交联透明质酸的方法，制备可注射水凝胶的方法，得到的水凝胶，得到的水凝胶的用途
阅读：772发布：2020-07-09
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1.一种用于交联透明质酸或它的一种盐，和任选的其他生物相容的聚合物的方法，特征在于其包含至少如下步骤：
a)制备部分交联的透明质酸，和任选的其他生物相容的聚合物的第一水相，特征在于：
–将透明质酸或其一种盐和任选的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中以得到透明质酸浓度C1，
–添加Q1的量的交联剂，
–通过控制交联反应的温度T1和持续时间t1得到部分交联的透明质酸，
其中所制备的部分交联的透明质酸的第一水相不转化为颗粒，
b)制备部分交联的透明质酸和任选的其他生物相容的聚合物的至少一种第二水相，特征在于：
-将透明质酸或其一种盐和任选的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中以得到透明质酸浓度C2，
–添加Q2的量的交联剂，
–通过控制交联反应的温度T2和持续时间t2得到部分交联的透明质酸，其中所制备的部分交联的透明质酸的至少一种第二水相不转化为颗粒，
c)将至少一种第二部分交联的透明质酸相添加至第一相中，然后通过任选地添加额外的Qm量的交联剂产生所述至少两相的混合物，
d)通过控制交联反应的温度Tm和持续时间tm继续进行预先形成的混合物的交联。
其中在所述交联方法的步骤a、b、c和d中，所述交联方法不包括加入交联的透明质酸颗粒或其一种盐或任何其他聚合物。
2.根据权利要求1所述的方法，特征在于第二部分交联的透明质酸水相具有比第一部分交联的透明质酸水相更高的部分交联度，和/或在于所述透明质酸浓度C2大于或等于所述浓度C1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，特征在于交联剂的量Q2大于或等于量Q1，和/或在于交联温度T2大于或等于温度T1且交联温度Tm大于温度T2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，特征在于交联持续时间t2大于或等于持续时间t1，和/或在于第一和第二部分交联的透明质酸水相在混合物中各自的质量相同或不同。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，特征在于，通过用水溶液稀释和/或通过实施由透析实现的纯化移除未反应的交联剂来停止混合物的交联。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，特征在于，通过一种或多种多官能交联剂的作用实施交联反应，所述多官能交联剂例如选自由二或多官能的环氧化物、二乙烯基砜、碳二亚胺和甲醛组成的组，特别在于通过交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)的作用实施交联反应。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，特征在于，透明质酸的盐为透明质酸的钠、钙、锌或钾盐。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，特征在于，透明质酸或其一种盐具有0.1至4百万Da的分子量。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，特征在于，所述透明质酸可为透明质酸的衍生物，即，由通过化学途径或通过任何其他途径改性透明质酸分子得到的分子。
10.制备可注射水凝胶的方法，特征在于其包含至少如下连续步骤：
-交联根据权利要求1-9任一项所述的透明质酸或它的一种盐和任选的其他生物相容聚合物，
-使用具有合适pH的等渗溶液纯化所述混合物，
-均质化所述混合物，任选地添加一种或数种其他生物相容聚合物和/或一种或数种可对生物体提供益处的物质例如活性物质，
-任选地脱气和/或冷冻干燥，
-在注射器或烧瓶或任何其他密封容器中调制(conditioning)，和
-灭菌。
11.根据权利要求10得到的水凝胶，其由至少交联的透明质酸或它的一种盐和任选的其他生物相容聚合物组成，特征在于具有不同交联度的数个交联透明质酸相的混合物，所述相通过共价键彼此连接，其中透明质酸或其一种盐的总浓度为例如0.01-50mg/ml。
12.根据权利要求11所述的水凝胶，特征在于其包含一种或数种具有或不具有药理作用的活性物质，例如抗氧化剂、抗炎剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗癌剂、蛋白质、激素、局部麻醉剂、生物实体，单独或作为组合。
13.根据权利要求11或12所述的水凝胶，特征在于其包含分散在其交联的基质内的利多卡因，和/或在于其包含一种或数种分散在所述交联的基质中的矿物质。
14.一种试剂盒，其包含在无菌注射器中调制的根据权利要求11-13任一项所述的水凝胶。
15.根据权利要求11-13任一项所述的水凝胶的用途，用于制备用于美学或治疗应用的组合物，或用于配制用于改善皮肤质量或填充皱纹或恢复面部或身体体积的皮内或皮下可植入式组合物，用于配制化妆品或药用化妆品组合物，用于配制局部或眼内组合物，用于眼科学应用中，用于配制用于牙齿应用的局部或可植入式组合物，用于用于矫形外科学或风湿病学的关节内组合物，用于配制用于大便失禁的治疗的应用中的泌尿学可植入式组合物，用于配置在治疗纤维变性或改善伤口愈合范围内的医学或通常的手术中使用的局部或可植入式组合物，用于配置允许对于不同医学应用的活性物质的延迟和/或受控释放的局部或可植入式药物组合物。
交联透明质酸的方法，制备可注射水凝胶的方法，得到的水
凝胶，得到的水凝胶的用途
[0001] 本发明的目的是：
[0004] -根据所述交联方法得到的水凝胶，和
[0005] -根据所述交联方法得到的水凝胶在美学和医学领域中的用途。
[0006] 透明质酸是通过由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺(N-actetyl glucosamine)。结构是线性的且不具有任何物种特异性。透明质酸广泛分布在人和动物生物体内，在其中它实现了许多生物学功能，例如水合作用水平的控制或流体或组织粘弹性的维持。尤其是发现它在眼睛的滑液流体、玻璃体和在真皮中有高浓度。一个70千克的人大约有15克透明质酸，其中一半是含在皮肤中且该量随着年龄增长而下降。
[0007] 透明质酸凝胶是已知的且已被用在美学和医学的广泛领域许多年的。这些凝胶尤其通常被注入：
[0008] -眼睛，在眼科手术中，以维持眼内空间和保护眼的组织，
[0009] -连接点，在关节的情况下，用于补充不充足的滑膜液和暂时恢复所述生物流体的软骨保护性能，
[0010] -注入或在皮肤下，以填充皱纹或增加脸部或身体的某些区域的体积。
[0011] 透明质酸在生物体内半衰期短(小于1周)。在美学和医学的许多应用的情况下，所施用的可注射水凝胶包含通过交联稳定的透明质酸，所述交联给出显著增加该多糖在体内的寿命(也称为存在期)并因此增加所注射产品效果的持续时间的可能性。因此，借助于通过交联的该修饰，基于交联的透明质酸的水凝胶具有例如在数月的时间内填充皱纹的能力。
[0012] 为了提高基于透明质酸的可注射水凝胶的体内存在期，本领域技术人员意识到他/她可增加透明质酸的交联度；但这种分子修饰使凝胶的粘度增加并因此使将其通过针挤出和后续将该凝胶注射入执业医生所希望的区域。这必然意味着：
[0013] -或者限制透明质酸的交联度并因此凝胶在体内的存在期，目的是具有保持满意的推顶力，
[0015] 已经提出了许多解决方案用于克服该问题，工作者力图提供具有合适存在期和黏度性能并因此通过针挤出凝胶的令人满意水平的可注射制剂。提议可由如下实例组成：
[0017] -基于含不同交联成分(crosslinking identities)的交联透明质酸的制剂，来自申请WO 2005/085329中描述的特定的制备方法。
[0018] -基于交联透明质酸的制剂，含不彼此交联即不通过共价键彼此连接的交联凝胶混合物；这些制剂根据在FR 2924615中描述的特定的制备方法得到，和
[0019] -基于交联透明质酸的制剂，由与交联的透明质酸基质交联在一起的交联的透明质酸颗粒组成；这些制剂根据申请EP 2011816或申请US 2010/0028435制备。
[0020] 然而，这些解决方案并不完全令人满意。
[0021] 申请WO 97/04012描述了一种特定的制备方法，给出得到基于颗粒形式的多糖(其可为透明质酸)的可能性。基于交联的透明质酸的颗粒凝胶，在文献中也被称为“双相凝胶”，其特征是存在分散在非交联的透明质酸溶液中的直径约200微米至大于1000微米的颗粒，这给出有助于通过润滑现象促进喷射的可能性。这些凝胶不完全令人满意，因为通过针挤出凝胶是不规则的，特别是具有含大直径颗粒的产品；其中起载体作用的基于非解交联透明质酸的溶液在体内被迅速再吸收，这涉及所需效果的至少部分损失(特别是在注射致力于产生体积的产品后接下来的数天内的填充损失)；并且最后相比较于基于不含任何颗粒——其促进对外来体的响应和/或在治疗区域的机械作用下产生这些粒子迁移——的透明质酸的凝胶，产品的安全性不太好(即更高水平的副效应)。
[0022] 申请WO 2005/0853描述了一种特定的制备方法，其特征在于引发确定量的至少一种聚合物(可为透明质酸)交联的步骤，和然后通过在具有反应混合物稀释物的溶液中添加额外量的分子量大于500,000Da的聚合物(可为透明质酸)以降低聚合物在溶液中的整体浓度同时使交联反应继续。此溶液不给予有效交联透明质酸的可能性。确实，额外量的聚合物添加伴随着稀释并因此降低反应混合物的透明质酸浓度。透明质酸链和交联剂之间接触的概率因此下降且交联反应不是很有效。
[0023] 申请FR 2924615描述了一种制备方法，特征在于相同或不同的在混合前交联的x聚合物(其可能是透明质酸)的均匀混合物。混合是指x聚合物的并置而不在后者间产生共价键。该解决方案不完全令人满意，因为聚合物不相互结合并因此由此获得的凝胶可在注射区域内分离，特别是在其中非常显著的机械应力的作用下。例如，可提及的有注入嘴唇的旨在产生体积的产品的案例；所述嘴唇经受强的机械应力。所经历的机械作用可产生植入的凝胶的迁移和因此在治疗区域及其周围的副效应。
[0024] 申请EP 2011816涉及到可注射的多糖凝胶(其可为透明质酸)，其包含至少一种颗粒形式的第一强交联的多糖凝胶，和至少一种形成基质的弱交联多糖凝胶，所述至少一种第一凝胶通过共价键与所述至少一种第二凝胶结合。与申请WO 97/04012的产品不同，强交联的颗粒与弱交联多糖基质结合；因此该实施方案在短期和/或中期强烈限制颗粒的迁移而不是长期(在弱交联的多糖已被再吸收入组织之后，释放具有迁移可能性的强交联的颗粒)。由于该解决方案包含强交联的多糖颗粒，由于产品的颗粒性质和这些颗粒高的交联度，对外来体响应的风险因此很高(透明质酸因此被显著改性，因此通过生物体提升分子的非识别性)。
[0025] 申请US 2010/0028435公开了用于制备基于交联的透明质酸的制剂的方法，所述交联的透明质酸由与交联的透明质酸基质共交联的交联的透明质酸颗粒组成。因此，适用与上述给出的对申请EP 2011816的相同的评论，加上必要的变更。
[0026] 本发明通过提出交联透明质酸，或其一种盐，或任选的其他生物可相容聚合物的新型方法给出解决这些不同缺点的可能性，所述方法给出得到以下列内容为显著特征的水凝胶的可能性：
[0027] -良好的通过针被挤出的能力，和因此能够被执业医生轻易注射至将被治疗的区域的能力，而这不涉及患者的疼痛和严重的创伤，
[0028] -在交联方法的过程中不发生水凝胶的一种或多种构成相转化成颗粒(但具有低的推顶力，尽管不含通常使推顶力下降的颗粒)；在产品中共交联力的缺乏导致显著改善的安全性(在短和/或中/长期较少的副作用和并发症)，水凝胶至组织中的增强的迁移/植入能力(产品在组织中的更平均的分布)，也可导致显著较短和较不复杂的制备方法(因为制备不包括乏味冗长的研磨步骤)，
[0029] -由所得到的水凝胶的特定结构引起的显著的粘弹性，这提供向执业医生建议具有特定机械/流变特性的产品的可能性，用于满足他/她对治疗所需区域的期望，同时遵守其解剖，控制它的生理机制，和，如果适用的话，将允许其更正确定的缺陷，[0030] -由于所得水凝胶的特定“多结构化”(且无共交联的颗粒)结构，以简单方式被植入要被治疗区域的组织的能力，
[0031] -由于较好的在被治疗区域内不分离和因此不向其他相邻或更远区域迁移的能力而显著加强的安全性，尤其是在机械应力的作用下，
[0032] -所得到凝胶的复杂结构，特征在于“多结构化”，从而允许当适用时活性和/或生物物质的受控释放的最优化，
[0033] -所得水凝胶的最佳化的存在期以扩展美学或治疗处理的效能，从而给出限制每次医疗或手术程序的操作数量的可能性。
[0034] 对于该目的，本发明的目的是用于交联透明质酸，或其一种盐，或任选的其他生物可相容聚合物的新型方法，包含至少以下步骤：
[0035] a)制备部分交联的透明质酸和任选的其他生物相容的聚合物的第一水相，特征在于：
[0036] -将透明质酸或其一种盐和任选的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中以得到浓度C1的透明质酸，
[0037] -添加Q1的量的交联剂，
[0038] -通过控制交联反应的温度T1和持续时间t1得到部分交联的透明质酸，[0039] 其中所制备的部分交联的透明质酸的第一水相通常不转化为颗粒，[0040] b)制备部分交联的透明质酸和任选的其他生物相容的聚合物的至少一种第二水相，特征在于：
[0041] -将透明质酸或其一种盐和任选的其他生物相容的聚合物添加至水溶液中以得到浓度C2的透明质酸，
[0042] -添加Q2的量的交联剂，
[0043] -通过控制交联反应的温度T2和持续时间t2得到部分交联的透明质酸，[0044] 其中所制备的部分交联的透明质酸的至少一种第二水相通常不转化为颗粒，[0045] c)将至少第二部分交联的透明质酸相添加至第一相中，然后通过任选地添加额外的Qm的量的交联剂实施所述至少两相的混合，
[0046] d)通过控制交联反应的温度Tm和持续时间tm继续进行预先形成的混合物的交联。
[0047] 然后停止交联反应，有利地通过用水溶液稀释和/或通过实施纯化移除未反应的交联剂。
[0048] 根据本发明的交联方法因此由以下构成：在交联过程中混合已部分交联的透明质酸和任选的其他生物相容的聚合物的至少两个水相，然后继续交联反应以通过共价键结合所述至少两个水相。
[0049] “部分交联的”是指如下事实：所述至少2个水相的透明质酸，任选地含其他生物相容的聚合物，在聚合物链上仍具有可利用的能够与交联剂反应用于交联/桥接透明质酸和/或其他生物相容聚合物的新链的反应位点。
[0050] 指定如下内容是重要的：根据本发明的交联方法在所述交联方法的步骤中例如在上述步骤a、b、c和d中不涉及透明质酸或其一种盐或任何其他聚合物的交联颗粒的制备和/或添加。在所述交联方法的步骤中，所有部分交联的相任何时间均不通过例如研磨转化为颗粒。因此，根据本发明的交联方法不给出具有与透明质酸凝胶交联在一起的交联颗粒的可能性。
[0051] 根据本发明的一个实施方案，部分交联的透明质酸的第二水较部分交联的透明质酸的第一水相具有更大的部分交联度。这特别地给出了促进第二更强交联的相在第一相中混合的可能性。
[0052] “部分交联度”是指所述相在其与另一相混合前的交联水平；所述交联水平仅为部分，因为它将随着在混合所述相的过程中交联的继续而进一步发展。对于每个相关相的该交联水平可通过试验测定交联度并将其与最大理论交联度(其可通过评估引入交联剂的摩尔数和具有交联能力的聚合物单元的摩尔数的比率计算)比较而确定。可间接(例如，通过推顶力的测定，参见实施例2)或直接(例如，通过核磁共振光谱测定法(NMR))实验评估交联度，例如使用Kenne等人描述的方法(Kenne et al.,Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels-definitions and analytical methods,Carbohyr.Polym.2013,91:410-418)
[0053] 因此，通常，部分交联的相的“部分交联度”小于(理论上计算的交联度最大值的)90％，或小于70％，或甚至小于50％，或甚至小于30％，或甚至小于10％。
[0054] 根据本发明的一个实施方案，透明质酸的浓度C2大于或等于浓度C1。这种特殊性给出促进更强浓缩的第二相在第一相中混合并且得到第二相在第一相中更大溶胀的可能性(第一相为在水中具有溶胀能力的透明质酸，且由于其浓度很大更是如此)。这然后给出了通过第二相聚合物链在第一相中的缠结促进最大空间“植入”并且促进将使第一和第二相的聚合物链结合的交联反应的可能性，这是由于这些链更大程度的物理接近和因此更好的用于桥接这些链的反应的效率。
[0055] 根据本发明的一个实施方案，交联剂的量Q2大于或等于量Q1，以使第二相获得比第一相更高的部分交联度。
[0056] 根据本发明的一个实施方案，交联温度T2大于或等于温度T1，以使第二相获得比第一相更高的部分交联度。交联温度Tm本身高于T2以使允许第一相和第二相通过共价键结合的交联反应的效率最大化。
[0057] 根据本发明的一个实施方案，交联持续时间t2大于或等于持续时间t1，以使第二相获得比第一相更高的部分交联度。交联持续时间tm本身可大于或等于也可小于持续时间t1和t2。所述持续时间tm取决于所选择的用于实现所述至少两相的混合物交联的温度Tm。
[0058] 在混合物的制备过程中，第一和第二相的质量可为相等或不同。取决于根据本发明所需赋予所得水凝胶的性质，在混合过程中，应相对于另一个相适当提升一个相的存在，因此可使用相对于另一相更大质量的该相。因此，可以说，从机械/流变学观点出发，具有最高交联度的相较具有较低交联度的相赋予根据本发明的凝胶更佳的弹性和存在期性能。在另一方面，具有最低交联度的相赋予该相较小的推顶力并因此更容易使用将被注射的产品。使用根据本发明的水凝胶，因此观察到在机械/流变、存在期和注射能力特性方面所形成性能的协同作用。这种协同作用是由于彼此相互作用的两个参数的最优化得到的：所述相中一种相的低交联度促进更好的水凝胶的注射能力以及内聚力和整体灵活性并减少存在期和弹性，而另一相的强交联度提升存在期、进一步明显的粘弹性质，有利于弹性且对立地减少注射能力、内聚力和灵活性。该协同性因此给出了用含交联聚合物颗粒的组合物通过最小化它们的缺点结合各不同构成相的优点同时避免上述缺点的可能性。各交联相在所述水凝胶内的比例的优化因此给出了得到可容易注射的产品的可能性，使用所述可容易注射的产品可能满足对于在美学或医学中的治疗在注射能力、机械/流变性能和存在期方面所表达的不同需求。
[0059] 根据本发明的一个实施方案，通过实现纯化以移除残留的未反应的交联剂而停止不同部分交联相的混合物的交联。根据本领域技术人员周知的技术实施所述纯化，例如使用透析浴或用连续水流冲洗。优选选择使用等渗溶液并具有合适pH的透析纯化。在不同部分交联的相的混合物交联反应结束时和在凝胶纯化步骤之前，根据本领域已知的标准中和得到的凝胶是有利的，例如当交联在碱性介质中进行时通过添加酸，和当条件在酸性介质中进行时通过添加碱中和。
[0060] 本发明涉及透明质酸或其一种盐的交联，特别地其在生理学上可接受的盐如钠、钙、锌、钾盐，有利地钠盐。透明质酸可来源于动物或通过细菌发酵获得。它可具有几个Da至数百万Da，有利地约0.1至4百万Da的分子量。
[0061] 本发明也涉及其他生物相容聚合物与透明质酸结合的交联。这些天然和合成的源的聚合物应具有允许它们交联的化学功能且它们应是生物可相容的以使能够与生物流体或组织接触。例如可提及的有多糖、聚酯、聚酸酐、聚磷腈、聚ε-己内酯、聚乳酸及其衍生物、聚酸、聚丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸聚合物和生物学上可接受的衍生物系列。
[0062] 交联反应在酸性或碱性介质中在水溶液中进行，有利地在pH优选8-13之间的碱性介质中。溶液的pH值可相同或不同。
[0063] 不同交联反应中所涉及的交联剂可相同或不同。这些通常是不同类型的二或多官能的交联剂，且它们可例如选自二乙烯基砜，二或多官能的环氧化物，碳二亚胺和甲醛。优选选择来自二或多官能环氧树脂系列的试剂，尤其是最好的代理商双家庭或多功能环氧树脂的选择和特别是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，二环氧辛烷或1,2-二-(2,3-环氧丙基)-2,3-乙烯。BDDE的使用对于将进行的各交联反应是最特别优选的。
[0064] 交联温度通常为约15℃-60℃。它们对于部分交联的相的交联有利地为小于35℃且对于不同的部分交联相的混合物的交联有利地为大于45℃。
[0065] 交联持续时间通常为数小时，有利地大于1小时多达约12小时。
[0066] 优选使用2个相实施不同部分交联相的混合物的交联，但也可使用多于2个具有不同部分交联度的相实施。
[0067] 在将被交联的混合物中的各部分交联的相的重量比例可强烈地显著变化，取决于选择的精确组分、不同相关相的部分交联度和所追求的最终性能。通常，在混合物中，具有最高部分交联度的相的重量比为混合物不同相总质量的约0.1-99.9％，或进一步约5-95％，或进一步10-90％，或进一步20-80％，或进一步30-70％，或进一步40-60％，或进一步45-55％。
[0068] 根据本发明的交联方法与现有技术中所述的不同。这些方法都不涉及由下列步骤组成的交联：在交联过程中混合已部分交联的交联透明质酸和任选地其他生物相容的聚合物的至少2个水相，然后继续所述交联反应以通过共价键结合所述至少2个相，而在所述交联方法步骤中不制备和/或添加交联的透明质酸或其盐或任何其他聚合物的制品。
[0069] 被认为最接近本发明的现有技术的相关文件如下：
[0070] –申请WO 97/04012描述了对于可为透明质酸的多糖的特定交联方法；一种包含如下步骤的方法：
[0071] ○将多糖加入水溶液中，
[0072] ○通过添加交联剂引发交联反应，
[0073] ○引入对交联反应不利的空间条件，这些条件优选为在交联过程中反应混合物的稀释，和
[0075] 与本发明不同，该申请不涉及在交联过程中不同部分交联的透明质酸相的混合。在另一方面，本发明不以在交联反应中提供不利空间条件(例如稀释)然后提供有利条件(例如蒸发)为特征，根据本发明的交联在有利条件下实施以优化产率。
[0076] -申请WO 2005/085329描述了以如下内容为特征的特定交联方法：
[0077] ○引发确定量的至少一种聚合物的交联的步骤，和
[0078] ○在溶液中添加额外量的分子量大于500,000Da的聚合物，伴随着稀释反应混合物，以降低聚合物在溶液中的整体浓度同时继续所述交联反应。
[0079] 与本发明不同，该申请不涉及在交联过程中不同部分交联的透明质酸的混合。
[0080] 该申请涉及在交联反应中聚合物的添加，但该聚合物没有经受部分或全部的初步交联。另一方面，与本发明不同，该聚合物的加入必然伴随着反应混合物的稀释，结果是提供不利的空间条件和因此并不非常有效的继续交联反应。
[0081] –申请FR 2924615描述了制备水凝胶的方法，特征在于在混合前被交联的相同或不同x聚合物的均匀混合。
[0082] 与本发明不同，该申请不涉及在交联过程中混合不同的部分交联的透明质酸。
[0083] 混合预先交联的且它们中每个的交联反应均停止的x聚合物，以得到这些x聚合物的简单并置而不产生共价键：在这些不同聚合物之间无交联。
[0084] –申请EP 2011816描述了制备水凝胶的方法，包含步骤：
[0085] ○根据本领域技术人员已知的研磨技术制备第一强交联的多糖颗粒，以得到具有所需粒度的颗粒，
[0086] ○悬浮所述颗粒，
[0087] ○添加至少一种第二多糖，和
[0088] ○交联所述至少一种第二多糖直至交联度X2用于得到至少一种第二弱交联的多糖并将所述至少一种弱交联的第二多糖与所述颗粒交联在一起。
[0089] 与该申请不同，本发明不涉及在交联过程中交联颗粒的使用(制备和/或添加在反应混合物中)。特别地，在本发明的交联方法过程中不存在允许制备交联的透明质酸颗粒的研磨步骤：
[0090] ○对于部分交联的相，在混合这些相用于继续交联之前，和
[0091] ○对于混合部分交联的相，在继续所述交联的过程中。
[0092] 申请US 2010/0028435描述了用于制备与申请EP 2011816相似的可注射凝胶的方法。
[0093] 通过实现交联的透明质酸颗粒和透明质酸凝胶的相互交联得到申请US2010/0028435的凝胶。
[0094] 与该申请不同(也与申请EP 2011816不同)，根据本发明的交联方法不涉及任何在所述交联方法步骤中制备和/或添加交联的透明质酸颗粒或它的一种盐或任何其他聚合物。根据本发明的交联方法因此不允许交联的颗粒与透明质酸凝胶的相互交联。
[0095] 本发明也涉及用于制备由根据先前描述的交联方法交联的透明质酸或它的一种盐和任选的其他生物相容的聚合物形成的可注射水凝胶的方法。所述制备方法的特征在于其包含至少下面的连续步骤：
[0096] -根据前面描述的交联方法交联透明质酸或它的一种盐和任选的其他生物相容聚合物，
[0097] -使用具有合适pH的等渗溶液纯化所述混合物，
[0098] -均质化所述混合物，任选地添加一种或数种其他生物相容聚合物和/或一种或数种可对生物体提供益处的物质如活性物质，
[0099] -任选地脱气和/或冷冻干燥，
[0100] -在注射器或烧瓶或任何其他密封容器中调制，和
[0101] -灭菌。
[0102] 有利地，在注射器中调制根据本发明的可注射水凝胶，然后根据任何本身已知的方法并优选通过高压灭菌对其进行灭菌，用于直接应用和/或销售。
[0103] 本发明也涉及根据先前表面的交联方法得到的水凝胶。所述水凝胶由至少交联的透明质酸或它的一种盐和任选的其他生物相容聚合物组成，特征在于具有不同交联度的交联透明质酸数个相的混合物，所述相通过共价键彼此连接。根据本发明的交联方法得到的水凝胶因此可表征为由不具有共交联颗粒的单一“多结构化”的交联相组成。
[0104] 根据本发明的一个方面，所述水凝胶可以基于透明质酸的衍生物，即基于由通过化学途径或任何其他途径改性透明质酸分子得到的分子。
[0105] 根据本发明的水凝胶具有良好的通过针被挤出的能力和因此被执业医生在将被治疗的区域轻易注射的能力而这对于患者不涉及疼痛和显著的创伤。该优点起因于源于本发明交联方法的“多结构化”复杂基质，所述复杂基质由于由在产品中交联度较低的相的存在引发的润滑作用给出了提升更好的注射能力的可能性。
[0106] 根据本发明的水凝胶不包括共交联的颗粒且不由共交联的颗粒组成。这给出了较含颗粒的产品显著改善的安全性的优势(在短和/或中/长期较少的副作用和并发症)和增强的水凝胶融入/植入组织的能力(产物在组织中的更均匀分布)。
[0107] 由于它的“多结构化”特征，根据本发明的水凝胶具有显著的机械/流变粘弹性性能(即粘性和弹性)。在根据本发明的水凝胶内至少2个相同或不同比例的具有不同交联度的相的存在给出了这样的可能性，即最佳地满足执业医生对治疗期望区域同时观察其解剖、控制它的生理机制的需求和如果适用的话，所需的将允许其改正确定缺陷的机械/流变性能(例如，用于在颧骨周围产生体积的强弹性)。
[0108] 根据本发明的水凝胶具有良好的被“生物植入”组织的能力。它的“多结构化”基质提供了极好的允许产品至组织的优化的渗透从而允许注射后创伤的限制和因此在注射区域副作用例如疼痛的限制和任何注射后炎症反应的限制。
[0109] 特征在于不同的相通过共价键彼此结合的事实的水凝胶的特定结构还通过改善产品不解离并因此不向其他相邻或更远区域迁移——尤其是在治疗区域的机械应力的作用下——的能力而允许增强所施用的植入物的安全性。
[0110] 水凝胶的“多结构化”基质还给出具有高交联度的相的同时保留可注射产品的可能性，这引起水凝胶更好的存在期和因此美学或治疗处理的功能的延长，进一步限制每次医疗或外科手术的操作数量。
[0111] 来自本发明的植入物高安全水平与其特定复杂结构——显著地赋予其可根据被治疗的区域而调节和优化的机械/流变和生物融合性能——结合，使其成为一种用于一种或数种可给予生物体益处的物质尤其是活性物质和/或生物实体例如细胞、浓缩的血小板、基因、DNA片段或生长因子的受控和/或延迟释放的产品的选择。在产品中不同相、不同交联度和不同聚合物浓度的相的存在给出了这样的可能性，即每种这些物质在不同时间的释放和因此优化一种或数种用于局部或整体治疗的生物源的活性成分或化合物的盐析和作用情况。
[0112] 根据本发明的水凝胶有利地通过注射入组织和/或活的人类和动物生物体的流体而植入。
[0113] 也可以以不可注射形式使用根据本发明的水凝胶。在该情况下，执业医生通过借助合适的医疗和/或外科器械使本发明的无菌产品沉积在被治疗的区域而植入本发明的无菌产品。
[0114] 根据本发明的水凝胶也用在用于局部应用的组合物中，根据合适的制剂例如用在皮肤、头发、指甲、眼角膜、牙齿、嘴唇、内部或外部粘膜和伤口上。在这种情况下，它可包含可向被治疗的区域提供一种或数种益处的所有的化合物，例如维生素，抗氧化剂，保湿分子，蛋白质，具有或不具有药理作用的活性物质，生物实体例如细胞、浓缩的血小板、基因、DNA片段或生长因子，着色剂，颜料，气味分子或芳香分子。这些化合物分散在水凝胶中，接枝到一种或数种水凝胶聚合物，或包含或包裹在自身分散在水凝胶中的另一种材料中。
[0115] 根据本发明的一个方面，透明质酸或其一种盐的总水凝胶浓度为0.01-50mg/ml，优选1-35mg/ml，有利地8-30mg/ml。
[0116] 根据本发明的一个方面，根据本发明的水凝胶被部分或全部冷冻干燥以得到半固体或粉末。
[0117] 根据本发明的一个方面，根据本发明的水凝胶包含的一种或数种具有或不具有药理作用的天然或合成源的活性物质，例如抗氧化剂、抗炎剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗癌剂、局部麻醉剂、蛋白质、激素，单独或作为组合。这些活性物质或分散在水凝胶中，或嫁接至一种或数种水凝胶聚合物中，或包含/包括在自身分散在水凝胶中另一种物质中。在后者情况下，例如，可提及活性物质例如抗炎剂在以源自聚乳酸或聚ε-己内酯的聚合物为基础的微球内的包裹。
[0118] 根据本发明的一个方面，根据本发明的水凝胶包含分散在其交联基质中的利多卡因。
[0119] 根据本发明的一个方面，根据本发明的水凝胶包含生物源例如细胞、浓缩血小板、基因、DNA片段或生长因子的一种或数种化合物。这些化合物优选分散在所述水凝胶中，但它们也可以被嫁接到一种或数种水凝胶的聚合物上或包含/包裹在自身分散在所述水凝胶中的另一种材料中。
[0120] 根据本发明的一个方面，根据本发明的水凝胶包含分散在水凝胶的交联基质中的聚合物。例如可提及的有多糖、聚酯、聚酸酐、聚磷腈、聚ε-己内酯、聚乳酸及其衍生物、聚酸、聚丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸聚合物和生物学上可接受的衍生物。
[0122] 根据本发明的一个方面，将根据本发明的水凝胶就在其被施用至患者之前与一种或数种对生物体提供益处的优选无菌的其它物质混合。然后由最终使用者即执业医生或授权人员根据合适的方法使用一种或数种混合设备实施混合，从而可产生令人满意的混合物和如果需要的话保持无菌。例如，可提及通过最终使用者通过如下方法混合根据本发明的水凝胶和混合一种或数种化合物如活性物质、生物实体或矿物质：
[0123] -通过在2个容器(一个充满根据本发明的水凝胶且另一个充满将被分散在所述水凝胶中的化合物)间进行往返(round trips)，这些容器可例如为注射器，和[0124] -通过同时挤出两个容器(一个充满根据本发明的水凝胶且另一个充满将被分散在所述水凝胶中的化合物)内的物质以在施用于患者之前并置所述不同的化合物和/或将它们在另一容器中混合。
[0125] 本发明还涉及根据先前所述的交联方法得到的水凝胶的用于美学或治疗应用的用途。
[0126] 由本发明提供的益处使得使用根据先前描述的交联方法得到的水凝胶用于在美学和医疗中的多种应用尤其是用于在关于透明质酸的文献中广泛描述的那些(参见，例如Volpi et al.,Curr.Med.Chem.2009,16:1718-45)成为可能。
[0127] 根据本发明的水凝胶因此用于人类和动物的美学或医疗应用。它有利地通过注射植入患者有机体但也可以不可注射的形成植入，且在该情况下，它被执业医生通过合适的医疗和/或外科器械沉积在被治疗的区域。最后，其可通过局部应用而使用。
[0128] 根据本发明的水凝胶特别用于：
[0129] -填充体积，
[0130] -在某些组织内产生空间，从而提升它们的最佳操作，
[0131] -取代生理流体或有缺陷的组织，
[0132] -刺激或提升组织的再生，
[0133] -保湿和保护组织，和
[0134] -递送可对生物体有益处的物质和特别是活性物质和/或生物实体。
[0135] 作为例子，可提及凝胶在下列情况的使用：
[0136] -配制皮内或皮下可植入式组合物用于改善皮肤质量，或填充皱纹或恢复面部体积(颧骨，下巴，嘴唇，鼻子，……)或身体体积，
[0137] -配制具有保湿目的和/或向生物体提供不同性质的化合物例如维生素、抗氧化剂、保湿分子、活性物质、生物实体、着色剂、颜料、气味分子或芳香分子的化妆品或药用化妆品，
[0138] -配制眼科学局部组合物例如用于长期保湿角膜，
[0139] -配制局部或可植入式组合物用于牙齿使用，例如用于填充牙周袋和/或用于刺激牙齿周围的组织再生，
[0144] -配制局部或可植入式药物组合物，其允许对于不同的医学应用活性物质和/或生物实体的延迟和/或受控释放。实施例
[0145] 现在将通过下面的实施例以非限制性方式说明本发明。
[0147] 通过测定通过给定针以12.5mm/min的速率喷射包含在1ml玻璃注射器(BD Hypak SCF,1ml长RF-PRTC)中的凝胶所需的力(牛顿)来确定所制备水凝胶的注射能力。
[0148] 在25℃下使用AR2000电流计(TAInstruments)使用40mm平面-平面几何结构和1000μm间隙测定凝胶的流变性能。
[0149] 实施例1
[0150] 制备根据本发明的凝胶1
[0151] a)制备部分交联的相A
[0152] 称重4.70g分子量约为3.0MDa且湿度水平为13.8％的透明质酸钠(NaHA)纤维，向其添加45.75g水性1wt.％NaOH溶液。
[0153] 实施纤维的水合作用1h 20min，具有使用小铲的规则的手动均化作用。
[0154] 将1.41g在1wt.％NaOH溶液中被稀释至1:5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)溶液添加至反应介质中，然后进行手动均化15min。
[0155] 将由此得到的凝胶分为三个相等的块以制备下面的三个片段：
[0156] -片段1引入30℃恒温槽1h，然后用含HCl的磷酸盐缓冲液稀释以得到浓度为20mg/ml的NaHA和中性pH(＝相A')。机械均化相A'10min(＝凝胶A')。
[0157] -片段2引入50℃恒温槽2h，然后用含HCl的磷酸盐缓冲液稀释以得到浓度为20mg/ml的NaHA和中性pH(＝相A”)。机械均化相A”10min(＝凝胶A”)。
[0158] -片段3引入30℃恒温槽1h。
[0159] 用A表示所述得到的部分交联的相。
[0160] b)制备部分交联的相B
[0161] 称重5.25g分子量约为3.0MDa且湿度水平为13.8％的透明质酸钠(NaHA)纤维，向其添加45.75g水性1wt.％NaOH溶液。
[0162] 实施纤维的水合作用1h 20min，具有使用小铲的规则的手动均化作用。
[0163] 将2.73g在1wt.％NaOH溶液中被稀释至1:5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)溶液添加至反应混合物中，然后使用小铲进行手动均化15min。
[0164] 将由此得到的凝胶分为三个相等质量以制备下面的三个段：
[0165] -段1引入30℃恒温槽1h，然后用含HCl的磷酸盐缓冲液稀释以得到浓度为20mg/ml的NaHA和中性pH(＝相B')。机械均化相B'10min(＝凝胶B')。
[0166] -段2引入50℃恒温槽2h，然后用含HCl的磷酸盐缓冲液稀释以得到浓度为20mg/ml的NaHA和中性pH(＝相B”)。机械均化相B”10min(＝凝胶B”)。
[0167] -段3引入30℃恒温槽1h。
[0168] 用B表示所述得到的部分交联的相。
[0169] c)结合部分交联的相A和B并继续交联
[0170] 将9.0g部分交联的相A添加至13.0g部分交联的相B中，在室温下实施机械混合15min后浸入50℃恒温槽中2h。
[0171] 在含HCl的磷酸盐缓冲液中中和交联的产物至pH＝7.0，其中使其溶胀24h然后用磷酸盐缓冲液对其透析24h以移除未反应的BDDE。
[0172] 在机械均化10min后，得到透明质酸钠浓度为20mg/ml的凝胶1。
[0173] 实施例2
[0174] 实施例1的凝胶1的表征
[0175] 将凝胶1、A'、A”、B'和B”引入1ml的玻璃注射器中且下表中示出了通过27G1/2针以12.5mm/min的速率挤出凝胶所需的力。
[0176]被测凝胶 推顶力(N)
1 23.3
A' 6.1
B' 7.0
A” 6.7
B” 25.1
1 23.3
A' 6.1
B' 7.0
A” 6.7
B” 25.1
[0177]
[0178] 可以看出：
[0179] -相A和相B的交联反应是部分的。确实，A”和B”的推顶力分别大于A'和B'，说明了凝胶A”和B”比A'和B'更多地交联，和
[0180] -根据本发明的凝胶1的推顶力低于B”的推动力并因此比未经受本发明交联方法的凝胶具有更好的注射能力。
[0181] 也测量了凝胶1在1.0Hz下的流变粘弹性性能G'和G”。
[0182]被测凝胶 G'(1.0Hz)Pa G”(1.0Hz)Pa
1 96 0.40
1 96 0.40
[0183] 实施例3
[0184] 制备根据本发明的凝胶2
[0185] a)制备部分交联的相C
[0186] 称重4.2g分子量约为2.0MDa且湿度水平为6.3％的透明质酸钠(NaHA)粉末，向其添加0.3g湿度水平为2.0％的羧甲基纤维素钠(42mPa·s，在水中2％，20℃)和33.6g水性1wt.％NaOH溶液。
[0187] 实施粉末的水合作用1h 20min，具有使用小铲的规则的手动均化作用。
[0188] 用H表示所得到的水合相。
[0189] 将1.80g在1wt.％NaOH溶液中被稀释至1:5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)溶液添加至反应混合物中，然后使用小铲进行手动均化15min，然后将反应混合物引入50℃恒温槽1h 30min。
[0190] b)制备部分交联的相D
[0191] 将0.10g在1wt.％NaOH溶液中被稀释至1:5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)溶液添加至上述相H中，然后使用小铲进行手动均化15min，然后将反应混合物引入50℃恒温槽2h。
[0192] c)结合部分交联的相C和D并继续交联
[0193] 将部分交联的相D添加至部分交联的相C中，在室温下实施机械混合15min后浸入50℃恒温槽中2h 30min。
[0194] 在含HCl的磷酸盐缓冲液中中和交联的产物至pH＝7.0，其中使其溶胀24h然后用磷酸盐缓冲液对其透析24h以移除未反应的BDDE。
[0195] 在机械均化10min后，得到透明质酸钠浓度为20mg/ml的凝胶2。
[0196] 实施例4
[0197] 制备根据本发明的可注射制剂1
[0198] 在25％的实施例3中得到的凝胶2质量中，加入0.3wt.％的盐酸利多卡因粉末并实施机械均化15min。
[0199] 将由此得到的凝胶引入1ml玻璃注射器中，然后将所述注射器在高压釜中在121℃下灭菌20min。
[0200] 实施例5
[0201] 制备根据本发明的可注射制剂2
[0202] 在25％的实施例3中得到的凝胶质量2中，加入30wt.％粒度为30-50μm的含磷钙羟磷灰石粉末并实施机械均化15min。
[0203] 将由此得到的凝胶引入1ml玻璃注射器中，然后将这些注射器在高压釜中在121℃下灭菌20min。
[0204] 实施例6
[0205] 表征实施例4的可注射制剂
[0206] 发现实施例4中得到的无菌制剂是通过薄的27G1/2针可轻易注射的；在12.5mm/min的速率下测定的注射力是21.3N。
[0207] 该制剂的pH和重量克分子渗透浓度是生理性的：
[0208] -pH＝6.9
[0209] 重量克分子渗透浓度＝290mOsm/kg H2O
[0210] 1.0Hz下的流变特性导致74Pa的弹性模量G'和0.25的Tanδ。
[0211] 重要的是注意这些流变特性与至真皮或皮下的注射是相适应的。
[0213] -将ml的 (Galderma Q-Med,Uppsala,Sweden) 凝 胶 引 入 F1；是美学医学中已知超过10年的基于以20mg/ml交联的透明质酸的产品，和
[0214] -将1ml的可注射制剂引入F2。
[0215] 手动搅拌F1和F25秒。在另一个10秒后，发现 产品完全在水中离解(交联透明质酸颗粒在水中悬浮)，这不是总是为在水中凝胶形式的制剂1的情况。可注射制剂1的内聚性水平因此比 产品高很多。
[0216] 实施例7
[0217] 将根据本发明的凝胶与现有技术(US 2010/0028435)对比
[0218] a)制备根据本发明的凝胶2
[0219] 参见实施例3
[0220] b)根据US申请2010/0028435的实施例4制备现有技术凝胶X
[0221] 称重3.50g分子量约为2.0MDa且湿度水平为6.3％的透明质酸钠(NaHA)粉末，向其添加24.0g水性1wt.％NaOH溶液。
[0222] 实施所述粉末的水合作用1h，然后使用小铲手动均化10min。
[0223] 将700μl的BDDE添加至反应介质中，然后使用小铲进行手动均化10min，之后将其浸入50℃恒温槽2h。
[0224] 在含HCl的磷酸盐缓冲液中中和交联的产物至pH＝7.0，其中使其溶胀24h(最终体积＝92ml)。
[0225] 使由此得到的凝胶经过250μm网格通过连续通道从而将其磨成颗粒。
[0226] 用Xp表示得到的颗粒。
[0227] 称重3.50g分子量约为2.0MDa且湿度水平为6.3％的透明质酸钠(NaHA)粉末，向其添加30.5g水性1wt.％NaOH溶液。
[0228] 实施所述粉末的水合作用1h，然后使用小铲手动均化10min。
[0229] 将263μl的BDDE添加至反应介质中，然后使用小铲进行手动均化10min，之后将其浸入50℃恒温槽2h。
[0230] 用Xg表示得到的交联的产物。
[0231] 将58g颗粒Xp和24g水性1wt.％NaOH溶液添加至交联的产物Xg中，然后使用小铲手动均化10min并在25℃下继续交联反应6h。
[0232] 在含HCl的磷酸盐缓冲液中中和交联的产物至pH＝7.0，其中使其溶胀24h，然后用磷酸盐缓冲液对其透析24h以移除未反应的BDDE。
[0233] 在机械均化30min后得到凝胶X。
[0234] c)对比凝胶2和凝胶X的制备过程
[0235] 将凝胶2和凝胶Y填充入1ml的玻璃注射器中并通过27G1/2针将其挤出(各凝胶进行6次试验/由操作者手动注射)。凝胶2和凝胶X易于通过所述针注射，然而，值得注意的是，发现根据本发明的凝胶2在所述注射器内具有好得多的均匀性。实际上，在注射过程中，使用X凝胶实施所述测试的操作者对于必须应用至所述注射器柱塞的力观察到许多不规则性(本发明的凝胶2不是这种情况)；操作者将不规则性表征为“推”。另一方面，在6个测试凝胶X的注射器中，2个注射器不能完全排出，因为针完全被凝胶堵塞/阻塞(根据本发明的凝胶2不是这种情况)。
[0236] 如上所述，现有技术教导交联的凝胶转化为颗粒能够降低产品的推顶力并因此能够增强其通过针的注射能力(强交联的凝胶被研磨成可可能通过针孔的小尺寸的颗粒)。令人惊奇的是，发现本发明的凝胶2——其未经过任何对部分交联的相(一个是高度交联的另一个是较少交联的)研磨的步骤且具有通过将所述两种部分交联的相结合和交联而得到的交联的相——也易于注射且更均匀。根据本发明的复杂的“多结构化”(且没有共交联的)结构因此使其可能解决现有技术中描述的注射能力的问题而不必须研磨产品以将其转化为颗粒。
[0237] 对在制备凝胶2和凝胶X的过程中取出的凝胶样品实施甲苯胺蓝染色试验以评估所述凝胶是否为颗粒。为此，将约0.1g的被测试凝胶配置在载玻片上并添加五滴甲苯胺蓝水溶液(每100克去离子水中有0.1g甲苯胺蓝)，然后将第二个载玻片放在第一个载玻片上。然后使用显微镜在40X放大率下观察结果并拍摄图片。
[0238] 实施下面的显色试验：
[0239] -对凝胶2：对部分交联的相C和D(参见图1和图2)和对由部分交联的相C和D得到的交联的产物(参见图3)，在将所述三个样品中和至中性pH后；
[0240] -对凝胶X：对颗粒Xp(参见图4)和对通过颗粒Xp的共交联得到的交联的产物(参见图5)，在将这两个样品中和至中性pH后。
[0241] 与其中NaHA交联的颗粒清楚显示的图4(也与图5)相反，涉及根据本发明的凝胶2的图1-3的凝胶结构不是颗粒状的。在本发明的交联方法中部分交联相的不转化允许得到不含共交联NaHA的水凝胶。
[0242] 这代表了相对于现有技术产品特别相对于在US 2010/0028435和在EP 2011816中描述产品的一个显著优势。确实，正如在文献中也在申请US2010/0028435和EP 2011816中描述的，交联的颗粒在短期和长期内产生副作用和并发症(在EP 2011816中，交联的颗粒明确描述为产生或多或少强的对外来物质的反应)。在本发明中，不存在共交联颗粒因此代表了相对于US 2010/0028435和EP 2011816关于更好的产品安全性同时保持易注射性的主要的改进。
[0243] 另一方面，同样重要的是要注意US 2010/0028435和EP 2011816声称限制体内高度交联的颗粒的迁移，因为这些颗粒与弱交联的NaHA基质共交联。这在短期内是真实的，但当交联的弱交联的NaHA被再吸收时，在长期内高度交联颗粒的迁移再次变得可能。后一点进一步证实了根据本发明的可注射水凝胶安全性的提高，在本发明中在长期内不引起共交联颗粒迁移的问题(根据本发明的水凝胶不含共交联的颗粒)。
[0244] 另一个主要的优势是相比较于已知来自US 2010/0028435和EP 2011816的共交联颗粒的产品，根据本发明的产品更好地整合(＝生物融入或生物植入)至组织中。确实，如在各种科学出版物(例如Tran C.et al.,In vivo bio-integration of three HAfillers in human skin:a histological study,Dermatology 2014,228:4754；或 Micheels,P.et al.,Superficial dermal injection of HAsoft tissue fillers:comparative ultrasound study,Dermatol.Surg.2012,38:1162-1169)中所描述的，相比较于基于非颗粒的交联NaHA的产品(正如在根据本发明的水凝胶的情况下)，基于颗粒的交联NaHA的产品(例如在US 2010/0028435和EP 2011816中公开的产品)至真皮中的注射分布显著更不均匀。
[0245] 同样重要的是要注意根据本发明的制备水凝胶的方法相比较于US2010/0028435和EP 2011816中描述的方法要求显著较短的制备产品的时间。制备本发明的凝胶2的时间(约55h)与制备根据US 2010/0028435的凝胶X的时间(约85h)的对比可说明这一点。这提供了清晰的经济优势和同时最小化在制备过程中随制备过程持续时间增加的凝胶细菌污染的风险。
[0246] 实施例8
[0247] 将根据本发明的凝胶产品与现有技术(EP 2011816)比较
[0248] a)根据本发明的凝胶2的制备
[0249] 参见实施例3。
[0250] b)根据EP申请2011816的实施例1的现有技术凝胶Y的制备
[0251] 称重1.00g分子量约为2.0MDa且湿度水平为6.3％的透明质酸钠(NaHA)粉末，向其添加6.2g水性1wt.％NaOH溶液。
[0252] 实施所述粉末的水合作用1h 20min，然后使用小铲手动均化。
[0253] 将0.15g的BDDE添加至反应介质中，然后使用小铲进行手动均化10min，之后将其浸入50℃恒温槽2h 30min。
[0254] 将交联的产物引入去离子水中24h，其中使用三个连续的浴，每个8h，以移除未反应的BDDE。
[0255] 使由此得到的凝胶经过250μm网格通过连续通道从而将其磨成颗粒，将所述颗粒放置排干2h。
[0256] 用Yp表示得到的颗粒。
[0257] 5.0g的Yp颗粒添加至0.8g分子量约为2.0MDa且湿度水平为6.3％的透明质酸钠(NaHA)粉末中，该粉末中添加有2.0g水性1wt.％NaOH溶液。
[0258] 在添加0.03g BDDE之前手动均化所述混合物30min，然后在将反应混合物浸入50℃恒温槽中2h 30min之前再次均化混合物30min。
[0259] 用Yg表示得到交联产物。
[0260] 在含HCl的磷酸盐缓冲液中中和交联产物Yg至pH＝7.0，其中使其溶胀24h，然后用磷酸盐缓冲液对其透析24h以移除未反应的BDDE。
[0261] 在手动均化30min后，得到凝胶Y。
[0262] c)比较凝胶2和凝胶Y的制备过程
[0263] 正如在实施例7中，凝胶2和凝胶Y填充至1ml玻璃注射器中并通过针27G1/2挤出。发现两种凝胶是轻易通过针可注射的并应用与对于实施例7提出的评论相同的评论：发现根据本发明的凝胶2是更均匀的，因为它通过针的注射比凝胶Y更规则。令人惊讶的是，尽管根据本发明的凝胶2不经受任何旨在促进其注射能力的研磨成颗粒的研磨步骤，凝胶2的复杂“微结构化”结构具有与经受将其强交联的相转化为颗粒的步骤的凝胶Y相似的低推顶力。
[0264] 正如在实施例7中所示，在制备凝胶2和凝胶Y的过程中取出的凝胶样品上实施甲苯胺蓝染色。
[0265] 实施下面的显色试验：
[0266] -对于凝胶2：对部分交联的相C和D(参见图1和图2)和对由部分交联的相C和D得到的交联的产物(参见图3)，在将所述三个样品中和至中性pH后；
[0267] -对凝胶Y：对颗粒Yp(参见图6)和对通过颗粒Yp的共交联得到的交联的产物(参见图7)，在将这两个样品中和至中性pH后。
[0268] 结论与实施例7的结论相同。与其中NaHA交联颗粒是清晰可见的图6(也和图7)相反，与根据本发明的凝胶2相关的图1-3的凝胶结构不是颗粒。
[0269] 因此，本发明允许得到可容易注射的水凝胶，尽管它在其交联过程中不经磨碎(部分或全部地)以形成颗粒。因此，在凝胶中不含共交联颗粒能够实现显著的改善(相比较于在EP2011816中得到的凝胶)：
[0270] -在短和长期安全性改善，尤其是不发生如在EP 2011816中的长期内高度交联颗粒的迁移；
[0271] -由于不含共交联的颗粒，凝胶至组织中的融合性增强(更均匀的分布)。
[0272] 最后，正如在实施例7中，应注意的是根据本发明的凝胶的制备具有经济优势和最小化颗粒和细菌污染的风险，因为所述制备过程显著快于EP 2011816中描述的制备过程(对于根据本发明的凝胶约55h，相比较于对于根据EP 2011816的凝胶的83h)，且不需要一个或多个如在EP 2011816中需要的复杂和繁琐的研磨步骤。
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