一种使含佐剂的疫苗组合物稳定的方法
阅读：852发布：2023-03-06
专利汇可以提供一种使含佐剂的疫苗组合物稳定的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种使干态的含佐剂的 疫苗 组合物、佐剂化的疫苗组合物稳定的方法，具体地讲，一种使干态的流感疫苗组合物，特别是佐剂化的流感疫苗组合物稳定的方法。，下面是一种使含佐剂的疫苗组合物稳定的方法专利的具体信息内容。
1.一种使疫苗组合物稳定的方法，所述方法包括如下步骤：
-用包含单糖、寡糖和/或糖醇或其混合物的水溶液稀释包含抗原或抗原制剂的液态原液组合物，以获得所得稀释的组合物中单糖、寡糖和/或糖醇含量为2％(w/v)至溶解极限，-使已稀释的组合物制粒，所述制粒为层流射流破碎技术，以形成直径为200μm-1500μm的规则液滴，
-在冷冻剂或低温室中冷冻所述规则液滴，以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，和-干燥所述冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为200μm-1500μm的干态规则球状微丸或颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述疫苗组合物包含佐剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含：
-将包含一种或多种佐剂的水溶液加入所述液态原液抗原组合物，或
-将包含一种或多种佐剂和稳定剂的水溶液加入所述液态原液抗原组合物，其中所述稳定剂包含单糖、寡糖和/或糖醇或其混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括:
-用包含稳定剂的水溶液稀释一种或多种佐剂的独立的液态原液溶液或乳液，其中所述稳定剂包含单糖、寡糖和/或糖醇或其混合物，以获得所得稀释的佐剂溶液或乳液中单糖、寡糖和/或糖醇含量为2％(w/v)至溶解极限，
-使已稀释的佐剂溶液或乳液制粒，所述制粒为层流射流破碎技术，以形成直径为200μm-1500μm的规则液滴，
-在冷冻剂或低温室中冷冻所述规则液滴，以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，-干燥所述冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为200μm-1500μm的干态规则球状微丸或颗粒，和
-与根据权利要求1获得的包含抗原的干态规则球状微丸混合并一起填充到小瓶或其它合适容器中。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述佐剂选自脂质体、脂质和去污胶束、病毒颗粒、蛋白螺旋体、聚合物纳米颗粒和微粒、可溶性聚合物、蛋白颗粒、矿物凝胶、矿物微粒和纳米颗粒、聚合物/铝纳米杂化体、水包油和油包水乳液、皂角苷提取物、细菌细胞壁提取物和天然免疫受体的刺激剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，
-其中所述液态原液组合物包含源自单一病原体或病原体血清型的抗原或抗原制剂，或
-其中所述液态原液组合物包含两种或更多种抗原或抗原制剂，所述各抗原或抗原制剂源自不同的病原体或病原体血清型。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括将两种或更多种微丸或颗粒计量、混合和填充到小瓶或其它合适容器中。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述干燥通过选自如下的方法进行：冻干法、常压冷冻干燥、流化床干燥、真空转鼓干燥、搅拌冷冻干燥、振动冷冻干燥、微波冷冻干燥。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自减毒活和灭活的全病毒，或病毒的抗原组分，所述病毒如脊髓灰质炎、流感病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、甲型和乙型肝炎，全细菌、细菌蛋白或多糖抗原、缀合或非缀合的，如流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌多糖、破伤风、白喉、细胞性和非细胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽热和艰难梭菌。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自源自流感嗜血杆菌的缀合或非缀合的多糖抗原或抗原制剂，和源自艰难梭菌的蛋白抗原或抗原制剂。
11.一种包含一种或多种抗原的稳定的干态疫苗组合物，所述组合物为通过权利要求
1-10中一项或多项的方法获得的直径为200μm-1500μm的干态规则球状微丸或颗粒形式。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中各规则球状微丸或颗粒进一步包含仅一种抗原，或
其中各规则球状微丸或颗粒包含一种或多种不同类型的抗原。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中各规则球状微丸或颗粒还包含佐剂，或其中所述佐剂包含于独立的干态规则球状微丸或颗粒中。
14.一种制备疫苗的方法，所述方法包括在水溶液中将权利要求11-13中的组合物重组的步骤，其中所述水溶液任选包含佐剂。
15.一种制备佐剂的干态规则球状微丸或颗粒的方法，其包括：
-用包含单糖、寡糖和/或糖醇或其混合物的水溶液稀释包含一种或多种佐剂的液态原液佐剂溶液或乳液，以获得所得稀释的佐剂溶液或乳液中单糖、寡糖和/或糖醇含量为2％(w/v)至溶解极限，
-使已稀释的佐剂溶液或乳液制粒，所述制粒为层流射流破碎技术，以形成直径为200μm-1500μm的规则液滴，
-在冷冻剂中或低温室中冷冻所述规则液滴，以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，-干燥所述冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为200μm-1500μm的干态规则球状微丸或颗粒，和
-任选将所述微丸或颗粒填充到小瓶或其它合适容器中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述佐剂选自脂质体、脂质和去污胶束、病毒颗粒、蛋白螺旋体、聚合物纳米颗粒和微粒、可溶性聚合物、蛋白颗粒、矿物凝胶、矿物微粒和纳米颗粒、聚合物/铝纳米杂化体、水包油和油包水乳液、皂角苷提取物、细菌细胞壁提取物和天然免疫受体的刺激剂。
17.一种稳定的干态佐剂组合物，所述组合物为通过权利要求15或16的方法获得的直径为200μm-1500μm的干态规则球状微丸或颗粒形式。
18.一种试剂盒，其包括含有如权利要求17所述的稳定的干态佐剂组合物的容器。
19.一种疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒包括：
-第一容器和第二容器，所述第一容器包含权利要求11-13所述的稳定的干态疫苗组合物，所述第二容器包含用于重组的水溶液；
-第一容器和第二容器，所述第一容器包含权利要求11-13所述的稳定的干态疫苗组合物，所述第二容器包含用于重组的水溶液，所述水溶液包含佐剂；或
-第一容器、第二容器和第三容器，所述第一容器包含权利要求11-13所述的稳定的干态疫苗组合物，所述第二容器包含用于重组的水溶液，所述第三容器包含权利要求17所述的佐剂组合物。
一种使含佐剂的疫苗组合物稳定的方法
技术领域
[0002] 本发明涉及一种使干态的含佐剂的疫苗组合物、佐剂化的疫苗组合物稳定的方法，具体而言，一种使干态的流感疫苗组合物，特别是佐剂化的流感疫苗组合物稳定的方法。
背景技术
[0003] US 3,655,838公开了通过在冷冻剂如液氮中冷冻溶液液滴，随后冻干以获得冻干的含试剂微粒、球珠或冻球(lyosphere)来将分析或免疫试剂制粒的方法。EP 0 081 913 B1描述了通过在惰性液体冷冻剂中冷冻液滴(该惰性液体冷冻剂的密度高于液滴的密度)，然后将冷冻颗粒从该液体冷冻剂表面移走来制备球状冷冻颗粒的方法。WO 94/25005公开了在冻球状促性腺激素的稳定化，一种制备这种冻球的方法及包含所述冻球的药物制剂。EP 0 799 613(US 5,897,852)公开了一种疫苗包，所述疫苗包包括疫苗容器，所述疫苗容器容纳一种或多种含所述疫苗组分的冻干体，所述疫苗组分的至少一种是直径为至少
0.2mm的冻球或微粒。WO 2006/008006(US 2008/0060213)公开了一种制备装填冻干产物的容器的方法，其中所述产物的液滴被冻成小球，所述小球经过冻干、测定并装入所述容器中。已知获得冷冻颗粒或小球的其它技术可用于食品工业(例如US 5,036,673或US 2007/
0281067 A1)。
0.2mm的冻球或微粒。WO 2006/008006(US 2008/0060213)公开了一种制备装填冻干产物的容器的方法，其中所述产物的液滴被冻成小球，所述小球经过冻干、测定并装入所述容器中。已知获得冷冻颗粒或小球的其它技术可用于食品工业(例如US 5,036,673或US 2007/
0281067 A1)。
[0004] 冻干技术能改善许多产品的稳定性，所述产品可为有佐剂或无佐剂的疫苗。例如，EP 0 475 409公开了一种保存含缓冲剂和任选抗冻剂的微观生物材料悬浮液的方法，其通过将所述悬浮液雾化成微液滴，在旋转的低温表面上冷冻所述液滴并干燥所述微液滴。优选所述液滴的直径约小于200μm。
[0005] 已在文献中对流感抗原的冻干进行研究，并有一篇详细的综述(Amorij等人，2008:Development of stable Influenza vaccine powder formulations:challenges and possibilities(稳定的流感疫苗粉末制剂的开发：挑战与前景)，Pharmaceutical Research,Vol 25,1256-1273)。US 3 674 864公开了一种使流感病毒疫苗稳定的方法，其基本上通过将所述病毒悬浮于含蔗糖的水溶液并冻干所得悬浮液进行。也已在文献中讨论了破伤风和白喉类毒素的稳定化( 参见例如S .P .Schwendeman等人，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.92,pp.11234-11238,1995)。最近，已提出了使破伤风类毒素冻干的优化制剂(P.Matejtschuk等人，Biologicals 37(2009)1-7)。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.92,pp.11234-11238,1995)。最近，已提出了使破伤风类毒素冻干的优化制剂(P.Matejtschuk等人，Biologicals 37(2009)1-7)。
[0006] 冻干通常是医药工业中的最后步骤，其在装入小瓶、注射器或较大容器的步骤之后。这种情况下，干产品在使用前必须再水合化(此文献中的同义词：再生或溶解)。
[0007] 以微丸的形式冻干使得干态疫苗产品获得与仅进行冻干相同的稳定效果或改善储存稳定性。此外，与现有冻干技术相比，微丸技术具有一些优点，这是由于它能，例如：
[0008] -在填充之前(或通过连续填充)混合干产品
[0009] -在填充之前调节效价(其可用于产品堆积的情况下)
[0010] -使得产品间的相互作用最小化(再水合后仅存在产品相互作用力)，和[0011] -在一些情况下改善稳定性。
[0012] 由于这些原因，微丸技术的优点使得可用以下方法干燥佐剂化的疫苗：
[0013] -将抗原与佐剂一起干燥(在同一阶段)：通过将两者(抗原和佐剂)限制在玻璃状基质中来使它们稳定并使它们之间的相互作用稳定，在所述基质中所有分子运动和化学反应受到严重阻碍。这种固态能在整个储存过程中(甚至在较高温度下)保持所述抗原的功效、所述佐剂的物理和免疫性能及两者之间相互作用的性质和效力。
[0014] -干燥抗原和独立干燥佐剂(抗原和佐剂在不同阶段)，然后在填充前将两者混合或连续填充。一些情况下，在+5℃或更高或更低温度下液态长期储存的单独佐剂的稳定性可能是一个问题(乳液的化学稳定性，铝凝胶、脂质体和其它物质的物理稳定性)。微丸技术能通过产生独立的抗原和佐剂微丸来改善佐剂化的疫苗的稳定性。可独立地优化各抗原和佐剂的稳定制剂。接着，抗原和佐剂的微丸可随后填充到小瓶中或在填充到小瓶中之前混合。独立的固体能在整个储存过程中(甚至在较高温度下)避免抗原和佐剂之间的相互作用，以保持抗原的功效和佐剂的物理和免疫性能。这种结构中，小瓶中的容纳物能比具有液态的抗原或佐剂之一的任何其它结构或抗原和佐剂在同一颗粒中干燥时更稳定。抗原和佐剂之间的相互作用是这样标准化的，正如它们仅在用选定的稀释剂使干组合物再水合后产生，所述稀释剂可包含注射用水、缓冲剂和稳定赋形剂。因此，仅在疫苗再水合和注射之间的短时间内需要控制相互作用。
[0015] 因此，可能通过两种产品干燥的分开改善这两种产品的整体稳定性(各产品配制的优化而不是两者一起的折中)和疫苗本身的稳定性、在储存后和填充之前调节两者之一的效价，以方便制备过程。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明提供了一种使含佐剂的疫苗组合物稳定的方法，所述方法包括如下步骤：用包含稳定剂的水溶液稀释包含抗原或抗原制剂的液态原液组合物，处理稀释的组合物以形成直径接近约200μm-约1500μm的规则液滴，在冷冻剂中冷冻所述规则液滴以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，和干燥所得冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为约200μm-约
1500μm的干态规则球状微丸或颗粒。
1500μm的干态规则球状微丸或颗粒。
[0018] 合适的疫苗组合物有例如包含整个病毒或抗原，如流感病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、甲型和乙型肝炎病毒，整个细菌或细菌蛋白或多糖抗原(缀合或非缀合的)如流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌多糖、破伤风、白喉、细胞性和非细胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽热和艰难梭菌的组合物。
[0019] 可例如实现液滴的冷冻，其中将稀释的组合物，即配制的液体产品制成小球以制得直径为200μm-1500μm、粒度分布非常窄的校准液滴。这些液滴落入低温室，其中通过冷冻剂或通过液氮的直接注入/喷雾或逆流非常冷(T°<-110℃)的气体如氮气、CO2或空气来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻以形成校准冷冻颗粒。
[0020] 获得校准液滴和随后的标准冷冻颗粒的其它技术在本领域中是已知的，如超声波喷雾(Sindayihebura D.,Dobre M.,Bolle L.,1997-Experimental study of thin liquid film ultrasonic atomization(薄液膜超声波喷雾的试验研究).ExHFT'97,Bruxelles.)，或如上所述是食品工业已知的，通过如US 5,036,673中所公开的特定冷冻转鼓。
[0021] 所述方法可还包括将包含一种或多种佐剂和任选稳定剂的水溶液加入所述液态原液抗原组合物中。
[0022] 或者，本发明方法还包括用包含稳定剂的水溶液稀释一种或多种佐剂的独立液态原液溶液或乳液，处理该稀释的佐剂或乳液以形成直径接近约200μm-约1500μm的规则液滴，在冷冻剂中冷冻所得规则液滴以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，干燥所得冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为约200μm-约1500μm的干态规则球状微丸或颗粒，及与含抗原的干态规则球状微丸混合并一起填充到小瓶或其它合适容器中。
[0023] 所述液态原液组合物可还包含一种或多种其它抗原或抗原制剂，所述各抗原或抗原制剂源自一种不同的病原体或不同病原体血清型，以获得干态规则球状微丸或颗粒，各微丸或颗粒包含源自两种或更多种不同病原体或不同病原体血清型的两种或更多种抗原或抗原制剂。
[0024] 或者，所述液态原液组合物包含源自一种单一病原体或单一病原体血清型的抗原或抗原制剂，以获得干态规则球状微丸或颗粒，各微丸或颗粒包含源自相同病原体或相同病原体血清型的抗原或抗原制剂。这种情况下，所述方法可任选还包括将两种或更多种干态规则球状微丸或颗粒计量、混合和填充到小瓶或其它合适容器中，其特征在于各种微丸包含源自两种或更多种不同病原体或不同病原体血清型的抗原或抗原制剂。
[0026] 有利的是，所述稳定剂包括单糖如甘露糖，寡糖如蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖，或糖醇如山梨糖醇、甘露糖醇或肌醇，或两种或更多种不同的这些上述稳定剂的混合物，如蔗糖和海藻糖的混合物。
[0027] 有利的是，糖、糖醇和稳定赋形剂的浓度为2％(w/v)至配制的液体产品中的溶解极限。一般而言，糖、糖醇和稳定赋形剂的浓度为5％(w/v)-40％(w/v)，5％(w/v)-20％(w/v)或20％(w/v)-40％(w/v)。包含例如破伤风或白喉类毒素和铝凝胶(AlOOH)的配制液体产品中蔗糖和海藻糖的1:1混合物的浓度实例分别为18.1％(w/v)和17.5％(w/v)。
[0028] 本发明具体涉及一种使流感疫苗组合物稳定的方法，所述方法包括如下步骤：用包含糖和/或糖醇或两种或更多种不同糖和/或糖醇的混合物的水溶液稀释包含源自季节性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制剂的液态原液组合物以获得所得稀释的组合物中糖和/或糖醇含量为2％(w/v)至溶解极限，处理已稀释的组合物以形成直径接近约200μm-约1500μm的规则液滴，在冷冻剂中冷冻所得规则液滴以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，和干燥所述冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为约200μm-约1500μm的干态规则球状微丸或颗粒。
[0029] 包含源自季节性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制剂的液态原液组合物可通过US 6,048,537(WO 96/05294)中公开的方法获得。
[0030] 所述干燥有利地通过冻干法(即冰的升华和结合水的解吸附)进行。冷冻微丸的其它合适干燥方法有常压冷冻干燥、流化床干燥、真空转鼓干燥、搅拌冷冻干燥、振动冷冻干燥和微波冷冻干燥。
[0031] 有利的是，所述糖为二糖，特别是蔗糖。同样合适的二糖有，例如乳糖、麦芽糖或海藻糖。同样适合于使所述流感疫苗组合物稳定的有单糖，如甘露糖，或糖醇如山梨糖醇、肌醇或甘露糖醇。
[0032] 有利的是，所配制的液体产品中所述糖或糖醇的浓度为5％-40％(w/v)，或者5％-20％(w/v)或20％-40％。所配制的液体产品中例如蔗糖的浓度的实例为2％(w/v)、10％(w/v)或15.4％(w/v)。
[0033] 所述液态原液组合物可还包含一种或多种其它流感抗原或抗原制剂，各抗原或抗原制剂源自不同的季节性、大流行前或流行的流感病毒株，以获得干态规则球状微丸或颗粒，各微丸或颗粒包含源自两种或更多种不同的季节性、大流行前或流行的流感病毒株的两种或更多种流感抗原或抗原制剂。这种情况下，所述方法任选还包括将所述干态规则球状微丸或颗粒计量和填充到小瓶或其它合适容器中。
[0034] 或者，所述液态原液组合物包含一种或多种源自季节性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制剂，以获得干态规则球状微丸或颗粒，各微丸或颗粒包含源自相同的季节性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制剂。这种情况下，所述方法可任选还包括将两种或更多种干态规则球状微丸或颗粒计量、混合并填充到小瓶或其它合适容器中，特征在于各种微丸包含源自不同于另一种的季节性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制剂。
[0035] 所述方法任选还包括将包含一种或多种佐剂和任选稳定剂的水溶液加入所述液态原液抗原组合物中。
[0036] 或者，本发明方法还包括用包含稳定剂的水溶液稀释一种或多种佐剂的独立的液态原液溶液或乳液，处理已稀释的佐剂溶液或乳液以形成直径接近约200μm-约1500μm的规则液滴，在冷冻剂中冷冻所得规则液滴以形成冷冻的规则球状微丸或颗粒，干燥所述冷冻的规则球状微丸或颗粒以形成直径为约200μm-约1500μm的干态规则球状微丸或颗粒，和与包含抗原的干态规则球状微丸一起混合并填充到小瓶或其它合适容器中。
[0037] 特别合适的佐剂有，例如脂质体、脂质或去污胶束或其它脂质颗粒、聚合物纳米颗粒或微粒、可溶性聚合物、蛋白颗粒、矿物凝胶、矿物微粒或纳米颗粒、聚合物/铝纳米杂化体、水包油或油包水乳液、皂角苷提取物、细菌细胞壁提取物、天然免疫受体的刺激剂，特别是天然或合成TLR激动剂、天然或合成NOD激动剂和天然或合成RIG激动剂。用于本发明方法的合适佐剂例如WO 2007/006939中公开的那种。
[0038] 所述流感病毒株为，例如H5N1、H9N2、H7N7、H2N2、H7N1和H1N1(Emergence of multiple genotypes of H5N1avian influenza viruses in Hong Kong SAR(香港特别行政区出现多种基因型H5N1禽流感):Y Guan等人，8950–8955,PNAS-June 25,2002-vol 99n°13；H9N2Influenza A Viruses from Poultry in Asia have Human Virus-like Receptor Specificity(来自亚洲家禽的H9N2A型流感病毒具有人病毒样受体特异性):MN Matrosovich,S Krauss和R Webster,Virology 281,156-162(2001)；Evolution and Ecology of Influenza A Viruses(A型流感病毒的演化和生态):R Webster等人，Microbiological ReviewsMar 1992,p.152–179)。或者，它可为选自季节性流感病毒株群的流感株。
[0039] 所述流感抗原可为选自纯化的全流感病毒、灭活的流感病毒或流感病毒的亚单位组分或片段流感病毒的形式。
[0040] 所述流感抗原可来自细胞培养。或者，所述流感抗原产于胚蛋中。
[0041] 本发明还涉及稳定的干态疫苗组合物，特别是可通过本发明方法获得的直径为约200μm-约1500μm的干态规则球状微丸或颗粒形式的稳定干态流感疫苗组合物或包含其它抗原的稳定干态疫苗组合物，所述其它抗原如灭活的全病毒或病毒的抗原组分、流感病毒、轮状病毒、巨细胞病毒和甲型和乙型肝炎，和全细菌或细菌蛋白或多糖抗原、缀合或非缀合的，如流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌性多糖、破伤风、白喉、细胞性和非细胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽热、艰难梭菌。
[0042] 有利的是，各规则球珠或颗粒包含仅一种抗原，例如源自仅一种流感病毒株的一种或多种流感抗原，或例如仅破伤风或仅白喉抗原。或者，各规则球珠或颗粒包含一种或多种抗原，例如源自一种或多种不同流感病毒株的流感抗原，或例如破伤风和白喉抗原。
[0043] 所述组合物可还包含佐剂，所述佐剂任选包含于独立的干态规则球状微丸或颗粒中。
[0044] 本发明还涉及制备疫苗的方法，所述方法包括干态规则球状微丸或颗粒形式的稳定的干态疫苗组合物，例如上述稳定的干态流感疫苗组合物在水溶液中重组的步骤。所述水溶液可任选包含佐剂。
[0045] 本发明还涉及疫苗试剂盒，包括包含干态规则球状微丸或颗粒形式的稳定的干态疫苗组合物例如稳定的干态流感疫苗组合物的第一容器和包含用于所述疫苗重组的水溶液的第二容器。所述试剂盒可还包括包含干态规则球状微丸或颗粒的容器，所述微丸或颗粒中包含佐剂。或者，所述水溶液包含佐剂。
[0046] 本发明还涉及储存稳定的干态原液抗原的方法，其中所述抗原首先通过上述方法使之稳定化，所得稳定的干态疫苗组合物(例如流感、白喉或破伤风疫苗组合物)用足够的溶剂重组并任选在以直径为约200μm-约1500μm的干态规则球状微丸或颗粒形式储存后、将液体填充到小瓶或注射器之前配制。附图说明
[0047] 图1所示为一般配制和干燥步骤流程图。
[0048] 图2所示为疫苗微丸的造粒、冷冻、干燥和填充。
[0049] 图3所示为包括佐剂的一般配制、冷冻和干燥步骤流程图。
[0050] 图4所示为抗原微丸的生产。
[0051] 图5所示为佐剂微丸的生产。
[0052] 图6所示为不同的微丸组合成完整的干态疫苗。
[0053] 图7所示为实施例1中所述的配制和干燥步骤的流程图。
[0054] 图8所示为实施例1中获得微丸的狭窄粒度分布。
[0055] 图9所示为采用微丸技术在糖存在下磷酸铝凝胶干燥后的粒径分布结果图。干燥之前(黑色曲线，右)和以微丸形式干燥并再水合后(灰色曲线，左)磷酸铝凝胶的粒度分布。没有观察到聚集迹象。DLS测定。
[0056] 图10所示为实施例2中所述的配制和干燥步骤的流程图。
[0058] 图12所示为：在37℃、45℃和55℃下热稳定孵育至少7天并用WFI溶解后氢氧化正铝凝胶的粒度。
[0059] 图13所示为用SG1稳定剂作为实例的配制和干燥步骤原理的流程图。
[0060] 图14所示为微丸再水合之前(红色曲线)和微丸溶解之后(绿色曲线)乳液的粒度比较。
[0061] 图15所示为微丸溶解后乳液在室温下的粒度稳定性。刚溶解后和溶解7、15、30、45和60min后乳液粒度分布曲线完全重合。
[0062] 图16所示为实施例4a所得微丸的配制和干燥步骤的流程图。
[0063] 图17所示为在铝凝胶存在下包含白喉Dt或破伤风Tt的待干燥配制液体产品与稳定剂混合获得的两种制剂的配制和干燥步骤的流程图。
[0064] 图18所示为不含铝凝胶、包含白喉Dt或破伤风Tt的待干燥配制液体产品与稳定剂混合获得的两种制剂的配制和干燥步骤的流程图。
[0065] 图19所示为仅含铝凝胶的待干燥配制液态产品和稳定剂混合获得的制剂的配制和干燥步骤的流程图。具体实施方案
[0066] 下面对本发明微丸状干疫苗的热稳定化方法进行更详细解释。
[0067] 为了通过微丸技术进行处理，需要配制生物物质如抗原以保护其免受所述处理过程中经受的物理和化学应力影响。
[0068] 待干燥的配制液体产品通过如下方法获得：将浓缩的疫苗原液(包含抗原)和包含至少一种糖和/或糖醇的稳定化制剂混合，使得获得的配制液体产品每ml包含目标量的稳定赋形剂和抗原。糖、糖醇和稳定化赋形剂的浓度为2％(w/v)至在配制液体产品中的溶解极限。例如，20℃下蔗糖在水中的溶解极限的浓度为约66.7％(w/v)。
[0069] 图1显示了一般配制和干燥步骤流程图。
[0070] 图2中所述的过程用于产生干态微丸。
[0071] 制粒，也就是已知的层流射流破碎(jet break-up)技术，是通常用于生物催化剂和活细胞固定化领域中产生液体的校准液滴(calibrated droplet)的众所周知的技术(Hulst等人，1985.A new technique for the production of immobilized biocatalyst andlarge quantities(大量生产固定化的生物催化剂的新技术).Biotechnol.Bioeng.27,870-876；Gotoh等人，1993.Mass production of biocatalyst-entrapping alginate gel particles by a forced oscillation method(通过受迫振荡法大规模生产生物催化剂包埋海藻盐凝胶颗粒).Chem.Eng.Commun.120,73-84.；Seifert和Philips,1997.Production of small,monodispersed alginate beads for cell immobilization(用于细胞固定化的单分散海藻盐小珠的生产).Biotechnol.Prog.13,562-568)。Lord Rayleigh是分析牛顿流体从喷嘴出来的毛细管射流的不稳定性并提出描述它的模型的第一人(Rayleigh L,
1978.On the stability of jets(关于射流稳定性).Proc.London Math.Soc.10,4-13)。
W e b e r( W e b e r C ,1 9 3 1 .Z u m Z e r f a l l e i n e s F l üssigkeitsstrahles.Z.Angew.Math.Mech.11,136-154)拓展了该分析，包括粘度的影响。最快增长扰动和射流间断的最佳波长通过下式给出：
1978.On the stability of jets(关于射流稳定性).Proc.London Math.Soc.10,4-13)。
W e b e r( W e b e r C ,1 9 3 1 .Z u m Z e r f a l l e i n e s F l üssigkeitsstrahles.Z.Angew.Math.Mech.11,136-154)拓展了该分析，包括粘度的影响。最快增长扰动和射流间断的最佳波长通过下式给出：
[0072]
[0073] 其中λopt是射流破碎的最佳波长，dj是射流直径，η是流体粘度，ρ是流体密度而σ是流体表面张力。形成的液滴的直径d可通过下式计算：
[0074]
[0075] 用于流体以获得所需结果的频率f与射流速度(以及因此流体的流速)uj和波长的关系为：
[0076]
[0077] 因此，如果知道处理参数和流体特征，则可计算最佳条件。然而，根据喷嘴直径、流体的流变学和表面张力，存在大范围的频率和射流速度来形成均匀液滴(Meesters G.,1992.Mechanisms of droplet formation(液滴形成机理).Delft University Press,Delft,NL)。合适的工作频率也可通过视觉评价液滴形成的稳定性来实验地确定。标准的制粒设备装备有闪光灯频闪观测仪以观察液滴形成：就给定产品和给定工作条件而言，可手动调节频率直到用频闪闪光灯光观察到稳定而静止的液滴链。
[0078] 此外，已为无菌造粒应用开发多喷嘴系统(Brandenberger H.等人，1998.A new multinozzle encapsulation/immobilization system to produce uniform beads of alginates(用于生产海藻盐均匀珠的新型多喷嘴封装/固定化系统).J.Biotechnol.63,73-80)。
[0079] 总之，可根据现有工具和产品知识从理论上和实验上确定工作频率。
[0080] 所述造粒法适合于粘性液体和饱和的糖溶液。现有供应商的最大可接受粘度接近300mPa.s。因此，制剂浓度可为非常低的浓度至室温或处理温度下选定赋形剂的溶解极限。
此外，必须控制处理管和喷嘴中的温度以避免糖或溶剂在液滴形成之前结晶。制剂领域中的技术人员会考虑赋形剂之间的最终相互作用来调节产品中不同赋形剂浓度以免超出给定限度的未控制结晶和粘度。
此外，必须控制处理管和喷嘴中的温度以避免糖或溶剂在液滴形成之前结晶。制剂领域中的技术人员会考虑赋形剂之间的最终相互作用来调节产品中不同赋形剂浓度以免超出给定限度的未控制结晶和粘度。
[0081] 将配制液体产品造粒以产生直径为200μm-1500μm、粒径分布非常窄的校准液滴。这些液滴落入低温室中，其中通过液氮的直接注入/喷雾或使非常冷(T°<-110℃)的气体如氮气、CO2或空气逆流来将温度保持在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻以形成校准冷冻颗粒。冷冻液滴(即固化小球的冰晶形成)的最低落下高度可通过限制超冷来最小化。
超冷可通过直接接触液氮雾或液滴(在所述室内直接注入液氮)或采用微观冰晶(冷室中水或超热蒸汽的直接雾化)将冰核植入液滴中来降低。
超冷可通过直接接触液氮雾或液滴(在所述室内直接注入液氮)或采用微观冰晶(冷室中水或超热蒸汽的直接雾化)将冰核植入液滴中来降低。
[0082] 然后收集这些冷冻颗粒并转移到-50℃预冷盘上，放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上以一直保持冷冻小球低于其低温浓缩相的玻璃化转变Tg’(Tg’值可为-10℃至-45℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动本领域技术水平已知的小球常规冻干(冰的升华)。以下冻干参数是可用于Tg’为-30℃至-45℃的制剂的冻干参数实例：
[0083] 第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。
[0084] 第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。
[0085] 必须设计冷冻干燥循环以使得残留水分优选低于3％。然而，根据具体情况，如果干态抗原的稳定需要，水分含量可在较高值优化。
[0086] 其它干燥技术如常压冷冻干燥、流化床干燥、真空转鼓干燥、搅拌冷冻干燥、振动冷冻干燥、微波冷冻干燥可用于干燥小球。
[0087] 接着收集原液干态小球以进行分析和储存。储存条件适合于干态易脆的吸湿性颗粒。在分析之前用稀释剂将干样品再水合化，所述稀释剂可包含注射用水、缓冲剂、稳定赋形剂和佐剂。立刻溶解。
[0088] 然后采用干粉填充技术将原液干态小球填充到目前市场上出售的小瓶中。
[0089] 同样，从储存稳定的干态抗原原液来看，可在将液体填充到小瓶或注射器之前将小球与足够溶剂重组并配制(如果需要)。由于这种小球的稳定性，囤积物的储存可在+5℃或更高温度进行，该温度比冷冻液体材料的温度(-20℃或更低)更方便。最后，储存干态原液材料比在最终容器中储存填充的干态产品占用空间少很多。
[0090] 如果是佐剂化的疫苗，当抗原和佐剂都是液态时，+5℃或更高和更低(冷冻)温度下储存时的稳定性常常是个问题。例如，下表描述了通过动态光散射测定的-20℃下的冻融循环对氧羟基铝凝胶的影响：
[0091]
[0092] 根据具体情况，所述微丸技术通过三种不同策略能克服稳定性问题：
[0093] 1.单独干燥微丸状的抗原并用佐剂(铝凝胶、乳液等)溶解于稀释剂中。当抗原稳定性在微丸形式下得到提高时和单独佐剂是高度热稳定的时，这个策略是适合的[0094] --->保存期内无相互作用
[0095] -->当独立储存时各相的稳定性提高
[0096] -->通过用液态佐剂临时溶解干态抗原使得吸附行为标准化
[0097] 2.干燥抗原和佐剂以在同一小球中使两者稳定并通过将它们限制在玻璃态基质中使它们之间的相互作用稳定，在所述基质中所有分子运动和化学反应大受阻碍。该固态能在整个储存过程中(甚至在较高温度下)保持抗原的功效、佐剂的物理和免疫性能及两者之间相互作用的性质和效力。
[0098] 3.干燥抗原和独立干燥佐剂，然后在填充之前将两者混合或连续填充。有些情况下，单独佐剂在+5℃或更高温度下以液态长期储存时的稳定性可能成为问题(乳液的化学稳定性，铝凝胶、脂质体和其它物质的物理稳定性)。微丸技术能通过产生独立的抗原和佐剂微丸来改善佐剂化的疫苗的稳定性。各抗原和佐剂的稳定化制剂可独立地优化。接着可将抗原和佐剂微丸填充到小瓶中。独立的固态能避免储存过程中(甚至在较高温度下)抗原和佐剂之间的相互作用，以保持抗原的功效和佐剂的物理和免疫性能。这种结构中，小瓶中的容纳物比具有抗原之一或在液态佐剂中的任何其它结构或抗原和佐剂在同一颗粒中干燥时更稳定。抗原和佐剂之间的相互作用是这样标准化的，正如它们仅在用选定的稀释剂使干组合物再水合后产生，所述稀释剂可包含注射用水、缓冲剂和稳定赋形剂。因此，仅在再水合和疫苗注射之间的短时间(快的相互作用和非常短的老化时间)内存在相互作用。因此，可能通过两种产品干燥的分开来改善这两种产品的整体稳定性(各产品配制的优化而不是两者在一起的折中)和疫苗本身的稳定性、在储存后调节两者之一的效价，以方便制备过程。
[0099] 为了用微丸技术进行处理，需要配制生物物质如抗原和佐剂以保护它们免受处理过程中的物理和化学应力的影响。
[0100] 如果是佐剂，稳定化制剂必须保持它们在加工(配制、造粒、干燥、储存、填充和再水合)过程中的质量。
[0101] 如果所述策略是在相同微丸中干燥抗原和佐剂，待干燥的配制液体产品通过如下方法获得：将浓缩的疫苗原液(包含抗原)、浓缩的佐剂原液和包含至少一种糖和/或糖醇的稳定化制剂混合，使得获得的配制液体产品包含每ml目标量的稳定赋形剂、佐剂和抗原。稳定赋形剂的浓度为2％(w/v)至在配制液体产品中的溶解极限。
[0102] 图3所示为包括佐剂的配制和干燥步骤流程图。
[0103] 如果所述策略是在独立的微丸中干燥抗原和佐剂，待干燥的配制液体产品(包含抗原)通过如下方法获得：将浓缩的疫苗原液(包含抗原)和稳定化制剂混合，使得获得的配制液体产品包含每ml目标量的稳定赋形剂和抗原。糖和稳定赋形剂的浓度为2％(w/v)至在配制液体产品中的溶解极限。
[0104] 对佐剂的方式相同，待干燥的配制液体产品通过如下方法获得：将浓缩的佐剂原液与稳定化制剂混合，使得获得的配制液体产品包含每ml目标量的稳定赋形剂和佐剂。糖和稳定赋形剂的浓度为2％(w/v)至在配制液体产品中的溶解极限。
[0105] 图4所示为制备含抗原的微丸的配制和干燥步骤流程图，图5所示为制备含佐剂的微丸的配制和干燥步骤流程图。图6显示了不同微丸的结合以得到干态疫苗。
[0106] 产生干态微丸的一般过程显示于图2中。它可独立于选定的佐剂化的疫苗策略而应用。
[0107] 微丸技术的快速冷冻机理也适合于干燥佐剂。例如，图9显示了采用微丸技术在糖存在下磷酸铝凝胶干燥后的粒径分布结果图。可以看出：干燥和再水合对佐剂颗粒的粒度分布无明显负面影响。
[0108] 可考虑的合适佐剂示例如下：
[0109] 1)微粒状佐剂如脂质体，特别是阳离子脂质体(如DC-Chol，参见例如US 2006/0165717、DOTAP、DDAB和1,2-二链烷酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EthylPC)脂质体，参见US 7,344,720)、脂质或去污胶束或其它脂质颗粒(例如产自CSL或Isconova的Iscomatrix、病毒颗粒和蛋白螺旋体(proteocochleate)、聚合物纳米颗粒或微粒(例如PLGA和PLA纳米颗粒或微粒、PCPP颗粒、藻酸盐/壳聚糖颗粒)或可溶聚合物(例如PCPP、壳聚糖)、蛋白颗粒如奈瑟菌属脑膜炎球菌蛋白体、矿物凝胶(标准铝佐剂：AlOOH,AlPO4)、微粒或纳米颗粒(例如Ca3(PO4)2)、聚合物/铝纳米杂化体(例如PMAA-PEG/AlOOH和PMAA-PEG/AlPO4纳米颗粒)O/W乳液(例如产自Novartis的MF59、产自GlaxoSmithKline Biologicals的AS03)和W/O乳液(例如产自Seppic的ISA51和ISA720，或WO 2008/009309中公开的)。例如，适用于本发明方法的佐剂乳液为WO 2007/006939中所公开的。
[0110] 2)天然提取物如：皂角苷提取物QS21及其半合成衍生物如Avantogen开发的那些、细菌细胞壁提取物(例如Corixa/GSK开发的micobacterium细胞壁骨架和micobaterium索状因子及其合成衍生物、海藻糖二酶菌酸)。
[0111] 3)天然免疫受体的刺激剂如：天然或合成TLR激动剂(例如刺激TLR2/1或TLR2/6杂二聚体的合成脂肽、刺激TLR3的双链RNA、刺激TLR4的LPS及其衍生物、刺激TLR4的E6020和RC-529、刺激TLR5的鞭毛蛋白、刺激TLR7和/或TLR8的单链RNA和3M’的合成咪唑喹啉、刺激TLR9的CpGDNA、天然或合成NOD激动剂(例如胞壁酰二肽)、天然或合成RIG激动剂(例如病毒核酸，特别是3'磷酸盐RNA)。
[0112] 这些佐剂可组合使用。优选的组合为微粒状佐剂与天然提取物之间的组合和微粒状佐剂与天然免疫受体的刺激剂之间的组合。
[0113] 就下面的实施例而言，采用产自Inotech(CH)的造粒装置IE-50R Encapsulator Research和300μm喷嘴头制备微丸。
[0114] 实施例1：微丸形式的含流感(Flu)抗原的热稳定干态疫苗的制备
[0115] 此研究将现有液态三价流感疫苗与用微丸技术加工的相同疫苗的干态制剂的热稳定性进行了比较。三价流感疫苗在疫苗缓冲剂中包含30μg/mlA/Salomon、B/Malaysia和A/Wisconsin株。通过将一体积的三价流感疫苗和一体积的包含至少一种糖的稳定化制剂混合获得待干燥的配制液体产品，所述糖的浓度为4％(w/v)至溶解极限。这对应于待干燥的配制液体产品中2％-32％(重量/体积)的浓度范围。对两种制剂SG1和SG2进行了评估，所述制剂的组成列于表1和2中：
[0116] 表1
[0117]
[0118] 表2
[0119]
[0120] 图7显示了配制和干燥步骤的流程图。
[0121] 图2显示了用于产生制剂SG1和SG2的干态微丸的方法。
[0122] 将配制的液态产品SG1和SG2造粒以产生校准液滴。该制剂和300μm喷嘴头的造粒参数为：
[0123] -产品流速：8ml/min
[0124] -喷嘴频率：954Hz
[0125] 这些液滴落入低温室内，其中通过液氮的直接注入/喷雾或使非常冷(t°<-110℃)的气体逆流来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻并形成校准冷冻颗粒。
[0126] 然后将这些冷冻颗粒转移到-50℃预冷盘上，并放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上以一直保持冷冻小球低于其玻璃化转变(其估计为-30℃至-40℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动本领域技术水平已知的小球常规冻干。针对这些制剂，采用以下冻干参数：第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。SG1和SG2制剂的所得微丸的残留水分低于2％。
[0127] 图8给出了采用这种造粒和干燥技术获得的非常窄的粒度分布的概念。
[0128] 从而，有3种产品用于热稳定性研究：市售的三价流感疫苗( Sanofi Pasteur)、干态微丸SG1制剂(三价流感疫苗)和干态微丸SG2制剂(三价流感疫苗)。
[0129] 将这3种制剂的各样品在37℃和45℃下暴露不同时间。然后通过SRD(SRID)法(M.S.Williams,Veterinary Microbiology,37(1993)253-262)测定各样品功效(μg抗原/ml)。在分析前采用注射用水使干态样品再水合。立刻溶解。表3、4和5汇总了所得结果。结果表示为抗原的平均值μg/ml。
[0130] 表3
[0131] A/Salomon
[0132]
[0133]
[0134] 表4
[0135] B/Malaysia
[0136]
[0137]
[0138] 表5
[0139] A/Wisconsin
[0140]
[0141]
[0142] 这些结果表明：微丸形式的干态制剂SG1和SG2比现有液态制剂更加稳定。37℃下3个月和45℃下1周后没有测到明显的抗原性损失。
[0143] 实施例2：微丸形式的含氢氧化正铝(aluminum oxyhydroxide)凝胶佐剂化的Flu H5N1(印度尼西亚)抗原的热稳定干态疫苗的制备
[0144] 此研究将液态H5N1印度尼西亚流感疫苗与用本发明微丸技术加工的相同疫苗的干态制剂的热稳定性进行了比较。
[0145] 所述疫苗在疫苗缓冲剂中包含65.4μg/ml氢氧化正铝凝胶佐剂化的H5N1印度尼西亚株。
[0146] 通过将一体积的H5N1疫苗和一体积的稳定化制剂SG1混合获得(SG1的组成参见实施例1)待干燥的配制液体产品。
[0147] 图10显示了配制和干燥步骤的流程图。
[0148] 将配制液态产品SG1造粒以产生校准液滴。该制剂和300μm喷嘴头的造粒参数为：
[0149] -产品流速:8ml/min
[0150] -喷嘴频率：916Hz
[0151] 这些液滴落入低温室内，其中通过液氮的直接注入或使非常冷的气体(t°<-110℃)逆流来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻并形成校准冷冻颗粒。
[0152] 然后将这些冷冻颗粒转移到-50℃预冷盘上并放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上以一直保持冷冻小球低于其玻璃化转变(其估计为-30℃至-40℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动本领域技术水平已知的小球常规冻干。针对这些制剂，采用以下冻干参数：第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。所得微丸的残留水分低于2％。
[0153] 将微丸样品暴露在37℃和45℃下7天。然后通过SRD法测定功效(μg抗原/ml)。在分析前采用注射用水使干态样品再水合。立刻溶解。表6汇总了所得结果。结果表示为抗原的平均值μg/ml；N.D.表示“检测不到的抗原性”。
[0154] 表6
[0155]
[0156] 这些结果表明：微丸形式的干态制剂SG1比现有液态制剂更稳定。37℃下和45℃下1周后没有测到明显的抗原性损失。55℃下一周后观察到接近15％的损失，所述值接近该分析本身的精度。
[0157] 通过采用粒度分析仪Malvern MasterSizer 2000测定小球干燥前、溶解后配制的原液中氢氧化正铝的粒度分布来评价该干燥过程和小球的再水合对佐剂性能的影响。结果显示于图11中。我们观察到此过程没有引起凝胶的聚集。
[0158] 图12也表明：在37℃、45℃和55℃下热稳定孵育至少7天后，凝胶大小得以保持，展示了微丸形式铝凝胶佐剂的稳定性。
[0159] 本实施例证实了该技术可用于铝凝胶佐剂化的流感抗原，更广泛而言，证实了采用微丸技术干燥铝凝胶佐剂化的抗原的可行性。
[0160] 实施例3：微丸形式的含未佐剂化的流感H5N1(印度尼西亚)抗原的热稳定干态疫苗的制备和用佐剂乳液进行再水合
[0161] 此研究将液态H5N1印度尼西亚流感疫苗与用微丸技术加工的相同疫苗的干态制剂的热稳定性进行了比较。
[0162] 所述疫苗在疫苗缓冲剂中包含176μg/ml H5N1印度尼西亚株。
[0163] 通过将H5N1疫苗和稳定化制剂SG1混合获得待干燥的配制液体产品，以得到所需抗原浓度和稳定剂含量。对制剂SG1进行评价(SG1的组成参见实施例1)。
[0164] 图13显示了配制和干燥步骤的流程图。
[0165] 将配制液态产品造粒以产生校准液滴。该制剂和300μm喷嘴头的造粒参数为：
[0166] -产品流速：8ml/min
[0167] -喷嘴频率：997Hz
[0168] 这些液滴落入低温室内，其中通过液氮的直接注入或使非常冷的气体(t°<-110℃)逆流来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻并形成校准冷冻颗粒。
[0169] 然后将这些冷冻颗粒转移到-50℃预冷盘上并放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上以一直保持冷冻小球低于其玻璃化转变(其估计为-30℃至-40℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动本领域技术水平已知的小球常规冻干。针对这些制剂，采用以下冻干参数：第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。所得微丸的残留水分低于2％。
[0170] 平行地，制备相同的配制产品，填充到小瓶中并在标准冻干机中正常冻干。将填充好的小瓶放在5℃的预冷搁板上；然后以1℃/min的速度将产品冷冻到-50℃并抽真空以开始升华。第一次干燥参数为：搁板温度等于-18℃，压力等于50μbars，16小时。第二次干燥参数：搁板温度等于37℃，压力等于50μbars，2小时。
[0171] 所得冻干产品的残留水分也低于2％。
[0172] 将微丸和液态样品在37℃、45℃和55℃下暴露不同时间。将冻干样品暴露在37℃和55℃。然后通过SRD法测定各样品的功效(μg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干态样品再水合。立刻溶解。表7、8和9汇总了标准液态制剂、干态微丸和冻干产品的所得结果。结果表示为抗原的平均值μg/ml；To时的起始SRD效价对应加工后微丸重组后的测定效价。
[0173] 表7
[0174]
[0175] 表8
[0176]
[0177] 表9
[0178]
[0179] 这些结果表明：微丸形式的干态制剂SG1比现有液态制剂更稳定。37℃、45℃和55℃下3个月后没有测到明显的抗原性损失。表9中给出的结果证实了标准冻干也提供了良好的热稳定性。
[0180] 此外，表10中给出的数据表明：+5℃下9个月后没有测到抗原性损失。这些结果对于+5℃下和室温下在几年时间内的长期稳定性非常有希望。
[0181] 已对用乳液使H5N1微丸再水合的可行性进行了研究。用于此研究的乳液为专利申请WO 2007/006939中描述的那种。进行与表8中相同的实验计划，所不同的是采用乳液而不是注射用水使样品再水合。结果列于表10和表11中：
[0182] 表10
[0183]
[0184] 表11
[0185]
[0186] 表10证实了用乳液作为佐剂来溶解微丸不会影响抗原的稳定性及其恢复(recovery)。表11证实了在所述微丸热稳定性孵育后该结论也是正确的，因为所有测得的效价与用注射用水溶解后测得的效价相当。
[0187] 图14显示了这些微丸再水合之前和溶解之后乳液粒度的比较。两者粒度分布的重合证实：乳液的粒度及由此其完整性没有被冻干基质的再水合明显地改变。粒度分布保持为单峰并集中在100nm。此外，图15证实了所述微丸溶解并在室温下保存一小时后乳液粒度的稳定性。
[0188] 此研究证实：由于微丸技术，可能采用佐剂作为溶解缓冲剂并在产品保存期间避免佐剂和抗原之间的所有相互作用。
[0189] 实施例4a:微丸形式的含未佐剂化的流感H5N1(印度尼西亚)并用不同糖作为稳定剂的热稳定干态疫苗的制备
[0190] 此研究显示了3种稳定的干态流感疫苗组合物的制备及用微丸技术加工的这些干态组合物的热稳定性，各疫苗组合物包含不同的二糖(分别为海藻糖、乳糖和麦芽糖)。
[0191] 所述疫苗在疫苗缓冲剂中包含131μg/ml H5N1印度尼西亚株。
[0192] 通过将H5N1疫苗分别与稳定化制剂SG5、SG5、SG6和SG7混合获得待干燥的配制的液体产品(参见表12a、12b和12c)，以得到所需抗原浓度和稳定剂含量。
[0193] 表12a
[0194]
[0195] 表12b
[0196]
[0197] 表12c
[0198]
[0199] 图13用SG1稳定剂作为实例显示了配制和干燥步骤原理的流程图。对SG5、SG6和SG7采用了相同的流程以使得造粒之前配制产品中的二糖浓度为15.4％(w/v)。
[0200] 对3种配制的液态产品的每种进行造粒以产生校准液滴。这些制剂和300μm喷嘴头的造粒参数为：
[0201] -产品流速：8ml/min
[0202] -喷嘴频率：根据制剂，994Hz-1001Hz
[0203] 这些液滴落入低温室内，其中通过液氮的直接注入或使非常冷的气体(t°<-110℃)逆流来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻并形成校准冷冻颗粒。
[0204] 然后将这些冷冻颗粒转移到-50℃预冷盘上并放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上，以一直保持冷冻小球低于其玻璃化转变(其估计为-30℃至-40℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动本领域技术水平已知的小球常规冻干。针对这些制剂，采用以下冻干参数：第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。所得微丸的残留水分低于2％。
[0205] 将微丸样品在37℃和55℃下暴露不同时间。然后通过SRD法测定各样品功效(μg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干态样品再水合。立刻溶解。表12d、12e和12f汇总了这3种干态微丸形式组合物各自的所得结果。结果表示为抗原的平均值μg/ml。To时的起始SRD效价对应加工后微丸重组后的测定效价。
[0206] 表12d
[0207]
[0208] 表12e
[0209]
[0210] 表12f
[0211]
[0212] 这些结果证实很多糖赋形剂用作稳定剂的类似稳定性能。
[0213] 实施例4b:微丸形式的含未佐剂化的流感H5N1(印度尼西亚)的热稳定干态疫苗的制备，其中待加工的配制原液中含2％(w/v)蔗糖
[0214] 所述疫苗在疫苗缓冲剂中包含176μg/ml H5N1印度尼西亚株。
[0215] 通过将H5N1疫苗和稳定化制剂SG8混合获得待干燥的配制的液体产品，以得到所需抗原浓度和2％(w/v)的稳定剂含量。表12g显示了稳定化制剂SG8的组成。
[0216] 表12g
[0217]
[0218] 如实施例4a中所述采用含2％w/v蔗糖的配制液态原液(用SG8配制的液态原液)制得微丸。图16显示了配制和干燥步骤的流程图。
[0219] 将微丸样品在37℃和55℃下暴露不同时间。然后通过SRD法测定各样品的功效(μg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干态样品再水合。立刻溶解。表12h显示了该干态微丸的所得结果。结果表示为平均值μg/ml抗原。To时的起始SRD效价对应加工后微丸重组后的测定效价。
[0220] 表12h
[0221]
[0222] 实施例5：微丸加工对佐剂白喉类毒素(Dt)和破伤风类毒素(Tt)疫苗的影响的研究
[0223] 此研究的第一部分评价了预吸附或不预吸附在铝凝胶ALOOH上、以微丸状冻干的破伤风Tt和Dt抗原的稳定性。如下所述制备5种制剂。
[0224] 在铝凝胶存在下包含白喉Dt或破伤风Tt的待干燥配制液体产品通过将给定体积的白喉或破伤风类毒素浓缩原液与稳定剂混合获得，以得到以下组合物：
[0225] -Dt(白喉类毒素)配制产品：200Lf/ml抗原和0.8mg/ml铝凝胶
[0226] -Tt(破伤风类毒素)配制产品：40Lf/ml抗原和0.8mg/ml铝凝胶
[0227] 图17显示了这两种制剂的配制和干燥步骤的流程图。
[0228] 不含铝凝胶、包含白喉Dt或破伤风Tt的待干燥配制液体产品通过将给定体积的白喉或破伤风类毒素浓缩原液与稳定剂混合获得，以得到以下组合物：
[0229] -Dt(白喉类毒素)配制产品：500Lf/ml抗原
[0230] -Tt(破伤风类毒素)配制产品：100Lf/ml抗原
[0231] 图18显示了这两种制剂的配制和干燥步骤的流程图。
[0233] 仅含铝凝胶的待干燥配制液态产品通过将给定体积的铝凝胶和稳定剂混合获得，以得到以下组合物：
[0234] -铝凝胶ALOOH配制产品：2.4mg/ml
[0235] 图19显示了这种制剂的配制和干燥步骤的流程图。
[0236] 用于本实验的稳定剂称为SDT-1，其组成在下表中列出：
[0237] 表13
[0238]
[0239] 将配制的液态产品造粒以产生校准液滴。这些制剂和300μm喷嘴头的造粒参数汇总于下表中：
[0240] 表14
[0241]
[0242] 这些液滴落入低温室内，其中通过液氮的直接注入或使非常冷的气体(t°<-110℃)逆流来保持温度在-110℃以下。所述液滴在落入过程中冷冻并形成校准冷冻颗粒。
[0243] 然后将这些冷冻颗粒转移到-50℃预冷盘上并放置在冻干机(-50℃)的预冷搁板上以一直保持冷冻小球低于其玻璃化转变(其估计为-30℃至-40℃)并避免所述颗粒的任何熔融或聚集。冻干机装载好后，在冻干室内抽真空以启动现有技术水平已知的小球常规冻干。针对这些制剂，采用以下冻干参数：第一次干燥：搁板温度等于-35℃，压力等于50μbars，10小时。第二次干燥：搁板温度等于20℃，压力等于50μbars，3小时。所得微丸的残留水分低于2％。
[0244] 将微丸样品暴露在37℃和55℃。采用火箭免疫电泳法测定各样品的功效(Lf/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干态样品再水合。立刻溶解。白喉类毒素稳定性结果：
[0245] 表15
[0246]
[0247] 这些结果证实了37℃和55℃下长达1个月后无明显损失，3个月后仅约13％损失，这是显著性的界限。此外，含白喉类毒素和铝凝胶的微丸的孵育表明：在所有时间点和所有测试温度，溶解后100％的抗原保持吸附到凝胶上。溶解后凝胶粒度分布的观察稳定性和热稳定性研究显示了与用铝凝胶佐剂化的流感H5N1类似的结果(参见实施例2)。
[0248] 破伤风类毒素稳定性结果：
[0249] 表16
[0250]
[0251] 这些结果证实了：37℃和55℃下长达3个月后无明显损失。此外，含破伤风类毒素和铝凝胶的微丸的孵育表明：在所有时间点和所有测试温度，溶解后100％的抗原保持吸附到凝胶上。溶解后凝胶粒度分布的观察稳定性和热稳定性研究显示了与用铝凝胶佐剂化的流感H5N1类似的结果(参见实施例2)。
[0252] 这些数据证实：微丸法能获得热稳定的干态佐剂化或未佐剂化白喉和破伤风类毒素疫苗，在正确配制时，55℃下保持长达3个月后功效、吸附状态和佐剂质量无明显下降。此外，铝凝胶能成功地采用所述微丸技术冻干，保持相当的粒度分布并避免大块聚集。
[0253] 实施例6：微丸加工对铝凝胶特征：与T(破伤风类毒素)的相互作用的影响的研究[0254] 在本实施例中，采用实施例5中制备的微丸。此研究的目标是评价微丸加工对铝凝胶AlOOH吸附能力的影响。
[0255] 在3ml小瓶中，将0.3mg恒定量的铝凝胶AlOOH(最初为液态或微丸形式)与不同量的破伤风类毒素(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75mg总量，最初也为液态或微丸形式)混合。
[0256] 进行5个实验：
[0257] -系列1：液态铝凝胶AlOOH和原液破伤风类毒素抗原的液态混合物，无稳定剂[0258] -系列2：溶解的铝凝胶AlOOH微丸和原液破伤风类毒素抗原的液态混合物[0259] -系列3：液态铝凝胶AlOOH、原液破伤风类毒素抗原和稳定剂的液态混合物[0260] -系列4：液态铝凝胶AlOOH和溶解的破伤风类毒素微丸的液态混合物[0261] -系列5：溶解的铝凝胶AlOOH微丸和溶解的破伤风类毒素微丸的液态混合物[0262] 在微丸溶解前调节水和稳定剂的含量以获得在所有含稳定剂制剂(系列2-5)中严格相同的再水合溶液。
[0263] 将液态产品混合后，室温下在轮式搅拌器中孵育这些小瓶2小时，然后以3000rpm离心分离5分钟。通过Micro Bradford技术(Bio Rad蛋白测定)确定上清液中的未吸附破伤风类毒素的量。测试各系列样品的破伤风类毒素对照物以进行定量分析。所得结果汇总于下表中：
[0264] 表17
[0265]
[0266] 这些结果证实：稳定剂的存在不会对凝胶的吸附能力产生任何明显负面影响。此外，当用于破伤风类毒素和/或铝凝胶时，考虑所述方法的可变性，微丸加工不会明显影响铝凝胶的吸附能力。
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