实施例1
一、材料
实验样品:鲜活湾鳄、逻罗鳄,由广东四会市贞山鳄鱼养殖限公司提供。
实验动物:NIH系小鼠,由广东省医学实验中心提供,聚乙烯吡咯烷
酮K-30(PVP K-30),由海南南杭 药业有限公司提供。
二、方法与结果
鳄鱼
血浆冻干粉制备:鲜活鲜活湾鳄、逻罗鳄,分别经心脏
插管无菌取血,经过
柠檬酸钠抗凝、离心, 混入5%wt聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP-K30)、冷冻干燥制成粉末,分别制备湾鳄、逻罗鳄鳄鱼血浆冻干粉。
灌胃给予受试动物急性毒性实验:选择健康NIH系小鼠,体重20±2g,40只,雌雄各半,随机分成2 组,即湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组,每组20只,雌雄各半。禁食12小时,提供饮
水,分别将鳄鱼 血冷冻粉剂以生理盐水配成含血浆冻干粉0.4g/ml溶液,湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组小鼠分别一次 灌胃湾鳄血浆溶液、逻罗鳄血浆溶液0.8ml/20g体重,连续观察七天,小鼠活动敏捷,
毛皮光滑,未引起死 亡或异常反应,限于给药浓度和体积不能再增大,不能测出其LD50。故进行最大耐受量试验。
另选择健康小鼠40只,雌雄各半,随机分成2组,即湾鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组,每组20只, 雌雄各半。禁食12小时,提供饮水,分别将鳄鱼血胶囊粉剂以生理盐水配成含血浆冻干粉0.4g/ml溶液,湾 鳄血浆给药组、逻罗鳄血浆给药组小鼠分别于24小时内分6次灌服鳄鱼血浆溶液,每次0.5ml/20g体重,观 察7天,此期间让小鼠自由进食和饮水,小鼠活动敏捷,毛皮光滑,未引起死亡或异常反应。
三、结论
小鼠每天灌胃分别给予湾鳄血浆溶液、逻罗鳄血浆最大耐受量应不小于0.4×6×0.5×50=60g/kg,属于 实际无毒级。
实施例2 抗肿瘤及提高
机体免疫功能的药理作用
一、材料及方法
癌细胞株 人
肺癌细胞95-D、人胃癌细胞BGC、人肝癌细胞HepG2细胞,由中山大学国家高技术(863) 海洋
生物功能基因组开放实验室提供;人鼻咽癌瘤源,由中山大学实验动物中心提供。
取约104个人肺癌细胞95-D、人胃癌细胞BGC、人肝癌细胞HepG2细胞、C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞 B16分别接种于96孔培养板中,每孔180μl,于37℃含5%CO2
培养箱中培养,培养24h。设阴性对照孔(含 相同浓度的聚乙烯吡咯烷酮辅料对照)及湾鳄血浆冻干粉、逻罗鳄血浆冻干粉,用生理盐水溶解,各组设5 个浓度,每浓度3个平行孔,每孔分别加样品20μl,于37℃含5%CO2培养箱中培养,培养48h后,每孔加 入MTT(用生理盐水配制成5mg/ml)20μl,37℃温育4h,使MTT还原为甲臜(Formanza)。吸出上清液, 加入150μl二甲基亚砜(DMSO),振荡10min,使Formanza溶解。
指标测定 最后用酶标定量仪测定492nm处光
密度值。阴性对照相比,计算肿瘤细胞抑制率。
将瘤源裸鼠脱颈处死,取出鼻咽癌肿瘤组织,切成2mm×2mm×2mm的小瘤
块,用
套管针将瘤块接种 于每只裸鼠的背部皮下,制备成为人鼻咽癌裸鼠模型。
裸鼠50只,接种后次日随机分为5组,即空白对照组、湾鳄血浆冻干粉低、高剂量给药组、逻罗鳄血
浆冻干粉低、高剂量给药组,每组10只,连续灌胃给药28天,处死动物,测定体重、肿瘤、胸腺、脾脏重 量,按公式计算抑瘤率=(空白对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100%
胸腺指数(mg/10g体重)=胸腺重量/体重
脾脏指数(mg/10g体重)=脾脏重量/体重
二、实验结果
表1湾鳄血浆冻干粉对95-D癌细胞的抑制率
剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40
抑制率(%) 82.0 70.9 60.7 30.0 26.2
表2逻罗鳄血浆冻干粉对95-D癌细胞的抑制率
剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40
抑制率(%) 89.0 73.9 64.7 40.0 32.2
表3湾鳄血浆冻干粉对HepG2细胞、B16癌细胞的抑制率
剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40
抑制率 HepG2 84.5 75.9 62.3 51.2 44.3
(%) B16 78.2 60.1 51.2 48.9 33.2
表4逻罗鳄血浆冻干粉对HepG2细胞、B16癌细胞的抑制率
剂量(μg/mL) 900 400 150 60 40
抑制率 HepG2 93.0 78.4 44.9 45.7 35.6
(%) B16 86.2 70.3 76.3 43.1 30.1
表5鳄鱼血浆冻干粉对荷人鼻咽癌裸鼠的影响( x±SD,n=10)
组别 剂量 体重(g) 瘤重 胸腺指数 脾赃指数
(mg/kg) 始 末 (g) mg.10g-1 mg.10g-1
空白对照组 5%PVP 19.6±1.3 25.4±2.2 1.5±0.3 25.9±3.2 58.6±6.2
K-30
湾鳄血浆冻干粉 50 20.6±1.3Δ 24.3±3.5Δ 0.6±0.4*** 32.6±3.5*** 64.3±4.7*
给药组 100 19.8±1.6Δ 26.1±3.1Δ 0.3±0.3 36.7±4.3*** 68.2±5.8**
湾鳄血浆冻干粉 50 20.7±1.8Δ 25.6±3.0Δ 0.5±0.3 33.3±3.6*** 64.5±4.2*
给药组 100 20.5±1.5Δ 24.6±1.8Δ 0.3±0.2 37.2±3.5*** 67.3±4.8**
与空白对照组相比,ΔP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.空白对照组给予等体积5%PVP K-30溶液。
实施例3 提高机体免疫功能的药理作用
一、材料及方法
NIH系小鼠,由广东省医药实验动物中心提供。环磷酰胺,由上海华联制药公司生产。胸腺肽肠溶片,由 西安迪赛生物药业有限公司生产。
环磷酰胺致小鼠免疫功能低下的药理作用
选择健康NIH系小鼠90只,18~22g,雌雄各半,随机抽取10只,雌雄各半,作为正常对照组,其余70 只口服环磷酰胺50mg/Kg体重,连续服用4天后,随机分成8组,每组10只,雌雄各半,即空白对照组, 湾鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组,逻罗鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组及阳性对照组(胸腺肽组)。灌胃给 受试样品,给受试样品剂量见表6,连续给受试样品40d,第41d各组小鼠禁食一天,但提供饮水。第42d, 处死各组小鼠,称量各组小鼠的体重,胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数及脾脏指数,比较各组间的差异。
对小鼠
碳廓清试验的作用
选择健康NIH系小鼠90只,18~22g,雌雄各半,随机抽取10只,雌雄各半,作为正常对照组,其余 70只口服环磷酰胺50mg/Kg体重,连续服用4天后,随机分成8组,每组10只,雌雄各半,即空白对照组, 湾鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组,逻罗鳄血浆冻干粉低、中、高剂量组及阳性对照组(胸腺肽组)。灌胃给 受试样品,给受试样品剂量见表7,连续给受试样品40d,第41d各组小鼠禁食一天,但提供饮水。第42d, 将印度墨汁,按每10g体重0.1ml计算,经鼠尾静脉注入小鼠,待墨汁注入后立即计时,注入墨汁后2、10min, 分别从小鼠眼眶内眦静脉丛取而20μl,加入2ml Na2CO3溶液中,用7550可见光-紫外分光光度计在600nm
波长处测光密度(OD),以Na2CO3溶液作空白对照。最后处死小鼠,称量体重,取肝脏和脾脏,用
滤纸吸干 脏器表面血污,称重,计算吞噬指数(K)及吞噬活性(α)值,比较各组差异。
吞噬指数K=(lgOD1-lgOD2)÷(t2-t1)(t为时间,单位为min)
吞噬活性α=体重÷(肝重+脾重)×K
表6对小鼠胸腺和脾脏的作用( x±SD,n=10)
项目 剂量 胸腺指数 脾脏指数
组别 (mg/kg) (mg/10g体重) (mg/10g体重)
空白对照组 5%PVP 16.25±3.21 48.46±8.26
K-30
湾鳄血浆冻干粉组 60 17.35±3.32Δ 56.62±10.31Δ
120 19.56±3.34* 68.47±13.43***
240 20.27±2.96** 76.28±9.96***
逻罗鳄血浆冻干粉组 60 17.98±3.45Δ 57.81±8.42*
120 19.95±3.82* 70.22±9.45***
240 21.26±3.55** 85.29±10.26***
阳性对照组 240 20.56±3.56** 76.29±12.45***
与空白对照组相比,ΔP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。空白对照组给予等体积5%PVP K-30溶液。
表7对小鼠碳廓清试验的作用( x±SD,n=10)
项目 剂量 吞噬指数 吞噬活性
组别 (mg/kg) K α
空白对照组 5%PVP 0.0682±0.0098 7.8351±0.2469
K-30
湾鳄血浆冻干粉组 60 0.1190±0.0240*** 7.9520±0.2561Δ
120 0.1832±0.0310*** 8.5234±0.2835***
240 0.2266±0.0352*** 9.694±0.2963***
逻罗鳄血浆冻干粉组 60 0.1230±0.0169*** 7.9932±0.2582***
120 0.1925±0.0254*** 8.6821±0.3243***
240 0.2264±0.0269*** 9.9753±0.2562***
阳性对照组 240 0.1149±0.0210*** 8.9342±0.3386***
与空白对照组相比,ΔP>0.05,***P<0.001.空白对照组给予等体积5%PVP K-30溶液。
实施例4 抗病毒药理作用
NIH系小鼠,由广东省医药实验动物中心提供。流感病毒鼠肺适应株FM1,由北京医学科学院医药生物 技术研究所提供,病毒唑,购于北京华康药业。禽流感病毒H5N1亚型,由华南农业大学
兽医学院提供。 对因小鼠体内感染流感病毒所致死亡的保护作用
将选择健康NIH系小鼠,体重20±2g,90只,雌雄各半,随机分为病毒对照组、正常对照组、湾鳄血 浆冻干粉给药低、中、高剂量组,逻罗鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组,除正常对照组外,其余各组分 别以FM1(血凝效价为1∶512)滴鼻感染,给药组自感染病毒前1d开始到感染后4d,共滴鼻给药0.05ml/次, 2次/d,同时各组按表8剂量连续10天口服灌胃给药,病毒对照组及正常对照组给予等体积5%PVP-K30溶液, 逐日观察动物发病和死亡数,并观察15天,计算死亡保护率及生命延长率。
表8鳄鱼血浆冻干粉对小鼠感染病毒性肺炎所致死亡的保护作用( x±SD,n=10)
组别 N/只 给药浓度(mg/L) 死亡(n) 死亡率(%) 平均存活(d)
病毒对照组 10 5%PVP-K30 8 80 9.7±3.1
正常对照组 10 5%PVP-K30 0 0 15.0±0.0***
病毒唑组 10 1000 5 50 13.6±0.6***
湾鳄血浆冻干 10 60 6 60 12.0±2.8**
粉给药组 10 120 3 30 13.7±2.4***
10 240 3 30 14.3±1.3***
逻罗鳄血浆冻 10 60 6 60 12.2±2.7Δ
干粉给药组 10 120 3 30 13.9±1.9***
10 240 2 20 14.7±0.7***
与空白对照组相比,ΔP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
将选择健康NIH系小鼠,体重20±2g,90只,雌雄各半,随机分为病毒对照组、正常对照组、湾鳄血 浆冻干粉给药低、中、高剂量组,逻罗鳄血浆冻干粉给药低、中、高剂量组,除正常对照组外,其余分别以 禽流感病毒H5N1亚型(血凝效价为1∶256)滴鼻感染,共滴鼻给药0.05ml/次,1次/d,连续滴鼻4天,同 时各组按表9剂量连续10天口服灌胃给药,病毒对照组及正常对照组给予等体积5%PVP-K30溶液,逐日观 察动物发病和死亡数,并观察20天,计算死亡保护率及生命延长率。
表9鳄鱼血浆冻干粉对小鼠H5N1所致死亡的保护作用( x±SD,n=10)
组别 N/只 给药浓度(mg/L) 死亡(n) 死亡率(%) 平均存活(d)
病毒对照 10 5%PVP-K 8 80 13.4±3.9
30
正常对照 10 5%PVP-K 0 0 20.0±0.0***
病毒唑 10 30 5 50 17.1±2.8*
1000
湾鳄血浆冻干 10 60 6 60 17.0±2.8*
粉给药组 10 120 3 30 18.7±2.4**
10 240 2 20 19.3±1.3***
逻罗鳄血浆冻 10 60 6 60 17.2±2.7*
干粉给药组 10 120 3 30 18.9±1.9***
10 240 2 20 19.7±0.7***
与空白对照组相比,ΔP>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001