C-环取代的孕甾-4-烯-21,17-羧内酯,以及含有其的药物制剂
阅读：745发布：2023-01-24
专利汇可以提供C-环取代的孕甾-4-烯-21,17-羧内酯,以及含有其的药物制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通式I的C-环取代的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其中R6，7是α-或β-亚甲基，并且R9是氢 原子 ，且R11是溴原子、氯原子或氟原子，或者R9和R11共同为键。该新化合物为促孕抗盐皮质 激素 物质。，下面是C-环取代的孕甾-4-烯-21,17-羧内酯,以及含有其的药物制剂专利的具体信息内容。
1.通式I的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯
式I
其中：
6，7
R 是α-或β-亚甲基，并且
9 11
R 是氢原子，且R 是溴原子、氯原子或氟原子，或者
9 11
R 和R 共同为键。
9
2.如权利要求1所述的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其特征在于R 位于α位。
11
3.如权利要求1所述的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其特征在于R 位于β位。
11
4.如权利要求1所述的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其特征在于所述卤素原子R 是氟原子或氯原子。
11
5.如权利要求4所述的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其特征在于所述卤素原子R 是氟原子。
6.如权利要求1所述的6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，
9(11)-二烯-21，17β-羧内酯。
7.如权利要求1所述的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，其特别是
11β-氯-6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯
6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯
6α，7α；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯。
8.药物制剂，其包含至少一种如权利要求1所述的通式I的化合物以及药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物制剂，其包含6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯。
10.如权利 要求8所 述的药 物制剂，其包含6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯。
11.如权利要求8、9或10所述的药物制剂，其另外包含至少一种雌激素。
12.如权利要求11所述的药物制剂，其包含炔雌醇。
13.如权利要求11所述的药物制剂，其包含天然雌激素。
14.如权利要求13所述的药物制剂，其包含雌二醇。
15.如权利要求13所述的药物制剂，其包含戊酸雌二醇。
16.如权利要求13所述的药物制剂，其包含至少一种共轭雌激素。
17.11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮，其作为起始化合物，用于制备所述通式I的化合物。
18.制备11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮的方法，其特征在于在发酵罐中用以下种类的微生物羟基化15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮：
梨头霉属(Absidia sp.)、支顶孢属(Acremonium sp.)、壳二孢属(Ascochyta sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、白僵菌属(Beauveria sp.)、球二孢属(Botryodipoldia sp.)、Caldariomyces sp.、丽赤壳属(Calonectria sp.)、毛盘孢属(Colletotrichum sp.)、弯孢霉属(Curvularia sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、盘长孢属(Gloeosporium sp.)、小丛壳属(Glomerella sp.)、日规壳属(Gnomonia sp.)、Haplosporella sp.、卷枝霉属(Helicostylum sp.)、长蠕孢属(Helminthosporium sp.)、绿僵菌属(Metarhizium sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、黑孢子菌属(Nigrospora sp.)、根霉菌属(Rhizopus sp.)、侧孢霉属(Sporotrichum sp.)、共头霉属(Syncephalastrum sp.)和Wojnowicia sp.。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于使用以下微生物进行羟基化：犁头霉菌(Absidia orchidis)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、直立顶孢霉(Acremonium strictum)、铁 线 莲 壳 二 孢 (Ascochyta clematidina)、洋 葱 曲 霉 (Aspergillus alliaceus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、费舍尔曲霉(Aspergillus fischeri)、黄 曲 霉 (Aspergillus flavus)、Aspergillus malignus、蜂 蜜 曲 霉 (Aspergillus melleus)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、赭曲霉菌(Aspergillus ochraceus)、杂色曲霉(Aspergillus variecolor)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、巴西安白僵菌(Beauveria bassiana)、纤细白僵菌(Beauveria tenella)、Botryodiplodia malorum、Caldariomyces fumago、Calonectria decora、番茄炭疽病毛盘孢(Colletotrichum phomoides)、月状弯孢菌(Curvularia lunata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、果生盘长孢(Gloeosporium fructigenum)、Gloeosporium higgensianum、柿盘孢子菌(Gloeosporium kaki)、悦色盘长孢菌(Gloeosporium lacticolor)、油橄榄番茄炭疽病毛盘孢(Gloeosporium olivarum)、Glomerella fusaroides、Gnomonia cingulata、Haplosporella hesperedica、长 蠕 孢菌(Helminthosporium sp.)、梨形卷枝霉(Helicostylum piriforme)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、密丛毛霉(Mucor plumbeus)、刺状毛霉菌(Mucor spinosus)、球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)、无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、科恩根霉(Rhizopus cohnii)、代氏根霉(Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、Rhizopus kazaensis、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、Rhizopus shanghaiensis、匍茎根霉菌(Rhizopus stolonifer)、小麦麯根霉(Rhizopus tritici)、Sporotrichum sulfurescens、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、Wojnowicia graminis和Wojnowicia hirta。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于使用以下微生物进行羟基化：犁头霉菌(ATCC 6647)、直立顶孢霉(NRRL 5759)、铁线莲壳二孢(CBS)、洋葱曲霉(ATCC 10060)、泡盛曲霉(CBS)、费舍尔曲霉(ATCC 1020)、Aspergillus malignus(IMI 16061)、蜂蜜曲霉(CBS)、构巢曲霉菌(ATCC 11267)、黑曲霉菌(ATCC 9142、ATCC 11394)、赭曲霉菌(NRRL
405、NRRL 410、CBS 13252、ATCC 46504)、杂色曲霉(ATCC 10067)、巨大芽孢杆菌(ATCC
13368)、巴西安白僵菌(IFO 5838、ATCC 13144、IFO 4848、CBS 11025、CBS 12736、ATCC
7159)、Botryodiplodia malorum(CBS 13450)、Caldariomyces fumago(ATCC 16373)、Calonectria decora(ATCC 14767)、月状弯孢菌(IX 3、NRRL 2380)、腐皮镰刀菌(ATCC
12823)、尖孢镰刀菌(ATCC 7808)、玉米赤霉(CBS 4474)、围小丛壳菌(ATCC 12097、ATCC
10534、CBS 23849、CBS 23749、ATCC 16646、IFO 6459、IFO 6425、IFO 6470、ATCC 15093、ATCC 10529、IFO 5257、ATCC 56596、ATCC 64682)、Glomerella fusaroides(ATCC 9552)、Gnomonia cingulata(CBS 15226)、Haplosporella hesperedica(CBS 20837)、梨形卷枝霉(ATCC 8992)、长蠕孢菌(NRRL 4671)、金龟子绿僵菌(IFO 5940)、密丛毛霉(CBS 29563)、球黑孢菌(ATCC 12772)、无根根霉菌(ATCC 11145)、米根霉(ATCC 4858、ATCC 34102、CBS
32947)、匍茎根霉菌(ATCC 15441)、总状共头霉(IFO 4827)和Wojnowicia graminis(CBS
89168)。
C-环取代的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯，以及含有其的药
物制剂
[0001] 本发明涉及通式I的C-环取代的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯
[0002] 式I
[0003] 其中：
[0004] R6，7是α-或β-亚甲基，且
[0005] R9是氢原子，且R11是溴原子、氯原子或氟原子，或者
[0006] R9和R11共同为键。
[0007] 氢原子R9优选位于α位。
[0008] 卤素原子R11优选位于β位。
[0009] 卤素原子R11优选为氟原子或氯原子，并特别优选氟原子。
[0010] 根据本发明，特别优选下述化合物：
[0012] 6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯；
[0013] 6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯；
[0014] 6α，7α；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯。
[0015] 屈螺酮(6β，7β-15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯)是新的孕激素，其存在于例如口服避孕药YASMIN 和用于治疗绝经后症状的制剂ANGELIQ 中。因为屈螺酮对孕激素受体的较低的亲和性及其较高的排卵抑制剂量，其以3mg的较高日剂量存在于YASMIN 中。
[0016] 屈螺酮
[0017] 除了促孕作用之外，屈螺酮还因具有醛固酮拮抗(抗盐皮质激素)作用和抗雄激素作用而令人注目。这两种性质使得屈螺酮在其药理性质上与天然孕激素孕酮非常相似，但是，与屈螺酮不同，后者的口服生物利用度不够。
[0018] 因此本发明的目的在于提供意图具有比屈螺酮更高的体内促孕效能的化合物。这最终欲通过更低的日剂量来表现，并欲导致更低的活性化合物物质需要。
[0019] 本发明欲提供的化合物意图另外具有体内抗盐皮质激素作用，其至多与屈螺酮的体内抗盐皮质激素作用相同，但优选低于后者。
[0020] 本发明的化合物进一步意图具有比屈螺酮更弱的抗雄激素活性。
[0021] 最后，本发明的化合物意图具有高代谢稳定性。
[0022] WO2006072467公开了这样的化合物，其在大鼠的妊娠保持试验中表现出比屈螺酮高得多的活性，并对来自大鼠肾脏匀浆的盐皮质激素受体表现出与屈螺酮相当的活性。这些化合物是18-甲基-19-去甲-17-孕甾-4-烯-21，17-羧内酯。
[0023] WO2008000521中描述了这样的化合物，其在关于它们与孕酮和盐皮质激素受体的结合方面具有比屈螺酮更少的体外解离性质(dissociated profile)。这些化合物是18-甲基-19-去甲-雄甾-4-烯-17，17-螺醚。
[0024] EP1746101A1中描述了通过17-(3-羟丙基)-3，17-二羟基雄甾烷的无金属氧化(metal-free oxidation)来制备3-氧代孕甾-4-烯-21，17-羧内酯的方法。从EP1746101A1中来看，这些羧内酯的药理学活性通常并不明显。所提及的仅有的具体化合物是6β，7β-15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯(屈螺酮)。并未具体显示11-卤代和9，11-脱氢化合物。
[0025] 本发明的目的是通过提供本文所述的通式I的C-环取代的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯来实现的。通式I的化合物(特别是实施例1和2的那些化合物)由于具有改善的作用特性(profile)而突出。
[0026] 本发明的化合物由于具有惊人的强促孕活性并在皮下给药后在大鼠的妊娠保持试验中具有高活性而令人注目。
[0027] 与屈螺酮相比，本发明的通式I的化合物具有更高的促孕活性，并同时与雄激素受体的结合更弱。
[0029] 由于它们的促孕活性，通式I的新化合物可以单独或与雌激素联合用于避孕药物制剂中。
[0030] 因此，本发明的所述通式的化合物可以单独(即不使用雌激素)用于制备所谓的POPs(仅含孕酮的避孕丸)。已公开了这样的基于其它具有促孕活性的化合物的POPs，例如基于产品Microlut 形式(各包含30μg左旋炔诺酮的28个日剂量单位)的孕激素左旋炔诺酮的POPs。
[0031] 由于具有有利的作用特性，本发明的化合物特别适合于治疗经前期症状，例如头痛、抑郁情绪、水潴留和乳痛症。
[0032] 由于具有促孕活性，本发明的化合物适于通常已知作为孕激素的进一步的可能用途，例如治疗严重的出血障碍(例如痛经和子宫不规则出血)、治疗黄体不足(即治疗先兆流产)、治疗青春期延迟以及治疗孕激素替代适用的疾患。
[0033] 因此本发明还涉及药物制剂，其包含至少一种通式I的化合物以及药学上可接受的载体。
[0034] 本发明的药物制剂优选包含6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯或6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯作为活性成分的那些药物制剂。
[0035] 本发明还涉及药物联合制剂，其除了通式I的化合物和药学上可接受载体之外，还包含雌激素。
[0036] 本发明的化合物在避孕制剂中的剂量意图为每天0.01-5mg，优选0.01-2mg。
[0037] 用于治疗经前期症状的日剂量为约0.1-20mg。
[0038] 在避孕制剂中，优选将促孕活性成分组分和雌激素活性成分组分共同口服给药。优选一次给药全部的日剂量。
[0039] 在本发明的用于避孕的联合制剂中的适合的雌激素为雌二醇和合成雌激素，优选为炔雌醇，同样还有美雌醇。
[0040] 此外，还可能使用雌二醇的酯，特别是戊酸雌二醇或苯甲酸雌二醇。
[0041] 给药的雌激素的日剂量对应于其雌激素作用，相当于0.01-0.04mg的炔雌醇。在这样的避孕制剂中，以0.01-0.04mg的日剂量使用炔雌醇本身。
[0042] 通式I的新化合物还可以用在用于治疗绝经前期症状、围绝经期症状和绝经后症状的药物制剂中，以及用在用于激素替代疗法(HRT)的制剂中。
[0044] 最近还有将叶酸(WO99/53910)或5-甲基-6-(S)-四氢叶酸盐(其中特别是5-甲基-6-(S)-四氢叶酸的钙盐(Metafolin WO2006/120035))掺入用于避孕或激素替代疗法的制剂中的描述。
[0045] WO2008/003432中描述了四氢叶酸盐与单独的孕激素，特别是与孕激素和雌激素的相应的稳定制剂。
[0047] 与以上出版物中关于之前已知的孕激素的描述类似地使用本发明的新孕激素在本发明的范围内。
[0048] 以在制药技术中常见的本领域已知的方式，通过加工(适当地与雌激素、与载体物质、稀释剂、适合的遮味剂等组合的)活性成分来配制基于所述新化合物的药物制剂，并将其转化为期望的给药形式。
[0049] 如果欲单独使用或与雌激素、与叶酸或5-甲基-6-(S)-四氢叶酸盐共同使用所述新化合物，可以如以上出版物中关于之前已知的孕激素所述地制备相应的制剂。
[0050] 具体而言，片剂、包衣片剂、胶囊剂、丸剂、混悬剂或溶液剂优选适于口服给药。
[0052] 还可以将本发明的物质掺入经皮体系，并用此将其经皮给药。
[0053] 类似地，可以将所述新化合物单独或与雌激素一同掺入在延长的时间内释放一种或多种活性成分的给药体系(例如子宫内体系(IUS)、阴道环(IVR))或掺入皮下移植的体系，在将所述体系插入子宫或阴道或移植入皮下之后，它们逐渐从该体系中释放。
[0054] 药理学
[0055] 在卵巢切除的大鼠中的促孕作用：
[0056] 如Muhn等 人 所 述 测 定 促 孕作 用 (Muhn，P.，Krattenmacher，R.，Beier，S.，Elger，W.， 和 Schillinger，E.(1995).Drospirenone：a novel progestogen with antimineralocorticoid and antiandrogenic activity.Pharmacological characterization in animal models.Contraception 51，99-110)。
[0057] 这需要研究所述化合物在不再具有自身的孕酮合成的卵巢切除的动物中补偿孕酮缺乏和保持妊娠(妊娠保持)的能力。
[0058] 使重200-230克的雌性动物交配。在性交后(p.c.)第8天将这些动物切除卵巢，并用5μg/kg/d雌酮治疗。将不同浓度(3mg/kg/d、10mg/kg/d、30mg/kg/d)的测试化合物给药。在p.c.第8天开始治疗，并持续6天。
[0059] 评价：
[0060] 在最后治疗后1天，解剖所述动物。通过将活胎儿数除以可探测的着床位点(implantation site)数来计算妊娠保持的程度。存在心脏跳动对于评价胎儿是活的是决定性的。没有可确认的着床位点(卵巢切除的对照)被定义为0％妊娠保持。
[0061] 测定ED50(发生半数最大效应的浓度)为促孕效能的测量值。
[0062] 发现本发明化合物的促孕效能高达4倍于屈螺酮的促孕作用。
[0063]ED50
屈螺酮 10mg/kg/d
实施例1的化合物 2.9mg/kg/d
实施例2的化合物 3.4mg/kg/d
屈螺酮 10mg/kg/d
实施例1的化合物 2.9mg/kg/d
实施例2的化合物 3.4mg/kg/d
[0064] 表1：所述化合物在妊娠保持测试中的促孕作用。
[0065] 在卵巢切除的大鼠中的促孕作用，药代动力学数值与药效的相互关系
[0066] 为了更精确地描述它们的促孕效能的差异，在改变的妊娠保持试验中，另外在不同的时间采集血样以测定药代动力学参数。在这种情况下，如之前的实验所述对大鼠进行预处理。使用以下程序开发基于生理学的药代动力学模型：PK-SIM 4.0.1版(Bayer Technology Services，Leverkusen，Germany)、GastroPlus 5.2版(Simulations Plus，Inc.，Lancaster，CA，USA) 和 WinNonlin Professional(5.2 版，Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA)。
[0067] 发现在所述实验期间达到的AUC(时间-浓度曲线的曲线下面积)与测得的药理效应(即达到的妊娠保持)之间的关系。因此该模型允许对AUC50值的估算。
[0068] 发现屈螺酮和本发明的化合物在体内促孕效能上有统计学显著性差异，本发明化合物的AUC50值低6倍多。基于全身暴露量和效果的关系，计算在大鼠模型中达到80％妊娠保持所必需的血液中的AUC(表2)。
[0069]
[0070] 表2：达到妊娠保持所必需的暴露量(计算值)
[0071] 所述化合物在切除肾上腺的大鼠中的抗盐皮质激素作用(利尿实验)：
[0072] 如Losert等人(Losert，W.，Casals-Stenzel，J.和Buse，M.(1985).Progestogens with antimineralocorticoid activity.Arzneimittelforschung 35，459-471)所述测定所述化合物的抗盐皮质激素作用。
[0073] 在实验前5天将重180-200克的雄性动物切除肾上腺，并接受糖皮质激素替代。在切除肾上腺后第5天进行利尿实验。通过静脉内给药向所述动物连续输注等渗NaCl溶液和5％的葡萄糖。同时给药1μg/kg/h的d-醛固酮达到持续的盐皮质激素作用，其可以由钠潴留和尿钾增多确认。以不同剂量(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)皮下给药测试化合物，醛固酮诱发的钠潴留的消失表明抗盐皮质激素作用。
[0074] 评价：
[0075] 在代谢笼中饲养所述动物，并每小时收集尿液部分(urine fractions)。通过火焰光度法测量尿中的钠离子浓度和钾离子浓度，并由此计算Na/K比例。以该Na/K比例对时间作图，并测定曲线下面积[AUC]。测定ED50(发生半数最大效应的浓度)为抗盐皮质激素效能的测量值。
[0076] 发现本发明化合物的抗盐皮质激素活性为屈螺酮的约一半至约一样强。
[0077]ED50
屈螺酮 6.7mg/kg
实施例1的化合物 5.9mg/kg/d
实施例2的化合物 12.36mg/kg/d
屈螺酮 6.7mg/kg
实施例1的化合物 5.9mg/kg/d
实施例2的化合物 12.36mg/kg/d
[0078] 表3：所述化合物在利尿实验中的抗盐皮质激素作用。
[0079] 所述化合物在抗雄激素反式激活测定中的体外抗雄激素作用
[0080] 如 Schneider 等 人 (Schneider K.，Graf E.，Irran E.，Nicholson G.，Stainsby F.M.，Goodfellow M.，Borden S.A.Keller S.，Süssmuth R.D. 和 Fiedler H.P.(2008)Bendigoles A～C，New Steroids from G，ordonia australis Acta 2299，J.Antibiotics(Tokyo)61(6)，356-364)所述实现抗雄激素作用。
[0082] 在白色不透明的96孔组织培养板中以每孔4×104个细胞的密度培养报道细胞系(reporter cell line)(用人雄激素受体(hAR)以及包含受雄激素应答启动
子(androgen-responsive promoter，MMTV)控制的荧光素酶的报道构建体(reporter construct)稳定转染的PC3细胞)，并将其保持在含有3％DCC-FCS(用活性炭处理以除去存在于血清中的干扰组分的血清)的培养基中。在8小时后加入欲研究的化合物，并将所述细胞用所述化合物培养16小时。将该实验重复三次。在培养的最后除去含有效应物的培养基，并用裂解缓冲液(lysis buffer)替代。加入荧光素酶测定底物(Promega，#E1501)，然后将该96孔板插入微孔板光度计(microplate luminometer，Pherastar，BMG labtech)中，并测量发光。利用计算剂量-活性关系的软件评价IC50值。该效能表明该最大效应相对于抗雄激素参照(羟基氟他胺)的最大效应的百分比。
子(androgen-responsive promoter，MMTV)控制的荧光素酶的报道构建体(reporter construct)稳定转染的PC3细胞)，并将其保持在含有3％DCC-FCS(用活性炭处理以除去存在于血清中的干扰组分的血清)的培养基中。在8小时后加入欲研究的化合物，并将所述细胞用所述化合物培养16小时。将该实验重复三次。在培养的最后除去含有效应物的培养基，并用裂解缓冲液(lysis buffer)替代。加入荧光素酶测定底物(Promega，#E1501)，然后将该96孔板插入微孔板光度计(microplate luminometer，Pherastar，BMG labtech)中，并测量发光。利用计算剂量-活性关系的软件评价IC50值。该效能表明该最大效应相对于抗雄激素参照(羟基氟他胺)的最大效应的百分比。
[0083] 发现本发明化合物的体外抗雄激素活性比屈螺酮更弱。
[0084]IC50[μM] 效能
屈螺酮 0.12 40.3
实施例1的化合物 0.24 19.3
实施例2的化合物 0.16 31.9
屈螺酮 0.12 40.3
实施例1的化合物 0.24 19.3
实施例2的化合物 0.16 31.9
[0085] 表4：所述化合物在反式激活测定中的抗雄激素作用。
[0086] 所述化合物在睾丸切除大鼠中的抗雄激素作用(Hershberger)
[0087] 如Muhn等人(Muhn，P.，Krattenmacher，R.，Beier，S.，Elger，W.，和Schillinger，E.(1995).Drospirenone：a novel progestogen with antimineralocorticoid and antiandrogenic activity.Pharmacological characterization in animal models.Contraception 51，99-110)所述测定所述化合物的抗雄激素作用。这需要测试所述化合物在接受雄激素替代的青年雄性阉割大鼠中抑制前列腺、精囊和肛提肌的雄激素依赖性生长的适合性。
[0088] 为此目的，首先阉割青年大鼠。在睾丸切除后8天，使该动物经皮下接受单独的或与该测试物质(10mg/kg/day)组合的1mg/kg/天的丙酸睾酮(TP)7天。
[0089] 在睾丸切除后第15天，处死该动物，解剖前列腺、精囊和肛提肌，并测定相对湿重。抑制的雄激素诱发的生长作为该测试物质的抗雄激素作用的测量值。将该抗雄激素作用转化为抑制百分率，当前列腺重量对应于载体对照时为完全作用(full effect，100％抑制)，并且当前列腺重量对应于TP治疗时为0％抑制。
[0090]抗雄激素作用(抑制百分率)
屈螺酮 22.5％
实施例1的化合物 ＜0％
实施例2的化合物 3.8％
乙酸环丙孕酮 73.1％
屈螺酮 22.5％
实施例1的化合物 ＜0％
实施例2的化合物 3.8％
乙酸环丙孕酮 73.1％
[0091] 表5：所述化合物在睾丸切除大鼠中的抗雄激素作用
[0092] 与它们的临床特性一致，发现乙酸环丙孕酮表现出强抗雄激素作用，而屈螺酮表现出较小但是明显的抗雄激素作用。与其相反，发现本发明的化合物不表现抗雄激素作用。
[0093] 所述化合物在睾丸切除大鼠中的抗雄激素活性，基因表达研究
[0094] 作为上述Hershberger测定的改变，另外在首次治疗(1mg/kg TP，10mg/kg测试物质)后24小时内处死动物，并在解剖后立即急冻(shock-frozen)前列腺组织，然后用于mRNA分离。使用定量PCR方法(TaqMan)研究雄激素刺激的基因的诱导(x倍诱导因子)，尤其是作为TP的雄激素作用以及本发明化合物对其的抑制的测量的类固醇生物合成(例如IDI1，NM 004508.2)的诱导。将该抑制转化为抑制百分率，当诱导因子为1时为完全抑制(100％)，并且当诱导因子为TP的诱导因子时为0％抑制。
[0095]
[0096] TP＝丙酸睾酮；DRSP＝屈螺酮；CPA＝乙酸环丙孕酮
[0097] 表6：所述化合物的抗雄激素作用：基因表达的改变
[0098] 与它们的临床特性一致，发现乙酸环丙孕酮表现出强抗雄激素作用，而屈螺酮表现出较小但是明显的抗雄激素作用。与此相反，发现本发明的实施例1的化合物不表现抗雄激素作用。
[0099] 按照以下描述制备本发明的通式I的新化合物。路线1所示的新的C-环取代的孕甾-4-烯-21，17-羧内酯的合成路线以例如已知化合物1起始。[CAS：95218-07-8，Nickisch等人J.Med.Chem.1985，546-550]。9，11
[0100] 通过例如甲磺酰化和消除[Chamberlin等人J.Org.Chem.1960，295]引入Δ 双键得到化合物2(实施例1)。
[0101]
[0102] 路线1
[0103]
[0104] 路线2
[0105] 条件：a)赭曲霉菌(Aspergillus ochraceus)；b)CH3SO2Cl，吡啶，DMAP；c)NaOAc，AcOH，Ac2O；d)二溴二甲基乙内酰脲，HF-吡啶(70％)，二氯甲烷；e)Bu3SnH/AIBN/苯；f)2，2-二甲氧基丙烷，吡啶嗡-pTsOH；g)CH2＝CHCH2OPO(NMe2)2，n-BuLi，THF；h)1.N-甲基吡咯烷酮，NaOAc/H2O，二溴二甲基乙内酰脲，2.LiBr/Li2CO3；i)(CH3)3SO-I，DMSO，NaH。
[0106] 路线2显示另一制备本发明化合物的方法。
[0107] 在发酵罐中用微生物经微生物羟基化由已知的15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮[Wiechert等人，Chem.Ber.106，1973，888](4)得到(5)，所述微生物在该类固醇的
11位，特别是在11α位引起羟基化，例如梨头霉属(Absidia sp.)、支顶孢属(Acremonium sp.)、壳二孢属(Ascochyta sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、白僵菌属(Beauveria sp.)、球二孢属(Botryodipoldia sp.)、Caldariomyces sp.、丽赤壳属(Calonectria sp.)、毛盘孢属(Colletotrichum sp.)、弯孢霉属(Curvularia sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、盘长孢属(Gloeosporium sp.)、小丛壳属(Glomerella sp.)、日规壳属(Gnomonia sp.)、Haplosporella sp.、卷枝霉属(Helicostylum sp.)、长蠕孢属(Helminthosporium sp.)、绿僵菌属(Metarhizium sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、黑孢子菌属(Nigrospora sp.)、根霉菌属(Rhizopus sp.)、侧孢霉属(Sporotrichum sp.)、共头霉属(Syncephalastrum sp.)和Wojnowicia sp.。
11位，特别是在11α位引起羟基化，例如梨头霉属(Absidia sp.)、支顶孢属(Acremonium sp.)、壳二孢属(Ascochyta sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、白僵菌属(Beauveria sp.)、球二孢属(Botryodipoldia sp.)、Caldariomyces sp.、丽赤壳属(Calonectria sp.)、毛盘孢属(Colletotrichum sp.)、弯孢霉属(Curvularia sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、盘长孢属(Gloeosporium sp.)、小丛壳属(Glomerella sp.)、日规壳属(Gnomonia sp.)、Haplosporella sp.、卷枝霉属(Helicostylum sp.)、长蠕孢属(Helminthosporium sp.)、绿僵菌属(Metarhizium sp.)、毛霉菌属(Mucor sp.)、黑孢子菌属(Nigrospora sp.)、根霉菌属(Rhizopus sp.)、侧孢霉属(Sporotrichum sp.)、共头霉属(Syncephalastrum sp.)和Wojnowicia sp.。
[0108] 特别使用犁头霉菌(Absidia orchidis)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、直立顶孢霉(Acremonium strictum)、铁线莲壳二孢(Ascochyta clematidina)、洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、费舍尔曲霉(Aspergillus fischeri)、黄 曲 霉 (Aspergillus flavus)、Aspergillus malignus、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、赭曲霉菌、杂色曲霉(Aspergillus variecolor)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、巴西安白僵菌(Beauveria bassiana)、纤细白僵菌(Beauveria tenella)、Botryodiplodia malorum、Caldariomyces fumago、Calonectria decora、番茄炭疽病毛盘孢(Colletotrichum phomoides)、月状弯孢菌(Curvularia lunata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、围小丛壳菌(Glomerella cingulata)、果生盘长孢(Gloeosporium fructigehum)、Gloeosporium higgensianum、柿盘孢子菌(Gloeosporium kaki)、悦色盘长孢菌(Gloeosporium lacticolor)、油橄榄番茄炭疽病毛盘孢(Gloeosporium olivarum)、Glomerella fusaroides、Gnomonia cingulata、Haplosporella hesperedica、长 蠕 孢菌(Helminthosporium sp.)、梨形卷枝霉(Helicostylum pirforme)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、密丛毛霉(Mucor plumbeus)、刺状毛霉菌(Mucor spinosus)、球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)、无根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、科恩根霉(Rhizopus cohnii)、代氏根霉(Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、Rhizopus kazaensis、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、Rhizopus shanghaiensis、匍茎根霉菌(Rhizopus stolonifer)、小麦麯根霉(Rhizopus tritici)、Sporotrichum sulfurescens、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、Wojnowicia graminis和Wojnowicia hirta。
[0109] 特别使用犁头霉菌(ATCC 6647)、直立顶孢霉(NRRL 5759)、铁线莲壳二孢(CBS)、洋葱曲霉(ATCC 10060)、泡盛曲霉(CBS)、费舍尔曲霉(ATCC 1020)、Aspergillus malignus(IMI 16061)、蜂蜜曲霉(CBS)、构巢曲霉菌(ATCC 11267)、黑曲霉菌(ATCC9142、ATCC 11394)、赭曲霉菌(NRRL 405、NRRL 410、CBS 13252、ATCC 46504)、杂色曲霉(ATCC 10067)、巨大芽孢杆菌(ATCC 13368)、巴西安白僵菌(IFO 5838、ATCC 13144、IFO 4848、CBS 11025、CBS 12736、ATCC 7159)、Botryodiplodia malorum(CBS 13450)、Caldariomyces fumago(ATCC 16373)、Calonectria decora(ATCC 14767)、月状弯孢菌(IX 3、NRRL 2380)、腐皮镰刀菌(ATCC 12823)、尖孢镰刀菌(ATCC 7808)、玉米赤霉(CBS
4474)、围小丛壳菌(ATCC 12097、ATCC 10534、CBS 23849、CBS 23749、ATCC 16646、IFO
6459、IFO 6425、IFO 6470、ATCC 15093、ATCC 10529、IFO 5257、ATCC 56596、ATCC 64682)、Glomerella fusaroides(ATCC 9552)、Gnomonia cingulata(CBS 15226)、Haplosporella hesperedica(CBS 20837)、梨形卷枝霉(ATCC 8992)、长蠕孢菌(NRRL 4671)、金龟子绿僵菌(IFO 5940)、密丛毛霉(CBS 29563)、球黑孢菌(ATCC 12772)、无根根霉菌(ATCC
11145)、米根霉(ATCC 4858、ATCC 34102、CBS 32947)、匍茎根霉菌(ATCC 15441)、总状共头霉(IFO 4827)和Wojnowicia graminis(CBS 89168)。
4474)、围小丛壳菌(ATCC 12097、ATCC 10534、CBS 23849、CBS 23749、ATCC 16646、IFO
6459、IFO 6425、IFO 6470、ATCC 15093、ATCC 10529、IFO 5257、ATCC 56596、ATCC 64682)、Glomerella fusaroides(ATCC 9552)、Gnomonia cingulata(CBS 15226)、Haplosporella hesperedica(CBS 20837)、梨形卷枝霉(ATCC 8992)、长蠕孢菌(NRRL 4671)、金龟子绿僵菌(IFO 5940)、密丛毛霉(CBS 29563)、球黑孢菌(ATCC 12772)、无根根霉菌(ATCC
11145)、米根霉(ATCC 4858、ATCC 34102、CBS 32947)、匍茎根霉菌(ATCC 15441)、总状共头霉(IFO 4827)和Wojnowicia graminis(CBS 89168)。
[0110] 然后例如通过甲磺酰化和甲磺酸的碱性消除将11-羟基类固醇5转化为Δ9(11)衍生物7。例如可以通过已知方法(例如使用Olah’s试剂/N-溴琥珀酰亚胺[Olah等人，9(11)
Synthesis 1973，780])将所述Δ 双键溴氟化(bromofluorination)，来将后者转化为二酮8，然后通过(例如使用氢化三丁基锡)还原脱溴来将其转化为氟二酮9。在如二烯醇醚(dienol ether)10对4-烯-3-酮体系(9)进行保护之后，例如通过Sturtz[Synthesis
1980，289]方法或通过已知方法[Bittler Angew.i.e.21 1982，696；Laurent J.Steroid Biochem.19 1983，771]构建螺内酯。可以通过以下方法将化合物11转化为4，6-二烯-3-酮12：例如类似[J.A.Zderic，Humberto Carpio，A.Bowers and Carl Djerassi Steroids 1 1963，233]方法的二烯醇醚溴化，以及通过在非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮)中在50-120℃的温度下加热该6-溴代化合物与碱性试剂(例如LiBr或Li2CO3)或者通过在溶剂(例如三甲基吡啶(collidine)或二甲基吡啶(lutidine))中加热该6-溴代化合物来进行溴化氢消除。然后通过已知方法，例如使用二甲基氧化锍叶立德(dimethylsulphoxonium methylide)[参见例如DE-A1183500、DE-A2922500、EP-A0019690、US-A4,291,029；E.J.Corey und M.Chaykovsky，J.Am.Chem.Soc.84 1962，
6
867]经Δ 双键的亚甲基化(methenylation)将化合物12转化为化合物13，得到α和β异构体的混合物(该比例取决于所用的底物，通常β异构体占明显优势)，可以通过例如色谱法将该混合物分离为单独的异构体。还可以如路线3所示引入11-氟取代基，例如从11-羟基4-烯二酮5起始，通过在有机溶剂(例如四氢呋喃)中与全氟正丁基磺酰氟(nonaflyl fluoride)和DUB反应[参见例如Bennua-Skalmowski，Tet.Lett.1995，2611]
9(11)
以形成上述11-氟类固醇9和同样上述Δ 衍生物7的混合物，可以通过色谱法将该混合物分离为单独的化合物，并随后如上所述进一步反应。
Synthesis 1973，780])将所述Δ 双键溴氟化(bromofluorination)，来将后者转化为二酮8，然后通过(例如使用氢化三丁基锡)还原脱溴来将其转化为氟二酮9。在如二烯醇醚(dienol ether)10对4-烯-3-酮体系(9)进行保护之后，例如通过Sturtz[Synthesis
1980，289]方法或通过已知方法[Bittler Angew.i.e.21 1982，696；Laurent J.Steroid Biochem.19 1983，771]构建螺内酯。可以通过以下方法将化合物11转化为4，6-二烯-3-酮12：例如类似[J.A.Zderic，Humberto Carpio，A.Bowers and Carl Djerassi Steroids 1 1963，233]方法的二烯醇醚溴化，以及通过在非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮)中在50-120℃的温度下加热该6-溴代化合物与碱性试剂(例如LiBr或Li2CO3)或者通过在溶剂(例如三甲基吡啶(collidine)或二甲基吡啶(lutidine))中加热该6-溴代化合物来进行溴化氢消除。然后通过已知方法，例如使用二甲基氧化锍叶立德(dimethylsulphoxonium methylide)[参见例如DE-A1183500、DE-A2922500、EP-A0019690、US-A4,291,029；E.J.Corey und M.Chaykovsky，J.Am.Chem.Soc.84 1962，
6
867]经Δ 双键的亚甲基化(methenylation)将化合物12转化为化合物13，得到α和β异构体的混合物(该比例取决于所用的底物，通常β异构体占明显优势)，可以通过例如色谱法将该混合物分离为单独的异构体。还可以如路线3所示引入11-氟取代基，例如从11-羟基4-烯二酮5起始，通过在有机溶剂(例如四氢呋喃)中与全氟正丁基磺酰氟(nonaflyl fluoride)和DUB反应[参见例如Bennua-Skalmowski，Tet.Lett.1995，2611]
9(11)
以形成上述11-氟类固醇9和同样上述Δ 衍生物7的混合物，可以通过色谱法将该混合物分离为单独的化合物，并随后如上所述进一步反应。
[0111]
[0112] 路线3
[0113] 条件：c’/e’)NfF，DBU，THF；d-i)参见路线2。
[0114]
[0115] 路线4
[0116] 所有的反应条件参见路线2(R＝甲基，甲苯基)
[0117] 可以从11-羟基类固醇5起始，通过上述方法在5步内制备4，6-二烯-3-酮18，随后由该化合物18通过6，7双键的亚甲基化(参见上述)得到本发明的化合物2。
[0118] 还可以从4-烯-3-酮7起始，通过上述方法在3步内得到4，6-二烯-3-酮18。
[0119] 式5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、19和20的中间体化合物全部是新化合物。因此本发明涉及所有这些化合物。
[0120] 本发明还另外涉及其作为起始化合物和中间体在制备本发明的通式I的化合物中的用途。
[0121] 以下的实施例用于更详细地说明本发明：
[0122] 实施例1
[0123] 6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯
[0124] a)6β，7β；15β，16β- 二 亚 甲 基-11α-甲 磺 酰 氧 基-3- 氧 代-17- 孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯
[0125]
[0126] 在0℃下将21.7ml的甲磺酰氯逐滴加入到25g的6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11α-羟基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯[CAS：95218-07-8，Nickisch等人，J.Med.Chem.1985，546-550]在250ml吡啶中的溶液中，并将混合物在25℃下搅拌2小时。然后用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。得到30克作为固体的纯6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11α-甲磺酰氧基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯。
[0127] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ ＝ 6.01(s，1H)，5.46(d(br)，1H)，2.69-2.61(m，2H)，2.56-2.46(m，3H)，2.39(m，1H)，2.27(d(br)，1H)，2.19-2.13(m，2H)，1.89(m，1H)，
1.81(dd(br)，1H)，1.72(m，1H)，1.67(m，1H)，1.52-1.45(m，2H)，1.37(m，1H)，1.31(m，1H)，
1.28(s，3H)，1.06(m，1H)，0.94(s，3H)，0.58(m，1H)。
1.81(dd(br)，1H)，1.72(m，1H)，1.67(m，1H)，1.52-1.45(m，2H)，1.37(m，1H)，1.31(m，1H)，
1.28(s，3H)，1.06(m，1H)，0.94(s，3H)，0.58(m，1H)。
[0128] b)6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯
[0129]
[0130] 在25℃下将0.5ml的乙酸酐加入到18.5g的6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11α-甲磺酰氧基-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯在50ml乙酸中的溶液中，并将混合物在100℃的浴温度下搅拌8小时。然后将其加入到水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。得到15.2克的粗品6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯。使用己烷/乙酸乙酯经硅胶色谱得到7.5克的纯固体产物。
[0131] MS(EI)：m/z＝364(M+)；
[0132] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ ＝ 6.07(s，1H)，4.96(m，1H)，2.97(s，3H)，2.75-2.51(m，3H)，2.47-2.31(m，3H)，2.22-1.84(m，5H)，1.77-1.41(m，8H)，1.32-1.23(m，
2H)，1.03(s，3H)，0.84(m，1H)。
2H)，1.03(s，3H)，0.84(m，1H)。
[0133] 实施例2
[0134] 6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯
[0135] a)11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0136]
[0137] 用2ml的赭曲霉菌(NRRL 405)菌株的DMSO-冰培养物接种含有1L已在高压釜中在121℃下杀菌30分钟的营养液(调节至pH 6.0)的2L锥形烧瓶，所述营养液含有3％的一水合葡萄糖、1％的玉米浆、0.2％的硝酸钠、0.1％的磷酸二氢钾、0.2％的磷酸氢二钾、0.05％的氯化钾、0.05％的七水合硫酸镁以及0.002％的七水合硫酸亚铁，并在27℃下在旋转摇床上以165转每分振摇71.5小时。用该预培养物接种含有19L无菌培养基的20L发酵罐，所述培养基的最终组成与预培养物所述的相同。此外，在杀菌之前，还加入1.0ml的硅油和1.0ml用于控制泡沫的Synperonic。在0.7bar的超大气压和28℃的温度下，以每分钟8L的曝气量和350转每分的搅拌速度将该发酵罐培养47.5小时。
[0138] 将2.5L的预培养物从该20L发酵罐中移出，以供接种含有47.5L无菌培养基的50L发酵罐，所述培养基的最终组成与预培养物所述的相同。加入2.5ml的硅油和2.5ml的Synperonic，然后杀菌。在0.7bar的超大气压和28℃的温度下，以每分钟10L的曝气量和
350转每分的搅拌速度经历最初生长期10小时，然后加入10.0g的15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在200ml DMF中的溶液。在曝气下持续搅拌。在26小时后收集培养液。
350转每分的搅拌速度经历最初生长期10小时，然后加入10.0g的15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在200ml DMF中的溶液。在曝气下持续搅拌。在26小时后收集培养液。
[0139] 将5.0L的预培养物从该20L发酵罐中移出，以供接种含有95.0L无菌培养基的100L发酵罐，所述培养基的最终组成与预培养物所述的相同。加入5.0ml的硅油和5.0ml的Synperonic，然后杀菌。在0.7bar的超大气压和28℃的温度下，以每分钟20L的曝气量和350转每分的搅拌速度经历最初生长期10小时，然后加入20.0g的15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在400ml DMF中的溶液。在曝气下持续搅拌。在26.25小时后收集培养液。
[0140] 合并这两种培养液，并用60L的甲基异丁酮萃取19.75小时。将合并的有机相浓缩至干燥。用己烷洗涤残留物以除去硅油。然后将产物从丙酮中结晶，并将19.2g(理论值的61％)的11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮分离。
[0141] 通过制备HPLC(250×40mm，Luna C18，10μ，100A，水-乙腈70∶30，100ml/min)纯化100mg。
[0142] M.p.：225/247-249℃
[0143] [α]D＝+48.6°(CHCl3，c＝1.0700)
[0144] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ ＝ 1.04(s，3H)，1.13-1.37(m，8H)，1.62(dt，1H)，1.77-1.91(m，2H)，1.99(m，1H)，2.03-2.21(m，4H)，2.31-2.57(m，5H)，4.05(m，1H)，5.78(s，
1H)。
1H)。
[0145] b)11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0146]
[0147] 在0℃下将23ml的甲磺酰氯逐滴加入到22g的11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在220ml吡啶中的溶液中，并将混合物在25℃下搅拌2小时。然后用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。得到24.7g的11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮。
[0148] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ ＝ 5.81(m，1H)，5.09(m，1H)，1.39(s，3H)，1.21(m，1H)1.06(s，3H)。
[0149] c)15β，16β-亚甲基雄甾-4，9(11)-二烯-3，17-二酮
[0150]
[0151] 在25℃下将0.82ml的乙酸酐加入到25.6g的11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在80ml乙酸中的溶液中，并将混合物在100℃的浴温度下搅拌8小时。然后将其加入到水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。从乙酸乙酯中结晶得到16.4g的15β，16β-亚甲基雄甾-4，9(11)-二烯-3，17-二酮。
[0152] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.79(m，1H)，5.55(m，1H)，1.85(m，1H)，1.65(m，1H)，1.37(s，3H)，1.12-1.33(2m，2H)，1.00(s，3H)。
[0153] d)9α-溴-11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0154]
[0155] 将24.5ml的70％浓度的HF/吡啶缓慢加入到8.76g的二溴乙内酰脲在250ml二氯甲烷中的悬浮液在。将16.3g的15β，16β-亚甲基雄甾-4，9(11)-二烯-3，17-二酮引入得到的溶液中，并在室温下搅拌30分钟。然后将其倒入200ml氨水(25％)和300ml冰的混合物中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。将残留物从乙酸乙酯中结晶得到15.2g的9α-溴-11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮。
[0156] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ ＝ 5.81(m，1H)5.28(dt，1H)，1.695(d，3H)，1.175(d，3H)。
[0157] e)11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0158]
[0159] 在80℃下将33.5g的9α-溴-11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在480ml苯中的溶液与42ml的氢化三丁基锡和416mg的偶氮二异丁腈搅拌30分钟。将混合物真空浓缩，并使残留物经硅胶60色谱层析。从乙酸乙酯中结晶得到18.7g的
11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮。
11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮。
[0160] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.73(m，1H)，5.28(dq，1H)，1.395(d，3H)，1.175(d，3H)。
[0161] f)11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮
[0162]
[0163] 将1.3g的吡啶甲苯磺酸盐(pyridine tosylate)引入10.79g的11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在220ml的2，2-二甲氧基丙烷中的悬浮液中。然后在100℃的浴温度下搅拌3小时。在冷却至室温后，加入2.5ml的三乙胺，并将混合物真空浓缩至干燥。用30ml甲烷搅拌残留物，并抽滤。得到9.6g的11β-氟-3-甲氧基-15β，
16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
[0164] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ ＝ 5.27-5.19(m，1.5H)，5.14(m，1H)，5.08(q，0.5H)，3.60(s，3H)，1.17(m，6H)。
[0165] g)11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5-二烯-21，17β-羧内酯
[0166]
[0167] 在-50℃下将溶解于30ml四氢呋喃中的14g的四甲基二氨基磷酸烯丙酯(tetramethylphosphorodiamidate)逐滴加入到91ml的1.6M丁基锂溶液(在己烷中)中。
在-20℃下搅拌30分钟，然后引入22ml的N，N，N，N-四甲基乙二胺，并将混合物升温至室温。加入15g的11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮在80ml四氢呋喃中的溶液，并将混合物在室温下搅拌4小时。然后加入饱和氯化铵水溶液，并倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。
从乙酸乙酯中结晶得到15.8g的11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，
5-二烯-21，17β-羧内酯。
在-20℃下搅拌30分钟，然后引入22ml的N，N，N，N-四甲基乙二胺，并将混合物升温至室温。加入15g的11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮在80ml四氢呋喃中的溶液，并将混合物在室温下搅拌4小时。然后加入饱和氯化铵水溶液，并倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。
从乙酸乙酯中结晶得到15.8g的11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，
5-二烯-21，17β-羧内酯。
[0168] 1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ ＝ 5.28-5.22(m，1.5H)5.17(m，1H)，5.09(q，0.5H)，3.63(s，3H)，1.20(m，6H)，0.53(m，1H)。
[0169] h)11β-氟-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯[0170]
[0171] 在0℃下将14.5ml的10％浓度的乙酸钠溶液和5.11g的1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲依次分批加入到13.5g的11β-氟-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5-二烯-21，17β-羧内酯在150ml的1-甲基-2-吡咯烷酮中的悬浮液中。然后将混合物在
0℃(冰浴)下搅拌0.5小时，并加入4.86g的溴化锂和4.27g的碳酸锂，然后在100℃的浴温度下搅拌3.5小时。将其倒入冰-水/氯化钠中，将沉淀过滤。经硅胶60色谱(用己烷/乙酸乙酯 1∶1洗脱)层析得到9.1g的11β-氟-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯。1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝6.41(m，1H)，6.22(m，1H)，
5.68(s，1H)，5.11(dq，1H)，1.31(d，3H)，1.21(d，3H)，0.60(m，1H)。
0℃(冰浴)下搅拌0.5小时，并加入4.86g的溴化锂和4.27g的碳酸锂，然后在100℃的浴温度下搅拌3.5小时。将其倒入冰-水/氯化钠中，将沉淀过滤。经硅胶60色谱(用己烷/乙酸乙酯 1∶1洗脱)层析得到9.1g的11β-氟-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯。1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝6.41(m，1H)，6.22(m，1H)，
5.68(s，1H)，5.11(dq，1H)，1.31(d，3H)，1.21(d，3H)，0.60(m，1H)。
[0172] i)6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯
[0173]
[0174] 在室温下将2.39g的氢化钠(60％，在矿物油中)分批加入到13.41g的三甲基碘化亚砜在250ml干燥DMSO中的溶液中，并且在添加完成后，将混合物在室温下搅拌3小时。然后引入8.38g的11β-氟-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯，并将混合物在室温下搅拌6小时。然后倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并在40℃下真空浓缩。经硅胶60色谱(用己烷和乙酸乙酯 1∶4洗脱)纯化。得到2.6克的6β，7β；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯作为组分A。
[0175] MS(EI)：m/z＝384(M+)，349，273，260；
[0176] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ ＝ 5.99(s，1H)，5.07(d(br)，1H)，2.69-2.61(m，2H)，2.53(m，1H)，2.43(d(br)，1H)，2.35(m，1H)，2.27(m，1H)，2.17-2.10(m，2H)，2.02-1.95(m，
2H)，1.83(m，1H)，1.68-1.62(m，2H)，1.61-1.52(m，2H)，1.49(m，1H)，1.40(m，1H)，1.29(d，
3H)，1.25(m，1H)，1.21(m，1H)，1.15(d，3H)，1.04(m，1H)，0.59(m，1H)。
2H)，1.83(m，1H)，1.68-1.62(m，2H)，1.61-1.52(m，2H)，1.49(m，1H)，1.40(m，1H)，1.29(d，
3H)，1.25(m，1H)，1.21(m，1H)，1.15(d，3H)，1.04(m，1H)，0.59(m，1H)。
[0177] 用于合成实施例2的替换方法：
[0178] c’)15β，16β-亚甲基雄甾-4，9(11)-二烯-3，17-二酮和e’)11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮
[0179]
[0180] 在0℃下将0.47ml的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1.5-5)逐滴加入到630mg的11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在16ml四氢呋喃中的溶液中，其滴加方式使得内部温度不超过5℃。然后将混合物在0℃下搅拌30分钟，逐滴加入0.55ml的全氟丁烷-1-磺酰氟，其滴加方式使得内部温度不超过5℃，并将混合物在0℃下进一步搅拌1.5小时。然后用乙酸乙酯稀释，用2M硫酸、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，用硫酸钠干燥，并在40C下真空浓缩。通过硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脱之后得到15β，16β-亚甲基-雄甾-4，9(11)-二烯-3，17-二酮作为组分1。
[0181] 1H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.79(m，1H)，5.55(m，1H)，1.85(m，1H)，1.65(m，1H)，1.37(s，3H)，1.12-1.33(2m，2H)，1.00(s，3H)。
[0182] 分离11β-氟-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮作为组分2。1
H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.73(m，1H)，5.28(dq，1H)，1.395(d，3H)，1.175(d，3H)。
H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.73(m，1H)，5.28(dq，1H)，1.395(d，3H)，1.175(d，3H)。
[0183] 实施例3
[0184] 6α，7α；15β，16β-二亚甲基-11β-氟-3-氧代-17-孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯：
[0185]
[0186] 得 到0.37g的6α，7α；15β，16β-二 亚 甲 基-11β- 氟-3-氧 代-17- 孕甾-4-烯-21，17β-羧内酯作为实施例2的组分B。+
[0187] MS(EI)：m/z＝384(M)；1
[0188] H-NMR(600MHz，CDCl3)：δ＝5.94(s，1H)，5.08(d(br)，1H)，1.35(s，3H)，1.25(m，1H)，1.21(m，1H)，1.20(d，3H)，1.00(m，1H)，0.76(ddd，1H)，0.54(m，1H)0.48(m，1H)。
[0189] 用于合成实施例1的替换方法：
[0190] 第一变体
[0191] a.11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮
[0192]
[0193] 将3.2g的吡啶甲苯磺酸盐引入27g的11α-羟基-15β，16β-亚甲基雄甾-4-烯-3，17-二酮在422ml的2，2-二甲氧基丙烷中的悬浮液中。然后将混合物在100℃的浴温度下搅拌18小时。冷却至室温，然后加入10ml的三乙胺，并真空浓缩至干燥。用
60ml的甲烷搅拌残留物，并抽滤。得到14.3g的11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
60ml的甲烷搅拌残留物，并抽滤。得到14.3g的11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
[0194] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝5.33(d，宽峰，J＝3.8Hz，1H)，5.14(s，宽峰，1H)，4.07(m，1H)，3.58(s，3H)，1.79(m，1H)，1.13(s，3H)，1.02(s，3H)。
[0195] b)11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5-二烯-21，17β-羧内酯
[0196]
[0197] 在-50℃下将溶解于13ml四氢呋喃中的10.24g的四甲基二氨基磷酸烯丙酯逐滴加入到66.6ml的1.6M丁基锂溶液(在己烷中)中。在-20℃下搅拌30分钟。然后引入16ml的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，然后逐滴加入5g的11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5-二烯-17-酮在33.5ml四氢呋喃中的溶液。将混合物升温至室温，然后搅拌30分钟。然后加入25ml饱和氯化铵水溶液，倒入水中，用乙酸乙酯萃取3次，用水和盐水洗涤至中性，用硫酸钠干燥，并真空浓缩。从二异丙基醚中结晶得到2.85g的
11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5-二烯-21，17β-羧内酯。
11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5-二烯-21，17β-羧内酯。
[0198] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝5.31(d，宽峰，J＝4.0Hz，1H)，5.14(s，宽峰，1H)，4.06(m，1H)，3.58(s，3H)，1.14(s，3H)，1.02(s，3H)，0.46(m，1H)。
[0199] c)11α-羟基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯
[0200]
[0201] 在0℃下将14.8ml的10％浓度的乙酸钠溶液和4g的1，3-二溴-5，5-二甲基-乙内酰脲依次分批加入到13.5g的11α-羟基-3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5，9(11)-三烯-21，17β-羧内酯在144ml的1-甲基-2-吡咯烷酮中的悬浮液中。然后将混合物在0℃(冰浴)下搅拌0.5小时，并加入4.88g的溴化锂和4.31g的碳酸锂，然后在
80℃的浴温度下搅拌3小时。然后将其倒入冰冷的饱和氯化钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取，用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，用硫酸钠干燥并过滤，并浓缩滤液至干燥。得到
12.8g的11α-羟基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯作为粗产品。将样品用己烷和乙酸乙酯的混合物经硅胶色谱层析以供分析目的。
80℃的浴温度下搅拌3小时。然后将其倒入冰冷的饱和氯化钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取，用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，用硫酸钠干燥并过滤，并浓缩滤液至干燥。得到
12.8g的11α-羟基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯作为粗产品。将样品用己烷和乙酸乙酯的混合物经硅胶色谱层析以供分析目的。
[0202] 1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.34(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，6.20(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，5.71(s，宽峰，1H)，4.05(m，1H)，1.95(m，1H)，1.85(m，1H)，1.29(m，1H)，1.25(s，
3H)，1.09(s，3H)，0.57(m，1H)。
3H)，1.09(s，3H)，0.57(m，1H)。
[0203] d)11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯
[0204]
[0205] 将12.8g的11α-羟基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯溶于113ml吡啶中。然后逐滴加入10.91ml的甲磺酰氯。将混合物在室温下搅拌90分钟，并倒入1.5L的冰水中。搅拌2小时，然后抽滤，然后干燥滤饼，并用己烷和乙酸乙酯的混合物进行硅胶色谱层析。得到5.4g的11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯。
1
1
[0206] H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.33(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，6.23(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，5.74(s，宽峰，1H)，5.10(m，1H)，3.01(s，3H)，1.56(m，1H)，1.45(m，1H)，1.30(s，
3H)，1.14(s，3H)，0.59(m，1H)。
3H)，1.14(s，3H)，0.59(m，1H)。
[0207] e)15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6，9(11)-三烯-21，17β-羧内酯[0208]
[0209] 在90℃下搅拌14.8ml的乙酸、0.16ml的乙酸酐和2.44g的乙酸钠直至乙酸钠溶解。将5.3g的11α-甲磺酰氧基-15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6-二烯-21，17β-羧内酯加入到该溶液中。在100℃下搅拌5小时，然后将其倒入冰水中，并用乙酸乙酯萃取3次。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，用硫酸镁干燥，然后过滤，并浓缩滤液。用己烷和乙酸乙酯的混合物经硅胶色谱层析得到2.12g的15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6，9(11)-三烯-21，17β-羧内酯。
[0210] 1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ＝6.36(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，6.24(d，宽峰，J＝9.6Hz，1H)，5.72(s，宽峰，1H)，5.48(m，1H)，3.09(d，宽峰，J＝11.7Hz，1H)，1.84(m，1H)，
1.47(m，1H)，1.38(m，1H)，1.32(s，3H)，1.03(s，3H)，0.59(m，1H)。
1.47(m，1H)，1.38(m，1H)，1.32(s，3H)，1.03(s，3H)，0.59(m，1H)。
[0211] f)6β，7β；15β，16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯
[0212]
[0213] 在室温下将0.09g的氢化钠(60％，在矿物油中)分批加入到0.52g的三甲基碘化亚砜在4ml干燥DMSO中的溶液中，并在添加完成后，将混合物在室温下搅拌2小时。然后在0℃下引入0.2g的15β，16β-亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，6，9(11)-三烯-21，17β-羧内酯，并将混合物在室温下搅拌2.5小时。然后将混合物搅拌入100ml硫酸(8体积％)中，并用乙酸乙酯萃取。依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤有机相，用硫酸钠干燥并过滤。真空浓缩，并用由乙酸乙酯和己烷组成的洗脱剂经硅胶色谱层析得到30mg的6β，7β；15β，
16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯。
16β-二亚甲基-3-氧代-17-孕甾-4，9(11)-二烯-21，17β-羧内酯。
[0214] 对于光谱数据，参见实施例1b。
[0215] 第二变体
[0216] a.3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5，9(11)-三烯-17-酮
[0217]
[0218] 将0.8g的吡啶甲苯磺酸盐引入6.4g的15β，16β-亚甲基雄甾-4，6，9(11)-三烯-3，17-二酮在106ml的2，2-二甲氧基丙烷的悬浮液中。将混合物在100℃的浴温度下搅拌6小时。冷却至室温，然后加入5ml吡啶，并在5分钟后真空浓缩至干燥。用130ml甲醇搅拌残留物，并抽滤。得到4.15g的3-甲氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-3，5，9(11)-三烯-17-酮。1
[0219] H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝5.47(s，宽峰，1H)，5.33(s，宽峰，1H)，5.19(s，宽峰，1H)，3.59(s，3H)，2.70(m，2H)，2.38(m，1H)，1.83(m，1H)，1.66(m，1H)，1.15(s，3H)，0.99(s，
3H)。
3H)。
[0220] b)3-甲氧基-15β，16β-亚甲基-17-孕甾-3，5，9(11)-三烯-21，17β-羧内酯[0221]
[0222] 在-50℃下将溶解于11.4ml四氢呋喃的6.51g的四甲基二氨基磷酸烯丙酯逐滴加入到42.2ml的1.6M丁基锂溶液(在己烷中)中。在-20℃下搅拌30分钟，引入10.21ml
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