脑脊液中的β淀粉样聚集体作为阿尔茨海默病的生物标记
阅读：935发布：2020-09-13
专利汇可以提供脑脊液中的β淀粉样聚集体作为阿尔茨海默病的生物标记专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且发明 提供评估所评价对象有阿尔茨海默病可能性增加的方法，包括获得对象 生物 样品Aβ40聚集体检测的步骤，其中生物样品不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。在一些实施方式中，发明涉及评价早期阿尔茨海默病可能性增加的方法。发明还提供评价没有阿尔茨海默病可能性增加的方法，监控阿尔茨海默病对象中 疾病 发展的方法，和对阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法，以及评价MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法。，下面是脑脊液中的β淀粉样聚集体作为阿尔茨海默病的生物标记专利的具体信息内容。
1.一种评估所评价对象有阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括获得所述对象生物样品中Aβ40聚集体检测值的步骤，其中所述生物样品不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
2.一种评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括获得所述对象生物样品中Aβ40聚集体检测值的步骤，其中所述生物样品不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述Aβ40聚集体检测值报告给包括可见显示器或打印机的报告机构的步骤。
4.如权利要求1或2的所述方法，其特征在于，所述Aβ40聚集体检测值包括所述生物样品中的Aβ40聚集体水平。
5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，来自所述评价对象或所述阿尔茨海默病对象的所述生物样品包含体液或体组织。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物样品包含选自下组的成员：全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液（CSF）、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、神经系统组织、非神经系统组织，肌肉组织、活检、尸检、脂肪活检、脂肪组织、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液（BAL）或滑液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物样品包含选自下组的成员：血浆，血清，CSF和尿液。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Aβ40聚集体是循环Aβ40聚集体。
9.如权利要求1-4所述的方法，其特征在于
其中所述生物样品包含体组织；和
其中所述Aβ40聚集体检测值或所述Aβ40聚集体水平通过包括下面步骤的方法获
得：
提供所述体组织的匀浆；
将所述匀浆与聚集体特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述 Aβ40聚集体从而形成复合物的条件下接触；以及
通过与所述试剂的结合检测所述生物样品中的Aβ40聚集体；其中所述试剂连接到固体支持物并且与所述固体支持物连接时优选结合聚集体而不是单体。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方式还包括以下步骤，如果所述Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定所述对象有阿尔茨海默病或MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加，
其中，所述对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中所有所述生物样品包含CSF。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病是早期。
12.一种评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
获得所述对象生物样品中Aβ40聚集体水平；和
如果所述对象没有显示临床认知损害，并且，如果所述Aβ40聚集体水平等于或低于对照水平临界值，确定所述对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
13.一种帮助评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
检测所述对象生物样品中Aβ40聚集体水平；和
将所述Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；
其中，如果所述对象没有显示临床认知损伤，并且，如果所述Aβ40聚集体水平等于或低于对照含量临界值，所述另外的实体确定所述对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
14.一种在没有经历任何阿尔茨海默病治疗的阿尔茨海默病对象中监控疾病发展的方法，所述方法包括步骤：
在所述对象诊断有阿尔茨海默病后的某一时间获得取自所述对象的生物样品中Aβ40聚集体水平；和
如果（a）所述Aβ40聚集体水平低于所述对象的早期Aβ40聚集体水平；或（b）如果没有所述对象的所述早期水平，所述Aβ40聚集体水平低于早期标准，则确定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或
如果（a）所述Aβ40聚集体水平等于所述对象的早期Aβ40聚集体水平；或（b），如果没有所述对象的所述早期水平，所述Aβ40聚集水平等于所述早期标准，则测定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；
其中，所述早期水平是在阿尔茨海默病早期取自所述对象的生物样品中的Aβ40聚集体水平；
其中，所述早期标准是取自一个或多个已知为阿尔茨海默病早期的标准对象的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
15.一种在没有经历任何阿尔茨海默病治疗的阿尔茨海默病对象中帮助监控疾病发展的方法，所述方法包括步骤：
在所述对象诊断有阿尔茨海默病后的某一时间检测取自所述对象的生物样品中Aβ40聚集体水平；和
将所述Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；
其中，
如果（a）所述Aβ40聚集体水平低于所述对象的早期Aβ40聚集体水平；或（b），如果没有所述对象的所述早期水平，所述Aβ40聚集体水平低于早期标准，则所述另外的实体确定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或
如果（a）所述Aβ40聚集体水平等于所述对象的所述早期水平；或（b），如果没有所述对象的所述早期水平，所述Aβ40聚集体水平等于所述早期标准，则另外的实体确定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；
其中，所述早期水平是在阿尔茨海默病早期从所述对象获得的生物样品的Aβ40聚集体水平；
其中，所述早期标准是从一个或多个已知为阿尔茨海默病早期的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
16.一种在任何阿尔茨海默病治疗前对阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法，所述方法包括步骤：
获得所述对象生物样品中Aβ40聚集体水平；和
如果有阶段特异标准，如果所述Aβ40聚集体水平接近阶段特异标准，则确定所述对象存在与阶段特异标准所指相同的疾病期的可能性增加；
其中，所述阶段特异标准是从一个或多个患同一已知阶段阿尔茨 海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
17.一种在任何阿尔茨海默病治疗前帮助阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法，所述方法包括步骤：
检测所述对象生物样品中Aβ40聚集体含量；和
将所述Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；
其中，如果有阶段特异标准，如果所述Aβ40聚集体水平接近阶段特异标准，则所述另外的实体确定所述对象有相同疾病期的可能性增加；
其中，所述阶段特异标准是从一个或多个患同一已知阶段阿尔茨海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述早期标准或所述阶段特异标准是从多个患同一已知阶段阿尔茨海默病的标准对象获得的生物样品中Aβ40聚集体平均水平。
19.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，至少有一个早期标准和一个晚期标准可用于与所述Aβ40聚集体水平作比较。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括获得所述评价对象中阿尔茨海默病第二指示物的检测值的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据包括所述Aβ40聚集体检测和所述第二指示物检测的数据计算对象指数的步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括比较所述对象指数与对照指数临界值的步骤；
其中，所述对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象的生物 样品Aβ40聚集体检测和所述对照对象的所述第二指示物检测值的数据来计算获得；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品是同一样品类型。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第二指示物在所述生物样品中测量。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第二指示物是Aβ42单体。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第二指示物是Aβ40单体。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，
所述第二指示物是Aβ42单体；
其中所述对象指数是所述评价对象中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；和其中，所述对照指数临界值是对照比率临界值，从包括所述对照对象生物样品的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算获得。
27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，
所述第二指示物是Aβ40单体；
其中所述对象指数是所述评价对象中Aβ40聚集体水平与Aβ40单体水平的比率；和其中，所述对照指数临界值是对照比率临界值，从包括所述对照对象生物样品的Aβ40聚集体水平和Aβ40单体水平的数据计算获得。
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：如果所述比率高于所述对照比率临界值，则确定所述评价对象有阿尔茨海默病的可能性增加，所述生物样品包含CSF。
29.如权利要求20-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病是早期。
30.一种评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
获得来自所述对象的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率；和
如果所述对象没有显示临床认知损伤，并且，如果所述比率等于或低于对照比率临界值，确定所述对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
31.一种帮助评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
检测来自所述对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平；和
将所述Aβ40聚集体水平和所述Aβ42单体水平或所述Aβ40聚集体水平与所述
Aβ42单体水平的比率传达给另外的实体；
其中，如果所述对象没有显示临床认知损伤，并且，如果所述比率等于或低于对照比率临界值，则所述另外的实体确定所述对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
32.一种在没有经历任何阿尔茨海默病治疗的阿尔茨海默病对象中监控疾病发展的方法，所述方法包括步骤：
在所述对象诊断有阿尔茨海默病后的某一时间，获得取自所述对象的生物样品中
Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；和
如果（a）所述比率低于所述对象的早期Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率（如果可用）；或（b）如果所述对象的所述早期比率不可用，所述比率低于早期比率标准，则测定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或
如果（a）所述比率等于所述对象的早期比率（如果可用）；或（b）如果所述对象的所述早期比率不可用，所述比率等于早期比率标准，则测定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；或
其中，所述早期比率是从所述早期阿尔茨海默病对象获得的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述早期比率标准是从一个或多个患已知早期阿尔茨海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
33.一种在没有经历任何阿尔茨海默病治疗的阿尔茨海默病对象中帮助监控疾病发展的方法，所述方法包括步骤：
在所述对象诊断有阿尔茨海默病后的某一时间，测量取自所述对象的生物样品中
Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平；和
与另外单体交流所述Aβ40聚集体水平和所述Aβ42单体水平或所述Aβ40聚集体水平与所述Aβ42单体水平的比率；
其中，
如果（a）所述Aβ40聚集体水平与所述Aβ42单体水平的比率低于所述对象的早期Aβ40聚集体与Aβ42单体水平的比率（如果可用）；或（b）如果所述对象的所述早期比率不可用，所述比率低于早期比率标准，则另外的实体确定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性 增加；或
如果（a）所述比率等于所述对象的所述早期比率（如果可用）；或（b）如果所述对象的所述早期比率不可用，所述比率等于所述早期标准，则另外的实体确定所述对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；或
其中，所述早期比率是从所述早期阿尔茨海默病对象获得的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述早期比率标准是从一个或多个患已知早期阿尔茨海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
34.一种在任何阿尔茨海默病治疗前对阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法，所述方法包括步骤：
获得来自所述对象的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率；和
如果阶段特异比率标准可用，如果所述比率接近所述比率标准，则测定所述对象有相同疾病期的可能性增加；
其中，所述比率标准是从一个或多个患同一已知阶段阿尔茨海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
35.一种在任何阿尔茨海默病治疗前帮助阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法，所述方法包括步骤：
检测来自所述对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水 平；和
将所述Aβ40聚集体水平和所述Aβ42单体水平或所述Aβ40聚集体水平与所述
Aβ42单体水平的比率传达给另外实体；
其中，如果阶段特异比率标准可用，如果所述比率接近所述比率标准，则所述另外的实体确定所述对象有相同疾病期的可能性增加；
其中，所述比率标准是从一个或多个患同一已知阶段阿尔茨海默病的标准对象取得的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；
其中，所述对象和所述标准对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述早期比率标准或所述阶段特异比率标准是从多个患同一已知阶段阿尔茨海默病的标准对象获得的生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的平均比率。
37.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，至少有一个所述早期比率标准和一个晚期比率标准可用于与所述比率作比较。
38.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括获得检测所述评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病第二指示物的检测值的步骤。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法还包括根据包括所述Aβ40聚集体检测值和所述第二指示物检测值的数据计算对象指数的步骤。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述方法还包括比较所述对象指数与对照指数临界值的步骤，
其中，所述对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体检测值和所述对照对象的所述第二指示物检测值的数据计算获得；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品是同一样品类型。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述第二指示物在所述生物样品中测量。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述第二指示物是Aβ42单体。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，
所述第二指示物是Aβ42单体；
其中所述对象指数是所述评价对象中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；和其中，所述对照指数临界值是对照比率临界值，从包括所述对照对象生物样品的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算获得。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述方法包括如果：如果所述比率高于所述对照比率临界值则确定所述评价对象有阿尔茨海默病的可能性增加，所述生物样品包含CSF。
45.一种评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
获得所述对象的生物样品中Aβ40聚集体的测量，
如果所述Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定所述对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加，
其中，所述对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF，并且其中所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
46.一种帮助评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
检测所述对象生物样品中Aβ40聚集体水平；和
将所述Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；
其中，如果所述Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，所述另 外的实体确定所述对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
47.一种评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
获得来自所述对象的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率；和
如果所述比率高于对照水平临界值，确定所述对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加，
其中，所述对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
48.一种帮助评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法，所述方法包括步骤：
测定来自所述对象的生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率；和
将所述Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的
比率传达给另外的实体；
其中，如果所述比率高于对照比率临界值，所述另外的实体确定所述对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加；
其中，所述对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算得来；
其中，所述评价对象和所述对照对象是同一物种；和
其中，所有所述生物样品包含CSF并且所述生物样品都不包含脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
49.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述评价对象或所述阿尔茨海默病对象是人。
50.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述评价对象或所述阿尔茨海默病对象是非人动物。
51.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述评价对象或所述阿尔茨海默病对象是活体。
52.如权利要求10-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述对照对象或所述标准对象是活体。
53.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，与从所述对照对象或标准对象采集生物样品一样，所述生物样品比照以相同方式运用相同方法收集。
54.如权利要求10-53中任一项所述的方法，其特征在于，
其中所述Aβ40聚集体检测值或所述Aβ40聚集体水平通过包括下面步骤的方法获
得：
将所述CSF与聚集体特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述Aβ40聚集体形成复合物的条件下接触；和
根据Aβ40聚集体与所述试剂结合检测对象CSF中的Aβ40聚集体；
其中所述试剂连接到固体支持物并且在连接到所述固体支持物时优先结合聚集体而不是单体。
55.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括分步骤：
将所述试剂和Aβ40聚集体形成的所述复合物与Aβ40未结合单体分离；
可选地，从所述复合物中解离Aβ40聚集体；和
检测Aβ40聚集体。
56.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括分步骤：
将所述试剂和Aβ40聚集体形成的所述复合物与Aβ40未结合单体分离，并且除去所述Aβ40未结合单体；
变性所述复合物中的所述Aβ40聚集以形成Aβ40单体；并
检测Aβ40聚集。
57.如权利要求1-8或10-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述Aβ40聚集体测量值或所述Aβ40聚集体水平用包括种子多聚化的方法获得。
58.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述试剂包含类肽。
59.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述试剂包含肽。
60.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述试剂包含树突。
61.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组：硝酸纤维素，聚苯乙烯乳胶，聚氟乙烯，重氮化纸，尼龙膜，活化珠，磁响应珠，氧化钛，氧化硅，多糖珠，多糖膜，琼脂糖，玻璃，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙二醇-聚苯乙烯混合，可控孔度玻璃，载玻片，金珠，纤维素。
62.如权利要求9或54所述的方法，其特征在于，所述试剂被可检测标记。
63.如权利要求55或56所述的方法，其特征在于，在所述复合物与未结合单体分离后用检测试剂检测所述Aβ40聚集体。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述检测试剂被可检测标记。
脑脊液中的β淀粉样聚集体作为阿尔茨海默病的生物标
记
[0001] 相关申请的交叉引用
背景技术
[0003] 阿尔茨海默病是与年龄相关的最常见痴呆形式，在将来50年内将成为一种流行病，因为相当高比率的世界人口年龄增长要超过65岁。尽管照顾阿尔茨海默病患者是社会重要而且增加的经济负担，现存的几种治疗只是减轻疾病症状；没有预防性的治疗。另外，目前诊断方法依赖于此疾病易于观察的症状，所述症状只在疾病发展中显现。
[0004] 阿尔茨海默病与大脑中错误折叠的Aβ和tau蛋白的聚集有关。已证明难以在活体对象和由活体对象获取的样品中检测错折叠蛋白的聚集。目前证实活体患者中存在聚集物的技术粗略且具有侵入性。例如，组织病理学检查要求对患者存在风险的活检。组织病理学固有地存在取样误差，因为病损和聚集的致病蛋白沉积可能根据进行活检区域而被忽略。因此，在对象死亡之前对这些病症进行确定诊断和姑息治疗仍然是一个巨大的尚未实现的挑战。
[0005] 大脑中β淀粉样蛋白（Aβ）聚集体主要是Aβ1-40（Aβ40）和1-42（Aβ42），这些聚集体与阿耳茨海默病（AD）关，被视作该疾病的黄金标准标记物。然而，AD唯一的确定性检验是在死后对脑样品进行纤维状Aβ聚集斑块的免疫组织化学染色。目前，尚没有FDA批准的AD死前诊断试验。血浆或CSF样品可用于死前试验。一些死前AD试验聚焦于脑脊液(CSF)，试图对可溶性单体Aβ42进行定量。然而，这种生物标记物仅仅用作AD的间接测量。
[0006] 近期文献指出Aβ的小、可溶性非纤维状寡聚种类可能是神经毒剂，直接造成阿尔茨海默病表型（Hoshi等，PNAS，2003，100，6370；Lambert等，PNAS，1998，95，6448；Sakano和Zako，FEBBS J.，2010，277（6），1348；Fukumoto等，2010，FASEB J.，24，2716）。另外，使用Aβ42抗体或用荧光标记Aβ42的种子多聚化策略，与发现取自阿尔茨海默病患者的脑脊髓液（CSF）中Aβ寡聚种类水平相较，取自健康对照对象的CSF提高（Georganopoulou等，PNAS，2005，102，2273；Pitschke等，Nature Medicine，1998，4（7））。
[0007] 需要使用早期检测阿尔茨海默病的额外生物标记，从而能更快和更高效的诊断和评价阿尔茨海默病的潜在治疗。另外，需要预后阿尔茨海默病，这与来自轻度认知损害（MCI）临床诊断的其他痴呆完全不同。还需要确定患者阿尔茨海默病阶段的方法，从而治疗和护理可就有效健康护理方案进行适当调整。另外，评价阿尔茨海默病进展的能力能极大帮助测试和评价疾病的潜在治疗。
[0008] 优选实施方式的简要概述
[0009] 本文所述发明通过提供单独使用Aβ40聚集体或与Aβ42单体，Aβ40单体或阿尔茨海默病其他生物标记联用的方法，来满足这些需要。
[0010] 因此，一方面包括评估所评价对象有阿尔茨海默病可能性增加的方法，包括获得对象生物样品Aβ40聚集体检测值的步骤，其中所述生物样品不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。在本方面的某些实施方式中，所述方法还包括将Aβ40聚集体检测值报道到包括可见显示或打印机在内的报告机构的步骤。在其他实施方式中，Aβ40聚集体检测包括生物样品中Aβ40聚集体的水平。在另一些实施方式中，所述方法还包括如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定对象有阿尔茨海默病可能性增加的步骤，其中对照水平临界值从包括多种认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型。在上述方法的某些实施方式中，阿尔茨海默病处于早期。
[0011] 另一方面包括评估所评价对象没有阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：获得对象生物样品的Aβ40聚集水平；并且如果对象没有显示临床认知损伤并且如果Aβ40聚集体水平等于或低于对照水平临界值，确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照水平临界值从包括多种认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0012] 一个相关方面包括评估所评价对象没有阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：检测对象生物样品的Aβ40聚集水平；将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；其中如果对象没有显示临床认知损伤并且如果Aβ40聚集体水平等于或低于对照水平临界值，另外实体确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照水平临界值从包括多种认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，并所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0013] 另一方面包括监控有阿尔茨海默病但没有接受任何阿尔茨海默病治疗的对象中疾病发展的方法，包括如下步骤：在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间获得取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平；并且如果（a）Aβ40聚集体水平低于对象可用Aβ40聚集体早期水平；或（b）如果对象早期水平不可用，Aβ40聚集体水平低于早期标准，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或者如果（a）Aβ40聚集体水平与对象可用Aβ40聚集早期水平相同；或（b）如果对象早期水平不可用，Aβ40聚集体水平与早期标准相同，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；其中早期水平是取自早期阿尔茨海默病对象生物样品的Aβ40聚集体水平；其中早期标准是取自已知患早期阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0014] 一个相关方面包括帮助监控有阿尔茨海默病但没有接受任何阿尔茨海默病治疗的对象中疾病发展的方法，包括如下步骤：在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间检测取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平；和将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；其中如果（a）Aβ40聚集体水平低于对象可用Aβ40聚集体早期水平；或（b）如果对象早期水平不可用，Aβ40聚集体水平低于早期标准，则另外实体确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或者如果（a）Aβ40聚集体水平与对象可用Aβ40聚集体早期水平相同；或（b）如果对象早期水平不可用，Aβ40聚集体水平与早期标准相同，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；其中早期水平是取自早期阿尔茨海默病对象生物样品的Aβ40聚集体水平；其中早期标准是取自已知患早期阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，并所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0015] 另一方面还包括对有阿尔茨海默病对象在治疗阿尔茨海默病之前指明疾病阶段的方法，包括如下步骤：获得取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平；并且如果可用阶段特异标准，如果Aβ40聚集体水平与阶段特异标准接近，确定对象有同一疾病阶段可能性增加；其中阶段特异标准是取自患已知同一阶段阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0016] 一个相关方面包括对有阿尔茨海默病对象在治疗阿尔茨海默病之前帮助指明疾病阶段的方法，包括如下步骤：测量取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平；和将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；其中如果可用阶段特异标准，如果Aβ40聚集体水平与阶段特异标准接近，另外实体确定对象有同一疾病阶段的可能性增加；其中阶段特异标准是取自患同一已知阶段阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0017] 在涉及疾病进展和指明疾病阶段的方法的某些实施方式中，早期标准或阶段特异标准是从患已知同一阶段阿尔茨海默病的多个标准对象获得的生物样品Aβ40聚集体平均水平。在一些实施方式中，有至少一个早期标准和一个晚期标准用于对比Aβ40聚集体水平。
[0018] 另一方面包括上述评价有阿尔茨海默病的可能性增加的方法，还包括获得所评价对象中阿尔茨海默病第二指示物测量的步骤。在某些实施方式中，有根据数据计算对象指数的额外步骤，包括Aβ40聚集体的测量和第二指示物的测量。在方法的一些实施方式中，计算对象指数后，所述方法还包括将对象指数和对照指数临界值作比较的步骤，其中，对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象生物样品的Aβ40聚集体水测量和对照对象第二指示物测量在内的数据计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型。
[0019] 在某些实施方式中，第二指示物在生物样品中测量。在优选实施方式中，第二指示物是Aβ42单体或Aβ40单体。在某些实施方式中，第二指示物是Aβ42单体；对象指数是评价对象的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的比率；并且对象指数临界值是对照对象生物样品中从包括Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的数据计算的对照比率临界值。在其它实施方式中，第二指示物是Aβ42单体；对象指数是评价对象的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的比率；并且对象指数临界值是对照对象生物样品中从包括Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的数据计算的对照比率临界值。
[0020] 在第二指示物是Aβ42单体或Aβ40单体的方法的某些实施方式中，存在额外步骤，如果比率高于对象比率临界值，确定所评价对象有阿尔茨海默病的可能性增加。
[0021] 在涉及检测第二指示物的方法的某些实施方式中，阿尔茨海默病处于早期。
[0022] 另一方面包括评估所评价对象没有阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：获得取自对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；并且如果对象没有显示临床认知损伤并且如果所述比率等于或低于对照比率临界值，则确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的数据的计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0023] 一个相关方面包括评估所评价对象没有阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：检测取自对象生物样品的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平；和将Aβ40聚集水平和Aβ42单体水平或Aβ40聚集水平与Aβ42单体水平的比率传达给另外的实体；其中如果对象没有显示临床认知损伤并且如果所述比率等于或低于对照比率临界值，则另外实体确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的数据计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0024] 另一方面包括监控有阿尔茨海默病但没有接受任何阿尔茨海默病治疗的对象中疾病发展的方法，包括如下步骤：在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间获得取自对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平；并且如果（a）所述比率低于对象可用Aβ40聚集体水平与和Aβ42单体水平的早期比率；或（b）如果对象早期比率不可用，所述比率低于早期比率标准，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或者如果（a）所述比率与对象可用早期比率相同；或（b）如果对象早期比率不可用，所述比率与早期标准比率相同，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；其中早期比率是来自早期阿尔茨海默病对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中早期水平标准是取自患已知早期阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0025] 一个相关方面包括帮助监控有阿尔茨海默病但没有接受任何阿尔茨海默病治疗的对象中疾病发展的方法，包括如下步骤：在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间检测取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平；和将Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率传达给另外的实体；其中如果（a）Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率低于对象可用的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的早期比率；或（b）如果对象早期比率不可用，所述比率低于早期标准比率，则另外实体确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加；或者如果（a）所述比率与对象可用早期比率相同；或（b）如果对象早期比率不可用，所述比率与早期标准相同，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低；其中早期比率是来自早期阿尔茨海默病对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中早期比率标准是来自患已知早期阿尔茨海默病的一个或多个标准对象的一个或多个生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0026] 另一方面还包括对有阿尔茨海默病对象在治疗阿尔茨海默病之前指明疾病阶段的方法，包括如下步骤：获得取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；并且如果可用阶段特异标准，如果所述比率与比率标准接近，则确定对象有同一疾病阶段的可能性增加；其中比率标准是从患已知同一阶段阿尔茨海默病的一个或多个标准对象得到的一个或多个生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0027] 一个相关方面包括对有阿尔茨海默病对象在治疗阿尔茨海默病之前帮助指明疾病阶段的方法，包括如下步骤：测量取自对象的生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；和将Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率传达给另外的实体；其中如果可用阶段特异标准比率，如果所述比率与比率标准接近，另外实体确定对象有同一疾病阶段的可能性增加；其中标准比率是从患已知同一阶段阿尔茨海默病的一个或多个标准对象得到的一个或多个生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；其中对象和标准对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0028] 在涉及使用Aβ40聚集体比率作为疾病进展或阶段的生物标记的方法的某些实施方式中，早期比率标准或阶段特异比率标准是从患已知同一阶段阿尔茨海默病的多个标准对象得到的生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率均值。在某些实施方式中，有至少一个早期比率标准和一个晚期比率标准用于比较比率。
[0029] 另一方面，本文所述方法包括评价MCI向阿尔茨海默病发展的可能性增加的方法，包括获得对象生物样品Aβ40聚集体检测值的步骤，其中生物样品不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。在本方面的某些实施方式中，所述方法还包括将Aβ40聚集体检测值报道到包括可见显示或打印机在内的报告机构的步骤。在其他实施方式中，Aβ40聚集体检测包括生物样品中Aβ40聚集体的水平。在另一些实施方式中，所述方法还包括如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加，其中对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型。在上述方法的某些实施方式中，阿尔茨海默病处于早期。
[0030] 另一方面包括上述评价MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法，并还包括获得所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的第二指示物测量的步骤。在某些实施方式中，有根据数据计算对象指数的额外步骤，包括Aβ40聚集体的测量和第二个指示物的测量。在方法的一些实施方式中，计算对象指数后，所述方法还包括将对象指数与对照指数临界值作比较的步骤，其中，对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平测量和对照对象中第二指示物测量在内的数据获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型。
[0031] 在某些实施方式中，第二指示物在生物样品中测量。在优选实施方式中，第二指示物是Aβ42单体。在某些实施方式中，第二指示物是Aβ42单体；对象指数是评价对象的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的比率；并且对照指数临界值是从包括对照对象生物样品的Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的的数据计算的对照比率临界值。在第二指示物是Aβ42单体方法的某些实施方式中，存在额外步骤，如果所述比率高于对照比率临界值，确定评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加。在涉及检测第二指示物的方法的某些实施方式中，阿尔茨海默病处于早期。
[0032] 另一方面包括评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：获得对象生物样品的Aβ40聚集体水平，如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加，其中，对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0033] 一个相关方面包括帮助评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：检测对象生物样品的Aβ40聚集体水平；和将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；其中如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，另外实体确定对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品的Aβ40聚集体水平的数据计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品包括CSF，所有生物样品都不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0034] 另一方面包括评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：获得对象生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；并且如果所述比率高于对照比率临界值，确定对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平的数据计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品是同一样品类型，且所有生物样品都不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0035] 一个相关方面包括帮助评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法，包括如下步骤：检测对象生物样品中Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率；和将Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率传达给另外的实体；其中如果所述比率高于对照比率临界值，另外实体确定对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加；其中，对照比率临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和Aβ42单体水平在内的数据计算获得；其中评价对象和对照对象是同一物种；并且其中所有生物样品包括CSF，所有生物样品都不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0036] 上述方法能用多种不同对象实施。在上述任何方法的某些实施方式中，所评价对象或患阿尔茨海默病的对象是人。在上述方法的其他实施方式中，所评价对象或患阿尔茨海默病的对象是非人类动物。在某些实施方式中，所评价对象或患阿尔茨海默病的对象是活体，或对照对象或标准对象是活体。
[0037] 上述方法能在多种不同生物样品上实施。在某些实施方式中，来自所评价对象或患阿尔茨海默病的对象的生物样品包括体液或体组织。在特定实施方式中，生物样品可包括全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、神经系统组织、非神经系统组织，肌肉组织、活检、尸检、脂肪活检、脂肪组织、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液（BAL）或滑液。在优选实施方式中，所述生物样品可包括血浆、血清、CSF或尿液。
[0038] 在样品包括体液或组织的方法的实施方式中，Aβ40聚集体优选循环。在某些实施方式中，生物样品使用与对照对象或标准对象生物样品相同的方法以相同方式收集。
[0039] 在上述任何方法的某些实施方式中，生物样品包括体液；并且Aβ40聚集体测量或Aβ40聚集体水平通过包括如下步骤的方法获得：将体液接触聚集物特异性结合试剂，所述接触条件允许所述试剂和Aβ40聚集体（如果有）结合形成复合物；并且通过与所述试剂的结合来检测对象生物样品中的Aβ40聚集体（如果有）；其中，所述试剂连接到固体支持物且连接到固体支持物时优选结合聚集物而不是单体。
[0040] 在其他实施方式中，生物样品包括体组织；并且Aβ40聚集体测量或Aβ40聚集体水平通过包括如下步骤的方法获得：提供体组织匀浆；将匀浆接触聚集特异结合试剂，所述接触条件允许所述试剂和Aβ40聚集体（如果有）结合形成复合物；并且通过与所述试剂的结合来检测对象生物样品中的Aβ40聚集体（如果有）；其中，所述试剂连接到固体支持物且连接到固体支持物时优选结合聚集体而不是单体。
[0041] 在某些实施方式中，检测步骤包括如下分步骤：从未结合Aβ40单体（如果有）中分离由所述试剂和Aβ40聚集体形成的复合物；可选地，从复合物中分离Aβ40聚集体；并且检测Aβ40聚集体。在其他实施方式中，检测步骤包括如下分步骤：从未结合Aβ40单体（如果有）中分离由所述试剂和Aβ40聚集体形成的复合物，并且除去未结合Aβ40单体；使所述复合物中存在的Aβ40聚集体变性形成Aβ40单体；并且检测Aβ40单体。从未结合单体分离所述复合物后可通过检测试剂来测得Aβ40聚集体。检测试剂进行可检测标记。
[0042] 在其他实施方式中，Aβ40聚集体测量或Aβ40聚集体水平通过使用种子多聚化的方法获得。在使用聚集体特异结合试剂的方法的实施方式中，所述试剂可以是肽，类肽或树突；固体支持物可以是硝化纤维素，聚苯乙烯乳胶，聚氟乙烯，重氮化纸，尼龙膜，活性珠，磁响应珠，氧化钦，二氧化硅，多糖珠，多糖膜，琼脂糖。玻璃，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙二醇-聚苯乙烯杂交体，可控孔度玻璃，载玻片，金珠，或纤维素；并且所述试剂进行可检测标记。
[0044] 图1显示用于检测Aβ聚集体的错折叠蛋白分析（MPA）步骤。
[0045] 图2显示用来自商业来源分析生物科学公司（Analytic Biological Sciences，ABS）的8例AD和8例对照CSF样品得到的Aβ40聚集体结果。图A：对照和AD组间Aβ40聚集体结果在统计学上有显著差异；图B：基于临床认知简易精神状态检查量表（MMSE）测试值，AD组根据疾病阶段区分。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。所有图中的Y轴是MPA中检测的相对光单位。
[0046] 图3显示用来自商业来源（ABS）的35例AD和23例对照CSF样品得到的Aβ40聚集体结果。图A：对照和AD组间Aβ40聚集体结果在统计上有显著差异；图B：厂商把AD样品分成不同疾病状态。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。所有图中的Y轴是MPA中检测的相对光单位。
[0047] 图4显示用来自大学研究医院的26例AD和10例相符对照CSF样品得到的Aβ40聚集体结果。图A：对照和AD组间Aβ40聚集体结果在统计学上有显著差异。Y轴是MPA中检测的相对光单位。图B：基于临床认知简易精神状态检查量表（MMSE）测试值，AD组根据疾病阶段区分。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。
[0048] 图5显示用与图4所示相同的26例AD和10例相符对照CSF样品获得的Aβ42单体和Aβ42聚集体/Aβ42单体比率的结果。图A：在预捕获CSF中检测到AD样品内Aβ42单体信号的统计学显著下降。Y轴是预捕获CSF中由免疫分析测量的Aβ42单体的pg/ml。
图B：观察到AD样品中Aβ40聚集体/Aβ42单体比率的统计学显著增加。图C：基于临床认知简易精神状态检查量表（MMSE）测试值，AD组根据疾病阶段区分。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。图B和C的Y轴是MPA中检测的Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测量Aβ42单体的pg/ml的相对光单位比率。
图B：观察到AD样品中Aβ40聚集体/Aβ42单体比率的统计学显著增加。图C：基于临床认知简易精神状态检查量表（MMSE）测试值，AD组根据疾病阶段区分。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。图B和C的Y轴是MPA中检测的Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测量Aβ42单体的pg/ml的相对光单位比率。
[0049] 图6显示来自图4所示相同临床样品组的AD与对照数据的ROC曲线（26例AD和10例相符对照CSF样品）。
[0050] 图7显示来自图4所示相同临床样品组的早期AD与对照数据的ROC曲线（13例早期AD和10例相符对照CSF样品）。
[0051] 图8显示用图4所示相同的26例AD和10例相符对照CSF样品获得的Aβ40单体和Aβ40聚集体/Aβ40单体比率的结果。图A：在预捕获CSF所测AD样品中观察到Aβ40单体信号在统计学没有显著下降。图A中的Y轴是预捕获CSF中免疫分析测量的Aβ40单体的pg/ml。图B：观察到AD样品中Aβ40聚集体水平/Aβ42单体水平比率在统计学显著增加。Y轴是MPA中检测的Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测Aβ40单体的pg/ml
的相对光单位比率。
的相对光单位比率。
[0052] 图9显示用来自同一大学研究医院的更大临床样品组（47例AD、71例MCI和21例对照）获得的Aβ40聚集体结果。图A：根据CSF收集时间的临床诊断，样品初始分成三个不同群体。三个组中用ANOVA没有统计学差异，但对照和AD组间Aβ40聚集体结果有统计学显著差异。图B：根据CSF样品收集后的后续临床诊断，进一步细分MCI样品。对照和AD组间Aβ40聚集体结果在统计学上有显著差异。图C：去除MCI到AD组中单个高异常值后，再细分MCI样品。ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。所有图中的Y轴是MPA中检测的相对光单位。
[0053] 图10显示用与图9所示相同的47例AD、71例MCI和21例相符对照CSF样品获得的Aβ42单体和Aβ42聚集体/Aβ42单体比率的结果。图A：在MCI和AD样品中预捕
获CSF检测的Aβ42单体信号没有统计学显著下降。图B：对照和MCI及AD组间Aβ40聚集体/Aβ42单体比率结果在统计学上有显著差异。图C：对照和稍后发展成AD的MCI及AD组之间的Aβ42单体结果在统计学上有显著差异。图D：对照和稍后发展成AD的MCI和AD组之间的Aβ40聚集体/Aβ42单体结果在统计学上有显著差异。所有图中，ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。图A和C中的Y轴是预捕获CSF中免疫分析测量的Aβ42单体的pg/ml。图B和D的Y轴是MPA中检测的
Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测Aβ42单体的pg/ml的相对光单位比率。
获CSF检测的Aβ42单体信号没有统计学显著下降。图B：对照和MCI及AD组间Aβ40聚集体/Aβ42单体比率结果在统计学上有显著差异。图C：对照和稍后发展成AD的MCI及AD组之间的Aβ42单体结果在统计学上有显著差异。图D：对照和稍后发展成AD的MCI和AD组之间的Aβ40聚集体/Aβ42单体结果在统计学上有显著差异。所有图中，ANOVA显示这些样品不来自一个群体。所示单个t检验展示不同组之间的显著差异。图A和C中的Y轴是预捕获CSF中免疫分析测量的Aβ42单体的pg/ml。图B和D的Y轴是MPA中检测的
Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测Aβ42单体的pg/ml的相对光单位比率。
[0054] 图11显示来自图9所示相同更大临床样品组的对照与AD数据的ROC曲线（47例AD，71例MCI和21例对照）。
[0055] 图12显示来自图9所示相同更大临床样品组的对照与发展成AD的MCI和AD数据的ROC曲线（47例AD，71例MCI和21例对照）。
[0056] 图13显示用获自大学研究医院的另一不同CSF样品组所得的A 40聚集体和A 42单体结果。图A：对照和AD组间的Aβ40聚集体结果在统计学上没有显著差异。Y轴是MPA中检测的相对光单位。图B：对照和AD组间的Aβ42单体结果在统计学上没有显著差异。Y轴是预捕获CSF中免疫分析测量的Aβ42单体的pg/ml。图C：对照和AD组间的Aβ40聚集体/Aβ42单体结果在统计学上没有显著差异。Y轴是MPA中检测的Aβ40信号与预捕获CSF中免疫分析所测Aβ42单体的pg/ml的相对光单位。
[0057] 图14显示在16,000g离心10分钟或134,000g离心1小时的阿尔茨海默病CSF和正常CSF的上清液和沉淀中错折叠蛋白分析所检测的Aβ40聚集体量。图例：小方格：
Aβ40总量；大方格：16,000g上清液；水平线：16,000g沉淀；垂直线：134,000g上清液，斜纹线：134,000g沉淀。
Aβ40总量；大方格：16,000g上清液；水平线：16,000g沉淀；垂直线：134,000g上清液，斜纹线：134,000g沉淀。
[0058] 发明详述
[0059] 本发明部分涉及生物标记物的开发，所述生物标记物可用于评价阿尔茨海默病的可能性，监控阿尔茨海默病的进展，对阿尔茨海默病分期，和阿尔茨海默病的早期诊断，特定评价MCI患者发展成阿尔茨海默病的可能性。具体地，发明包括单独使用Aβ40聚集体或与Aβ40或Aβ42单体联用的方法，以评价阿尔茨海默病可能性，监控阿尔茨海默病的发展，和对阿尔茨海默病分期。
[0060] 除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》），第18版（宾夕法尼亚州伊斯顿：马克出版公司（Mack Publishing Company），1990）；Methods In Enzymology（《酶学方法》）（S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社有限公司（Academic Press，Inc.））；Handbook of Experimental Immunology（《实验免疫学手册》），第I-IV卷，（D.M.Weir和CC.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版社（Blackwell Scientific Publications））；
Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》（第二版，
1989）；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry（《表面和胶体化学手册》）（Birdi，K.S.编，CRC 出版社（CRC Press），1997）；Short Protocols in Molecular Biology（《精编分子生物学实验指南》），第四版，（Ausubel等编，1999，约翰威利父子公司（John Wiley & Sons））；Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course（《分子生物学技术：强化实验室课程》），（Ream等编，1998，学术出版社（Academic Press））；PCR（Introduction to Biotechniques Series（《PCR（生物技术入门丛书）》），第二版，（Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司（Springer Verlag））；Peters和Dalrymple，Fields Virology（《费氏病毒学》）（第二版），Fields等编，B.N.乌鸦出版社（Raven Press），纽约州纽约。
Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》（第二版，
1989）；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry（《表面和胶体化学手册》）（Birdi，K.S.编，CRC 出版社（CRC Press），1997）；Short Protocols in Molecular Biology（《精编分子生物学实验指南》），第四版，（Ausubel等编，1999，约翰威利父子公司（John Wiley & Sons））；Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course（《分子生物学技术：强化实验室课程》），（Ream等编，1998，学术出版社（Academic Press））；PCR（Introduction to Biotechniques Series（《PCR（生物技术入门丛书）》），第二版，（Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司（Springer Verlag））；Peters和Dalrymple，Fields Virology（《费氏病毒学》）（第二版），Fields等编，B.N.乌鸦出版社（Raven Press），纽约州纽约。
[0061] 应理解本发明的试剂和方法不限于具体配制或方法参数，因为这些当然可变。也应理解本文所用术语仅用于描述本发明特定实施方式的目的而不构成限制。
[0062] I 定义
[0064] 本文所用的“生物标记物”包括但不限于，蛋白，核酸和代谢物，以及其多态性，突变，变体，修饰，亚基，片段，蛋白-配体复合物，和降解产物，蛋白-配体复合物，元素，相关代谢物，和其他分析物或与生物状态相关的样品来源检测。生物标记物也能包括突变蛋白或突变核酸。本文所用的术语“分析物”指待检测的任何物质且能包括电解质和元素，例如钙。
[0065] 本文所用的“Aβ40单体”指由蛋白聚集时不暴露的Aβ40表位特异性抗体检测的未变性Aβ40总蛋白。本文所用的“Aβ42单体”指由蛋白聚集时不暴露的Aβ42表位特异性抗体检测的未变性Aβ42总蛋白。
[0066] 本文所用的术语“聚集体”指包括多于一个拷贝的蛋白非天然构象异构体的复合物，其产生自构象异构体之间的非天然相互作用。聚集体包括多拷贝的相同蛋白，多拷贝的一种以上蛋白，和额外成分，所述额外成分包括但不限于糖蛋白，脂蛋白，脂质，聚糖，核酸，和盐。聚集体可存在于诸如包涵体，斑，或聚集体的结构内。聚集体可以与涉及纤维形成的通路有关或无关。一些聚集体示例是无定形聚集体，寡聚体和纤维。无定形聚集体一般无序且不溶。本文所用的“寡聚体”包括多于一个拷贝的蛋白非天然构象异构体。通常，包括6
至少两个单体，但不多于1000个单体，或一些情况中，不多于10 个单体。寡聚体包括小胶束聚集体和原细纤维。小胶束聚集体通常可溶，有序并是球形结构。原细纤维通常也是可溶、有β片层结构的有序聚集体。原细纤维通常是曲线结构，并包括至少10个单体，或一些情况中为至少20个单体。纤维通常是可溶且高度有序的聚集体。纤维通常包括成百上千的单体。例如，纤维包括淀粉体，淀粉体显示交联β片层结构，且用刚果红染色时能由苹果绿双折射鉴定，并在偏振光下可见。当包含于一个样品中时，聚集体例如无定形聚集体、寡聚体和纤维，可以由离心分离。例如，14,000xg离心10分钟通常只除去非常大的聚集物，例如大纤维和无定形聚集物（10-1000MDa），100,000xg离心1小时通常除去大于1MDa的聚集物，例如较小纤维和无定形聚集物。聚集物的大小和可溶性会影响分离所需的沉降速度。
在发明的优选实施方式中，聚集物包括Aβ40。
至少两个单体，但不多于1000个单体，或一些情况中，不多于10 个单体。寡聚体包括小胶束聚集体和原细纤维。小胶束聚集体通常可溶，有序并是球形结构。原细纤维通常也是可溶、有β片层结构的有序聚集体。原细纤维通常是曲线结构，并包括至少10个单体，或一些情况中为至少20个单体。纤维通常是可溶且高度有序的聚集体。纤维通常包括成百上千的单体。例如，纤维包括淀粉体，淀粉体显示交联β片层结构，且用刚果红染色时能由苹果绿双折射鉴定，并在偏振光下可见。当包含于一个样品中时，聚集体例如无定形聚集体、寡聚体和纤维，可以由离心分离。例如，14,000xg离心10分钟通常只除去非常大的聚集物，例如大纤维和无定形聚集物（10-1000MDa），100,000xg离心1小时通常除去大于1MDa的聚集物，例如较小纤维和无定形聚集物。聚集物的大小和可溶性会影响分离所需的沉降速度。
在发明的优选实施方式中，聚集物包括Aβ40。
[0067] 术语“聚集体特异结合试剂”或“ASB试剂”指任何种类的试剂，包括但不限于肽、类肽或树突，当以特定电荷密度结合固体支持物时，相较单体，其优选结合聚集体。这种结合可能是由于增加的亲和性，亲合力或特异性。例如，在某些实施方式中，本文所述聚集体特异结合试剂优选结合聚集体，但尽管如此，也能与单体以微弱但仍可检测的水平结合。通常，弱结合或背景结合易与和感兴趣聚集体优先相互作用区分，例如通过使用合适的对照。通常，本发明方法使用的聚集体特异结合试剂在单体过量时结合聚集体。优选地，ASB试剂结合聚集体的亲和性/亲合力为结合单体的至少约两倍。
[0068] 如果发生特异性结合、非特异性结合或者特异性和非特异性结合的一些组合，则认为聚集体特异性结合试剂与另一种肽或蛋白质发生“结合”。如果相较单体以更大亲和性、亲合力、和/或更高特异性结合聚集体，试剂称为“优选结合”聚集体。术语“优选结合”、“优选与...结合”、“选择性结合”、“与…选择性结合”和“选择性捕获”在本文可互换使用。
[0069] 术语“阿尔茨海默病（AD）蛋白”或“AD蛋白”在本文可互换使用，指聚集体（广泛称为致病性蛋白形式、致病性同种型、致病性阿尔茨海默病蛋白和阿尔茨海默病构象异构体）和非聚集体（广泛称为单体、正常细胞形式、非致病性同种型、非致病性阿尔茨海默病蛋白），以及可能不具有致病性构象或正常细胞构象的阿尔茨海默病蛋白的变性形式和各种重组形式。示例性的阿尔茨海默病蛋白包括Aβ和tau蛋白。
[0070] 本文所用的术语“淀粉样beta，”“淀粉样β”，“Abeta”，“Aβ”，“Aβ42”，“Aβ40”，“Aβx-42”，“Aβx-40”和“Aβ40/42”都指淀粉样β肽，是在淀粉样前体蛋白（APP）剪切后于细胞外发现的长至43个氨基酸的家族。术语Aβ通常用于表示任何形式的淀粉样β肽。术语“Aβ40”指“Aβx-40”。术语“Aβ42”指“Aβx-42”。优选地，x是从1-17。更优选地，x等于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，或17。术语“Aβ1-42”指Aβ的1-42氨基酸的相应片段（APP序列597-638氨基酸（Johnson-Wood等（1997）PNAS 94，1550-1555））。术语“Aβ1-40”指Aβ的1-40氨基酸的相应片段（APP序列597-636氨基酸）。术语Aβ40/42用来指Aβ40和Aβ42同种型。
[0071] 本文所用的“指示物”与跟生物状态相关的任何因子，可以单独或跟其他指示物联合。指示物包括生物标记和与生物状态相关的非生物样品衍生因子，例如健康状态的非分析物生理学标记，或未从生物样品中检测的其他因子或标记，例如本文定义的“临床参数”。指示物还包括数学上创建的任何计算指数或者任何一个或多个前述检测的组合，包括时间趋势和不同。
[0072] 本文所用的“临床参数”包括对象健康状态或其他特性的所有非样品或非分析物生物标记，例如但不限于，年龄，性别，家族医学史，MCI预先诊断，ApoE基因型，教育水平，和生活方式因子例如高血压、高胆固醇和控制不佳的糖尿病。阿尔茨海默病的临床参数也包括从本领域技术人员已知的临床检测所得结果，包括阿尔茨海默病评定量表-认知部分（ADAS-Cog），临床痴呆评定量表（CDR，包括总体和总和（sum-of-boxes）CDR），记忆盒分数，和简易智力状态检测量表（MMSE）。
[0073] “TN”是真阴性，就疾病评价试验而言指正确分类非疾病或正常对照。
[0074] “TP”是真阳性，就疾病评价试验而言指正确分类疾病对象。
[0075] “FN”是假阴性，就疾病评价试验而言指把疾病对象错误分类为非疾病或正常。
[0076] “FP”是假阳性，就疾病评价试验而言指把非疾病或正常对照错误分类为有疾病。
[0077] “精确性”指检测或计算量（检测报道值）与其真实（或真正）值的一致程度。临床精确性涉及真实结果的比例（真阳性（TP）或真阴性（TN）相比错误分类结果（假阳性（FP）或假阴性（FN）），并且可以描述为灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）或阴性预测值（NPV），或作为可能性、比值比等其他检测。本文所用的“试验准确性”用（TP+TN）/（TP+TN+FP+FN）计算。
[0078] “灵敏度”用TP/（TP+FN）或疾病对象的真阳性部分计算。
[0079] “特异性”用TN/（TN+FP）或非疾病或正常对照的真阴性部分计算。
[0080] “阴性预测值”或“NPV”用TN/（TN+FN）或所有阴性试验结果的真阴性部分计算。这也受到疾病流行和要检测群体的验前概率的内在影响。参见例如O'Marcaigh A S，Jacobson R M，“Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test，How To Prevent Misleading Or Confusing Results（估计诊断检测的预测值，如何预防误导或混乱结果），”Clin.Ped.1993，32（8）：485-491，其讨论试验例如临床诊断试验的特异性，灵敏度，阳性和阴性预测值。通常，对使用连续诊断试验检测的二元疾病状态分类方法，灵敏度和特异性根据Pepe等，Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance of a Diagnostic，Prognostic，or Screening Marker（测量诊断，预后或筛选标记性能的比值比的局限），”Am.J.Epidemiol 2004，159（9）：882-890，由接受者工作特征曲线（ROC）总结，并且由曲线下面积（AUC）或c-统计总结，这是能表示在只有一个值的完整检测（或分析）分割点上试验、分析或方法的灵敏度和特异性的指示物。也参见，例如Shultz，“Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures（实验室方法的临床解释），”收录于Teitz，Fundamentals of Clinical Chemistry（《临床化学基础》）第14章，Burtis和Ashwood编，第4版，1996，桑德斯出版公司（W.B.Saunders Company），192-199页；和Zweig等，“ROC Curve Analysis:An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid AndApolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease（ROC曲线分析：在鉴定冠脉动脉疾病对象中显示血清脂质和阿朴脂蛋白浓度关系的示例），”Clin.Chem.，1992，38（8）：1425-1428。使用似然函数，比值比，信息理论，预测值，校准（包括适合度），和重新分类检测的替代方法根据Cook，“Use and Misuse of the Receiver Operating Characteristic Curve in Risk Prediction（风险预测中接受者工作特征曲线的使用和误用），”Circulation 2007，115：928-935进行总结。由试验定义的对象组的危险比和绝对及相对风险率是临床精确性和效用的进一步量度。最后，经常使用多个方法来定义异常或疾病值，包括参考限值，区别限值，和风险阈值，按照Vasan，“Biomarkers of Cardiovascular Disease Molecular Basis and Practical Considerations（心血管疾病分子基础和实践考虑的生物标记），”Circulation2006，113：2335-2362。
[0081] “阳性预测值”或“PPV”用TP/（TP+FP）或所有阳性试验结果的真阳性部分计算。这受到疾病流行和要检测群体的验前概率的内在影响。
[0082] 术语“公式”，“算法”和“模型”可互换用于任何数学方程式，算法，分析或程序过程，或使用一个或多个连续或分类输入和计算输出值，有时称为“指数”或“指数值”的统计技术。“公式”的非限制示例包括和，比率，和回归操作，例如系数或指数，生物标记值转化和标准化（包括但不限于，那些基于临床参数如性别、年龄或种族的标准化方法），规则和指导方针，统计分类模型，和在历史种群上训练的神经网络。生物标记的具体使用是线性和非线性方程和统计分类分析，以确定对象样品和有阿尔茨海默病可能性的对象的生物标记水平之间的关系。对于诊断面板和组合构建，特别感兴趣的是结构和共同统计分类算法，和风险指数构建方法，使用模式认知特性，包括已建立的技术，例如交叉相关，主成分分析（PCA），因素轴转，逻辑回归（LogReg），线性判别分析（LDA），Eigengene线性判别分析（ELDA），支持向量机（SVM），随机森林法（RF），递归分割树（RPART），以及其他相关的决策树分类技术，Shruken质心（SC），StepAIC，K-邻近法（kth-nearest），Boosting，决策树，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机，和隐马尔可夫模型，线性回归或分类算法，非线性回归或分类算法，变异分析（ANOVA），层次分析或聚类算法；使用决策树的递阶算法；基于机器算法如核偏最小二乘算法的核，核匹配追踪算法，内核费雪判别分析算法，或核主成分分析算法，等等。这些可与信息规则结合，例如赤池信息标准（AIC）或贝叶斯信息准则（BIC），以确定附加生物标记和模型改良之间的平衡，和有助于使过拟合最小化。所得预测模型可以在其他研究中验证，或在最初训练的研究中交叉验证，使用如弃一法（LOO）和10倍交叉验证（10倍CV）技术。
[0083] 本文所用的“与…相同”指两个测量之间没有统计学显著差异。
[0084] “统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期（可以是“假阳性”）。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限至在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。在p值是0.05或更小时，通常认为结果显著性高。
[0085] 本发明内容中的“对象”优选哺乳动物。哺乳动物可以是人，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马，或牛，但不限于这些例子。人除外的哺乳动物能有利用作代表阿尔茨海默病动物模型的对象。对象可以是雄性或雌性。对象可以是预先诊断或鉴定有阿尔茨海默病的对象。优选，对象还没有经历过，或没有正在经历阿尔茨海默病的治疗干预。或者，对象也可以是预先未诊断有阿尔茨海默病的对象。例如，对象可以是显示有一个或多个阿尔茨海默病风险因子的对象，或没有显示阿尔茨海默病风险因子的对象，或无阿尔茨海默病症状的对象。对象也能是正在患有阿尔茨海默病或有发展阿尔茨海默病风险的对象。
[0086] “类肽”通常用来表示含有至少1个、优选2个或多个氨基酸取代物的肽模拟物，所述氨基酸取代物优选N-取代的甘氨酸。拟肽可参见例如，美国专利号5,811,387。本文所用的“类肽试剂”是具有氨基末端区域、羧基末端区域以及所述氨基末端区域和羧基末端区域之间至少一个“类肽区域”的分子。氨基末端区域指试剂的氨基末端侧上通常不包含任何N取代甘氨酸的区域。氨基末端区域可以是H、烷基、取代的烷基、酰基、氨基保护基、氨基酸、肽等。羧基末端区域指不包含任何N取代甘氨酸的类肽羧基末端上的区域。羧基末端区域可包括H、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基保护基、氨基酸、肽等。
[0087] 本文所用的“树突”是与肽结构相似性很少的分支聚合体。
[0088] 本文所用的“种子多聚化”指可溶Aβ单体累进沉积和转化成聚集物。单体的种子多聚化特征是慢成核和快生长动力学。
[0089] 本文所用的“水平”指相对水平。
[0090] 本文所用的“体液”包括循环和非循环液体。循环液体的示例包括血液，CSF，和淋巴液。非循环液体的示例包括滑液。
[0091] 本文所用的“MCI”指轻度认知损害。MCI是临床认知损害诊断，由Petersen提倡（Peteresemn RC（2004）Mild cognitive impairment as a diagnostic entity（轻度认知损害作为诊断实体）J Intern Med 256,183-194），并包括记忆力衰退抱怨，由医师确定的客观记忆损害，MMSE值>24的总体认知功能的保存，日常生活能力的最小损伤，和不符合痴呆DSM-IIIR标准。临床诊断为MCI的早期AD患者和过后发展为AD的MCI患者亚群可能是患者的相似组，但有时由不同临床医生不同分类。
[0092] II 发明方法
[0093] 评价有阿尔茨海默病可能性增加的方法
[0094] 本文所述发明提供评估所评价对象中阿尔茨海默病可能性增加的方法。这些方法基于以下发现：不包括对象中脑组织、脑组织部分、或脑匀浆的样品Aβ40聚集体水平与对象有阿尔茨海默病的可能性相关联。评价阿尔茨海默病的可能性增加包括确定对象有疾病或预测对象是否发生疾病的可能性或几率。评价阿尔茨海默病的可能性增加还包括，例如，诊断疾病或提供疾病预后。
[0095] 本文所述发明提供评估所评价对象中阿尔茨海默病可能性增加的方法，这是通过获得对象生物样品中的Aβ40聚集体检测值，其中生物样品不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。
[0096] 评估所评价对象中阿尔茨海默病可能性增加的方法可以包括向含有可见显示或打印机的报告机构报道Aβ40聚集体测量的步骤。报道Aβ40聚集体测量可以手工或自动完成。例如，Aβ40聚集体测量可以手工输入到报告机构中，或Aβ40聚集体测量可以通过能向报道工具后续自动报道检测值的方法获得。合适报告机构包括，例如，传统计算机处理器，直接连接检测工具的计算机处理器，或远程连接检测工具如通过无线网络的计算机处理器。
[0097] 在某些实施方式中，Aβ40聚集体检测包括生物样品中Aβ40聚集体的水平。评估所评价对象阿尔茨海默病可能性增加的方法可包括，如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，确定对象有阿尔茨海默病可能性增加的步骤。临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，并且所有生物样品是同一样品类型
[0098] 发明方法使用的对照对象认知正常。确定对象认知正常可以根据本领域技术人员已知方法完成。本文所用的对照对象在本领域技术人员已知的常用认知功能临床检测中没有显示损伤信号。这些临床试验的一些示例是MMSE，CDR，记忆盒评分，和ADAS-Cog。通常，对照对象也可以根据其他因子选择，例如年龄和性别。例如，如果可能，选择符合所评价对象年龄和性别的对照对象。
[0099] 临界值计算
[0101] 一些情况中，临界值可用于诊断检测。这些情况中，临界值可以从纳入优选诊断性能参数例如准确性、灵敏度、特异性、阳性预期值和阴性预期值的模型计算获得。疾病诊断中，改变试验或分析的临界值通常改变定性反比关系中的灵敏度和特异性。因此，在评价对象情况的建议医学试验、分析或方法的准确性和有用性评价中，应该总是考虑灵敏度和特异性两者，并且因为灵敏度和特异性可以在临界值范围内显著变化，注意临界值在哪一个灵敏度和特异性报道。用于测定对照水平临界值优选灵敏度值是至少65%，理想至少70%，更理想至少75%，优选至少80%，更优选至少85%，并更优选至少90%。用于测定对照水平临界值的优选特异性值是至少65%，理想至少70%，更理想至少75%，优选至少80%，更优选至少85%，并更优选至少90%。
[0102] 使用统计学，例如AUC（试验ROC曲线下的面积）包括所有潜在临界值，优选使用发明的最明确分类风险检测，而对持续风险检测，优选观察结果或其他黄金标准的拟合优度统计和校准。
[0103] 评价阿尔茨海默病可能性的诊断准确性的可接受程度是，AUC至少0.60，理想至少0.65，更理想至少0.70，优选至少0.75，更优选至少0.80，并更优选至少0.85。
[0104] 评价阿尔茨海默病可能性的诊断准确性的极高程度是，AUC（试验ROC曲线下的面积）至少0.80，理想至少0.85，更理想至少0.875，优选至少0.90，更优选至少0.925，更优选至少0.95，更优选至少0.98，并更优选至少0.99。
[0105] 任何评价或检验的预测值取决于该检验的灵敏度和特异性，和检测人群的病症流行情况。基于贝叶斯定理的这个概念规定对象或人群（验前概率）中出现的筛选病症的可能性越大，正检验有效性越大并且结果是真阳性的可能性越大。因此，在任何人群中使用任何检验出现低病症可能性的问题是阳性结果的值更有限（即阳性检验更像假阳性）。相似地，高度风险的人群中，阴性检验结果更像假阴性。结果，ROC和AUC能误导成低疾病流行性测试人群（定义为每年小于1%发生率（发病率）或特定时间范围内小于10%累积流行性）中检验的临床效用。
[0106] 在优选实施方式中，发明涉及以MMSE值大于19为特征的评价早期阿尔茨海默病可能性增加的方法。
[0107] 第二指示物的测量
[0108] 本文提供的评估所评价对象阿尔茨海默病可能性增加的方法还可包括获得评价对象中阿尔茨海默病第二指示物测量的步骤。例如，第二指示物可包括阿尔茨海默病的其他生物标记，例如Aβ40或Aβ42单体，Aβ42聚集体，tau单体和聚集体，淀粉样斑块，和阿尔茨海默病连锁的基因突变，以及非样品来源指示物，例如年龄，性别，ApoE基因型，MMSE评分，CDR评分，记忆盒评分，生活方式因子，包括高血压、高胆固醇和控制不佳的糖尿病，和教育水平。
[0109] 在获得阿尔茨海默病第二指示物测量后，本文提供的方法可以包括根据含Aβ40聚集体测量和第二指示物测量的数据计算对象指数的步骤。对象指数提供说明包括Aβ40聚集体测量和第二指示物测量的数据对阿尔茨海默病可能性增加的相对贡献的单一数字。计算对象指数的方法会根据阿尔茨海默病每个测量关联强度和两个测量之间的任何联系而不同。
[0110] 本领域技术人员已知的对作用于生物状态或疾病的权重因子有用的任何公式或模型可用于计算对象指数。例如，计算对象指数的简单模型可以包括计算Aβ40聚集体测量和第二指示物测量之间的比率。其他优选公式包括广义的统计分类算法，并特定使用判别分析。判别分析目标是从原先确定特性组中预测归属关系。在线性判别分析（LDA）情况中，特征线性结合是通过一些准则对组之间进行最大区分而鉴定的。能用根据不同临界值的eigengene法（ELDA）或根据多元方差分析（MANOVA）的分步算法就LDA确定特征。正向，后向，和逐步算法能根据Hotelling-Lawley统计使不分离概率最小化来完成。
[0111] 基于Eigengene的线性判别分析（ELDA）是Shen等（2006）发明的特征挑选技术。所述公式在多变量结构中使用改良特征分析（eigen analysis）挑选特征以确定与最重要特征向量相关的特征。“重要”定义为那些在尝试相对一些临界值分类的样品中解释最大差异变化的特征向量。
[0112] 支持向量机（SVM）是尝试找到区分两类的超平面的分类公式。超平面包括支持向量，离超平面精确边际距离的数据点。可能在目前数据维度中不存在分离超平面，由初始变量的非线性函数通过投射数据到更大维度而大幅扩展维度（Venables和Ripley，2002）。尽管不必须，SVM特征过滤一般改善预测。能使用非参数Kruskal-Wallis（KW）检验选择最佳单变量特征来就支持向量机鉴定特征（例如指示物）。随机森林法（RF，Breiman，2001）或递归分区（RPART，Breiman等，1984）也能单独或联用来确定最重要的指示物组合。KW和RF两者需要从总体中选择一些特征。RPART使用可用指示物亚组来创建单独分类树。
[0113] 本文所述评估要评价对象阿尔茨海默病可能性增加的其他方法步骤还能包括对比对象指数和对照指数临界值，其中对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象生物样品Aβ40聚集体测量和对照对象中第二指示物测量的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，并且所有生物样品是同一样品类型。
[0114] 通常，对照指数临界值根据每个对照对象的Aβ40聚集体测量和第二指示物测量首先通过计算每个认知正常对照对象的指数来计算。对照对象指数可以通过与上述对象指数同样的方法计算得到。一旦就每个认知正常对照对象计算指数，对照指数临界值从根据对照对象指数的模型计算得到。例如，对照指数临界值可以通过对照对象平均指数简单计算得到。
[0115] 一些情况中，对照指数临界值可用于诊断检测。这些情况中，对照指数临界值可以从纳入优选诊断性能参数例如准确、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值的模型计算获得。如上所述，改变试验或分析的临界值通常仅仅改变定性反比关系中的灵敏度和特异性。因此，在评价对象情况的建议医学试验、分析或方法的准确性和有用性评价中，应该总是考虑灵敏度和特异性两者，并且因为灵敏度和特异性可在临界值范围内显著变化，注意临界值在哪一个灵敏度和特异性报道。用于测定对照指数临界值的优选灵敏度值是至少65%，理想至少70%，更理想至少75%，优选至少80%，更优选至少85%，并更优选至少90%。用于测定对照指数临界值的优选特异性值是至少65%，理想至少70%，更理想至少75%，优选至少80%，更优选至少85%，并更优选至少90%。
[0116] 在一些实施方式中，第二指示物在得到Aβ聚集体测量的相同生物样品中测量。在优选实施方式中，第二指示物是Aβ40单体或Aβ42单体。在第二指示物是Aβ40单体或Aβ42单体的特定优选实施方式中，对象指数是所评价对象的Aβ40聚集体水平与Aβ40单体或Aβ42单体的比率，并且对照指数临界值是对照比率临界值，从包括对照对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ40单体或Aβ42单体水平的数据计算得到。在这种实施方式中，对照指数临界值可以通过首先计算多个对照对象中Aβ40聚集体水平与Aβ40单体或Aβ42单体水平的比率得到，并且随后从根据多种比率的模型中计算对照比率临界值。对照比率临界值可以用纳入优选诊断性能参数的模型计算得到。优选实施方式还可以包括以下步骤：如果对象比率高于对照比率临界值，确定所评价对象有阿尔茨海默病可能性增加。
在本文所述方法包括获得第二指示物测量的实施方式中，发明涉及以MMSE值大于19为特征的评价早期阿尔茨海默病可能性增加的方法。
在本文所述方法包括获得第二指示物测量的实施方式中，发明涉及以MMSE值大于19为特征的评价早期阿尔茨海默病可能性增加的方法。
[0117] 评价没有阿尔茨海默病可能性的方法。
[0118] 根据另一方面，发明提供评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法。所述方法包括如下步骤，获得对象生物样品Aβ40聚集体水平，以及如果对象没有显示临床认知损害和如果Aβ40聚集体水平等于或低于对照水平临界值，则确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加。临床认知损害通常通过本领域技术人员已知的任何临床试验评价，包括阿尔茨海默病评定量表–认知部分（ADAS-Cog），临床痴呆评定量表（CDR），记忆盒评分，和简易智力状态量表（MMSE）。临床认知损害可由为本领域技术人员已知的这些临床试验结果表明。对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，所有生物样品是同一类型样品且不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0119] 还根据另一方面，发明提供帮助评估所评价对象没有阿尔茨海默病可能性增加的方法。所述方法包括如下步骤：检测对象生物样品中Aβ40聚集体水平，并将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体，其中如果对象没有显示临床认知损伤并且如果Aβ40聚集体水平等于或低于对照水平临界值，则另外实体确定对象没有阿尔茨海默病的可能性增加；对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，所有生物样品是同一类型样品且不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0120] 根据其他方面，评价没有阿尔茨海默病的可能性增加或帮助评价没有阿尔茨海默病的可能性增加的方法可以包括获得或检测取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率的步骤。
[0121] 监控疾病进展的方法
[0122] 本文所述发明提供在阿尔茨海默病对象中监控疾病进展的方法。这些方法是基于实施例中描述的进一步发现，即随着疾病进展，阿尔茨海默病对象的Aβ40聚集体水平和Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率下降。根据本文所述监控疾病进展的方法，阿尔茨海默病对象没有经历任何目前已知治疗或将来显示用于治疗阿尔茨海默病的任何疗法。根据发明的这个和其他方面，目前阿尔茨海默病治疗包括，例如胆碱酯酶抑制剂例如多奈哌齐（爱忆欣（Aricept）），卡巴拉汀（艾斯能（Exelon））和加兰他敏（Razadyne），NMDA谷氨酸受体阻滞剂如美金刚（盐酸美金刚（Namenda）），和草药治疗如石杉碱甲（HuperzineA）。目前在开发中的治疗包括免疫治疗和Aβ疫苗。
[0123] 发明提供监控没有经历阿尔茨海默病任何治疗的患阿尔茨海默病对象疾病进展的方法，包括在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间获得取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平的第一个步骤。然后，所述方法包括步骤：如果（a）Aβ40聚集体水平低于对象Aβ40聚集体早期水平（如果可用），或如果（b）若对象Aβ40聚集体早期水平不可用，Aβ40聚集体水平低于早期标准，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加。或者，所述方法包括步骤：如果（a）Aβ40聚集体水平等于对象的Aβ40聚集早期水平（如果可用），或如果（b）若对象Aβ40聚集早期水平不可用，Aβ40聚集体水平等于早期标准，则确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低。早期水平可以是取自早期阿尔茨海默病对象的生物样品Aβ40聚集体水平，或取自一个或多个已知早期阿尔茨海默病标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平。对象和标准对象是同一物种，所有生物样品是同一类型样品且不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0124] 另一方面，发明提供在没有经历任何阿尔茨海默病治疗的阿尔茨海默病对象中帮助监控疾病进展的方法。所述方法包括如下步骤，在对象诊断有阿尔茨海默病后某一时间测量对象的生物样品Aβ40聚集体水平，并将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体。如果（a）Aβ40聚集体水平低于对象的Aβ40聚集体早期水平（如果可用），或如果（b）若对象Aβ40聚集体早期水平不可用，Aβ40聚集体水平低于早期标准，则另外实体随后确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加。或者，如果（a）Aβ40聚集体水平等于对象的Aβ40聚集体早期水平（如果可用），或如果（b）若对象Aβ40聚集体早期水平不可用，Aβ40聚集体水平等于早期标准，则另外实体随后确定对象发展成晚期阿尔茨海默病的可能性降低。早期水平能是取自早期阿尔茨海默病对象的生物样品Aβ40聚集体水平，或取自一个或多个已知早期阿尔茨海默病标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平。对象和标准对象是同一物种，所有生物样品是同一类型样品且不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0125] 根据其他方面，监控阿尔茨海默病对象疾病进展或帮助监控阿尔茨海默病对象疾病进展的方法可以包括在对象诊断有阿尔茨海默病后某一个时间获得或测量取自对象的生物样品Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。
[0126] 与上面部分描述的测定临界值的方法相似，早期标准可以从本领域技术人员已知任何模型计算得到，以处理取自多个患早期阿尔茨海默病的标准对象生物样品中的Aβ40聚集体水平来产生该水平的平均值或其他有意义数值摘要。在某些实施方式中，早期标准是取自多个患早期阿尔茨海默病标准对象的生物样品中的Aβ40聚集体平均水平。
[0127] 本文所用的早期阿尔茨海默病表征是MMSE值大于19。
[0128] 阿尔茨海默病分期的方法
[0129] 本文所述发明也提供在治疗阿尔茨海默病之前对阿尔茨海默病对象疾病分期的方法。所述方法包括如下步骤，从取自对象的生物样品中获得Aβ40聚集体水平，并且如果Aβ40聚集体水平与标准接近，则确定对象有与阶段特异标准（如果可用）相同疾病阶段的可能性增加。通常，如果Aβ40聚集体水平在标准95%置信区间内，Aβ40聚集体水平被认为“接近”标准。95%置信区间定义为对正常人群的平均值±2（标准偏差）。标准是取自一个或多个已知患同一阶段阿尔茨海默病的标准对象的一个或多个生物样品中的Aβ40聚集体水平。对象和标准对象是同一物种，所有生物样品是同一样品类型并且不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0130] 另一发明，发明提供在任何阿尔茨海默病治疗之前帮助阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法。所述方法包括测量取自对象的生物样品中Aβ40聚集体水平和将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体的步骤。然后，如果Aβ40聚集体水平接近标准，另外实体确定对象具有与标准（如果可用）相同的疾病阶段的可能性增加。标准是取自一个或多个已知患同一阶段阿尔茨海默病的标准对象的一个或多个生物样品的Aβ40聚集体水平。对象和标准对象是同一物种，所有生物样品是同一样品类型并且不包括脑组、脑组织部分或脑匀浆。
[0131] 根据其他方面，在治疗阿尔茨海默病前对阿尔茨海默病对象进行疾病分期或在治疗阿尔茨海默病前帮助阿尔茨海默病对象进行疾病分期的方法可包括获得或测量取自对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。
[0132] 根据本发明，疾病期指本领域技术人员已知的任何阿尔茨海默病阶段。例如，疾病期包括早期阿尔茨海默病和晚期阿尔茨海默病。本文使用的早期阿尔茨海默病表征是MMSE值大于19和包括MCI。本文使用的晚期阿尔茨海默病的表征是MMSE值为19和以下且包括累进（MMSE=15-19）以及末期阿尔茨海默病（MMSE<15）。标准对象可以根据本领域技术人员已知方法分为有阿尔茨海默病特定期。
[0133] 与上面部分描述的测定临界值的方法相似，阶段特异标准可从本领域技术人员已知任何模型计算得到，以处理取自多个有已知阿尔茨海默病的标准对象生物样品的Aβ40聚集体水平来产生该水平的平均值或其他有意义数值摘要。在某些实施方式中，标准是取自多个已知患同一阶段阿尔茨海默病的标准对象的生物样品中的Aβ40聚集体平均水平。在某些实施方式中，有至少一个早期标准和一个晚期标准用于对比Aβ40聚集体水平。
[0134] 评价MCI发展成阿尔茨海默病可能性增加的方法
[0135] 还根据另一方面，发明提供例如评估所评价对象中MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加的预后方法。所述方法包括获得对象生物样品中Aβ40聚集体水平测量和如果Aβ40聚集水平高于对照水平临界值，确定对象中MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加。对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，所有生物样品是同一样品类型，优选CSF样品，并且其中所有生物样品都不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0136] 另一相关方面，发明提供帮助评估所评价对象中MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加的方法。所述方法包括步骤：测量对象生物样品中Aβ40聚集体水平；和将Aβ40聚集体水平传达给另外的实体；其中如果Aβ40聚集体水平高于对照水平临界值，另外实体确定对象中MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加。对照水平临界值从包括多个认知正常对照对象的生物样品中Aβ40聚集体水平的数据计算得来。评价对象和对照对象是同一物种，所有所述生物样品是同一样品类型，优选CSF样品，并且所有生物样品都不包括脑组织、脑组织部分或脑匀浆。
[0137] 根据其他方面，评价MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加的方法可以包括获得或测量来自对象生物样品的Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率的步骤。
[0138] 本文提供的评估所评价对象中MCI发展为阿尔茨海默病的可能性增加的方法还可包括获得所评价对象中MCI发展为阿尔茨海默病的第二指示物测量的步骤。例如，第二指示物可包括阿尔茨海默病的其他生物标记，例如Aβ40或Aβ42单体，Aβ42聚集体，tau单体和聚集体，淀粉样斑块，和阿尔茨海默病连锁的基因突变，和非样品来源指示物，例如年龄，性别，ApoE基因型，MMSE评分，CDR评分，记忆盒评分，生活方式因子，包括高血压、高胆固醇和控制不佳的糖尿病，和教育水平。
[0139] 在获得MCI发展为阿尔茨海默病的第二指示物测量之后，本文提供的方法可以包括根据含Aβ40聚集体测量和第二指示物测量的数据来计算对象指数的步骤，和涉及“评价有阿尔茨海默病的可能性增加的方法”的“第二指示物测量”部分所述的计算对象指数的方法。
[0140] 本文所述评估所评价对象中MCI发展成阿尔茨海默病的可能性增加的方法的其他步骤还能包括对比对象指数和对照指数临界值，其中对照指数临界值从包括多个认知正常对照对象生物样品Aβ40聚集体测量和对照对象中第二指示物测量的数据计算得来。对照指数能如涉及“评价有阿尔茨海默病的可能性增加的方法”的“第二指示物测量”的部分所述计算得到。
[0141] 对象
[0142] 发明优选实施方式中，对象是人。其他实施方式中，对象是非人动物。在发明的优选非人动物的示例包括小鼠。
[0143] 在发明的其他优选实施方式中，评价对象和有阿尔茨海默病的对象可以是活体。在发明的进一步优选实施方式中，对照对象和标准对象可以是活体。
[0144] 生物样品
[0145] 用于发明方法的生物样品不包括脑组织，脑组织部分或脑匀浆。优选生物样品可以包括体液或体组织。在某些实施方式中，Aβ40聚集体循环。优选生物样品也包括全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液（CSF）、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、神经系统组织、非神经系统组织，肌肉组织、活检、尸检、脂肪活检、脂肪组织、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液（BAL）或滑液。特定优选生物样品包括血浆，血清，CSF，和尿。在其它的实施方式中，生物样品包括CSF。
[0146] III 发明的实施方法
[0147] 完成发明目标所需的步骤可以由一个或多于一个实体实现。例如，实体可以是人，一组人，机构或公司。
[0148] 一个实体
[0149] 根据某些方面，完成发明目标所需的步骤由一个实体实施。在某些实施方式中，单个实体可以得到对象生物样品的指示物水平和确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。例如，所述实体可以是医师或临床医生。所述实体也可以是机构，例如医院或医师诊所，其中所有方法步骤由机构员工完成。本文所用的“获得”能包括测量，接收，或其他直接或间接获得信息方法。在实体获得比率的发明方面，获得比率能包括在相同或另外实体完成测量步骤之后从测量或水平计算，接收比率，或其他直接或间接获得比率的方法。
[0150] 在其他实施方式中，单个实体可以测量对象生物样品的指示物水平和将指示物水平传达给另外的实体，然后确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。在这些实施方式中，例如，实现测量和传达步骤的单个实体可以是临床或实验室技术员。
[0151] 多于一个实体
[0152] 根据其他方面，完成发明目标所需的步骤可由多于一个实体实现。一个实体可以测量对象生物样品中的指示物水平，而另外实体可以确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。例如，临床上的实验室技术员可以确定对象生物样品中的指示物水平，并且医院医生可以确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。
[0153] 实体之间的传达
[0154] 实施发明应用方法的实体之间的联系可由本领域使用的任何方法完成。通常，实体之间的传达信息会采用报告的形式。在某些实施方式中，第一个实体可以从检测生物样品指示物水平的第二个实体得到生物样品指示物水平。第一个实体可以直接或间接从第二个实体获得水平。例如，第一个实体可以直接从第二个或另外实体获得书面或电子的水平报告另一个示例中，第一个实体可以从第二个实体上传水平的网络上获得该水平的电子报告。另外一个示例中，第一个实体可以从准备来自第二个实体测量的报告的第三个实体获得水平。
[0155] 在其他实施方式中，第一个实体可以测量生物样品中的指示物水平和将该水平传达给第二个或另外实体，然后确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。第一个实体可以直接或间接传达水平给第二个实体。例如，第一个实体可以准备水平报告并且将该报告经手工或电子给予第二个实体。另一个示例中，第一个实体可以上传水平到第二个实体能得到该水平的网络上。另外一个示例中，第一个实体可以传达水平给第三个实体，第三个实体准备由第二个实体使用的报告。
[0156] 临床试验
[0157] 发明的方法能用于包括阿尔茨海默病的临床试验。通常，对于临床试验应用，实现发明目标所需的步骤会由多于一个实体完成。例如，不同位置的多个实体，例如不同城市的门诊部，可以测量要评价对象生物样品中的指示物水平，并且传达水平给另外实体，例如一组指导临床试验的医生，其然后确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。在某些实施方式中，多个实体可以使用准备和传达水平报告给另外实体的第三个实体，确定对象有或没有阿尔茨海默病的可能性增加，发展成晚期阿尔茨海默病的可能性增加或降低，或有与标准相同疾病阶段的可能性增加。包括本发明方法的临床试验可以用于评价阿尔茨海默病新药物和治疗的有效性，或评价不同临床参数对阿尔茨海默病和其进展的效果。
[0158] IV 发明方法中获得Aβ40聚集体测量和水平
[0159] 发明方法包括获得所评价对象生物样品中Aβ40聚集体测量或水平的步骤。获得Aβ40聚集体测量或水平可以由本领域技术人员已知的任何方法完成，例如错折叠蛋白分析（MPA）（Lau等，2007，PNAS，104:11551），ELISA，种子多聚化，基于纳米粒子的检测，纳米尺度光学生物传感器方法，带流式细胞仪的双色FRET检测，和双色单一聚集体FCS检测（Funke等，Current Alzheimer Research，2009，6:285-289）。用于获得Aβ40聚集体检测或水平的示例性试剂包括mAb158（Englund等，J.Neurochem 2007，103:334-345）和能特异性结合Aβ聚集体的Kayed等描述的抗体（Science，2003，300:486-489和Mol.Neurodegeneration，2007，2:18）。也可使用本领域技术人员已知的其他抗体。
[0160] 在某些实施方式中，Aβ40聚集体水平由包括以下第一步骤的方法获得：将体液或体组织匀浆接触聚集体特异性结合试剂，接触条件允许所述试剂结合Aβ40聚集体（如果存在）形成复合物。聚集体特异性结合试剂可以是任何试剂，例如类肽，肽或树突，当以特定电荷密度连接到固体支持物时，优选结合聚集体而不是单体。如果相比单体以更大亲和性、亲合力和/或更高特异性结合聚集体，试剂称为“优选结合”聚集体。例如，聚集体特异性结合试剂可以包括美国临时专利申请号61/258,188所述试剂，其通过引用纳入本文。这些聚集体特异性结合试剂可以用标记进行可检测标定，所述标记包括但不限于标签（例如生物素，His标签，寡核苷酸）、染料、荧光团和结合对组成。
[0161] 聚集体特异性结合试剂连接到固体支持物上。使用的固体支持物包括但不限于，硝酸纤维素，聚苯乙烯乳胶珠，氧化钛，氧化硅，多糖珠，多糖膜，琼脂糖，玻璃，聚丙烯酸，聚乙二醇，聚乙二醇-聚苯乙烯杂合体，可控孔度玻璃，载玻片，金珠，和纤维素。Aβ40聚集体特异性结合试剂可以本领域技术人员已知的任何方法连接到固体支持物上。
[0162] 获得Aβ40聚集体测量或水平的方法也包括通过结合聚集体特异性结合试剂来检测生物样品中Aβ40聚集体（如果有）的后续步骤。在某些实施方式中，所述方法的检测步骤可以包括如下分步骤：从未结合Aβ40单体（如果有）中分离由所述试剂和Aβ40聚集体形成的复合物，可选地，从复合物中分离Aβ40聚集体，并且检测Aβ40聚集体。在其他实施方式中，所述方法的检测步骤包括如下分步骤：从未结合Aβ40单体（如果有）中分离由所述试剂和Aβ40聚集体形成的复合物，并且移除未结合Aβ40单体，使复合物中存在的Aβ40聚集体变性形成Aβ40单体，并且检测Aβ40单体。从未结合Aβ40单体中分离和移除由所述试剂和Aβ40聚集体形成的复合物能用免疫沉淀和清洗，尺寸排阻色谱或本领域技术人员已知的任何其他方法完成。“解离”表示Aβ40聚集体从所述试剂物理分离，从而能够检测与试剂分开的聚集体。例如，从复合物分离和变性Aβ40聚集体能用3.0-6.0M盐酸胍或异硫氰酸胍完成。Aβ40聚集体也可以用本领域技术人员已知的任何方法来分离和变性形成Aβ40单体，例如通过改变pH。
[0163] 复合物从未结合单体（如果有）分离后，Aβ40聚集体可以用检测试剂检测。检测试剂可以是任何试剂，通常是特异性结合Aβ40聚集体和/或Aβ40单体的抗体。合适检测试剂描述于美国临时专利申请号61/258,188中。优选检测试剂包括11A50-B10（科文斯（Covance）），对Aβ40C末端特异的抗体；4G8，对Aβ氨基酸18-22特异；20.1，对Aβ氨基酸1-10特异；和6E10，对Aβ氨基酸3-8特异。在某些实施方式中，检测试剂可以用标记进行可检测标定，所述标记包括但不限于标签（例如生物素，His标签，寡核苷酸），染料，荧光团和结合对组成。
[0164] 描述下列非限制性实施例以用于说明。
[0165] 实施例
[0166] 实施例1：使用错折叠蛋白分析（MPA）从阿尔茨海默病患者CSF样品中检测Aβ40聚集体
[0167] 此实施例第一次显示生物样品中能检测循环Aβ40聚集体，特别是CSF生物液体样品。更重要的是，此实施例显示阿尔茨海默病患者CSF样品的Aβ40聚集体水平高于没有阿尔茨海默病并且假定认知正常的人的对照样品。使用捕获试剂PSR1（连接到磁性珠的类肽试剂XIIb）的错折叠蛋白分析（MPA）用于相对Aβ40单体选择性检测Aβ40聚集体。
[0168] PSR1的结构如下所提供：
[0169]
[0170] 基本MPA示意图如图1所示。简单说，最初是基于淀粉样选择珠的捕获步骤，随后是洗脱和特异性检测特定淀粉样蛋白种类。最少200微升的患者CSF目前用于每个数据点。
[0171] 此实施例中，八个阿尔茨海默病患者（或AD样品）和八个正常对照个体的CSF样品获自分析生物科学公司（ABS）。八个AD样品根据临床认知简易精神状态检查量表（MMSE）试验分值分类成疾病期。下述标准用于在此实施例中分组试验样品。
[0172]
[0173] 各200μl的这些CSF样品与50μl 5X TBSTT（250mM Tris，pH 7.5；750mMNaCl；5%吐温-20；5%曲通X-100）和30μl的PSR1（类肽试剂XIIb共价结合30mg/mL Dynal M270-羧酸珠）在37°C 550rpm振荡孵育1小时。
[0174] 分析阴性对照用每个分析250μl 1X TBSTT缓冲液（50mM Tris，pH 7.5；150mM NaCl；1%吐温-20；1%曲通X-100）完成，重复三次。阳性对照用每个分析125μl的含超声处理100nl 5%ADBH（阿尔茨海默病脑匀浆）的200μl正常CSF（没有阿尔茨海默病个体的CSF）和50μl 1X TBSTT完成。
[0175] 用TBST（50mM Tris，pH 7.5；150mM NaCl；0.05%吐温-20）清洗珠八次，使用磁性分类来固定珠而除去清洗缓冲液。加入100μl的1%两性洗涤剂（Zwittergent）3-14（来自西格玛公司（Sigma），产品号T7763），并且混合物在室温以750rpm振荡孵育30分钟。珠用磁性分离由TBST清洗八次。洗脱聚集体，并通过加入20μl 0.1N NaOH和80°C 750rpm振荡孵育30分钟来变性。测定板立刻放置在冰上1分钟，然后加入包含0.4%吐温-20的20μl0.12M NaH2PO4中和。混合物室温750rpm振荡孵育5分钟。对测定板应用磁性分离，并且上清液转入ELISA板，所述ELISA板是MSD公司（Meso Scale Discovery，马里兰州盖瑟斯堡）的 96-孔 人/啮齿动物[4G8]Abeta 三重超灵敏分析的试
剂盒组分。根据能多重检测Aβ38，Aβ40和Aβ40的试剂盒操作方案完成ELISA。用试剂盒获得的Aβ40检测免疫分析结果示于图2中。
剂盒组分。根据能多重检测Aβ38，Aβ40和Aβ40的试剂盒操作方案完成ELISA。用试剂盒获得的Aβ40检测免疫分析结果示于图2中。
[0176] 图2A显示阿尔茨海默病患者的CSF样品的Aβ40聚集体水平在统计学上显著高于未患病和假定认知正常对照样品。
[0177] 图2B中根据疾病期分离AD样品组。ANOVA检验显示AD样品和对照样品不来自一个人群。个体t检验显示早期AD样品组和对照组，以及累进亚期AD样品组和对照组之间的显著差异。由于本研究中的样品数量低，不计算诊断灵敏度和特异性。
[0178] 实施例2：Aβ40聚集体水平在早期和晚期阿尔茨海默病患者的CSF样品中增加[0179] 此实施例证明能在早期和晚期阿尔茨海默病患者CSF样品中检测到提高水平的Aβ40聚集体，并表明早期阿尔茨海默病患者CSF Aβ40聚集体水平高于晚期阿尔茨海默病患者。
[0180] 在此实施例中，35例AD和23例对照样品的CSF样品得自ABS。根据ABS定义，这些样品分组成早期和累进和末期AD亚期。这些样品的MMSE评分不可用，所以不能如实施例1所述确认分类。使用与实施例1所述相同的方法测试样品。
[0181] 图3A证明阿尔茨海默病患者的CSF样品的Aβ40聚集体水平在统计学上显著高于未患病和假定认知正常对照样品。
[0182] 图3B中根据ABS分类的期和亚期分离AD样品组。ANOVA检验显示AD样品和对照样品不来自一个人群。个体t检验显示ABS早期AD样品组和对照组之间，ABS累进亚期AD样品组和对照组之间，和ABS末亚期样品组和对照组之间的显著差异。
[0183] 用平均对照组RLU值加上2倍标准偏差的判决门限，观察到AD的82.86%临床灵敏度和95.65%临床特异性。
[0184] 实施例3：得自另一来源的临床CSF样品证明Aβ40聚集体水平在早期和晚期阿尔茨海默病患者中增加并且Aβ40聚集体是AD和早期AD的生物标记
[0185] 此实施例显示能在早期和晚期阿尔茨海默病患者CSF样品中检测到提高水平的Aβ40聚集体，并且Aβ40聚集体水平是AD和早期AD的有用生物标记。
[0186] 此实施例中，26例AD和10例对照样品用实施例1中讨论的标准分成不同疾病期和亚期并且用与实施例1所述相同的方法进行测试。
[0187] CSF样品从大学研究医院中获得。AD组包括26名记忆障碍诊所就诊患者，平均年龄71.8±7.3岁。诊断为AD的患者必须符合痴呆的DSM-IIIR标准[美国精神病学协会（1987）Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Third edition revised.（《精神疾病的诊断和统计手册》，第三版修订）美国精神病学协会，美国华盛顿特区]和由NINCDS-ADRDA定义的可能AD标准[McKann G，Drachman D，Folsyein M，Katzman R，Pricxe D，Stadlan EM（1984）Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease:report of the NINCDS-ARADA Work Group under the auspices of Department of Health Service Task Force on Alzheimer’s Disease（临床诊断阿尔茨海默病：卫生部阿尔茨海默病特别小组指导下的NINCDS-ARADA工作组报告）Neurology 34,939-944]。AD患者用附加临床评价根据时间随访。对照组，总共10例，平均年龄69.4±9.7岁，基于缺乏记忆抱怨或任何其他认知症状，和没有活性神经系统或精神疾病的征兆来定义。所有患者和对照签署参与这项研究的知情同意书。CSF收集在聚丙烯管中，离心，等分试样并且贮存在-80°C中，有待分析。
[0188] 图4A证明使用不同组临床CSF样品，阿尔茨海默病患者的Aβ40聚集体水平高于未患病和假定认知正常对照样品。
[0189] 图4B中，根据疾病期和亚期分离AD样品组。ANOVA检验显示AD样品和对照样品不来自一个人群。个体t检验显示早期AD样品组和对照组之间，累进亚期AD样品组和对照组之间，以及末亚期AD样品组和对照组之间的显著差异。
[0190] 进行ROC分析来测定最佳阿尔茨海默病灵敏度和特异性。Graph Pad Prism 5.0版本用于操作ROC分析。此程序对很多不同临界值/截断值产生ROC曲线和相关AUC，灵敏度和特异性值。然后通过简单选择提供最好灵敏度和特异性的临界值（即这两个参数之间的最小差异）手动确定提供最好灵敏度和特异性的最佳临界值/截断值。
[0191] ROC曲线见图6。下面提供Aβ40聚集体的诊断性能参数。
[0192] 本文使用的参数如上所定义。“试验准确性”用（TP+TN）/（TP+TN+FP+FN）计算。
[0193]参数 Aβ40聚集体（MPA）
ROC AUC 0.9307
临界值 >851RLU
灵敏度（％） 80.77
特异性（％） 90.00
检验准确性（％） 83.33
阳性预测值（％） 95.45
阴性预测值（％） 64.29
ROC AUC 0.9307
临界值 >851RLU
灵敏度（％） 80.77
特异性（％） 90.00
检验准确性（％） 83.33
阳性预测值（％） 95.45
阴性预测值（％） 64.29
[0194] 为评价Aβ40聚集体是否也是只对早期AD有用的生物标记，进行额外ROC分析来专注于这些样品。ROC曲线见图7。下面提供诊断性能参数。
[0195]参数 Aβ40聚集体（MPA）
ROC AUC 0.9538
临界值 >861.0RLU
灵敏度（％） 92.31
特异性（％） 90.00
检验准确性（％） 91.30
阳性预测值（％） 92.31
阴性预测值（％） 90.00
ROC AUC 0.9538
临界值 >861.0RLU
灵敏度（％） 92.31
特异性（％） 90.00
检验准确性（％） 91.30
阳性预测值（％） 92.31
阴性预测值（％） 90.00
[0196] MPA分析也用于检测样品的Aβ42聚集体水平。在任何AD样品中没有检测到Aβ42聚集体信号的统计学显著增加。（数据未显示。）
[0197] 实施例4：Aβ40聚集体与Aβ42单体的比率是AD和早期AD的生物标记
[0198] 此实施例显示阿尔茨海默病患者CSF样品中Aβ42单体水平显著增加和Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率显著增加。
[0199] 为确定其他可单独使用或与Aβ40聚集体联用的生物标记，如实施例3所述操作实验以评价样品中Aβ42单体水平。
[0200] CSF样品在分析缓冲液中1:3稀释，并且根据实施例1所述的 96-孔人/啮齿动物[4G8]Aβ三重超灵敏分析的试剂盒操作方案进行应用和处
理。试剂盒使用针对AβC末端尾区域的Aβ42抗体，当Aβ42采用聚集形式时认为所述区域被包埋。由于实施例1样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ42预期是单体形式。
理。试剂盒使用针对AβC末端尾区域的Aβ42抗体，当Aβ42采用聚集形式时认为所述区域被包埋。由于实施例1样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ42预期是单体形式。
[0201] 图5A显示AD患者CSF样品中Aβ42单体水平在统计学上显著下降。
[0202] 就每个样品计算Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。图5B显示AD患者的该比率在统计学上显著增加。
[0203] 使用单独Aβ42单体水平或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率来完成ROC分析。包括前面实施例中所提供Aβ40聚集体数据的ROC曲线示于图6。下面提供AD的诊断性能参数：
[0204]
[0205] 尽管Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率在三者之间产生最佳，所有三个测量给出极佳灵敏度，特异性和准确性值。
[0206] 为评价此比率是否也只对早期AD为有用的生物标记，根据使用实施例1所述标准的疾病期来分开样品（图5C）。t检验显示早期AD样品组和对照组之间，累进亚期AD样品组和对照组之间，和末亚期AD样品组和对照组之间的显著差异。包括前面实施例中Aβ40聚集体数据的ROC曲线示于图7。下面提供早期AD的诊断性能参数。
[0207]
[0208] 实施例5：阿尔茨海默病患者CSF样品中Aβ40聚集体与Aβ40单体的比率增加[0209] 此实施例显示阿尔茨海默病患者CSF样品中Aβ40聚集体水平与Aβ40单体水平的比率显著增加并且这种比率是AD的有用生物标记。
[0210] 为确定其他单独使用或与Aβ40聚集体联用的生物标记，如实施例3所述操作实验以评价样品中Aβ40单体水平。
[0211] CSF样品在分析缓冲液中1:11稀释，并且以实施例1所述的 96-孔人/啮齿动物[4G8]Aβ三重超灵敏分析的试剂盒操作方案进行应用和处
理。试剂盒使用针对Aβ40C末端尾区域的Aβ40抗体，当Aβ40采用聚集形式时认为该区域被包埋。由于实施例1的样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ40预期是单体形式。
理。试剂盒使用针对Aβ40C末端尾区域的Aβ40抗体，当Aβ40采用聚集形式时认为该区域被包埋。由于实施例1的样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ40预期是单体形式。
[0212] 阿尔茨海默病患者CSF样品中Aβ40单体水平没有显著改变（图8A）。但是，Aβ40聚集体水平与Aβ40单体水平的比率在统计学上显著增加，如图8B显示。
[0213] 使用Aβ40聚集体水平与Aβ40单体水平的比率完成ROC分析，并且ROC曲线示于图6。下面描述诊断性能参数：
[0214]
[0215] Aβ40聚集体水平与Aβ40单体水平的比率有良好灵敏度，特异性和准确性特征。
[0216] 实施例6：大量收集临床CSF样品证明Aβ40聚集体水平在轻度认知障碍患者和阿尔茨海默病患者中增加而且Aβ40聚集体是AD和发展成AD的MCI患者亚组的生物标记[0217] 此实施例显示从MCI和AD患者的CSF样品大组中检测到提高水平的Aβ40聚集体且Aβ40聚集体水平是AD和包括发展成临床诊断AD的MCI患者的早期AD的有用生物标记。
[0218] 此更大CSF样品组从大学研究医院得到。收集CSF收集时的AD组包括47例记忆障碍诊所就诊患者，平均年龄75.7+6.6岁。诊断为AD的患者符合痴呆的DSM-IIIR标准[美国精神病学协会（1987）Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Third edition revised.（《精神疾病的诊断和统计手册》，第三版修订）美国精神病学协会，美国华盛顿特区]和由NINCDS-ADRDA定义的可能AD标准[McKann G，Drachman D，Folsyein M，Katzman R，Pricxe D，Stadlan EM（1984）Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease:report of the NINCDS-ARADA Work Group under the auspices of Department of Health Service Task Force on Alzheimer’s Disease（临床诊断阿尔茨海默病：卫生部阿尔茨海默病特别小组指导下的NINCDS-ARADA工作组报告）.Neurology 34,939-944]。AD患者用用重复临床评价根据时间进行随访，增加临床诊断准确性。CSF收集时的MCI组包括71例患者，平均年龄72.9±7.7岁，并且必须符合Petersen提倡的MCI标准[Petersen RC（2004）Mild cognitive impairment as a diagnostic entity（轻度认知损害作为诊断实体）J Intern Med 256，183-194]，并且包括记忆力衰退抱怨，由医师确定的客观记忆损害，MMSE值≥24的总体认知功能保持，日常生活能力的最低损伤和不符合痴呆的DSM-IIIR标准。对照组包括健康老年志愿者，平均年龄76.6±6.5岁，缺乏记忆抱怨或任何其他认知症状，和没有活性神经系统或精神疾病的征兆。
[0219] 就随后向AD或其他痴呆类型转变对MCI患者进行平均临床随访4.7年。随后AD诊断必须符合与上述CSF收集时AD组相同的AD标准。CSF收集在聚丙烯管中，离心，等分试样并且贮存在-80°C中，有待分析。
[0220] 各100μl的这些CSF样品与25μl 5X TBSTT（250mM Tris，pH 8.4；750mMNaCl；4.15%吐温-20；4.15%曲通X-100）和30μl的PSR1（类肽试剂XIIb共价连接到30mg/mL Dynal M270-羧酸珠）在37°C 500rpm振荡孵育1小时。
[0221] 分析的负对照用每个分析100μl正常人CSF和25μl 5X TBSTT缓冲液完成，重复三次。正对照用100μl正对照CSF（诊断出阿尔茨海默病的个体的CSF）和25μl 1X TBSTT完成。
[0222] 用TBST（50mM Tris，pH 7.5；150mM NaCl；0.05%吐温-20）清洗珠八次，使用磁性分类来固定珠而移除清洗缓冲液。加入100μl的1%两性洗涤剂（Zwittergent）3-14（来自西格玛公司（Sigma），产品号T7763），并且混合物在室温以750rpm振荡孵育30分钟。珠用磁性分离由TBST清洗八次。洗脱聚集体，并通过加入20μl 0.15N NaOH和室温750rpm振荡孵育30分钟来变性。测定板立即加入20μl含有0.4%吐温-20的0.18M NaH2PO4中和。混合物室温750rpm振荡孵育5分钟。测定板应用磁性分离，并且上清液转入ELISA板，所述ELISA是MSD公司马里兰州盖瑟斯堡）的 96-孔 人/啮齿[4G8]Abeta三重超灵敏分析的试剂盒组分，根据能多重检测Aβ38，Aβ40和Aβ42的试剂盒操作方案完成ELISA。此实施例中，47例AD，71例MCI和21例对照样品根据临床诊断分成三个不同群。根据CSF样品收集后的后续临床诊断，进一步细分MCI样品。
[0223] 图9A使用另一更大CSF样品组证明阿尔茨海默病患者的Aβ40聚集体水平高于认知正常对照样品。在图9B，MCI患者样品进一步分成7例稍后发展成其他非AD类型痴呆的MCI患者，34例稳定MCI患者，和30例发展成临床诊断AD的MCI患者。AD的Aβ40聚集体水平在统计学上显著增加。在图9C，MCI-AD组去除高信号异常值会提供对照和MCI-AD组间的额外统计学显著性。
[0224] 为证明Aβ42单体可以单独或与Aβ40聚集体联合使用，也进行实验来评价样品中的Aβ42单体水平。CSF样品在分析缓冲液中1:3稀释，并且根据实施例1所述的96-孔 人/啮齿动物[4G8]Aβ三重超敏分析的试剂盒操作方案进行应用和
处理。试剂盒使用针对AβC末端尾区域的Aβ42抗体，当Aβ42采用聚集形式时认为所述区域被包埋。由于实施例1的样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ42预期是单体形式。
处理。试剂盒使用针对AβC末端尾区域的Aβ42抗体，当Aβ42采用聚集形式时认为所述区域被包埋。由于实施例1的样品没有变性，这种方法检测的大部分Aβ42预期是单体形式。
[0225] 图10A显示MCI或AD患者的CSF样品Aβ42单体水平相对于相符的认知正常对照在统计学上显著下降。就每个样品计算Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。图
10B显示MCI或AD患者的该比率在统计学上显著增加。图10C和10D也分别显示MCI亚组的相似Aβ42单体水平值和Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。图10D显示AD
患者与稍后发展成AD的MCI患者的该比率在统计学上显著增加。
10B显示MCI或AD患者的该比率在统计学上显著增加。图10C和10D也分别显示MCI亚组的相似Aβ42单体水平值和Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率。图10D显示AD
患者与稍后发展成AD的MCI患者的该比率在统计学上显著增加。
[0226] 完成ROC分析来测定最佳阿尔茨海默病灵敏度和特异性。采用Windows的Prism5.0版本（GraphPad软件公司（GraphPad Software）；加利福尼亚州拉由拉市）来操作ROC分析。这个程序对很多不同临界值/截断值产生ROC曲线和相关AUC，灵敏度和特异性值。
然后通过简单选择提供最好灵敏度和特异性的临界值（即这两个参数之间的最小差异）手动确定提供最好灵敏度和特异性的最佳临界值/截断值。
然后通过简单选择提供最好灵敏度和特异性的临界值（即这两个参数之间的最小差异）手动确定提供最好灵敏度和特异性的最佳临界值/截断值。
[0227] AD诊断的ROC曲线示于图11。下面提供Aβ40聚集体、Aβ42单体和Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率的诊断性能参数。
[0228]
[0229] 尽管Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率在三者之间产生最好，所有三个测量给出极佳灵敏度，特异性和准确性值。
[0230] Aβ40聚集体作为AD的生物标记
[0231] 为评价Aβ40聚集体是否也是检测由特异性检测发展成AD的MCI患者和AD患者所定义的AD的有用生物标记，进行图9B中所有数据点的额外ROC分析以专注到这些样品。ROC曲线见图12。显示MCI向AD转变和AD的临界值。下面提供诊断性能参数。
[0232]
[0233] 尽管Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率在三者之间产生最好，所有三个测量给出极佳灵敏度，特异性和准确性值。
[0234] MPA分析也用于检测样品的Aβ42聚集体水平。在任何AD样品中没有检测到Aβ42聚集体信号的统计学显著增加。（数据未显示）
[0235] Aβ40聚集体作为MCI发展成AD的生物标记
[0236] 为评价Aβ40聚集体是否也是后来发展成AD的MCI患者的有用生物标记，ROC分析中产生的检测AD的三个临界值概括于图11，并且上述相应表格用于后来发展成AD或其他非AD痴呆类型的MCI患者亚组。下面总结了Aβ40聚集体、Aβ42单体和Aβ40聚集体/Aβ42单体比率的临界值诊断效用以预测随后向AD的发展。
[0237]
[0238] 尽管Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平的比率在三者之间产生最好，所有三个测量给出极佳灵敏度，特异性和准确性值。
[0239] 实施例7：另一个临床CSF收集没有证明阿尔茨海默病中Aβ40聚集体含量增加[0240] 此实施例未能显示AD患者CSF样品的另一个单独组中检测出Aβ40聚集体水平增加和Aβ40聚集体水平是AD有用的生物标记。
[0241] 此CSF样品组获自与实施例6所评价CSF样品相同的大学研究医院。如实施例6讨论，患者用相同标准诊断并用相同方式收集。
[0242] 各200μl的这些CSF样品与50μl 5X TBSTT（250mM Tris，pH 7.5；750mMNaCl；5%吐温-20；5%曲通X-100）和30μl的PSR1（类肽试剂XIIb共价连接到30mg/mL Dynal M270-羧酸珠上）在37°C 500rpm振荡孵育1小时。
[0243] 分析的阴性对照用每个分析200μl正常人体CSF和50μl 5X TBSTT缓冲液（250mM Tris，pH 7.5；750mM NaCl；5%吐温-20；5%曲通X-100）完成，重复三次。正对照用
200μl正对照CSF（诊断出阿尔茨海默病的个体的CSF）和50μl 1X TBSTT完成。
200μl正对照CSF（诊断出阿尔茨海默病的个体的CSF）和50μl 1X TBSTT完成。
[0244] 用TBST（50mM Tris，pH 7.5；150mM NaCl；0.05%吐温-20）清洗珠八次，使用磁性分类来固定珠而除去清洗缓冲液。加入100μl的1%两性洗涤剂（Zwittergent）3-14（来自西格玛公司（Sigma），产品号T7763），并且混合物在室温750rpm振荡孵育30分钟。珠用磁性分离由TBST清洗八次。洗脱聚集体，并通过加入20μl 0.1N NaOH和80°C 750rpm振荡孵育30分钟来变性。测定板立刻放置在冰上1分钟，200x g 4°C离心1分钟，然后加入包含0.4%吐温-20的20μl 0.12M NaH2PO4中和。混合物室温750rpm振荡孵育5分钟。测定板应用磁性分离，并且上清液转入ELISA板，所述ELISA板是MSD公司（马里兰州盖瑟斯堡）的 96-孔 人/啮齿[4G8]Abeta 三重超灵敏分析的试剂盒组分，根据能多重检测Aβ38，Aβ40和Aβ42的试剂盒操作方案完成ELISA。
[0245] 此实施例中，15例AD和15例对照样品根据临床诊断分成2个不同群。图13A，B和C显示认知正常对照或AD患者中没有观察到Aβ40聚集体水平，Aβ42单体水平，或Aβ40聚集体水平与Aβ42单体水平比率的统计学显著改变。我们观察到在使用相对小样品组的此实施例中，检测到的Aβ40聚集体和Aβ42单体水平比上述实施例所测水平低很多。小样品组和低检测水平可以解释为何此实施例不能证明AD的CSF样品中可检测到Aβ40聚集体水平增加。
[0246] 实施例8：用差异离心从AD CSF依大小排列Aβ40聚集体
[0247] 此实施例以通过PSR1从阿尔茨海默病患者捕获的聚集体物理特性为特征。
[0248] 不加入任何物质，加入5ng/mL球聚体或200nL/mL ADBH（用或不用超声处理）的AD CSF或正常收集CSF在4C 16,000xg 离心10分钟，或者134,000xg离心1小时。上清液和沉淀部分转入到单独试管（沉淀物用与最初样品相同体积的CSF重建）并用于错折叠蛋白分析（MPA）。
[0249] 错折叠蛋白分析：100ul样品用25ul 5xTBSTT缓冲液（250mM Tris，750mM NaCl，5%吐温20，5%曲通-100pH 7.5）和30ul PSR1珠37C孵育1小时。珠用TBST清洗6次，随后用1%两性洗涤剂（Zwittergent）3-14孵育30分钟，再用TBST洗一次。Abeta肽用0.15M NaOH室温洗脱30分钟，随后用0.18M NaH2PO4+0.5%吐温20中和洗脱液，并且根据生产商说明用Mesoscale三重Aβ免疫分析检测。
[0250] 测定多种已知大小聚集体的性能来提供阿尔茨海默病CSF中聚集体的分子量参照。尽管聚集体溶解性和分子量没有必然的线性关系（并且受到根据聚集体构象的可变性），这些研究提供聚集体大小参照的一些框架。来自未经超声处理的阿尔茨海默病脑匀浆（ADBH）的Abeta纤丝在16,000g和134,000g沉降。这些聚集体从接近TSK4000柱空体积洗脱并且可能大于1Mda。经超声处理ADBH的Abeta聚集体的一些组分在16,000g可溶但在134,000g沉降。尺寸排阻色谱法预测这些聚集体约为0.5-1Mda。球聚体（预测约54KDa）在16,000g和134,000g都可溶。
[0251] 图14显示在16,000g或134,000g离心的阿尔茨海默病CSF和正常CSF上清液和沉淀的错折叠蛋白分析所检测的Aβ40聚集体量。AD CSF的内源Aβ40聚集体在134,000g1小时离心后留在溶液中，表明它们可能小于在超声处理ADBH样品中发现的0.5-1Mda的“中间大小”聚集体。这些数据表明ADCSF中所发现寡聚体的溶解性相较组织（ADBH）中沉淀聚集体有不同表现，提示它们尺寸更小。
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