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牛冷冻精液稀释液制备方法

阅读：415发布：2023-03-11

专利汇可以提供牛冷冻精液稀释液制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种牛冷冻精液稀释液制备方法，称取果糖5～8g、柠檬酸钠19.8～26.6 g，加入蒸馏水 800 mL，搅拌，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，置75～80℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入180～220 mL的新鲜卵黄，以及再加入青霉素、链霉素各40～50万IU单位，按此比例配置的溶液称为第一液；取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，搅拌后放入3～5℃的冰箱，称之为第二液；然后将精液稀释、冷冻、包装。提高优秀种公牛新鲜精液稀释效果和精子活率，达到冷冻精液长期有效保存。，下面是牛冷冻精液稀释液制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种牛冷冻精液稀释液制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
步骤1：精液稀释液配置；
按比例，称取果糖5～8g、柠檬酸钠19.8～26.6 g，无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置75～80℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入180～220 mL的新鲜卵黄，以及再加入青霉素、链霉素各40～50万IU单位，按此比例配置的溶液称为第一液；
取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入3～5℃的冰箱或生化培养箱内待用，按此比例配置的溶液称之为第二液；
步骤2：精液稀释；
用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送0～5℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻；
步骤3：精液冷冻；
将平衡、封装后的细管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架码放，码放在平衡架上，超声波封口端远离操作者，细管放入冷冻仪时也应如此放置；每个平衡架上放一根细管的标记物，为了便于识别，一头种公牛用同一颜色的标记物；如果同一个平衡架上有不同种公牛的细管精液，须分开码放，且要隔开一些距离，以免混淆；
在细管冻精生产过程中，使用由计算机控制的全自动冷冻仪，首先在电脑中设置好最佳冷冻温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4℃，关闭风扇电源，待风扇完全停止后把已排满待冻细管的平衡架迅速轻放人冷冻仪，盖好盖子，按预先设定的程序自动完成冷冻过程；
步骤4：冻精解冻与抽检；
预先把水浴箱水温加热至38～40℃，用镊子夹取一支冷冻后的细管冻精迅速浸入38～
40℃水中并轻轻晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管专用剪剪去超声波封口端，滴一小滴精液于经过预热的载玻片上即可进行镜检，评价精子活率；
步骤5：冻精包装；
在-140℃以下的环境中，用细管计数分装机进行包装，包装后的细管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置，塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管，包装好的细管冻精人库贮存。
2.根据权利要求1所述的牛冷冻精液稀释液制备方法，其特征在于，所述步骤2中，细管分装使用细管灌封一体机进行。
3.根据权利要求1所述的牛冷冻精液稀释液制备方法，其特征在于，还包括步骤6，冻精贮存；冻精贮存在液氮罐的液氮中，每周定时加一次液氮，当发现液氮罐外壳出现白霜时，应立即将精液转移人其他液氮罐内保存；包装好的冻精液氮罐间转换时，在液氮罐外停留时间不能超过3s；取存冻精后要盖好液氮罐塞，在取放盖塞时，要垂直轻拿轻放，不得用力过猛，防止液氮罐塞折断或损坏；移动液氮罐时，应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动，不得在地上拖行。
4.根据权利要求1所述的牛冷冻精液稀释液制备方法，其特征在于，还包括步骤7：冻精运输；冻精运输过程不得横倒、碰撞和强烈振动，保证冻精始终浸在液氮中。
5.根据权利要求1所述的牛冷冻精液稀释液制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所加第一液的量=[（稀释液总量+合格精液量）／2] -合格精液量；
稀释液总量=原精液量×（稀释倍数-1）；
稀释倍数=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷冻后精子活力)/每头份输精量所含有效精子数/ 0.25；
所加第二液的量=（所加稀释液总量一所加第一液的量）。

说明书全文

牛冷冻精液稀释液制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于畜牧业养殖技术领域，涉及一种牛冷冻精液稀释液制备方法。

背景技术

[0002] 牛冷冻精液与人工授精技术在我国养牛业生产中已广泛应用，因此牛冷冻精液的生产与质量控制一直受到行业内的关注。

[0003] 实践证明，冷冻精液生产是各地种公牛站的核心业务，该生产流程体系应该建立在标准化作业程序的基础上，包括生产牛冷冻精液的器械清洗与消毒、稀释液配制、采精、精液处理、精液冷冻、冻精解冻、冻精镜检和检验规则、冻精包装、冻精贮存及冻精运输等操作环节。

[0004] 目前大部分种公牛站以进口稀释粉取代自配精液稀释液，进口稀释粉在某种程度上取得了较好效果，但从长远考虑这增加了牛冷冻精液的生产成本，降低了经济效益，同时也反映出牛冷冻精液稀释液配方的缺陷。

[0005] 众观各地种公牛站冷冻精液稀释液，不论是自配的或是进口的，其中均包括稀释剂、营养剂、保护剂和其他添加剂等。目前，牛冷冻精液稀释液多数为葡萄糖-甘油-卵黄液，但稀释剂、营养剂、保护剂又有可选的不同化学物质和剂量组合，大部分种公牛站反映进口稀释液比自配稀释液稀释效果好。

[0006] 牛细管冻精质量高低与假阴道安装调试、种公牛准备与调教、采精人员技术水平、采精操作的规范性、精液品质评价与稀释倍数计算、稀释液配方与配制、精液稀释过程的规范性、稀释精液冷冻过程等多项因素有关。各环节操作人员大部分进过职业技能培训，规范性较强，最大的区别是精液稀释液不同，导致稀释后精子活力偏低。

[0007] 首先，目前牛细管冻精稀释液营养剂选择葡萄糖、蔗糖存在不足，从有利于精子代谢吸收的角度考虑，应选择果糖，因为果糖结构简单，在同等条件下更有利于精子代谢吸收，满足精子营养需求；其次，作为维持精子内外环境渗透压平衡的柠檬酸钠，其用量把握不精准，不能维持溶液的等渗性，引起精子变形；第三，青链霉素作为抗菌物质，原本是为了提高精子抗污染能力，但用量失控尤其偏多时反而会杀死精子或降低精子活力；第四，鸡蛋新鲜度和消毒把控不严，营养价值降低；第五，抗冻物质甘油用量不合理，未能达到相应的抗冻效果，超量时反而降低了精子对营养物质的吸收量；第六，牛冷冻精液生产的操作细节缺乏规范性。

[0008] 总之，稀释液配方中各物质用量搭配缺乏合理性，同时，有必要进一步探索更科学的牛细管冻精生产工艺。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种牛冷冻精液稀释液制备方法，解决了现有技术中存在的问题，提高优秀种公牛新鲜精液稀释效果和精子活率，达到冷冻精液长期有效保存。

[0010] 本发明所采用的技术方案是，一种牛冷冻精液稀释液制备方法，按照以下步骤进行：步骤1：精液稀释液配置；
按比例，准确称取果糖5～8g、柠檬酸钠19.8～26.6 g，无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置75～80℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入180～220mL的新鲜卵黄，以及再加入青霉素、链霉素各40～50万IU单位，按此比例配置的溶液称为第一液；
取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入3℃～5℃的冰箱或生化培养箱内待用，按此比例配置的溶液称之为第二液；
步骤2：精液稀释；
用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送0～5℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻；
步骤3：精液冷冻；
将平衡、封装后的细管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架码放，码放在平衡架上，超声波封口端远离操作者，细管放入冷冻仪时也应如此放置；每个平衡架上放一根细管的标记物，为了便于识别，一头种公牛用同一颜色的标记物；如果同一个平衡架上有不同种公牛的细管精液，须分开码放，且要隔开一些距离，以免混淆；
在细管冻精生产过程中，使用由计算机控制的全自动冷冻仪，首先在电脑中设置好最佳冷冻温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4℃，关闭风扇电源，待风扇完全停止后把已排满待冻细管的平衡架迅速轻放人冷冻仪，盖好盖子，按预先设定的程序自动完成冷冻过程；
步骤4：冻精解冻与抽检；
预先把水浴箱水温加热至38～40℃，用镊子夹取一支冷冻后的细管冻精迅速浸入38～
40℃水中并轻轻晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管专用剪剪去超声波封口端，滴一小滴精液于经过预热的载玻片上即可进行镜检，评价精子活率；
步骤5：冻精包装；
在-140℃以下的环境中，用细管计数分装机进行包装，包装后的细管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置，塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管，包装好的细管冻精人库贮存。

[0011] 进一步的，所述步骤2中，细管分装使用细管灌封一体机进行。

[0012] 进一步的，还包括步骤6，冻精贮存；冻精贮存在液氮罐的液氮中，每周定时加一次液氮，当发现液氮罐外壳出现白霜时，应立即将精液转移人其他液氮罐内保存；包装好的冻精液氮罐间转换时，在液氮罐外停留时间不能超过3s；取存冻精后要盖好液氮罐塞，在取放盖塞时，要垂直轻拿轻放，不得用力过猛，防止液氮罐塞折断或损坏；移动液氮罐时，应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动，不得在地上拖行。

[0013] 进一步的，还包括步骤7：冻精运输；冻精运输过程不得横倒、碰撞和强烈振动，保证冻精始终浸在液氮中。

[0014] 进一步的，所述步骤中，所加第一液的量=[（稀释液总量+合格精液量）／2] -合格精液量；稀释液总量=原精液量×（稀释倍数-1）；
稀释倍数=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷冻后精子活力)/每头份输精量所含有效精子数/ 0.25；
所加第二液的量=（所加稀释液总量一所加第一液的量）。

[0015] 本发明的有益效果是：首先，筛选出了优良的牛冷冻精液稀释液种类，目前，牛冷冻精液稀释液有卵黄—磷酸盐稀释液、果糖—卵黄—柠檬酸盐—甘油稀释液、卵黄—Tris稀释液和全脂均质乳和脱脂乳等几种，经过大量试验研究，结果表明：在原精液品质合格和操作规范的前提下，果糖—卵黄—柠檬酸钠—甘油稀释液的稀释效果最好；第二，优化了稀释液中所用化学物质的配比，纵观牛冷冻精液稀释液配方，所用的基本化学物质大同小异，但各物质配比各不相同，本发明研究出了果糖、柠檬酸钠、卵黄、青链霉素、甘油等的最佳配方，提高了合格精液的稀释效果；第三，进一步规范了牛精液稀释液配制、精液稀释过程、稀释精液的灌封、平衡降温、冷冻、包装、贮存和运输等技术环节，为制定牛细管冻精生产规程提供了理论依据与技术支撑。

具体实施方式

[0016] 下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0017] 一种牛冷冻精液稀释液制备方法，在制备稀释液之前具有以下要求：制备蒸馏水：严格按照全自动双重纯水蒸馏器的操作说明书制备双蒸水，蒸馏水最好用干净的玻璃器皿贮存。

[0018] 天平放置在平稳的工作台上，保持清洁干燥，不使用时刀口应处于空载状态；称取药品时，盘内垫以称量纸，校零后方可称重。砝码要求保持清洁、干燥，防止受潮或污染。

[0019] 配制稀释液所用的化学药品规格为分析纯，且在保质期内，药品取用后，应立即将瓶口盖严，并妥善保存；药品一旦从瓶中取出，再不能放回药品瓶而统一收集，妥善处理。

[0020] 用于配制稀释液的鸡蛋应来源于无疫病的鸡场，且新鲜、完整、干净，用75%酒精棉球对蛋壳表面进行彻底消毒，等酒精挥发尽后用蛋清分离器取出完整的卵黄（也可在鸡蛋腰正中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分为二，利用两个蛋壳交替倾倒，除去蛋清，留下卵黄），然后用灭菌的注射器穿过蛋黄膜抽取卵黄。

[0021] 具体按照以下步骤进行：步骤1：精液稀释液配置
按比例，准确称取果糖（分析纯）5～8g、柠檬酸钠19.8～26.6 g无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置75～80℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入180～220mL的新鲜卵黄和青霉素、链霉素各40～50万IU单位，此溶液称为Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入1℃～4℃的冰箱或生化培养箱内待用，该溶液称之为Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀释液放置时间不得超过24 h。

[0022] 步骤2：精液稀释用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送0～5℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻；
所加第一液的量=[（稀释液总量+合格精液量）／2] -合格精液量；
稀释液总量=原精液量×（稀释倍数-1）；
稀释倍数=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷冻后精子活力)/每头份输精量所含有效精子数/ 0.25；
所加第二液的量=（所加稀释液总量一所加第一液的量）。

[0023] 步骤3：精液冷冻将平衡、封装后的细管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架码放码放在平衡架上，超声波封口端远离操作者，细管放入冷冻仪时也应如此放置。每个平衡架上放一根类似于细管的标记物，为了便于识别，最好一头种公牛用同一颜色的标记物。如果同一个平衡架上有不同种公牛的细管精液，必须要分开码放，且要隔开一些距离，以免混淆。

[0024] 在细管冻精生产过程中，使用由计算机控制的全自动冷冻仪，首先在电脑中设置好最佳冷冻温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4℃，关闭风扇电源，待风扇完全停止后把已排满待冻细管的平衡架迅速轻放人冷冻仪，盖好盖子，按预先设定的程序自动完成冷冻过程。

[0025] 步骤4：冻精解冻与抽检预先把水浴箱水温加热至38～40℃，用镊子夹取一支冷冻后的细管冻精迅速浸入38～
40℃水中并轻轻晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管专用剪剪去超声波封口端，滴一小滴精液于经过预热的载玻片上即可进行镜检，评价精子活率。

[0026] 步骤5：冻精包装在-140℃以下的环境中，用细管计数分装机进行包装，包装后的细管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置。塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管。包装好的细管冻精人库贮存。

[0027] 步骤6：冻精贮存冻精贮存在液氮罐的液氮中，由专人保管，每周定时加一次液氮，应经常检查液氮罐的状况，当发现液氮罐外壳出现白霜时，应立即将精液转移人其他液氮罐内保存。包装好的冻精液氮罐间转换时，在液氮罐外停留时间不能超过3s。取存冻精后要盖好液氮罐塞，在取放盖塞时，要垂直轻拿轻放，不得用力过猛，防止液氮罐塞折断或损坏。移动液氮罐时，应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动，不得在地上拖行。

[0028] 步骤7：冻精运输冻精运输过程中要有专人看守，注意贮存容器不得横倒、碰撞和强烈振动，保证冻精始终浸在液氮中。

[0029] 本文中，柠檬酸钠作为缓冲物质，防止精液处理过程中pH的变化，同时对代谢性酸中毒和酶活性反应具有良好的缓冲作用。研究表明：稀释液中添加19.8～26.6 g柠檬酸钠复苏后精子活力最高，环性精子活力最低。否则冷冻精液复苏精子活力极低，降低母牛情期受胎率。

[0030] 糖在稀释液中具有营养、增加稀释液的渗透压和在低温环境中保护精子等多重作用，不同糖类及其用量对同种动物精子冷冻保存效果不同，同种糖及其用量对不同动物精子冷冻保存效果也不同，常用的糖类有葡萄糖、蔗糖、果糖等。研究认为，果糖依其生物特性，作为供给牛精子能量的成分，更易利用，效果最好，选择该用量能取代精子膜周围的水分子与膜中磷酸基团形成氢键，对精子膜结构有稳固和修复作用。

[0031] 常用抗冻剂有EDTA、二甲基亚砜、低浓度甲醛（0.025%）和甘油。其中甘油作为精子超低温冷冻过程中最好的抗冻保护剂，具有溶于水的特性，不易发生结晶，同时具有吸水性强和可降低水溶液冰点的特点。在配制精液稀释液时，甘油用量控制在13%～14%为最好，低于13%抗冻效果很低，达到或超过18%会对精子产生毒害作用。

[0032] 卵黄具有保护精子免受冷休克的影响，能防止精子内部液相转变的作用，同时卵黄可通过促进精子与卵细胞透明带的结合而使顶体反应率提高，在精液稀释液中添加本文含量的卵黄，使母牛情期受胎率达75%以上。

[0033] 在细管冻精生产中，用青霉素和链霉素来控制精液中病源性和非病源性疾病，它具有抗菌范围广、成本低等特点。按照此精液稀释液配方中抗生素用量，通过重点控制性病和孤菌病来提高母牛情期受胎率。低于40万IU单位时稀释精液易受病原微生物污染，超过50万IU单位时，抗生素本身对精子产生过高杀伤力，两者均降低精子活力和母牛情期受胎率40%～70%。

[0034] 总之，在牛精液稀释液配方中，通过科学合理选择稀释剂、营养剂、保护剂和其他添加剂及其用量的最佳组合，同时规范精液稀释和细管冻精生产工艺的每一个细节。在规范操作的基础上，能提高细管冻精解冻后活力10%～15%，维持母牛情期受胎率75%以上，同时对加速黄牛改良步伐和提高种公牛站生产冻精的经济效益及区域社会效益必将产生积极作用。

[0035] 实施例1按比例，准确称取果糖5 g、柠檬酸钠26.6 g无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置75℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入180 mL的新鲜卵黄和青霉素、链霉素各40万IU单位，此溶液称为Ⅰ液；取Ⅰ液
430 mL加入65 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入1℃冰箱或生化培养箱内待用，该溶液称之为Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀释液放置时间不得超过24 h。

[0036] 用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送0℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。

[0037] 实施例2按比例，准确称取果糖8g、柠檬酸钠26.6 g无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置80℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入220 mL的新鲜卵黄和青霉素、链霉素各50万IU单位，此溶液称为Ⅰ液；取Ⅰ液
430 mL加入75 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入4℃的冰箱或生化培养箱内待用，该溶液称之为Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀释液放置时间不得超过24 h。

[0038] 用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送5℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。

[0039] 实施例3按比例，准确称取果糖6 g、柠檬酸钠23 g无损耗地移入1000 mL的烧杯内，加入蒸馏水
800 mL，用消毒过的玻璃棒或磁力搅拌器搅拌，使果糖和柠檬酸钠充分溶解，然后将溶液用滤纸过滤于三角烧瓶或盐水瓶中，扎好或塞紧瓶口，置78℃水浴锅中消毒30 min，冷却至常温后再加入200 mL的新鲜卵黄和青霉素、链霉素各45万IU单位，此溶液称为Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入70 mL甘油，并用磁力搅拌器充分搅拌均匀后放入2℃的冰箱或生化培养箱内待用，该溶液称之为Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀释液放置时间不得超过24 h。

[0040] 用35℃的第一液缓慢地加入原合格精液中，轻轻摇匀，用烧杯盛适量的35℃水，把稀释管放入后送3℃低温柜内降温，与此同时把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰块促使其快速降温，当降温至10℃时加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。

[0041] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

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牛冷冻精液稀释液制备方法

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