基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法
阅读：1024发布：2020-09-26
专利汇可以提供基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法，此方法包括以下步骤：培养基配制；配制好的培养基放置于高压灭菌锅中，高温灭菌处理；选用酒精和 次氯酸 钠进行消毒，利用ARTP育种仪处理 种子 ，以氦气为工作气体；在超净 工作台 内用 镊子 将无菌处理好的种子接种到含有致死盐浓度的培养基上培养，用 封口膜 将培养皿密封，最终筛选出紫花苜蓿耐盐突变体。本发明的有益效果是能够获得理想的耐盐候选突变体。，下面是基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法专利的具体信息内容。
1.基于ARTP诱变紫花苜蓿耐盐突变体的筛选方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1，培养基配制；培养基采用的是：MS4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+NaCl，配制好的培养基放置于高压灭菌锅中，121℃高温灭菌处理；
步骤2，ARTP处理；利用ARTP育种仪处理种子，以氦气为工作气体；
步骤3，种子处理；选用75％酒精和次氯酸钠进行消毒，种子在室温下浸泡浮选除去质量较差的种子，用滤纸吸干，75％的乙醇浸泡30s，2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗5次，每次2min。留作备用；
步骤4，接种；在超净工作台内用镊子将无菌处理好的种子接种到含有致死盐浓度的培养基上培养，用封口膜将培养皿密封，最终筛选出紫花苜蓿耐盐突变体。
基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因技术领域，涉及基于ARTP常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma)育种仪诱变紫花苜蓿进行耐盐突变体种质创新的方法。
背景技术
[0002] 紫花苜蓿原产伊朗，是当今世界分布最广的栽培牧草，，在我国已有两千多年的栽培历史，主要产区在西北、华北、东北和江淮流域。苜蓿种类繁多，全球的分布有60余种，多是野生的草本植物，营养价值很高，具有清脾胃、利大小肠、下膀胱结石的功效。苜蓿含有大量的粗蛋白质、丰富的碳水化合物和B族维生素，维生素C、E、K及铁等多种微量营养素，是优良的牲畜饲料。不仅可用于家畜饲养，也是人类最古老的食物之一。苜蓿以“牧草之王”著称，不仅产量高，而且草质优良，各种畜禽均喜食。我国苜蓿的种植面积约133万hm2，随着商品经济的发展，苜蓿产业化规模发展较快，苜蓿的种植面积正在扩大。紫花苜蓿有较强的抗逆性，能生长在多种类型的气候土壤环境下，但我国盐碱化土壤面积较大，苜蓿耐盐碱性不强的缺陷引起了育种学家的关注。
[0003] ARTP常压室温等离子体是近几年提出的一种新的大气压辉光放电冷等离子体源。它的作用原理是通过发射均匀丰富的等离子体流。能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流对人体和环境没有危害，目前被广泛应用于微生物的诱变育种，并且获得了许多有意义的突变体。目前我国自主研发的紫花苜蓿品种较少，对苜蓿的研究和其余国家相比处于严重落后阶段。而苜蓿市场的需求取决于规模化养殖速度，全国奶牛规模化养殖的比例和集约化管理水平不断提高，对优质苜蓿的需求越来越大。苜蓿种子发芽期耐盐性评价对耐盐性苜蓿材料的选择和培育至关重要。进行紫花苜蓿耐盐胁迫的种质研究，是实现盐碱地的合理利用和推动苜蓿产业发展的必然要求。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供基于ARTP育种仪诱变紫花苜蓿获得耐盐突变体的方法，本发明的有益效果是能够获得理想的耐盐候选突变体。
[0005] 本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
[0006] 步骤1，培养基配制；培养基采用的是：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+NaCl，配制好的培养基放置于高压灭菌锅中，121℃高温灭菌处理；
[0007] 步骤2，ARTP处理；利用ARTP育种仪处理种子，以氦气为工作气体；
[0008] 步骤3，种子处理；选用75％酒精和次氯酸钠进行消毒，种子在室温下浸泡，除去漂浮质量较差的种子，用滤纸吸干，75％的乙醇浸泡30s，2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗5次，每次2min。留作备用；
[0010] 图1是ARTP诱变的三得利种子发芽情况本发明示意图；
[0011] 图2是ARTP诱变的中苜3号种子发芽情况；
[0012] 图3是三得利诱变后致死盐浓度下的萌发情况。
具体实施方式
[0013] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0014] 1材料与试剂
[0015] 供试紫花苜蓿品种为中苜三号、三得利(种子均由青岛农业大学草学实验室提供)。仪器：高压灭菌锅，锥形瓶，烧杯，培养瓶，培养皿，滤纸，镊子；试剂：乙醇，次氯酸钠，MS培养基；
[0016] 2方法
[0017] 培养基配制
[0018] 培养基采用的是：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+NaCl
[0019] 配制好的培养基放置于高压灭菌锅中，121℃高温灭菌处理。
[0020] 表1培养基盐浓度
[0021]
[0022] (1)1-8号培养基进行粗筛；(2)9-16号培养基确定致死盐浓度。
[0023] ARTP处理
[0024] 利用ARTP育种仪处理种子，处理时间分别为120min、240min、360min。氦气为工作气体。
[0025] 种子处理
[0026] 用75％酒精和20％次氯酸钠进行消毒。种子在室温下浸泡，除去漂浮质量较差的种子，用滤纸吸干，75％的乙醇浸泡30s，2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗5次，每次2min。留作备用。
[0027] 接种
[0028] 在超净工作台内用镊子将无菌处理好的种子接种到含有致死盐浓度的培养基上，用封口膜将培养皿密封。将材料放置于培养箱中(25℃)培养。
[0029] 接种7d后，观察种子萌发情况，统计发芽种子数。发芽率(％)＝发芽种子数/接种总数×100％。
[0030] 致死盐浓度筛选
[0031] 不同品种的耐盐性有差异，所以发芽期间不同品种的致死盐浓度也有差异，需要筛选。在盐浓度0(即空白对照)的培养基中，中苜三号和三得利的发芽率分别为79％和97％。
[0032] 按表2所示，中苜三号在1-5号培养基NaCl胁迫下的发芽率表明，可能的致死盐浓度在154mmol/L附近。再用4、9、10号培养基筛选，可能的致死盐浓度超过162mmol/L。最后用10-13号的培养基盐浓度下筛选，找到中苜三号的致死盐浓度为164mmol/L。
[0033] 表2不同NaCl浓度下三得利和中苜三号的发芽率
[0034]
[0035] 与中苜三号相似，三得利在1-8号培养基NaCl胁迫下的发芽率表明，可能的致死盐浓度在308mmol/L与359mmol/L之间。再用14-16号培养基筛选，三得利的致死盐浓度为325mmol/L。
[0036] 突变体筛选
[0037] ARTP育种仪半致死剂量的探究。
[0038] (1)以0,120,240,360(单位：min)时间作为梯度，用APTP育种仪对两个品种的种子进行处理。
[0039] (2)按照上述时间梯度诱变处理的三得利和中苜3号分别接种到MS培养基中各30粒，重复3次。
[0040] (3)一周后，分别计算三得利和中苜3号的发芽率。由表3可知，三得利和中苜3号发芽率没有因为诱变时间的增长发生明显降低的现象。
[0041] 表3 ARTP诱变的三得利、中苜3号发芽率
[0042]
[0043] 图1是图1ARTP诱变的三得利种子发芽情况，由左至右依次是诱变0min；诱变120min；诱变240min；诱变360min。图2是ARTP诱变的中苜3号种子发芽情况，由左至右依次是诱变0min；诱变120min；诱变240min；诱变360min。
[0044] 从发芽率来看，没有得到预期的半致死诱变剂量。原因分析如下：①ARTP育种仪是利用等离子体引起基因损伤，但是其能量较低，处理的实际效果一般；②紫花苜蓿是四倍体，比二倍体具有更强的掩盖防护作用；③ARTP富含的活性能量粒子对植株细胞的遗传物质造成损伤，诱发生物细胞启动SOS修复机制。因此，种子虽然未致死，但内部细胞的核基因可能已经发生了突变,将这些种子在筛选压下筛选也可能获得耐盐突变体。
[0045] 耐盐突变体的筛选。
[0046] 在含有致死盐浓度的培养基上，接种经过ARTP育种仪诱变的紫花苜蓿种子，一周后统计发芽株数。在含有325mmol/LNaCl的培养基上对诱变后的三得利种子进行耐盐突变体的筛选,发芽株数见表4。在含有164mmol/LNaCl的培养基上对诱变后的中苜三号种子进行耐盐突变体的筛选,发芽株数见表5。三得利种子和中苜3号种子在诱变时间分别为240min和120min时发芽株数最多，既保证有合适的诱变时间，又可以满足有较高发芽株数的要求。
[0047] 表4三得利种子在含有325mmol/L NaCl的培养基上的发芽株数
[0048]
[0049] 表5中苜3号种子在含有164mmol/LNaCl的培养基上的发芽株数
[0050]
[0051] 图3是三得利诱变后致死盐浓度下的萌发情况。其中a:经过2h诱变处理的中苜三号萌发情况b:经过4h诱变处理的中苜三号萌发情况。c:经过6h诱变处理的中苜三号萌发情况。
[0052] 利用ARTP育种仪对紫花苜蓿两个品种三得利和中苜三号种子进行诱变，可以采用三得利诱变240min、中苜三号诱变120-240min，接种到含盐筛选压的培养基上筛选，初步获得耐盐的候选突变体。
[0053] 本发明选取紫花苜蓿的三得利和中苜三号两个品种，利用ARTP诱变，筛选两个品种的耐盐突变体。经过粗筛，找到中苜三号可能的致死盐浓度在154mmol/L附近，三得利可能的致死盐浓度在308mmol/L、359mmol/L之间。再经过进一步筛选，最后找到中苜三号的致死盐浓度为164mmol/L，三得利的致死盐浓度为325mmol/L。结果表明，ARTP诱变能提高两个紫花苜蓿品种的耐盐性，中苜三号在164mmol/L盐胁迫下，经过2h、4h、6h诱变分别有48％、35％、17％发芽；三得利在325mmol/L下，经过2h、4h、6h诱变分别有10％、38％、6％发芽，初步获得了两个品种的候选耐盐突变体。
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