流感中的风险分层
阅读：498发布：2021-03-03
专利汇可以提供流感中的风险分层专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中的临床 风 险的方法。本发明还涉及用于区分患有流感或病毒性 肺 炎的患者和具有症状上类似的状况的患者的方法。本发明的所述方法包括确定在来自患有或被怀疑患有流感的患者的 生物 样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)的表达 水 平。本发明还提供了包含适合实施所述方法的组分的 试剂 盒 。本发明允许将患者分层为界定临床风险的组，例如基于所述受试者长期健康的风险严重性的组。，下面是流感中的风险分层专利的具体信息内容。
1.用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂在制备组合物中的用途，其中所述组合物用于鉴定患有或被怀疑患有流感感染的患者中的临床风险，其中所述临床风险是由所述感染引起的需要住院、实施重症监护、生命支持治疗中的一项或多项的严重疾病的风险。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种药剂是引物、抗体或探针。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述引物或探针对选自以下的核酸序列具有特异性：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的序列。
4.如权利要求2所述的用途，其中所述组合物包含能够选择性扩增选自以下的核酸序列的正向和反向引物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的序列。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述组合物包含选自以下的一种或更多种核酸序列：
SEQ ID NO:7(acctcatcagcagtgaccagt),SEQ ID NO:8(acatcatcttggctgctatgg),SEQ ID NO:9(TGCCTCGGGCAGCCT)和SEQ ID NO:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述组合物包含能够检测生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的存在的多种药剂。
7.如权利要求2所述的用途，其中所述组合物包含能够特异性结合由IFI27基因序列编码的多肽的抗体。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述抗体是对IFI27具有特异性的缀合抗体。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述抗体是多克隆抗体。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述多克隆抗体是兔多克隆抗体。
11.如权利要求7所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.如权 利 要求 7所 述的 用途 ，其 中所 述抗 体 结合 以 下表 位 序列 ：
MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY。
13.如权利要求7所述的用途，其中所述抗体能够选择性结合以下多肽：(i)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的IFI27多肽，或(ii)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的IFI27多肽。
14.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物用于通过如下方法来鉴定患有或被怀疑患有流感感染的患者中的临床风险，所述方法包括确定来自所述患者的生物样品中的干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物水平和将所确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物的标准水平表示没有临床风险，并且所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述标准水平是基于健康受试者、感染流感但无症状的受试者或感染流感但没有发展成严重疾病的受试者中的IFI27基因产物的水平。
17.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物的标准水平表示有临床风险，并且所述患者样品中与所述标准水平相比相等或升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
18.如权利要求14所述的用途，其中所述标准水平是基于健康受试者中的IFI27基因产物的水平，并且所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
19.如权利要求14所述的用途，其中所述标准水平是基于感染流感病毒但无症状的受试者中的IFI27基因产物的水平，并且所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
20.如权利要求14-19中任一项所述的用途，其中所述标准水平是在确定来自所述患者的生物样品中IFI27基因的表达水平的同时进行制备的。
21.如权利要求18或19所述的用途，其中IFI27基因产物水平为所述标准水平的至少40倍表示有临床风险。
22.如权利要求18或19所述的用途，其中IFI27基因产物水平为所述标准水平的至少50倍表示有临床风险。
23.如权利要求18或19所述的用途，其中IFI27基因产物水平为所述标准水平的至少60倍表示有临床风险。
24.如权利要求14所述的用途，其中所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示有临床风险的预先确定的量，并且所述患者样品中与所述标准水平相比相等或升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
25.如权利要求14所述的用途，其中所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示没有临床风险的预先确定的量，并且所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
26.如权利要求14所述的用途，其中所述方法提供监测患有流感的患者的进展的方法，所述方法包括确定来自所述患者的第一生物样品中IFI27基因的表达水平和确定来自所述患者的第二生物样品中IFI27基因的表达水平，其中所述第一和第二生物样品是在不同的时间从所述患者获得的，并且基于在所述第一和第二生物样品中IFI27的相对表达水平评估患者的状态。
27.如权利要求26所述的用途，其中与所述第一生物样品相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水平的升高表示在所述患者中增加的临床风险。
28.如权利要求26所述的用途，其中与所述第一生物样品相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水平的下降表示在所述患者中降低的临床风险。
29.如权利要求14所述的用途，其中所述方法进一步包括确定在所述生物样品中至少一个另外的基因的表达水平。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述至少一个另外的基因是其表达为组成型的基因。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述至少一个另外的基因是GAPDH基因。
32.如权利要求14所述的用途，其中所述生物样品是血液或其组分如血细胞亚群。
33.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括将所述生物样品与能够与IFI27基因产物结合的药剂接触，并且检测所述药剂和所述IFI27基因产物之间的结合。
34.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物是RNA、mRNA、cDNA或蛋白质。
35.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物是IFI27mRNA。
36.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO:1的核酸序列，或者SEQ ID NO:2的核酸序列。
37.如权利要求14所述的用途，其中所述IFI27基因产物是IFI27多肽。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述IFI27基因产物包含含有SEQ ID NO:3序列的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:4序列的氨基酸序列。
39.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括将mRNA反转录为cDNA。
40.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括扩增所述样品的IFI27核酸序列和检测所扩增的序列。
41.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括定量聚合酶链式反应(qPCR)。
42.如权利要求41所述的用途，其中所述聚合酶链式反应利用能够扩增核酸序列的一种或更多种引物，所述核酸序列选自以下序列：(i)SEQ ID NO:1，(ii)SEQ ID NO:2，(iii)SEQ ID NO:5，(iv)SEQ ID NO:6。
43.如权利要求41所述的用途，其中所述聚合酶链式反应利用SEQ ID NO:7(acctcatcagcagtgaccagt)和SEQ ID NO:8(acatcatcttggctgctatgg)的引物序列中的一个或两个。
44.如权利要求41所述的用途，其中所述聚合酶链式反应可以利用SEQ ID NO:9(TGCCTCGGGCAGCCT)和SEQ ID NO:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)的引物序列中的一个或两个。
45.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括将所述样品与能够特异性结合IFI27基因产物的一种或更多种探针接触。
46.如权利要求45所述的用途，其中所述一种或更多种探针是包含以下序列的核酸：
(i)与SEQ ID NO:1所示的序列互补的序列，或(ii)与SEQ ID NO:2所示的序列互补的序列。
47.如权利要求45所述的用途，其中所述一种或更多种探针是包含以下序列的核酸：
(i)与SEQ ID NO:5所示的序列互补的序列，或(ii)与SEQ ID NO:6所示的序列互补的序列。
48.如权利要求45所述的用途，其中所述探针包含10-50个碱基。
49.如权利要求45所述的用途，其中所述探针包含30-600个碱基。
50.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括以下步骤：(i)从患有或被怀疑患有流感感染的患者获取血液样品；(ii)从所述血液样品制备总RNA的分离物；(iii)通过所述总RNA分离物的反转录制备cDNA；(iv)通过聚合酶链式反应扩增IFI27核酸序列；(v)将所述扩增的IFI27核酸序列的水平与标准进行比较；(vi)基于所述比较确定所述患者是否具有对于所述患者的临床风险。
51.如权利要求50所述的用途，其中所述聚合酶链式反应是定量聚合酶链式反应。
52.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括确定IFI27多肽的水平。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述方法包括确定IFI27多肽的水平，所述IFI27多肽包含：(i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或(ii)SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
54.如权利要求52所述的用途，其中所述方法包括将所述样品与能够与IFI27多肽选择性地结合的抗体接触，所述IFI27多肽包含：SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
55.如权利要求14所述的用途，其中所述方法包括凝胶电泳、核酸测序和氨基酸测序中的一种或更多种。
56.如权利要求14所述的用途，其中所述方法完全离体进行。
57.如权利要求14所述的用途，其中将确定的生物样品中的IFI27基因产物水平与标准水平进行比较是在计算机程序的协助下完成的。
58.如权利要求14所述的用途，其中基于所述比较鉴定患者中的临床风险是在计算机程序的协助下完成的。
59.用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂在制备试剂盒中的用途,其中所述试剂盒用于通过确定生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平从而鉴定患有或被怀疑患有流感感染的患者中的临床风险，且所述试剂盒包含用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂，其中所述临床风险是由所述感染引起的需要住院、实施重症监护、生命支持治疗中的一项或多项的严重疾病的风险。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述至少一种药剂是引物、抗体或探针。
61.如权利要求60所述的用途，其中所述引物或探针对选自以下的核酸序列具有特异性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的序列。
62.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含能够选择性扩增选自以下的核酸序列的正向和反向引物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的序列。
63.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含选自以下的一种或更多种核酸序列：SEQ ID NO:7(acctcatcagcagtgaccagt)、SEQ ID NO:8(acatcatcttggctgctatgg)、SEQ ID NO:9(TGCCTCGGGCAGCCT)和SEQ ID NO:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)。
64.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含能够检测生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的存在的多种药剂。
65.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含能够特异性结合由IFI27基因序列编码的多肽的抗体。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述抗体是对IFI27具有特异性的缀合抗体。
67.如权利要求65所述的用途，其中所述抗体是多克隆抗体。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述多克隆抗体是兔多克隆抗体。
69.如权利要求65所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
70.如权利要 求65所述的 用途 ，其 中所述抗 体结合以下 表位序列 ：
MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY。
71.如权利要求65所述的用途，其中所述抗体能够选择性结合以下多肽：(i)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的IFI27多肽，或(ii)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的IFI27多肽。
72.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含用于标准化的一种或更多种药剂。
73.如权利要求72所述的用途，其中所述用于标准化的药剂选自用于检测组成型表达的基因产物的一种或多种药剂。
74.如权利要求73所述的用途，其中所述组成型表达的基因产物是GAPDH。
75.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含一种或更多种校准标准，其中所述标准包含已知浓度的IFI27基因产物。
76.如权利要求59所述的用途，其中所述试剂盒包含一种或更多种选自以下的另外的组分：(i)一个或更多个参考样品；(ii)一种或更多种可检测的部分；(iii)将用于检测IFI27基因产物的药剂固定于固相支持物上的一种或更多种物质；(iv)固相支持物质；(v)用于生物样品的收集和/或储存的一个或更多个容器；(vi)用于生物样品的制备的一种或更多种试剂；(vii)用于核酸序列的扩增的一种或更多种药剂；以及(viii)在用于通过确定生物样品中IFI27基因产物水平从而鉴定患有或被怀疑患有流感感染的患者中的临床风险的方法中使用所述试剂盒或其组分的说明，其中所述临床风险是发展成由所述感染引起的严重疾病的风险。
77.用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂在制备组合物中的用途,所述组合物用于通过如下方法评估用于降低被暴露于流感病毒的个体的疾病严重性的药剂的有效性，所述方法包括将所述药剂施用给所述个体，确定来自所述个体的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平，并将所述确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
78.如权利要求77所述的用途，其中所述个体在施用所述药剂之前被暴露于流感病毒。
79.如权利要求77所述的用途，其中当被施用所述药剂时所述个体患有流感感染。
80.如权利要求77所述的用途，其中所述个体在施用所述药剂之后被暴露于流感病毒。
81.如权利要求77所述的用途，其中所述方法进一步包括在施用所述药剂之前确定从所述个体获取的生物样品中IFI27基因产物的水平。
82.如权利要求77所述的用途，其中在施用所述药剂之后来自所述个体的生物样品中IFI27基因产物的水平与所述施用之前的水平相比下降表示药剂能够降低被暴露于流感病毒或患有流感感染的患者中的疾病严重性。
83.如权利要求77所述的用途，其中所述方法是作为用于流感的预防或治疗的候选抗病毒药剂的研究试验或临床试验的一部分进行的。
流感中的风险分层
发明领域
[0001] 本发明涉及用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中的临床风险的方法。本发明还涉及用于区分患有流感或病毒性肺炎的患者和具有症状上类似的状况的患者的方法。本发明的所述方法包括在来自患有或被怀疑患有流感的患者的生物样品中确定干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)的表达水平。本发明还提供了包含适合实施所述方法的组分的试剂盒。
本发明允许将患者分层为界定临床风险的组，例如基于所述受试者长期健康的风险严重性的组。
本发明允许将患者分层为界定临床风险的组，例如基于所述受试者长期健康的风险严重性的组。
[0002] 发明背景
[0003] 已经报道流感/肺炎在美国前十位死因中排名第八位。流感病毒感染代表了每年在全球范围影响人数最多的最常见传染病。流感以季节性流行的方式在全球范围内快速蔓延，并造成相当大的住院负担。尽管难以进行全球性评估，世界卫生组织(WHO)估计每年的流行病发病率在3-5百万危重病例之间，死亡率在每年全球250,000-500,000例死亡之间。在美国，WHO已经估计流感流行影响5-15％的美国人口患有上呼吸道感染，住院和死亡主要是高风险组(如老年人和慢性病患者)，并且对美国经济造成每年US$710-1670亿的相应成本。在发达国家中，来自流感的大多数死亡发生于超过65岁的老年人中。感染的流行以及患者遭受的潜在严重程度，以及相应的经济成本，已经使得对它们的检测和治疗成为健康护理系统的优先事项。
[0004] 从临床角度来看，不能鉴定患有具有较高风险发展成严重疾病的流感感染患者，延迟了适合这类高风险患者的治疗的给予，并且对所述患者的康复和长期健康具有深远的影响。在发展成为严重疾病的患者中，在文献中已经一直报道5-7天的平均延迟。在具有发展成严重疾病风险的患者中避免治疗延迟是至关重要的，因为及时给予重症监 护治疗与降低流感死亡的风险有关。例如，最近有报道说，从症状发作到住院延迟一天增加5.5％的(HIN1)流感死亡的风险1。
[0005] 通常情况下，仅凭临床背景(例如，流感样症状的历史)而怀疑流感感染，并且所述个体在没有任何正式实验室测试的情况下用抗病毒药物进行治疗。因此，临床决策并不是必须与所述个体是否具有流感病毒有关，而是所述个体是否应当允许住院或安全地返回家中。在这样的背景下，针对流感病毒存在的诊断测试可能是多余的。相反，临床医生需要一个测试，可以帮助他们量化患者会如何充分地应答流感感染，其最终确定疾病严重程度。所述疾病严重程度越严重，所感染的受试者越有可能变得恶化，并因此需要住院。
[0006] 目前，也有一些实验室方法，可以可靠地评估流感感染的严重程度。评估流感感染的严重程度的方法一个例子涉及测试气道样品中的病毒载量(load)，作为已被认为是与疾病的严重程度有关的流感病毒复制的程度。但是，对于气道和血清样品的研究已经显示，无论疾病的严重程度如何，病毒载量是相同的2，12。这证实流感感染的严重程度并不必然与表现为感染结果的疾病严重程度相关。
[0007] 因此，由于各种理由，尽管诊断测试可以确定流感病毒的存在或不存在并因此可以协助临床医生，它们可能仍然不足以对临床决策产生影响，因为病毒的存在并不总是等同于可能是感染患者中疾病进展的真正原因的异常免疫应答。
[0008] 为了给患有确认的流感感染的个体或有流感感染症状的个体提供及时和适当的治疗，需要评估疾病严重程度或由于该感染造成的潜在的疾病严重程度的特异性测试。这样的严重程度分层工具将协助这样的患者的管理。它允许临床医生鉴定能够安全地出院回家的患者，同时那些被鉴定患有更加严重的疾病的或者具有发展成更加严重的疾病的较高风险的患者被允许住院以进一步观察和治疗。它还给医生机会，采用预防措施阻止或减缓在可以仅有轻微的症状但有可能发展成严重疾病的患者中的疾病进展。
[0009] 存在对用于评估患有或被怀疑患有流感的个体以协助提供预后和诊断信息来帮助制定临床决策的改进方法的需要。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明人已经认识到，在患者显示任何严重疾病的指征之前，能够区分可能需要医院或临床环境的医疗介入的流感患者和可能安全地返回家中的流感患者(不管他们已被确认和/或有症状)的方法，将大大有助于医生制定更好的治疗决策。
[0012] 本发明是基于(至少部分基于)发明人的所述鉴定，其中受试者中的干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平与该受试者中流感感染所引起的疾病严重程度相关。该相关性可以用于在所述受试者具有流感感染症状或具有严重疾病症状之前，预测受试者中从感染引起的疾病的严重程度。本发明涉及用于在流感感染过程中检测所述宿主应答的特定方面的方法，其可以表示患者的不充分的应答和发展成需要医院或临床环境的医疗介入的严重疾病的可能性。在实施方案中，本发明的所述方法可以被用于评估患有流感感染的患者，以确定哪些个体具有临床风险(成为那些很可能发展成由所述感染引起的严重疾病的个体)，其特征在于需要医疗介入(如住院或者甚至生命支持治疗)。
[0013] 本发明应用于健康护理中，如在流感感染的早期管理中，在监测患者对所述感染的免疫应答中，以及在给处于风险中的个体(其可能被传统诊断方法以其它方式错过)提供拯救生命的介入中。本发明人构想，在呈现给医生手术或住院的怀疑患有流感感染的患者中，IFI27基因表达水平能协助临床医生预测患者是否能够安全地出院回家或是否需要住院。在这种情况下，IFI27表达的正常水平可以表示患者或者没有患有流感或者患有流感但不具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况下，他们可以出院。但是，IFI27表达上调的水平可以表示患者患有流感感染并且具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况下，所述患者可能需要医院或临床环境的医疗介入。
[0014] 例如，对于医生的手术患者可能呈现怀疑患有流感感染，以及相对轻微的感染症状，其通常导致患者被以最少的药物治疗送回家中。但是，本发明可以用于确定患者是否具有临床风险，在这种情况下， 治疗医师能够在早期介入，并且在所述感染表现为严重疾病之前将所述患者收治入院，以进行监测和治疗。
[0015] 在另一个例子中，患者可以在医院并被确认患有流感感染，并可以显示出与严重疾病的发展一致的一些症状。通常情况下，这可能会导致病人被送进医院治疗。然而，本发明可用于预测患者是否实际上是可能发展成作为流感感染结果的严重疾病，这可以协助临床医生适当分配工作人员和资源。因此，本发明可以防止过度管理所述患者，其中患者被预测为不具有临床危险，也不会发展成作为所述感染结果的严重疾病。
[0016] 在又一个例子中，本发明人构想，在流感流行或大流行时，当难以确定个体是否感染流感且临床资源需要被保留用于临床风险的患者时，本发明可以提供有用的筛选工具。在这些情况下，本发明可以被用于筛选可能显示或可能不显示任何流感感染迹象的个体或个体的组，以确定他们是否具有发展成作为流感感染结果的严重疾病的临床风险。在筛选过程中，IFI27表达的正常水平可以表示患者或者没有患有流感或者确实患有流感并且不具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况下，他们的监测或治疗可以降低优先级。但是，IFI27表达上调的水平可以表示患者患有流感感染并且具有发展成严重疾病的较高风险，因而具有临床风险的患者，在这种情况下，所述患者可能被进一步监测和治疗。
[0017] 类似地，本发明人构想，在由于流感感染住院的患者中，IFI27基因表达可以协助临床医生预测患者的免疫应答的充分性，以及患者是否会进一步恶化或康复。在预测所述患者会进一步恶化的情况下，可以给所述患者实施合适的治疗方案(protocol)，如进入重症监护病房。可选地，所述患者有可能康复的判定会允许患者留在标准医院病房，而不是可能占用重症监护病房中的有用资源。本发明人构想，IFI27基因表达水平还可以被用于协助临床医生不断监测患者，例如在抗病毒治疗或与所述患者状况的治疗相关的其它护理之后。
[0018] 在实施方案中，本发明提供基因表达测定以测量被怀疑具有流感感染的个体中IFI27的mRNA表达水平。高水平的IFI27基因表达表 明免疫去补偿(decompensating)的风险显著增加，因而警告医生患者的临床状况即将恶化。IFI27基因表达的测量通过精确地区分能够安全地出院回家的个体和呈现发展成严重疾病的临床风险并需要住院的个体，从而协助医生制定他们的临床决策(即，风险分层)。因此，在流感流行和大流行过程中，本发明在患者的初始分诊中也具有实际用途。
[0019] 在一个方面，本发明提供用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中临床风险的方法，所述方法包括确定在来自所述患者的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
[0020] 在一个实施方案中，所述患者患有或被怀疑患有甲型流感或乙型流感感染或其亚型感染。在一个实施方案中，所述亚型是甲型流感的季节性毒株。在一个实施方案中，所述亚型是乙型流感的季节性毒株。
[0021] 在一个实施方案中，IFI27基因产物的标准水平表示没有临床风险，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
[0022] 在一个实施方案中，所述表示没有临床风险的标准水平是基于健康受试者中的IFI27的水平。
[0023] 在一个实施方案中，所述标准水平是基于感染流感病毒但无症状的受试者中IFI27的水平，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中的临床风险。
[0024] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物的标准水平表示有临床风险，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比相等或升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中的临床风险。
[0025] 在一个实施方案中，所述标准水平是在确定在来自所述患者的生物样品中IFI27基因的表达水平的同时进行制备的。
[0026] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或感染流感病毒但无症状的受试者的标准水平，IFI27基因产物水平为至少40-60倍表示有临床风险。
[0027] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或感染流感病毒但无症状的受试者的标准水平，IFI27基因产物水平为至少60倍表示有临床 风险。
[0028] 在一个实施方案中，所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示临床风险的预先确定的量，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比具有相等或升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
[0029] 在一个实施方案中，所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示没有临床风险的预先确定的量，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比具有升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风险。
[0030] 在一个实施方案中，本发明提供监测患有流感的患者的进展的方法，所述方法包括确定来自所述患者的第一生物样品中IFI27基因的表达水平，以及确定来自所述患者的第二生物样品中IFI27基因的表达水平，其中所述第一和第二样品是在不同的时间从所述患者获得的，并且基于在所述第一和第二样品中IFI27的相对表达水平评估患者的状态。在一个实施方案中，与所述第一生物样品相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水平升高表示在所述患者中具有增加的临床风险。在一个实施方案中，与所述第一生物样品相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水平下降表示在所述患者中具有降低的临床风险。
[0031] 在另一个方面，本发明提供用于在患者中鉴定流感或病毒性肺炎的方法，所述方法包括确定在来自所述患者的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与IFI27基因产物标准水平进行比较。
[0032] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物的标准水平是基于健康受试者中IFI27的水平，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27表达水平表示在所述患者中患有流感或病毒性肺炎。
[0033] 在一个实施方案中，所述患者被怀疑患有病毒性肺炎或细菌性肺炎。
[0034] 在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定流感或病毒性肺炎的方法，其中所述标准水平是基于患有细菌性肺炎的受试者中的IFI27基因产物的水平，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中患有流感或病毒性肺炎。
[0035] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水平，IFI27基因产物水平为至少10倍表示患有流感或病毒性肺炎。
[0036] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水平，IFI27基因产物水平为至少40-60倍表示具有流感或病毒性肺炎和临床风险的患者。
[0037] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水平，IFI27基因产物的水平为至少60倍表示具有流感或病毒性肺炎和临床风险的患者。
[0038] 以下实施方案适用于本文所述的本发明的所有方面。
[0039] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定在所述生物样品中至少一个另外的基因的表达水平。在一个实施方案中，所述至少一个另外的基因是其表达为组成型的基因。在一个实施方案中，所述至少一个另外的基因是其表达不被流感感染影响的基因。在一个实施方案中，所述至少一个另外的基因是GAPDH基因。
[0040] 在一个实施方案中，所述生物样品是血液或其组分如血细胞亚群。在一个实施方案中，所述生物样品包含白细胞的亚群。
[0041] 在一个实施方案中，所述方法包括处理来自所述患者的血液样品，以富集浆细胞样树突细胞(pDCs)的存在。
[0042] 在一个实施方案中，所述方法包括将所述生物样品和能够与IFI27基因产物结合的药剂(agent)接触，并且检测所述药剂和所述IFI27基因产物之间的结合。
[0043] 在一个实施方案中，所述生物样品是RNA、mRNA或蛋白质。
[0044] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是IFI27 mRNA或其片段。 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO：1的核酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO：2的核酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是同种型(isoform)1转录变体。在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是同种型2转录变体。
[0045] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是IFI27多肽或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其片段或变体。
[0046] 在一个实施方案中，所述方法包括mRNA反转录为cDNA。在一个实施方案中，所述IFI27 cDNA序列包含SEQ ID NO：5的序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27 cDNA序列包含SEQ ID NO：6的序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述方法包括扩增所述样品的IFI27核酸序列(如cDNA序列)和检测所扩增的序列。在一个实施方案中，所述扩增包括聚合酶链式反应(PCR)。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应包括定量聚合酶链式反应(qPCR)。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应利用能够扩增选自以下的核酸序列的一个或更多个引物：(i)SEQ ID NO：1，(ii)SEQ ID NO：2，(iii)SEQ ID NO：5，(iv)SEQ ID NO：6，和(v)或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中任意一个的片段或变体。
[0047] 在一个实施方案中 ，所述聚合酶链式反应利用SEQ ID NO：7(acctcatcagcagtgaccagt)和SEQ ID NO：8(acatcatcttggctgctatgg)的引物序列中的一个或两个，或其能够扩增相同靶序列的序列变体。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应可以利用SEQ ID NO：9(TGCCTCGGGCAGCCT)和SEQ ID NO：10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)的引物序列中的一个或两个，或其能够扩增相同靶序列的序列变体。
[0048] 在一个实施方案中，所述方法包括将所述样品与能够特异性结合IFI27基因产物或其片段或变体的一个或更多个探针接触。在一个实施方案中，所述一个或更多个探针是包含以下序列的核酸：(i)与SEQ ID NO：1所示的序列互补的序列，或(ii)与SEQ ID NO：2所示的序列互补的序列，或者(i)或(ii)的片段或变体。在一个实施方案中，所述一个或更多个探针是包含以下序列的核酸：(i)与SEQ ID NO：5所示的序列互补的序列，或(ii)与SEQ ID NO：6所示的序列互补的序列，或者(i)或(ii)的片段或变体。在一个实施方案中，所述核酸探针包含10-50个碱基。在一个实施方案中，所述核酸探针包含30-600个碱基。
[0049] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)从患有或被怀疑患有流感感染的患者获取血液样品；(ii)从所述血液样品制备总RNA分离物；(iii)通过所述总RNA分离物的反转录制备cDNA；(iv)通过聚合酶链式反应扩增IFI27核酸序列；(v)将所述扩增的IFI27核酸序列的水平与标准进行比较；(vi)基于所述比较确定所述患者是否具有临床风险。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应是定量聚合酶链式反应。在一个实施方案中，所述标准可以是基于表示有临床风险的或者表示没有临床风险的IFI基因产物的标准水平。
[0050] 在一个实施方案中，所述方法包括确定IFI27多肽或其片段的水平。在一个实施方案中，所述方法包括确定IFI27多肽的水平，所述IFI27多肽包含：(i)SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或(ii)SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者(i)或(ii)的抗原片段或变体。在一个实施方案中，所述方法包括将所述样品和能够与包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其抗原片段或变体的IFI27多肽选择性地结合的抗体接触。
[0051] 在一个实施方案中，所述方法包括凝胶电泳、核酸测序和氨基酸测序中的一个或更多个。
[0052] 在一个实施方案中，所述方法完全在离体(ex vivo)进行。在一个实施方案中，将在生物样品中确定的IFI27基于产物的水平与标准水平进行比较是在计算机程序的协助下完成的。在一个实施方案中，基于所述比较给患者分配临床风险是在计算机程序的协助下完成的。
[0053] 在第二个方面，提供用于确定在生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测IFI27 基因产物的存在的至少一种药剂。
[0054] 在一个实施方案中，所述至少一种药剂是引物、抗体或探针。在一个实施方案中，所述引物或探针对选自以下的核酸序列具有特异性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的序列，或者其变体或片段。在一个实施方案中，所述试剂盒包含能够选择性扩增选自以下的核酸序列的正向和反向引物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的序列，或者其变体或片段。
[0055] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含选自以下的一种或更多种核酸序列：SEQ ID NO：7(acctcatcagcagtgaccagt)、SEQ ID NO：8(acatcatcttggctgctatgg)、SEQ ID NO：9(TGCCTCGGGCAGCCT)和SEQ ID NO：10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)，或者其能够特异性结合相同靶序列的序列变体。
[0056] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含能够检测生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的存在的多种药剂。
[0057] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含能够特异性结合由IFI27基因序列编码的多肽或其片段或变体的抗体。在一个实施方案中，所述抗体对IFI27具有特异性的缀合抗体。在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，所述多克隆抗体是兔多克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合至该表位序列：MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY。
[0058] 在一个实施方案中，所述抗体能够选择性地结合至：(i)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的IFI27多肽，或(ii)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的IFI27多肽，或者(iii)(i)或(ii)的抗原片段或变体。
[0059] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于所述方法的标准化的一种或更多种药剂。在一个实施方案中，所述用于标准化的药剂选自用 于组成型表达的基因产物的检测的一种或多种药剂。在一个实施方案中，所述组成型表达的基因产物是GAPDH。
[0060] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或更多种校准标准，其中所述标准包含已知浓度的IFI27基因产物。在一个实施方案中，所述已知浓度的IFI27基因产物是表示具有可以忽略不计的来自流感感染的严重疾病的临床风险的个体的量，或表示处于来自流感感染的严重疾病的临床风险的个体的量。
[0061] 在一个实施方案中，所述校准标准涵盖表示IFI27基因产物量的范围，如表示可以忽略不计的临床风险的量，表示相比典型的健康个体高大约5-10倍的量，表示相比典型的健康个体高大约10-20倍的量，表示相比典型的健康个体高大约20-40倍的量，表示相比典型的健康个体高大约30-60倍的量，表示相比典型的健康个体高大约50-60倍的量，表示相比典型的健康个体高大约50-100倍的量，表示相比典型的健康个体高大约100-200倍的量，表示相比典型的健康个体高大约150-600倍的量，或表示相比典型的健康个体高大约500-1000倍的量。
[0062] 在一个实施方案中，所述校准标准涵盖表示IFI27基因产物量的范围，如表示临床风险的量，表示相比典型的具有流感感染和临床风险的个体高大约1-2倍的量，表示相比典型的具有流感感染和临床风险的个体高大约2-4倍的量，表示相比典型的具有流感感染和临床风险的个体高大约3-6倍的量，表示相比典型的具有流感感染和临床风险的个体高大约5-10倍的量，或表示相比典型的具有流感感染和临床风险的个体高大约10-20倍的量。
[0063] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含选自以下的一种或更多种另外的组分：(i)一个或更多个参考样品；(ii)一种或更多种可检测的部分；(iii)将用于检测IFI27基因产物的药剂固定于固相支持物上的一种或更多种物质；(iv)固相支持物质；(v)用于生物样品的收集和/或存储的一个或更多个容器；(vi)用于生物样品的制备的一种或更多种试剂(reagent)；(vii)用于核酸序列的扩增的一种或更多种药剂；以及(viii)在用于确定生物样品中IFI27基因产物的水平的方法中使用所述试剂盒或其组分的说明。
[0064] 在又一个方面，提供评估用于流感治疗的药剂的有效性的方法，所述方法包括将所述药剂施用给患有流感感染的个体，并确定来自所述个体的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平，并将所述确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
[0065] 在又一个方面，提供评估用于降低被暴露于流感病毒的个体的疾病严重性的药剂的有效性的方法，所述方法包括将所述药剂施用给患有流感感染的个体，确定来自所述个体的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平，并将所述确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
[0066] 在一个实施方案中，在所述药剂的施用之前，将所述个体暴露于流感病毒。在一个实施方案中，当被施用所述药剂时所述个体患有流感感染。在一个实施方案中，在所述药剂的所述施用之后，将所述个体暴露于流感病毒。
[0067] 在一个实施方案中，所述表示有临床风险的标准水平包括界定临床风险的标准曲线。在一个实施方案中，本发明的所述方法包括涵盖IFI27的量的范围(如从可以忽略不计的临床风险到严重疾病的临床风险的范围)的标准曲线的用途。
[0068] 在一个实施方案中，所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示临床风险的预先确定的量。
[0069] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括在施用所述药剂之前确定从所述个体获取的生物样品中IFI27基因产物的水平。在一个实施方案中，在施用所述药剂之后，来自所述个体的生物样品中IFI27基因产物的水平与所述施用之前的水平相比的下降，表示药剂能够降低被暴露于流感病毒或患有流感感染的患者中的疾病严重性。
[0070] 在一个实施方案中，所述方法是作为用于流感的预防或治疗的候选抗病毒药剂的研究线索或临床试验的一部分进行的。
[0071] 缩略语
[0072] 本文的缩写RSV是用于指呼吸道合胞病毒。
[0073] 本文的缩写IFI27是用于指干扰素α可诱导蛋白27。本文的缩写p27也可以用于指干扰素α可诱导蛋白27。
[0075] 本文的缩写LPS是用于指脂多糖。
[0076] 定义
[0077] 如本申请中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。
[0078] 除非上下文另有要求或者被特别指出相反含义，否则本发明的整数、步骤或元素(element)在本文中记载为单数整数、步骤或元素其明确涵盖单数和复数形式的所述整数、步骤或元素。
[0079] 术语“至少一个”当用于可选择元素的组的上下文中时，包括独立选自该组的任意和所有成员，并且包括该组的成员的任意组合。类似地，术语“至少两个”当用于可选择元素的组的上下文中时，包括该组的两个或更多个成员以任何组合的方式的任意选择。
[0080] 如本文所使用的，术语“包含(comprising)”是指“包括(including)”。所述词语“包含(comprising)”的变体(如“包含(comprise/comprises)”)具有相应改变的含义。例如，因此，“包含(comprising)”编码蛋白质的序列的多核苷酸可以只由该序列组成或者可以包括一个或更多个另外的序列。类似地，“包括(comprising)”一个或更多个指定的活性的方法可以只由这些活性组成，或者可以包括一个或更多个另外的活性。类似地，“包含(comprising)”一个或更多个指定的组分的试剂盒，可以只由这些组分组成，或者可以包括一种或更多种另外的组分。
[0081] 如本文所使用的，术语“抗体(antibody/antibodies)”被以其最广泛的含义进行使用，并且包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY、全抗体(包括单链全抗体)及其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs (sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。所述抗体可以是来自任何动物来源。抗原结合抗体片段(包括单链抗体)可以只包含可变区或结合以下的全长或部分：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。还包括的是可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。抗体可以是单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的，以及特异性结合所述生物分子的人单克隆和多克隆抗体。
[0082] 如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且被认为具有相同的含义。
[0083] 如本文所使用的，术语“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换使用，并且被认为具有相同的含义。
[0084] 如本文所使用的，术语“试剂盒”是指用于递送物质的任何递送系统。在本文所述的检测测定和方法的上下文中，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如，在合适的容器中的标记、参考样品、支持物质等)和/或支持物质(例如，用于进行所述测定的缓冲液、书面说明等)从一个位置到另一个位置的存储、传输或递送。例如，试剂盒包括容纳相关反应试剂和/或支持物质的一个或更多个外壳(enclosure)，如盒子。
[0085] 已经被包括于本发明的说明书中的文件、行为、物质、设备(device)、物品等的任何讨论，仅是为了给本发明提供背景的目的。其不能被视为承认在本申请的优先权日之前，任何或所有的这些事项形成现有技术基础的部分或者本发明相关领域的公知常识。
[0087] 现在通过仅作为例子的方式，将参考附图对本发明的优选的实施方案进行描述，其中：
[0088] 图1显示采用全基因组微阵列分析筛选候选基因。从患有确认的流感感染的个体进行外周血取样。RNA被提取用于覆盖48,804个探针的微阵列分析(Illumina Sentrix HT-12_v3_BeadChip阵列)。基因表 达信号由每个轴上的表达密度的log2表示。对角线表示当两组进行比较时在表达中没有变化(H1N1流感vs.健康对照)。对角线之上的线表示基因上调至少两倍的增加。对角线之下的线表示基因下调至少两倍的增加。每个点代表在微阵列上的个体探针。IFI27代表α可诱导蛋白27(所述IFI27探针以红色突出)。
[0089] 图2显示在严重流感感染中IFI27的表达。发展组(n＝8)和验证组(n＝33)由患有严重流感肺炎的个体组成，其发展成呼吸衰竭并且需要住入重症监护病房。对照组(n＝18)由健康志愿者组成。通过PCR测量外周血IFI27基因表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。采用非参数曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验计算p值。
[0090] 图3显示IFI27表达和流感感染的严重程度。采用患有轻微疾病和严重疾病个体的独立数据集来验证生物标记物。轻微感染群包括无症状的(n＝8)和有症状的个体(n＝9)。严重感染群(n＝10)包括发展成呼吸衰竭并需要住入重症监护病房的个体。基因表达综合数据库(GEO)提供用于IFI27表达计算的微阵列数据集(GSE17156-轻微流感，GSE21802-严重流感)。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。采用非参数曼-惠特尼U检验计算p值。
[0091] 图4显示在发展组中从流感感染康复过程中IFI27的表达。在发展组中患有来自流感感染的严重疾病的患者(n＝8)被随访五天，并通过定量PCR在第一、第三和第五天测量了外周血IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0092] 图5显示在验证组中从流感感染康复过程中IFI27的表达。在验证组中患有来自流感感染的严重疾病的患者(n＝33)被随访五天，并通过定量PCR在第一、第三和第五天测量了外周血IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0093] 图6显示来自流感感染的轻微和严重疾病中干扰素来源的基因。深色条表示来自流感感染的轻微疾病中的基因表达。浅色条表示来自流感感染的严重疾病中的基因表达。
[0094] 图7显示IFI表达和增加的病毒载量。将从健康志愿者分离的外周血单核细胞与流感病毒(H1N12009)一起培养。通过定量PCR对 每个浓度的病毒载量测量了IFI27表达(MOI表示感染复数，并代表病毒对总细胞的比率)。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD，并代表来自三个不同受试者的独立实验。SEQ ID NO：1
[0095] 图8显示IFI27表达和抗病毒药剂。将从健康志愿者分离的外周血单核细胞(PBMC)与流感病毒(H1N12009)一起培养，并且然后用抗病毒药剂(奥司他韦)处理。奥司他韦H表示高浓度(37ng/μl)。奥司他韦L表示低浓度(0.3ng/μl)。通过定量PCR测量IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD，并代表来自三个不同受试者的独立实验。
[0096] 图9显示IFI27表达和干扰素通路的激活子。在通过IFN-α、IFN-β和IFN-λ刺激外周血单核细胞之后，通过PCR测量IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0097] 图10显示IFI27表达和干扰素α。将从健康志愿者分离的外周血单核细胞与不同浓度的干扰素α(IFN-α)一起培养。通过定量PCR测量IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD，并代表来自三个不同受试者的独立实验。
[0098] 图11显示IFI27表达和Toll样受体配体。将从健康志愿者分离的外周血单核细胞与抗Toll样受体的配体一起培养。对每个配体通过定量PCR测量IFI27的表达。针对每个Toll样受体(TLR)配体包括：TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR6、TLR8、TLR9(n＝2)、TLR4(n＝4)、TLR7(n＝10)进行来自不同受试者的独立实验。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。采用用于多组比较的Kruskal-Wallis检验计算p值。
[0099] 图12显示在Toll样受体7上的配体刺激之后不同免疫细胞亚群中IFI27表达。在用Gardiquimod(TLR7配体)刺激之后，通过定量PCR在每个免疫细胞亚群(包括CD4、CD8、中性粒细胞、B细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、髓样(myeloid)树突细胞(mDC)、浆细胞样树突细胞(pDC)、单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和单核细胞来源的树突细胞(MDDC))中测量了IFI27的表达。PBMC表示外周血单核细胞。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。采用用于多组比较的Kruskal-Wallis检验计算p值。
[0100] 图13显示IFI27表达和病毒抗原。针对用病毒抗原刺激通过定量PCR测量IFI27的表达。免疫细胞亚群包括CD4、CD8、中性粒细胞、B细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、髓样(myeloid)树突细胞(mDC)、浆细胞样树突细胞(pDC)、单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和单核细胞来源的树突细胞(MDDC)。PBMC表示外周血单核细胞。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0101] 图14显示在浆细胞样树突细胞中IFI27的表达和流感病毒。浆细胞样树突细胞与甲型流感病毒(包括H1N1(Carlifornia-2009)、H3N2(Victoria-2011))和乙型流感病毒一起培养。通过定量PCR测量IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。每个数据点代表来自两个不同受试者的独立实验。
[0102] 图15显示建议的IFI27基因表达机制。pDC表示浆细胞样树突细胞。TRL7表示Toll样受体7。IFNα表示干扰素α。MyD88表示髓样分化初级应答基因。IRF7表示干扰素调节因子7。
[0103] 图16显示在浆细胞样树突细胞(pDCs)中IFI27表达的时间进程(time-course)。流感病毒与浆细胞样树突细胞一起培养。每天通过定量PCR测量IFI27的基因表达。凋亡细胞被鉴定为膜联蛋白V和碘化丙啶双阳性(膜联蛋白V pos，PI pos)，如通过流式细胞术门控的。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0104] 图17显示应答细菌性和病毒性病原体的IFI27的表达。在通过病毒(H1N1流感病毒)和细菌刺激之后，通过定量PCR测量IFI27的基因表达(LPS表示脂多糖)。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0105] 图18显示在不同疾病状态中IFI27的表达。SIRS表示全身性炎症应答综合征。在患有流感肺炎(n＝8)、细菌性肺炎(n＝16)、SIRS(n＝12)和健康对照(n＝18)的个体中，通过定量PCR测量外周血IFI27的基因表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。采用非参数曼-惠特尼U检验计算p值。
[0106] 图19显示在细菌性和流感肺炎中IFI27的表达。在患有严重流感肺炎(n＝8)和细菌性肺炎(n＝16)的患者的两个群中，通过定量PCR测量IFI27的表达。柱状图示出了平均倍数变化+/-SD。
[0107] 图20显示在外伤和手术患者中IFI27的表达。
[0108] 图21显示在外伤患者的大群中IFI27的表达。采用外伤患者的独立群(n＝167)验证生物标记物。基因表达综合数据库(GEO)提供用于IFI27表达计算的微阵列数据集(GSE11375)。基因表达数据被记录28天以上。每个数据点代表个体患者的基因表达水平。
[0109] 图22显示IFI27 mRNA序列的核苷酸序列，同种型1(SEQ ID NO:1)。智人干扰素，α-诱导蛋白27(IFI27)，mRNA。NCBI参考序列：NM_001130080.1。引物退火位点(SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8)被突出并加下划线。
[0110] 图23显示IFI27 mRNA序列的核苷酸序列，同种型2(SEQ ID NO:2)。引物退火位点(SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8)被突出并加下划线。
[0111] 图24显示IFI27的氨基酸序列，同种型1(SEQ ID NO:3)。干扰素α-诱导蛋白27，[智人]。NCBI参考序列：NP_001123552.1。
[0112] 图25显示IFI27的氨基酸序列，同种型2(SEQ ID NO:4)。
[0113] 图26显示在本文实施例中IFI27的靶标区。核苷酸序列位置参考uc021sba.1__IFI27。引物退火位点(SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8)被突出并加下划线。
[0114] 图27显示在本文实施例中GAPDH的靶标区。核苷酸序列位置参考uc001qop.1__GAPDH(SEQ ID NO.:13)。外显子以大写字母字体显示。引物退火位点(SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15)被突出并加下划线。
[0115] 图28显示在智人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的核苷酸序列，转录变体1，mRNA。NCBI参考序列：NM_002046.4(SEQ ID NO.:12)。引物退火位点(SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15)被突出并加下划线。
[0116] 图29显示在智人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的核苷酸序列，转录变体2，mRNA。NCBI参考序列：NM_001256799.1(SEQ ID NO.:18)。引物退火位点(SEQ ID NO.:14和SEQ ID NO.:15)被突出并加下划线。
[0117] 本文所参考的序列
[0118] SEQ ID NO:1：IFI27 mRNA序列，同种型1；665个碱基；来自NM_001130080.1。
[0119] SEQ ID NO:2：IFI27 mRNA序列，同种型2；656个碱基。
[0120] SEQ ID NO:3：IFI27多肽氨基酸序列，同种型1；来自NP_001123552.1。
[0121] SEQ ID NO:4：IFI27多肽氨基酸序列，同种型2。
[0122] SEQ ID NO:5：IFI27 cDNA序列，同种型1；如可以从同种型1mRNA(SEQ ID NO:1)来自NM_001130080.1合成。
[0123] SEQ ID NO:6：IFI27 cDNA序列，如可以从同种型2mRNA(SEQ ID NO:2)合成。
[0124] SEQ ID NO:7：acctcatcagcagtgaccagt(IFI27正向引物59.8℃)。
[0125] SEQ ID NO:8：acatcatcttggctgctatgg(IFI27反向引物60.1℃)。
[0126] SEQ ID NO:9：TGCCTCGGGCAGCCT(IFI27正向引物)。
[0127] SEQ ID NO:10：TTGGTCAATCCGGAGAGTCC(IFI27反向引物)。
[0128] SEQ ID NO:11：如本文每个实施例的IFI27靶核酸序列。序列和坐标来自UCSC基因，uc021sba.1_IFI27，位置142-328。187bp的靶标区。
[0129] SEQ ID NO:12：GAPDH全长mRNA序列；转录变体1，mRNA；NCBI参考序列：NM_002046.4。
[0130] SEQ ID NO:18：GAPDH全长mRNA序列；转录变体2，mRNA；NCBI参考序列：NM_001256799.1。
[0131] SEQ ID NO:13：如本文每个实施例的GAPDH靶核酸序列。序列和坐标来自UCSC基因，uc001qop.1_GAPDH。
[0132] SEQ ID NO:14：ACGCATTTGGTCGTATTGGG(GAPDH正向引物)。
[0133] SEQ ID NO:15：TGATTTTGGAGGGATCTCGC(GAPDH反向引物)。
[0134] SEQ ID NO：16：cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(来自Gjermandsen et al，1999(ISG12f；)的IFI27正向引物)。
[0135] SEQ ID NO：17：cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(来自Gjermandsen et al，1999(ISG12r；)的IFI27反向引物)。
[0136] 发明详述
[0137] 本发明是基于(至少部分基于)发明人的所述鉴定，其中受试者中的干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平与该受试者中流感感染所引起的疾病严重程度相关。本发明可以被用于通过确定哪个个体具有临床风险(由更可能发展成严重疾病并需要医院或临床环境的医疗介入所界定)来评估感染流感的患者。该确定可以在患者具有流感感染症状之前，并且在患者显示表示严重疾病的症状之前被完成。所述医疗介入可以包括但不限于住院或生命支持治疗。本发明应用在健康护理中，例如在流感感染的早期管理中，在监测患者对所述疾病的免疫应答中，以及在给处于风险中的个体(其可能被传统诊断方法以其它方式错过)提供拯救生命的介入中。
[0138] 在本发明的一个方面，提供了用于鉴定在患有或被怀疑患有流感感染的患者中临床风险的方法，所述方法包括确定在来自所述患者的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。所述IFI27基因产物的标准水平可以是表示有临床风险或没有临床风险的水平。
[0139] 当将患者中的所述IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较时，患者中IFI27基因产物升高的水平可以被表述为相比(over)所述标准水平的倍数增加。在本发明的一个方面，患者中IFI27基因产物的水平是典型的健康受试者或患有无症状的流感的受试者中IFI27基因产物的水平的至少40-60倍表示有临床风险。在本发明的另一个方面，患者中IFI27基因产物的水平是典型的健康受试者或患有无症状的流感的受试者中IFI27基因产物的水平的至少40倍表示有临床风险。在进一步的方面，患者中IFI27基因产物的水平是典型的健康受试者或患有无症状的流感的受试者中IFI27基因产物的水平的至少50倍表示 有临床风险。在本发明的又一个方面，患者中IFI27基因产物的水平是典型的健康受试者或患有无症状的流感的受试者中IFI27基因产物的水平的至少60倍表示有临床风险。
[0140] 在本发明的另一个方面，提供了能够在生物样品中检测IFI27基因产物的药剂在制备用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中临床风险的诊断的用途。
[0141] 在本发明的另一个方面，提供了用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中临床风险的方法中的能够在生物样品中监测IFI27基因产物的药剂。
[0142] 应当理解的是，确定例如在生物样品中IFI27基因产物的水平，可以备选地在本文中被称为确定例如在生物样品中IFI27基因的表达水平。因此，确定IFI27基因产物的表达水平是指其最广泛的含义，使得所述“水平”可以包括任何IFI27转录物或下游产物，如IFI27蛋白或其片段。
[0143] 所述干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物可以是任何合适的基因产物，包括但不限于，核酸，例如RNA转录物，该转录物的cDNA衍生物等，蛋白质和多肽。典型地，所述基因产物是mRNA或其片段或多肽、蛋白质或其片段。
[0144] 本发明解决了在传染病医学中风险分层工具的缺乏，所述缺乏加重了传染病的发病率、死亡率和社会和财政成本，尤其是在流行病(例如，每年的季节性流感)或大流行病(例如，H1N1 2009流感病毒)，由于有效管理减轻传播和疾病严重程度的因素的能力被削弱了或者不可用。这样的减轻因素包括确定以下事项并优先排序：(1)患者需要隔离，以控制疾病传播；(2)患者恶化的易感性，以降低疾病严重程度和感染程度；以及(3)患者的预处置至共同发病率，以在早期中和高风险或困难病例。
[0145] 如本文所述的通过IFI27生物标记物的风险分层，可以尽可能减少住院的延迟并因此潜在地拯救生命。通过提供可在患者变得有感染或严重疾病的症状之前应用的用于流感感染的风险分层工具，高风险的患者可以被早期鉴定从而确保促进将合适的医疗护理递送给这些患 者。
[0146] 本发明的所述方法还允许临床医生监测患有流感的患者的进展。这允许所述临床医生监测可能从相对轻微的疾病表现恶化为临床风险的患者，或监测患者从临床风险状态到康复状态的改善。
[0147] 典型地，这种类型的监测可以在本发明的所述方法中完成，通过确定来自所述患者的第一生物样品中IFI27基因的表达水平，以及确定来自所述患者的第二生物样品中IFI27基因的表达水平，其中所述第一和第二样品是在不同的时间从所述患者获得的。例如，所述第一样品可以在治疗开始之前已经获得，并且所述第二样品可以在给定的时间段之后获得，在所述时间段过程中所述患者正在进行治疗或观察。
[0148] 如可以期望的，当然可以采用任何数量的后续样品来进一步监测所述患者。可以以合适的间隔从所述患者获取样品，如一小时或几小时、或每天或每周的间隔。可以在已经进行某种治疗之后获取样品，如施用治疗剂以治疗由所述流感感染所引起的疾病。
[0149] 以这种方式，与所述第一生物样品相比，在所述第二(或后续)生物样品中IFI27基因产物的水平的升高表示在所述患者中增加的临床风险，而下降则表示降低的临床风险。增加的临床风险可以被定义为所述患者会需要或继续需要医疗介入的可能性增加，而降低的临床风险是所述患者会需要或继续需要医疗介入的可能性降低。根据该监测的结果，所述临床医生可以调整所述患者的治疗。所述方法从而协助临床医生治疗和管理患者。
[0150] 本发明人还已经通过体外测试证实，IFI27表达的升高对流感感染具有特异性，并且不在细菌性感染中增加。作为结果，本发明还提供将具有其它状况(可呈现类似症状如细菌性肺炎)的患者和患有流感和相关状况(如病毒性肺炎)的患者区分的方法。这种能力在许多情况下有利于进行治疗的临床医生，并能有助于避免过度管理那些可能有可表示既有流感又有细菌性感染症状的患者。因此，本发明可以减轻典型的流感感染管理的一种或多种问题，特别是在一般的实践层面上，如用抗生素预防来“过度治疗”流感患者而不是分层诊断。这种做法是如此广泛使得对抗生素有抗药性的细菌正在出现。本发明可以 减轻所述疾病的管理总体不足或过度管理的情况，分别导致大规模不必要的发病率而常常加重产生死亡率，或者导致抗生素的过度处方而刺激抗药性细菌的发展。
[0151] 在另一种情况下，病人可能会先以病毒性肺炎住院。所述患者可能随后发展成并发症，如细菌性肺炎。临床医生需要知道所述患者没有变好是否因为(1)病毒性肺炎仍然存在，或者(2)细菌性感染已经叠加了。本发明提供了基于IFI27基因产物的表达区分这二者的能力，如通过对来自所述患者的生物样品的分析所确定的，如果病毒性肺炎仍然存在和/或临床显著流感仍然存在，IFI27基因产物的表达会在所述患者中升高，但是如果所述患者相反患有细菌性肺炎，其会在或者接近基线水平。
[0152] 进一步的情况是，所述患者首先呈现给急诊科的是非典型的或不寻常的症状，使得医生不能在第一时间有信心诊断它是细菌性还是病毒性肺炎。这是一个比较常见的临床窘境，到目前为止，传统的测试都没有对解决这个问题有所帮助。作为一项预防措施，这样的患者往往会用抗生素治疗。通过提供区分仅患有细菌性肺炎的患者(其中预期IFI27表达水平不会升高)和患有病毒性肺炎的患者(其中预期在来自所述患者的生物样品中确定的IFI27表达会升高)的能力，本发明给医生提供了改善的诊断工具，从而临床相关治疗可以在更早的时间开始。
[0153] 在另一个方面，本发明从而提供用于在患者中鉴定流感或病毒性肺炎的方法，所述方法包括确定在来自所述患者的生物样品中IFI27基因的表达水平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。所述标准水平可以是基于健康患者或患有细菌性肺炎的患者中IFI27基因产物的水平，其中在所述患者中升高的IFI27基因产物的水平表示患者患有流感或病毒性肺炎。
[0154] 在本发明的一个方面，在来自患者的生物样品中相比所述标准水平，IFI27基因产物水平为至少10倍表示流感或病毒性肺炎。
[0155] 在本发明的另一个方面，提供了能够检测生物样品中IFI27基因产物的药剂在制备用于鉴定患者中流感和病毒性肺炎的诊断的用途。
[0156] 在本发明的另一个方面，提供了用于鉴定患者中流感和病毒性肺炎的方法的能够检测生物样品中IFI27基因产物的药剂。
[0157] 在本发明的另一个方面，提供了用于鉴定患者中流感和病毒性肺炎的方法的试剂盒，所述试剂盒包含能够检测生物样品中IFI27基因产物的至少一种药剂。
[0158] 由本发明人鉴定的IFI27表达与由流感感染引起的疾病严重程度相关在可用于流感治疗或预防的药剂的测试和用于测试方面具有好处。例如，这可以是能够在暴露于流感病毒的受试者中降低疾病严重程度的药剂。抗病毒(流感病毒)是研究的主要领域，进行临床试验以研究潜在的或推定的抗病毒药物或药剂的效果。典型地，这些试验使用临床参数，如心率、血液中的氧气水平、血压、死亡率(death rate)(死亡率(mortality))等。这些参数有显著的局限性。这是因为它们不是测量疾病严重程度(例如，心率和血压对于感染严重程度是非特异性的)。此外，在流感感染中如死亡的事件是罕见的事件。这意味着在临床试验中需要招募成千上万的患者，以便有足够的统计学效力以检测治疗组和对照组之间的差异。在临床试验中克服或改善局限性的替代方法是使用替代标记物。理想的情况下，替代标记物反映了疾病的生物活性，并与治疗效果相关(即，随着治疗的成功其水平降低)。如本文所证实，IFI27具有成为这样的替代标记物的潜力。它可以帮助在抗病毒药物的临床试验过程中监测治疗应答。
[0159] 干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)
[0160] IFI27是未知功能的小干扰素α可诱导基因家族中的一个成员。IFI27可选地被称为干扰素α诱导的11.5kDa的蛋白、干扰素刺激基因12a的蛋白和可选的缩写ISG12、ISG12(a)、FAM14D和P27。IFI27的cDNA最初被克隆为在人上皮细胞系MCF-7中的雌激素可诱导基因并命名为p273。已经报道，IFI27在银屑病皮损区表皮中皮损和非皮损银屑病皮肤中上调4，以及在定量RT-PCR研究中在非皮损角质形成细胞中为可检测的5。同样的研究还报道在其它皮肤状况下的表达，如扁平苔癣、慢性湿疹、皮肤鳞状细胞癌，并当角质形成细胞用IFN-γ、TNF-α或TGF-β1刺激时显示上调表达。作为结果，已经推定IFI27是 上皮细胞增殖和癌症的标记物。还已经报道，与骨关节炎和类风湿性关节炎的滑膜组织相比，IFI27在全身性红斑狼疮滑膜组织中显著过度表达6。
[0161] 本申请提供了IFI27增加的表达水平和在患有流感的受试者中临床风险之间的相关性的第一次描述。
[0162] 人IFI27基因长11,852bp、位于14q32。有报道剪接变体产生不同的蛋白同种型7。有两种已知的IFI27转录变体，称为同种型1(665个核苷酸)和同种型2(656个核苷酸)。NM_
001130080.1是同种型1的NCBI参考序列(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001130080.1)。该变体代表在人类群体中通常发现的等位基因。完整的多肽序列是119个氨基酸(http：//www.uniprot.org/uniprot/P40305)。NM_005532.3是同种型2的NCBI参考序列(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005532.3)。该变体(2)代表与变体1相比，在CDS中缺少9-nt节段的替代性等位基因。所得到的同种型(2)与同种型1相比，缺少内部3个氨基酸节段并且在两个相邻氨基酸不同。该变体代表在人类群体中通常发现的第二个等位基因。所述IFI27多肽可选地被称为干扰素α诱导的11.5kDa的蛋白。
001130080.1是同种型1的NCBI参考序列(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001130080.1)。该变体代表在人类群体中通常发现的等位基因。完整的多肽序列是119个氨基酸(http：//www.uniprot.org/uniprot/P40305)。NM_005532.3是同种型2的NCBI参考序列(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005532.3)。该变体(2)代表与变体1相比，在CDS中缺少9-nt节段的替代性等位基因。所得到的同种型(2)与同种型1相比，缺少内部3个氨基酸节段并且在两个相邻氨基酸不同。该变体代表在人类群体中通常发现的第二个等位基因。所述IFI27多肽可选地被称为干扰素α诱导的11.5kDa的蛋白。
[0163] 已经在各种报道中研究了IFI27的表达，最初采用核苷酸水平的研究，例如通过5，6，8 5
RT-PCR ，和通过Northern分析。还已经基于IFI27多肽水平的定量分析报道了IFI27基因产物的表达，例如采用免疫测定或蛋白印迹6。在之前的出版物中所述的用于IFI27基因产物表达的检测和/或确定的方法适用于本发明的方法的工作和其中描述的方法和药剂，其作为参考引入。
RT-PCR ，和通过Northern分析。还已经基于IFI27多肽水平的定量分析报道了IFI27基因产物的表达，例如采用免疫测定或蛋白印迹6。在之前的出版物中所述的用于IFI27基因产物表达的检测和/或确定的方法适用于本发明的方法的工作和其中描述的方法和药剂，其作为参考引入。
[0164] 患者
[0165] 本发明的方法包括分析患者样品中IFI27基因产物的存在和定量。以这种方式，在所述样品中的IFI27基因产物的水平可以被确定，从而允许鉴定患者中的临床风险。类似地，本发明的所述方法允许评估患者中流感或病毒性肺炎的存在，以区分于具有类似临床表现的状况(如细菌性肺炎)。
[0166] 应当理解的是，本文使用的术语“患者”意图具有广泛的含义。所述患者是就实施所述方法的任何个体。典型地，所述患者是患有或者被怀疑患有流感感染的个体。通过非限制性例子的方式，所述患者可以是住院个体、出现在医院门诊或急诊科的个体、出现在医生诊所或手术或医学实践或处于任何健康评估或健康测试机构的个体。所述患者可以是其呈现或不呈现流感感染的一种或更多种症状的群体一员的个体。所述患者可以是被认为是由于流感感染而“处于风险中”潜在性发展成严重疾病的一组或一群的一员，例如，老年人、慢性病患者、免疫受损、具有来自流感病毒的严重疾病史的那些患者、具有流感样症状史的那些患者。这样的组或群的成员可以经受作为广泛健康目标一部分的筛查，如在流感爆发、大流行或流行期间。
[0167] 生物样品
[0168] 在实施方案中，本发明的所述方法包括从所述患者获取生物样品。所述生物样品典型地是血液样品。所述生物样品可以是血液的选定组分如血细胞亚群、蛋白级分，或核酸级分如总RNA或mRNA。所述生物样品可以被处理而分级分离或富集一种或更多种组分的存在，如白细胞或其特异性组分如pDCs。
[0169] 在本发明的所述方法的进行中，从患者获取生物样品(如血液样品)的步骤可以是作为连续系列步骤的一部分进行。从患者获取血液样品的步骤可以作为不同于本发明的所述方法的一个或更多个剩余步骤的独特步骤或多个步骤，例如，在时间、地点或操作者中为分开的。因此，在本发明的所述方法的进行中，获取所述血液样品可以或可以不涉及从所述患者提取血液。例如，进行本发明的所述方法可以包括在容器中接收血液样品，所述血液之前已经被作为独立于进行本发明的所述方法的操作从所述患者提取了。作为进一步的例子，获取血液样品可以包括从临时存储器检索血样，所述血样之前已经被作为独立于进行本发明的所述方法的操作从所述患者提取。应当理解的是，本发明的所述方法可以由此是完全离体实施的(ex vivo)。
[0170] 从患者获得的生物样品可以经历作为本发明工作一部分或者作为分开的步骤或一系列步骤的一个或更多个转换步骤。例如，其中从患 者获取血液样品，所述样品可以被进一步处理以产生用于本发明方法的生物样品的更便利形式。例如，这可以是加工所述血液以分离不同细胞亚群，其被用于IFI27基因产物的评估中。可选地，或者另外，可以简单加工所述血液以去除可能会干扰所述方法的有效操作的组分，如红细胞或抗凝剂，其可以已经被用于所述样品的收集中。
[0171] 作为进一步的备选或添加的步骤或多个步骤，所述样品可以被处理以产生用于确定IFI27基因产物的级分和不用于确定IFI27基因产物的级分或多个级分。例如，该处理或分级分离可以包括从所述样品分离总RNA、或从所述样品分离信使RNA(mRNA)、或从所述样品分离蛋白质或多肽，其中任何一个可以适合用于确定IFI27基因产物。本领域技术人员应知道存在以这种方式处理血液样品的方法，例如RNeasy迷你试剂盒，Qiagen和FOCUS成员蛋白质试剂盒，GBiosciences操作步骤。
[0172] 多核苷酸和多肽
[0173] 本发明人已经鉴定了在患有流感的受试者中IFI27基因的表达水平与疾病严重程度相关，并因此可以被用作临床风险的指标。因此，在本发明的工作中，可以测试样品中IFI27基因产物的存在。所述基因产物可以是IFI27 mRNA或转录物。IFI27 mRNA的全长多核苷酸序列已经被确定和报道了，例如在Ensembl/Havana merge：ENSG00000165949。如本文所指出的，存在之前所述的IFI27转录物的变体。在一个实施方案中，分析所述样品中IFI27基因的存在包括分析所述样品中IFI27 mRNA序列的存在，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的序列或其片段或变体。
[0174] 所述基因产物可以是IFI27多肽，ISG12，以及ISG12多肽的两个同种型已经被报道了并且所述序列被确定了，例如，NP_001123552.1。在一个实施方案中，分析所述样品中IFI27基因的存在包括分析所述样品中IFI27多肽的存在，如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的那些或其片段或变体。
[0175] 除了本文所示的多核苷酸和多肽序列之外，还包括于本发明的保护范围和本发明的所述方法内的是它们的变体和片段。因此，其中指 出可以测试样品中给定的多核苷酸序列的存在，应当理解的是，该语句还意味着，可以测试所述样品中该多核苷酸序列的片段或变体的存在。
[0176] 如本发明的所述方法所使用的，本文所公开的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或互补脱氧核糖核酸(cDNA中)。
[0177] RNA可以衍生自DNA序列的RNA聚合酶催化的转录。所述RNA可以是从相应DNA序列的转录得到的初级转录物。RNA还可经历转录后加工。例如，初级RNA转录物可经历转录后加工形成成熟的RNA。如本文所述，已知有IFI27转录物的至少两种同种型，665个核苷酸的一种和656个核苷酸的一种(分别参见SEQ ID NO：1和2)。信使RNA(mRNA)是指衍生自可以由细胞翻译成蛋白质的相应开放阅读框的RNA。cDNA是指互补并源自mRNA的单链DNA。对应于IFI27的同种型1和同种型2的cDNA序列在本文中分别称为SEQ ID NO：5和6。有义RNA指包括mRNA的RNA转录物，并且因此可以由所述细胞翻译成蛋白质。反义RNA是指与靶初级转录物或mRNA的全部或者部分互补的RNA转录物，并且可以被用于阻断靶基因的表达。
[0178] 本领域技术人员将认识到，由本文公开的DNA序列编码的RNA和cDNA序列可以用遗传密码导出。RNA序列可以通过产生与特定DNA序列互补的序列而从给定的DNA序列得到。所述互补序列可以通过转换所述DNA序列中的每个胞嘧啶(‘C’)碱基为鸟嘌呤(‘G’)碱基、所述DNA序列中的每个鸟嘌呤(‘G’)碱基为胞嘧啶(‘C’)碱基、所述DNA序列中的每个胸腺嘧啶(‘T’)碱基为腺嘌呤(‘A’)碱基，以及所述DNA序列中的每个腺嘌呤(‘A’)碱基为尿嘧啶(‘U’)碱基来产生。
[0179] 互补DNA(cDNA)序列可以通过从DNA序列衍生RNA序列，然后将所述RNA序列转换成cDNA序列，而从如上述的DNA序列衍生出来。RNA序列可以通过转换所述RNA序列中的每个胞嘧啶(‘C’)碱基为鸟嘌呤(‘G’)碱基、所述RNA序列中的每个鸟嘌呤(‘G’)碱基为胞嘧啶(‘C’)碱基、所述RNA序列中的每个尿嘧啶(‘U’) 碱基为腺嘌呤(‘A’)碱基以及所述RNA序列中的每个腺嘌呤(‘A’)碱基为胸腺嘧啶(‘T’)碱基，来转换成cDNA序列。
[0180] 通常，多肽序列变体具有共同的定性生物活性。多核苷酸序列变体通常编码的多肽，其一般具有共同的定性生物活性。因此，本发明人构想，通过比较本文所提供的序列，在IFI27的特定序列的变异是有可能存在于自然界中，而不引起编码基因的生物活性中的显著改变。作为结果，本发明并不局限于如本文具体指出的IFI27序列，但也可以适用于可以存在于自然界的IFI27的变体序列。本文中这样的序列预期可保留本文所证实的基因产物的表达特征，并因此同样适用于在患者或患有或者被怀疑患有流感感染的受试者中临床风险的指示性标记物。
[0181] 作为结果，本文所明确指出的变体序列也包括在本发明之内。如本文所使用的术语“变体”是指基本上类似的序列。通常，如果两个序列在指定的区域上，或者当没有指定时在整个序列上，具有指定的相同氨基酸残基核苷酸百分比(“序列同一性”百分比)，那么这两个序列是“基本上类似的”。因此，本文所公开的多核苷酸和多肽序列的“变体”与所述参考序列共享至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0182] 此外，术语“变体”还包括本发明所述多肽的类似物。多肽的“类似物”是这样一种多肽，其是本发明的多肽的衍生物，所述衍生物包括一个或更多个氨基酸的添加、缺失、取代，使得所述多肽保留基本上相同的功能。术语“保守氨基酸取代”是指在多肽链(蛋白质的一级序列)内用具有类似性质的一个氨基酸对另一个氨基酸进行取代或置换。例如，用带电氨基酸谷氨酸(Glu)对类似的带电氨基酸天冬氨酸(Asp)进行取代是保守氨基酸取代。
[0183] 通常，两个序列之间的序列同一性百分比可以通过在比较窗口比较两个最佳比对序列来确定。例如，在所述比较窗口中序列的部分(portion)可以包含与所述参考序列(例如，本文所公开的多核苷酸或多肽序列)(其不包含缺失或添加)相比的缺失或添加(即，缺口)， 以便最佳比对这两个序列。然后，通过确定在其中两条序列中皆出现的相同核酸碱基或氨基酸残基位置的数量来产生匹配的位置的数量，并将所述匹配的位置的数量除以在比较窗口中位置的总数，并将所得到的结果乘以100来产生序列同一性的百分比，可以计算序列同一性百分比。
[0184] 在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，序列同一性的百分比是指，在指定区域上(或者，当没有指定时在整个序列上)当在比较窗口上针对最大对应性进行比较和比对时，或者如采用下面的序列比较算法或通过手工比对和目测检查所测量的指定区域，相同的氨基酸残基或核苷酸的指定的百分比。
[0185] 对于序列比较，典型地，一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当采用序列比较算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果需要的话，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或选定替代性参数。然后，基于所述程序参数，所述序列比较算法计算所述测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于序列比较的比对方法是本领域公知的。用于序列比较的最佳比对，可以采用已知的计算机程序常规地确定，包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可以获得自Intelligenetics，Mountain View，California)；在GCG威斯康星遗传学软件包、版本10中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可以获得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)。
[0186] 所述BESTFIT程序(威斯康星序列分析包，用于Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)采用Smith和Waterman的局部同源性算法来找到两个序列之间的最佳同源性节段(Smith and
Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))。当采用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定序列之间的同源性程度时，可以设定参数以使得所述同一性百分比在参考核苷酸序列的全长上进行计算，并且允许在参考序列中高达5％的核苷酸总数的同源性中的缺口。
Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))。当采用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定序列之间的同源性程度时，可以设定参数以使得所述同一性百分比在参考核苷酸序列的全长上进行计算，并且允许在参考序列中高达5％的核苷酸总数的同源性中的缺口。
[0187] GAP采用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453中所述的算法，来发现两个完整序列的比对，所述比对最大化匹配数且最小化缺口数。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，并产生具有最大数量的匹配碱基和最小缺口的比对。它允许在匹配的碱基单元中的缺口产生罚分和缺口延伸罚分条款。GAP代表了最佳比对家族中的一员。
[0188] 另一个用于确定查询序列和受试序列之间的最佳总体匹配的方法(也称为全局序列比对)，可以采用基于Brutlag及其同事的算法(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中，所述查询和受试序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U’s转换成T’s进行比较。所述全局序列比对的结果是同一性百分比的形式。
[0189] 所述BLAST和BLAST 2.0算法可以被用于确定序列同一性和序列相似性百分比。这些分别被描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul et al(1990)J.MoI.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件，公众可通过美国国家生物技术信息中心获得。该算法涉及首先通过在所述查询序列中鉴定短的词(short word)的长度W来鉴定高得分序列对(HSPs)，其在序列数据库中用相同长度的词比对时匹配或者满足某些正阈得分T。T被称作邻近词得分阈值(Altschul et al，同上)。这些命中的初始邻近词作为起始搜索的种子，以找到含有它们的更长的HSPs。所述命中的词沿着每个序列在两个方向延伸直到累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，采用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，评分矩阵被用于计算所述累积得分。然后，在每个方向的命中词的延伸被停止，当：累积比对得分从其最大获得值下降了数量X；由于一个或更多个负得分残基比对的累积，所述累积得分达到零或以下；或者到达任一序列的末端。所述BLAST算法参数W、T和X确定所述比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)采用11的词长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4作为默认值，并且比较两个链。对于氨基酸序列， BLASTP程序采用3的词长、10的期望值(E)和50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl，Acad.SciUSA 89：10915)比对(B)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4作为默认值并且比较两个链。所述BLAST算法还在两个序列之间进行相似性的统计学分析(参见例如Karlin and Altschul(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，核酸被认为是类似于参考序列。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，核酸被认为是类似于参考序列。
[0190] 还包括的是本文所公开的所述多核苷酸的片段。多核苷酸“片段”是编码或作为本发明的多核苷酸或其变体的组成的多核苷酸分子。多核苷酸的片段不一定需要编码保留生物活性的多肽。例如，所述片段可以有效用作杂交探针或PCR引物。所述片段可以衍生自本发明的多核苷酸，或者可以通过一些其它手段来合成，例如通过化学合成。例如，所述片段可以是在确定在生物样品中IFI27基因产物的水平中所检测到的，使得例如所述探针或引物对所述IFI27基因产物的区域具有特异性，并且正是该区域是在本发明的工作中所检测到的。例如，这在采用PCR的方法中是典型的，使得IFI27基因产物的靶标区(典型地mRNA或cDNA)会组成小于所述完整的IFI27 mRNA或cDNA序列长度。例如，它可以是大约50-100个碱基或碱基对、或大约75-150个碱基或碱基对、或大约120-250个碱基或碱基对、或大约200-300个碱基或碱基对、或大约250-350个碱基或碱基对、或大约300-400个碱基或碱基对、或大约350-450个碱基或碱基对、或大约400-500个碱基或碱基对的靶标区。
[0191] 本发明的所述序列可以包含离散的序列，其中整个序列包含本文鉴定的基因IFI27仅其序列，或其片段。反之，本发明的序列可以是非离散的序列，其中它们包含本文鉴定所述IFI27基因或其变体的序列、或其部分，连同不是该基因一部分的序列。以类似的方式，该序列还可以包括无关序列，如与载体、标签(如用于辅助纯化或检测) 相连的序列以及杂交助剂。
[0192] 多核苷酸可以被克隆入载体。例如，所述载体可以包含DNA、RNA或互补DNA(cDNA)序列。所述载体可以是质粒载体、病毒载体或任何其它适于插入外源序列、将它们引入细胞并表达所引入的序列的合适载体。典型地，所述载体是表达载体，并可以包括表达控制和加工序列，如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号和转录终止序列。本发明还包括由这样的载体转化的宿主细胞。例如，本发明的所述多核苷酸可以被克隆入载体，其被转化入细菌宿主细胞，例如大肠杆菌。用于构建载体和将它们转化入宿主细胞的方法通常是本领域已知的。并且被描述于例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York，和Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Inc.。
[0193] 核苷酸探针、引物和抗体
[0194] 本发明是基于(至少部分基于)发明人的所述鉴定，其中受试者中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平与该受试者中流感所引起的疾病严重程度相关。因此本发明涉及通过在从感兴趣的受试者获得的样品中检测并确定干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水平来检测在流感感染过程中宿主应答的方法。在本发明的工作中，基于所述IFI27多核苷酸或其片段或变体的核苷酸和片段，可以被用作检测和确定干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物水平的引物和探针。
[0195] 所述核苷酸和片段可以是以寡核苷酸的形式。寡核苷酸是适合用于核酸扩增反应(如PCR)的核苷酸残基的短的延伸(stretch)，典型地是长度至少大约5个核苷酸至大约80个核苷酸，更典型地长度大约10个核苷酸至大约50个核苷酸，以及甚至更典型地长度大约15个核苷酸至大约30个核苷酸。本领域技术人员将会理解的是，任何合适长度的序列可以被使用，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或更多。
[0196] 探针是可变长度的核苷酸序列，例如在大约10个核苷酸到几千个 核苷酸之间，用于检测同源序列，典型地通过杂交。例如，用于杂交的探针可以是大约10-25碱基或碱基对、或大约20-40碱基或碱基对、或大约30-50个碱基或碱基对、或大约50-100个碱基或碱基对、或大约75-150个碱基或碱基对、或大约120-250个碱基或碱基对、或大约200-300个碱基或碱基对、或大约250-350个碱基或碱基对、或大约300-400个碱基或碱基对、或大约350-450个碱基或碱基对、或大约400-500个碱基或碱基对。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。
[0197] 用于核苷酸探针和/或引物的设计和/或产生的方法通常是本领域已知的，并且被描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012；Itakura K.et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Innis et al.，(Eds)(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)，和Innis and Gelfand，(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。核苷酸引物和探针可以通过例如化学合成技术，例如，磷酸二酯和磷酸三酯的方法(参见例如Narang
S.A.et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown，E.L.(1979)et al.Meth.Enzymol.68：109和美国专利第4356270号)，二乙基亚磷酰胺酯法(参见Beaucage S.L et al.(1981)
Tetrahedron Letters，22：1859-1862)。用于在改性的固相支持物上合成寡核苷酸的方法被描述于美国专利第4458066号。
S.A.et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown，E.L.(1979)et al.Meth.Enzymol.68：109和美国专利第4356270号)，二乙基亚磷酰胺酯法(参见Beaucage S.L et al.(1981)
Tetrahedron Letters，22：1859-1862)。用于在改性的固相支持物上合成寡核苷酸的方法被描述于美国专利第4458066号。
[0198] 本发明的核酸(包括本文提到的那些)可以通过引入标记物进行标记以方便它们的检测。用于标记和检测核酸的技术被描述于，例如Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc.，和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012中。合适的标记物的例子包括荧光分子(例如，乙酰氨基芴、5-溴脱氧尿苷、地高辛、荧光素)和放射性同位素(例如，32P、35S、3H、33P)。所述标记物的检测可以通过例如化学、光化学、免疫化学、生物活性或光谱技术实现。
[0199] 在杂交技术中，所有已知的碱基序列的全部或部分被用于生成探 针，其选择性地杂交到存在于给定样品中的其他相应的核酸序列。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测的标志物标记。因此，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本发明的序列的合成寡核苷酸进行制备。
[0200] 探针和所述靶序列之间的同源性(序列同一性)程度将主要由杂交条件的严格性来确定。特别是，用作探针的核苷酸序列可以在低严格性、中严格性、高严格性条件下与本文所公开的多核苷酸的同源物或其他变体杂交。有本领域技术人员所熟知的众多条件和因素，其可被用来改变杂交的严格性。例如，待与指定的核酸杂交的核酸的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)；盐和其它组分(如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇等)的浓度；以及改变杂交温度和/或洗涤步骤。
[0201] 典型地，严格杂交条件会是那些，其中在pH 7.0-8.3，所述盐浓度小于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且所述温度是对于短探针(例如10-50个核苷酸)至少大约30℃且对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少大约60℃。严格条件还可以用加入去稳定剂(如甲酰胺)实现。示例性的低严格条件包括用30％-35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃杂交，并且在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸钠)于50℃-55℃洗涤。示例性的中严格条件包括在50％甲酰胺、
1M NaCl、1％SDS于37℃杂交，并且在0.1X SSC于60℃-65℃最终洗涤至少大约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包含大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间通常小于大约24小时，一般大约4至大约12小时。
1M NaCl、1％SDS于37℃杂交，并且在0.1X SSC于60℃-65℃最终洗涤至少大约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可以包含大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间通常小于大约24小时，一般大约4至大约12小时。
[0202] 在PCR方法中，寡核苷酸引物可以被设计用于PCR反应，以扩增来自从任何感兴趣的有机体中提取的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常为本领域已知，并且被公开于Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)；Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology (2007)，John Wiley and Sons，Inc；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012；Maniatis et al.Molecular Cloning(1982)，280-281；Innis et al.(Eds)(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)和Innis and Gelfand，(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)中。已知的PCR方法包括但不限于，采用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0203] 本领域的技术人员将认识到，本文中所描述的用于在PCR中或者RT-PCR使用的引物也可以用作检测感兴趣的序列的探针，例如用于检测干扰素α诱导蛋白27(IFI27)基因产物。
[0204] 在特定的实施方案中，片段或探针是所述IFI27基因的片段，例如可用于杂交分析(如Northern分析)的片段。作为特异性的例子，Suomela et al(2004)描述了用于检测在来自培养的人细胞的总RNA分离物中IFI27 RNA转录物的人IFI27 cDNA的482bp片段。IFI27核酸序列的任何适当长度的片段或其变体可以在本发明的方法中使用。本领域技术人员能够基于本文所提供的信息，并根据本领域已知的方法(例如用于序列的选择的方法)确定合适的序列，其在期望的条件下选择性结合至所述靶序列。
[0205] 在特定的实施方案中，片段、探针或引物是所述IFI27基因的片段，例如序列ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(正向引物；SEQ ID NO：7)或序列ACATCATCTTGGCTGCTATGG(反向引物；SEQ ID NO：8)。在本发明的方法的特定实施方案中，PCR可以采用引物对
ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(SEQ ID NO：7)和序列ACATCATCTTGGCTGCTATGG(SEQ ID NO：8)进行，其扩增187bp的序列(SEQ ID NO：11)。
ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(SEQ ID NO：7)和序列ACATCATCTTGGCTGCTATGG(SEQ ID NO：8)进行，其扩增187bp的序列(SEQ ID NO：11)。
[0206] 在特定的实施方案中，片段、探针或引物是所述IFI27基因的片段，例如本领域已知的对IFI27基因或其片段或变体具有特异性针的序列。本领域技术人员能够确定用于本发明所述方法中的该核酸序列 的合适条件。
[0207] 在特定的实施方案中，片段、探针或引物是所述IFI27基因的片段，例如序列TGC CTC GGG CAG CCT(SEQ ID NO：9)或序列TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(SEQ ID NO：10)。在本发明的方法的特定实施方案中，PCR可以采用引物对TGC CTC GGG CAG CCT(正向引物；SEQ ID NO：9)和序列TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(反向引物；SEQ ID NO：10)进行5。本领域技术人员能够确定用于本发明所述方法中的该核酸序列的合适条件。本领域技术人员还会在Suomelaetal5(其内容通过参考引入本文)中发现使用这样的核酸序列扩增和检测
IFI27基因产物的指导。
IFI27基因产物的指导。
[0208] 在特定的实施方案中，片段、探针或引物是所述IFI27基因的片段，例如序列cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f；SEQ ID NO：16)或序列cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r；SEQ ID NO：17)。在本发明的方法的特定实施方案中，PCR可以采用引物对cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f；SEQ ID NO：16)和序列cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCA ATG(ISG12r；SEQ ID NO：17)进行8。本领域技术人员能够确定用于本发明的所述方法中的该核酸序列的合适条件。本领域技术人员还会在Gjermandsen et al(1999)8(其内容通过参考引入本文)中发现使用这样的核酸序列扩增和检测IFI27基因产物的指导。
[0209] 抗体
[0210] 本发明的所述方法还包括的是抗体，其能够特异性结合由IFI27基因或其片段或变体编码的多肽。抗体或多个抗体可以被用于定性或定量检测和分析给定样品中的一种或更多种多肽，特别是由IFI27基因编码的多肽或片段。还可以进行用于测定的控制或标准化分析目的的抗体检测和另外的多肽的定量。应当理解的是，通过“特异性结合”，相比它结合至无关蛋白质所述抗体能够以更高的亲和力结合至靶多肽或其片段。例如，所述抗体可以在至少大约10-4M至大约10-10M的结合常数结合至所述多肽或其片段。优选地，所述结合常数是至少大约10-5M，或至少大约10-6M，更优选地所述抗体与感兴趣的所述多肽或 其片段的结合常数是至少大约10-7M，至少大约10-8M，或至少大约10-9M或更低。
[0211] 所述抗体可以各种形式存在，包括例如作为完全抗体，或作为抗体片段，或其其它免疫学活性片段，如作为互补决定区。类似地，所述抗体可以作为具有功能性抗原结合结构域(即，重链和轻链可变区)的抗体片段存在。而且，所述抗体片段可以下述形式存在(但不限于)：Fv、Fab、F(ab)2、scFv(单链Fv)、dAb(单结构域抗体)、嵌合抗体、双特异性抗体、双抗体和三抗体。
[0212] 抗体‘片段’可以通过完整抗体的修饰或通过所期望的抗体片段的合成来产生。产生的抗体(包括抗体片段)方法是本领域已知的，并且包括例如通过重组DNA技术进行合成。本领域技术人员能够知晓合成抗体的方法，如描述于例如美国专利第5296348号和Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc中的那些。
[0213] 优选地，抗体是从感兴趣的多肽的离散区域或片段制备的。感兴趣的多肽的抗原性部分可以是任何适当的长度，如从大约5个至大约15个氨基酸。优选地，抗原性部分含有至少大约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基。
[0214] 在本说明书的上下文中，参考的对由IFI27基因编码的多肽具有特异性的抗体还包括对所述感兴趣的多肽的片段或变体具有特异性的抗体。
[0215] 例如，特异性结合本发明的多肽的抗体可以采用任何本领域已知的合适方法用由IFI27基因编码的纯化的多肽进行制备。例如，单克隆抗体，典型地含有Fab部分，可以采用Harlow and Lane(Eds)Antibodies-A Laboratory Manual，(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y、Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)、Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(1986)2nd ed和Kohler&Milstein，(1975)Nature 256：495-497中所述的杂交瘤技术进行制备。这类技术包括但不限于，通过从在噬菌体或类似载体中的重组抗体文库选择抗体进行抗体制备，以及通过免疫兔或小鼠制备多克 隆和单克隆抗体(参见，例如Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；Ward et al.(1989)Nature 341：544-546)。
[0216] 还应当理解的是，本发明的抗体包括人源化抗体、嵌合抗体和全人抗体。本发明的抗体可以是双特异性抗体，器具有针对多于一个抗原或表位的结合特异性。制备人源化抗体、嵌合抗体、全人抗体和双特异性抗体的方法是本领域已知的，并包括于例如2006年2月7日授予给Garabedian et al.的标题为“识别并结合磷酸化的人糖皮质激素受体的抗体以及使用该抗体的方法”的美国专利第6995243号中所述的。
[0217] 通常，可将可能包含由IFI27基因编码的多肽的样品与特异性结合所述多肽或其片段的抗体进行接触。任选地，在将所述抗体与样品接触之前，所述抗体可以被固定于固相支持物，以便于洗涤和后续复合物的分离。固相支持物的例子包括，例如微量滴定板、珠、棒或微珠。抗体也可以被附着到如上所述的蛋白质芯片(ProteinChip)阵列或探针基板。
[0218] 用于鉴定结合至感兴趣的多肽的可检测标记，包括但不限于：荧光色素(fluorochrome)、荧光染料、放射性标记、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)以及其它本领域常用的标记，以及比色标记包括胶体金或有色玻璃或塑料珠。可选地，所述样品中的标记物可以采用间接测定进行检测，其中例如标记的二抗被用于检测结合标记物特异性的抗体。
[0219] 用于检测抗体-标记物复合物的存在或测量其量的方法包括，例如，检测荧光、化学发光、发冷光(luminescence)、吸光度、双折射、透射率、反射率或折射率如表面等离子体共振、生物传感器、椭圆偏振、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉法。射频方法包括多极共振谱。电化学方法包括安培和伏安法。光学方法包括成像方法和非成像方法和显微镜法。
[0220] 用于检测抗体-标记物复合物的存在或测量其量的有用测定法包括，例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或免疫印迹测定法。例如，这样的方法被描述于Clinical Immunology(Stites&Terr，eds.，7th ed.1991)、Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology，volume 37(Asai，ed.1993)和同上的Harlow&Lane中。
[0221] 在特定的实施方案中，本发明的方法可以利用本领域已知的一个或更多个抗体。能够结合IFI27多肽的抗体是本领域已知的，并且包括抗IFI27多克隆抗体，目录号：LS-C70809，LSBio；IFI27多克隆抗体(A01)，目录号：H00003429-A01，Abnova Corporation；
IFI27多克隆抗体，目录号：PAB8961，Abnova Corporation；IFI27抗体，目录号：H00003429-A01，Novus Biologicals；FI27抗体，目录号：H00003429-D01P，Novus Biologicals；IFI27兔多克隆抗体(Sapphire Bioscience，USA)，IFI27MaxPab兔多克隆抗体。
IFI27多克隆抗体，目录号：PAB8961，Abnova Corporation；IFI27抗体，目录号：H00003429-A01，Novus Biologicals；FI27抗体，目录号：H00003429-D01P，Novus Biologicals；IFI27兔多克隆抗体(Sapphire Bioscience，USA)，IFI27MaxPab兔多克隆抗体。
[0222] 如本文中所指出的，通过免疫分析和相关方法研究IFI27表达已经在文献中报道，如由NzeusseuToukap et al(2007年；其内容作为参考引入本文)，并且应当理解的是，本发明的方法、试剂、装置和试剂盒可以包含使用先前报道的用于IFI27研究的抗体。应当理解的是，本发明以及因此本发明的所述方法、试剂、装置和试剂盒包括根据本文描述的任何合适的抗体，且不仅限于本文特别提到的那些抗体。本领域技术人员会知晓，合适的抗体可以通过文献检索、常规测试进行鉴定，并可以被列于在线数据库中，如www.antibodies-online.com。
[0223] 用于检测的方法和试剂盒
[0224] 如本文所使用的，确定干扰素α诱导蛋白27(IFI27)基因产物的水平，可以在各种实施方案中包括确定样品中基因产物的存在、不存在或其量，并且可以包括定量样品中基因产物的量。在优选的实施方案中，本发明的方法的所有步骤在受试者身体(如受试者人体或动物身体)之外发生，使得所述方法没有在所述身体上实施。因此，在优选的实施方案中，本发明并不涉及在人体或动物身体上实施的任何物理介入。
[0225] 确定IFI27基因产物的水平包括相对定量，如通过与另一个样品或参考进行比较来评估给定样品中IFI27基因产物的存在，例如其中所测试的样品被发现大于、小于或大约等于参考中的基因产物的量。
[0226] 定量并且因此确定所述水平，还可以包括样品或方法的标准化以考虑到特异性针对所述样品的测定中的差异。典型地，这包括确定样 品中可检测的另一种组分的水平。例如，当确定IFI27基因产物的水平包括确定IFI27的mRNA转录物的水平，样品可以进行标准化以考虑在实施本发明中样品之间的差异。内部参考标记物可以是样品中任何合适的组分，如基因产物，并将通常为这样的组分，其在来自健康受试者和在不健康的受试者的样品中的存在是均匀的；或是这样的组分，其在没有感染流感的受试者和在感染流感的受试者的样品中的存在是均匀的。作为特异性的例子，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因产物被用作内部参考。
[0227] 因此，本发明的方法包括将来自患者的生物样品中IFI27基因产物的水平与表示临床风险的参考标准进行比较。可以采用任何合适的参考标准。例如，所述参考标准可以是来自健康受试者的样品，或者可以是典型地发现于健康受试者中的IFI27基因产物的量。在这种情况下，与所述标准相比在所述患者样品中IFI27升高的水平表示在所述患者中有临床风险。作为进一步的例子，所述参考标准可以是来自感染了流感病毒的有症状受试者的样品，或者可以是在没有发展成严重疾病的感染流感病毒的受试者中发现的典型的IFI27基因产物的量；与所述标准相比在所述患者样品中IFI27升高的水平表示在所述患者中有临床风险。
[0228] 所述参考标准可以表示有临床风险，在这种情况下，与这样的参考相比在患者样品中IFI27基因产物相等或升高的水平表示在受试者中有临床风险。
[0229] 作为进一步的例子，所述参考标准可以是界定临床风险的标准曲线。在这种情况下，所述参考标准可以独立于在所述患者样品中IFI27基因产物水平的确定，例如所述参考曲线可以是界定临床风险的补充参考曲线的形式。
[0230] 所述参考标准可以在确定来自所述患者的生物样品中的IFI27基因产物水平的同时进行制备。例如，这可以包括通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中IFI27基因产物水平的相同方法来制备所述标准，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示有临床风险、或没有临床 风险的预定量，或者具有针对没有或具有可忽略不计的临床风险的受试者的典型量的选定的倍数升高，所述倍数如5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、200倍、300倍、500倍或1000倍。
[0231] 如本发明的特定实施方案所示，并且特别是在所述例子中，其中进行IFI27基因产物的定量检测，与在健康或者无症状的个体中所看到的那些相比，在来自已经发展成流感感染的严重疾病的患者的样品中所检测到的IFI27基因产物中有至少大约40倍至60倍的升高。通过与健康或者无症状的个体进行比较，在来自患有流感或病毒性肺炎的患者的样品中所检测到的IFI27基因产物中有至少大约10倍的升高。
[0232] 确定IFI27基因产物的水平还可以包括绝对定量，如其中样品中的IFI27基因产物的量被确定，如被以合适的单位表达，例如可以被表达为倍数变化的量，样品的单位/体积，如每毫升、微升、纳升等中所含有的克、微克、纳克、皮克、飞克等。
[0233] 截断值可以在本发明的各种实施方案中被实现。例如，在一个实施方案中，截断值可以通过定量测量样品中IFI27基因产物的实际量(如以样品的量/ml形式的测量)来实现。在另一个实施方案中，截断值可以通过在所期望的截断值设定可检测性下限或阈值来实现。在这种形式下，由于提供样品的受试者的流感感染，所述样品中IFI27基因产物的检测(在该上下文中其可以称为阳性信号)表示有严重疾病，而在样品中没有可检测的IFI27基因产物(在该上下文中其可以称为阴性信号)表示提供所述样品的受试者没有患有流感或者是无症状的。这样的实施方案，在任何合适的正/负截断值，可以发现在这样的情况下的特定用途，其中相对快速的诊断是期望的，或者其中相对复杂的测试设备(equipment)并不总是可用的。例如，这可以是在护理点或在医生的咨询室。
[0234] 本文所公开的多核苷酸和多肽的检测可以采用任何合适的方法进行。例如，用于检测IFI27基因产物(如多核苷酸和/或多肽)的方法可以涉及对IFI基因产物具有特异性的引物、探针或抗体的使用。本领域技术人员可以在合适的技术和测定中利用引物、探针或抗体，所 述技术和测定包括例如聚合酶链式反应(以及该技术的相关变化形式)、基于抗体的测定(如ELISA和流式细胞术)，以及荧光显微术。通过其可以鉴定本文所公开的特征多肽的方法通常是本领域已知的，并且被描述于例如Coligan J.E.et al.(Eds)Current Protocols in Protein Science(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Walker，J.M.，(Ed)(1988)New Protein Techniques：Methods in Molecular Biology，Humana Press，
Clifton，N.J和Scopes，R.K.(1987)Protein Purification：Principles and Practice，
3rd.Ed.，Springer-Verlag，New York，N.Y中。例如，由IFI27编码的多肽可以通过Western印迹或光谱分析进行检测。用于多肽检测的合适方法的另外例子被描述于，例如美国专利第4683195号、美国专利第6228578号、美国专利第7282355号、美国专利第7348147号和PCT公开WO/2007/056723中。
Clifton，N.J和Scopes，R.K.(1987)Protein Purification：Principles and Practice，
3rd.Ed.，Springer-Verlag，New York，N.Y中。例如，由IFI27编码的多肽可以通过Western印迹或光谱分析进行检测。用于多肽检测的合适方法的另外例子被描述于，例如美国专利第4683195号、美国专利第6228578号、美国专利第7282355号、美国专利第7348147号和PCT公开WO/2007/056723中。
[0235] 在本发明的优选实施方案中，IFI27基因产物的检测和确定是通过如下来实现的，即采用与IFI27基因产物的序列或其变体或片段特异性杂交的引物，通过聚合酶链式反应扩增来自感兴趣的样品的核苷酸序列，并检测所扩增的序列。在这种情况下，典型的靶序列是IFI27 mRNA，如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列；或IFI27的cDNA序列，如具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的序列，或其任何片段或变体。在本发明的实施方案中，可以采用多个靶序列、其片段或变体。
[0236] 所述方法可包括检测多个序列、其片段或变体。所述方法还进一步包括纳入控制，如用于正确或一致性执行所述方法，或允许将mRNA的表达水平在样品之间进行标准化。例如，所述方法可以包括检测一种或更多种多核苷酸或多肽或其片段或变体，已知组成型表达的，如GAPDH，或者已知在感染流感的受试者和没有感染流感的受试者中以一致的水平表达的。
[0237] 采用本发明所述方法和试剂盒将核酸提取和纯化至必须或者期望的程度以用于分析的合适方法通常是本领域已知的，并被描述于例如，Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc、
Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012中。本领域技术人员将容易理解的是，本发明并不限于本文所述的用于核酸分离的特定方法，其它合适的方法也被本发明涵盖。在核酸分析之前，本发明可以无需核酸分离而进行。
Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012中。本领域技术人员将容易理解的是，本发明并不限于本文所述的用于核酸分离的特定方法，其它合适的方法也被本发明涵盖。在核酸分析之前，本发明可以无需核酸分离而进行。
[0238] 为本发明的目的将多肽提取和纯化至必须或者期望的程度的合适方法通常是本领域已知的，并被描述于例如，Coligan J.E.et al.(Eds)Current Protocols in Protein Science(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Walker，J.M.，(Ed)(1988)New Protein Techniques：Methods in Molecular Biology，Humana Press，Clifton，N.J和Scopes，R.K.(1987)Protein Purification：Principles and Practice，3rd.Ed.，Springer-Verlag，New York，N.Y中。适合用于蛋白提取的技术的例子包括但不限于，透析、超滤和沉淀。蛋白质纯化技术适合用于包括但不限于，反相层析、疏水相互作用层析、离心、凝胶过滤、硫酸铵沉淀和离子交换。
[0239] 根据本发明的方法和试剂盒，可以通过任何本领域已知的合适手段检测多核苷酸或其变体或片段。在本发明的优选实施方案中，通过PCR扩增检测所述多核苷酸。在PCR方法中，寡核苷酸引物可以被设计用于PCR反应，以扩增代表IFI27基因产物的多核苷酸。典型地，所述PCR包括通过相关序列的反转录来定量扩增从信使RNA(mRNA)制备的互补DNA(cDNA)(RT-PCR)。PCR的已知方法包括但不限于：采用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。用于设计PCR和RT-PCR引物的方法通常是本领域已知的，并且被公开于例如，Ausubel F.M.et al.(Eds)
Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Maniatis et al.Molecular Cloning(1982)，280-281、Innis et al.(Eds)(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)、Innis and Gelfand，(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)、Innis and Gelfand，(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)和Sambrooket al.(1989)
Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012中。
Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Maniatis et al.Molecular Cloning(1982)，280-281、Innis et al.(Eds)(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)、Innis and Gelfand，(Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)、Innis and Gelfand，(Eds)(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)和Sambrooket al.(1989)
Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012中。
[0240] 本领域的技术人员应当容易理解的是，进行PCR和RT-PCR程序的各种参数可在不影响获得所期望的产物的能力情况下被改变。例如，可以改变盐浓度或可以改变变性、退火和延伸步骤中一个或更多个的时间和/或温度。类似地，还可以基于可用核酸的量或有效扩增所需要的最佳模板量改变DNA、cDNA或RNA模板的量。用于本发明的所述方法和试剂盒的引物典型地为寡核苷酸，通常长度至少大约5个核苷酸到大约80个核苷酸，更典型地长度大约10、11、12、13或14个核苷酸到长度大约50个核苷酸，并且甚至更典型地长度大约15个核苷酸到长大约30个核苷酸，如长15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸中的任意一个。本领域的技术人员将认识到，本文所述的引物可以用于若干不同的应用，包括但不限于PCR、RT-PCR，并且采用探针用于检测本文所鉴定的序列作为高度侵入性株的特征。
[0241] 这样的引物可以通过任何合适的方法制备，包括例如直接化学合成或合适的序列的克隆和限制性酶切。不是在引物中所有碱基都需要反映引物所要杂交的模板分子的序列，所述引物只需要含有足够的使得所述引物能与所述模板杂交的互补碱基。所述引物还可以在一个或更多个位置包括错配碱基，其作为不与模板碱基互补的碱基，而是被设计为在碱基延伸或扩增时将变化引入所述DNA。引物可以包括另外的碱基，例如以在5′端的限制性内切酶识别序列的形式，以便于克隆所扩增的DNA。
[0242] 本领域的技术人员将认识到，能够扩增代表IFI27 mRNA序列或其片段的序列的任何引物均适用于本发明的方法。IFI27 mRNA序列如SEQ ID NO：1和2中所示。可以采用任何适于扩增包括SEQ ID NO：1和2或其片段或变体的核酸的寡核苷酸引物对。本领域的技术人员将知晓的是，可以通过检测代表IFI27 mRNA转录物的序列的常规方法(如通过PCR扩增)来选择合适的引物和引物对。
[0243] 作为特异性的例子，所述PCR扩增可以利用选自以下的引物对： (i)ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(正向引物；SEQ ID NO：7)和ACATCATCTTGGCTGCTATGG(反向引物；
SEQ ID NO：8)；(ii)TGC CTC GGG CAG CCT(正向引物；SEQ ID NO：9)和TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(反向引物；SEQ ID NO：10)；(iii)cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f；SEQ ID NO：16)和cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCAATG(ISG12r；SEQ ID NO：17)。
SEQ ID NO：8)；(ii)TGC CTC GGG CAG CCT(正向引物；SEQ ID NO：9)和TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(反向引物；SEQ ID NO：10)；(iii)cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f；SEQ ID NO：16)和cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCAATG(ISG12r；SEQ ID NO：17)。
[0244] 还包括于本发明的保护范围内的是，例举的寡核苷酸引物的变体和片段。本领域技术人员还将认识到，本发明并不局限于使用例举的特异性引物，还可以使用替代的引物序列，只要所述引物被适当设计以便能够扩增感兴趣的特征序列。合适的引物序列可以由本领域技术人员使用常规方法而无需过多的实验来确定。用于对所期望的序列进行扩增的合适引物的位置，可通过这样的因素如G+C含量以及形成不希望的二级结构的能力来确定。
[0245] 分析所扩增的核酸的合适方法是本领域技术人员公知的，并且被描述于例如Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc和Maniatis et al.Molecular Cloning(1982)，280-281中。分析所扩增的核酸的合适方法包括，例如其之前可以进行或不进行限制性酶切的凝胶电泳和/或核酸测序。凝胶电泳可以包括琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，其为本领域技术人员通常使用的基于大小分离DNA片段的技术。凝胶中琼脂糖或聚丙烯酰胺的浓度很大程度上确定了凝胶的分辨力，并且琼脂糖或聚丙烯酰胺合适的浓度将因此取决于要被区分的DNA片段大小。
[0246] 在本发明的其它实施方案中，可以通过使用合适的探针检测IFI27基因产物(其是多核苷酸及其变体或片段)。探针可以是能够与IFI27基因产物如mRNA或其扩增的衍生物选择性地杂交的任何合适探针。探针是长度可变的核苷酸序列，例如在大约10个核苷酸到几千个核苷酸之间，用于典型地通过杂交来检查同源序列。对于检测代表IFImRNA转录物的序列，探针可以典型地具有小于或者等于所述转录物 长度的大小。本发明的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。
[0247] 用于设计和/或产生核苷酸探针的方法通常是本领域已知的，并且被描述于例如，Robinson P.J..et al.(Eds)Current Protocols in Cytometry(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York和Maniatis et al.Molecular Cloning(1982)，280-281中。核苷酸探针的制备，可以通过例如化学合成技术，例如，磷酸二酯和磷酸三酯的方法(参见例如Narang S.A.et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown，E.L.(1979)et al.Meth.Enzymol.68：109和美国专利第
4356270号)，二乙基亚磷酰胺酯法(参见Beaucage S.L et al.(1981)Tetrahedron
Letters，22：1859-1862)。用于在改性的固相支持物上合成寡核苷酸的方法被描述于美国专利第4458066号。
4356270号)，二乙基亚磷酰胺酯法(参见Beaucage S.L et al.(1981)Tetrahedron
Letters，22：1859-1862)。用于在改性的固相支持物上合成寡核苷酸的方法被描述于美国专利第4458066号。
[0248] 本发明的探针或用于本发明的方法和试剂盒的探针，可以通过引入标记物进行标记以方便它们的检测。用于标记和检测核酸的技术被描述于例如，Ausubel F.M.et al.(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007)，John Wiley and Sons，Inc.中。合适的标记物的例子，包括荧光分子(例如，乙酰氨基芴、5-溴脱氧尿苷、地高辛、荧光素)和放射性同位素(例如，32P、35S、3H、33P)。所述标记物的检测可以通过例如化学、光化学、免疫化学、生物化学或光谱的技术来实现。
[0249] 本发明的方法和试剂盒还涵盖抗体的使用，所述抗体能够特异性结合本发明的多肽。所述抗体可以被用于定性或定量检测和分析给定样品中的一种或更多种多肽。用于抗体的产生和使用的方法通常是本领域已知的，并且被描述于例如，Harlow and Lane(Eds)Antibodies-A Laboratory Manual，(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y：Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)、Goding，Monoclonal Antibodies：
Principles and Practice(1986)2nd ed和Kohler&Milstein，(1975)Nature 256：495-497中。所述抗体可以被缀合至荧光色素以允许例如 通过流式细胞术、免疫组化或本领域已知的其它手段来检测。可选地，所述抗体可以结合至允许比色或化学发光检测的底物。本发明还包括使用能够结合到能够特异性结合本发明多肽的一个或更多个抗体的二次抗体。
Principles and Practice(1986)2nd ed和Kohler&Milstein，(1975)Nature 256：495-497中。所述抗体可以被缀合至荧光色素以允许例如 通过流式细胞术、免疫组化或本领域已知的其它手段来检测。可选地，所述抗体可以结合至允许比色或化学发光检测的底物。本发明还包括使用能够结合到能够特异性结合本发明多肽的一个或更多个抗体的二次抗体。
[0250] 在本发明的方法中，应当理解的是，例如，样品或制剂的使用说明包括小于本领域技术人员认为合适的情况下所确定的可用总量的使用。例如，在制备从患者获取的血液样品的总RNA分离物的说明中，如果本领域技术人员认为合适的话不必使用完整的血液样品，而使用所述样品的一小等份即可。作为另一个例子，在通过反转录总RNA分离物来制备cDNA中，如果本领域技术人员认为合适的话不必使用完整的总RNA分离物，而使用所述总RNA分离物的一小等份即可。
[0251] 试剂盒
[0252] 本发明还提供用于确定在生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因产物水平的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂。所述药剂可以是能够检测IFI27基因产物的药剂，其中所述基因产物可以是多核苷酸或多肽。能够检测本文所述的序列的任何合适的药剂可以被包括于所述试剂盒中。非限制性的例子包括引物、探针和抗体。
[0253] 所述试剂盒可以包含至少一种药剂，其是引物、抗体或探针。所述引物或探针可以是特异性针对如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列或其变体或片段。所述引物或探针可以选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。所述引物或探针可以选自以下的引物对：(i)ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(正向引物；SEQ ID NO：7)和ACATCATCTTGGCTGCTATGG(反向引物；SEQ ID NO：8)；(ii)TGC CTC GGG CAG CCT(正向引物；SEQ ID NO：9)和TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(反向引物；SEQ ID NO：10)；(iii)cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f；SEQ ID NO：16)和cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCAATG(ISG12r；SEQ ID NO：17)。
[0254] 所述试剂盒可以包含能够在生物样品中检测IFI27基因产物的存在的多个药剂。
[0255] 所述试剂盒可以包含能够特异性结合由IFI27基因序列编码的多肽或其抗原片段或变体的抗体。所述试剂盒可以包含能够选择性结合包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的序列或其抗原片段或变体的IFI27多肽的抗体。
[0256] 所述试剂盒可以包含用于标准化本发明方法的一种或更多种药剂。所述用于标准化的药剂可以选自由用于检测组成型表达的基因产物(如GAPDH)的药剂所组成的组。例如，所述试剂盒可以包含能够选择性结合GAPDH核苷酸序列的一种或更多种核酸序列。所述能够选择性结合GAPDH核苷酸序列的一种或更多种核酸序列可以是，如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或其任何一个的片段或变体所示序列中的一个或更多个。
[0257] 所述试剂盒可以包含一种或更多种校准标准，其中所述标准包含已知浓度的IFI27基因产物。
[0258] 所述试剂盒可以包含一种或更多种另外的组分，其选自以下：(i)一个或更多个参考样品；(ii)一种或更多种可检测的部分；(iii)将用于检测IFI27基因产物的药剂固定于固相支持物上的一种或更多种物质；(iv)固相支持物质；(v)用于生物样品的收集和/或存储的一个或更多个容器；(vi)用于生物样品的制备的一种或更多种试剂；(vii)用于核酸序列的扩增的一种或更多种药剂；以及(viii)在用于确定生物样品中IFI27基因产物水平的方法中使用所述试剂盒或其组分的说明。
[0259] 在一般情况下，本发明的试剂盒可包含任何数量的另外的组分。
[0260] 通过非限制性的例子的方式，所示另外的组分可以包括用于细胞培养的试剂、参考样品、缓冲液、标记和用于进行所述检测测定的书面说明。实施例
[0261] 本发明现在将参考具体的实施例来进行描述，其不应当被解释为以任何方式限制本发明的保护范围。
[0262] 实施例1：材料与方法
[0263] 研究参与者
[0264] 实验是基于由发展组(set)和验证组组成的研究样品来进行的。所述发展组(n＝54)被用于鉴定针对流感感染的候选生物标记物。它包括几个患者群(cohort)：流感感染(n＝8)、细菌感染(n＝16)、具有非感染性状况的危重患者(n＝12)和健康志愿者(n＝18)。所述验证组(n＝33)被用于测试由所述发展组产生的所述生物标记物。所有研究参与者给予知情书面同意，并且研究参与者的详细信息被提供于表1中。
[0265] 表1：在发展组和验证组中的个体的人口统计学和临床特征。
[0266]
[0267] (COPD，慢性阻塞性肺部疾病；APACHE II，急性生理和慢性健康评估得分；SIRS，全身性炎症应答综合征。正-负的值是平均值±标准偏差)
[0268] 基因表达分析
[0269] 为了筛选潜在候选标记物，对来自患有确认的流感感染的个体的全血进行转录组微阵列分析。采用标准操作步骤(PAXgeneTM血液RNA试剂盒-Qiagen，Germany)进行RNA提取。采用Agilent生物分析仪分析RNA质量，并且所有样品具有的RNA完整性数字均大于6.5，表明样品质量高。采用Illumina TotalPrep扩增试剂盒，以一次24个样品的批次(Ambion，Austin，TX)对200ng总RNA进行样品扩增和标记。采用Agilent生物分析仪评估扩增的cRNA，以确保令人满意的扩增。
[0270] 所述样品(每个样品750ng)被直接杂交至HT-12_v3_BeadChips上。对于每组所处理的阵列，所述杂交和洗涤步骤是相同的，并且，在标准化之后，没有鉴定出显著的批次效应。为了最小化实验假象(experimental artifact)，RNA提取、样品扩增和标记、杂交和洗涤以及扫描均由同一个操作者、在一天的同一时间进行。按照有关微阵列实验(MIAME)标准的最低限度信息，在基因表达库(GEO)(GSE40012)上提供了所有的微阵列数据。
[0271] 在分析之前，使所述阵列上的每个探针流穿(pass through)过滤器，要求在待包含于任何进一步分析中的至少一个样品中小于0.0050的检测p值。在所述Illumina HT 12阵列上存在的所述48,804个探针中，24840个探针(以下称为基因)通过了该标准。通过所述过滤的基因被装载(load)入BRB阵列工具，其中应用了所述数据的分位(quantile)标准化和对数转换。通过测量针对基因亚群的相对于GAPDH的表达，采用qRT-PCR验证所述微阵列实验。当比较qRT-PCR和微阵列相对倍数变化时所获得的R平方值范围为0.67-0.83，表明所述两个基因表达平台之间有很强的一致性。
[0272] 所有样品中具有低变异的基因(被界定为小于所述中位数(median))被从数据集中去除。采用Benjamani和Hochberg假发现率(False Discovery Rate，FDR)方法对P值针对多个测试进行调整。5％的FDR被用作被认为在这两类之间差异表达的基因的截断值。
[0273] 定量实时PCR
[0274] 在所述发展组和验证样品组中，对所有样品进行定量实时PCR。 用Qiagen RNeasy迷你试剂盒根据制造商的说明(Qiagen，Germany)制备总RNA。通过UV吸光度确定RNA产率。
[0275] 采用Superscript III，RNaseOut，Oligo(dT)和随机引物(Invitrogen)在gradient 5331(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)中制备第一链cDNA。对
于RT-PCR反应，以一式两份运行(run)样品。所述PCR反应体积是25ul，其中含有5ul cDNA样品、1ul的每种引物，12.5ul的POWER SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems)和5.5ul无RNase的水。设计寡核苷酸引物(Sigma Aldrich)，使得所述PCR产物跨越(span)内含子，并在UCSC计算机模拟(in silico)PCR网站(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr？command？command＝start)上进行验证。
于RT-PCR反应，以一式两份运行(run)样品。所述PCR反应体积是25ul，其中含有5ul cDNA样品、1ul的每种引物，12.5ul的POWER SYBR green PCR master mix(Applied Biosystems)和5.5ul无RNase的水。设计寡核苷酸引物(Sigma Aldrich)，使得所述PCR产物跨越(span)内含子，并在UCSC计算机模拟(in silico)PCR网站(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr？command？command＝start)上进行验证。
[0276] 用于IFI27扩增的引物是5’-ACCTCATCAGCAGTGACCAGT-3’(正向)(SEQ ID NO.：7)和5’-ACATCATCTTGGCTGCTATGG-3’(反向)(SEQ ID NO.：8)。PCR循环条件是：在95℃保持10min；5个循环的95℃保持30sec、64℃保持30sec、然后72℃保持30sec；35个循环的95℃保持30sec、59℃保持30sec、然后72℃保持30sec；从75℃至99℃熔解。采用人看家基因GAPDH5’-ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3’(正向)(SEQ ID NO.：14)和5’-
TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’(反向)(SEQ ID NO.：15)对IFI27的表达水平进行标准化。在Rotor-Gene 2000实时PCR机器(Corbett Research，NSW，Australia)上运行测定。通过熔解曲线和通过对运行于溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上并以UV-透射进行可视化的单个产物的观察二者来确认单个PCR产物。采用GraphPad PRISM(版本6)产生基因表达数据的可视化。
TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’(反向)(SEQ ID NO.：15)对IFI27的表达水平进行标准化。在Rotor-Gene 2000实时PCR机器(Corbett Research，NSW，Australia)上运行测定。通过熔解曲线和通过对运行于溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上并以UV-透射进行可视化的单个产物的观察二者来确认单个PCR产物。采用GraphPad PRISM(版本6)产生基因表达数据的可视化。
[0277] 细胞培养
[0278] 对于在人免疫细胞中进行的实验，使用由补充有10％的胎牛血清(FBS；SAFC Biosciences，Victoria，Australia)、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的Gibco RPMI 1640培养基(Life Technologies，Australia Pty Ltd)组成的培养基。所有培养的细胞被保持在37℃、5％CO2的湿润气氛中。
[0279] 免疫细胞亚群的分离
[0280] 从全外周血单核细胞(PBMCs)纯化人细胞类型(单核细胞、NK细胞、B细胞、pDCs、mDCs、CD4+、CD8+T细胞和中性粒细胞)。
[0281] 为了分离PBMCs，35ml的全血被装载至15ml的Ficoll上，于50mlFalcon管中并以400x g于20℃离心30min，不开刹车。小心吸取(extract)位于界面的白色层至新的Falcon
2+ 2+
管中。用不含Ca 或Mg 的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Lonza，Walkersville，MD，USA)洗涤所分离的PBMCs两次。通过结晶紫染色确定有核细胞的数量。
2+ 2+
管中。用不含Ca 或Mg 的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Lonza，Walkersville，MD，USA)洗涤所分离的PBMCs两次。通过结晶紫染色确定有核细胞的数量。
[0282] 采用EasySep人单核细胞富集试剂盒(阴性选择-STEMCELL Technologies，Australia)，通过按照制造商的说明从新鲜的人PBMCs分离单核细胞。所述试剂盒消耗了一小亚群的CD+16单核细胞。用CD14-FITC对细胞进行荧光染色，并通过流式细胞术进行分析。
纯度总是大于92％。
纯度总是大于92％。
[0283] 采用EasySep人NK细胞富集试剂盒(阴性选择-STEMCELL Technologies，Australia)从人PBMCs分离天然杀伤(NK)细胞。所述试剂盒通过消耗非NK细胞来富集NK细胞。在用CD56-PE.Cy7和CD3-FITC染色之后，通过流式细胞术测量NK细胞的纯度。纯度总是大于94％。
[0284] 采用人B细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，Australia)，通过磁性细胞分离(阴性选择)将B细胞富集至＞98％纯度(CD19+)。纯度总是大于90％。
[0285] 采用髓样(myeloid)树突细胞分离试剂盒(阴性选择，Miltenyi Biotec，N.S.W.，Australia)，从人PBMCs分离髓样树突细胞(mDCs)。通过消耗非dDCs来分离mDCs。在加入抗生物素缀合的微珠作为二级标记试剂之前，用生物素缀合的抗体混合物对非mDCs进行间接磁性标记。所述磁性标记的非mDCs被通过将这些细胞保持在MACS柱上而被消耗。使未标记的mDCs流穿所述柱。用CD141(BDCA-3)-FITC、CD1c(BDCA-1)-APC对细胞进行荧光染色，并通过流式细胞术进行分析。纯度总是大于90％。
[0286] 采用EasySep人浆细胞样DC富集试剂盒(阴性选择-STEMCELL Technologies，Vic，Australia)，从人PBMCs分离浆细胞样树突细胞。所述试剂盒通过消耗非pDCs来从PBMCs富集pDCs。用CD304(BDCA-4)-APC和HLA-DR-PerCP对细胞进行荧光染色，并通过流式细胞术进行分析。纯度总是大于92％。
[0287] 或者通过收集塑料粘附细胞(plastic-adherent cell)，或者通过用RosetteSep CD14+富集试剂盒(STEMCELL Technologies，Australia)处理PBMCs，来获得单核细胞来源的树突细胞(MDDC)(＞90％CD14+)。随后，分离的单核细胞在补充有合适浓度的重组人IL-4和GM-CSF的完全培养基(eBioscience，San Diego，CA，USA)中培养六天。
[0288] 根据由制造商提供的操作步骤，通过阴性选择(STEMCELL Technologies，Australia)新鲜分离CD4+T细胞。CD3+/CD4+T细胞的纯度≥96％。
[0289] 采用EasySep CD8富集试剂盒(STEMCELL Technologies，Australia)，通过CD8阴性选择分离CD8+T细胞。CD3+/CD8+T细胞的纯度通过流式细胞术进行验证(＞95％)。
[0290] 从获取自健康供体的总共10-20mL人血液中分离中性粒细胞，采用肝素来防止凝血。所有后续步骤在4℃或冰上进行。所述血液用具有2％Dextran T500(Pharmacia)的Hank’s平衡的盐溶液(HBSS；Life Technologies，Victoria，Australia)按1∶1进行稀释，并孵育30分钟以沉淀红细胞。上层相被转移至一个新管中，并采用Ficoll-PaquerMpLUS(GE HealthCare，Australia)进行密度分级分离。从该沉淀回收中性粒细胞，并且从界面回收单核细胞。沉淀被转移至新管中，并重悬于RBC裂解缓冲液(150mM氯化铵、1mM碳酸氢钾、0.1mM EDTA、pH 7.2)中，然后用补充有10％低内毒素胎牛血清(FBS)和抗生素的RPMI 1640洗涤。典型的回收是每毫升收集的血液三至五百万个中性粒细胞。纯度大于92％。在每次实验之前分离中性粒细胞，并立即使用。
[0291] 从来自健康血液供体的如之前所述纯化的PBMCs制备巨噬细胞。用10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF；R&D Systems)，在96孔板(Becton Dickinson，Franklin Lake，NJ，USA)中以1.5x 106个细胞/孔的密度在补充有10％肽小牛血清、2mM L-谷氨酰胺和50IU/ml青 霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，从纯化的单核细胞产生巨噬细胞。在第二天和第五天更新一半的培养基，并且在第六天收获单核细胞来源的巨噬细胞。所获得的细胞群体含有＞90％的巨噬细胞。
[0292] 免疫细胞分离和FACS分析
[0293] 基于如表2中所示的不同表面标记物的表达来分离细胞。在每个实验中，细胞(每个样品＞104个细胞)被悬浮于所述培养基中，并且或者立即确定新鲜分离的细胞的纯度(细胞表面表型)，或者固定于1％多聚甲醛中用于以后通过流式细胞术BD LSR-II(BD Biosciences)分析。采用FlowJo软件程序(Tree Star，USA)进行分析。
[0294] 表2用于流式细胞术纯化免疫细胞亚群的抗体
[0295]缀合的抗体 克隆名称 同种型 公司
CD1c(BDCA-1)-APC L161 ms IgG1，κ Biolegend
HLA-DR-PerCP L243 ms IgG2a，κ Biolegend
CD14-FITC HCD14 ms IgG1，κ Biolegend
CD56-PECy7 NCAM16.2 ms IgG2b，κ BD Bioscience
CD4-FITC SK3 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD8-PerCP SK1 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD304-APC AC144 ms IgG1 Miltenyi Biotec
CD45-PE HI30 ms IgG1，κ Biolegend
CD19-FITC 4G7 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD19-APC HIB19 ms IgG1，κ Biolegend
CD16-Pacific Blue eBioCB16 ms IgG1，κ eBioscience
CD3-Pacific Orange UCHT1 ms IgG1，κ BD Pharmingen
CD1c(BDCA-1)-APC L161 ms IgG1，κ Biolegend
HLA-DR-PerCP L243 ms IgG2a，κ Biolegend
CD14-FITC HCD14 ms IgG1，κ Biolegend
CD56-PECy7 NCAM16.2 ms IgG2b，κ BD Bioscience
CD4-FITC SK3 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD8-PerCP SK1 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD304-APC AC144 ms IgG1 Miltenyi Biotec
CD45-PE HI30 ms IgG1，κ Biolegend
CD19-FITC 4G7 ms IgG1，κ BD Bioscience
CD19-APC HIB19 ms IgG1，κ Biolegend
CD16-Pacific Blue eBioCB16 ms IgG1，κ eBioscience
CD3-Pacific Orange UCHT1 ms IgG1，κ BD Pharmingen
[0296] 细胞刺激测定
[0297] 通过内源性配体刺激分离的免疫细胞，所述内源性配体包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ、流感病毒抗原、Toll-样受体激动剂(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9)，以及活的流感病毒(H1N1、H3N2、乙型流感)。纯的细胞群体以1-2x106个细胞/ml的密度被重悬于含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640中。为了确定不同浓度的刺激子对IFI27表达的作用，将细胞在37℃于具有指定浓度的刺激子的培养基中孵育6、12和24小时。对于所有处理，进行剂量反应以界定最 佳刺激条件。通过台盼蓝排除法(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)测量在刺激之前和之后的细胞活力。
[0298] 统计分析
[0299] 采用合适的未配对的双尾学生T检验(Student’s t)或非参数曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验计算2组之间的比较。根据需要采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis检验计算多个组之间的比较。将基因表达数据表示为相对于健康对照的倍数变化(平均值+/-SD)。采用GraphPad Prism版本6(GraphPad Software，La Jolla，CA)进行所有统计分析。所有的p值是双侧(two-sided)具有被认为p＜0.05的显著性阈值。
[0300] 实施例2：IFI27在严重流感感染中高度表达
[0301] 为了筛选潜在候选标记物，对来自患有确认的流感感染的患者的全血进行转录组微阵列分析。该分析鉴定干扰素刺激的基因(干扰素α可诱导蛋白27(IFI27))为严重流感感染的标记物(图1)。在所述发展组中，所述IFI27基因在患有来自流感感染的严重疾病的个体中高度表达。该发现在所述验证组中被确认(图2)。
[0302] IFI27表达水平与疾病严重程度之间的相关性在两个独立基因表达数据集(GSE17156，GSE21802)中被进一步验证，其中发现IFI27的表达在患有无症状感染的个体中最少，在有症状感染中适度升高，
[0303] 并且在患有来自所述感染的严重疾病的那些个体中显著升高(图3)。在发展为严重疾病的个体群中，更高的平均IFI27表达(＞90倍数变化)与更高比例的需要机械通风的个体相关(表3)。
[0304] 表3在患有严重流感肺炎的患者中IFI27的表达
[0305]
[0306] 随着患者从严重疾病康复，IFI27表达朝着基线水平返回(图4和5)。作为严重程度生物标记物，IFI27优于所有其它干扰素来源的基因。与其它基因相比，IFI27显示出在由流感感染引起的轻微和严重疾病之间最大的差异表达(图6)。
[0307] 体外(in vitro)实验确认，外周血中的病毒载量(load)与IFI27表达相关。采用从健康志愿者分离的PBMC，发现流感病毒引起IFI27基因表达的剂量依赖性升高(图7)。在用抗病毒药剂磷酸奥司他韦处理细胞之后，所述上调被消除(图8)。
[0308] 实施例3：IFI27表达机制
[0309] 为了阐明IFI27的表达机制，采用内源性配体(干扰素-α、干扰素-β和干扰素-λ)进行实验刺激干扰素通路。观察到干扰素-α(IFNα)产生IFI27表达的最大升高(图9)，并且该升高以剂量依赖性的形式发生(图10)。
[0310] 因为外周血含有免疫细胞的异源混合物，采取步骤以鉴定产生所述IFI27信号的特异性免疫细胞亚群。由于Toll-样受体(TLR)是IFNα通路的主要激活子，评估了将不同的TLR配体应用于血细胞的作用。在所有的TLR配体中，发现TLR7配体产生最大的IFI27表达(图11)。通常TLR7主要发现于浆细胞样树突细胞(pDCs)和B细胞中9，因此推测pDCs或B细胞是在外周血中所观察到的IFI27信号的可能的来源。
[0311] 为了测试该推测，从健康志愿者的全血中纯化8个免疫细胞亚群(CD4、CD8、中性粒细胞、B细胞、单核细胞、天然杀伤细胞、髓样树突细胞和浆细胞样树突细胞)。此外，产生来自单核细胞的体外分化的免疫细胞亚群(单核细胞来源的巨噬细胞和单核细胞来源的树突细胞)。这些实验显示，与所有其它细胞类型相比，pDCs产生应答于TLR7配体的IFI27基因表达的最大升高(图12)。其它免疫细胞亚群包括B细胞，产生最小或可以忽略不计的IFI27信号。采用病毒抗原的进一步实验确认，pDC产生最大的IFI27上调(图13)。重要的是， 采用甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和乙型流感病毒，发现所有常见季节性流感病毒株均引起了pDCs中的IFI27表达上调(图14)。
[0312] 总之，上述发现表明，循环pDCs产生了在感染的患者全血中所观察到的IFI27信号。该表达可以通过TLR7受体(针对单链RNA病毒的高度特异性内源受体)来介导10。暴露于流感病毒可以导致TLR7的活化，其反过来导致通过IFNα通路的剂量依赖性IFI27上调(IFN-a的产生依赖于含有Toll-白细胞介素-1受体结构域的接头MyD88，其与转录因子IRF7形成复合物)(图15)。
[0313] 实施例4：IFI27表达的时间进程(time-course)
[0314] 为了研究IFI27表达的时间进程，进行在pDCs中IFI27表达的纵向分析。将pDCs暴露于流感病毒，并且4天中每天测量IFI27的基因表达(图16)。该实验显示，pDC在24小时内快速提高IFI27表达，接着在48和72小时下降。基因表达的下降不是由于pDCs数量的降低，因为存活细胞的数量在48和72小时保持相对恒定，如凋亡测定所证实的(图16)。该观察证实，IFI27具有发生于感染早期的快速上调。
[0315] 实施例5：在细菌性感染中的IFI27表达
[0316] 还研究了其它病原体(例如细菌)是否也可以提高IFI27的表达。为此，用脂多糖(LPS)培养PBMC。发现LPS引起可以忽略不计的IFI27基因表达(图17)。这被患有细菌性肺炎的患者的群所确认，其中与患有流感肺炎的患者相比，IFI27表达显著更低(图18)。这在由病毒性和细菌性二者的肺炎患者(n＝37)组成的独立数据集(GSE6269)中被进一步验证。再次，该分析显示，与细菌性肺炎相比，在流感感染中IFI表达显著更高(图19)。
[0317] 实施例6：在全身性炎症中IFI27的表达
[0318] 严重疾病在所述宿主中引起广义的全身性炎症应答，并且研究了严重疾病是否也可以提高IFI27表达。在患有全身性炎症应答综合征 (由外伤、胰腺炎和高风险手术引起)的患者群中，发现IFI27基因表达没有显著升高(图20)。这在SIRS患者(n＝167)的独立数据集(GSE11375)中被确认，其中IFI27表达最小(图21)。
[0319] 实施例7：讨论
[0320] 流感大流行的特征在于，通过易感人群快速传播新病毒株。在爆发过程中感染个体的指数增加，使得逻辑上(logistically)不能测试并隔离每个被怀疑的病例。公共卫生反应将很快从遏制爆发转移到将健康护理资源分配给该最危重的疾病。因此，能够快速分选(triage)大量感染个体并鉴定那些处于恶化高风险的个体的能力，对于大流行管理是至关重要的。为此，已经将IFI27确立成为与流感感染相关的可信赖的疾病严重程度生物标记物。
[0321] 数据已经证实，IFI27与来自流感感染的严重疾病中三个独立群的疾病严重程度有关。在其他群中的进一步验证已经确认，IFI27对流感感染具有特异性。另外，已经发现，所有常见流感病毒株(H1N1、H3N2、乙型流感)均引起升高的IFI27表达和显著的IFI27上调，其也与住院(＞50倍数变化)或呼吸衰竭(＞90倍数变化)有关。总之，这些发现证实，IFI27表达是鉴定患有进展性疾病的个体的有用血液标记(signature)，并具有宝贵的临床应用。
[0322] IFI27作为生物标记物具有良好的动力学曲线。在暴露于流感病毒的24小时内，IFI27上调快速发生。该特征可以帮助临床医生在高风险的患者中尽量减少治疗延迟。在2009年H1N1流感大流行过程中，在患有进展性疾病的患者中常见报道5-7天的平均延
迟11-13。IFI27可以帮助在他们临床恶化之前鉴定这些患者。
迟11-13。IFI27可以帮助在他们临床恶化之前鉴定这些患者。
[0323] 传统上，流感大流行爆发期间的风险分层依赖于已知的危险因素(例如，年龄、怀孕、肥胖或免疫抑制)。然而，在2009年H1N1流感大流行过程中，不相称地大量的感染者没有可鉴定的风险因素14。常规的病毒测定可以鉴定致病的病毒株。但它们不提供关于宿主应答、疾病进展的主要决定因素的任何信息。宿主应答生物标记物如IFI27，通过提供有关诊断和宿主应答的信息来克服上述限制。值得注意的是， 当前的数据显示，IFI27在反映疾病严重程度方面优于所有其它已知的干扰素来源的宿主应答生物标记物(例如，MxA，OAS)。
[0324] 宿主应答的生物标记物的常见限制是它们缺乏特异性。例如，在禽流感(H5N1)感染中，高水平的炎症性细胞因子(例如，TNF-α，IL-6)是疾病严重程度的标记物15。但是，同一生物标记物还在许多非病毒状况下也升高，包括细菌性败血症、外伤及手术。存在这种特异性的缺乏是因为，这些生物标记物是由各种免疫细胞(例如，单核细胞和淋巴细胞)产生的。相反，IFI27更具病原性并且是细胞特异性的。这种特异性可能是由于TLR7-IFNα通路，其仅识别单链RNA(例如，流感病毒)10。重要的是，该通路目前仅已知存在于pDCs中，并且在其它免疫细胞中不存在，从而赋予IFI27在所述生物标记物文献中无与伦比的优异诊断特异性。
[0325] 在防治流感大流行中的独特挑战是，在新病毒株的遗传组成中不可预知的变化。宿主应答生物标记物如IFI27可能潜在地回避该挑战。我们的数据表明，IFI27的表达被所有常见流感株(包括大流行的H1N1、季节性H3N2和乙型流感)提高。
[0326] IFI27基因编码位于细胞的内线粒体膜的蛋白质(ISG12)8。测量细胞或血清的IFI2蛋白可以提供检测流感感染的替代性诊断方法。在另一方面，基因表达测定提供测量IFI27表达的更快速和具有成本效益的手段。通过获得2.5ml的外周血样品，可以通过常规RT-PCR在数小时内快速测定IFI27的表达，使得有可能在常规临床实践中监控活化的pDCs。
[0327] 本发明具有重要的治疗和临床意义。免疫学的最新进展显示，树突细胞处于宿主应答的中央阶段，与几个树突细胞亚群(包括pDCs)配合抗病毒感染的多支免疫应答17，18。这种复杂的树突细胞网络对于宿主防御是必不可少的；但是，它也可能是免疫病理学的来源19。新出现的证据表明，异常pDC应答能够支持病毒传播，并与致命流感感染有关20-22。为了抗击来自病毒感染的严重疾病，最近已经开发了靶向树突细胞的药物23-24。然而，但目前还没有用于鉴定哪些患者是适合于pDC-定向(pDC-directed)治疗的可用测定。但是，本文提供了 关联新的生物标记物与pDC应答和临床严重性的第一数据。作为辅助诊断(companion diagnostic)进行应用，IFI27表达还可有助于鉴定能够从pDC-定向治疗中获益的患者的亚组。
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