-胡萝卜素7.13mg/L，虾青素6.27mg/L，雌二醇0.42μg/L，腐胺4.73mg/L，亚硒酸钠3.18mg/L，硝酸铁1.05g/L，柠檬酸铁0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
[0022] 羊水细胞培养基的制备方法与传统培养基制备方法类似，溶于超纯水中，并用0.22μM滤膜过滤。
[0023] 实施例2一种羊水细胞培养基
[0024] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164040g/L混合后，胰岛素30mg/L，血小板来源生长因子15μg/L，表皮生长因子30μg/L，转化生长因子10μg/L，成纤维细胞生长因子0.75μg/L，神经生长因子1μg/L，集落刺激因子0.68μg/L，黄芩甙元5mg/L，大豆异黄酮14.58mg/L，β-胡萝卜素10mg/L，虾青素8mg/L，雌二醇0.56μg/L，腐胺
10mg/L，亚硒酸钠5mg/L，硝酸铁1.6g/L，柠檬酸铁0.8mg/L，环庚三烯酚酮2μM，碳酸氢钠3g/L，小牛血清2％。
10mg/L，亚硒酸钠5mg/L，硝酸铁1.6g/L，柠檬酸铁0.8mg/L，环庚三烯酚酮2μM，碳酸氢钠3g/L，小牛血清2％。
[0025] 制备方法与实施例1类似。
[0026] 实施例3一种羊水细胞培养基
[0027] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164020g/L，胰岛素1mg/L，血小板来源生长因子5μg/L，表皮生长因子10μg/L，转化生长因子1μg/L，成纤维细胞生长因子0.25μg/L，神经生长因子0.1μg/L，集落刺激因子0.32μg/L，黄芩甙元0.15mg/L，大豆异黄酮3.65mg/L，β-胡萝卜素1mg/L，虾青素5mg/L，雌二醇0.1μg/L，腐胺1mg/L，亚硒酸钠0.1mg/L，硝酸铁0.5g/L，柠檬酸铁0.2mg/L，环庚三烯酚酮0.1μM，碳酸氢钠1g/L，小牛血清0.1％。
[0028] 制备方法与实施例1类似。
[0029] 实施例4一种羊水细胞培养基
[0030] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164025g/L，胰岛素15mg/L，血小板来源生长因子12μg/L，表皮生长因子24μg/L，转化生长因子9μg/L，成纤维细胞生长因子0.7μg/L，神经生长因子0.9μg/L，集落刺激因子0.62μg/L，黄芩甙元3.5mg/L，大豆异黄酮13.2mg/L，β-胡萝卜素7.8mg/L，虾青素6.5mg/L，雌二醇0.48μg/L，腐胺5.6mg/L，亚硒酸钠3.8mg/L，硝酸铁1.2g/L，柠檬酸铁0.75mg/L，环庚三烯酚酮1.58μM，碳酸氢钠2.5g/L和小牛血清1％。
[0031] 制备方法与实施例1类似。
[0032] 实施例5一种羊水细胞培养基
[0033] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164035g/L，胰岛素15mg/L，血小板来源生长因子10μg/L，表皮生长因子18μg/L，转化生长因子6μg/L，成纤维细胞生长因子0.5μg/L，神经生长因子0.85μg/L，集落刺激因子0.4μg/L，黄芩甙元1mg/L，大豆异黄酮7.8mg/L，β-胡萝卜素6.5mg/L，虾青素5.5mg/L，雌二醇0.32μg/L，腐胺3.7mg/L，亚硒酸钠2.2mg/L，硝酸铁0.88g/L，柠檬酸铁0.43mg/L，环庚三烯酚酮0.84μM，碳酸氢钠1.8g/L和小牛血清0.5％。
[0034] 制备方法与实施例1类似。
[0035] 对比例1一种羊水细胞培养基
[0036] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164030g/L，胰岛素23mg/L，血小板来源生长因子11.5μg/L，表皮生长因子19.2μg/L，成纤维细胞生长因子8.45μg/L，神经生长因子0.89μg/L，集落刺激因子0.56μg/L，黄芩甙元2.15mg/L，大豆异黄酮10.42mg/L，β-胡萝卜素7.13mg/L，虾青素6.27mg/L，雌二醇0.42μg/L，腐胺4.73mg/L，亚硒酸钠3.18mg/L，硝酸铁1.05g/L，柠檬酸铁0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
[0037] 制备方法与实施例1类似。
[0038] 与实施例1区别在于，未添加转化生长因子，成纤维细胞生长因子浓度升高至8.45μg/L，因而生长因子总量未变。
[0039] 对比例2一种羊水细胞培养基
[0040] 一种羊水细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基RPMI164030g/L，胰岛素23mg/L，血小板来源生长因子11.5μg/L，表皮生长因子19.2μg/L，转化生长因子7.8μg/L，成纤维细胞生长因子0.65μg/L，神经生长因子0.89μg/L，集落刺激因子0.56μg/L，黄芩甙元2.15mg/L，大豆异黄酮16.69mg/L，β-胡萝卜素7.13mg/L，雌二醇0.42μg/L，腐胺4.73mg/L，亚硒酸钠3.18mg/L，硝酸铁1.05g/L，柠檬酸铁0.67mg/L，环庚三烯酚酮1.26μM，碳酸氢钠2.03g/L和小牛血清0.87％。
[0041] 制备方法与实施例1类似。
[0042] 与实施例1区别在于，未添加虾青素，而增加大豆异黄酮的浓度。
[0043] 试验例1培养基质量测试
[0044] 测试培养基：实施例1-5制备得到的培养基以及对比例1-2制备得到的培养基[0045] 测试内容：
[0046] (1)无菌检测
[0047] 使用平板法检测，取羊血琼脂平板1块和沙保弱琼脂平板1块，平衡至室温。取上述测试培养基为样品经4000rpm离心15min后从样品管底部吸取样品，每块平板100μL，用接种针划线。将平板放入37℃培养箱中，培养48h后观察结果为阴性，样品合格。
[0048] (2)内毒素检测
[0049] 使用凝胶法检测，取上述测试培养基为样品经稀释后，同阴性对照、阳性对照、供试品阳性对照分别加入经无菌检查用水复融后的鲎试剂中，每种平行两管。结果为阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，供试品阳性对照管为阳性且样品管为阴性，样品合格。
[0050] (3)支原体检测为PCR法检测
[0051] 将上述测试培养基为样品进行沸水浴10min后经12000rpm离心3min后使用，采用25μL体系对待测样品、阳性对照、阴性对照进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察检测结果。检测结果为阴性，样品合格。
[0052] 试验例2
[0053] (一)试验对象：实施例1-5及对比例1-2制备得到的羊水细胞培养基。
[0054] (二)羊水细胞培养：收集羊水样品(为20-21周龄之间的羊水样品，每份约[0055] 0.1-0.5ml，共4ml左右)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品I，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行：
[0056] (1)在无菌条件下取羊水各2.5mL/管，共2管；
[0057] (2)以1000r/min室温离心10分钟；
[0058] (3)在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入4.5mL培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置含5％CO2的37℃温箱饱和湿度行开放式培养；
[0059] (4)6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5ml，24-48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素0.04-0.08μg/mL，(20μg/mL，7号针头垂直竖加2滴)4-6h左右进行细胞学处理；
[0060] (5)收获细胞：倒出瓶中细胞液入10mL离心管，用0.85％NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，0.25％胰酶消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打下细胞453g(1500r/min)室温离心10分钟，去上清，约留0.5mL；
[0061] (6)低渗：加入37℃0.075M KCl 4-6mL，吸管吹打，37℃水浴3-5分钟；
[0063] (8)固定：加入3:1固定剂8mL，轻混匀，37℃水浴10分钟，453g(1500r/ Min，eppendorf5810R)室温离心10分钟；去上清，约留0.5mL；
[0064] (9)重复固定：同上。453g(1500r/min)室温离心10分钟，去上清，视管底细胞量加入适当几滴固定剂；
[0066] (11)培养结束染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有分裂相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计分裂相细胞数目；
[0067] (12)羊水细胞收集样品I培养5天后收获，进行染色体制片。
[0068] 以上试验结果如表1所示。
[0069] 表1不同培养基中羊水细胞培养效果比较
[0070]
[0071] 注：
[0072] 1、表1各培养基配方中的维生素E和L-抗坏血酸浓度是指添加胎牛血清前的浓度。
[0074] 3、总克隆数＝有分裂相的总克隆数+无分裂相的克隆数；有分裂相总克隆数为大、中、小各克隆数目之和。
[0075] 由表1可知，本发明实施例1-5培养基与对比例1-2培养基中羊水细胞克隆数、分离相克隆数均有显著提高，其中实施例1培养基中羊水细胞克隆数、分离相克隆数最多。
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