靶向治疗
阅读：168发布：2021-06-26
专利汇可以提供靶向治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于将活性剂(X)递送至表达蛋白聚糖的细胞或组织的组合物、方法和 试剂 盒 。更具体而言，本发明涉及含有(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)o的缀合物，其中，HB为肝素结合蛋白，X为活性剂(例如 治疗 蛋白(包括其功能 片段 或变体)或治疗小分子)，接头为接头实体，以及m是至少为1的整数，并且n+o是至少为1的整数。其它方面涉及HB-X缀合物在将活性剂递送至软骨以治疗软骨相关 疾病 和障碍的方法中的用途、HB-X缀合物在将活性剂递送至神经元组织(例如脑和脊髓)以治疗神经性障碍的方法中的用途、以及HB-X缀合物在治疗眼睛病症和障碍以及炎性病症和障碍的方法中的用途。，下面是靶向治疗专利的具体信息内容。
1.一种包含至少一种HBn-Xn的组合物，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
X为活性剂，并且n是至少为1的整数。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物进一步包含接头，其中，所述组合物表示为(HB-接头)n-Xn。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述接头为包含序列GGG的肽。
4.如权利要求3所述的组合物，所述组合物具有的组合物的HB-接头部分选自于：
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：4)，或KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：5)。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，X为选自于以下蛋白的蛋白：神经营养因子；神经营养蛋白；神经生长因子(NGF)；脑源性神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3(NT-3)；神经营养蛋白-4(NT-4)；睫状神经营养因子(CNTF)；中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)；保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)；神经胶质细胞系源性神经营养因子家族配体；神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)；neurturin(NRTN)；
artemin(ARTN)；或persephin(PSPN)；促神经生长细胞因子；白介素-6；白介素-11；白介素-27；白血病抑制因子；睫状神经营养因子；心脏营养素1；神经生成素；心脏营养素样细胞因子；成纤维细胞生长因子2；抗炎细胞因子；白介素-4；白介素-10；神经保护剂；神经调节蛋白-1；血管内皮生长因子(VEGF)； (FPF-1070)、依那西普( 融合至人免疫球蛋白G1的Fc部分的可溶性重组TNF受体2)；生长分化因子
11(GDF11)；基质细胞衍生因子-1(SDF-1)；肌肉生长抑制素(生长分化因子8(GDF8))；甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；成纤维细胞生长因子18(FGF-18)；高迁移率族蛋白2(HMG-2，也被称为高迁移率族盒2(HMGB2))；
糖皮质激素受体；治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔单抗，抗TNF-α，
JanssenBiotech，Horsham，PA)、 (阿达木单抗，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、或抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或其它治疗蛋白；或任何前述蛋白的功能部分、变体、类似物或衍生物；
或小分子活性剂。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，HBn-Xn或(HB-接头)n-Xn为融合蛋白。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，X或接头融合至HB的N末端。
8.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，X或接头融合至HB的C末端。
9.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，n＝2，并且X融合至HB的N末端和C末端这两端，该融合任选包含至少一种接头肽。
10.一种治疗软骨相关临床病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；
成纤维细胞生长因子18(FGF-18)、抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；
肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或上述治疗蛋白的部分、类似物、衍生物或功能片段。
11.一种治疗软骨相关病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为糖皮质激素受体；以及进一步同时给予或单独给予皮质类固醇。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述软骨相关病症为：
关节软骨缺陷，包括破裂或脱离；半月板缺陷，包括部分撕裂或完全撕裂；骨关节炎；
外伤性软骨破裂或脱离；强直性脊柱炎；囊炎；银屑病关节炎；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；幼年特发性关节炎；或X-连锁低血磷性佝偻病。
13.一种治疗神经性病症(例如障碍或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心脏营养素1、神经生成素、心脏营养素样细胞因子、FPF-1070、成纤维细胞生长因子2、神经调节蛋白-1、血管内皮生长因子(VEGF)，或上述治疗蛋白的功能部分、类似物或衍生物。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述神经性病症为：
阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、脑损伤、脊髓损伤、周围神经变性、中风、亨廷顿氏病、皮克氏病、糖尿病性神经病变、额颞痴呆、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、朊病毒障碍、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性下肢轻瘫、脊髓小脑萎缩、弗里德希氏共济失调、淀粉样变性或Charcot Marie Tooth综合征。
15.一种治疗眼睛疾病的方法，所述方法包括给予权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述眼睛疾病例如为：
角膜溃疡/角膜磨损、Thygeson浅层点状角膜病变、角膜血管新生、富克斯营养不良、干燥性角结膜炎、脉络膜视网膜炎症、脉络膜视网膜瘢痕、脉络膜变性、遗传性脉络膜营养不良、视网膜脱离、视网膜劈裂、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜变性、黄斑变性、黄斑视网膜前膜、周边视网膜变性、遗传性视网膜营养不良、色素性视网膜炎、干眼症或视网膜出血。
16.一种治疗炎症的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于如下治疗蛋白的治疗蛋白或其部分：TNF受体2、白介素-4或白介素-10。
17.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，X为小分子。
18.如权利要求6或32所述的组合物，其中，所述融合蛋白选自以下：
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGGDGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARAVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：10)；
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：11)；
MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：12)；
MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGTVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：13)；
MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：14)；
MKRKKKGKGLCKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：15)；
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：16)；
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEO ID NO：17)；
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTCIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：18)；或
KRKKKCKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTCIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：19)。
19.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，HBn＝2，并且HB融合至X的N末端和C末端这两端，其中，所述HB与N末端或C末端的融合任选包含至少一种接头肽。
20.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述HBn-Xn包括(HB-接头)n-Xm-(HB-接头)o，其中，m是至少为1的整数、且n+o是至少为1的整数。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述HBn-Xn包含选自以下序列的两种以上不同的HB肽：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)。
22.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含至少2种HBn-Xn缀合物。
23.如权利要求6、21或22中任一项所述的组合物，其中，X选自于由以下蛋白所组成的组中的任何一种蛋白或组合：
SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73-SEQ ID NO：76，或上述蛋白的功能片段。
24.如权利要求1-9和17-23中任一项所述的组合物，所述组合物用于将活性剂X递送至表达蛋白聚糖的细胞或组织。
25.如权利要求24所述的组合物，其中，所述组织为软骨组织、神经元组织、皮肤或皮下组织。
26.如权利要求1-9和17-25中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含水凝胶。
27.如权利要求26所述的组合物，其中，所述水凝胶为自组装肽水凝胶。
28.如权利要求27所述的组合物，其中，所述自组装肽水凝胶包含选自以下肽的至少一种或组合：
RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、
KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)、或
AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
29.如权利要求10-16中任一项所述的方法，其中，所述HB-Xn或(HB-接头)n-Xn存在于水凝胶上或水凝胶中。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述水凝胶为自组装肽水凝胶。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述自组装肽水凝胶包含选自以下肽的至少一种或组合：
RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、
KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)、或
AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
32.如权利要求10-16中任一项所述的方法，其中，所述HB-Xn或(HB-接头)n-Xn存在于生物植入物上或生物植入物中。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述生物植入物为骨软骨同种异体移植物或半月板同种异体移植物。
34.一种治疗软骨相关临床病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、生长抑素(SST)，或上述治疗蛋白的片段、部分、类似物、衍生物或功能片段。
35.如权利要求34所述的方法，其中，SST的类似物选自于奥曲肽、帕瑞肽或兰瑞肽。
36.一种载体，所述载体包含编码至少一种肝素结合肽(HB)的核酸，所述肝素结合肽(HB)选自：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)。
37.如权利要求36所述的载体，所述载体进一步包含编码至少一种活性剂(X)的至少一种核酸序列。
38.如权利要求36所述的载体，所述载体进一步包含编码至少一种接头的至少一种核酸序列。
39.如权利要求37所述的载体，其中，所述核酸序列编码至少一种HB-Xn融合蛋白或Xn-HBn融合蛋白，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
X为活性剂，并且n是至少为1的整数。
40.如权利要求38所述的载体，其中，所述核酸序列编码至少一种(HB-接头)n-Xn融合蛋白或至少一种Xn-(HB-接头)n融合蛋白或至少一种(HB-接头)n-Xm-(HB-接头)o融合蛋白，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
X为活性剂，其中m是至少为1的整数、且n+o是至少为1的整数。
41.如权利要求36或38所述的载体，其中，所述接头包含GGG。
42.如权利要求36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述X或所述接头的核酸序列在编码HB的核酸的5’处。
43.如权利要求36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述X或所述接头的核酸序列在编码HB的核酸的3’处。
44.如权利要求36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述HB肽的核酸序列在编码所述X或所述接头的核酸的5’和3’处。
45.如权利要求36-44中任一项所述的载体，其中，所述载体为表达载体。
46.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
i.选自于由以下序列所组成的组中的至少一种HB肽：
KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；以及
ii.将所述HB肽缀合至小分子的化学接头。
47.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求36或38所述的载体；以及用于将编码活性剂(X)的核酸序列插入所述载体的试剂。
48.包含权利要求36-45中任一项所述的载体的细胞系。
靶向治疗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年6月25日提交的美国临时申请No.61/663,679的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
技术领域
[0003] 概括地说，本发明涉及通过将活性剂(active agent)(例如治疗剂(therapeutic agent))缀合、融合、或非直接连接(non-direct linkage)至一个或多个肝素结合肽(heparin-binding peptide，HB)来递送所述活性剂的方法和组合物。其它方面涉及包含与治疗剂融合或缀合的肝素结合肽(HB)的组合物、方法和试剂盒。
背景技术
[0004] 治疗剂(例如重组细胞因子和小分子)的全身给药或非特异性活性可触发脱靶后遗症(selequae)。因此，仍需要将活性分子靶向递送至感兴趣的位点。
发明内容
[0005] 本实施方式提供了将重组治疗蛋白或小分子选择性递送至表达蛋白聚糖(proteoglycans)的细胞或组织，所述细胞或组织例如但不限于软骨、脑和脊髓组织、皮肤和皮下组织。更具体而言，本文的一些实施方式针对任选通过接头肽(linker peptide)融合至治疗蛋白或其部分的新型肝素结合肽(HB)。一些实施方式提供了小分子与新型HB的缀合或间接连接以用于选择性递送。HB-试剂组合物可串联(in tandem)使用，以将治疗蛋白和试剂递送至组织。
[0006] 本发明的一个方面提供了包含例如(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)o的选择性治疗组合物，其中，HB为肝素结合蛋白，X为活性剂(例如治疗蛋白或其部分、或治疗小分子)，以及其中，n、m和o为整数，并且m至少为1、且n+o至少为1。在一些实施方式中，HB-X缀合物为HB-Xn或(HB-接头)n-Xn，其中，n是至少为1的整数。在一些实施方式中，该组合物为包含重组HB和治疗蛋白(或其部分)的重组融合蛋白。相对于所述组合物的HB部分的N末端，该组合物的组件(components)可以按顺序安放：HB-X、X-HB、HB-接头-X、(HB-接头)2-X、X-接头-HB、X-HB-X、HBn-X-HBn、(HB-接头)n-X-(接头-HB)n、HB-X-HB-X等。另外，该组合物可包含HB-X构建体(constructs)的混合物，其中，X代表不同的蛋白或不同的小1 2
分子(即，含有HB-X和HB-X 等的组合物)。示例接头为含有氨基酸GGG的肽。包括本领域公知的其它接头(例如已知的肽接头和化学接头)，以供HB-X缀合物使用。
分子(即，含有HB-X和HB-X 等的组合物)。示例接头为含有氨基酸GGG的肽。包括本领域公知的其它接头(例如已知的肽接头和化学接头)，以供HB-X缀合物使用。
[0007] 更具体而言，组合物的HB部分凭借HB肽中的多个赖氨酸残基和精氨酸残基而带正电荷，所述组合物的HB部分结合至细胞或组织表达的蛋白聚糖，所述蛋白聚糖通过硫酸根(sulfate)基团而带负电荷。在具体实施方式中，通过用精氨酸残基或赖氨酸残基替换天然半胱氨酸残基来使HB突变，以增强正电荷。例如，HB可选自具有如下氨基酸残基序列的肽或其功能性变体、类似物或衍生物：KRKKKGKGLGKKRDPCLRK YK(SEQ ID NO：1)；KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)(也称为HB C16R)；或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)(也称为HB C16K)。
[0008] 此外，可任选用联接(connecting)HB肽的接头肽使组合物的HB部分重复。因此，例如，使用SEQ ID NO：2作为示例性HB部分，治疗分子可包含下列氨基酸、或者可连接至下列氨基酸：KRKKKGKGLG KKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：4)或KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLR KYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：5)。包括本领域普通技术人员公知的接头肽(例如，如本文所公开的接头肽)，以供本发明使用。在一些实施方式中，接头肽包含GGG。在一些实施方式中，接头肽包含(GGGGS)(SEQ ID NO：42)。
[0009] 在一些实施方式中，重组HB融合蛋白的活性剂可选自：神经营养因子，包括神经营养蛋白(Neurothrophins)，例如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(neurotrophin-3，NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性(astrocyte-derived)神经营养因子(MANF)或保守性多巴胺神经营养因子(conserved dopamine neurotrophic factor，CDNF)；神经胶质细胞系源性神经营养因子家族配体(Glial cell-line derived neurotrophic factor family ligands)，例如神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)或persephin(PSPN)；促神经生长细胞因子(Neuropoietic cytokines)，例如白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor)、睫状神经营养因子、心脏营养素1(cardiotrophin 1)、神经生成素(neuropoietin)、心脏营养素样细胞因子(cardiotrophin-like cytokine)或成纤维细胞生长因子2；抗炎细胞因子，包括白介素-4和白介素-10；神经保护剂(Neuroprotection agents)，包括神经调节蛋白-1(Neuregulin-1)和血管内皮生长因子(VEGF)；或其它治疗蛋白，例如(FPF-1070)、生长分化因子11(GDF11)、基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor 1，SDF-1)、肌肉生长抑制素(Myostatin)(生长分化因子8(GDF8))；胰岛素样生长因子1(IGF-1)；甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；IL-1/IL-1RA嵌合体(chimerias)、成纤维细胞生长因子18(FGF-18)；高迁移率族蛋白2(High-mobility group protein 2，HMG-2，也被称为高迁移率族盒2(High mobility group box 2，HMGB2))；治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔
单抗(infliximab)，抗TNF-α，Janssen Biotech，Horsham，PA)、 (阿达
木单抗(adalimumab)，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、 (依那西普
(etanercept)，重组抗TNF蛋白，Amgen，Thousand Oaks，CA)、或抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、生长抑素(somatostatin，SST)，或任何这些活性剂的功能部分、变体、类似物或衍生物。
单抗(infliximab)，抗TNF-α，Janssen Biotech，Horsham，PA)、 (阿达
木单抗(adalimumab)，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、 (依那西普
(etanercept)，重组抗TNF蛋白，Amgen，Thousand Oaks，CA)、或抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、生长抑素(somatostatin，SST)，或任何这些活性剂的功能部分、变体、类似物或衍生物。
[0010] 在一些实施方式中，HB融合体(fusion)的治疗蛋白部分选自：IGF-1、PTH、PTHrP、IL-1RA、FGF-18，或它们的功能部分、类似物或衍生物。
[0011] 本发明的另一个方面提供了治疗软骨相关临床病症(例如损伤或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的含有HB-X的重组融合蛋白，其中，X为治疗蛋白或其部分，其中，所述治疗蛋白选自：IGF-1、PTH、PTHrP、IL-1RA、FGF-18、抗神经生长因子抗体、FGF-9、肝细胞生长因子、TGFβ、TGFβ3、BMP2、BMP7，或它们的功能部分、类似物或衍生物。
[0012] 在另一个具体实施方式中，HB融合至糖皮质激素(Glucocorticoid)受体，这有利于将皮质类固醇(corticosteroids)靶向递送至软骨；所述融合至糖皮质激素受体的HB的给药可与皮质类固醇的给药同时(concurrently)进行或单独(separately)进行。
[0013] 在一些实施方式中，软骨病症为关节软骨缺陷(articular cartilage defect)(包括破裂(rupture)或脱离(detachment))、半月板缺陷(包括部分撕裂(tear)或完全撕裂)、骨关节炎(Osteoarthritis)、外伤性软骨破裂或脱离、强直性脊柱炎、囊炎(Capsulitis)、银屑病关节炎(Psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、或X-连锁低血磷性佝偻病(X-linked hypophosphatemic rickets)、或幼年特发性关节炎(Juvenile idiopathic arthritis)。软骨病症的治疗可与其它疗法联用，作为用于关节软骨修复、半月板修复或韧带修复的其它外科干预的辅助，以同时改善修复并防止骨关节炎的发展。
[0014] 本发明的另一个方面提供了治疗神经性(neurological)病症(例如障碍(disorder)或疾病)，所述治疗神经性病症包括向受试者给予有效量的含有HB-X的重组融合蛋白，其中，X为治疗蛋白或其部分，所述治疗蛋白选自：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心脏营养素1、神经生成素、心脏营养素样细胞因子、FPF-1070、成纤维细胞生长因子2、神经调节蛋白-1、血管内皮生长因子(VEGF)、IGF或胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
[0015] 所述神经性病症可选自：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、多发性硬化症(Multiple sclerosis)、脑损伤(Brain injury)、脊髓损伤、周围神经变性(Peripheral nerve degeneration)、中风、亨廷顿氏病、皮克氏病(Pick’s disease)、糖尿病性神经病变(Diabetic neuropathy)、额颞痴呆(Frontotemporal dementia)、路易体痴呆(Dementia with Lewy bodies)、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)、进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)、朊病毒障碍、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性下肢轻瘫(Hereditary spastic paraparesis)、脊髓小脑萎缩(Spinocerebellar atrophies)、弗里德希氏共济失调(Friedreich’s ataxia)、淀粉样变性或Charcot Marie Tooth综合征(Charcot Marie Tooth syndrome)。
[0016] 另一个实施方式提供了用于治疗眼病的HB-X组合物的给药，所述眼病例如为角膜溃疡、角膜磨损、Thygeson浅层点状角膜病变(Thygeson’s superficial punctate keratopathy)、角膜血管新生(Corneal neovascularization)、富克斯营养不良(Fuchs’dystrophy)、干燥性角结膜炎(Keratoconjunctivitis sicca)、脉络膜视网膜炎症(Chorioretinal inflammation)、脉络膜视网膜瘢痕(Chorioretinal scars)、脉络膜变性(Choroidal degeneration)、遗传性脉络膜营养不良(Hereditary choroidal dystrophy)、视网膜脱离、视网膜劈裂(Retinoschisis)、高血压性视网膜病变(Hypertensive retinopathy)、早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity)、年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration)、视网膜变性、黄斑变性、黄斑视网膜前膜(Epiretinal membrane)、周边视网膜变性、遗传性视网膜营养不良(Hereditary retinal dystrophy)、色素性视网膜炎(Retinitis pigmentosa)、干眼症(Xerophthalmia)或视网膜出血(Retinal haemorrhage)。
[0017] 本发明的另一个方面提供了治疗炎症的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的含有HB-X的重组融合蛋白的方法，其中，X为治疗蛋白或其部分，所述治疗蛋白选自：TNF受体2、白介素-4或白介素-10。
[0019] 图1提供了示出关节内(intra-articular)注射后一个实施方式的HB-IGF-1的长期保留(retention)的数据。在关节内注射IGF-1、HB-IGF-1或PBS之一后2、4、6和8天时，对大鼠关节软骨、半月板或髌腱(patellar tendon)中保留的IGF-1或HB-IGF-1进行蛋白印迹分析。
[0020] 图2示出关节内注射后IGF-1与HB-IGF-1的血清水平。将雄性Lewis大鼠251-275g(Charles River,Wilmington MA)随机分配至3组中的1组(每组n＝3)：
HB-IGF-1、IGF-1或盐水。大鼠在右膝关节接受50μl关节内注射，各自含有100μg HB-IGF-1、100μg IGF-1或盐水。在注射后2、4、8、24、48和96小时时经由尾静脉收集血液。用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)对血清水平进行测量。在前三个时间点时，血清中的HB-IGF-1水平显著低于IGF-1水平。2小时后，HB-IGF-1水平没有显著不同于盐水。这表明相比未关联HB的IGF1，HB-IGF-1的关节内注射限制了非特异性IGF-1循环的量。
HB-IGF-1、IGF-1或盐水。大鼠在右膝关节接受50μl关节内注射，各自含有100μg HB-IGF-1、100μg IGF-1或盐水。在注射后2、4、8、24、48和96小时时经由尾静脉收集血液。用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)对血清水平进行测量。在前三个时间点时，血清中的HB-IGF-1水平显著低于IGF-1水平。2小时后，HB-IGF-1水平没有显著不同于盐水。这表明相比未关联HB的IGF1，HB-IGF-1的关节内注射限制了非特异性IGF-1循环的量。
[0021] 图3为描绘在大鼠中关节内注射后由HB-IGF-1引起的对软骨生物合成和增殖的离体(ex vivo)持续性(sustained)刺激的柱状图。大鼠在右膝关节接受单次50μl关节内注射，各自含有100μg一个实施方式的HB-IGF-1、100μg IGF-1或PBS。注射后2天和4天时处死大鼠，收集半月板并在有放射性标记的情况下进行培养。图表表示关节内注射后
35
2天和4天时半月板中[ S]硫酸根(sulfate)的掺入。结果以平均值±SEM显示。
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2天和4天时半月板中[ S]硫酸根(sulfate)的掺入。结果以平均值±SEM显示。
[0022] 图4是来自比较HB-IGF-1、IGF-1和PBS的OARSI评分的骨关节炎研究的柱状图。
[0023] 图5示出了可溶性HB-IGF-1的优异表达，所述可溶性HB-IGF-1包含增强的HB(eHB)肽：C17K(SEQ ID NO：22)和C17R(SEQ ID NO：21)。图5示出了在用不同HB-IGF-1融合变体孵育软骨分离体(explants)后使用抗IGF-1抗体检测IGF-1的存在的蛋白印迹，其中，所述HB变体包含C17K(SEQ ID NO：22)、C17R(SEQ ID NO：21)、C17S(SEQ ID NO：41)和野生型HB(SEQ ID NO：20)。图5表明，相比C17S(SEQ ID NO：41)和野生型HB(SEQ ID NO：1)的HB变体，包含C17K(SEQ ID NO：22)或C17R(SEQ ID NO：21)变体的IGF-1融合蛋白在软骨中获得了更高的IGF-1保留。
[0024] 图6示出了以包含C17R(SEQ ID NO：21)HB变体的HB-IGF-1融合蛋白进行的可溶性HB-IGF-1纯化的优异产率。图6示出了使用抗IGF-1抗体对由通过尺寸排阻色谱法纯化的软骨提取物进行的蛋白印迹，以检测用含有C17R(SEQ ID NO：21)HB肽或野生型HB(SEQ ID NO：20)HB肽的HB-IGF-1融合变体孵育软骨分离体后的IGF-1的产率。图6示出了相比HB(WT)-IGF-1融合蛋白，来自用HB(C17R)-IGF-1融合蛋白C17R孵育的提取物的IGF-1具有显著较高的产率。
[0025] 图7示出了HB(C17R)使得由包涵体获得了优异的HB-IGF-1产率。图7示出了使用抗IGF-1抗体对由包涵体纯化的软骨提取物进行的蛋白印迹，以检测用含有C17R(SEQ ID NO：21)(称为eHB)HB肽或野生型HB(SEQ ID NO：20)HB肽的HB-IGF-1融合变体孵育软骨分离体后的IGF-1的产率。图7示出了相比用HB(WT)-IGF-1(wHB-IGF-1)融合蛋白孵育的提取物，由HB(C17R)-IGF-1(eHB-IGF-1)融合蛋白获得的诱导包涵体和未诱导包涵体中的IGF-1具有显著较高的产率。
[0026] 图8示出了用HB-IGF-1孵育的脊髓中IGF-1的保留的蛋白印迹。将大鼠脊髓组织在无添加(无IGF-1)、含1μg/ml IGF-1或1μg/ml HB-IGF-1的培养基中孵育24小时。孵育后，对组织进行洗涤，并立即冷冻(“第0天”)或在收集清洗的蛋白前在新鲜培养基中孵育另外的24小时(“第1天”)。然后，用抗IGF-1抗体通过蛋白印迹对组织进行分析，以检测残留在脊髓组织中的IGF-1或HB-IGF-1的存在。
[0027] 图9A-图9B示出用PTH-HB孵育的软骨盘(cartilage disks)中PTH的保留。将软骨盘在未添加肽(“无PTH”)、含甲状旁腺激素1-34(“PTH”)或甲状旁腺激素1-34与HB结构域的融合体(“PTH-HB”)的培养基中孵育。图9A示出了加入至软骨盘分离体的PTH或PTH-HB的量的肽对照。24小时后，对软骨盘进行洗涤，并送回至不存在肽的新鲜培养基中进行孵育。图9B示出了清洗(washout)后2天，在软骨组织提取物中用抗PTH抗体进行的蛋白印迹，表明PTH仅在用PTH-HB孵育而非用非融合PTH孵育的软骨盘中保留。
具体实施方式
[0028] 本发明涉及肝素结合肽(HB)与活性剂(例如X)的缀合，以将所述活性剂选择性递送至表达蛋白聚糖的细胞或组织。在一些实施方式中，HB-活性剂缀合物可用于将所述活性剂递送至表达蛋白聚糖的细胞或组织，例如但不限于软骨、脑和脊髓组织、皮肤和皮下组织。
[0029] 更具体而言，本文的一些实施方式针对任选通过接头肽融合至活性剂的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22的肝素结合肽(HB)，所述活性剂为治疗蛋白或其部分。在一些实施方式中，所述活性剂为小分子，并能够将所述小分子递送至含有蛋白聚糖的细胞和组织，其中，SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22的HB肽可通过直接或间接连接(例如化学接头的使用)缀合至所述小分子。在一些实施方式中，包含HB-X缀合物的组合物可用于将一种或多种不同的治疗蛋白和试剂递送至表达蛋白聚糖的组织和细胞。
[0030] 本发明的一个方面提供了包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的选择性治疗组合物，其中，HB为肝素结合蛋白，X为活性剂(例如治疗蛋白或其部分、或治疗小分子)，并且n为至少为1的整数。在一些实施方式中，该组合物为包含重组HB和治疗蛋白(或其部分)的重组融合蛋白。选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：22的组的HB肽的任何组合可在存在或不存在接头蛋白的情况下用于活性剂的任何组合，其中，所述HB肽可位于所述活性剂的N末端和/或C末端，并且可存在一个或多个结合至(attached to)所述活性剂的N末端和/或C末端的HB肽-接头。例如，在一些实施方式中，融合体或缀合物可包含(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)o，其中，n、m和o为整数，m至少为1、且n+o至少为1。
[0031] 在一些实施方式中，相对于所述组合物的HB部分的N末端，该组合物的组件可以按顺序安放：HB-X、X-HB、HB-接头-X、(HB-接头)2-X、X-接头-HB、X-HB-X、HBn-X-HBn、(HB-接头)n-X-(接头-HB)n、HB-X-HB-X等。另外，该组合物可包含HB-X构建体的混合物，1 2
其中，X代表不同的蛋白或不同的小分子(即，含有HB-X和HB-X 等的组合物)。示例接头为具有氨基酸GGG的肽。
其中，X代表不同的蛋白或不同的小分子(即，含有HB-X和HB-X 等的组合物)。示例接头为具有氨基酸GGG的肽。
[0032] 应当理解的是，本发明并不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，并且本文所述的具体方法学、方案和试剂等可以发生变化。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围只通过权利要求进行定义。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非另有说明，所有基因ID是指在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库可获得的人类基因。
[0033] 除非上下文另有明确指示，在本文及权利要求中使用的单数形式也包含复数含义，反之亦然。除非被例如“两者中任一(either)”修饰，术语“或(or)”表示包括在内的(inclusive)。除了在操作实施例或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。进一步可以理解的是，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均是近似的，并且是提供用于描述目的的。
[0034] 出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将在本文中标明的所有专利与其它出版物明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
[0035] 本发明提供了将活性剂和治疗部分(例如蛋白质或小分子)选择性递送至与肝素结合蛋白有关的特定组织。更具体而言，本发明实施方式提供了新型蛋白质肝素结合基序(proteinaceous heparin-binding motifs)(HB)，所述肝素结合基序连接至或融合至治疗部分(例如小分子、或细胞因子或生长因子或它们的功能部分)。
[0036] 定义
[0037] 为了方便起见，在此收集了整个申请(包括说明书、实施例和所附权利要求书)中使用的某些术语。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0038] 术语“蛋白”与“多肽”可互换使用，指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。通常，蛋白或多肽具有至少25个氨基酸的最小长度。术语“多肽”和“蛋白”可涵盖多聚体(multimeric)蛋白，例如含有多于一个结构域或亚基的蛋白。本文所用的术语“肽”通常是指含有少于25个氨基酸的肽键连接的氨基酸聚合物，例如长度为约4个氨基酸至约25个氨基酸之间。蛋白和肽可由通过肽键连接的线性排列的氨基酸构成，无论是生物生产、重组生产还是合成生产以及无论是由天然存在的氨基酸构成还是由非天然存在的氨基酸构成，均包括在本定义内。大于25个氨基酸的全长蛋白质及其片段均被蛋白的定义所涵盖。该术语还包括具有多肽的共翻译修饰(例如信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，如，例如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂化、蛋白水解切割(例如由金属蛋白酶切割)等。此外，本文所用的“多肽”是指包含对天然序列的修饰(例如删除、添加和置换(本领域技术人员知晓其通常是保守性的))的蛋白，只要所述蛋白维持了所需活性。这些修饰可为有意的(例如通过定点诱变)或者可为偶然的(例如通过产生该蛋白的宿主的突变、或由于PCR扩增或其它重组DNA方法产生的错误)。多肽或蛋白由通过肽键连接的线性排列的氨基酸构成，但与肽相比，具有良好定义的构象。与肽不同，蛋白通常由25个以上的氨基酸的链组成。出于本发明的目的，本文所用的术语“肽”通常是指由D-氨基酸或L-氨基酸或者D-氨基酸和L-氨基酸的混合物通过肽键连接形成的单个链构成的氨基酸序列。通常，肽包含至少两个氨基酸残基，并且长度小于约25个氨基酸。
[0039] 应该理解的是，蛋白、多肽或肽时常含有除通常被称为20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸以外的氨基酸(例如合成的非天然氨基酸)，还应该理解的是，给定多肽中的许多氨基酸(包括末端氨基酸)可通过天然过程(例如糖基化和其它翻译后修饰)或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。可在本发明多肽中存在的已知修饰包括但不限于：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合(covalent attachment)、血红素部分的共价结合、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、制剂(formulation)、γ-羧化、糖化(glycation)、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白添加氨基酸(例如精氨酰化(arginylation))和泛素化。
[0040] 在某些情况下，非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、置换的氨基酸、或者一个或多个D-氨基酸)掺入HB肽和/或活性剂肽或蛋白(或组合物的其它组件))是可取的。相比含有L-氨基酸的形式，含有D-氨基酸的肽在体外或体内表现出增加的稳定性。因此，当想要或需要较大的体内或细胞内稳定性时，构建掺入D-氨基酸的肽可特别有用。更具体而言，D-肽对内源性肽酶和蛋白酶具有抵抗性，从而为连接的药物和缀合物提供了更好的口服跨上皮(trans-epithelial)递送和透皮(transdermal)递送、改善的膜永久复合物(membrane-permanent complexes)的生物利用度(参见下文的进一步讨论)、以及延长的血管内和间质(interstitial)寿命(当想要此类特性时)。使用D-异构体(D-isomer)肽还可增强连接的药物和其它货物分子的透皮递送和口服跨上皮递送。此外，D-肽不能被有效加工以进行受限于II类主要组织相容性复合物的向辅助T细胞的呈递，并因此不太可能在整个有机体中诱导体液免疫应答。因此，可使用例如细胞穿透肽(penetrating peptide)序列的D-异构体形式、切割位点的L-异构体形式、以及治疗肽的D-异构体形式构建肽缀合物。在一些实施方式中，HB-融合蛋白包含D-氨基酸残基和/或L-氨基酸残基，因为使用天然存在的L-氨基酸残基具有以下优点：任何分解的产物对细胞或有机体来说应该是相对无毒的。
[0041] 在又一个进一步的实施方式中，HB-X可为逆反肽(retro-inverso peptides)。“逆反肽”是指在至少一个位置上肽键方向反转(reversal)的肽，即，相对于所述氨基酸的侧链而言氨基末端和羧基末端的反转。因此，逆反类似物具有反转的末端和反转的肽键方向，同时大致保持如同天然肽序列的侧链拓扑学。逆反肽可含有L-氨基酸或D-氨基酸、或者L-氨基酸和D-氨基酸的混合物，至多所有的氨基酸都为D-异构体。局部逆反肽类似物为其中仅部分序列反转并用对映体氨基酸残基替换的多肽。由于这样的类似物的逆反部分具有反转的氨基末端和羧基末端，逆反部分侧翼的氨基酸残基分别被侧链类似的α-取代的偕-二氨基甲烷(geminal-diaminomethanes)和丙二酸盐/酯(malonates)替换。已发现细胞穿透肽的逆反形式在易位跨膜方面与天然形式一样有效。逆反肽类似物的合成在以下文献中描述：Bonelli,F.等，Int J Pept Protein Res.24(6):553-6(1984)；
Verdini,A和Viscomi,G.C.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:697-701(1985)；以及美国专利No.6,261,569，以引用的方式将它们整体并入本文。局部逆反肽类似物的固相合成工艺已有描述(EP 97994-B)，也通过引用将其整体并入本文。
Verdini,A和Viscomi,G.C.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:697-701(1985)；以及美国专利No.6,261,569，以引用的方式将它们整体并入本文。局部逆反肽类似物的固相合成工艺已有描述(EP 97994-B)，也通过引用将其整体并入本文。
[0042] 术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸或核酸删除、添加、置换或侧链修饰而不同于天然存在的多肽或核酸、但保留了这些天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物活性的多肽或核酸。氨基酸置换包括用不同的天然存在的氨基酸残基或非常规氨基酸残基替换氨基酸的改变。此类置换可分为“保守的”，在这种情况下，用在极性、侧链功能或尺寸方面具有类似性质的另一天然存在的氨基酸替换多肽中包含的氨基酸残基。本文所述的变体包含的置换也可为“非保守的”，其中，用具有不同特性的氨基酸置换存在于肽中的氨基酸残基(例如，用丙氨酸置换带电的氨基酸或疏水性氨基酸)；或者其中，用非常规氨基酸置换天然存在的氨基酸。当就多核苷酸或多肽使用时，术语“变体”也包含分别相比参比多核苷酸或多肽(例如相比野生型多核苷酸或多肽)而言，在一级结构、二级结构、或三级结构中的变化。
[0043] 如下所述，变体可包括保守氨基酸改变或非保守氨基酸改变。多核苷酸的改变可导致由参比序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、删除、融合和截短。变体还可包括氨基酸的插入、删除或置换，包括通常不出现在作为变体基础的肽序列中的氨基酸和其它分子的插入和置换，例如但不限于通常不出现在人蛋白中的鸟氨酸的插入。“保守氨基酸置换”由用具有类似结构性质和/或化学性质的另一氨基酸替换一个氨基酸造成。提供功能相似氨基酸的保守置换表在本领域中是公知的。例如，下面6组各自含有彼此为保守置换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。参见例如Creighton，Proteins(W.H.Freeman&Co.,1984)。保守氨基酸的选择可基于肽中待置换的氨基酸的位置进行选择，例如，氨基酸是否在肽的外部且暴露至溶剂、或是否在内部且不暴露至溶剂。在一些实施方式中，含有非保守氨基酸置换的多肽也包含在术语“变体”内。本文所用的术语“非保守”置换是指用氨基酸残基置换具有不同化学性质的不同氨基酸残基。非保守置换的非限制性实例包括用甘氨酸(G)替换天冬氨酸(D)、用赖氨酸(K)替换天冬酰胺(N)、以及用精氨酸(R)替换丙氨酸(A)。对此类保守氨基酸置换和非保守氨基酸置换的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0044] 术语“衍生物”是指已通过例如泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其它分子进行化学修饰的蛋白或肽。当分子含有通常不是所述分子的部分的附加化学部分时，该分子也是另一分子的“衍生物”。此类部分可改善该分子的溶解性、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分可以降低分子的毒性、或消除或减弱该分子不希望的副作用等。能够介导此类效应的部分公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences(第21版，Tory著，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006)中。
[0045] 当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“功能性”是指具有与实体或分子(它是该实体或分子的衍生物或变体)的生物学活性大体上类似的生物学活性的蛋白分子。在该上下文中，“大体上类似的”意味着多肽的生物学活性为参比(例如相应的野生型多肽)的至少50％，例如至少60％、70％、80％、90％、95％、100％或甚至更高(即，变体或衍生物的活性比野生型高)，例如为参比的110％、120％或以上，包含端值。
[0046] 术语“功能部分”或“功能片段”是指介导与全长分子相同的效果(例如刺激细胞应答(例如生长)或影响与期望生理效应有关的信号或信号级联)的天然分子(例如天然蛋白或化学实体的受体结合部分)的部分。
[0047] 本文所用的术语肽、多肽或分子的“片段”是指该分子的任何连续的(contiguous)多肽子集。本文所用的术语“蛋白片段”包括来源于天然存在的氨基酸序列的合成氨基酸序列和天然存在的氨基酸序列，例如天然存在的蛋白活性剂、或HB(SEQ ID NO：1)或其变体(例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)。如果蛋白可通过将天然存在的蛋白片段化(fragmenting)而获得、或者如果蛋白可基于天然存在的氨基酸序列或编码该序列的遗传物质(DNA或RNA)的知识而合成，所述蛋白被认为是“来源于天然存在的氨基酸序列”。因此，分子的“片段”意思是指所述分子的任何多肽子集。具有本文所公开的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3HB肽变体活性并可溶的HB片段也包括在本发明中使用。
[0048] 例如，在本文所公开的方法中有用的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的功能片段在体内具有SEQ ID NO：2多肽或SEQ ID NO：3多肽至少30％的活性。换句话说，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的片段是任何此类片段：单独的该片段或融合至活性剂的该片段可产生与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3相比至少30％的相同活性，以在当将含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB融合蛋白与软骨分离体或脊髓分离体孵育时，如本文所公开地在清洗后
24小时后使HB融合蛋白保留在组织中(如实施例中所公开的)。“片段”可为至少约6个、至少约9个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约
100个、至少约250个、至少约300个(以及其间所有整数)核酸或氨基酸。示例性片段包括C末端截短、N末端截短或C末端和N末端都截短(例如从N末端、C末端或N末端和C末端二者删除例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个或更多个氨基酸)。本领域普通技术人员可通过简单的删除分析来制造此类片段。此类SEQ ID NO：
2或SEQ ID NO：3的片段可为例如分别从SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的N末端和/或C末端删除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸或多于10个氨基酸。在一些实施方式中，通过由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3顺序(sequentially)删除N末端和/或C末端氨基酸，并评估所得肽片段(单独的肽片段或融合至活性剂的肽片段)的功能，可鉴别用于本发明的HB的功能片段。可以用多个较小片段制造功能片段。这些片段可通过桥接(bridging)肽接头连接。可以容易地选择接头来保持野生型构象。本领域普通技术人员可容易地评估相比含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB融合蛋白而言的HB-X缀合物保留在组织中并由活性剂X引发生物效应的功能(如实施例中所公开的)。使用体内分析(例如实施例中所公开的软骨分析)，如果HB肽片段具有对应于如本文所公开的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB的至少30％的生物活性，那么HB(片段)-X融合蛋白的HB肽片段被认为是有效的HB片段，并可用于本文所公开的融合蛋白和方法中。在一些实施方式中，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的片段可为少于20个、或少于15个或少于10个、或少于5个SEQ ID NO：
2或SEQ ID NO：3的氨基酸。然而，如上所述，该片段必须为至少4个氨基酸、至少约9个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约100个、至少约250个、至少约500个(或其间的任何整数)核酸或氨基酸。
24小时后使HB融合蛋白保留在组织中(如实施例中所公开的)。“片段”可为至少约6个、至少约9个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约
100个、至少约250个、至少约300个(以及其间所有整数)核酸或氨基酸。示例性片段包括C末端截短、N末端截短或C末端和N末端都截短(例如从N末端、C末端或N末端和C末端二者删除例如至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个或更多个氨基酸)。本领域普通技术人员可通过简单的删除分析来制造此类片段。此类SEQ ID NO：
2或SEQ ID NO：3的片段可为例如分别从SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的N末端和/或C末端删除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸或多于10个氨基酸。在一些实施方式中，通过由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3顺序(sequentially)删除N末端和/或C末端氨基酸，并评估所得肽片段(单独的肽片段或融合至活性剂的肽片段)的功能，可鉴别用于本发明的HB的功能片段。可以用多个较小片段制造功能片段。这些片段可通过桥接(bridging)肽接头连接。可以容易地选择接头来保持野生型构象。本领域普通技术人员可容易地评估相比含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB融合蛋白而言的HB-X缀合物保留在组织中并由活性剂X引发生物效应的功能(如实施例中所公开的)。使用体内分析(例如实施例中所公开的软骨分析)，如果HB肽片段具有对应于如本文所公开的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB的至少30％的生物活性，那么HB(片段)-X融合蛋白的HB肽片段被认为是有效的HB片段，并可用于本文所公开的融合蛋白和方法中。在一些实施方式中，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的片段可为少于20个、或少于15个或少于10个、或少于5个SEQ ID NO：
2或SEQ ID NO：3的氨基酸。然而，如上所述，该片段必须为至少4个氨基酸、至少约9个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约100个、至少约250个、至少约500个(或其间的任何整数)核酸或氨基酸。
[0049] 术语“野生型”分别是指天然存在的正常的编码蛋白的多核苷酸序列或其部分、或者蛋白序列或其部分，如通常在体内所存在的。
[0050] 术语“突变体”是指在其遗传物质中具有任何改变，特别是相对于野生型多核苷酸序列的改变(即，删除、置换、添加或改变)或者相对于野生型蛋白质序列的任何改变的有机体或细胞。术语“变体”与“突变体”可互换使用。尽管通常假定遗传物质的改变引起蛋白功能的改变，术语“突变体”和“变体”是指野生型蛋白序列的改变，而不考虑该改变是否使得蛋白的功能变化(例如提高、降低、赋予新功能)，或该改变是否对蛋白的功能没有影响(例如，突变或变异是沉默的)。
[0051] 当用于指蛋白或肽或者它们的功能衍生物的变体时，术语“大体上类似(substantially similar)”意味着相比原始蛋白，特定目标序列通过一个或多个置换、删除或添加而不同于该多肽的序列，但仍保留所述蛋白功能的至少50％以上，例如至少
60％、70％、80％、90％以上，包含端值。在确定多核苷酸序列时，能够编码大体上相似的氨基酸序列的所有目标多核苷酸序列都被认为是大体上类似于参比多核苷酸序列，而不管密码子序列的差异。如果：(a)给定多核苷酸的核苷酸杂交至天然多核苷酸的编码区；或(b)在适度严格(moderately stringent)条件下，给定多核苷酸能够杂交至天然多核苷酸，并且其编码的蛋白具有与天然蛋白类似的生物活性；或(c)相对于(a)或(b)中所定义的核苷酸序列，多核苷酸的序列作为遗传密码子的结果是简并(degenerate)的，则该核苷酸序列“大体上类似”于该给定核酸序列。大体上类似的蛋白通常将与天然蛋白的相应序列具有大于约80％的相似性。
60％、70％、80％、90％以上，包含端值。在确定多核苷酸序列时，能够编码大体上相似的氨基酸序列的所有目标多核苷酸序列都被认为是大体上类似于参比多核苷酸序列，而不管密码子序列的差异。如果：(a)给定多核苷酸的核苷酸杂交至天然多核苷酸的编码区；或(b)在适度严格(moderately stringent)条件下，给定多核苷酸能够杂交至天然多核苷酸，并且其编码的蛋白具有与天然蛋白类似的生物活性；或(c)相对于(a)或(b)中所定义的核苷酸序列，多核苷酸的序列作为遗传密码子的结果是简并(degenerate)的，则该核苷酸序列“大体上类似”于该给定核酸序列。大体上类似的蛋白通常将与天然蛋白的相应序列具有大于约80％的相似性。
[0052] 术语“同源的(homologous)”或“同源物(homologues)”可互换使用，并且，在用于描述多核苷酸或多肽时，表示当例如使用BLAST(版本2.2.14)以用于比对的缺省参数进行最佳比对和比较时，对于高同源性而言，具有适当核苷酸插入或删除或者氨基酸插入或删除的两个多核苷酸或多肽或它们的指定序列通常在至少70％的核苷酸中是一致的。对于多肽，在所述多肽中应该有至少30％的氨基酸一致性，或对于较高同源性而言为至少
50％。本文所用的术语“同源物(homolog)”或“同源的(homologous)”也指结构方面的同源性。基因或多肽同源物的确定可由本领域技术人员容易地确定。在定义的百分比的情况下时，所定义的百分比同源性是指至少该百分比的氨基酸相似性。例如，85％同源性是指至少85％的氨基酸相似性。
50％。本文所用的术语“同源物(homolog)”或“同源的(homologous)”也指结构方面的同源性。基因或多肽同源物的确定可由本领域技术人员容易地确定。在定义的百分比的情况下时，所定义的百分比同源性是指至少该百分比的氨基酸相似性。例如，85％同源性是指至少85％的氨基酸相似性。
[0053] 对于序列比较，通常一个序列作为参比序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，指定子序列坐标(subsequence coordinates)(如果需要的话)，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的百分比序列一致性。在必要或期望时，用于比较的最佳序列比对可通过任何各种方法进行，因为这些方法是本领域公知的。
[0054] 涉及核酸序列、蛋白或多肽的术语“异源的(heterologous)”是指这些分子不是在细胞中天然存在的。例如，在蛋白表达载体的情况下，被插入到细胞中的编码本文所述融合蛋白的核酸序列是异源核酸序列。
[0055] 本文所用的术语“试剂”或“化合物”是指给予受试者以治疗或预防或控制疾病或病症的化学实体或生物产品、或化学实体或生物产品的组合。化学实体或生物产品优选但并非必须是低分子量化合物，但也可为较大的化合物，或任何有机分子或无机分子，包括修饰的核酸和未修饰的核酸，例如反义核酸、RNAi(例如siRNA或shRNA)、肽、肽模拟物(peptidomimetics)、受体、配体和抗体、适体(aptamers)、多肽、核酸类似物或其变体。例如，试剂可为核酸、氨基酸或碳水化合物的寡聚物，包括但不限于：蛋白、肽、寡核苷酸、核酶(ribozymes)、DNA酶、糖蛋白、RNAi试剂(例如siRNA)、脂蛋白、适体，以及它们的修饰和组合。在一些实施方式中，活性剂是核酸，例如miRNA或其衍生物或变体。在一些实施方式中，包含核酸试剂(例如RNAi或miRNA试剂)的HB-X缀合物可使得所述miRNA或RNAi试剂与DNA相互作用，所述核酸试剂可通过接头部分的方式连接(例如缀合)至HB肽。在一些实施方式中，所述接头部分是可逆(reversible)部分，例如，miRNA或RNAi试剂可在靶细胞或组织的位置从HB肽释放。
[0056] 本文所用的术语“融合的(fused)”是指至少一种蛋白或肽在物理上与第二蛋白或肽关联。在一些实施方式中，融合通常为共价连接，但是其它类型的连接也包含在术语“融合的”中，例如包括经由静电相互作用或疏水性相互作用等的连接。共价连接可包括例如经由两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键形成的如融合蛋白或化学偶联连接的连接。
[0057] 本文所用的术语“融合多肽”或“融合蛋白”是指通过将两个以上的多肽序列连接到一起而创造的蛋白。包含在本发明中的融合多肽包括嵌合基因构建体的翻译产物，所述嵌合基因构建体将编码HB肽或其突变体的DNA序列与编码第二多肽的DNA序列连接在一起，以形成单个开放阅读框。换言之，“融合多肽”或“融合蛋白”是指两个以上的蛋白通过肽键或经由若干肽连接在一起的重组蛋白。融合蛋白也可在该融合蛋白的HB肽和活性剂(例如治疗肽或治疗多肽)之间包含肽接头。
[0058] 在一些实施方式中，例如可通过如下方式生产融合蛋白：将编码一个蛋白的核酸序列连接至编码另一蛋白的核酸，以使得它们构成单个开放阅读框，该开放阅读框可在细胞中翻译成含有所有目的蛋白的单个多肽。蛋白的排列顺序可变化。作为非限制性实例，将编码HB肽的核酸序列框内(in frame)融合至编码第一融合伴侣(例如X，例如治疗蛋白或治疗肽)的基因的一端(5’端或3’端)。以这种方式，一旦基因表达，HB肽被功能性地表达并融合至X(例如治疗肽或治疗蛋白)的N末端或C末端。在某些实施方式中，通过融合至第一融合伴侣X(例如治疗肽)对多肽探针的修饰使得HB肽的功能性在其生物活性方面大体上保持不受影响。在一些实施方式中，编码HB-X融合蛋白的核酸构建体还具有编码接头的核酸序列，所述编码接头的核酸序列位于编码HB肽的核酸和编码X(例如治疗肽或治疗蛋白)的核酸序列之间。在一些实施方式中，将所述HB-X融合蛋白配置为使得HB肽或X(例如治疗蛋白或治疗肽)的功能性不会因为融合而被显著削弱。
[0059] 本文所用的术语“与…关联(associated with)”是指一个实体与另一实体物理关联或接触。因此，HB肽与活性剂“关联”可为所述HB肽共价或非共价连接至所述活性剂。关联可通过接头部分介导，特别是当关联为共价关联时。术语“关联(association)”或“相互作用(interaction)”或“与…关联”在本文中可互换使用，并用于指HB肽通过直接连接或间接连接与活性剂关联或相互作用。
[0060] 本文所用的术语“缀合(conjugate)”或“缀合(conjugation)”或“连接(linked)”是指两个以上实体结合形成一个实体。缀合物既包括肽-小分子缀合物，也包括肽-蛋白/肽缀合物。例如，本发明的方法提供了与另一实体(例如活性剂，例如，如治疗蛋白/肽或小分子的部分)连接的HB肽的缀合。如本文所公开的，结合可通过接头、化学修饰、肽接头、化学接头、共价键或非共价键、或蛋白融合的方式进行，或者结合可通过本领域技术人员公知的任何手段进行。连接可为永久的或可逆的。在一些实施方式中，可包括数种接头分子(化学接头或肽接头)，以利用每个接头和缀合物中每个蛋白或分子的期望性质。计划将柔性接头和提高缀合物溶解度的接头单独使用或者与本文公开的其它接头一起使用。可通过表达编码接头的DNA而将肽接头连接至缀合物中一个或多个蛋白。接头可为酸裂解性、光裂解性和热敏感接头。缀合方法是本领域技术人员所熟知的，并都被包括在本发明中使用。
[0061] 或者，连接的两个以上实体可通过间接连接来连接。间接连接包括HB肽和活性剂之间的关联，其中，所述HB肽和所述活性剂经由“接头部分”结合，例如，它们不直接连接。直接连接包括不需要接头部分的任何连接。在一个实施方式中，直接连接包括化学相互作用或物理相互作用，其中，两个部分(即，靶向部分和结合部分)相互作用以使得它们彼此吸引(attracted)。直接相互作用的实例包括共价相互作用，非共价相互作用，疏水/亲水相互作用，离子相互作用(例如静电、库仑引力、离子偶极、电荷转移)，范德华力或氢键键合，以及化学键合(包括共价键的形成)。因此，在一个实施方式中，靶向部分(例如抗体或其片段)与结合部分不经由接头连接，例如，它们直接连接。在进一步的实施方式中，靶向部分和结合部分彼此静电关联。
[0062] 术语“缀合的(conjugated)”是指连接在一起的至少两个实体的结合。两个实体的连接可为直接的(例如通过共价键或非共价键)或间接的(例如通过接头等)。
[0063] 术语“接头”是指用于连接两个以上实体的任何工具(means)、实体或部分。例如，可使用接头部分将本文所公开的HB肽连接至活性剂X(例如治疗蛋白或治疗肽)。接头可为共价接头或非共价接头。共价接头的实例包括共价键或共价结合至待连接的一个或多个蛋白的接头部分。接头也可为非共价键，例如通过金属中心(例如铂原子)的有机金属键。对于共价连接，可使用各种官能团，例如酰胺基团(包括碳酸衍生物)、醚、酯(包括有机酯和无机酯)、氨基、氨基甲酸乙酯(urethane)和尿素等。为了提供连接，可以通过氧化、羟基化、取代、还原等对效应分子(effector molecule)和/或探针进行修饰，以提供偶联(coupling)位点。接头可为酸裂解性、光裂解性和热敏感接头。缀合方法为本领域技术人员所熟知的，并都被包括在本发明中使用。在一些实施方式中，将HB肽结合至核酸的接头部分是环丙吡咯并吲哚(cyclo-propapyrroloindole)交联接头。接头部分包括但不限于：化学接头部分，或者例如肽接头部分。在一些实施方式中，HB肽和活性剂或肽接头之间的接头可通过使聚合物与例如选自于由如下接头所组成的组中的接头进行反应而形成：对硝基苯基氯甲酸酯、羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、顺式乌头酸酐，以及这些化合物的混合物。应该理解的是，不显著降低如本文所公开的HB肽或活性剂(例如治疗蛋白或治疗肽)的功能的修饰是优选的。
[0064] 当用于描述核酸分子时，术语“重组体(recombinant)”是指基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作原因，该多核苷酸不与其在自然界中关联的多核苷酸序列的全部或部分关联。当就肽、多肽、蛋白或重组融合蛋白而使用时，术语重组体是指通过由重组多核苷酸表达而产生的多肽。当就宿主细胞而使用时，术语重组体是指其中已引入有重组多核苷酸的宿主细胞。就材料(例如细胞、核酸、蛋白或载体)而言，重组体在本文中也用来指所述材料已通过引入异源物质(例如细胞、核酸、蛋白或载体)进行修饰。
[0065] 术语“载体”指能够将与其连接的异源核酸转运至宿主细胞或介导与其连接的异源核酸表达至宿主细胞的核酸分子；质粒是由术语“载体”所包含的一个类型。术语“载体”通常是指含有复制起点和对于在宿主细胞中复制和/或维持所必需的其它实体的核酸序列。能够指导与其可操作地连接的基因和/或核酸序列表达的载体在本文中被称为“表达载体”。通常，具实用性的表达载体通常处于“质粒”形式，这是指环状双链DNA分子，处于该载体形式的DNA分子不与染色体结合，并且所述质粒通常包含用于稳定表达或瞬时表达编码DNA的实体。可用于本文所公开的方法的其它表达载体包括但不限于质粒、游离体(episomes)、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes)、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可整合到宿主基因组中，或可在特定细胞中自主复制。载体可为DNA载体或RNA载体。也可使用本领域技术人员已知的提供等同功能的其它形式的表达载体，例如自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组中的载体。优选的载体为能够使与其连接的核酸得以自主复制和/或表达的载体。
[0066] 术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，是指向其提供用根据本发明的药物组合物进行治疗(包括预防性治疗)的动物(例如人)。本文所用的术语“受试者”是指人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔和牛；以及非哺乳动物，如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方式中，所述受试者为人。在另一个实施方式中，所述受试者为实验动物或作为疾病模型的动物替代品(substitute)。该术语不表示特定年龄或性别。因此，意味着覆盖不论雄性还是雌性的成年受试者和新生儿受试者以及胎儿。受试者的实例包括人、狗、猫、牛、山羊和小鼠。术语受试者进一步旨在包括转基因物种。
[0067] 术语“组织”旨在包括完整细胞、血液、血液制品(例如血浆和血清)、骨、关节、软骨、神经组织(neuronal tissue)(脑、脊髓和神经元)、肌肉、平滑肌、以及器官。
[0068] 术语“疾病”或“障碍”在本文中可互换使用，是指中断或干扰功能执行和/或引起折磨人或与人有联系的症状(例如不适(discomfort)、功能障碍(dysfunction)、痛苦(distress)、或甚至死亡)的身体状态或一些器官的状态的任何变化。疾病或障碍也可涉及精神不佳(distemper)、小病(ailing)、微恙(ailment)、疾患(amlady)、障碍、患病(sickness)、病态(illness)、身体不适(complaint)、轻病(inderdisposion)、感染(affection)。
[0069] 术语“软骨相关病症”或“软骨相关临床病症”是指关节软骨中的任何缺陷。该术语包括但不限于：软骨破裂或脱离、半月板缺陷(包括部分撕裂或完全撕裂)、影响半月板和/或髌骨的损害或疾病、骨关节炎(本文中称为“OA”，包括膝盖、手指、手腕、髋部、脚踝、手肘、脚趾、肩和脊柱骨关节炎)、外伤性软骨破裂或脱离、强直性脊柱炎、囊炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、软骨病(Chondropathy)、软骨肉瘤、软骨软化(Chondromalacia)、多软骨炎、复发性多软骨炎、骨骺滑脱(Slipped epiphysis)、剥脱性骨软骨炎(Osteochondritis Dissecans)、软骨发育不良(Chondrodysplasia)、肋软骨炎(Costochondritis)、X-连锁低血磷性佝偻病、骨软骨瘤、软骨肉瘤(恶性)、骨关节炎易感性(Osteoarthritis Susceptibility)(1-6型)、椎关节强直(Spondylosis)、骨软骨病(Osteochondroses)、原发性软骨肉瘤、软骨发育不良、Tietze综合征、Francois皮肤软骨角膜营养不良、骨骺发育不良(多发性，1-5型)、骨质化耳软骨伴智力缺陷(Ossified Ear cartilages with Mental deficiency)、肌肉损耗和骨变化(Muscle Wasting and Bony Changes)、Carpotarsal骨软骨瘤病(osteochondromatosis)、软骨发育不全、软骨钙质沉着病(Chondrocalcinosis，1-2型)、遗传性软骨瘤病(Genochondromatosis)、软骨发育不良(性发育障碍)、软骨瘤、软骨成长不全(Achondrogenesis，1A型、1B型、2型、3型、4型，Langer-Saldino型)、II型软骨成长不全-软骨生成低下(Type II Achondrogenesis-Hypochondrogenesis)、骨发育不全症(Atelosteogenesis，1型、2型和III型)、致密软骨成长不全(Pyknoachondrogenesis)、假性软骨发育不全(Pseudoachondroplasia)、手指骨关节病(家族性)、骨畸形性发育不良(Diastrophic dysplasia)、软骨骨生成障碍-肾炎(Dyschondrosteosis-nephritis)、鼻翼软骨缺损伴内眦间距过宽(Coloboma of Alar-nasal cartilages with telecanthus)、鼻翼软骨发育不全--缺损-内眦间距过宽(Alar cartilages hypoplasia--coloboma-telecanthus)、Pierre Robin综合征--胎儿软骨发育不良、异常脊柱内生软骨瘤病(Dysspondyloenchondromatosis)、区域性软骨发育不全--发育不良的腹肌(Achondroplasia regional--dysplasia abdominal muscle)、剥脱性骨软骨炎、家族性关节软骨钙质沉着病、气管支气管软化(Tracheobronchomalacia)、软骨炎、软骨骨生成障碍、Maffucci综合征、Jequier-Kozlowski骨骼发育不良(Jequier-Kozlowski-skeletal dysplasia)、软骨营养不良(Chondrodystrophy)、颅骨关节病、Tietze综合征、髋关节发育不良--内生软骨瘤-外生软骨瘤(Hip dysplasia--enchondromata-ecchondromata)、Bessel-Hagen病、软骨瘤病(良性)、内生软骨瘤病(Enchondromatosis)(良性)、由于磷灰石结晶沉积引起的软骨钙质沉着病、Meyenburg-Altherr-Uehlinger综合征、内生软骨瘤病-侏儒症-耳聋、Astley-Kendall综合征、滑膜骨软骨瘤病(Synovial osteochondromatosis)、家族性关节软骨钙质沉着病(Chondrocalcinosis familial articular)、严重软骨发育不全伴发育迟缓和黑棘皮病(Severe achondroplasia with developmental delay and acanthosis nigricans)、软骨钙质沉着病、Keutel综合征、Stanescu综合症、纤维软骨增生(Fibrochondrogenesis)、软骨发育低下(Hypochondroplasia)。
[0070] “组合物”或“药物组合物”在本文中可互换使用，指通常含有本领域常规的并适于向组织或受试者给予HB-X缀合物的赋形剂(excipient)(例如药学上可接受的载体)的组合物。此外，如本领域已知和本文所述的，用于局部(例如口腔粘膜、呼吸道粘膜)给药和/或口服给药的组合物可形成溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂、口腔含漱剂(oral rinses)或粉剂。组合物还可包含稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂(adjuvants)的实例参见University of the Sciences in Philadelphia(2005)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons，第21版。
[0071] 本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指疾病或障碍的一种或多种症状或可测量标记物得以减轻或可测量的减少；尽管不希望被限定于此，特别感兴趣的疾病或障碍包括自身免疫疾病和肌炎。可测量的减少包括可测量标记物或症状的任何统计学显著的下降。在一些实施方式中，治疗是预防性治疗。
[0072] 术语“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段上有效实现期望治疗结果(例如削弱或预防与各种疾病状态或病症相关的作用(例如降低受试者中自身免疫疾病的症状))的量。术语“治疗有效量”指有效治疗或预防哺乳动物(优选人)的疾病或障碍的本文所公开的HB-X缀合物的量。HB-X缀合物的治疗有效量可根据例如如下因素变化：受试者的疾病状况、年龄、性别和体重，以及治疗化合物X在受试者中引发期望应答的能力。治疗有效量也为治疗剂的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。在一些实施方式中，治疗有效量为“有效量”，本文中所用的有效量是指减轻疾病或障碍的至少一种症状或一些症状的药物组合物的治疗剂的量。因此，为了本文目的，通过为本领域所已知的注意事项确定“有效量”，且所述“有效量”为实现改善(包括但不限于：改善存活率或较快恢复、或改善或消除待治疗疾病的至少一个症状和适于本领域技术人员测量的其它指标)的量。应注意的是，本文所公开的HB-X融合蛋白可作为药学上可接受的盐进行给药，并且可单独给药或作为活性成分与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和辅料(vehicles)联合给药。
[0073] 术语“预防有效量(prophylactically effective amount)”指在必要的剂量和时间段上有效实现期望预防结果的HB-X缀合物的量。通常，由于HB-X缀合物的预防剂量在疾病之前或在疾病的早期阶段被给予受试者，在一些实施方式中，预防有效量小于治疗有效量。HB-X缀合物的预防有效量也为化合物的有益效果超过任何毒性或有害效果的量。
[0074] 本文所用的术语“预防/防止(prevent/preventing/prevention)”是指避免或延迟疾病或障碍(例如自身免疫疾病)的一种或多种症状或可测量标记物的显现(manifestation)。症状或标记物显现的延迟是相对于此类症状或标记物在具有发展成所述疾病或障碍的类似可能性或易感性的对照受试者或未治疗受试者中显现出的时间来说延迟。术语“预防”不仅包括避免或预防疾病的症状或标记物，也包括相比具有发展成所述疾病或障碍的类似可能性或易感性的对照个体或未治疗个体中的那些症状或标记物、或相比基于受所述疾病或障碍影响的群体的历史测量或统计测量可能出现的症状或标记物，所述疾病的症状或标记物中任何一个的严重性或程度降低。“降低的严重性”是指相比对照或参比，症状或可测量的疾病标志物的严重性或程度降低至少10％，例如至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％(即，无任何症状或可测量标记物)。
[0075] 本文所用的术语“给药/给予(administering)”和“引入(introducing)”在本文中可互换使用，是指通过使得HB-X缀合物至少部分定位于期望位点的方法或途径，将本发明的HB-X缀合物放置入受试者内。本发明的化合物可通过在受试者中引起有效治疗的任何合适途径进行给药。
[0076] 本文所用的短语“胃肠外给药(parenteral administration/administered parenterally)”是指除了肠内给药和局部给药以外的给药模式(通常通过注射进行)，并且包括但不限于：静脉内注射和输注、肌内注射和输注、动脉内注射和输注、鞘内注射和输注、心室内注射和输注、囊内注射和输注、眼眶内注射和输注、心内注射和输注、皮内(intradermal)注射和输注、腹膜内注射和输注、经气管注射和输注、皮下注射和输注、表皮下(subcuticular)注射和输注、关节内注射和输注、囊下(sub capsular)注射和输注、蛛网膜下注射和输注、脊柱内(intraspinal)注射和输注、脑脊髓内(intracerebro spinal)注射和输注以及胸骨内注射和输注。本文所用的短语“全身给药(systemic administration/administered systemically)”和“外周给药(peripheral administration/administered peripherally)”意味着此类HB-X给药：使得HB-X进入动物的系统(system)内，从而经历代谢及其它类似过程(例如皮下给药)。
[0077] 短语“药学上可接受的”在本文中用来指在健全的(sound)医学判断范围内，适合用于与人类和动物组织相接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症(complication)，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0078] 本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指参与将主题试剂从身体的一个器官或部分运送或转运至身体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料(例如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料)。从与制剂的其它成分相容的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。
[0079] 本文所用的术语“降低/下降(reduced/reduce)”或“减少(decrease)”通常都意味着相对于参比而言减少统计学显著的量。为避免疑义，如本文中对该术语的定义，“降低/下降”是指相对于参比水平而言至少10％的统计学显著性减少，例如减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、至少90％以上，上至并包括减少100％(即，相比参比样品而言的缺失水平)，或相对于参比水平而言减少10％-100％之间的任意量。
[0080] 如本文中对该术语的定义，本文所用的术语“增加/提高(increased/increase)”通常都意味着增加了统计学显著的量；例如，相对于参比水平而言至少10％的统计学显著性增加，包括增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％以上，包含端值；例如包括相对于参比水平而言至少2倍、至少
3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍的增加或更大量的增加。
3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍的增加或更大量的增加。
[0081] 本文所用的术语“高(high)”通常意味着相对于参比而言高统计学显著的量；例如，比参比水平高至少10％的统计学显著性值，例如相对于参比水平而言高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％，包含端值；例如相对于参比水平而言高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少10倍或更高。
[0082] 本文所用的术语“受试者”是指任何此类动物：在该动物中，在由所述组合物的HB部分靶向的组织中调节应答是有用的。受试者可为野生动物、家养动物、商业动物或伴侣(companion)动物，例如鸟或哺乳动物。受试者可为人。尽管在本发明的一个实施方式中可以预见本文所公开的治疗组合物也可适用于人的治疗处理，所述治疗组合物也可适用于温血脊椎动物，例如哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛；以及非哺乳动物，例如鸡、鸭或火鸡。在一些实施方式中，受试者是实验动物或作为疾病模型的动物替代品。
[0083] 术语“药学上可接受的”是指可给予哺乳动物而无过度毒性的化合物和组合物。术语“药学上可接受的载体”不包括组织培养基。示例性的药学上可接受的盐包括但不限于：无机酸盐(mineral acid salts)，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐(benzoates)等。药学上可接受的载体在本领域中是公知的。一些药学上可接受的载体可用于提供本文所述的组合物的持续释放。
例如，将透明质酸及透明质酸凝胶形式用于关节内注射，并可用来提供HB-X组合物的持续释放。
例如，将透明质酸及透明质酸凝胶形式用于关节内注射，并可用来提供HB-X组合物的持续释放。
[0084] 本文所用的术语“治疗(treating/treatment/to treat)”用于表示产生有益结果或期望结果，例如减轻症状、或在临时或永久的基础上消除疾病或障碍的起因、使障碍的症状出现和/或进展放慢、或阻止疾病进展。术语“治疗(treat/treatment)”是指治疗处理以及预防或防御措施。有益或期望的临床结果包括但不限于：症状减轻、孤独症(autism)程度缩减、病理学牵连(involvement)状态稳定(即，不恶化)、疾病进展延缓或放慢、疾病状态转佳或缓和。将“有效治疗方案(effective regimen)”在有效疗程(足够的时间段内充分的治疗或量)内给予以实现期望结果的水平。对于特定疾病或其症状，监测功效可通过本领域已知的方法完成。
[0085] HB-X缀合物
[0086] 如本文所公开的本发明的一个方面包括治疗组合物，所述治疗组合物包含例如(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)o，其中，HB为肝素结合蛋白，X为活性剂(例如治疗蛋白或其部分、或治疗小分子)，以及其中，n、m和o为整数，并且m至少为1、且n+o至少为1。
[0087] 在一些实施方式中，HB-X缀合物为HB-Xn或(HB-接头)n-Xn，其中，n是至少为1的整数。HB可结合至活性剂X的N末端或C末端、或N末端和C末端两端。在一些实施方式中，HB-X缀合物是包含重组HB和治疗蛋白的重组融合蛋白。在一些实施方式中，HB-X缀合物包含如本文所公开的HB肽和小分子。在这两种情况下，HB肽可在有或没有接头实体的情况下与活性剂结合(例如缀合)。
[0088] 在一些实施方式中，相对于所述组合物的HB部分的N末端，HB-X缀合物的组件可以按顺序安放：HB-X、X-HB、HB-接头-X、(HB-接头)n-X、X-(接头-HB)n、X-HBn-X、HBn-X-HBn、(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)n、HBn-Xm-HBn-Xm等。
[0089] 在一些实施方式中，HB-X缀合物可包含至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少约4个、或至少约6个、或至少约7个、或至少约8个、或至少约9个、或至少约10个、或多于10个SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22的HB肽。具有多于一个HB肽的HB-X缀合物的所有HB肽可为相同类型(例如，所有HB肽都包含SEQ ID NO：2)，或者具有多于一个HB肽的HB-X缀合物可包含来自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22的不同HB肽的任意组合。在一些实施方式中，HB-X缀合物可包含与HB肽关联的至少一个接头，例如，HB-X缀合物中存在的每个HB都可与接头关联。或者，在一些实施方式中，当HB-X缀合物包含多于一个HB肽时，并不是HB-X缀合物中的所有HB肽都需要与接头关联。HB肽可随机或非随机地散布于HB-X缀合物中的活性剂序列之间，例如，作为示例性实例，HB-X-X-X-HB-X-X-X-HB或X-X-HB-X-HB-X-HB-X-X-X-HB-等。如本文所公开的，HB肽在X活性实体之间的此类随机或非随机散布在有或没有接头的情况下均可发生。
[0090] 此外，所述组合物可包含HB-X构建体的混合物，其中，X代表不同的蛋白或小分子1 2
(即，包含HB-X和HB-X 等的组合物)。
(即，包含HB-X和HB-X 等的组合物)。
[0091] 在一些实施方式中，HB-X缀合物可包含至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少约4个、或至少约6个、或至少约7个、或至少约8个、或至少约9个、或至少约10个、或多于10个活性剂(X)。活性剂可为如本文所公开的治疗蛋白或治疗肽、或小分子。
[0092] 肝素结合蛋白(HB)
[0093] 本发明涉及连接至或融合至治疗部分或活性剂(例如小分子、或细胞因子或生长因子或它们的功能部分)的蛋白质肝素结合基序(HB)。在一些实施方式中，该HB肽可选自于具有以下氨基酸残基序列的肽：K RKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)；KRKKKGKGLGKK RDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)(C16R)；或 KRKKKGKGLGKKRDPK LRKYK(SEQ ID NO：3)(C16K)。在一些实施方式中，该HB肽可选自于具有以下氨基酸残基序列的肽：
MKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：20)；MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：21)(C17R)；或MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：22)(C17K)。
MKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：20)；MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：21)(C17R)；或MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：22)(C17K)。
[0094] 在一些实施方式中，组合物的HB部分凭借多个赖氨酸残基和精氨酸残基而带正电荷；并且所述组合物的HB部分结合至细胞或组织蛋白聚糖，所述蛋白聚糖通过硫酸根基团而带负电荷。在具体实施方式中，通过用精氨酸(SEQ ID NO：2)(C16R)或赖氨酸(SEQ ID NO：3)(C16K)替换具有SEQ ID NO：1的残基的HB第16位的天然半胱氨酸残基来使HB突变，以增强正电荷。可在纳入或不纳入肽接头的情况下使HB重复。具有接头的串联HB肽构建体的示例表示为HB-接头-HB-X，其中，HB-接头-HB包含SEQ ID NO：2的HB变体，并具有以下氨基酸：KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：4)；或者表示为HB-接头-HB-接头-HB-X，其中，HB-接头-HB-接头-HB具有以下残基：KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：5)。在一些实施例中，具有接头的串联HB肽构建体表示为HB-接头-HB-X，其中，含有SEQ ID NO：3的HB变体的HB-接头-HB构建体具有以下氨基酸：KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：23)；或者表示为HB-接头-HB-接头-HB-X，其中，包含SEQ ID NO：3的HB变体的HB-接头-HB-接头-HB具有以下残基：KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：24)。在一些实施方式中，串联HB构建体包含相同的HB构建体。在替代的实施方式中，设想串联HB肽构建体可包含HB肽的不同组合，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3以任何顺序的任意组合。
作为示例性实例，串联HB肽构建体可包含SEQ ID NO：2-接头-SEQ ID NO：3-接头-SEQ ID NO：3-X。在一些实施方式中，串联HB肽构建体仅包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的HB肽的组合。
作为示例性实例，串联HB肽构建体可包含SEQ ID NO：2-接头-SEQ ID NO：3-接头-SEQ ID NO：3-X。在一些实施方式中，串联HB肽构建体仅包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的HB肽的组合。
[0095] 接头
[0096] HB肽结合至X可借助接头，例如但不限于：化学修饰、肽接头、化学接头、共价键或非共价键、或蛋白融合、或者通过本领域技术人员已知的任何手段。连接可为永久的或可逆的。在一些实施方式中，可包含若干接头，以利用各接头和缀合物中各蛋白质的期望性质。计划将柔性接头和提高缀合物溶解度的接头单独使用或者与本文公开的其它接头一起使用。可通过表达编码接头的DNA将肽接头连接至缀合物中的一个或多个蛋白。接头可为酸裂解性、光裂解性和热敏感接头。缀合方法是本领域技术人员所熟知的，并都被包括在本发明中使用。
[0097] 在一些实施方式中，HB肽可通过肽接头连接至活性剂X，其中，所述活性剂是治疗肽或治疗蛋白。可通过表达编码接头的DNA将肽接头连接至缀合物中的一个或多个蛋白。在一些实施方式中，肽接头是GGG。任选地，接头肽将以短柔性接头(例如包含至少约2、3、
4个以上的甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基)连接在HB肽的氨基末端和羧基末端之一或两者。在一些实施方式中，一种这样的接头包含基序(GGGGS)(SEQ ID NO：42)，并且可存在一个或多个拷贝。在一些实施方式中，接头包含带正电荷的氨基酸残基。
4个以上的甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基)连接在HB肽的氨基末端和羧基末端之一或两者。在一些实施方式中，一种这样的接头包含基序(GGGGS)(SEQ ID NO：42)，并且可存在一个或多个拷贝。在一些实施方式中，接头包含带正电荷的氨基酸残基。
[0098] 根据本发明，可经由本领域已知的任何合适手段将HB肽连接至活性剂，参见例如美国专利号4,625,014、5,057,301和5,514,363，以引用的方式将它们整体并入本文。
[0099] 用于将本文所公开的HB肽与X(例如第一融合伴侣，例如治疗蛋白或治疗肽)缀合的多种方法是本领域已知的。此类方法例如由Hermanson(1996，Bioconjμgate Techniques，Academic Press)、美国6,180,084和美国6,264,914描述，以引用的方式将它们整体并入本文；并包括例如应用免疫学中常规使用的用于将半抗原连接至载体蛋白的方法(参见Harlow和Lane，1988，“Antibodies:A laboratory manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。在一些情况下，认识到HB肽和/或治疗蛋白或治疗肽在缀合后可能失去功效或功能，这取决于例如缀合过程或缀合过程中使用的化学基团。然而，考虑到存在大量缀合方法，本领域技术人员能够找到不影响或最低限度影响实体(例如待缀合的HB肽和治疗肽)的功效或功能的缀合方法。
[0100] 在一些实施方式中，可通过交联将HB肽缀合至活性剂(X)。交联试剂包括戊二醛(GAD)、双官能团环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和水溶性碳二亚胺(优选1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))。如本领域技术人员所周知的，任何交联化学(crosslinking chemistry)都可以使用，包括但不限于：硫醚、硫酯、苹果酰亚胺(malimide)和硫醇、胺-羧基、胺-胺和有机化学手册中列出的其它交联化学，例如Elements of Organic Chemistry，Isaak and Henry Zimmerman Macmillan Publishing Co.,Inc.866Third Avenue，New York，N.Y.10022。
[0101] 将HB肽缀合至活性剂的其它连接方法包括但不限于：氨基己辣根过氧化物酶(aminocaproic horse radish peroxidase(HRP))或异双功能(heterobiofunctional)交联接头(例如羰基反应性和巯基反应性交联接头)。异双功能交联剂通常包含两种反应基团，这两种反应基团可在两步骤或三步骤过程中偶联至蛋白和其它大分子上的两个不同官能靶标，这可限制通常与使用同双功能交联接头相关的聚合的程度。此类多步方案可提供对缀合物尺寸和组分摩尔比的有力控制。
[0102] 在一些实施方式中，如美国专利申请公开号US2002/0132990 和US2004/0023902(以引用的方式将它们整体并入本文)所公开的，使用鱼精蛋白接头将HB肽缀合至核酸活性剂(例如RNAi试剂或miRNA试剂)。具体而言，当接头为鱼精蛋白或鱼精蛋白类试剂时，描述与HB肽关联的鱼精蛋白的制备方法、试剂和参考文献公开于美国临时申请60/957,023和美国专利申请US2007/012152以及美国2010/0209440中，以引用的方式将它们各自整体并入本文。在一些实施方式中，包括在本发明中使用的鱼精蛋白接头含有US 2010/0209440中公开的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6。
[0103] 用于将本文所公开的HB肽与X(例如第一融合伴侣，例如治疗蛋白或治疗肽)缀合的合适方法包括例如碳二亚胺缀合(Bauminger和Wilchek，1980，Meth.
Enzymol.70：151-159)。或者，可将部分偶联至由Nagy等，Proc NProc.Natl.Acad.Sci.USA
93:7269-7273(1996)；以及Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1794-1799(1998)所描述的靶向试剂，以引用的方式将其各自并入本文。可使用的另一缀合方法为例如高碘酸钠氧化后进行适当反应物的还原性烷基化及戊二醛交联。
Enzymol.70：151-159)。或者，可将部分偶联至由Nagy等，Proc NProc.Natl.Acad.Sci.USA
93:7269-7273(1996)；以及Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1794-1799(1998)所描述的靶向试剂，以引用的方式将其各自并入本文。可使用的另一缀合方法为例如高碘酸钠氧化后进行适当反应物的还原性烷基化及戊二醛交联。
[0104] 可使用各种不同接头来将本文所公开的HB肽与X(例如第一融合伴侣，例如治疗蛋白或治疗肽)缀合，例如但不限于：氨基己辣根过氧化物酶(HRP)或异双功能交联接头(例如羰基反应性和巯基反应性交联接头)。异双功能交联剂通常包含两种反应基团，这两种反应基团可在两步骤或三步骤过程中偶联至蛋白和其它大分子上的两个不同官能靶标，这可限制通常与使用同双功能交联接头相关的聚合的程度。此类多步方案可提供对缀合物尺寸和组分摩尔比的有力控制。
[0105] 在一些实施方式中，接头为美国专利6,165,476、5,856,456；美国申请2010/0063258；以及国际申请WO2012/142515(以引用的方式将它们各自整体并入本文)中公开的免疫球蛋白铰链区(hinge region)接头。
[0106] 在一些实施方式中，如美国申请2010/0063258(以引用的方式将其整体并入本文)所公开的，HB-X融合蛋白可在无细胞系统中生产。
[0107] 示例性接头序列包括例如：(i)IgA 1的膜长亚型(membrane long isoform)的尾部区域(tail region)(malL)：SCSVADWQMPPPYVVLD LPQETLEEETPGAN(SEQ ID NO：43)；(ii)IgA 1的膜变异长亚型的尾部区域(具有额外cys的malL)：SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLE EETPGAN(SEQ ID NO：44)；(iii)IgA 1的膜短亚型的尾部区域(具有6个氨基酸的N端删除的mals)：
[0108] DWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN(SEQ ID NO：45)；(iv)IgA2的膜结合形式的尾部区域：SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEE TPGAN(SEQ ID NO：46)；(v)IgD的膜结合形式的尾部区域：YLA MTPLIPQSKDENSDDYTTFDDVGS(SEQ ID NO：47)；(vi)IgE的膜结合形式的尾部区域：ELDVCVEEAEGEAPW(SEQ ID NO：48)；(vii)IgG的膜结合形式的尾部区域：ELQLEESCAEAQDGELDG(SEQ ID NO：49)；以及(viii)IgM的膜结合形式的尾部区域：EGEVSADEEGFEN(SEQ ID NO：50)。
[0109] 在其它实施方式中，接头序列来源于分泌性或可溶性形式的免疫球蛋白的尾部区段。示例性接头序列包括例如：(i)IgA1的可溶性形式的尾部
区 域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO：51)；(ii)IgA2 的 可 溶 性 形 式 的 尾 部区 域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO：52)；(iii)IgD 的 可 溶 性 形 式 的 尾 部区 域：YVTDHGPMK(SEQ ID NO：53)；以 及 (iv)IgM的 可 溶 性 形 式 的 尾 部 区 域：
PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO：54)。
区 域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO：51)；(ii)IgA2 的 可 溶 性 形 式 的 尾 部区 域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID NO：52)；(iii)IgD 的 可 溶 性 形 式 的 尾 部区 域：YVTDHGPMK(SEQ ID NO：53)；以 及 (iv)IgM的 可 溶 性 形 式 的 尾 部 区 域：
PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO：54)。
[0110] 在某些实施方式中，可期望具有含游离半胱氨酸残基的接头序列，以允许接头之间二硫键的形成，由此形成HB融合蛋白的二聚体。在其它实施方式中，可期望例如通过将接头中的一个或多个半胱氨酸残基突变为另一残基(例如丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸)来改变接头序列，以移除游离的半胱氨酸残基。已进行改变来移除游离半胱氨酸残基的来源于膜结合免疫球蛋白的尾部区域的接头序列的实例包括：
[0111] (i)SXSVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：55)；(ii)SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X各自独立地选自于丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：56)；(iii)SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X各自独立地选自于丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：57)；(iv)ELDVXVEEAEGEAPW，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：58)；以及(v)ELQLEESXAEAQDGELDG，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：59)。已进行改变来移除游离半胱氨酸残基的来源于分泌形式的免疫球蛋白的尾部区域的接头序列的实例包括：(i)KPTHVNVSVVMAEVDGTXY，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：60)；(ii)KPTHVNVSVVMAEVDGTXY，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：61)；以及(iii)PTLYNVSLVMSDTAGTXY，其中，X为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸(SEQ ID NO：62)。
[0112] 待缀合至HB肽的活性剂-治疗蛋白
[0113] 本文所述组合物的重要性和有用性由该组合物在软骨修复的应用中得到例证，其中，融合蛋白为HB-IGF-1。关节的外伤性损伤(例如涉及前交叉韧带(ACL)破裂的损伤)导致发展出骨关节炎的风险增加。此外，这种风险可能无法通过手术修复功能来解决(Lohmander等，35Am.J.Sports Med.1756(2007))，这可能涉及关节损伤后的初始炎症和分解代谢反应。Lohmander等，42Arthritis Rheum.534(1999)；Lohmander等，48Arthritis Rheum.3130(2003)；Irie等，10Knee 93(2003)。在该时间段中的治疗性干预可能对于对抗这些分解代谢过程和促进软骨修复特别重要。
[0114] IGF-1为 刺 激 软 骨 生 物 合 成 的 典 型 循 环 因 子。Daughaday 等，19J.Clin.Endocrinol.Metab.743(1959)；McQuillan 等，240Biochem.J.423(1986)；Jones&Clemmons，16Endocrine Rev.3(1995)。它还作用于对抗代谢刺激。Luyten等，
267Arch.Biochem.Biophys.416(1988)；Tvler，260Biochem.J.543(1989)。结果，研究者一直试图将IGF-1用作软骨修复的治疗剂。Trippel，43J.Rheumatol.Suppl.129(1995)。
但是，IGF-1和其它生长因子的局部递送严重受限于它们在关节中的短半衰期。研究者已经开发了用IGF-1进行基因治疗的选项和封装在水凝胶中的IGF-1，从而允许向关节软骨的长期受控释放。虽然有前景，这些技术却迟迟没有进入临床试验。Evans等，7Nat.Rev.Rheum.244(2011)。
267Arch.Biochem.Biophys.416(1988)；Tvler，260Biochem.J.543(1989)。结果，研究者一直试图将IGF-1用作软骨修复的治疗剂。Trippel，43J.Rheumatol.Suppl.129(1995)。
但是，IGF-1和其它生长因子的局部递送严重受限于它们在关节中的短半衰期。研究者已经开发了用IGF-1进行基因治疗的选项和封装在水凝胶中的IGF-1，从而允许向关节软骨的长期受控释放。虽然有前景，这些技术却迟迟没有进入临床试验。Evans等，7Nat.Rev.Rheum.244(2011)。
[0115] 示例大鼠IGF-1蛋白具有以下氨基酸残基：
[0116] GPETLCGAELVDALQFVCGPRGFYFNKPTGYGSSIRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPTKSA(SEQ ID NO：6)。参见例如Tokunou等，22FASEB J.1886(2008)。
[0117] 示例人IGF-1具有以下氨基酸残基：
[0118] GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：7)。也参见Gene ID：3489(人IGF1)。另一示例人IGF-1(变体)具有以下氨基酸残基序列：GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA.(SEQ ID NO：8)。具有生物活性的人IGF-1变体(参见WO92/03477；GenBank：CAA01451.1)具有以下氨基酸残基：
[0119] megpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa(SEQ ID NO：9)。
[0120] 已知IGF-1的N末端截短(例如N末端氨基酸GPE的删除)保留了生物活性。因此，在一些实施方式中，包含于本发明中使用的人IGF-1(变体)具有以下氨基酸残基序列：
[0121] TLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA.(SEQ ID NO：63).
[0122] 因此，在一些实施方式中，重组HB-接头-HB-X融合蛋白(其中，HB是C16R变体，所述接头是GGG，以及X是SEQ ID NO：7的人IGF-1变体)具有以下氨基酸序列：
[0123] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：10)；另一重组HB-接头-HB-接头-HB-X(其中，HB是C16R变体，所述接头是GGG，以及X是人IGF-1变体(SEQ ID NO：7))可描述为：
[0124] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGL GKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：11).
[0125] 在一些实施方式中，SEQ ID NO：7的IGF-1变体可被替换为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。在一些实施方式中，HB C 16R(例如SEQ ID NO：2)可被替换为HB C17R(例如，MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK；SEQ ID NO：21)。HB C 17R与全长人IGF-1(SEQ ID NO：7的IGF-1)的示例融合体具有以下氨基酸：
[0126] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：12)。在一些实施方式中，HB C16R与全长人IGF-1(SEQ ID NO：7的IGF-1)的示例融合体(例如HB-IGF)具有以下氨基酸：
[0127] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：16).
[0128] 在一些实施方式中，HB C16R(例如SEQ ID NO：2)或HB C17R(SEQ ID NO：21)可被替换为HB C16K(SEQ ID NO：3)或HB C 17K(MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK；SEQ ID NO：22)。例如，在另一实例中，HB C17K与全长人IGF-1(例如SEQ ID NO：7)的融合体具有以下氨基酸：
[0129] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：13)。融合至HB C17R的人IGF-1截短(对应于SEQ ID NO：8)具有以下氨基酸序列：
[0130] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：14)或
[0131] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：18)，以及HB C17K与成熟的人IGF-1的融合体：
[0132] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：15)。
[0133] 可构建缺少HB肽(例如包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB肽)上的起始N末端甲硫氨酸的前述HB-融合蛋白的变体，即，KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：16)；
[0134] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：17)；
[0135] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：18)；以及
[0136] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：19).
[0137] 表1公开了HB肽融合至试剂的不同实施方式的实例。作为示例性试剂(例如X)，使用了IGF-1：
[0138]
[0139]
[0140]
[0141] 还包括了以下方案：HB肽可位于活性剂(活性剂的实例例如IGF-1)的N末端或C末端或者活性剂的N末端和C末端。在一些实施方式中，HB肽可在HB肽与活性剂之间的各个过渡处(transition)具有或不具有接头的情况下位于所述活性剂的N末端或C末端、或者所述活性剂的N末端和C末端。因此，涵盖表1中序列(例如SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：71)的变种(variations)，其中，HB位于C末端而不是N末端，并且其中，在IGF-1蛋白与C末端HB的序列之间存在或者不存在接头。在另一实施方式中，涵盖表1中序列(例如SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：71)的变种，其中，HB位于C末端和N末端两端，并且其中，在IGF-1蛋白与C末端HB或N末端HB的序列之间存在或者不存在接头。选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：22的组中的HB肽的任意组合可在有或没有接头蛋白的情况下用于活性剂的任意组合中，其中，HB肽可位于活性剂的N末端和/或C末端，并且可存在结合至活性剂的N末端和/或C末端的一个或多个HB肽-接头。例如，在一些实施方式中，融合体或缀合物可包含(HB-接头)n-Xm-(接头-HB)o，其中，n、m和o为整数，m至少为1、且n+o至少为1。
[0142] 本发明人先前已经证实了，刺激软骨生物合成的方法使用融合有大鼠肝素结合结构域的工程化大鼠IGF-1蛋白，其中，该肝素结合IGF-1(HB-IGF-1)融合蛋白在关节内注射后保留在软骨中(Miller等，62Arth.Rheum.3686(2010))。本文中，代替使用Miller所使用的野生型大鼠HB肽，发明人对人野生型HB肽(例如，在本文对应于SEQ ID NO：1)进行了修饰，并令人惊奇地证明了，本文所公开的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB构建体(其中，SEQ ID NO：1的C16或SEQ ID NO：20的C17由半胱氨酸(C)变换为精氨酸(R)或赖氨酸(K))产生以下两方面效果：(i)HB-IGF-1融合蛋白的表达和产率显著增加；以及(ii)HB融合蛋白在感兴趣的组织中的保留增加。因此，在野生型人HB肽中改变C16(SEQ ID NO：1的C16)或C17(SEQ ID NO：20的C17)来增强正电荷的新突变令人惊奇地使得HB-X融合蛋白的表达和生产实现了出乎预料的增加。
[0143] 因此，本说明书表明了在关节内注射后包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的HB-IGF-1融合蛋白的动力学，显示了HB-IGF-1在体内对关节软骨的功能刺激，并证明了HB-IGF-1在关节损伤诱导的关节炎大鼠模型中的体内治疗功效。
[0144] 因此，在一些实施方式中，将缀合至活性剂的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22的HB肽(特别是包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22中的至少一个或组合的HB-X缀合物)包含在本发明的治疗软骨相关疾病或障碍的方法中使用，所述活性剂例如但不限于IGF-1蛋白或其功能片段(例如，选自来自如下组中的序列的任何IGF-1变体：SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：63)。
[0145] 本发明人在本文证明了，令人惊奇的是，不像单独的IGF-1(例如未融合至试剂)，本文所公开的HB-IGF-1融合蛋白不仅在关节内注射后保留在软骨的细胞外基质中，它还能够刺激软骨中的细胞，并且是治疗有效的。更具体而言，为了测定HB-IGF-1在体内结合至软骨的动力学，注射后收集关节组织，并通过Western分析对组织提取物进行分析(图1)。注射IGF-1两天后，在所收集的任何关节组织中均没有可检测的IGF-1残留。与此相反，HB-IGF-1保留在关节软骨和半月板软骨二者中，但并未保留在髌腱中。在注射后四天观察到类似结果。注射后6-8天，在软骨提取物中HB-IGF-1仍然是可检测的，但免疫反应条带变模糊且更多变。这些结果证明，不像IGF-1，本发明的HB-IGF-1融合蛋白在关节内注射后在关节软骨中保留长达8天。IGF-1在血清中的药代动力学在图2中示出，说明相比未修饰的IGF-1，关节内注射的HB-IGF-1向全身循环中的渗漏显著减少。
[0146] 此外，HB-IGF-1在体内产生了对软骨生物合成的持续刺激。尽管在软骨细胞外基质中HB-IGF-1与硫酸软骨素结合增加，HB-IGF-1在体内仍然能够激活细胞IGF-1受体。对注射后收集的半月板软骨中硫酸根的掺入进行测量，并针对仅注射盐水后的掺入进行标准化(图3)。注射后两天，相比IGF-1，HB-IGF-1刺激了显著较高的硫酸根掺入率(HB-IGF：2.10±0.52；IGF：0.49±0.11；N＝4-5/组；P＝0.032)。注射后四天，相比IGF-1组，硫酸根掺入在HB-IGF-1组中保持显著较高(HB-IGF：1.82±0.09；IGF：1.05±0.21；N＝5/组；
P＝0.011)。
P＝0.011)。
[0147] 此外，内侧半月板横切后HB-IGF-1在体内保护软骨。更具体而言，HB-IGF-1在手术诱导的OA大鼠模型中有功效。对大鼠进行内侧半月板撕裂(MMT)手术，并每周注射HB-IGF、IGF或盐水。MMT手术后三周，进行膝骨关节炎(OA)的组织学评价。关于主要结果测量(primary outcome measure)(图4)，相比用IGF-1治疗的对照动物，在用HB-IGF-1治疗的动物的关节中，整体OARSI评分显著降低(HB-IGF：12.9±1.5；IGF：18.7±1.2；N＝9-10/组；P＝0.008)。在总变性宽度(total degeneration width)和全厚度软骨缺失(full-thickness cartilage loss)的二级分析上也观察到HB-IGF-1和IGF-1治疗的膝盖之间的显著差异，如表2所示：
[0148] 表2.大鼠MMT模型中的软骨分析。(结果显示为平均值±SEM。)
[0149]盐水(n＝８） IGF-1(n＝9) HB-IGF-1(n＝10)
表面软骨缺失 174±56 207±39 120±41
全厚度软骨缺失 36±15 95±35 0±0
总变性宽度 436±28 506±57 346±36
显著变性宽度 202±13 236±30 178±17
表面软骨缺失 174±56 207±39 120±41
全厚度软骨缺失 36±15 95±35 0±0
总变性宽度 436±28 506±57 346±36
显著变性宽度 202±13 236±30 178±17
[0150] 在一些实施方式中，本文所公开的组合物提供了治疗融合蛋白，所述治疗融合蛋白允许递送生物活性蛋白并使其能够选择性保留在期望位点。注射后，HB-IGF-1以足以刺激蛋白聚糖合成的水平保留在关节软骨和半月板中4-8天。IGF-1(未融合至HB)并未有这样的保留。因此，体内局部递送HB-IGF-1可减少大鼠半月板撕裂关节炎模型中的疾病进展。如改良OARSI评分所测量的，相比IGF-1或溶媒(vehicle)，HB-IGF-1显著减少了软骨损害的进展。二级分析表明了较低的软骨变性评分和对全深度软骨缺失的防止，这说明对软骨具有整体有益效果。
[0151] 尽管IGF-1是软骨的主要合成代谢生长因子之一，仅用关节内注射IGF-1来修复软骨和防止骨关节炎(OA)的尝试都没有成功。Rogachefsky等，1993；Schmidt等，2006。本发明的数据表明，这些阴性结果并不是由于IGF-1本身缺乏效果，而是因为在关节内递送后“游离(free)”的IGF-1未在软骨中保留有效量的时间(IGF-1保留少于24小时)。
[0152] 此外，这些数据总体上暗示了针对软骨的可注射蛋白疗法。未来疗法的发展应该评估是否需要靶向机制产生到软骨细胞的持续递送。软骨中的保留动力学可在其它模型或实验中验证，以使得特定试剂的阴性实验结果不会被解释为试剂本身失效。有趣的是，已显示出在该模型中有疗效的另一生长因子FGF-18是肝素结合生长因子(Moore等，2005；Hu等，1998；Chuang等，2010)。
[0153] 如本文在实施例中所示的，还证实了HB-PTH(而不是单独的PTH)保留在软骨分离体中。
[0154] 此外，全身药代动力学数据表明，IGF水平不够高，从而无法通过结合到胰岛素受体来改变葡萄糖水平。如果将全身水平的增加限制在～24小时，对IGF水平长期升高的担忧将减少。
[0155] 此外，本文中观察到的预料不到的结果是关节软骨和半月板软骨均对HB-IGF有稳健(robust)的应答。尽管相比关节软骨，半月板的电荷密度不均匀并且较低，HB-IGF-1在半月板中以足以刺激蛋白聚糖合成的水平保留。这证实了HB-IGF可能直接保护关节软骨和半月板，因此在半月板损伤后会特别有效。
[0156] 相比早期OA，HB-IGF作为OA治疗剂对晚期OA可能不太有效，因为HB-IGF可能需要基质中存在硫酸化蛋白聚糖以实现软骨中的长期保留。然而，在先前健康的关节遭受急性外伤性关节损伤的设定下，可使用HB-IGF作为有效的新型软骨保护(chondroprotective)治疗剂。
[0157] 在其它实施方式中，HB融合蛋白包含成纤维细胞生长因子18(FGF-18)或其功能部分。FGF家族成员具有广泛的促有丝分裂活性和细胞存活活性，并参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复。因此，例如，可将成熟人FGF-18纳入HB融合蛋白中，其中，FGF-18具有以下氨基酸序列：
[0158] EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPTHPA(SEQ ID NO：30)。还参见Gene ID：8817。HB可融合至FGF-18的N末端或C末端(例如HB-FGF、FGF-HB、HB-接头-FGF、或FGF-接头-HB)；或者FGF-18的部分(例如成熟FGF-18的1-169残基)的N末端或C末端。
[0159] 在一些实施方式中，HB-融合蛋白包含甲状旁腺激素(PTH)或其部分。PTH与维持钙水平和骨稳态(osteostasis)相关，并可防止关节损伤后的软骨缺失。参见例如Harrington等，290Anatom.Rec.155(2007)。因此，例如，PTH可为具有以下氨基酸序列的成熟PTH：
[0160] SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ(SEQ ID NO：32).
[0161] 在一些实施方式中，HB可融合至PTH的氨基末端或羧基末端、或PTH的部分(例如成熟PTH的1-31、1-34、1-37、1-38、1-44或1-84位氨基酸残基)的氨基末端或羧基末端。在一些实施方式中，PTH的部分可为对应于SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF(SEQ ID NO：33)的N末端1-34位氨基酸的片段(称为PTH(1-34))。在一些实施方式中，融合至HB肽的PTH的部分可选自于以下氨基酸序列：
[0162] PTH(1-31)：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDV(SEQ ID NO：34)；PTH(1-37)：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL(SEQ ID NO：35)；PTH(1-44)：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPR(SEQ ID NO：36).
[0163] 如本文在实施例中所示的，还证实了HB-PTH(1-34)(而不是单独的PTH(1-34))在软骨分离体中得以保留。在一些实施方式中，HB-PTH(1-34)融合蛋白是PTH(1-34)-接头-HB融合蛋白，并包含以下氨基酸：
[0164] SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFGGG KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：37).
[0165] 此外，PTH可为PTH类似物，例如环PTH-(1-31)。重组人PTH(1-34)目前由Eli Lily&Co(Indianapolis，IN)以 (特立帕肽[rDNA来源]注射剂，
teriparatide[rDNA origin]injection)销售。OSTABOLIN-CTM(ZT-031；环PTH-(1-31))已由Zelos Therapeutics，Inc.(West Conshohocken，PA)在临床试验中进行了研究。
teriparatide[rDNA origin]injection)销售。OSTABOLIN-CTM(ZT-031；环PTH-(1-31))已由Zelos Therapeutics，Inc.(West Conshohocken，PA)在临床试验中进行了研究。
[0166] 在其它实施方式中，HB融合蛋白包含PTHrP或其部分。PTHrP与损伤后新再生的软骨的软骨保护相关。Wang等，19Osteoarth.Cartil.213(2011)；Sampson等，Ann.Meeting Am.Soc.Bone Mineral Res.(2009)。成熟PTHrP具有以下氨基酸：
[0167] AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSEVSPNSKPSPNTKNHPVRFGSDDEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTP(SEQ ID NO：38)。
[0168] 也参见PLHLH，Gene ID：5744。PTHrP HB融合蛋白例如可如下排列：PTHrP-接头 -HB；PTHrP(1-34)- 接 头 -HB；PTHrP(1-36)- 接 头 -HB；PTHrP(1-37)- 接 头 -HB；PTHrP(1-40)-接头-HB等。
[0169] PTHrP-HB融合蛋白的另一实例包括可融合至HB的合成的PTHrP部分(AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA)，其中，N为Aib(2-氨基异丁酸)(SEQ ID NO：39)，例如AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA(SEQ ID NO：39)-接头-HB，其中，N为Aib(2-氨基异丁酸)。Aib在这一PTHrP类似物或衍生物中指定(designates)α-氨基异丁酸(也称为2-氨基异丁酸、α-甲基丙氨酸或2-甲基丙氨酸)。该PTHrP相关多肽可合成制备或通过重组手段制备，或者通过它们的组合制备。参见Wang等，292Science 498(2001)；Ryu&Schultz，3Nat.Methods 263(2006)。
[0170] 如所提到的，本发明的组合物可包含HB-X2、或2种以上不同的HB-X融合蛋白等，其中，X代表两种不同的活性剂。因此，例如，组合物可包含HB-PTHrP和/或HB-PTH和/或HB-IGF-1的任意组合，例如以用于再生软骨或损伤后稳定再生软骨等的方法中。
[0171] 再一示例HB融合蛋白将HB与IL1RA(白介素-1受体拮抗剂)融合为例如HB-接头-IL1RA或IL1RA-接头-HB。IL1RA是白介素-1细胞因子家族的成员。IL1RA由多种类型的细胞(包括免疫细胞、上皮细胞以及脂肪细胞)分泌，并且是IL1β的促炎作用的天然抑制剂。该蛋白抑制白介素-1，α(IL1A)和白介素-1，β(IL1B)的活性，并调控多种白介素-1相关的免疫应答和炎性反应。参见Arend，13Cytokine Growth Factor Rev.323(2002)。在一些实施方式中，将HB与IL-1/IL-1RA嵌合体(例如Hou等，PNAS，2013，110(10)：3913-8中所公开的)融合，例如以用于治疗软骨和/或半月板的损害或疾病、或用于治疗眼睛病症或炎性病症。成熟IL1RA具有以下氨基酸序列：
[0172] RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE(SEQ ID NO：40)。也参见Gene ID：3557。
[0173] 本发明的另一实施方式中，HB融合体包括融合至HGMB2(也称为HMG2)的HB。关节软骨是提供生物力学特性的组织，它允许接近无摩擦的关节运动以及力学负载的分散。软骨由单一细胞谱系构成，但已了解了各种软骨层在组织、表型和细胞功能上的差异。浅表区(superficial zone，SZ)是最独特的。SZ细胞产生润滑素(lubricin)(也称为蛋白聚糖-4(PRG4)或浅表区蛋白(SZP))，重要的关节润滑剂；SZ细胞对由分解代谢细胞因子(如IL-1)引起的刺激响应更强；并表达间充质干细胞标记物。HMGB2的表达限于关节软骨的SZ，而HMGB2与Wnt/β-连环蛋白通路之间的相互作用调节SZ的维护并促进软骨细胞存活。重要的是，人和小鼠中的关节老化导致HMGB2表达缺失，这与OA样改变的发作有关。Taniguchi等，106PNAS 16817(2009)。人HMG2具有以下氨基酸序列(UniProtKB/SWISS-PROT：P26583.2；也 参 见 Gene ID：3148)：MGKGDPNKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDSSVNFAE FSKKCSERWK TMSAKEKSKF EDMAKSDKAR YDREMKNYVP PKGDKKGKKK DPNAPKRPPS AFFLFCSEHR PKIKSEHPGL SIGDTAKKLG EMWSEQSAKD KQPYEQKAAK LKEKYEKDIA AYRAKGKSEA GKKGPGRPTG SKKKNEPEDE EEEEEEEDED EEEEDEDEE(SEQ ID NO：41).
[0174] 在一些实施方式中，HB融合蛋白包含生长抑素(SST)或者其功能片段或其类似物(例如，HB肽可缀合至小分子奥曲肽(octreotide，商标名 )、帕瑞肽(pasireotide，SOM230，商品名 )、兰瑞肽(lanreotide，商品名
))。包含SST或其功能片段或变体或类似物的这类HB融合蛋白可用于
治疗软骨和/或半月板中的缺陷和障碍以及抗炎状况(anti-inflammatory conditions)。
人SST具有以下氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot：Hs.12409；也参见Gene ID：6750)：
))。包含SST或其功能片段或变体或类似物的这类HB融合蛋白可用于
治疗软骨和/或半月板中的缺陷和障碍以及抗炎状况(anti-inflammatory conditions)。
人SST具有以下氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot：Hs.12409；也参见Gene ID：6750)：
[0175] MLSCRLQCAL AALSIVLALG CVTGAPSDPR LRQFLQKSLA AAAGKQELAKYFLAELLSEPNQTENDALEP EDLSQAAEQD EMRLELQRSA NSNPAMAPRE RKAGCKNFFW KTFTSC(SEQ ID NO：72).
[0176] 在一些实施方式中，HB融合蛋白包含血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)或其功能片段或类似物。包含ANGPTL3或其功能片段或变体或类似物的这类HB融
合蛋白可用于治疗软骨和/或半月板中的缺陷和障碍以及抗炎状况。人前原蛋白
ANGPTL3(preproproteinANGPTL3)具有以下氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot：Q9Y5C1；
也参见Gene ID：27329或NP_055310.1″)：
合蛋白可用于治疗软骨和/或半月板中的缺陷和障碍以及抗炎状况。人前原蛋白
ANGPTL3(preproproteinANGPTL3)具有以下氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot：Q9Y5C1；
也参见Gene ID：27329或NP_055310.1″)：
[0177] MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVH
[0178] KTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKL
[0179] ESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQY
[0180] KQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSW KSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE(SEQ ID NO：73).
[0181] 在一些实施方式中，HB融合蛋白包含血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)的功能片段。ANGPTL3的功能片段包括但不限于：人ANGPTL3(241-455)，对应于：
[0182] GIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENY
[0183] KYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKP ERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD(SEQ ID NO：74)；
[0184] 人ANGPTL3(225-455)
[0185] TTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYILHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD
[0186] (SEQ ID NO：75)；人ANGPTL3(207-455)
[0187] IQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTD(SEQ ID NO：76)。
[0188] 与HB关联的脑蛋白聚糖提供向中枢神经系统选择性递送治疗剂的途径。参见例如Brandtlow&Zimmerman，80Physiol.Rev.1267(2000)。如本文在实施例中所示的，HB-IGF-1融合蛋白保留在脊髓中。因此，在一些实施方式中，HB融合蛋白可包含用于递送至脑和脊髓的活性剂。
[0189] 在一些实施方式中，HB融合蛋白包含IL-10。据报道，IL-10(抗炎细胞因子)对患有多发性硬化症(MS)的受试者有利；诱导抗炎细胞因子IL-10在MS患者中提供临床优势。Ersoy等，12Eur.J.Neurol.208(2005)。因此，另一实施方式提供了其中X是IL-10或其部分的HB-X融合体。
[0190] 或者，当X为重组HB-X融合蛋白的治疗蛋白部分时，X可选自：神经营养因子，包括神经营养蛋白，例如神经生长因子(NGF；Gene ID：4803)、脑源性神经营养因子(BDNF，Gene ID：627)、神经营养蛋白-3(NT3，Gene ID：4908)、神经营养蛋白-4(NTF4，Gene ID：4909)、睫状神经营养因子(CNTF，Gene ID：1270)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF，Gene ID：7873)、或脑多巴胺神经营养因子(CDNF，Gene ID：441549)；神经胶质细胞系源性神经营养因子家族配体，例如神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF，Gene ID：2668)、neurturin(NRTN，Gene ID：4902)、artemin(ARTN，Gene ID：9048) 或persephin(PSPN，Gene ID：5623)。
[0191] 在一些实施方式中，活性剂X可选自促神经生长细胞因子，例如白介素-6(IL6，Gene ID：3569)、白介素-11(IL11，Gene ID：3589)、白介素-27(IL27，Gene ID：246778)、白血病抑制因子(LIF，Gene ID：3976)、睫状神经营养因子(CNTF，Gene ID：1270)、心脏营养素1(CTF1，Gene ID：1489)、神经生成素(小鼠的NP直系同源物(ortholog)，人假基因Gene ID：647088)、心脏营养素样细胞因子(CLGF1，Gene ID：23529)、或成纤维细胞生长因子2(FGF2，Gene ID：2247)。
[0192] 在一些实施方式中，活性剂X可选自抗炎细胞因子，包括白介素-4(ILR4，Gene ID：3565)和白介素-10(ILR10，Gene ID：3586)。
[0193] 在一些实施方式中，活性剂X可选自神经保护剂，包括神经调节蛋白-1(NRG1，Gene ID：3084)和血管内皮生长因子(VEGFA，Gene ID：7422；VEGFB，Gene ID：7423；VEGFC，Gene ID：7424)。
[0194] 或者，在一些实施方式中，活性剂X可选自：其它治疗蛋白，例如(FPF-1070猪脑肽制剂，Ever Neuro Pharma，Austria)、生长分化因
子11(GDF11，Gene ID：10220)、基质细胞衍生因子-1(SDF1，也为CXCL12，Gene ID：6387)、肌肉生长抑制素(MSTN，Gene ID：2660)、甲状旁腺激素(PTH，Gene ID：5741)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP或PLHLH，Gene ID：5744)、白介素1受体拮抗剂(IL1RN，Gene ID：3557)、成纤维细胞生长因子18(FGF18，Gene ID：8817)、高迁移率族盒2(HMGB2，Gene ID：3148)；
治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔单抗，抗TNF-α，Janssen Biotech，
Horsham，PA)、 (阿达木单抗，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、或
(依那西普，融合到人免疫球蛋白G1的Fc部分的可溶性重组TNF受体2，Amgen，Thousand Oaks，CA)。
子11(GDF11，Gene ID：10220)、基质细胞衍生因子-1(SDF1，也为CXCL12，Gene ID：6387)、肌肉生长抑制素(MSTN，Gene ID：2660)、甲状旁腺激素(PTH，Gene ID：5741)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP或PLHLH，Gene ID：5744)、白介素1受体拮抗剂(IL1RN，Gene ID：3557)、成纤维细胞生长因子18(FGF18，Gene ID：8817)、高迁移率族盒2(HMGB2，Gene ID：3148)；
治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔单抗，抗TNF-α，Janssen Biotech，
Horsham，PA)、 (阿达木单抗，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、或
(依那西普，融合到人免疫球蛋白G1的Fc部分的可溶性重组TNF受体2，Amgen，Thousand Oaks，CA)。
[0195] 在一些实施方式中，活性剂X可为糖皮质激素受体，例如核受体亚家族3，C组，成员1(NR3C1，Gene ID：2908)。
[0196] 在一些实施方式中，活性剂X可为任何前述治疗蛋白的部分、变体、类似物或衍生物。
[0197] 活性剂-治疗小分子
[0198] 在又一其它实施方式中，可利用HB来实现对治疗小分子的选择性递送。例如，小分子TR2-01829(PRO1的优化类似物)具有软骨形成特性(chondrogenic properties)。更具体而言，可证明PRO1或优化类似物(已证实指导MSC沿着软骨形成途径分化的小分子开发候选物)在OA再生治疗中有用。此外，2-羟基-N-[3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(HS-Cf)是TNF-α刺激的猪软骨细胞中NO产生和iNOS表达的强效抑制剂。通过下调TNF-α诱导的IRF-1的活性(抑制软骨细胞活化并防止软骨毁坏)，HS-Cf可为OA治疗的潜在疾病缓解药(disease-modifying drug)。Liu等，31J.Clin.Immunol.1131(2011)。体外研究和小鼠研究表明，小分子kartogenin可有助于治疗骨关节炎。5(18)SciBX(2012年
5月3日)。
5月3日)。
[0199] 小分子可通过任何数量的已知方法连接到组合物的HB部分。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子与其它分子偶联。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸盐/酯(disocyanates)、戊二醛、重氮苯(diazobenzenes)和己二胺(hexamethylene diamine)。此列表并非意在穷举本领域已知的各种类型的偶联剂，而只是较常见的偶联剂的示例。参见Killen&Lindstrom，133J.Immunol.1335(1984)；Jansen等，62Imm.Rev.185(1982)。在一些实施方式中，文献中公开的交联剂包含在本文所公开的HB组合物中使用。参见例如Ramakrishnan等，
44Cancer Res.201(1984)(描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用)；Umemoto等，美国专利号5,030,719(描述了通过寡肽接头的方式偶联至抗体的卤代乙酰肼(acetyl hydrazide)衍生物的使用)。具体的接头包括：(a)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(b)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G))；(c)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat#21651G)；
(d)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-propianamide]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；以及(f)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。
44Cancer Res.201(1984)(描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的使用)；Umemoto等，美国专利号5,030,719(描述了通过寡肽接头的方式偶联至抗体的卤代乙酰肼(acetyl hydrazide)衍生物的使用)。具体的接头包括：(a)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(b)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G))；(c)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat#21651G)；
(d)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-propianamide]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；以及(f)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。
[0200] 如上所述的连接(linkages)或连接剂(linking agents)包含具有不同属性的组件，从而产生具有不同物理-化学性质的缀合物。例如，烷基羧化物(carboxylates)的磺基-NHS酯比芳族羧化物的磺基-NHS酯更稳定。含有接头的NHS-酯比磺基-NHS酯的溶解性差。此外，接头SMPT含有空间位阻二硫键，并能形成具有增加的稳定性的缀合物。由于二硫连接可在体外被切割，二硫连接通常比其它连接稳定性差，从而导致可得到的缀合物较少。特别地，磺基-NHS可增强碳二亚胺偶联的稳定性。相比仅碳二亚胺偶联反应，当与磺基-NHS联合使用时，碳二亚胺偶联(例如EDC)形成更抗水解的酯。
[0201] 在本文所公开的方法和组合物中使用的示例性交联分子包括但不限于表3和表4中列出的交联分子：
[0202] 表3.示例性同双功能(homobifunctional)交联剂(在任一末端具有相同类型的反应基团的同双功能交联试剂。试剂按照同双功能交联剂交联的化学基团(左列)和所述同双功能交联剂的化学组成(中间列)分类。产品按在每个单元内增加的长度的顺序列出。
[0203]
[0204] 表4.示例性异双功能交联剂(在任一末端具有不同反应基团的异双官能交联试剂。试剂按照异双功能交联剂交联的化学基团(左列)和所述异双功能交联剂的化学组成(中间列)分类。产品按在每个单元内增加的长度的顺序列出。
[0205]
[0206] 与融合蛋白相关的情况下，HB-X组合物的小分子可包括前药。术语“前药(pro-drug)”是指任何此类化合物：当将此类前药给予哺乳动物受试者时，所述前药在体内释放活性母体药物。化合物的前药通常通过以这样的方式修饰存在于所述化合物中的一个或多个官能团来制备：所述修饰可在体内被切割以释放母体化合物。前药的实例包括但不限于：羟基官能团的酯(例如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)和氨基甲酸酯(例如N,N-二甲基氨基羰基)；以及氨基官能团的酰胺、氨基甲酸酯和脲(urea)衍生物等。前药形式通常在哺乳动物有机体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点。参见Bundgard，Design Prodrugs，7，21(Elsevier，Amsterdam，1985)；Silverman，Organic Chemistry Drug Design&Drug Action，352(Academic Press，San Diego，CA)。此外，本发明的前药衍生物可与本领域技术人员已知的其它特征结合来增强生物利用度。
[0207] 治疗方法中的HB-X缀合物
[0208] 本发明的另一方面涉及治疗软骨相关病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的HB-X缀合物(如，例如包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白)，其中，X为活性剂。在一些实施方式中，用于治疗软骨相关病症的活性剂是治疗蛋白。在一些实施方式中，治疗蛋白选自：甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；成纤维细胞生长因子18(FGF-18)、抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或上述治疗蛋白的部分、类似物、衍生物或功能片段。
[0209] 在一些实施方式中，用于治疗软骨相关病症的HB-X缀合物可包含至少一种甲状旁腺激素(PTH)治疗蛋白，例如，从选自SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：37的组中的任何蛋白或其功能片段中选择的治疗蛋白。
[0210] 在一些实施方式中，用于治疗软骨相关病症的HB-X缀合物可包含至少一种治疗蛋白，例如，从选自以下蛋白的组中的任何蛋白或其功能片段中选择的治疗蛋白：IGF-1或其变体或功能片段(SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：63)；FGF-18(SEQ ID NO：30)；PTH或其变体或功能片段(SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：37)；PTHrP(SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39)；IL-1RA或IL-1/IL-1RA嵌合体(SEQ ID NO：40)；HMG(SEQ ID NO：41)；SST(SEQ ID NO：72)；ANGPTL3或其变体或功能片段(SEQ ID NO：73-SEQ ID NO：76)；-41，SEQ ID NO：
63和SEQ ID NO：73-SEQ ID NO：76，或其功能片段。
63和SEQ ID NO：73-SEQ ID NO：76，或其功能片段。
[0211] 在一些实施方式中，用于治疗软骨相关病症的HB-X缀合物可包含至少一种小分子，例如但不限于SST激动剂，例如奥曲肽、帕瑞肽或兰瑞肽。在一些实施方式中，包含IGF-1蛋白或其功能片段或变体(例如SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：63)的本文所公开的HB-X缀合物可用于治疗患有侏儒症和/或生长延迟相关病症的受试者。
[0212] 本发明的另一方面涉及治疗软骨相关病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予一定量的HB-X缀合物(如，例如包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白)，其中，X为糖皮质激素受体；以及进一步同时给予或单独给予皮质类固醇。
[0213] 在一些实施方式中，软骨相关病症为关节软骨缺陷(包括破裂或脱离)、半月板缺陷(包括部分撕裂或完全撕裂)、骨关节炎、外伤性软骨破裂或脱离、半月板和/或髌骨的疾病或损害、强直性脊柱炎、囊炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎或X-连锁低血磷性佝偻病。
[0214] 在一些实施方式中，软骨相关病症为：软骨破裂或脱离、半月板缺陷(包括部分撕裂或完全撕裂)、或影响半月板和/或髌骨的损害或疾病。在一些实施方式中，软骨相关病症选自来自如下组中的任何疾病或疾病组合：骨关节炎(在本文中称为“OA”，由软骨破损(breakdown)产生，包括膝盖、手指、手腕、髋部、脚踝、手肘、脚趾、肩和脊柱骨关节炎)、外伤性软骨破裂或脱离、强直性脊柱炎、囊炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎、软骨病、软骨肉瘤、软骨软化、多软骨炎、复发性多软骨炎、骨骺滑脱、剥脱性骨软骨炎、软骨发育不良、肋软骨炎、X-连锁低血磷性佝偻病、骨软骨瘤、软骨肉瘤(恶性)、骨关节炎易感性(1-6型)、椎关节强直、骨软骨病、原发性软骨肉瘤、软骨发育不良、Tietze综合征、Francois皮肤软骨角膜营养不良、骨骺发育不良(多发性，1-5型)、骨质化耳软骨伴智力缺陷、肌肉损耗和骨变化、Carpotarsal骨软骨瘤病、软骨发育不全、软骨钙质沉着病(1-2型)、遗传性软骨瘤病、软骨发育不良(性发育障碍)、软骨瘤、软骨成长不全(1A型、1B型、2型、3型、4型，Langer-Saldino型)、II型软骨成长不全-软骨生成低下、骨发育不全症(1型、2型和III型)、致密软骨成长不全、假性软骨发育不全、手指骨关节病(家族性)、骨畸形性发育不良、软骨骨生成障碍-肾炎、鼻翼软骨缺损伴内眦间距过宽、鼻翼软骨发育不全--缺损-内眦间距过宽、Pierre Robin综合征--胎儿软骨发育不良、异常脊柱内生软骨瘤病、区域性软骨发育不全--发育不良的腹肌、剥脱性骨软骨炎、家族性关节软骨钙质沉着病、气管支气管软化、软骨炎、软骨骨生成障碍、Maffucci综合征、Jequier-Kozlowski骨骼发育不良、软骨营养不良、颅骨关节病、Tietze综合征、髋关节发育不良--内生软骨瘤-外生软骨瘤、Bessel-Hagen病、软骨瘤病(良性)、内生软骨瘤病(良性)、由于磷灰石结晶沉积引起的软骨钙质沉着病、Meyenburg-Altherr-Uehlinger综合征、内生软骨瘤病-侏儒症-耳聋、Astley-Kendall综合征、滑膜骨软骨瘤病、家族性关节软骨钙质沉着病、严重软骨发育不全伴发育迟缓和黑棘皮病、软骨钙质沉着病、Keutel综合征、Stanescu综合症、纤维软骨增生、软骨发育低下。
[0215] 适合(amenable for)以用于治疗软骨相关病症的HB-X缀合物进行治疗的受试者选自具有关节障碍或软骨缺失或损害的一种或多种症状的受试者，包括选自如下组中的一种或多种症状：关节肿胀、关节疼痛、关节发红(redness)、关节松弛(laxity)、轻度关节炎症状、出血性关节积液(haemorrhagic joint effusion)、炎性关节积液、关节运动过度(hypermobility)、非炎性关节积液或其它类型。
[0216] 在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗软骨相关病症的受试者为患有家族性剥脱性骨软骨炎的受试者，其中，所述受试者具有ACAN基因的突变。ACAN基因为制造作为软骨组分的聚集蛋白聚糖(aggrecan)蛋白提供了指导。聚集蛋白聚糖结合至软骨的其它组分，组织给予软骨强度的分子网络。此外，聚集蛋白聚糖吸引水分子并赋予软骨凝胶状结构。这一特征使得软骨抗压，从而保护骨骼和关节。与家族性剥脱性骨软骨炎相关的ACAN基因突变产生无法结合到软骨其它组分的异常蛋白。结果，软骨不正常、无组织且衰弱，并造成家族性剥脱性骨软骨炎的病灶(lesions)和骨关节炎特征。
[0217] 在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗软骨相关病症的受试者患有骨质减少(osteopenic)相关疾病或骨质疏松(例如与围绝经期和绝经后状况相关的骨质疏松)。还包括对以下疾病的治疗和预防：Paget氏病、骨赘生物(bone neoplasms)相关的高血钙症、以及所有类型的骨质疏松疾病，骨质疏松疾病根据其病因分类如下：原发性骨质疏松、高血钙症(hypercalcemia)、退化性骨质疏松(involutional osteoporosis)、I型或绝经后骨质疏松、II型或老年性骨质疏松、幼年骨质疏松、特发性青年成人骨质疏松(Idiopathic in young adults osteoporosis)、继发性骨质疏松、内分泌异常、甲状腺功能亢进、性腺机能减退(Hypogonadism)、卵巢发育不全、或Turner氏综合征、肾上腺皮质机能亢进或Cushing氏综合征、甲状旁腺功能亢进、骨髓异常、多发性骨髓瘤及相关障碍、和系统性肥大细胞增多症(mastocytosis)、播散性癌骨质疏松(disseminated carcinoma osteoporosis)、Gaucher氏病、结缔组织异常、成骨不全症(Osteogenesis imperfecta)、高胱氨酸尿症(Homocystinuria)、Ehlers-Danlos综合征、Marfan氏综合征、Menke氏综合征、多原因固定化或失重(Miscellaneous causes Immobilisation or weightlessness)、Sudeck氏萎缩、慢性阻塞性肺病、慢性酒精中毒、慢性肝素给药和抗惊厥药的慢性摄入。
[0218] 适合以本文所公开的用于治疗软骨相关病症的包含HB-X的缀合物的组合物进行治疗的患者包括处于疾病风险中但没有表现出症状的患者(例如无症状(asymptomatic)患者)以及目前显示出症状的患者。在OA或骨质疏松的情况下，事实上，如果他或她活得够长，任何人(特别是女性)都处于患OA和骨质疏松的风险中。
[0219] 在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗软骨相关病症的受试者为已知具有软骨相关病症或障碍(例如OA)遗传风险的受试者。在一些实施方式中，患者是女性，例如绝经后的女性或至少65岁的女性，或者以前曾骨折过的患者或有患有代谢性骨病(例如骨质疏松)的亲属的患者。使用本领域普通技术人员公知的方法，可将患者鉴定为具有发展为代谢性骨病的增加的风险。
[0220] 在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗软骨相关病症的受试者具有至少一种以下病症：类风湿性关节炎(RA)、幼年类风湿性关节炎(JRA)、银屑病关节炎、Reiter综合征(反应性关节炎)、Crohn氏病、溃疡性结肠炎和结节病(sarcoidosis)(Orcel等，Bone demineralization and cytokines，Rev Rhum Mal Osteoartic.1992；59:16S-22S；Brown等，The radiology of rheumatoid arthritis.Am Fam Physician.1995.52:1372-80；De Vos等，Bone and joint diseases in inflammatory bowel disease.Aliment Pharmacol Ther.1998；12(5):397-404；Falcini等，The primary role of steroids on the osteoporosis in juvenile rheumatoid patients evaluated by dual energy X-ray absorptiometry.J Endocrinol Invest.1996；19(3):165-9；Scutellari等，Rheumatoid arthritis:sequences.Eur J Radiol.1998:Suppl 1:S31-8)。
[0221] 类风湿性关节炎与骨量减少有关(Cortet等，Evaluation of bone mineral density in patients with rheumatoid arthritis.Influence of disease activity and glucocorticoid therapy.Rev Rhum Engl Ed.1997July-Sep.30,1997；64(7-9)451-8)。炎性关节炎的典型变化包括近关节骨质疏松、软骨缺失、以及皮质或边缘骨侵蚀(erosions)(Lawson 等，Lyme arthritis:radiologic findings.Radiology.1985；154(1):37-43；Grassi 等，The clinical features of rheumatoid arthritis.Eur J Radiol.1998；
1:S18-24)。
1:S18-24)。
[0222] 在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗软骨相关病症的受试者患有慢性炎性关节疾病(例如类风湿性关节炎)，滑膜细胞产生大量细胞因子，从而导致局部骨再吸收增加和近关节骨破坏(Orcel,P等，Bone demineralization and cytokines.Rev Rhum Mal Osteoartic.1992；59(6Pt 2):16S-22S)。
[0223] 本发明的另一方面涉及治疗神经性病症(例如障碍或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予一定量的HB-X缀合物(如，例如包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白)，其中，X为选自如下治疗蛋白的治疗蛋白：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心脏营养素1、神经生成素、心脏营养素样细胞因子、FPF-1070、成纤维细胞生长因子2、神经调节蛋白-1、血管内皮生长因子(VEGF)，或上述治疗蛋白的功能部分、类似物或衍生物。
[0224] 在一些实施方式中，待治疗的神经性病症选自以下神经性疾病的组：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、脑损伤、脊髓损伤、周围神经变性、中风、亨廷顿氏病、皮克氏病、糖尿病性神经病变、额颞痴呆、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、朊病毒障碍、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性下肢轻瘫、脊髓小脑萎缩、弗里德希氏共济失调、淀粉样变性或Charcot Marie Tooth综合征。
[0225] 因此，在一些实施方式中，选择用于给予包含HB-X缀合物的组合物来治疗神经性疾病或障碍的受试者具有下列疾病和障碍中的至少一种，包括但不局限于：阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿氏病(HD)、血管性痴呆、衰老和轻度认知损害。在一些实施方式中，选择用于进行治疗的受试者具有选自于由阿尔茨海默氏病和帕金森氏病所组成的组中的神经退行性障碍。
[0226] 在一些实施方式中，选择用于进行治疗的受试者患有神经性障碍，例如：高渗血症(hyperosmolarity)、酸性pH、烧伤脑病(burn encephalopathy)、铅中毒脑病、自身免疫性脑炎、多发性硬化症、缺血后再灌注、急性高血压、微波辐射、肝性脑病、癫痫、肿瘤、发育、高血容量(hypervolemia)、体温过低(hypothermia)、辐射后(post-radiation)、高压条件(hyperbaric conditions)、脑膜炎、淋巴滞留性脑病、Wernickes-Korsakoff综合征、家族性智力低下和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。
[0227] 适合以本文所公开的用于治疗神经性疾病或障碍的包含HB-X缀合物的组合物进行治疗的受试者包括处于疾病风险中但未显示出症状(例如无症状受试者)的受试者以及目前显示出症状的受试者。在阿尔茨海默氏病的情况下，如果他或她活得够长，事实上任何人都有患阿尔茨海默氏病的风险。因此，本发明的方法可预防性地给予没有进行任何受试者患病风险评估的一般人群。本文公开的方法对具有已知的阿尔茨海默氏病遗传风险的个体特别有用。如本文所公开的，这样的个体包括具有经历过这种疾病的亲戚的个体以及通过遗传标记物或生化标记物分析确定具有风险的个体。
[0228] 阿尔茨海默氏病(AD)是导致老年痴呆的进行性疾病。总体上参见Selkoe，TINS 16，403-409(1993)；Hardy 等，WO 92/13069；Selkoe,J.Neuropathol.Exp.Neurol.53,438-447(1994)；Duff 等，Nature 373,476-477(1995)；Games 等，Nature373,523(1995)。从广义的角度讲，该病分为两类：晚发型，发生在老年(65岁以上)；和早发型，在老年期前(即，35岁至60岁之间)发展完成。在这两类疾病中，病理相同，但β异常往往在较早年龄开始的病例中更严重和普遍。该疾病在宏观水平的特征在于作为神经元缺失的直接结果，在MRI图像中看到显著的大脑萎缩远离颅顶(cranial vault)；还在于脑中的两类宏观病灶(macroscopic lesions)，老年斑和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles)。老年斑是包含无组织神经元突出(neuronal processes)横穿直达150μm和细胞外淀粉样蛋白沉积的区域，老年斑通常集中在中心处，并通过脑组织切片的显微分析可见。神经原纤维缠结是tau蛋白(由相互扭合成对的两个细丝构成)的细胞内沉积。
[0229] 朝向阿尔茨海默氏病的风险的遗传标记物包括APP基因中的突变，特别是分别称为Hardy突变和Swedish突变的位置717以及位置670和671处的突变(参见Hardy，TINS，同上)。其它风险标记物是早老素(presenilin)基因、PS1和PS2和ApoE4中的突变，阿尔茨海默氏病、高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。目前遭受阿尔茨海默氏病的受试者可从特征性痴呆以及上述风险因素的存在来识别。此外，用于识别具有阿尔茨海默氏病的受试者的许多诊断测试是可得的。这些诊断测试包括测量CSF tau和Aβ42水平。升高的tau和增加的Aβ42水平意味着阿尔茨海默氏病的存在。遭受阿尔茨海默氏病的个体也可通过MMSE或ADRDA标准进行诊断。用于分析的组织样品通常是来自患者的血液、血浆、血清、粘液或脑脊液。对样品针对任何形式的Aβ肽(典型地为Aβ42)的免疫应答标记进行分析。所述免疫应答可由例如特异性结合至Aβ肽的抗体或T细胞的存在来确定。检测特异性针对Aβ的抗体的ELISA方法是本领域普通技术人员公知的。
[0230] 在无症状患者中，治疗可开始于任何年龄(例如10岁、20岁、30岁)。但是，通常在患者达到40岁、50岁、60岁或70岁前没有必要开始治疗。治疗在一段时间内通常需要多个剂量。治疗可通过测定CSF中Aβ肽的存在来进行监测。如果Aβ肽仍然存在于CSF中，推荐用本文所公开的用于神经退行性疾病的HB-X缀合物的额外治疗，和/或用于阿尔茨海默氏病的其它疗法的治疗。在潜在唐氏综合征患者的情况下，治疗可通过将治疗剂给予母亲在出生前开始、或在出生后不久开始。
[0231] 在一些实施方式中，本文所公开的用于治疗神经性疾病或障碍的含有HB-X缀合物的组合物通常还在治疗其它神经退行性障碍或认知损害障碍中有用：例如痴呆、抑郁症、精神混乱(confusion)、Creutzfeldt-Jakob病或疯牛病、亨廷顿氏病、运动协调丧失、多发性硬化症、帕金森氏病、皮克病和其它脑贮积病(例如淀粉样变性、神经节苷脂贮积病、脂质贮积病、粘多糖贮积病)、晕厥和血管性痴呆。因此，治疗可针对受神经退行性疾病影响但未有症状的受试者；它可以改善认知功能。
[0232] 本发明的另一方面涉及治疗眼睛障碍或疾病的方法，所述方法包括向受试者给予一定量的HB-X缀合物(如，例如包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白)，其中，X为选自如下治疗蛋白的治疗蛋白：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心脏营养素1、神经生成素、心脏营养素样细胞因子、FPF-1070、成纤维细胞生长因子2、神经调节蛋白-1、血管内皮生长因子(VEGF)，或上述治疗蛋白的功能部分、类似物或衍生物。
[0233] 在一些实施方式中，选择用于以治疗眼睛障碍或疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有一种或多种以下眼睛疾病：角膜溃疡/角膜磨损、Thygeson浅层点状角膜病变、角膜血管新生、富克斯营养不良、干燥性角结膜炎、脉络膜视网膜炎症、脉络膜视网膜瘢痕、脉络膜变性、遗传性脉络膜营养不良、视网膜脱离、视网膜劈裂、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜变性、黄斑变性、黄斑视网膜前膜、周边视网膜变性、遗传性视网膜营养不良、色素性视网膜炎、干眼症或视网膜出血。
[0234] 在一些实施方式中，选择用于以治疗眼睛障碍或疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有一种或多种以下眼睛疾病：糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞、放射性视网膜病变，但不限于此。在一些实施方式中，选择用于以治疗眼睛障碍或疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者患有“炎症介导的眼睛病症”，所述炎症介导的眼睛病症在本文中是指能受益于用抗炎剂进行的治疗的任何眼睛病症，并意在包括但不限于：葡萄膜炎(uveitis)、黄斑水肿、急性黄斑变性、视网膜脱离、眼部肿瘤、真菌或病毒感染、多灶性脉络膜炎、糖尿病性葡萄膜炎、增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、交感性眼炎(sympathetic opthalmia)、Vogt Koyanagi-Harada(VKH)综合征、组织胞浆菌病和葡萄膜扩散(uveal diffusion)。
[0235] 本发明的另一方面涉及在受试者中治疗炎症的方法，所述方法包括向受试者给予一定量的HB-X缀合物(如，例如包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白)，其中，X为选自如下治疗蛋白的治疗蛋白或其部分：TNF受体2、白介素-4或白介素-10。
[0236] 在一些实施方式中，用于治疗炎症的含有HB-X的组合物包含细胞因子(例如抗炎细胞因子)或趋化因子作为活性剂。
[0237] 本文所用的“细胞因子”是用于由任何淋巴细胞释放的、作为细胞间介质(mediators)作用于其它细胞并影响细胞活性和控制炎症的蛋白的通用术语。细胞因子通常是可溶性蛋白或肽，由哺乳动物细胞自然产生并在体内作为体液调节剂以微摩尔-皮摩尔浓度起作用。无论是在正常或病理状况下，细胞因子均可调节个体细胞和组织的功能活动。抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、W-13、IL-13和TGFβ)不是炎症介质。细胞因子的其它实例包括：淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括：生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基(methionyl)人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素(relaxin)；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体化激素(luteinizing hormone，LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素(prolactin)；胎盘催乳素(placental lactogen)；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance，MIS)；小鼠促性腺激素关联肽(gonadotropin-associated peptide)；抑制素(inhibin)；激活素(activin)；血管内皮生长因子(VEGF)；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILS)，如，例如但不限于IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括白血病抑制因子(LIF)和kit配体(KL)。
[0238] 术语“趋化因子”是作用于白细胞并诱导其移动和/或诱导其活化以执行它们的免疫系统功能的任何蛋白的通用术语。趋化因子在本领域是公知的。示例性的趋化因子包括例如但不限于：TECK、ELC、BLC-1、CTACK、RANTES、fractalkine、exotaxin、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)-2、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、白细胞趋化因子(leukotactin)、SDF-1β、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)、TARC、ITAC、ENA-70、ENA-78、IP-10、NAP-2、白介素-8(IL-8)、HCC-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、I-309、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、MPIF-1、I-LINK和GCP-2。
[0239] 在一些实施方式中，用于治疗患有侏儒症和/或生长延迟相关病症的受试者的组合物包含活性剂IGF-1蛋白或其功能片段或变体(例如SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：63)。
[0240] 在一些实施方式中，用于在受试者中治疗炎症的含有HB-X的组合物包含作为甾体抗炎剂的活性剂。优选地，所述甾体抗炎剂选自于由以下抗炎剂所组成的组：21-乙酰氧孕烯醇酮(21-acetoxypregnenolone)、阿氯米松(alclometasone)、阿尔孕酮(algestone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龙、氯泼尼醇(cloprednol)、皮质酮、可的松、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙(diflucortolone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、甘草次酸、氯扎可特(fluazacort)、氟氯奈德(flucloronide)、氟米松(flumethasone)、氟尼缩松、氟轻松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟考丁酯(fluocortin butyl)、氟可龙(fluocortolone)、氟米龙(fluorometholone)、醋酸氟培龙(fluperolone acetate)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)、氟泼尼龙、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、福莫可他(formocortal)、哈西奈德、卤贝他索丙酸酯、卤米松、醋酸卤泼尼松、氢可他酯(hydrocortamate)、氢化可的松、依碳氯替泼诺(loteprednol etabonate)、马泼尼酮(mazipredone)、甲羟松、甲泼尼松(meprednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、糠酸莫米松(mometasone furoat)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼卡酯(prednicarbate)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松龙25-二乙氨基-乙酸酯、泼尼松龙磷酸钠、强的松(prednisone)、强的松龙戊酸酯(prednival)、泼尼立定(prednylidene)、利美索龙、替可的松(tixocortol)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)和己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide)。在优选实施方式中，所述甾体抗炎剂选自于由以下抗炎剂所组成的组：可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、强的松和曲安西龙。在更优选的实施方式中，所述甾体抗炎剂是地塞米松。在另一实施方式中，可生物蚀解(bioerodible)植入物包含多于一种甾体抗炎剂。
[0241] 在一些实施方式中，用于治疗炎症的含有HB-X的组合物包含抗炎剂。优选的抗炎剂选自于由以下抗炎剂组成的组：止痛剂、抗风湿药剂、胃肠药剂、痛风制剂(gout preparation)、糖皮质激素、眼用制剂、呼吸系统药剂、鼻腔制剂和粘膜药剂。
[0242] 在一些实施方式中，选择用于以治疗炎症或炎症相关疾病或障碍的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有一种或多种以下炎症相关疾病：关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病、多发性硬化症、神经退行性障碍、充血性心脏衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、肾衰竭、狼疮、胰腺炎、过敏、纤维化、贫血、动脉粥样硬化、代谢疾病、骨疾病、心血管疾病、化疗/放射相关并发症、I型糖尿病、II型糖尿病、肝脏疾病；胃肠障碍、眼科疾病、过敏性结膜炎、糖尿病性视网膜病变、Sjogren综合征、uvetitis、肺部障碍、肾障碍、皮炎、HIV相关的恶病质(cachexia)、脑型疟疾、强直性脊柱炎、麻风病、贫血和纤维肌痛。
[0243] 在一些实施方式中，选择用于以治疗炎症或炎症相关疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有炎性肠病(IBD)，特别包括Crohn病和溃疡性结肠炎。在另一实施方式中，所治疗的疾病为关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、阿尔茨海默氏病或帕金森病。在又一优选实施方式中，所述疾病是放疗后相关疾病或动脉粥样硬化。
[0244] 在一些实施方式中，选择用于以治疗炎症或炎症相关疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有：炎性肠病，其选自于由以下炎性肠病组成的组：Crohn病或溃疡性结肠炎；胃肠并发症，例如腹泻；肝脏疾病，其选自于由以下肝脏疾病组成的组：自身免疫性肝炎、C型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎或暴发性肝衰竭(fulminant liver failure)；胃肠障碍，其选自于由以下胃肠障碍组成的组：乳糜泻和非特异性结肠炎；骨疾病为骨质疏松；肺部障碍选自于由以下肺部障碍组成的组：过敏性鼻炎(allergic rihinitis)、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性肉芽肿性炎症、囊性纤维化和结节病；心血管疾病选自于由以下心血管疾病组成的组：动脉粥样硬化性心脏病(atheroscleotic cardiac disease)、充血性心脏衰竭和再狭窄；以及肾疾病，其选自于由以下肾疾病组成的组：肾小球肾炎(glomerulpnephritis)和脉管炎。
[0245] 在一些实施方式中，选择用于以治疗炎症的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有自身免疫疾病。在一些实施方式中，待以治疗炎症或自身免疫疾病的包含HB-X的组合物来进行治疗的受试者具有一种或多种以下病症：类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性心肌炎、败血症、Graves病(甲状腺功能亢进)、Hashimoto氏甲状腺炎(甲状腺功能低下)、1型糖尿病、乳糜泻、Crohn病和溃疡性结肠炎、Guillain-Barre综合征、原发性胆汁性硬化症/肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、Raynaud现象、硬皮病、Sjogren综合征、Goodpasture综合征、Wegener肉芽肿病、风湿性多肌痛、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome，CFS)、银屑病、自身免疫性Addison病、强直性脊柱炎、急性播散性脑脊髓炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力(Myasthenia gravis)、眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome)、视神经炎、Ord甲状腺炎、天疱疮、恶性贫血、狗的多关节炎、Reiter综合征、Takayasu动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia)、Wegener肉芽肿病和纤维肌痛(FM)。目前，慢性炎症作为各种疾病状况的嫌疑病因和/或促成因素而受到关注。在此类病症中最突出的可能是心血管疾病，尽管癌症也类似地常被视为与慢性炎症的发展相关。
[0246] 药物组合物的给药
[0247] 可将有效量(例如治疗有效剂量)的包含治疗蛋白或治疗肽的HB-X缀合物以单剂量或以多剂量给予患者。当给予多剂量时，所述剂量可彼此相隔例如1小时、3小时、6小时、8小时、1天、2天、1周、2周或1个月。例如，可给予包含HB-X的组合物例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、15周、20周或更多周。应该理解的是，对于任何具体的受试者而言，特定剂量方案应根据个体需要和管理或指导组合物给药的人的专业判断随时间调整。例如，如果较低剂量未提供足够的治疗活性，治疗剂的剂量可以增加。
[0248] 虽然主治医师最终将决定适当的量和剂量方案(dosage regimen)，有效量的HB-X可 以 0.0001mg/kg、0.01mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg或1000mg/kg的剂量提供。有效剂量可从由体外或动物模型测试生物分析或系统得到的剂量应答曲线中推测出。
[0249] 用于具体患者或受试者的剂量可由本领域普通技术人员使用常规注意事项(例如借助适当的常规药理学方案)确定。医生例如可首先开相对低剂量的药方，随后增加剂量直至获得恰当响应。取决于应用，给予患者的剂量足以随着时间推移在患者中产生有益的治疗响应；或者例如足以减轻症状；或者足以产生其它适当活性。剂量由以下因素确定：具体制剂的功效；以及活性剂X(例如本文公开的治疗肽或治疗蛋白)的活性、稳定性或血清半衰期；以及患者的状况；待治疗的疾病；以及待治疗的患者的体重或表面积。剂量大小还由如下因素确定：伴随在具体受试者中给予具体载体或剂型等发生的任何不利副作用的存在、性质和程度。任选在一个或多个合适的疾病体外和/或体内动物模型(例如本文公开的软骨分析)中或本领域普通技术人员公知的其它模型中，对其中包含HB-X的治疗组合物进行测试，以确认在组织中随时间推移的功效、组织代谢和保留，并根据本领域中公知的方法估计剂量。特别地，剂量最开始可由相关分析中的治疗对比非治疗(例如经治疗的细胞或动物模型与未经治疗的细胞或动物模型的比较)的活性、稳定性或者其它合适的测量结果来确定。将制剂按例如适用于患者的质量和整体健康的速率/比率(由相关制剂的LD50和/或在各种浓度下对HB-X的任何副作用的观察而确定)给予。给药可通过单次剂量或分次剂量完成。
[0250] 在确定在疾病的治疗或预防中要给予的HB-X的有效量中，医生对循环血浆水平、制剂毒性以及疾病进展进行评价。所选剂量水平也将取决于多种因素，包括：所采用的本发明具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药时间；所采用的具体化合物的排泄率(rate of excretion)；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物联用的其它药物、化合物和/或材料；治疗的患者的年龄、性别、重量、状态、一般健康状况以及既往病史；以及医学领域公知的类似因素。
[0251] 在一些实施方式中，如本文公开的HB-X可按照良好医疗实践的剂量给药，考虑个体患者的临床状况；给药位点和方法；给药时间安排；患者年龄、性别、体重；以及医疗从业人员所知晓的其它因素。
[0252] 可对如本文所公开的含有HB-X的组合物的给药方案进行调整，以提供最佳的期望响应(例如治疗响应或预防响应)。例如，根据治疗情况的迫切需求的指导，可单次大剂量(single bolus)给予，可在一段时间内给予数个分次剂量，或者可将剂量按比例减少或增加。特别有利的是，将胃肠外组合物配制成单位剂量形式，从而易于给药并且剂量均匀。
[0253] 此外，药物组合物中HB-X的实际剂量水平可以变化，以获得在具体受试者、组合物和给药模式中有效地实现期望的治疗响应且对所述受试者无毒的活性成分的量。本文所公开的含有HB-X的药物组合物可为“治疗有效量”和/或“预防有效量”。通常，本文所公开的含有HB-X的组合物的合适的每日剂量将为活性剂X有效地产生治疗效果(例如所要给予HB-X的疾病的症状减少)的最低剂量的量。此类有效剂量通常会取决于上文所述的因素。
[0254] 如果需要，可将含有HB-X的组合物的有效每日剂量任选地以单位剂型(unit dosage forms)在全天中以适当的时间间隔分为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量(sub-doses)分别给予。
[0255] 应当注意的是，剂量值可随待减轻的疾病的类型及严重性而有所变化。应当进一步理解的是，对于任何具体受试者而言，具体的剂量方案应根据个体需要和实施或指导组合物给药的人的专业判断而随时间进行调整，并且本文阐述的剂量范围仅为示例性的，并不意味着限制所请求保护的组合物的范围或实践。
[0256] 化合物的功效和毒性可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，例如ED50(该剂量在50％的群体中有效)和LD50(该剂量对50％的群体是致死的)。毒性效果与治疗效果的剂量比是治疗指数，它可表示为比值LD50/ED50。优选表现出高治疗指数的药物组合物。
[0257] 例如，治疗有效量起初可在细胞培养分析或动物模型(通常是小鼠、兔、狗或猪)中进行估计。动物模型还用于获得理想的浓度范围和给药途径。然后，可将这类信息用于确定对在其它受试者中给药有用的剂量和途径。通常，治疗有效量取决于所期望的治疗效果。例如，对于用于治疗软骨相关疾病或障碍的HB-X的治疗有效量，可在如本文在实施例中所公开的横切内侧半月板(例如内侧半月板撕裂(MMT)手术)后的大鼠模型中体内评定HB-X(例如HB-IGF-1)的效果，该模型是手术诱导的OA大鼠模型。注射HB-X缀合物(例如HB-IGF-1)后，如本文在实施例中所述的，进行膝骨关节炎(OA)的组织学评估并确定整体OARSI评分，以对用HB-X缀合物(例如HB-IGF-1)治疗的动物关节和对照治疗的动物进行比较。
[0258] 具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平的剂量开始给予药物组合物中使用的本发明的化合物，并逐渐增加剂量直至达到所期望的效果。还注意到，相比本文所例举的小鼠或其它实验动物，对人的治疗通常较长，该治疗的长短与疾病进程长短和药效成比例。在数天的时间内，剂量可为单剂量或多剂量，但优选单剂量。
[0259] 在一些实施方式中，HB-X缀合物可通过任何合适的给药途径给予人和其它动物以用于治疗，包括口服给药、鼻腔给药(通过例如喷雾)、直肠给药、阴道内给药、关节内注射、胃肠外给药、脑池内(intracisternally)给药和局部给药(如通过粉剂、软膏剂或滴剂(drops)，包括经颊给药和舌下给药)。
[0260] HB-X缀合物可通过本领域已知的或本文所述的任何途径给药，例如口服给药、胃肠外给药(例如静脉内给药或肌内给药)、腹膜内给药、直肠给药、皮肤给药、鼻腔给药、阴道给药、吸入给药、皮肤给药(贴剂)或眼睛给药。HB-X缀合物可以任何剂量或给药方案给药。
[0261] 在一些实施方式中，HB-X缀合物可作为生物植入物(implant)或移植物(transplant)的一部分给予受试者。在一些实施方式中，在将植入物或移植物植入受试者之前，将生物植入物或移植物与如本文所公开的HB-X缀合物孵育一段时间。本领域普通技术人员已知的任何生物植入物均包括在本发明中使用，例如但不限于骨软骨同种异体移植物(allograft)或半月板同种异体移植物。在一些实施方式中，在将生物支架植入受试者前，将所述支架与如本文所公开的HB-X缀合物孵育一段时间。在一些实施方式中，所述支架为生物相容的和/或可生物降解的支架。
[0262] 在一些实施方式中，在水凝胶组合物中将HB-X缀合物给予受试者。可使用任何生物相容的水凝胶组合物，例如但不限于含有自组装肽(self-assembling peptides)的水凝胶。在一些实施方式中，含有自组装肽的水凝胶是RADA-16(也称为 )和KLD-12。自组装肽水凝胶是本领域普通技术人员已知的，例如以下文献中描述的自组装肽水凝胶：美国专利公布号：2013/0129712、2013/0079421；和欧洲专利申请：EP1802743；以及Kisiday等，PNAS，2002；99(5)；9996-10001，以引用的方式将它们各自整体并入本文。
[0263] 在一些实施方式中，水凝胶可包含具有以下序列的肽：序列RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)和/或序列KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)。在一些实施方式中，所述水凝胶包含AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。因此，在本发明的一些方面中涉及向有需要的受试者给予HB-X缀合物的方法，其中，所述HB-X缀合物存在于水凝胶中，所述水凝胶包含选自于如下组的肽：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78) 或 AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：
79)。在一些实施方式中，本发明涉及治疗软骨相关临床病症或半月板相关临床病症的方法，所述方法包括给予包含HB-X和水凝胶的组合物，例如含有选自于以下组中的肽 的 水 凝 胶：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78) 或AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。在一些实施方式中，本发明涉及治疗神经元疾病或障碍的方法，所述方法包括给予包含HB-X和水凝胶的组合物，例如含有选自于以下组中的肽的水凝胶：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)或AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
79)。在一些实施方式中，本发明涉及治疗软骨相关临床病症或半月板相关临床病症的方法，所述方法包括给予包含HB-X和水凝胶的组合物，例如含有选自于以下组中的肽 的 水 凝 胶：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78) 或AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。在一些实施方式中，本发明涉及治疗神经元疾病或障碍的方法，所述方法包括给予包含HB-X和水凝胶的组合物，例如含有选自于以下组中的肽的水凝胶：RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)或AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
[0264] 当将试剂或化合物递送至受试者时，它们可通过任何适当的途径给药，包括例如口服给药(例如在胶囊剂、混悬剂或片剂中)或者通过胃肠外给药。胃肠外给药可包括例如肌内给药、静脉内给药、关节内给药、动脉内给药、鞘内给药、皮下给药或腹膜内给药。所述试剂也可口服给药、透皮给药、局部给药、吸入给药(例如支气管内、鼻内、口腔吸入或鼻内滴剂)或直肠给药。如所说明的，给药可为局部的或全身的。试剂也可使用本领域技术人员公知的病毒载体进行递送。药学上可接受的制剂可悬浮于水性载体中，并通过常规的皮下注射针或使用输注泵引入。
[0265] 局部给药和全身给药均在本发明考虑内。局部给药的理想特征包括达到活性化合物的有效局部浓度以及避免活性化合物全身给药的不良副作用。局部递送技术在例如 51J.Biomed.Mat.Res.96(2000)；100J.Control Release 211(2004)；103J.Control Release 541(2005)；15Vet.Clin.North Am.Equine Pract.603(1999)；1Semin.Interv.Cardiol.17(1996)中有所描述。
[0266] 给予个体的试剂的量将取决于该个体的特性，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性以及所表明的疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。
[0267] 因此，对于本发明的治疗方法，并不意味着HB-X缀合物(例如包含治疗蛋白或治疗肽的HB-X融合蛋白)的给药限于特定的给药模式、剂量或给药频率；本发明考虑所有给药模式，包括肌内给药、静脉内给药、腹膜内给药、囊内(intravesicular)给药、关节内给药、病灶内(intralesional)给药、皮下给药、或足以提供足够治疗如本文所公开的疾病或障碍的剂量的任何其它途径。
[0268] 在以所需剂量与合适的药学上可接受的载体进行配制后，可向受试者给予如本文中所公开的含有HB-X的药物组合物。含有HB-X的药物组合物可使用任何合适的手段给予受试者。通常，合适的给药手段包括但不限于局部途径、口服途径、胃肠外途径(例如静脉内途径、皮下途径或肌内途径)、直肠途径、脑池内途径、阴道内途径、腹膜内途径、眼睛途径或鼻腔途径。
[0269] 在具体的实施方式中，可希望将包含HB-X的药物组合物局部给予至需要治疗的区域；这可不受限地通过例如手术期间的局部输注；局部应用，例如通过注射、借助导管、或借助植入物(植入物为多孔材料、非多孔材料或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜(sialastic membrane))、纤维或商业皮肤替代品)来实现。在一些实施方式中，使用局部霜剂、贴剂、肌内注射剂等将如本文所公开的HB-X施用至肌肉。
[0270] 在一些实施方式中，HB-X可口服给予(例如在胶囊剂、混悬剂或片剂中)受试者或通过胃肠外给药给予受试者。常规口服给药方法包括将HB-X作为片剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂等可用形式给予。优选口服或静脉内递送HB-X并保留生物活性的已知技术。胃肠外给药可包括例如肌内给药、静脉内给药、关节内给药、动脉内给药、鞘内给药、皮下给药或腹膜内给药。HB-X也可口服给药、透皮给药、局部给药、吸入给药(例如支气管内、鼻内、口腔吸入或鼻内滴剂)或直肠给药。如所说明的，给药可为局部的或全身的。试剂(例如编码HB-X的核酸试剂)也可通过本领域技术人员公知的方法使用载体(例如病毒载体)来进行递送。
[0271] 当胃肠外给予如本文所公开的含有HB-X的组合物时，通常将其配制成单位剂量的可注射形式(例如溶液剂、混悬剂、乳剂)。适于注射的药物制剂包括无菌水溶液剂或分散剂和用于复溶为无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。载体可为溶剂或者含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)、上述物质合适的混合物、以及植物油的分散介质。
[0272] 本文所用的术语“剂量单位(dosage unit)”形式是指用于待治疗的哺乳动物受试者的适合作为单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药物载体组合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本发明对剂量单位形式的规定由以下方面决定并直接取决于这些方面：(a)本文所公开的HB-X的独特特征和要实现的特定治疗效果或预防效果；以及(b)本领域中将HB-X配制为活性剂用于敏感性个体治疗的固有限制。
[0273] 包含本文所公开的HB-X的药学上可接受的组合物可悬浮于水性载体(vehicles)中，并通过常规的皮下注射针或使用输注泵引入。
[0274] 本文描述的方法可用于将HB-X体外或离体(ex vivo)递送至细胞(例如人细胞)。或者，给予HB-X的方法可作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分在存在于受试者中的细胞上实施。例如，该方法可用于在受试者中治疗或预防IGF-1介导的指征(indication)，例如用于损伤后软骨再生的治疗。因此，本发明提供了治疗(例如治愈、抑制、减轻、延缓或防止发作，或者防止再发或复发)或预防永久性软骨缺失的方法。该方法包括以足以抑制或减少软骨缺失或增加软骨再生的量向受试者给予HB-X组合物，由此治疗或预防受试者中的关节变性。
[0275] 药物组合物
[0276] 本发明的组合物可包含在药学上可接受的制剂中。此类药学上可接受的制剂可包含生理相容的药学上可接受的载体或赋形剂(excipients)、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。例如，载体可适合于关节内注射。赋形剂包括药学上可接受的稳定剂。本发明涉及任何药学上可接受的制剂，包括高分子复合物形式的合成聚合物或天然聚合物、纳米胶囊、微球或珠；以及基于脂质的制剂，包括水包油乳剂、胶束(micelles)、混合胶束(mixed micelles)、合成膜囊泡和凝胶(例如透明质酸凝胶)。
[0277] 在一些实施方式中，包含本文所公开的HB-X的组合物可配制成任何合适的方式，例如作为无菌可注射溶液剂，例如，所述无菌可注射溶液剂可通过将HB-X加入所需量的适当溶剂(根据需要具有各种其它成分)中而制备。在一些实施方式中，包含本文所公开的HB-X的组合物可配制在水凝胶中，例如但不限于：包含自组装肽RADA-16(也称为)和KLD-12的水凝胶。
[0278] 包含本文所公开的HB-X的组合物的药物制剂可以可注射制剂的形式给予患者，所述可注射制剂含有任何相容的载体，例如各种辅料、佐剂、添加剂和稀释剂；或者，本发明中使用的化合物可以如下形式胃肠外给予患者：缓慢释放(slow-release)皮下植入物或靶向递送系统(例如单克隆抗体)、载体递送(vectored delivery)、离子导入(iontophoretic)、聚合物基质、脂质体和微球。在本发明中有用的递送系统的实例包括以下专利文献中记载的递送系统：美国专利号5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196 和
4,475,196。其它这样的植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。
4,475,196。其它这样的植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。
[0279] 可保持适当的流动性，例如通过：使用包衣(例如卵磷脂)；在分散剂的情况下通过维持所需粒径；以及通过使用表面活性剂。非水性辅料(例如棉籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、葵花籽油(sunflower oil)或花生油以及酯(例如肉豆蔻酸异丙酯))也可用作用于化合物组合物的溶剂系统。此外，可添加增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。防止微生物活动可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保。在许多情况下，理想的是包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)。可注射药物形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。但是，根据本发明，所用的任何辅料、稀释剂或添加剂都必须与所述化合物相容。
[0280] 在另一实施方式中，包含本文所公开的HB-X的组合物可包含基于脂质的制剂。任何已知的基于脂质的药物递送系统可用于本发明的实践。例如，多囊脂质体(multivesicular liposomes)、多层脂质体(multilamellar liposomes)和单层脂质体(unilamellar liposomes)都可以使用，只要可确立所包封的活性化合物的持续释放速率。制造受控释放多囊脂质体药物递送系统的方法描述于PCT申请公开号：WO 9703652、WO
9513796和WO 9423697中，以引用的方式将其内容并入本文。
9513796和WO 9423697中，以引用的方式将其内容并入本文。
[0281] 合成膜囊泡的组分通常为磷脂的组合，所述磷脂通常与类固醇(特别是胆固醇)组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。在合成膜囊泡生产中有用的脂质的实例包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂，并在优选的实施方式中包括蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油和二油酰磷脂酰甘油。
[0282] 在制备含有HB-X的基于脂质的囊泡中，此类变量应予以考虑：活性化合物的包封效率、活性化合物的labiality、所得囊泡群的均质性和大小、活性化合物与脂质的比、渗透性、制品的不稳定性以及制剂的药学可接受性。
[0283] 在另一实施方式中，HB-X可在囊泡、特别是脂质体中递送(参见Langer(1990)Science 249:1527-1533)。在又一实施方式中，HB-X可在受控释放系统中递送。在一个实施方式中，可使用泵(参见Langer(1990)，同上)。在另一实施方式中，可使用聚合材料(参见Howard等(1989)J.Neurosurg.71:105)。在本发明的活性剂是编码HB-X的核酸的另一实施方式中，可通过以下方式体内给予所述核酸以促进其编码的蛋白的表达：将所述核酸构建为合适核酸表达载体的一部分并给予所述表达载体，使其成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见例如美国专利号4,980,286)；或通过直接注射；或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被；或通过连接至已知进入核的同源异型盒样肽来给予所述核酸(参见例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)等。或者，可通过同源重组将核酸引入细胞内并并入宿主细胞DNA，从而表达。
[0284] 在引入前，可通过本领域的众多可用技术中的任何技术来对包含本文所公开的HB-X的组合物进行杀菌，例如，用γ辐射或电子束灭菌。
[0285] 在本发明的另一实施方式中，包含本文公开的HB-X或其变体的组合物可与任何其它治疗剂结合(例如联合)给药和/或配制。为了给药目的，优选将本文公开的HB-X配制成药物组合物。本发明的药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体，其中，所述化合物以对治疗感兴趣的病症有效的量存在于所述组合物中。合适的浓度和剂量可由本领域技术人员容易地确定。
[0286] 药学上可接受的载体是本领域技术人员所熟悉的。对于配制成液体溶液的组合物，可接受的载体包括盐水和无菌水，并且可任选包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂(bacteriostats)以及其它常用添加剂。所述组合物也可配制成丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，除本发明的化合物外，所述组合物还含有稀释剂、分散剂和表面活性剂、粘合剂(binders)和润滑剂。本领域技术人员可进一步以适当的方式并根据公认的操作(例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Gennaro 著，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.1990中所公开的)对本发明的化合物进行配制，。
[0287] 本发明的组合物可为任何形式。这些形式包括但不限于：溶液剂、混悬剂、分散剂、软膏剂(包括口服软膏剂)、霜剂、糊剂(pastes)、凝胶剂、粉剂(包括牙粉)、牙膏、锭剂(lozenges)、油膏剂(salve)、咀嚼胶剂(chewing gum)、口腔喷雾剂、软锭剂(pastilles)、冲剂(sachets)、漱口剂、气溶胶、片剂、胶囊剂、透皮贴剂，上述形式均包含本发明的一种或多种消退素(resolvins)和/或保护素(protectins)或它们的类似物。
[0288] 包含本文所公开的HB-X的组合物的制剂可通过本领域技术人员已知的多种手段来制备。在一些实施方式中，例如可通过如下方式制备作为气溶胶制剂给药的制剂：混合(combining)(i)本文所公开的HB-X，足以提供多个治疗有效剂量的量；(ii)水，以有效稳定各制剂的量添加；(iii)喷射剂(propellant)，足以从气溶胶桶中推动出多个剂量的量；以及(iv)任何进一步任选的组分(例如作为共溶剂(cosolvent)的乙醇)；以及分散所述组分。可使用常规混合器或均质器通过震动、或通过超声波能量使各组分分散。可通过使用阀至阀转移方法(valve to valve transfer methods)、压力填充或者通过使用常规冷填充方法来将散装制剂(bulk formulation)转移到较小的单个气溶胶小瓶中。不需要悬浮气溶胶制剂中所使用的稳定剂可溶于喷射剂。可将未充分溶解的稳定剂以合适的量涂覆在药物颗粒上，然后如上所述将涂覆的颗粒掺入制剂中。
[0289] 在某些实施方式中，包含HB-X(其为核酸试剂或多肽试剂)的组合物可与药学上可接受的载体一起作为药物组合物给予受试者。在某些实施方式中，这些药物组合物任选地进一步包含一种或多种其它治疗剂。在某些实施方式中，所述其它治疗剂为自身免疫疾病药物，例如免疫抑制剂(immune suppressant)等。当然，这类治疗剂是本领域普通技术人员能容易替换的已知治疗剂，因为该列表不应被认为是穷举或限制性的。
[0290] 润湿剂、乳化剂、润滑剂(例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、隔离剂(release agent)、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠(sodium metabisulfate)、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0291] 本发明的制剂包括适合于静脉内给予、口服给予、鼻腔给予、局部给予、透皮给予、口腔给予、舌下给予、直肠给予、阴道给予和/或胃肠外给予的制剂。制剂可以方便地处于单位剂量形式，并且可以通过药学领域所公知的任何方法制备。可与载体材料相联合以生产单一剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在100％之中，该量的范围将为约1％至约99％的活性成分、优选约5％至约70％、最优选约10％至约30％。
[0292] 适于口服给予的本发明的制剂可以处于以下形式：胶囊剂、扁囊剂(cachets)、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂；或作为处于水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油或油包水液态乳剂；或作为酏剂(elixir)或糖浆剂；或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等；各形式都包含预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物也可作为大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂给予。
[0293] 在用于口服给予的本发明的固体剂量形式(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣剂(dragees)、粉剂和颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任何以下物质混合：填充剂或扩充剂(extenders)，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，如，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐/酯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；湿润剂，例如甘油；崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯(tapioca)淀粉、海藻酸、某些硅酸盐/酯和碳酸钠；溶液阻滞剂(retarding agents)，如石蜡；吸收加速剂，如季铵化合物；润湿剂，如，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；吸收剂，如高岭土和膨润土(bentonite clay)；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物；以及着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，该药物组合物还可包含缓冲剂。相似类型的固态组分也可以在软壳明胶胶囊和硬壳明胶胶囊(使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂)中用作填充剂。
[0294] 可任选地与一种或多种辅助成分通过压制或模制来制备片剂。可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压制片剂。可以在合适的机器中，用惰性液态稀释剂将粉状化合物的混合物润湿，制备模制片剂。
[0295] 可任选地使用包衣和壳(例如肠溶包衣和在药物制剂领域中公知的其它包衣)来定量(scored)或制备本发明药物组合物的片剂和其它固体剂型(如糖衣剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂)。可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素(以获得所需的释放曲线)、其它聚合物基质、脂质体和/或微球对所述片剂和其它固体剂型进行配制，以使得其中的活性成分缓慢释放或受控释放。所述片剂和其它固体剂型可以通过以下方式灭菌：例如通过细菌滞留过滤器过滤，或通过在临近使用时加入处于无菌固体组合物形式的灭菌剂(所述灭菌剂可溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质)。这些组合物还可以任选地含有乳浊剂(opacifying agents)，并且可以是仅在或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋(embedding)组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，所述活性成分也可与一种或多种上述赋形剂处于微囊化形式。
[0296] 用于口服给予本发明化合物的液态剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。
[0297] 除了活性成分以外，液态剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，如，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨糖醇脂肪酸酯，以及上述物质的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂(suspending agents)、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
[0298] 除了活性化合物以外，混悬剂(suspensions)还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂和西黄蓍胶，以及上述悬浮剂的混合物。
[0299] 在一些情况下，包含本文所公开的HB-X的组合物可处于适于直肠给药或阴道给药的制剂中(例如作为栓剂)，栓剂可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种适当的无刺激性赋形剂或载体混合而制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐/酯，并且所述栓剂在室温下是固体，而在体温下是液体，从而释放出活性化合物。适合用于此类给药的载体和制剂是本领域已知的。
[0300] HB-X的局部给药或透皮给药(例如用于肌肉给药)的剂型包括：粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂(lotions)、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。本文公开的HB-X可以在无菌条件下与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。
[0301] 除本发明的活性化合物以外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或上述赋形剂的混合物。除本发明的化合物以外，粉剂和喷雾剂还可含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以额外含有常用的喷射剂，如氯氟烃和挥发性未取代的烃类，如丁烷和丙烷。
[0302] 透皮贴剂具有将HB-X受控地递送至身体的额外优点。将化合物溶解或分散于适当的介质中可以生产这样的剂型。也可以使用吸收促进剂增加化合物穿过皮肤的通量。无论是提供速率控制膜，还是将活性化合物分散在聚合物基质或凝胶中，均可以控制该通量的速率。
[0303] 适于胃肠外给药的本发明药物组合物包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳剂、或无菌粉末(所述无菌粉末可在临使用时复溶成无菌可注射溶液或分散液)的组合，所述药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳剂、或无菌粉末可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与目标接受者(intended recipient)的血液等渗的溶质、或悬浮剂、或增稠剂。
[0304] 可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及它们适当的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如可以通过以下方式保持适当流动性：使用包衣材料(如卵磷脂)；在分散剂的情况下维持所需粒径；以及使用表面活性剂。
[0305] 这些组合物还可以包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物活动的防止可通过包含各种抗细菌剂和/或抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、山梨酸苯酯等。可期望在组合物中包含等渗剂，如糖和氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0306] 在一些情况下，为了延长药物的作用，期望能够减缓来自皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶材料或无定形材料的液体悬浮液来实现。这样，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而其溶解速率转而又可能取决于晶体大小和晶型。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性辅料中来实现胃肠外给予的药物形式的延迟吸收。
[0307] 通过在可生物降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊化基质来制备可注射的储库(depot)形式。根据药物与聚合物的比例以及所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物封装(entrapping)在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库可注射制剂。
[0308] 在某些实施方式中，可通过本文描述的或本领域技术人员已知的一种或多种纯化方法对HB-X进行分离和/或纯化或大体上(substantially)纯化。通常，纯度为至少90％、特别是95％、并通常高于99％。在某些实施方式中，天然存在的化合物被排除在较广的属的一般描述(general description of the broader genus)之外。
[0309] 在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种HB-X与药学上可接受的载体的组合。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例不受限制地包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡(suppository waxes)；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类(glycols)，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水(pyrogen-free water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。
[0310] 在某些实施方式中，包含本文所公开的HB-X的组合物可含有一个或多个酸性官能团，因此，该组合物能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。本文所用的术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药”是指在健全的医学判断范围内，适用于与患者的组织相接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利益/风险比；并且对于本发明化合物的预期用途而言有效的本发明化合物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前药。术语“盐“是指本发明化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。
[0311] 这些盐可在化合物的最终分离和纯化期间原位(in situ)制备，或者可通过将纯化的化合物以其游离碱的形式与合适的有机酸或无机酸单独反应并分离由此形成的盐来制备。这可以包括基于碱金属和碱土金属(如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子；以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(参见例如Berge S.M.等，“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.，1977；66:1-19，以引用的方式将其并入本文)。
[0312] 术语“药学上可接受的酯”是指本发明化合物的相对无毒的酯化产物。这些酯可在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者可通过将纯化的化合物以其游离酸的形式或羟基与合适的酯化试剂单独反应来制备。经由在催化剂的存在下用醇处理，可将羧酸转化为酯。该术语进一步意在涵盖能够在生理条件下被溶剂化(solvated)的低级烃基，例如烷基酯，甲基酯、乙基酯和丙基酯。
[0313] 本文所用的“药学上可接受的盐或前药”是在健全的医学判断范围内，适用于与患者的组织相接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的利益/风险比；并且对于其预期用途而言有效的盐或前药。在可能的情况下，这些化合物包括本发明化合物的两性离子形式。
[0314] 术语“盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者可通过将纯化的化合物以其游离碱的形式与合适的有机酸或无机酸单独反应并分离由此形成的盐来制备。这可以包括基于碱金属和碱土金属(如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子；以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(参见例如Berge S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66,1，以引用的方式将其并入本文)。
[0315] 术语“前药”是指在体内快速转化以产生活性HB-X的化合物或试剂，例如编码功能活性的治疗肽或治疗蛋白的生物活性或功能活性HB-X。在一些实施方式中，HB-X前药可通过在血液中水解而活化，例如，类似于胰岛素从其蛋白原(proprotein)活化为活性胰岛素蛋白的方式，通过将前体治疗蛋白切割成活性治疗蛋白。如下文献中提供了彻底讨论：T.Higachi和V.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，the A.C.S.Symposium Series，第14卷；以及Bioreversible Carriers in:Drug Design，Edward B.Roche著；
American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，以引用的方式将二者并入本文。本文所用的前药是当体内给药后，被代谢或以其它方式转化为所述化合物的生物活性形式、药学活性形式或治疗活性形式的化合物。该前药可被设计为改变HB-X的代谢稳定性或转运特性、掩盖副作用或毒性、或改变HB-X的其它特性或性能。凭借药效动力学过程和药物代谢或HB-X在体内的翻译后蛋白加工的知识，一旦鉴定出药物活性化合物，药物领域中的技术人员通常可以设计出能够在体内被活化以增加存在于HB-X中的治疗蛋白在受试者中的水平的HB-X前药(参见例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press，N.Y.，第388-392页)。用于选择和制备合适前药的常规方法公开于例如“Design of Prodrugs,”H.Bundgaard著，Elsevier，
1985中。前药的合适实例包括相应酸的甲基酯、乙基酯和甘油酯。
American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，以引用的方式将二者并入本文。本文所用的前药是当体内给药后，被代谢或以其它方式转化为所述化合物的生物活性形式、药学活性形式或治疗活性形式的化合物。该前药可被设计为改变HB-X的代谢稳定性或转运特性、掩盖副作用或毒性、或改变HB-X的其它特性或性能。凭借药效动力学过程和药物代谢或HB-X在体内的翻译后蛋白加工的知识，一旦鉴定出药物活性化合物，药物领域中的技术人员通常可以设计出能够在体内被活化以增加存在于HB-X中的治疗蛋白在受试者中的水平的HB-X前药(参见例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press，N.Y.，第388-392页)。用于选择和制备合适前药的常规方法公开于例如“Design of Prodrugs,”H.Bundgaard著，Elsevier，
1985中。前药的合适实例包括相应酸的甲基酯、乙基酯和甘油酯。
[0316] 不管所选择的给药途径，通过本领域普通技术人员所已知的常规方法将本发明的化合物(可以适当的水合(hydrated)形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
[0317] 载体
[0318] 在另一实施方式中，本发明提供了编码在本文所公开的方法、组合物和试剂盒中使用的HB-X融合蛋白的载体。在一些实施方式中，所述载体是表达载体，并能够插入编码研究者所选的活性剂的核酸序列。在一些实施方式中，本发明涉及包含编码选自以下肝素结合肽(HB)中的至少一种HB的核酸的载体：KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)。在一些实施方式中，所述载体包含多克隆位点，以用于在HB序列的3'处、或5'处、或3'处和5'处插入编码研究者选择的活性剂的核酸序列。在一些实施方式中，所述载体包含多个HB肽。在一些实施方式中，所述载体在HB肽序列的3'处或5'处、在多克隆位点之前还包含至少一种编码接头肽(例如至少包含GGG)的核酸，这取决于是否将编码X的核酸序列插入至HB肽核酸序列的3'处、或5'处、或3'处和5'处。在一些实施方式中，所述载体还包含编码至少一种活性剂(X)的至少一种核酸序列。
[0319] 在一些实施方式中，所述载体包含编码至少一种HB-Xn融合蛋白或Xn-HBn融合蛋白的核酸序列，其中，HB为选自以下HB的肝素结合肽：KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；X为活性剂，以及n是至少为1的整数。
[0320] 在一些实施方式中，所述载体包含编码至少一种(HB-接头)n-Xn融合蛋白或至少一种Xn-(HB-接头)n融合蛋白或至少一种(HB-接头)n-Xm-(HB-接头)o融合蛋白的核酸序列，其中，HB为选自如下HB的肝素结合肽：KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；X为活性剂，其中，m是至少为1的整数，且n+o是至少为1的整数。
[0321] 试剂盒
[0322] 在另一实施方式中，本发明提供了用于实践本发明方法的试剂盒。该试剂盒优选包含一个或多个容器，所述容器含有HB肽和将所述HB肽结合至活性剂(X)的工具。在一些实施方式中，试剂盒包含(i)选自以下HB肽组成的组的至少一种HB肽：KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、 或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；以及将所述HB肽与小分子缀合的化学接头。
[0323] 在一些实施方式中，试剂盒可包含载体，所述载体包含编码选自本文所公开的如下肝素结合肽(HB)中的至少一种肝素结合肽的核酸：KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；以及用于将编码至少一种活性剂的核酸序列亚克隆到载体中的合适试剂(例如限制性内切酶和连接酶等)。在一些实施方式中，试剂盒中的载体还包含编码接头肽的核酸序列，所述编码接头肽的核酸序列可位于编码HB肽的核酸序列的3'处、或5'处(或3'处和5'处)，这取决于要将活性剂克隆至何处。
[0324] 在另一实施方式中，试剂盒可包含HB-X缀合物，其中，X是用于治疗疾病或病症(例如软骨相关疾病或障碍、神经性障碍、眼睛障碍、或炎症)的治疗蛋白或治疗肽。
[0325] 试剂盒可任选包含待与HB-X缀合物共同给药(co-administered)的其它治疗剂(therapeutics)。所述试剂盒可包含将HB-X缀合物给予患有软骨相关疾病或障碍、神经性障碍、眼睛障碍、或炎症的受试者的说明书(instructions)。
[0326] 所述试剂盒还可任选包含适当的系统(例如不透明的容器)或稳定剂(例如抗氧化剂)以防止由光或其它不利条件使HB-X缀合物降解。
[0327] 本发明的另一方面提供了包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器含有本文所公开的HB-X缀合物和药学上可接受的赋形剂。所述试剂盒可任选包含待与所述HB-X缀合物共同给药的其它治疗剂。所述试剂盒可包含对患有软骨相关疾病或障碍、神经性障碍、眼睛障碍、或炎症的受试者进行给药的说明书。
[0328] 所述试剂盒可任选包含含有指南(directions)(即，方案)的说明材料(instructional materials)，提供了HB-X缀合物治疗哺乳动物疾病的用途，例如治疗软骨相关疾病或障碍、神经性障碍、眼睛障碍、或炎症。
[0329] 尽管说明材料通常包括手写(written)材料或印刷材料，但它们并不限于此。能够存储这样的说明并将它们传达给终端用户的任何媒介均在本发明考虑之列。此类媒介包括但不限于：电子存储媒介(例如磁盘、磁带、盒式磁带(cartridges)、芯片)和光学媒介(例如CD-ROM)等。此类媒介可包含提供此类说明材料的因特网网站的地址。
[0330] 在一些实施方式中，可以将本发明定义为以下编号段落中的任一项：
[0331] 1.一种包含至少一种HBn-Xn的组合物，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
[0332] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0333] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0334] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
[0335] X为活性剂，并且n是至少为1的整数。
[0336] 2.如段1所述的组合物，所述组合物进一步包含接头，其中，所述组合物表示为(HB-接头)n-Xn。
[0337] 3.如段2所述的组合物，其中，所述接头为包含序列GGG的肽。
[0338] 4.如段3所述的组合物，所述组合物具有的组合物的HB-接头部分选自于：
[0339] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：4)，或KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：5)。
[0340] 5.如前述段中任一项所述的组合物，其中，X为选自于以下蛋白的蛋白：神经营养因子；神经营养蛋白；神经生长因子(NGF)；脑源性神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3(NT-3)；神经营养蛋白-4(NT-4)；睫状神经营养因子(CNTF)；中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)；保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)；神经胶质细胞系源性神经营养因子家族配体；神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)；neurturin(NRTN)；artemin(ARTN)；或persephin(PSPN)；促神经生长细胞因子；白介素-6；白介素-11；白介素-27；白血病抑制因子；睫状神经营养因子；心脏营养素1；神经生成素；心脏营养素样细胞因子；成纤维细胞生长因子2；抗炎细胞因子；白介素-4；白介素-10；神经保护剂；神经调节蛋白-1；血管内皮生长因子(VEGF)； (FPF-1070)、依那西普
( 融合至人免疫球蛋白G1的Fc部分的可溶性重组TNF受体2)；生长分化因子
11(GDF11)；基质细胞衍生因子-1(SDF-1)；肌肉生长抑制素(生长分化因子8(GDF8))；甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；成纤维细胞生长因子18(FGF-18)；高迁移率族蛋白2(HMG-2，也被称为高迁移率族盒2(HMGB2))；
糖皮质激素受体；治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔单抗，抗TNF-α，
Janssen Biotech，Horsham，PA)、 (阿达木单抗，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、或抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或其它治疗蛋白；或任何前述蛋白的功能部分、变体、类似物或衍生物；
( 融合至人免疫球蛋白G1的Fc部分的可溶性重组TNF受体2)；生长分化因子
11(GDF11)；基质细胞衍生因子-1(SDF-1)；肌肉生长抑制素(生长分化因子8(GDF8))；甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；成纤维细胞生长因子18(FGF-18)；高迁移率族蛋白2(HMG-2，也被称为高迁移率族盒2(HMGB2))；
糖皮质激素受体；治疗抗体或其部分，例如 (英夫利昔单抗，抗TNF-α，
Janssen Biotech，Horsham，PA)、 (阿达木单抗，抗TNF，Abbot Labs.，N.Chicago，IL)、或抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或其它治疗蛋白；或任何前述蛋白的功能部分、变体、类似物或衍生物；
[0341] 或小分子活性剂。
[0342] 6.如前述段中任一项所述的组合物，其中，HBn-Xn或(HB-接头)n-Xn为融合蛋白。
[0343] 7.如段1-6中任一项所述的组合物，其中，X或接头融合至HB的N末端。
[0344] 8.如段1-6中任一项所述的组合物，其中，X或接头融合至HB的C末端。
[0345] 9.如段1-6中任一项所述的组合物，其中，n＝2，并且X融合至HB的N末端和C末端这两端，该融合任选包含至少一种接头肽。
[0346] 10.一种治疗软骨相关临床病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
[0347] 甲状旁腺激素(PTH)；甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)；白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)；成纤维细胞生长因子18(FGF-18)、抗神经生长因子抗体；成纤维细胞生长因子9(FGF-9)；肝细胞生长因子；TGFβ超家族蛋白，例如TGFβ、TGFβ3、BMP2或BMP7；或上述治疗蛋白的部分、类似物、衍生物或功能片段。
[0348] 11.一种治疗软骨相关病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为糖皮质激素受体；以及进一步同时给予或单独给予皮质类固醇。
[0349] 12.如段10或11所述的方法，其中，所述软骨相关病症为：
[0350] 关节软骨缺陷，包括破裂或脱离；半月板缺陷，包括部分撕裂或完全撕裂；骨关节炎；外伤性软骨破裂或脱离；强直性脊柱炎；囊炎；银屑病关节炎；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；幼年特发性关节炎；或X-连锁低血磷性佝偻病。
[0351] 13.一种治疗神经性病症(例如障碍或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
[0352] 神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养因子(CNTF)、中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)、保守性多巴胺神经营养因子(CDNF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)、白介素-6、白介素-11、白介素-27、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、心脏营养素1、神经生成素、心脏营养素样细胞因子、FPF-1070、成纤维细胞生长因子2、神经调节蛋白-1、血管内皮生长因子(VEGF)，或上述治疗蛋白的功能部分、类似物或衍生物。
[0353] 14.如段13所述的方法，其中，所述神经性病症为：
[0354] 阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、脑损伤、脊髓损伤、周围神经变性、中风、亨廷顿氏病、皮克氏病、糖尿病性神经病变、额颞痴呆、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、朊病毒障碍、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性下肢轻瘫、脊髓小脑萎缩、弗里德希氏共济失调、淀粉样变性或Charcot Marie Tooth综合征。
[0355] 15.一种治疗眼睛疾病的方法，所述方法包括给予段1-9中任一项所述的组合物，所述眼睛疾病例如为：
[0356] 角膜溃疡/角膜磨损、Thygeson浅层点状角膜病变、角膜血管新生、富克斯营养不良、干燥性角结膜炎、脉络膜视网膜炎症、脉络膜视网膜瘢痕、脉络膜变性、遗传性脉络膜营养不良、视网膜脱离、视网膜劈裂、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜变性、黄斑变性、黄斑视网膜前膜、周边视网膜变性、遗传性视网膜营养不良、色素性视网膜炎、干眼症或视网膜出血。
[0357] 16.一种治疗炎症的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于如下治疗蛋白的治疗蛋白或其部分：TNF受体2、白介素-4或白介素-10。
[0358] 17.如段1-4中任一项所述的组合物，其中，X为小分子。
[0359] 18.如段6或32所述的组合物，其中，所述融合蛋白选自以下：
[0360]
[0361] 19.KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：10)；
[0362] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：11)；
[0363] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：12)；
[0364] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：13)；
[0365] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：14)；
[0366] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：15)；
[0367] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：16)；
[0368] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO：17)；
[0369] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：18)；或
[0370] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO：19)。
[0371] 20.如段1-6中任一项所述的组合物，其中，HBn＝2，并且HB融合至X的N末端和C末端这两端，其中，所述HB与N末端或C末端的融合任选包含至少一种接头肽。
[0372] 21.如段1-5中任一项所述的组合物，其中，所述HBn-Xn包括(HB-接头)n-Xm-(HB-接头)。，其中，m是至少为1的整数、且n+o是至少为1的整数。
[0373] 22.如段20所述的组合物，其中，所述HBn-Xn包含选自以下序列的两种以上不同的HB肽：
[0374] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0375] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0376] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)。
[0377] 23.如段1-9中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含至少2种HBn-Xn缀合物。
[0378] 24.如段6、21或22中任一项所述的组合物，其中，X选自于由以下蛋白所组成的组中的任何一种蛋白或组合：
[0379] SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：30-SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：73-SEQ ID NO：76，或上述蛋白的功能片段。
[0380] 25.如段1-9和17-23中任一项所述的组合物，所述组合物用于将活性剂X递送至表达蛋白聚糖的细胞或组织。
[0381] 26.如段24所述的组合物，其中，所述组织为软骨组织、神经元组织、皮肤或皮下组织。
[0382] 27.如段1-9和17-25中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含水凝胶。
[0383] 28.如段26所述的组合物，其中，所述水凝胶为自组装肽水凝胶。
[0384] 29.如段27所述的组合物，其中，所述自组装肽水凝胶包含选自以下肽的至少一种或组合：
[0385] RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、
[0386] KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)、或
[0387] AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
[0388] 30.如段10-16中任一项所述的方法，其中，所述HB-Xn或(HB-接头)n-Xn存在于水凝胶上或水凝胶中。
[0389] 31.如段29所述的方法，其中，所述水凝胶为自组装肽水凝胶。
[0390] 32.如段30所述的方法，其中，所述自组装肽水凝胶包含选自以下肽的至少一种或组合：
[0391] RADARADARADARADA(SEQ ID NO：77)、
[0392] KLDLKLDLKLDL(SEQ ID NO：78)、或
[0393] AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2(SEQ ID NO：79)。
[0394] 33.如段10-16中任一项所述的方法，其中，所述HB-Xn或(HB-接头)n-Xn存在于生物植入物上或生物植入物中。
[0395] 34.如段32所述的方法，其中，所述生物植入物为骨软骨同种异体移植物或半月板同种异体移植物。
[0396] 35.一种治疗软骨相关临床病症(例如损害或疾病)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的包含HB-Xn或(HB-接头)n-Xn的重组融合蛋白，其中，X为选自于以下治疗蛋白的治疗蛋白：
[0397] 血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)、生长抑素(SST)，或上述治疗蛋白的片段、部分、类似物、衍生物或功能片段。
[0398] 36.如段34所述的方法，其中，SST的类似物选自于奥曲肽、帕瑞肽或兰瑞肽。
[0399] 37.一种载体，所述载体包含编码至少一种肝素结合肽(HB)的核酸，所述肝素结合肽(HB)选自：
[0400] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0401] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0402] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)。
[0403] 38.如段36所述的载体，所述载体进一步包含编码至少一种活性剂(X)的至少一种核酸序列。
[0404] 39.如段36所述的载体，所述载体进一步包含编码至少一种接头的至少一种核酸序列。
[0405] 40.如段37所述的载体，其中，所述核酸序列编码至少一种HB-Xn融合蛋白或Xn-HBn融合蛋白，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
[0406] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0407] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0408] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
[0409] X为活性剂，并且n是至少为1的整数。
[0410] 41.如段38所述的载体，其中，所述核酸序列编码至少一种(HB-接头)n-Xn融合蛋白或至少一种Xn-(HB-接头)n融合蛋白或至少一种(HB-接头)n-Xm-(HB-接头)o融合蛋白，其中，HB为选自于以下序列的肝素结合肽：
[0411] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0412] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0413] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；
[0414] X为活性剂，其中m是至少为1的整数、且n+o是至少为1的整数。
[0415] 42.如段36或38所述的载体，其中，所述接头包含GGG。
[0416] 43.如段36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述X或所述接头的核酸序列在编码HB的核酸的5’处。
[0417] 44.如段36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述X或所述接头的核酸序列在编码HB的核酸的3’处。
[0418] 45.如段36-41中任一项所述的载体，其中，编码所述HB肽的核酸序列在编码所述X或所述接头的核酸的5’和3’处。
[0419] 46.如段36-44中任一项所述的载体，其中，所述载体为表达载体。
[0420] 47.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
[0421] i.选自于由以下序列所组成的组中的至少一种HB肽：
[0422] KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK(SEQ ID NO：1)、
[0423] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK(SEQ ID NO：2)、或
[0424] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK(SEQ ID NO：3)；以及
[0425] ii.将所述HB肽缀合至小分子的化学接头。
[0426] 48.一种试剂盒，所述试剂盒包含段36或38所述的载体；以及用于将编码活性剂(X)的核酸序列插入所述载体的试剂。
[0427] 49.包含段36-45中任一项所述的载体的细胞系。
[0428] 现在将通过非限制性实例对实施方式进行进一步描述。
[0429] 实施例
[0430] 材料和方法
[0431] 软骨结合分析：
[0432] 从1-2周龄的新生小牛(Research 87Inc.，Boylston MA)膝关节(stifle joints)收集软骨分离体。对关节软骨进行切片，冲压成1mm厚乘3mm直径的盘(disks)，并在低葡萄糖DMEM中37℃孵育。
[0433] 使软骨盘与仅培养基、PTH或eHB-PTH孵育。24小时后，将所有软骨盘用不添加肽的新鲜培养基洗涤3次。然后，在不存在肽的情况下将软骨重新孵育，并在两天或四天后收集。
[0434] 对软骨盘进行蛋白提取和分析：
[0435] 将软骨盘分别粉碎，并用液氮冷却。将粉末重悬于裂解缓冲液(含有0.1％Triton X-100、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))中，并在4℃旋转过夜。通过离心使所得提取液澄清，并用660nm蛋白测定(Pierce)分析蛋白浓度。
[0436] 关于Western分析，将含有等量蛋白的提取物部分(3μg总蛋白/泳道)在还原条件下煮沸，并在4％-12％Bis-Tris凝胶上进行电泳。兔抗PTH多克隆抗体来自Abcam(ab40630)，用于软骨分离体中PTH的存在的蛋白质印迹分析。用1:1000稀释的抗体ab40630、随后用1:5000稀释的山羊抗兔二抗对膜中的PTH进行探测。
[0437] 对脊髓中HB-IGF-1保留的评价：
[0438] 报废(retired)雄性繁殖大鼠(breeder rats)从Charles River获得。将大鼠安乐死，然后收集组织。解剖后取脊髓组织，并分成相似的部分。对每一部分进行称重，然后37℃孵育在24孔板中的1mL无血清DMEM中。然后，用不含添加的无血清DMEM、含有1μg/ml IGF-1的无血清DMEM、或含有1μg/ml HB-IGF-1的无血清DMEM替换培养基。IGF-1是人重组IGF-1(Increlex，Tercica)。将IGF-1融合到HB(C17R)(SEQ ID NO：21)。HB-IGF-1表达为人重组HB-C17R-IGF-1，并于在大肠杆菌(E.coli)中表达后从包涵体中提取。脊髓与HB-IGF-1孵育一天后，将培养基替换为不含添加的无血清DMEM。收集一组组织作为“第
0天”样品，并在-20℃冷冻存储。然后在清洗24小时后取组织样品(“第1天”)。
0天”样品，并在-20℃冷冻存储。然后在清洗24小时后取组织样品(“第1天”)。
[0439] 对脊髓进行蛋白提取和分析：
[0440] 通过以1ml裂解缓冲液/100mg组织进行均质化，从冷冻的脊髓组织中提取蛋白。裂解缓冲液含有具有1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的0.1％Trition X-100。
对总蛋白浓度进行测定，将含等量总蛋白的提取物部分在还原性样品缓冲液中煮沸，并上样在4％-12％Bis-Tris凝胶上用于Western分析。
对总蛋白浓度进行测定，将含等量总蛋白的提取物部分在还原性样品缓冲液中煮沸，并上样在4％-12％Bis-Tris凝胶上用于Western分析。
[0441] 对包含C17K和C17R HB肽的融合蛋白表达的测定：
[0442] 相比野生型(SEQ ID NO：20)和C17S序列(SEQ ID NO：41)，检测到具有增强HB肽(例如C17R和C17K)序列的可溶性HB-IGF-1的优异表达。对下列质粒的蛋白表达进行了评价：(i)质粒04：在pET24a(+)中的HB(C17K)-IGF-1；(ii)质粒05：在pET24a(+)中的HB(C17R)-IGF-1；(iii)质粒06：在pET24a(+)中的HB(C17S)-IGF-1；以及(iv)质粒07：在pET24a(+)中的HB-IGF-1。将HB-IGF-1和突变体(上文列出)转进T7表达大肠杆菌细胞，并以每批1L在Luria-Bertani(LB)培养基中生长。蛋白表达用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导4h，然后通过离心收集细胞。用10ml BugBuster Master Mix天然提取试剂(Novagen)提取蛋白。在还原条件下使10μl各样品在4％-12％Bis-Tris凝胶上跑胶。
表达水平使用IGF-1抗体ab9572(AbCam)通过蛋白印迹进行比较。
表达水平使用IGF-1抗体ab9572(AbCam)通过蛋白印迹进行比较。
[0443] 确定生产包含C17K和C17R HB肽的融合蛋白的产率：
[0444] 检测到含有增强HB(C17R)肽的可溶性HB-IGF-1融合蛋白优异的纯化产率(yield)。对来自下列质粒的融合蛋白的下列产率进行了评价：(i)质粒05：在pET24a(+)中的HB(C17R)-IGF-1；或(ii)质粒07：在pET24a(+)中的HB-IGF-1。
[0445] 将HB-IGF-1和HB(C17R)-IGF-1(上文列出)转入T7表达大肠杆菌细胞，并以每批1L在Luria-Bertani(LB)培养基中生长。蛋白表达用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导4h，然后通过离心收集细胞。用BugBuster Master Mix天然提取试剂(Novagen)提取蛋白。纯化通过将样品加载到HiLoad 16/60Superdex 200尺寸排阻层析柱上进行。每个部分(fraction)洗脱2mL。在还原条件下使10μl各个部分在4％-12％Bis-Tris凝胶上跑胶。每个部分中的IGF-1使用IGF-1抗体ab9572(AbCam)通过蛋白印迹进行测定。对蛋白进行检测，部分3-12(示出的部分)中为C17R变体(eHB)，部分4-10中为野生型变体。
[0446] 为了证明增强HB(C17R)允许来自包涵体的HB-IGF-1融合蛋白的优异产率，将编码HB-IGF-1和HB(C17R)-IGF-1的质粒(例如上文所列出的质粒05：在pET24a(+)中的HB(C17R)-IGF-1；或(ii)质粒07：在pET24a(+)中的HB-IGF-1)转入T7表达大肠杆菌细胞，并以每批1L在Luria-Bertani(LB)培养基中生长。关于诱导样品，蛋白表达用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导4h。使未诱导样品在无1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷的情况下生长4h。然后通过离心收集细胞。将细胞在8ml裂解缓冲液(含有6M盐酸胍、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.8)中进行裂解。将细胞裂解物在含有50mM Tris、100mM NaCl的缓冲液中进行透析。在还原条件下使5μl各样品在4％-12％Bis-Tris凝胶上跑胶。使用IGF-1抗体ab9572(AbCam)通过蛋白印迹并通过考马斯染色对样品的IGF-1进行分析。
[0447] 实施例1.HB-IGF-1融合蛋白
[0448] 制造HB-IGF-1构建体，以表达融合至成熟IGF-1蛋白氨基末端的肝素结合结构域。HB-IGF-1融合蛋白通过在大肠杆菌中重组表达产生，使其重折叠(refolded)，并通过反相色谱法进行纯化。人重组IGF-1是可商购的，例如 (mecasemin[rDNA来源]，Ipsen Biopharmaceuticals,Inc.，Basking Ridge，NJ)。
[0449] 实施例2.体内结合和药代动力学
[0450] 实验用雄性Lewis大鼠(251-275g，Charles River，Wilmington，MA)进行。所有动物程序均得到Harvard Medical Area Standing Committee on Animals的批准。
[0451] 大鼠在右髌股关节(patellofemoral joint)接受含有100μg HB-IGF-1、100μg IGF-1或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的单次关节内注射。在注射后2天、4天、6天和8天收集关节软骨、内侧半月板和髌腱样品。对样品进行称重，在液氮中粉碎，并以每毫克组织10μl裂解缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris、0.5％Triton X-100、5mM EDTA、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物[Roche])进行提取。通过蛋白印迹对具有等蛋白质量的提取物部分进行分析。血清IGF-1水平通过与人IGF-1具有反应性而与啮齿动物IGF-1不具有反应性的ELISA(R&D Systems#DY291)进行测量。
[0452] 实施例3.软骨生物合成分析
[0453] 将大鼠随机分配为在右髌股关节接受含有100μg HB-IGF-1、100μg IGF-1或PBS的单次关节内注射。在注射后2天或4天将动物处死。处死后，收集右膝关节半月板，并将35
其在含有5μCi/ml S-硫酸根(sulfate)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中37℃孵育18h。孵育后，将样品在具有硫酸根的PBS中洗涤4次，每次15分钟，以除去未掺入的放射性标记(radiolabel)。将样品用1mg/ml蛋白酶K在60℃消化过夜，并在液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)中对放射性标记掺入进行测量。
其在含有5μCi/ml S-硫酸根(sulfate)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中37℃孵育18h。孵育后，将样品在具有硫酸根的PBS中洗涤4次，每次15分钟，以除去未掺入的放射性标记(radiolabel)。将样品用1mg/ml蛋白酶K在60℃消化过夜，并在液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)中对放射性标记掺入进行测量。
[0454] 实施例4.关节损害的大鼠模型
[0455] 关于外科手术，将大鼠随机分配到三组之一：在右膝关节中接受包含100μg HB-IGF-1、100μg IGF-1或PBS的50μl关节内注射。在内侧半月板撕裂(MMT)前1天给予起始(initial)注射。MMT模型如前所述地使用。Gerwin等，18Osteoarthr.Cartil.S24(2010)。简单地说，跨膝盖内侧面(medial aspect)制造皮肤切口。通过钝性分离(blunt dissection)暴露内侧副韧带并将其横切。将内侧半月板向内侧反折(reflected medially)并切割，以模拟完全撕裂。MMT后7天和14天，给予后续关节内注射。手术后21天处死动物。
[0456] 进行组织学分级(histological staging)和切片。收集膝关节并在4％多聚甲醛中固定。然后将关节转移至5％甲酸脱钙溶液(ImmunoCal，Decal Chemical Corp，Tallman，NY)。将关节切成两半以形成前部切片和后部切片，并包埋于石蜡中。对相隔约200μm取用的8μm切片用甲苯胺蓝(Toluidine Blue)进行染色。
[0457] 对内侧胫骨平台(medial tibial plateau)进行分析以及显微成像。选择展现出最大损伤程度的最中央切片用于盲法评分(blinded scoring)。使用改良的Mankin评分系统对损伤进行评分。使用三种不同的度量标准(metrics)对损伤进行测量：软骨基质缺失宽度、总软骨变性宽度和显著变性宽度。
[0458] 软骨基质缺失宽度仅测量100％基质缺失的程度，而PG区域或软骨细胞变性则被忽略。在表面(0％深度)和潮标(tidemark)(100％深度)处进行测量。总软骨变性宽度测量受到任何类型变性改变影响的关节软骨区域的总宽度。显著软骨变性宽度测量影响大于50％厚度的软骨的损伤的程度。显著软骨变性宽度包括任何形式的胶原基质、PG或软骨细胞变性。所有结果表示为平均值±SEM。
[0459] 实施例5：
[0460] 本发明人证明了SEQ ID NO：20中的氨基酸残基17(对应于SEQ ID NO：1中的氨基酸残基16)的修饰可以增加HB融合蛋白在组织中的产率和保留。使用SEQ ID NO：20的17-mer HB肽，本发明人证明了，相比包含C17S(MKRKKKGKGLGKKRDPSLRKYK；SEQ ID NO：41)或野生型HB(SEQ ID NO：20)的HB-IGF-1融合蛋白，与包含增强HB(eHB)肽C17K(SEQ ID NO：22)和C17R(SEQ ID NO：21)的融合蛋白孵育的软骨分离体中的可溶性HB-IGF-1存在预料不到的优异保留。此外，相比包含C17S(MKRKKKGKGLGKKRDPSLRKYK；SEQ ID NO：41)或野生型HB(SEQ ID NO：20)的HB-IGF-1融合蛋白，与包含增强HB(eHB)肽C17K(SEQ ID NO：
22)和C17R(SEQ ID NO：21)的融合蛋白孵育的软骨分离体中的可溶性HB-IGF-1存在预料不到的优异表达(图5)。
22)和C17R(SEQ ID NO：21)的融合蛋白孵育的软骨分离体中的可溶性HB-IGF-1存在预料不到的优异表达(图5)。
[0461] 此外，令人惊奇的是，本发明人检测到，相比用含有野生型HB(SEQ ID NO：20)的HB-IGF融合蛋白孵育的软骨分离体，以用含有C17R(SEQ ID NO：21)的HB-IGF-1融合蛋白孵育的软骨分离体进行可溶性HB-IGF-1纯化时获得了显著较高的产率(图6)。
[0462] 接下来，本发明人还证明了，相比用含有野生型HB(SEQ ID NO：20)的HB-IGF-1孵育的软骨分离体，以用含有C17R(SEQ ID NO：21)的HB-IGF-1融合蛋白孵育的软骨分离体中获得的包涵体(诱导的和未诱导的)进行可溶性HB-IGF纯化时也获得了较高的产率(图7)。
[0463] 因此，本发明人证明了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：20中的负电荷氨基酸修饰(例如SEQ ID NO：20中第17位氨基酸处的半胱氨酸残基改变(或SEQ ID NO：1中第16位氨基酸处的半胱氨酸残基改变)成带正电荷的残基(例如精氨酸或赖氨酸))可令人惊奇地导致保留在组织中的HB融合蛋白的量显著增加，以及从来自全组织提取物的组织(图6)和来自组织提取物的包涵体(图7)获得的HB融合蛋白的产量显著增加。
[0464] 实施例6：
[0465] 在实施例1-实施例4中，本发明人证明了肝素结合(HB)肽与IGF-1的融合允许融合蛋白通过与高丰度硫酸软骨素蛋白聚糖相互作用而在软骨组织内具有延长的保留。然而，其它组织在其胞外基质中也具有丰富的带负电荷的蛋白聚糖。因此，本发明人评价了HB-IGF-1融合蛋白在从脊髓收集的神经组织中是否会有延长的蛋白保留。
[0466] 在IGF-1或HB-IGF-1存在的情况下将脊髓分离体孵育1天后，通过针对IGF-1的Western分析在组织提取物中检测到了两种蛋白(图8)。清洗1天后，没有检测到有可检测的非融合IGF-1被保留在组织中。与此相反，HB-IGF-1蛋白在脊髓组织提取物中仍然可检测到(图8)。
[0467] 因此，本发明人在本文已证明，HB-IGF-1在离体脊髓组织中保留至少24小时，但未经修饰(非融合)的IGF-1却没有。因此，融合至蛋白的HB允许蛋白在不同于软骨的其它组织(包括神经组织和组织的细胞表面上具有丰富的硫酸软骨素蛋白聚糖的其它组织)中具有延长的保留。
[0468] 实施例7：
[0469] 在实施例1-实施例4中，本发明人证明了HB结构域与IGF-1的融合体允许IGF-1融合蛋白靶向并持续保留在软骨中。然而，如本文所讨论的，HB结构域的融合并不限于IGF-1蛋白。因此，HB可以融合到任何活性剂，以作为靶向递送多种治疗蛋白的策略。
[0470] 甲状旁腺激素(PTH)的肽(例如氨基酸1-34，PTH(1-34))为批准临床用于骨质疏松的肽，该肽在软骨修复中具有潜在益处。在大鼠骨关节炎模型中，已显示出该肽降低骨关节炎发展的程度(Chang等，2009)。
[0471] 如本文所证明的，本发明人使用PTH-HB融合蛋白，利用牛组织培养分离体对PTH在软骨中的保留进行了评价。
[0472] 以下PTH肽通过合成(Peptide 2.0，Chantilly VA)产生：
[0473] 1.PTH(1-34)-生 物 素：SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQ DVHNFK-( 生 物 素基)-NH2(SEQ ID NO：80)；
[0474] 2.PTH(1-34)-接头-HB-生物素：
[0475] SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKK-(生 物 素基)-NH2(SEQ ID NO：81)。将生物素添加到PTH(1-34)和PTH(1-34)-接头-HB肽以用于识别和示踪目的。类似地，不具有生物素的PTH(1-34)-接头-HB构建体可用于治疗目的。此外，如本文所公开的，也可利用不存在接头的情况。兔抗PTH多克隆抗体来自Abcam(ab40630)，用于对软骨分离体中PTH的存在进行蛋白印迹分析。
[0476] Western分析证实检测到PTH和PTH-HB肽二者(图9A)。在不存在PTH肽的情况下孵育两天后，仅微弱地检测到保留在组织中的PTH(图9B)。与此相反，强烈地检测到保留在组织中的PTH-eHB(图9B)。另外，在不存在PTH肽的情况下孵育四天后，PTH-HB肽在组织中保持高丰度(数据未显示)。再次，仅微弱地检测到PTH肽(数据未显示)。
[0477] 因此，本发明人在本文已 证实，通过融合至肝素结合序 列“KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKK”(SEQ ID NO：2)对PTH(1-34)肽进行的修饰允许PTH肽在软骨组织中的延长保留。因此，PTH-HB肽可保留在软骨组织中，以用于防止损伤后或OA期间软骨缺失。
[0478] 参考文献
[0479] 通过引用将本文和整个申请文件中引用的参考文献整体并入本文。
[0480] Chang，J.-K.，Chang，L.-H.，Hung，S.-H.，Wu，S.-C.，Lee，H.-Y.，Lin，Y.-S.，Chen，C.-H.，Fu，Y.-C.，Wang，G.-J.，and Ho，M.-L.(2009).Parathyroid hormone 1-34inhibits terminal differentiation of human articular chondrocytes and osteoarthritis progression in rats.Arthritis Rheum.60，3049-3060.
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