线状透明颤菌脂质多糖级分作为刺激皮肤抗菌肽合成试剂的应用
阅读：295发布：2020-05-12
专利汇可以提供线状透明颤菌脂质多糖级分作为刺激皮肤抗菌肽合成试剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及线状透明颤菌脂质多糖级分作为刺激 皮肤 抗菌肽合成 试剂 的应用，还涉及线状透明颤菌的含有其脂质A的特定馏分在刺激皮肤抗菌肽合成的应用。，下面是线状透明颤菌脂质多糖级分作为刺激皮肤抗菌肽合成试剂的应用专利的具体信息内容。
1.具有以下结构的线状透明颤菌的脂质A的用途，(a)通式(I)的化合物：
其中：
AG1表示3-羟基癸酰基基团，
AG2表示3-十二烷酰基氧基癸酰基基团，
其中R表示氢原子或PO(OR’)2基团，R’表示氢原子、直链或支链的、饱和或不饱和的C1-C6的烷基基团、或苯基或苄基基团，并
(b)在上述通式(I)中R表示PO(OH)2的情况下，为通式(I)化合物的无机盐，或通式(I)化合物的伯胺、仲胺或叔胺盐，或通式(I)化合物的磷酸乙醇胺盐，
并应理解当分别存在若干R和R’基团时，它们相同或不同，
用于制备刺激皮肤、粘膜、半粘膜和头皮防御酶的表达或β-防御素-2表达的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，是用于诱导皮肤防御酶的表达。
3.前述任一项权利要求所述的用途，其特征在于将所述提取物局部敷于带或不带体毛的皮肤、头皮、粘膜和/或半粘膜上。
4.前述任一项权利要求所述的用途，其特征在于所述组合物是敷用于哺乳动物。
5.前述任一项权利要求所述的用途，其特征在于所述级分与益生菌和/或益生元结合使用。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述级分与益生菌和益生元结合使用。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于所述的益生菌选自子囊菌例如酵母菌、耶罗维亚酵母菌、克鲁维酵母属、球拟酵母菌、裂殖酵母属、德巴利酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、曲霉菌和青霉菌、和双岐杆菌属的细菌、拟杆菌属、梭菌属、蜜蜂球菌属、丙酸菌属、肠道球菌、乳酸球菌、葡萄球菌、消化链球菌属、芽胞杆菌属、小球菌属、微球菌、白联球菌属、魏斯氏菌属、气球菌属、乳球菌属或乳酸杆菌。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于益生菌选自干酪乳酸杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌或两岐双岐杆菌、短双岐杆菌、长双岐杆菌、动物双岐杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、青春双岐杆菌或假链状双歧杆菌和它们的混合物。
9.如权利要求7或8所述的用途，其特征在于在每克载体的微生物中益生菌的浓度范
3 12 5 10 7 9
围是10-10 cfu，特别是10-10 cfu，更特别是10-10cfu。
10.如权利要求6所述的用途，其特征在于益生元选自果糖寡聚体、菊糖和低聚异麦芽糖。
线状透明颤菌脂质多糖级分作为刺激皮肤抗菌肽合成试剂
的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及含有其脂质A的线状透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)特定级分在刺激皮肤抗菌肽的合成中的作用。
背景技术
[0002] 人类皮肤分为两层，称作浅部的外表皮层，和深层的真皮层。
[0005] 皮肤构成了防止外界攻击的屏障，特别是化学和机械攻击，并且，在该方面，在其中发生一定数量的对抗环境因素(气候、紫外线、烟草、污染等等)和/或无生命因素(例如，举个例子，特定的药物)的防御反应。而且，皮肤是过敏反应的部位，如在接触性湿疹或特应性湿疹中所观察到的那样。
[0007] 这些防御性的肽和蛋白质(包括β-防御素、RNA酶7、牛皮癣素，参见文章“Antimicrobial peptides in human skin”， 等 人。Mechanisms ofepithelialdefense，Chem Immunol Allergy，2005，vol 86 22-41页)由表皮细胞在与活的完整的致病体接触后产生。
[0008] 在正常情况下，该肽产物足以限制皮肤表面微生物的增殖，因此能够防止损伤或感染。
[0009] 然而，当出现这些系统不足以限制细菌增殖的情况，观察到了皮肤和/或上皮粘膜的感染或脓毒症。
[0010] 因此，所有的兴趣都在于无论是局部(干燥皮肤、特应性过敏等等)还是整体(烧伤、外伤、皮肤摩擦、脱皮治疗)，能够刺激该第一天然防御系统以恢复天然内环境稳定，特别是在屏障功能不足的情况是可以理解的。
[0012] 此外，已经知道，大肠杆菌外膜脂多糖(LPS)能够模拟完整细菌的一些活性，以刺激免疫细胞特别是经由“促炎症反应”细胞因子(白介素-1，TNF-α)或其它C-C和CXC趋化因子如IL-8和MCP-1生成的响应，以补充和激活一定的淋巴细胞群。
[0013] 矛盾的是，这些大肠杆菌脂多糖在免疫细胞上有全身性或静脉内活性时，在直接激活皮肤第一防御屏障(即角质层)中，其活性非常低，甚或无活性。因此，它们对诱导对抗微生物的皮肤防御系统是无效的。
[0014] 申请人证实含有非光合的、非生成(non-fruiting)的线状透明颤菌的脂质A的LPS的特定级分能够刺激皮肤角质化细胞抗微生物肽的表达。不同于大肠杆菌，该细菌没有任何致病活性。
[0015] 该特定的LPS级分随后在体外和等量的大肠杆菌(C14-C16)的LPS级分进行比较评估，制备是在相同的条件下并在相同的最终浓度(10μg/ml)，就其可能的特定诱导表皮抗菌肽前体(mRNA)的合成的性质而进行的。
[0016] 结果观察到，令人惊奇和意想不到的是，和大肠杆菌LPS相比，线状透明颤菌的脂质A的特定级分在相同浓度和相同实验条件下，能够更加有效地刺激在皮肤防御系统，特别是抗微生物防御系统运动中的预防性调节功能。
[0018] 具有非特异性免疫促进活性的线状透明颤菌的各种提取物已由申请人描述为具有化妆或药物用途，特别是在皮肤老化标记的治疗中。这是在专利申请EP0604631和EP0765667中的案例，分别用于非生成丝状菌的提取物和富含核糖体的这些细菌的通过离心生物菌体和透析上层得到的级分的获得。
[0019] 专利申请EP 0876813描述了通过培养这些细菌得到的免疫促进剂级分。专利申请WO 94/02158描述了细菌外膜或其级分的用途，特别是LPS级分，由所述的作为刺激免疫系统试剂的外膜得到。
[0020] 最终，专利申请EP 1400237描述了可以是线状透明颤菌总提取物的激活剂，用于改善皮肤对非特异性激活补充效果的抵抗力。
发明内容
[0021] 本发明涉及非光合的、非生成的线状透明颤菌的脂质A作为诱导皮肤抗微生物肽表达的试剂的用途。脂质A是LPS级分的一部分。
[0022] 线状透明颤菌菌株(用ATCC 15551保藏的菌株)目前被申请人用于介入化妆产品的生物菌体的生产。制备该生物菌体的方法包括在含氧无菌介质中，在矿物盐和糖存在下细菌的连续培养；和取样后含细菌的培养介质的离心，由此得到生物菌体，置于细颈瓶中，然后灭菌消毒。连续的操作以及恒定的生长率μ的优点是可以保证生理学状态的恒定。灭菌导致的细胞破裂引起生物菌体向含有细胞膜和凝固蛋白和含有大约70％重量的LPS的沉淀物，和含有细胞质和大约30％重量LPS的上清液中倾析，全部细菌含有(基于干重)大约10％的LPS。均匀的生物菌体在使用前通过搅拌进行重构化。
[0023] 通常，制备LPS级分的方法可以根据已公开出版的常规技术实施。
[0024] 例如，可以采用已知的Westphal等人1952年的技术(苯酚/氯仿/石油醚)，或Galanos等人1969年的技术(苯酚∶水)，或可选择的源自Westphal的技术：Westphal & Jann[Methods Carbohydr Chem.5(1965)83]，Galanos等人的技术[Eur.J.Biochem.9(1969)245]，Ni Eidhin和Mouton[FEMS Microbiol.Lett.110(1993)133]和Nichols的技术[Infect.Immun.62(1994)3753]。
[0025] 所有这些技术都用于提取LPS。尽管如此，这些技术都不能得到纯的级分。
[0026] 要制备包含脂质A的特定级分，根据专利申请WO 2004/062690名为“Novelmethod for isolating endotoxins(分离内毒素的新方法)”的M.Caroff的方法也可以使用。该方法使用异丁酸和氨体积比5/3的摩尔水性溶液混合物，或异丁酸和三乙胺体积比5/3的10％水性溶液混合物，混合物在环境温度下搅拌10分钟，过滤和/或在3000g、4℃下离心
15分钟。减压蒸去残余溶剂。
15分钟。减压蒸去残余溶剂。
[0027] 从线状透明颤菌(EP 1531158)菌株分离得到脂质A。
[0028] Gram的脂质A-细菌是在3-位和3’-位的羟基，和在2-位和2’-位的胺基缩合的葡萄糖胺的二聚体，或多或少不饱和和羟基化的可自身可酯化的在其羟基基团与其它脂肪酸结合的脂肪酸。正是这些脂肪酸允许在细胞外膜固定脂质A，这是磷脂的性能。另外，它们的性能(如C12-C18)和它们在葡萄糖胺的位置确定了脂质A和相应的LPS的生物活性和毒性。
[0029] 根据本发明，脂质A具有下述结构：(a)通式(I)的结构：
[0030]
[0031] 其中：
[0032] AG1表示3-羟基癸酰基基团，
[0033] AG2表示3-十二烷酰基氧基癸酰基基团，
[0034] R表示氢原子或PO(OR’)2基团，R’表示氢原子、直链或支链的饱和或不饱和的C1-C6的烷基基团、或苯基或苄基基团，并
[0035] (b)在上述通式(I)中R表示PO(OH)2的情况下，为通式(I)化合物的无机盐，或通式(I)化合物的伯胺、仲胺或叔胺盐，或通式(I)化合物的磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine)盐，
[0036] 并应理解在存在若干R和R’基团时，它们可以相同或不同。
[0037] 通式(I)化合物的胺盐可以选自单、二和三乙醇胺盐，单、二或三异丙醇胺盐，2-氨基-2-甲基-1-丙醇，2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇和三(羟甲基)氨基甲烷。
[0039] 根据本发明的脂质A是先前描述过的化合物和根据实施例1得到的化合物，从线状透明颤菌或富含脂质A的线状透明颤菌级分如LPS级分中提取的脂质A。
[0040] 根据本发明能够使用的在特定LPS级分中的脂质A的量当然要依赖所用的提取方法，根据本发明的富含脂质A的特定LPS级分包含至少0.01％重量的脂质A。
[0041] 术语“皮肤”意思是身体的全部表面，包括皮肤、粘膜和半粘膜(semi-mucous)、头皮、和它们的附属物(指甲、体毛、头发等等)。
[0042] 术语“抗菌肽”意思是在和微生物致病体接触时由角质化细胞特定表达的肽；这些肽中的一些由 等人在文章“Antimicrobial peptides in human skin”当中描述，包含β-防御素，包括有人类β-防御素-1、人类β-防御素-2、人类β-防御素-3、人类β-防御素-4、cathelicidin LL-37、丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗白细胞蛋白酶、弹力素(elafin)、皮离蛋白(dermcidin)、肾上腺髓质素、嗜中性粒细胞明胶酶关联的lipocalin和RNA酶7。S100 A7(或牛皮癣素)也是这些肽中的一种，具有抗微生物活性，能够干扰细菌致病体的增殖。
[0043] 防御素是对细菌、真菌和病毒具有活性的抗菌肽(Harder J等人的Nature387：861，1997；Frohm M等人的J Biol Chem 272：15258-15263，1997；Gropp R等人的Hum Gene Ther 10：957-964，1999)。这些肽由皮肤角质化细胞和特定的粘膜细胞生成；它们能够破坏目标微生物的膜和/或穿过它们的膜，因而干扰致病微生物细胞内的功能。β-防御素-2和cathelicidin(LL-37)是能够在皮肤内诱导生成的防御素并在皮肤炎症或紧张状态下增加(Harder J等人的Nature 387：861，1997；Frohm M等人的J Biol Chem
272：15258-15263，1997)。目前已经知道超过大约十二种防御素，在基因水平下鉴别为DEFB1；DEFB2；DEFB124；DEFB107；DEFα6；DEFB106；DEFB122；DEFB105；DEFB103；DEFB108；
DEFα4；DEFB125；DEFB124；DEFB104(有时也称作DEFB4)。
272：15258-15263，1997)。目前已经知道超过大约十二种防御素，在基因水平下鉴别为DEFB1；DEFB2；DEFB124；DEFB107；DEFα6；DEFB106；DEFB122；DEFB105；DEFB103；DEFB108；
DEFα4；DEFB125；DEFB124；DEFB104(有时也称作DEFB4)。
[0044] 本发明涉及具有以下结构的线状透明颤菌的脂质A的用途，(a)通式(I)的结构：
[0045]
[0046] 其中：
[0047] AG1表示3-羟基癸酰基基团，
[0048] AG2表示3-十二烷酰基氧基癸酰基基团，
[0049] R表示氢原子或PO(OR’)2基团，R’表示氢原子、直链或支链的饱和或不饱和的C1-C6的烷基基团、或苯基或苄基基团，并
[0050] (b)在上述通式(I)中R表示PO(OH)2的情况下，为通式(I)化合物的无机盐，或通式(I)化合物的伯胺、仲胺或叔胺盐，或通式(I)化合物的磷酸乙醇胺盐，
[0051] 并应理解在存在若干R和R’基团时，它们可以相同或不同，
[0052] 用于制备抑制不希望的微生物，特别是细菌、皮肤菌群的增殖，和/或预防和/或治疗皮肤微生物感染和重复感染。
[0053] 这些感染和重复感染是皮肤疾病，特别是与致病的皮肤微生物的发展有关，这些致病微生物选自细菌，酵母或低等蘑菇(真菌)如下列的细菌例子：金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、梭状芽胞杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、阴道加德纳菌、短小棒状杆菌、克雷伯氏菌属、酿脓链球菌、白色念球菌、糠秕马拉色菌、须疮癣菌、趾间毛癣菌、红色毛癣菌、杨德氏发癣菌(Trichophyton yaoundei)、头癣、体癣、或真菌如曲霉菌。
[0054] 皮肤疾病可以是皮肤病学的感染并发症，特别是痤疮；愈合中的感染并发症；皮肤真菌病；念球菌病；阴道病；甲癣病；头癣、体癣；与抗生素或抗真菌剂治疗有关的或由激素紊乱引起的皮肤病；皮炎；丹毒；脂溢性皮炎。
[0055] 特别是，重复感染可以是：
[0056] -重复感染的特应性皮炎，传染性湿疹样皮炎，重复感染的炎性痤疮，重复感染的疱疹；
[0057] -与起因无关的皮肤外伤和损伤的重复感染，特别是是在愈合期间，选自溃疡、创伤和烧伤；
[0058] -皮肤真菌病例如头癣，体癣，脚癣，希伯来湿疹和环状疱疹；
[0059] -念珠菌病例如粘膜念珠菌病、阴道念珠菌病、指趾间念珠菌病、与职业风险或糖尿病有关的念珠菌病的念珠菌病；
[0060] -皮炎如脓疱病和表面毛囊炎的皮炎。
[0061] 该用途还可以维持和/或恢复正常皮肤菌群。皮肤的腐生生物的微生物菌群表示皮肤免疫防护的主要因素。
[0062] 任何的这种菌群的失衡都会导致功能性的免疫缺陷和通常的致病菌群在皮肤的6 2
滋生。皮肤菌群估计10个细胞/cm (Leyden JJ等人的Soc Inves Dermatol88：65-69，
1987)，并且主要由棒状菌(棒状杆菌、短状杆菌和丙酸杆菌)和葡萄球菌组成。
滋生。皮肤菌群估计10个细胞/cm (Leyden JJ等人的Soc Inves Dermatol88：65-69，
1987)，并且主要由棒状菌(棒状杆菌、短状杆菌和丙酸杆菌)和葡萄球菌组成。
[0063] 还发现了不动杆菌(acinetobacter)和微球菌，不过程度较低，和主要包括马拉色氏霉菌的真菌菌群(Noble WC，Microbiol Human Skin，London，SaundersCompany Ltd编辑，1974；Leeming JP等人的J Clin Microbiol 25：2017-2019，1987；Leeming JP等人的J Applied Bacteriol 67：47-52，1989；Rudolf R等人的J Am AcadDermatol 1989)。
[0064] 当这种生态学的微生物屏障减弱(如在异位性湿疹)、降低(在新生儿中)，或遭破坏(如滥用攻击性皮肤产品)时，任何不希望的微生物都能够在皮肤表面或增殖或穿过皮肤，因而引发非特异性防御机制。
[0065] 正常菌群的存在能够通过阻止致病性微生物通过营养性竞争和通过酶作用的物质分泌和杀菌活性植入而提供给皮肤生态学上的防御。
[0066] 根据另一个方面，本发明涉及线状透明颤菌的脂质A作为使皮肤菌群正常化的试剂的用途。
[0067] “使皮肤菌群正常化”的表达意思是维持或恢复在皮肤、头皮和/或粘膜正常皮肤微生物菌落的情况，也就是说，在正常的皮肤、正常的头皮或正常的粘膜上存在的微生物菌群相符。
[0068] 本发明的应用涉及至少含有线状透明颤菌的脂质A的组合物的制备，所述组合物用于维持和/或恢复皮肤正常菌群。
[0069] 特别是，根据本发明的应用可以是：
[0070] -用于预防和/或限制头皮屑症状。例如，根据本发明的提取物可以配制成组合物，比如洗发香波、洗发液或头发滋补剂、或保留在头皮上的掩蔽物；
[0072] -用于预防和/或限制皮脂溢状态，特别是维持油性皮肤和/或油性头皮现象的致病性皮肤微生物的增殖。例如，根据本发明的提取物可以配制成保养乳剂比如用于油性皮肤的收敛乳剂，用于身体、面部或头发的清洁组合物比如抗皮脂溢的香波；
[0073] -用于制备身体保健的组合物，特别是私密处的保健，或头发的保健。例如，根据本发明的提取物可以配制成用于私密处或用于身体、面部、头发或头皮的清洁组合物，比如香皂、淋浴凝胶、私密用凝胶、面部清洁凝胶，保养产品比如抗微生物须后凝胶、面部或身体乳；
[0074] -用于预防和/或限制令人不愉快的在封闭体位的和皮肤微生物增殖有关的气味，例如腋下区域或足部。对于此类应用，根据本发明的提取物可以配制成除臭组合物。
[0075] 根据本发明的用途可以将脂质A局部施用于含或不含体毛、头皮、粘膜和/或半粘膜的皮肤来实施。
[0076] 可以用于本发明的口腔组合物优选含有可吸收的载体。对于吸收，很多口腔组合物的具体实施方式和特别是食物补充剂都是可行的。它们的配制可以用常规的方法制成糖包衣片剂、凝胶胶囊、凝胶、乳剂、片剂或胶囊。特别是，根据本发明的活性剂可以结合在任何其它形式的浓缩食物或食物补充剂中，例如食物棒，或压缩或非压缩粉剂。粉剂可以在水、苏打或奶或大豆衍生产品中稀释，或可以结合在食物棒中。
[0077] 特别适合作食物或药物载体的是奶、酸乳酪、乳酪、发酵奶、基于奶的发酵制品、冰淇淋、发酵的谷物类产品、奶粉、儿童和婴儿配方、甜点型食物产品、巧克力、谷物、动物饲料特别是驯养动物饲料、片剂、凝胶胶囊或团块、干燥形式的口用补充物。
[0079] 这些应用可以扩大到任何用于兽医治疗的组合物。它们还可以特别用于预防微生物，特别是细菌的增殖。举个非限定性的例子，它可以包括应用于奶牛的乳房及通常的任何可产奶的哺乳动物。
[0080] 该兽医的应用使其可以治疗和/或预防与葡萄球菌、链球菌和霉菌感染有关的疾病。
[0082] 适合于本发明的益生菌微生物是那些施用对动物或人体没有危险的微生物。
[0083] 为了本发明的目的，术语“益生菌微生物”(或益生菌)意思是活的微生物，当其有足够的数量时，对其宿主的健康有积极的效果，参见“Joint FAO/WHOExpert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic inFood Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria，2001年10月6日”，并且特别能够改善肠内的微生物平衡。
[0084] 根据本发明各种变化，该微生物以其分离形式使用，即不与一种或多种在其起源环境中有关的物质混合。
[0085] 为了本发明的目的，术语“级分”指的是所述微生物的特定的片段，该片段具有类似于整体微生物的对敏感和/或干燥皮肤的治疗性效果。
[0086] 适合于本发明的微生物可以特别选自子囊菌例如酵母菌、耶罗维亚酵母菌(Yarrowia)、克鲁维酵母属、球拟酵母菌、裂殖酵母属、德巴利酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、曲霉菌和青霉菌、和双岐杆菌属的微生物、拟杆菌属、梭菌属、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸菌属、肠道球菌、乳酸球菌(lactococcus)、葡萄球菌、消化链球菌属、芽胞杆菌属、小球菌属、微球菌、白联球菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属、乳球菌属(Oenococcus或乳酸杆菌以及它们的混合物。
[0087] 由于子囊菌最适合于本发明，所提及的由解脂耶罗威亚酵母(YarrowiaLipolitica)和乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)，和相似的酿酒酵母菌(saccharomyces cereviseae)，孢圆酵母属(Torulaspora)，裂质性酵母菌(Schizosaccharamyces pombe)，念珠菌和毕赤酵母(Pichia)构成。
[0088] 至于益生菌微生物，通常应用以下所述的细菌和酵母菌：
[0089] -乳酸菌：通过糖发酵产生乳酸。它们可以根据它们的形态学分成两组：
[0090] -乳杆菌属类：嗜酸性乳酸菌；食淀粉乳酸杆菌(amylovorus)，干酪乳杆菌(casei)，鼠李糖乳杆菌(rhamnosus)，短菌属，卷曲菌属，德氏菌属(保加利亚亚种，乳酸乳杆菌属)，酵母菌属，瑞士菌属，鸡乳杆菌(gallinarum)，干酪乳酸杆菌(lactobacillus johnsonii)，副酪蛋白，植物海芋属，罗伊乳酸杆菌属，唾液乳酸杆菌属，食品乳酸杆菌属，弯曲乳酸杆菌属，干酪乳酸杆菌属亚种干酪菌，清酒乳杆菌(sake)，-Gocci：肠道球菌(粪肠球菌，屎肠球菌)，乳酸乳球菌(亚种乳酸乳球菌或cremoris)，肠膜明串珠菌亚种(Leuconstoc mesenteroidesubspdextranicum)，乳酸小球菌属，菊糖芽胞乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)，唾液链球菌(Streptococcus salvarius)亚种热恐怖菌，嗜热链球菌，肉葡萄球菌属，木糖葡萄球菌属；
[0091] -双岐杆菌或双岐杆菌属：青春双岐杆菌，动物双岐杆菌(animalis)，两岐菌，短链菌，乳双歧杆菌(lactis)，长链菌，婴儿菌，假链状菌；
[0092] -酵母：酵母菌(啤酒或boulardii)；
[0093] -其它的芽胞菌：芽胞杆菌属(仙人掌var toyo或纳豆芽孢杆菌(subtilis))，凝结芽胞杆菌(bacillus coagulans)，芽胞杆菌地衣状菌属，大肠杆菌菌株nissle，费罗伊登赖希氏丙酸杆菌；
[0094] -和它们的混合物。
[0095] 乳酸菌和双岐杆菌是最常应用的益生菌。
[0096] 益生菌微生物的特别的例子是青春双岐杆菌，动物双岐杆菌(bifidobacteriumanimalis)，两岐双岐杆菌，短双岐杆菌，乳双歧杆菌，长双岐杆菌，婴儿双岐杆菌，假链状双岐杆菌，嗜酸乳酸杆菌(NCFB 1748)；乳酸杆菌食淀粉乳酸杆菌，干酪乳酸杆菌(Shirota)，鼠李糖乳酸杆菌乳酸杆菌(lactobacillus rhamnosus)(菌株GG)，短乳酸杆菌，卷曲乳酸杆菌，德氏乳酸杆菌(保加利亚亚种，lactis)，发酵乳酸杆菌，瑞士乳酸杆菌，鸡乳酸杆菌，加氏乳酸杆菌，干酪乳酸杆菌(CNCM I-1225)，变性酪蛋白乳酸杆菌，植物乳酸杆菌，罗伊乳酸杆菌，唾液乳酸杆菌，食品乳酸杆菌，弯曲乳酸杆菌，干酪乳酸杆菌干酪亚种，乳酸杆菌起源的乳酸乳球菌，肠道球菌(faecalis，faecium)，乳酸乳球菌(亚种lactis或cremoris)，肠膜明串珠菌亚种，乳酸小球菌，菊糖芽胞杆菌，唾液链球菌亚种热恐怖菌，嗜热链球菌，肉葡萄球菌，木糖葡萄球菌，酵母菌(啤酒或subtilis)，芽胞杆菌属(仙人掌var toyo或subtilis)，凝结芽胞杆菌，芽胞杆菌地衣状菌属，大肠杆菌菌株nissle，费罗伊登赖希氏丙酸杆菌和它们的混合物。
[0097] 微生物可以配制成粉末状，即干燥形式，或悬浮液或溶液形式。
[0098] 特别优选的是，微生物是衍生自乳酸菌类型的益生菌微生物，特别是例如乳酸杆菌和/或双岐杆菌。说明性的这些乳酸菌的例子是干酪乳酸杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌或两岐双岐杆菌、短双岐杆菌、长双岐杆菌、动物双岐杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、青春双岐杆菌或假链状双歧杆菌和它们的混合物。通过对这些乳酸菌的说明，所提及的优选由干酪乳酸杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌或两岐双岐杆菌、短双岐杆菌、长双岐杆菌、动物双岐杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、青春双岐杆菌或假链状双歧杆菌和它们的混合物构成。
[0099] 最优选的种类是干酪乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、青春双岐杆菌、长双岐杆菌和乳双歧杆菌NCC 2818，分别各自根据布达佩期条约和Pasteur协会(28rue du Docteur Roux，F-75024 Paris cedex 15)按照以下说明在30/06/92，12/01/99，15/04/99，15/04/99，07/06/05保藏的：CNCM I-1225，CNCM I-2116，CNCM I-2168，CNCM I-2170和CNCM I-3446，以及长双岐杆菌基因(BB536)，和它们的混合物。
[0100] 微生物和/或它们的级分和/或代谢物能够在合适的载体中配制，其量相当于载3 5 15 7 12
体中的含量为至少10cfu/g，特别是10-10 cfu/g，更特别是10-10 cfu/g。
体中的含量为至少10cfu/g，特别是10-10 cfu/g，更特别是10-10 cfu/g。
[0101] 本发明的局部用组合物或口服组合物通常每克载体中的微生物中益生菌的浓度3 12 5 10 7 9
范围是10-10 cfu，特别是10-10 cfu，更特别是10-10cfu。
范围是10-10 cfu，特别是10-10 cfu，更特别是10-10cfu。
[0102] 微生物可以以活性、半活性或灭活或死亡的形式包括在根据本发明的组合物当中。
[0103] 它们还可以细胞成分的级分形式或代谢物形式包括在其中。微生物、代谢物或级分还可以以冻干粉末，培养液和/或适当的浓缩形式引入。
[0104] 根据一个特定的具体实施方式，微生物以灭活或死亡形式使用，特别是在局部用组合物中。
[0106] 通常，低聚糖是主要的益生元的来源。
[0107] 在这一方面，所有FOS(呋喃低聚糖)是刺激双岐菌生长的益生元。菊粉和其衍生物也是双岐菌的促进剂，所述菊粉发现于菊苣(Ciichorium intybus)和菊芋(向日葵的块茎)和菊科或桔梗科植物中。乙酰基羟基呋喃低聚糖如最初的异麦芽糖，还有潘糖、异麦芽三糖(isomaltotrealose)、曲二糖等等，都是很好的双岐菌和乳酸菌的生长刺激剂。
[0108] 根据本发明的应用，发现当线状透明颤菌的脂质A与脱皮屑剂合用或在去皮屑剂之后应用时，对刺激角质化细胞的皮肤内源性防御特别有益。
[0109] 因此，本发明还涉及一种化妆去皮屑方法，包括去皮屑和/或脱皮剂应用之前、同时或之后施用，优选是同时施用或之后施用。
[0110] 去皮屑是一种已知的改善皮肤和/或头皮的外观和/或纹理的方法，特别是改善皮肤的光泽和肤色的均一性和/或减少可见的和/或可触摸的皮肤的不均匀，特别是皮肤表面的外观，减少光化斑点、粉刺斑和水痘斑，还可以预防、减少或对抗皮肤老化斑，特别是消除皮肤纹理的不均匀，如皱纹和细线。
[0111] 它们具有对化学方法处理的皮肤表面部分(表皮和可能的真皮的表面层)的去除效果。
[0112] 使用去皮屑或脱皮剂的结果还有对皮肤天然菌群的部分消除。根据本发明的LPS级分的伴随应用使其能够预防皮肤不希望的菌群的发展。
[0113] 术语“去皮屑剂”或“脱皮剂”意思是具有以下功能的任何物质：
[0114] -直接促进脱落脱皮剂，例如：饱和和不饱和一元羧酸、饱和和不饱和二元羧酸、饱和和不饱和三元羧酸；一元羧酸的α-羟酸和β-羟酸；二元羧酸的α-羟酸和β-羟酸；三元羧酸的α-羟酸和β-羟酸；酮酸，多羧酸、多羟基一元羧酸、多羟基二元羧酸、多羟基三元羧酸的α-酮酸、β-酮酸；和(3-羟基-2-戊基环戊基)乙酸。
[0116] 优选β-羟酸选自：水杨酸和其衍生物，特别是5-正辛酰基水杨酸。
[0117] 其它所提及的脱皮剂包括：二羧酸(dioic acid)、丙酮酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、乙酸、龙胆酸、肉桂酸、壬二酸；苯酚、间苯二酚；脲和其衍生物；在专利EP 0218200中的寡聚岩藻糖；在专利申请EP1333022和EP 1333021中的茉莉酸和其衍生物；三氯乙酸；维生素A物质如维生素A醇或视黄酸；阿达帕林；槐树(saphora japonica)提取物；白黎芦醇；和它们的盐和衍生物，例如顺或反式，外消旋混合物，和上面提及的试剂的右旋或左旋形式；
[0118] -或者通过酶的作用脱落或角化桥粒脱落，如糖苷酶、角质层糜蛋白酶(SCCE)或其它蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶样物质)；矿物盐螯合剂如EDTA；N-酰基-N，N’，N’-乙烯基二胺三乙酸；氨基磺酸化合物且特别是(N-2-羟乙基-哌嗪基-N-2-乙烷)磺酸(HEPES)；2-氧代噻唑烷-4-羧酸(丙半胱氨酸(procysteine))衍生物；甘氨酸型α氨基酸衍生物(如在EP 0852949中描述的，及BASF的商标名为Trilon M 的甲基甘氨酸双乙酸钠)；蜂蜜；糖衍生物例如O-辛酰基-6-D-麦芽糖、O-亚油基-6-D-葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺。
[0119] 其它能用于本发明脱皮剂可以由下述构成：海带属提取物例如糖海带(laminaria saccharina)和楔基海带(laminaria ochrolenca)、甘油三乳酸酯、在专利EP 0796861中的硅酸水杨酸盐衍生物、5-乙酰水杨酸盐、在专利EP 0899330中的对转谷氨酰胺酶有作用的活性剂和无花果梨果仙人掌(ficus opuntia indica)花的提取物，如来自Silab的Exfolactive 。
[0120] 那些本领域技术人员能够确定为获得所希望的皮肤效果而存在于本发明的组合中的脱皮剂需要的量。
[0121] 例如，脱皮剂可以是占组合物总重量的0.001％-95重量％的范围的量，特别是占组合物总重量的0.01％-30重量％，优选是组合物总重量的0.01％-10重量％。
[0122] 本发明还涉及化妆用皮肤脱皮屑方法，包括同时或在去皮屑剂施用后施用线状透明颤菌的脂质A。有益的是，所述的脂质A配制成化妆用组合物。
[0123] 含有脂质A的线状透明颤菌的脂质A还发现在皮肤设计模型中的有益应用。
[0124] 因此，本发明还涉及线状透明颤菌的脂质A的应用，用于预防在细胞或器官型培养中的微生物增殖。该应用是作为天然或合成抗生素的替代或与天然或合成抗生素的结合。
[0125] 这样的应用允许在表皮和/或皮肤模型中的脓毒产生或在皮肤移植或头发嫁接中的脓毒性产生。
[0126] 该皮肤模型可以是上皮细胞、角质化细胞、前体细胞、干细胞产生的表皮。
[0127] 它们还可以并且是非排他的在合成的膜上、胶原生物载体上，或天然无细胞脱表皮真皮上(DED模型)上重构的表皮，或包含包括在有胶原凝胶(点阵模型)中或胶原海绵状物中的成纤维细胞中的活性真皮。
[0128] 重构的皮肤模型还可以包括非角质化细胞如朗格罕氏细胞和/或黑素细胞，结合至表皮中，和/或非成纤维细胞如内皮细胞和/或淋巴细胞，结合至真皮中。
[0129] 皮肤模型还能够在保持体外存活条件下被移植。
[0130] 例如，可提及的是重构的表皮模型EpiSkin ，通过在胶原载体上培养成人角质化细胞而获得，是在允许末期分化和带有功能性角质层的表皮的重构的条件下进行的。
[0131] 本发明可以应用于各种可商购的皮肤模型：EpiSkin ，并且特别是，非排他的，SKinEthic ，Matek 或Natskin 。
[0132] 各种重构的表皮和/或重构的皮肤模型(实验研究模型和/或商购模型)都特别在以下参考文献中描述：Asselineau D，Bernard B，Bailly C，Darmon M(1985).Epidermal morphogenesis and induction of the 67kD keratinpolypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.ExpCell Res.159：536-539.；Bernerd F， Vioux C，Lejeune F，Asselineau D(2003)。The sun protection factor(SPF)inadequately defines broad spectrumphotoprotection：demonstration using skin reconstructed in vitro exposed toUVA，UVB or UV-solar simulated radiation.Eur J Dermatol.13：242-249；Lenoir MC，Bernard BA，Pautrat G，Darmon M，Shroot B(1988)。Outerroot sheath cells of human hair follicle are able to regenerate a fullydifferentiated epidermis in vitro.Dev Biol.130：610-620；Prunieras M，Regnier M，Wooodley D(1983)。Methods for cultivation of keratinocyteswith an air-liquid interface.J Invest Dermatol.81(1 suppl)：28s-33s；Regnier M，Staquet MJ，Schmitt D，Schmidt R(1997).Integration ofLangerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis。J InvestDermatol.109：510-512；Regnier M，Desbas C，Bailly C，Darmon M(1988)。Differentiation of normal and tumoral human keratinocytes culturedon dermis：reconstruction of either normal or tumoral architectute。In VitroCell Dev Biol.24：625-632；Regnier M，Schweizer J，Michel S，Bailly C，Prunieras M(1986)。Expression of high molecular weight(67K)keratin inhuman keratinocytes cultured on dead de-epidermized dermis。Exp Cell Res.165：
63-72；Tinois E，Tiollier J，Gaucherand M，Dumas H，Tardy M，Thivolet J(1991)。In vitro and post-transplantation differentiation of humankeratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayereddermal substitute.Exp Cell Res.193：310-319。
63-72；Tinois E，Tiollier J，Gaucherand M，Dumas H，Tardy M，Thivolet J(1991)。In vitro and post-transplantation differentiation of humankeratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayereddermal substitute.Exp Cell Res.193：310-319。
[0134] 各种上皮组织的模型特别在以下参考文献中描述：
[0135] -Oral and gingival ：Jayatilake JAMS，Samaranayake YH，SamaranayakeLP(2005)。An ultrastructural and a cytochemical study of candidal invasionof reconstituted human oral epithelium.J Oral Pathol Med.34：240-246；
Vande Vannet B，Hanssens J-L(2004)。Characterization of human oral andgingival mucosal models：a histological characterization and applications intoxicity testing.3rd International SkinEthic Workshop，Nice，France.
Vande Vannet B，Hanssens J-L(2004)。Characterization of human oral andgingival mucosal models：a histological characterization and applications intoxicity testing.3rd International SkinEthic Workshop，Nice，France.
[0136] -Oesophageal：Bemhardt J，Bernhardt H，Knoke M，Ludwig K(2004)。Influence of voriconazole and fluconazole on reconstituted multilayeredoesophageal epithelium infected by Candida albicans.Mycoses，47，7，p 330.
[0137] -Vaginal：Schaller M，Korting HC，Borelli C，Hamm G，Hube B(2005)。Candida albicans-secreted aspartic proteinases(Sap)modify the epithelialcytokine response in an in vitro model of vaginal candidiasis.Infect Immun.73：2758-2765.[0138] -Corneal：Van Goethem F，Adriaens E，Alépée N，Straube F， De Wever B，Cappadoro M，Catoire S，Hansen E，Wolf A，Vanparys P(2006)。Prevalidationof a new in vitro reconstituted human corneal model to assess the eyeirritating potential of chemicals.Toxicology In Vitro.20：1-17.
[0139] -Alveolar：Roggen E，Nilsson N，Dam L，Mikkelsen B，Rasmussen C，Cappadoro M，Rosdy M(2001)。The use of airlifted reconstituted human lungepithelial tissues to predict in vitro the allergenic risk of topically appliedenzyme proteins.Congrès de la Sociétéde pharmaco-toxicologie cellulaire(SPTC)，Toulouse，France.[0140] 优选的是，线状透明颤菌的脂质A配制成局部用于皮肤、头皮或粘膜的化妆用组合物。
[0141] 该组合物含有0.001ng/ml-100mg/ml，优选1ng/ml-100μg/ml的线状透明颤菌的脂质A。
[0142] 本发明使用的组合物可以是在化妆品和皮肤病学领域中任何适合于施用的形式，特别是局部施用。
[0143] 本发明的组合物因而可以施用于身体、皮肤、头皮或粘膜的任何表皮区域，并可以被所属领域技术人员用于任何盖仑制剂形式。可以特别是水性或油性溶液或悬浮液，水包油或油包水或多相乳剂，基于硅酮的乳剂，微乳剂或纳米乳剂，水性或油性凝胶或无水液体，糊状或固体产品形式。
[0144] 对于皮肤的局部应用，组合物可以特别具有洗剂或血清剂型的水性或油性溶液或分散体，通过将脂肪相分散至水相(O/W)或相反(W/O)得到的液态或半液态乳液型粘稠性的乳剂，或具有水性或无水凝胶或乳油的温和粘稠性的乳剂，或其它微囊或微粒，或离子和/或非离子型的囊泡分散体。还可以是贴片剂或控制释放系统的形式。这些组合物根据常规方法制备。
[0145] 它们还可以以水性、醇性或水性醇溶液形式，乳油、凝胶、乳剂或奶冻形式，或其它也含有加压推进剂的气溶胶组合物的形式用在头发上。
[0146] 本发明组合物中各种成分的量都是在本领域内常规使用的量。
[0147] 这些组合物特别组成净化、防护、治疗或保养的乳霜，用于面部、手部、足部、主要的折褶区或身体(例如日霜、晚霜、化妆去除霜、粉底霜、防晒霜)，皮肤或头发的掩蔽物，液体粉底，化妆去除乳，护肤液，凝胶或乳冻，例如清洗液，防晒液，人造革洗液，沐浴组合物，含有杀菌剂的除臭组合物，须后凝胶或洗液，脱毛乳霜，治疗特定皮肤疾病的组合物，如痤疮、湿疹或皮癣。
[0148] 本发明的组合物还可以包括香皂或清洗棒构成的固体剂型。
[0149] 本发明的组合物还可以包装成含有加压推进剂的气溶胶组合物形式。
[0150] 本发明的组合物还可以是头发保养组合物，特别是香波、头发定型液、含药洗液、定形乳霜或凝胶、染发组合物(特别是氧化染发剂)，任选是着色香波、头发重组洗液、固定波浪组合物(特别是固定波浪操作的第一阶段)、对抗头发缺失的洗液或凝胶、抗寄生虫香波等等。
[0151] 组合物还可以是口腔用途的，例如牙膏。在该例中，组合物可以含有常规用于口腔用途的辅剂和添加剂，特别是表面活性剂，增稠剂，湿润剂，抛光剂如二氧化硅，各种活性成分如氟化物，特别是氟化钠，和任选的甜味剂如糖精钠。
[0152] 当组合物是乳剂时，脂肪相的比例范围可以是组合物总重量的5％-80重量％，优选是5％-50重量％。用于乳剂组合物的油、蜡、乳化剂和辅助乳化剂选自那些化妆品领域常用的。乳化剂和辅助乳化剂存在于组合物中的比例范围是组合物总重量的0.3％-30重量％，优选是0.5％-20重量％。乳剂还可以含有脂质囊泡。
[0153] 当组合物是油性溶液或凝胶时，脂肪相可以是超过组合物总重量的9％。
[0154] 化妆组合物还可以以已知的方式含有化妆品领域中常用的辅剂，如亲水或亲脂凝胶剂，亲水或亲脂添加剂，防腐剂，抗氧化剂，溶剂，香味剂，填充剂，掩蔽剂，气味吸附剂和染料。这些辅剂的含量都是化妆品领域中常规的，例如是组合物总重量的0.01-10％。根据它们的性质，这些辅剂可以导入脂肪相，水相和/或脂质微球中。
[0155] 作为可以用于本发明的油或蜡，可以提及的是矿物油(液体石油凝胶)，植物油(乳木果油(SHEA BUTER)、向日葵油的液体级分)，动物油(全氢化角鲨烯)，合成油(purcellin油)，硅油或蜡(环聚二甲基硅氧烷)和氟代油(全氟代聚醚)，蜂蜡，巴西棕榈蜡或石蜡。脂肪醇和脂肪酸(硬脂质酸)可以加入到这些油中。
[0156] 作为可以用于本发明的乳化剂，可以是例如硬脂酸甘油酯，聚山梨醇酯60和PEG-6/PEG-32/乙二醇硬脂酸酯的混合物，由Gattefosse公司以名称Tefose 币售。
[0157] 作为可以用于本发明的溶剂，可以是低级醇，尤其是乙醇、异丙醇和丙二醇。
[0158] 作为可以用于本发明的亲水胶试剂，可以提及的是羧乙烯基聚合物(卡波姆)，丙烯酸类共聚物如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物，聚丙烯酰胺，多糖如羟丙基纤维素，天然树胶和粘土，及作为亲脂凝胶剂，可以提及的是改性粘土例如Bentones ，脂肪酸的金属盐例如硬脂酸铝，和疏水性二氧化硅，乙基纤维素和聚乙烯。
[0159] 当脂质A包含在特别的LPS成分中(富集在脂质A中)，线状透明颤菌的存在于本发明组合物中的LPS级分的含量可以被本领域技术人员调整，得到可调控的活性。经过标记，组合物中特定的线状透明颤菌的LPS成分的量为组合物总重量的0.0001％-10重量％，优选是0.001％-2重量％，特别指出的是至少为0.01％。
[0160] 有益的是，本发明的组合物含有纳米球或微球，实例如同在专利申请EP0447318，EP0557489，EP 1151741，EP 1201219或WO 97/12602中所描述的。
[0161] 实施例1：脂质A的制备
[0162] a)A的合成
[0163] 含有商购的葡萄糖胺A’(1.4mmol)和3-十二烷酰氧基癸酰基(1.54mmol)在CH2Cl2(15ml)中的溶液用EDC.Mel(2.10mmol)处理并在室温下搅拌过夜。反应混合物随后浓缩，残渣通过硅胶快速色谱法纯化。
[0164] 先前化合物(15.2mmol)和3-羟基癸酰(16.7mmol)与4-吡咯烷基吡啶(pyrrolidinopyridine)(1.7mmol)在CH2Cl2(95ml)中一并溶解。加入EDC.Mel(16.7mmol)并在室温下搅拌过夜。反应混合物随后浓缩，残渣通过硅胶快速色谱法纯化。
[0165] 上述所得丙酮化合物(acetonide溶解于乙酸/水(4/1)的混合物中，在60℃下加热一小时。随后浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化得到中间体A。
[0166] b)B的合成
[0167] B’是得自商购产品B”，应用与合成A相同步骤(参见上面)。
[0168] TCBOC-Cl(13.2mmol)在CH2Cl2(25ml)中的溶液在15分钟内于0℃下滴加至含有B’(12mmol)和吡啶(25mmol)的CH2Cl2(125ml)溶液中。混合物随即在室温下静置超过3.5小时。连续加入4-吡咯烷基吡啶(6.0mmol)、N，N-二异丙基乙胺(60mmol)和氯代膦酸二苯基酯(18mmol)。混合物在室温下搅拌5小时。反应随后用CH2Cl2稀释，用冷的水性HCl溶液(7.5％)洗，再用饱和的水性NaHCO3溶液洗，再干燥并浓缩。残渣通过硅胶快速色谱法纯化。
[0169] ZnCl2(1.0M的醚溶液，2.41mmol)在0℃下加入到含有以上所得到的物质(4.84mmol)和二氯甲基甲基醚(24.2mmol)的CHCl3(60ml)的溶液中。混合物在室温下静置，随后在室温下搅拌过夜。反应介质随后用EtOAc稀释，用饱和的水性NaHCO3溶液洗，再干燥并浓缩。残渣通过硅胶快速色谱法纯化得到中间体B。
[0170] c)C的合成
[0171] 含有B(1.85mmol)和A(1.54mmol)在1，2-二氯乙烷(18.5mmol)中的溶液和分子筛(1g)一同搅拌1小时，随后用AgOTf(5.55mmol)以一个单一部分处理。室温下黑暗中搅拌4小时后，再加入AgOTf(1.85mmol)，反应搅拌过夜。乳状混合物随即用C盐过滤并浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化可以得到化合物C’。
[0172] 含有C’(0.46mmol)在AcOH(4.5ml)/THF(40ml)混合物中的溶液在室温下在压力70psig下在PtO2(0.45g)存在下氢化18个小时。溶液用CHCl3/MeOH(2/1)稀释，然后简单地用声波处理。催化剂随后过滤，用CHCl3/MeOH(2/1)混合物洗。滤液合并并浓缩。残渣通过硅胶快速色谱法纯化。
[0173] 前述产品(12mmol)在CH2Cl2(25ml)中的溶液在室温下在N，N-二异丙基乙胺(60mmol)和POCl3(18mmol)存在下搅拌5小时。反应随后浓缩。反应介质用CH2Cl2稀释，用饱和水性NaHCO3溶液洗，干燥并浓缩。残渣随后溶解在乙酸(100ml)中，和锌粉(0.9ml)一起加热到60℃。反应随即冷却，在C盐上过滤，然后浓缩。通过硅胶快速色谱法纯化可以得到化合物C。
[0174] 实施例2-含有脂质A的线状透明颤菌提取物的制备
[0175] 125克线状透明颤菌冷冻干燥产物通过以下方法获得：
[0176] -连续模式的培养(μ＝0.12H-1)在有效的3m3的装有导流筒的发酵罐中完成；
[0177] -在无菌条件下通过离心分离(10000G)连续的收获；
[0178] -因此得到生物菌体的冷冻干燥产物。
[0179] 这些125克的冷冻干燥的生物物质(biomass)随后由以下混合物进行提取：
[0180] -33.5ml浓缩的NH4OH；
[0181] -906ml渗透性水；
[0182] -1560ml异丁酸。
[0183] 提取是在环境温度下搅拌10-30分钟而实施的。
[0184] 得到的产品在8000G/30min/4℃下离心以去除颗粒。离心的上清液而后通过GFD随后是GFF过滤器进行过滤。
[0185] NB：丸粒是线状透明颤菌生物物质，其中去除了95％的LPS(级分随后指的是不含LPS，用于实施例4)。
[0186] 全部随后在65℃/40mbar下减压蒸馏。
[0187] 得到600ml浓缩物并置于通风箱中以浓缩。而后得到37g糊体，所述糊体加入50％的水进行冷冻干燥。
[0188] 实施例3-线状透明颤菌的脂质A诱导皮肤防御酶的表达的测定，和大肠杆菌LPS对比
[0189] 两种纯化的细菌脂多糖提取物，一种是根据本发明的提取物(特定的富含脂质A的LPS级分)，另一种是商购的大肠杆菌LPS提取物，进行评估，通过基因分析方法(Affymetrix U133加法列阵(plus arrays))，评估它们在皮肤细胞中编码它们的抗细菌蛋白的特定诱导特别基因表达的能力。
[0190] 正常人体表皮角质化细胞(NHEK)在SFM培养基(Invitrogen)中和表皮生长因子0.25ng/ml、25μg/ml的脑垂体提取物(EGF，EP，Invitrogen 3700015)、和庆大霉素25μg/ml(Sigma G1397)一起预培养，然后置于检测介质中。
[0191] 它们随后导入检测介质(和用于培养的相同的介质，不含有EP和EGF)。细胞随后用检测产品处理或不处理(对照)，在37℃和5％CO2下培养24小时。
[0192] 去除培养上清液，用PBS溶液冲洗细胞膜，然后置于无菌的不含RNA的含有tri-reagent试剂(Sigma T9424)的管中，在-80℃下快速冷冻。
[0193] 所感兴趣的蛋白合成前体的表达通过RT-Q-PCR从每次处理的细胞膜提取的信使RNA进行评估：
[0194] 逆转录：
[0195] -应用根据由提供者推荐的实验设计的tri-reagent试剂提取每种样品的总RNA；
[0196] -清除用不含DNA的系统(Ambion ref.1906)处理而有可能污染DNA的痕量；
[0197] -在少量(dT)引发剂和标记II酶(Invitrogen 18064071)存在下进行mRNA逆转录反应，用于Q/RTPCR研究(实施例3)或通过Affymetrix转录研究(实施例2)的Affymetrix一个周期逆转录试剂盒进行。
[0198] 通过与数据采掘分析偶联的对全部人类基因组的生物统计分析，观察到与已知的具有低皮肤角质化细胞刺激活性的大肠杆菌LPS相反，含有来自线状透明颤菌的脂质A的LPS，在相同浓度和相同实验条件下，能够完全刺激皮肤防御系统运动中的预防性配置，特别是抗细菌防御系统。
[0199] 因此，这种细菌或模拟成分具有诱导皮肤防御系统的生物学特性，特别是β-防御素和cathelicidin，还有蛋白酶抑制剂如弹力素(SKALP)；Elias等人，Exp.Dermatol.(14)：719-726。
[0200] 因此，如下表所示，响应于线状透明颤菌的脂质A，清楚地观察到了对编码β-防御素-2，RNA酶7和PS100A7，还有其它对表皮防御有贡献的抗蛋白酶的诱导。
[0201]本发明特定的对
正常人类角质化 大肠杆菌对正常
Genbank参考 描述 细胞的线状透明 人类角质化细胞
颤菌LPS级分(富 的LPS级分
含脂质A)
NM_002963 牛皮癣素1(S100 14.8 1.4
钙结合蛋白A7)
AJ243672 S100钙结合蛋白 14.7 1.2
A7样物质1
NM_004942 防御素β2 8.6 1.1
AJ131212 核糖核酸酶，RNA 2.6 -1.0
酶A族，7
AI554300 丝氨酸(或半胱氨 3.5 1.3
酸)蛋白酶抑制
剂，分化体B(卵
清蛋白)成员1
NM_002638 蛋白酶抑制剂3， 3.5 1.3
皮肤衍生的
(SKALP)///蛋白
酶抑制剂3，皮肤
衍生的(SKALP)
NM_030666 丝氨酸(或半胱氨 3.4 1.2
酸)蛋白酶抑制
剂，分化体B(卵
清蛋白)成员1
L10343 蛋白酶抑制剂3， 2.7 1.2
皮肤衍生的
(SKALP)
正常人类角质化 大肠杆菌对正常
Genbank参考 描述 细胞的线状透明 人类角质化细胞
颤菌LPS级分(富 的LPS级分
含脂质A)
NM_002963 牛皮癣素1(S100 14.8 1.4
钙结合蛋白A7)
AJ243672 S100钙结合蛋白 14.7 1.2
A7样物质1
NM_004942 防御素β2 8.6 1.1
AJ131212 核糖核酸酶，RNA 2.6 -1.0
酶A族，7
AI554300 丝氨酸(或半胱氨 3.5 1.3
酸)蛋白酶抑制
剂，分化体B(卵
清蛋白)成员1
NM_002638 蛋白酶抑制剂3， 3.5 1.3
皮肤衍生的
(SKALP)///蛋白
酶抑制剂3，皮肤
衍生的(SKALP)
NM_030666 丝氨酸(或半胱氨 3.4 1.2
酸)蛋白酶抑制
剂，分化体B(卵
清蛋白)成员1
L10343 蛋白酶抑制剂3， 2.7 1.2
皮肤衍生的
(SKALP)
[0202] 实施例4-应用本发明级分(不含LPS的线状透明颤菌的级分)的角质化细胞进行β-防御素-2表达，与大肠杆菌LPS级分的比较
[0203] PCR反 应(聚合 酶 链反 应)通 过 定量 的PCR和“Light Cycler”系 统(RocheMolecular Systems Inc.)和根据由提供者推荐的过程进行。
[0204] 每个样本的反应混合物(10μl最终体积)如下：
[0205] -2.5μl cDNA稀释至1/10th；
[0206] -使用的各种标记的引发剂(primer)；
[0207] -含有taq DNA聚合酶，SYBR Green I标记物(在链伸长步骤中嵌入双链DNA中的荧光基团)反应混合物(Roche)和MgCl2。
[0208] 通过Q-PCR的分析
[0209] 将荧光基团结合至放大的DNA是在PCR周期当中连续测量的。该系统使其能够得到PCR周期功能的荧光检测曲线并因此评估每个标记的相对表达值。
[0210] 周期的数由荧光曲线的“出口”点确定。对于相同的标记分析，样本的出口点越晚(周期的高值)，mRNA原始复制数越低。
[0211] RE值(相对表达)由根据下式的任意单元表达：
[0212] 1/2周期数×106。
[0213] 制备实施例3的RNA的实验设计是和另外两种产品一同进行的：
[0214] A-线状透明颤菌的不含LPS的级分(称为不含LPS的级分，见实施例2)如线状透明颤菌LPS的制备中所提及。这是去除95％LPS的全部的生物物质(蛋白质等)。
[0215] B-商购的大肠杆菌LPS级分。
[0216]处理 浓度 β-防御素-2的表达％对照
对照 - 100
本发明的级分(根据实施
例1制备) 10μg/ml 221
级分A 0.1％ 155
级分B 10μg/ml 191
对照 - 100
本发明的级分(根据实施
例1制备) 10μg/ml 221
级分A 0.1％ 155
级分B 10μg/ml 191
[0217] 实施例5-组合物
[0218] A.口服给予
[0219] 实施例1：单剂量粉末药囊
[0221] 每日服用一至三个药囊
[0222] 实施例2：胶囊
[0223]mg/个药囊
乳酸菌变性酪蛋白(CNCM I-2116) 50.00
线状透明颤菌的脂质A提取物(实施例2) 5.00
黑醋栗籽油 100.00
鱼油 100.00
硬脂酸镁 0.02
天然香料 适量
赋形剂 适量
乳酸菌变性酪蛋白(CNCM I-2116) 50.00
线状透明颤菌的脂质A提取物(实施例2) 5.00
黑醋栗籽油 100.00
鱼油 100.00
硬脂酸镁 0.02
天然香料 适量
赋形剂 适量
[0224] 每日服用一至三个胶囊
[0225] B.局部给予至皮肤
[0226] 实施例3：除臭剂喷雾(泵-分配瓶)
[0227] 线状透明颤菌的脂质A提取物(实施例2) 0.30g
[0228] 芳香剂，染料 适量
[0229] 变性的体积比95％的乙醇 100g
[0230] 实施例4：透明的水性-含醇滚涂
[0231] 氧代乙烯化(20EO)和氧代丙烯化(5PO)鲸蜡醇 2.00g
[0232] 羟乙基纤维素 0.75g
[0233] 线状透明颤菌的脂质A提取物(实施例2) 0.0250g
[0234] 变性的体积比95％的乙醇 45.00g
[0235] 芳香剂 适量
[0236] 去矿物质水 适量至100g[0237] 实施例5：保持头皮的抗头发缺失凝胶掩蔽物
[0238] ％重量
[0239] 干酪乳酸杆菌(CNCM I-1225) 0.05
[0240] 羟丙基纤维素(Hercules公司销售的Klucel H) 1.00
[0241] 线状透明颤菌的脂质A提取物(实施例2) 5.00
[0242] 葡萄糖酸钙 3.00
[0243] 亚油酸钙 2.00
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