肠降血糖素肽是当葡萄糖水平正常或尤其是当它们升高时造成释 放的胰岛素的量增加的激素和肽模拟物。这些肠降血糖素肽具有超过 由胰岛素分泌限定的最初肠降血糖素作用以外的其它作用。例如，它 们也可以具有减少胰高血糖素生成和延迟胃排空的作用。另外，它们 可以具有提高胰岛素敏感性的作用，且它们可以增加胰岛细胞新生- -新胰岛的形成。
肠降血糖素效应的概念，源自下述观察，即对口服葡萄糖的胰岛 素应答超过了在静脉施用等量葡萄糖之后测得的胰岛素应答。结论 是，肠衍生的因子或肠降血糖素会影响餐后胰岛素释放。营养物进入 胃和邻近的胃肠道，造成肠降血糖素激素的释放，它们然后刺激胰岛 素分泌。通过对比对口服和静脉内葡萄糖负荷的胰岛素或C-肽应答， 可以定量该促胰岛素或刺激胰岛素分泌的能力。以此方式，已经证实 肠降血糖素效应在健康个体中负责约50％-70％的对口服葡萄糖的胰岛 素应答。
尽管许多餐后激素具有肠降血糖素样活性，突出的肠降血糖素 肽包括葡萄糖-依赖性的促胰岛素多肽，也称作抑胃多肽(GIP)，胰高 血糖素样肽-1(GLP-1)，和毒蜥外泌肽(它们是非内源性肠降血糖素 模拟物)。GIP和GLP-1二者都属于胰高血糖素肽超家族，因而具有 氨基酸序列同源性。GIP和GLP-1由胃肠道中的特化细胞分泌，且 具有位于胰岛细胞以及其它组织上的受体。作为肠降血糖素，二者 都反应于营养物的摄入，由肠分泌，这导致增强的胰岛素分泌。GIP 和GLP-1的促胰岛素效应依赖于周围葡萄糖的升高。二者都被普遍 存在的二肽基肽酶IV(DPP-IV)迅速灭活。
天然的人GIP是一种42个氨基酸组成的单肽，其由特化的肠内 分泌K-细胞合成和分泌。这些细胞主要集中在十二指肠和邻近的肠 中，尽管发现它们也存在于整个肠中。GIP分泌的主要刺激是富含碳 水化合物和脂质的膳食的摄入。摄入后，循环血浆GIP水平升高10-20 倍。估计完整GIP的半衰期在健康受试者中是约7.3分钟，在糖尿病 受试者中是5.2分钟。
除了GIP输注方案以外，已经使用GIP受体拮抗剂、GIP肽拮抗 剂和GIP受体敲除的小鼠，阐述了GIP的生理作用。阻断GIP与它的 受体的结合，会在大鼠和小鼠中导致口服葡萄糖负荷后的葡萄糖-依赖 性的胰岛素分泌减弱。类似地，GIP拮抗剂或GIP抗血清的施用，会 显著减少大鼠的餐后胰岛素释放。GIP受体敲除的小鼠表现出正常的 空腹葡萄糖水平，但是口服葡萄糖负荷之后表现出轻微的葡萄糖不耐 受。令人感兴趣地，它们也表现出对数月高脂肪饮食后饮食诱导的肥 胖的抗性。另外，在瘦蛋白缺乏的ob/ob小鼠中，GIP受体敲除的基 因型似乎会降低发展肥胖的程度。
GIP输注已经一致地证实了分离的大鼠胰岛、分离的、灌注大鼠 胰腺、狗和人中的胰岛素分泌的刺激。在逐步血糖正常的轻微高血糖(超 过基础水平54mg/dL)和中等高血糖(超过基础水平143mg/dL)夹中， 已经证实仅仅在有升高的葡萄糖浓度存在下，GIP输注会导致胰岛素 分泌。而且，已经证实，在血糖正常或高血糖条件下，GIP在正常人 中不是出促胰高血糖素的。因而，内源释放的GIP的作用似乎是餐后 胰岛素分泌的重要机理，似乎在空腹状态不起作用。
GIP也具有许多非肠降血糖素效应。与其它胰岛素促分泌剂不同， GIP会在INS-1胰岛细胞系研究中刺激β-细胞增殖和细胞存活。此外， 动物研究已经指出了GIP在脂类代谢中的作用，它会刺激脂蛋白脂酶 活性，诱导脂肪酸向脂肪组织中的掺入，和刺激脂肪酸合成。但是， 在人类中，没有清楚的证据表明GIP对脂类代谢的作用。GIP还似乎 会刺激从分离的灌注的大鼠胰腺分泌胰高血糖素，尽管人类研究没有 证实对胰高血糖素分泌的任何显著影响。此外，与GLP-1不同，GIP 似乎通过加速胃的排空，而不是通过抑制胃肠蠕动来起作用。
GIP-受体(即G蛋白偶联的受体家族的一个成员)对GIP具有高 特异性，且不会结合胰高血糖素家族的其它肽。鉴于该原因，GLP-1/GIP 嵌合肽对GIP-受体几乎没有亲和力。从这样的研究已经得到结论，即 GIP(1-42)的GIP(1-30)序列对于识别受体是足够的。GIP(6-30)-酰胺含 有GIP(1-42)的高亲和力结合区域，但是表现出拮抗剂活性。
尽管通过葡萄糖依赖性的胰岛素分泌刺激发挥了有效的葡萄糖调 节作用，但与正常个体相比，糖尿病受试者中GIP的促胰岛素作用显 著减少(16-18)。结果，GIP的临床应用尚未取得显著进展。此外，仍 然需要开发其它糖尿病治疗模态，以及代谢疾病、状况和病症的治疗。 因此，本发明的一个目标是提供GIP类似物和含有GIP的杂合多肽， 以及它们用于治疗或预防代谢疾病、状况和病症的方法。
本文引用的所有文件都通过引用结合到本申请中，如同本文完全 阐述一样。
发明概述
本发明提供了用于治疗或预防代谢疾病和病症的方法，所述代谢 疾病和病症包括可通过控制血糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌来 减轻的那些，例如糖尿病和糖尿病相关病症，所述状况和病症包括但 不限于高血压、血脂异常、心血管疾病、摄食障碍、胰岛素抵抗、肥 胖和任何种类的糖尿病，包括1型、2型和妊娠糖尿病。该方法包含， 给有需要的受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的GIP或GIP 类似物、其片段或衍生物、或GIP杂合体或其衍生物，它是单独的(单 一疗法)或与另一种试剂或疗法相组合(辅助疗法)，例如降糖剂(例如， 抗糖尿病剂)或抑制或减少胃排空的试剂或方法(本文提供了这样的试 剂的实例)。通过提供GIP生物活性作为具有一种或多种其它激素生 物活性(例如，普兰林肽(pramlintide)，毒蜥外泌肽，BNP)的GIP杂 合体的一部分，具有一种或多种选择功能的化合物将具有GIP生物活 性的性质的额外益处，例如降低血糖，增加胰岛素分泌，而没有与其 它肠降血糖素分子有关的副作用。例如，本发明的GIP-sCT杂合化合 物可以具有鲑鱼降钙素的可选择性质，例如减少骨丢失和骨重吸收或 减少软骨更新(软骨保护)，和GIP的性质，例如血糖降低(同时伴有本 文所述的抗分解代谢方面)和/或抑制骨重吸收和维持或增加骨密度。 具有这样的可选择性质的GIP杂合体可以增强骨质疏松症或高软骨更 新的状况的治疗，尤其是也可以从血糖控制获益的那些人，例如患有 糖尿病或正在接受病危护理的受试者。
在一个实施方案中，提供了具有一种或多种增强的性质的新的GIP 类似物。所述GIP类似物具有增强的对DPP-IV或其它蛋白酶(例如 在人血浆中和/或在肾刷状缘膜上发现的那些)的抗性，这会增加体内 半衰期。在另一个实施方案中，所述GIP类似物在氨基酸4-30中具 有至少一个置换、修饰、插入或缺失。这些变化可以提供增强的性质， 例如增强的GIP受体结合、增强的受体选择性、和/或增强的对化学和 /或蛋白水解方式的降解的抗性。在另一个实施方案中，在每个分子的 整个长度，所述GIP类似物还与天然GIP(1-30)、天然GIP(1-14)、天 然GIP(19-30)或天然GIP(1-42)具有至少50％序列同一性，且具有GIP 的至少一种生物学性质。在某些实施方案中，新的GIP类似物多肽包 括非天然氨基酸，例如D氨基酸。在另一个实施方案中，将GIP类似 物或杂合体修饰成具有减少的肾清除，例如通过脂肪酰基衍生化。
在另一个实施方案中，提供了新的具有可选择性质的含有GIP的 杂合多肽。所述杂合多肽表现出至少一种激素活性。在一个实施方案 中，所述GIP-杂合多肽包含至少2个共价连接在一起的生物学上有活 性的(“生物活性的”)肽激素模块(module)，其中至少一个生物活性的肽 激素模块包含GIP多肽。另一个生物活性的肽激素模块可以是：(a)天 然组分肽激素，(b)保留激素活性的天然组分肽激素类似物或衍生物， (c)保留激素活性的天然组分肽激素的片段，(d)保留激素活性的天然 组分肽激素类似物或衍生物的片段，(e)赋予杂合多肽希望的化学稳 定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体 相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物代谢动力学特 性的天然组分肽激素的结构基序；或(f)赋予杂合多肽希望的化学稳 定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体 相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物代谢动力学特 性的天然组分肽激素类似物或衍生物的结构基序。(e)和(f)的结构基序 在本文中集中称作“肽增强子”。肽增强子的一个实例是Trp笼(cage)序 列，尤其是源自毒蜥外泌肽-4的Trp笼序列。
在另一个实施方案中，GIP-杂合多肽包含至少2个共价连接在一 起的生物活性的肽激素模块，其中至少一个生物活性的肽激素模块包 含GIP多肽，且第二个模块表现出组分肽激素的至少一种激素活性。 所述生物活性的肽激素模块独立地选自：组分肽激素，表现出组分肽 激素的至少一种激素活性的组分肽激素的片段，表现出组分肽激素的 至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物，表现出组分肽激素 的至少一种激素活性的组分肽激素类似物和衍生物的片段。
在一个实施方案中，所述GIP-杂合多肽包含本发明的新的GIP类 似物多肽，该多肽共价连接到至少一个额外的生物活性的肽激素模块 上。在另一个实施方案中，所述生物活性的肽激素模块是肽增强子。 在一个实施方案中，本发明的GIP杂合多肽在GIP部分的整个长度表 现出与天然GIP(1-30)、天然GIP(1-14)、天然GIP(19-30)或天然GIP(1-42) 的至少50％序列同一性。在某些实施方案中，所述GIP部分可以包含 新的GIP类似物，该类似物另外包含肽增强子，例如trp-笼基序。因 此，GIP杂合体可以包含作为GIP类似物的GIP部分，其具有肽增强 子(例如trp-笼基序)且具有增强的性质的片段或衍生物，其共价连 接到一个额外的生物活性的肽激素模块，例如另一种激素或生长因子 或其片段上。
用于GIP-杂合多肽中的组分肽激素包括：胰淀素，肾上腺髓质素 (ADM)，降钙素(CT)，降钙素基因相关肽(CGRP)，垂体中间叶激素， 缩胆囊素(“CCK”)，瘦蛋白，肽YY(PYY)，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)， 胰高血糖素样肽2(GLP-2)，泌酸调节肽(OXM)，利钠肽(例如ANP， BNP，CNP或尿舒张肽)，尿皮质激素家族肽，例如，Ucn-2和Ucn-3， 神经调节肽家族肽，例如神经调节肽U25或剪接变体，毒蜥外泌肽-3和 毒蜥外泌肽-4。
在其它GIP杂合体实施方案中，所述GIP部分与下述配体相组合： 胃泌素/CCK受体配体；胰淀素受体配体；降钙素受体配体；CGRP受 体配体，PYY受体配体，EGF受体配体；胰高血糖素样肽1受体配体； 胰高血糖素样肽2受体配体；抑胃多肽(GIP)受体配体；角质形成细胞 生长因子(KGF)受体1配体；二肽基肽酶IV抑制剂；REG蛋白受体 配体；生长激素受体配体；泌乳素(PRL)受体配体；胰岛素样生长因 子(IGF)受体配体；PTH-相关蛋白(PTHrP)受体配体；肝细胞生长因子 (HGF)受体配体；骨形态发生蛋白(BMP)受体配体，转化生长因子(TGF 受体配体；层粘连蛋白受体配体；血管活性肠肽(VIP)受体配体；成纤 维细胞生长因子(FGF)受体配体；神经生长因子(NGF)受体配体；胰岛 新生相关蛋白(INGAP)受体配体；Activin-A受体配体；血管内皮生长 因子(VEGF)受体配体；促红细胞生成素(EPO)受体配体；垂体腺苷酸 环化酶激活多肽(PACAP)受体配体；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体 配体；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；血小板衍生的生长 因子(PDGF)受体配体，大麻素(cannabinoid)CB1受体拮抗剂，和胰泌 素受体配体。
在一个实施方案中，希望的GIP杂合多肽包括N-末端GIP或新 的GIP类似物片段，其与一个具有葡萄糖降低活性(例如，抗糖尿病 剂，毒蜥外泌肽)或抑制或减少胃排空的能力的C-末端多肽或其片段 组合。这样的希望的GIP杂合体包括N-末端GIP片段或新的GIP类 似物或衍生物片段，其与C-末端毒蜥外泌肽，GLP1，symlin(普兰林 肽)，胰淀素，CCK，胃泌素，PYY，胰泌素，GRP，神经调节肽，尿 皮质激素，降钙素，或鲑鱼降钙素，利钠肽(例如，ANP，BNP，CNP， 尿舒张肽)或类似物(例如胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体)，其衍生物或片段 组合。在其它实施方案中，希望的GIP杂合体包括C-末端GIP或新 的GIP类似物片段，其与一个具有葡萄糖降低活性(例如，抗糖尿病 剂，毒蜥外泌肽)或抑制或减少胃排空的能力的N-末端多肽或其片段 组合。在这样的实施方案中，嵌合多肽可以包括C-末端GIP、新的GIP 类似物或其片段，其与N-末端毒蜥外泌肽，GLP1，symlin(普兰林肽)， 胰淀素，CCK，胃泌素，PYY，胰泌素，GRP，神经调节肽，尿皮质 激素，降钙素，或鲑鱼降钙素，利钠肽或类似物，其衍生物或片段组 合。
在其它实施方案中，肽增强子是源自第二种激素(例如毒蜥外泌 肽，人GLP-1，或蛙GLP-1)的尾或末端延伸，或根据经验确定。在一 个实施方案中，肽增强子是GIP部分的异源C-末端尾或末端延伸。至 于本文所述的其它GIP杂合体，在含有肽增强子的杂合体的一个实施 方案中，所述GIP部分可以是天然GIP、其活性片段或它们的类似物 或衍生物。在另一个方面，杂合体的GIP部分包含至少一个修饰、置 换、缺失或添加，其提供一种或多种增强的性质，例如增强的对蛋白 水解消化的抗性(从而延长半衰期)，减少肾清除的脂肪酰基衍生化。 在一个实施方案中，所述尾包含trp-笼基序序列。在另一个实施方案 中，所述GIP类似物多肽部分包括非天然氨基酸，例如D氨基酸，例 如其抑制至减少DPP-IV的蛋白水解速率。
本发明也提供了代谢疾病和病症的治疗和预防，尤其可通过控制 血糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌来减轻的那些，例如糖尿病和 糖尿病相关状况。所述状况和病症包括但不限于高血压，血脂异常， 心血管疾病，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥胖，和任何种类的糖尿病， 包括1型、2型、和妊娠糖尿病，糖尿病并发症(例如神经病(用例如 含有毒蜥外泌肽家族激素模块的GIP杂合体治疗)，神经性疼痛(用例 如含有胰淀素家族激素模块的GIP杂合体治疗)，视网膜病变，肾病， 胰腺β细胞团不足的状况(基于，例如，毒蜥外泌肽-4和GLP-1的胰 岛新生作用)。因此，本发明提供了用于治疗或预防这样的状况的方法， 其中所述方法包含，给有需要的受试者施用治疗或预防有效量的GIP 或其类似物或衍生物，包括本发明的新的GIP类似物，或本发明的GIP- 杂合体，包括具有肽增强子的杂合体。在一个实施方案中，本发明的 多肽可以作为单一疗法来提供。在另一个实施方案中，为了治疗糖尿 病或与升高的葡萄糖水平有关的状况，可以在辅助疗法中与降糖剂(例 如，抗糖尿病剂)或抑制或减少胃排空的试剂或方法一起施用GIP化 合物。本文提供了这样的试剂的实例。例如，在一个实施方案中，提 供了一种用于降低受试者(例如具有1型、2型或妊娠糖尿病的受试 者)的血糖水平的辅助治疗方法，该方法包含，在具有本发明的GIP 或新的GIP类似物或有效量的GIP-毒蜥外泌肽杂合体的辅助疗法中， 给所述受试者施用治疗有效量的毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂，例 如其中所述毒蜥外泌肽激动剂是肽。
单独的或与降糖剂(例如，抗糖尿病剂)或抑制或减少胃排空的试 剂或方法相组合的本发明的化合物，也可以用于强化、减少、增强或 恢复胰岛或细胞的葡萄糖反应性。这些作用也可以用于治疗或预防与 代谢病症有关的状况，例如在上面和在本文整体引作参考的美国专利 申请号US20040228846中描述的那些。
在另一个方面，提供了治疗或预防肥胖的方法，其中所述方法包 含，给有需要的受试者施用治疗或预防有效量的GIP或其类似物或衍 生物，包括本发明的新的GIP类似物，或本发明的GIP-杂合体，包括 具有肽增强子的杂合体。在一个实施方案中，所述受试者是肥胖的或 超重的受试者。尽管“肥胖”通常定义为超过30的体重指数，为了本发 明公开的目的，在“肥胖”的范围内包括需要或希望减轻体重的任何受 试者，包括体重指数小于30的那些。胰岛素抗性的、葡萄糖不耐受 的、或具有任何形式的糖尿病(例如，1、2型或妊娠糖尿病)的受试者 可以从该方法获益。本发明的化合物也可以用于治疗或预防其它与肥 胖有关的状况，包括中风，癌症(例如，子宫内膜癌，乳腺癌，前列腺 癌，和结肠癌)，胆囊疾病，睡眠呼吸暂停，生育力降低，和骨关节炎 (参见Lyznicki等，Am.Fam.Phys.63：2185，2001)。在状况与升高 的葡萄糖或高血糖症有关时，所述方法包含，单独地或与降糖剂(例如， 抗糖尿病剂)或抑制或减少胃排空的试剂或方法相组合施用治疗或预防 有效量的GIP化合物。
在另一个方面，GIP化合物，尤其是本发明的GIP杂合体，可以 用于减少食物摄取、减少食欲、诱导饱感、减少营养物利用度、减少 热量效率、造成体重减轻、影响机体组成、改变体能含量或能量消耗、 和改进脂质谱(包括减少LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL 胆固醇水平)的方法中，其中所述方法包含，给受试者施用有效量的本 发明的GIP化合物，尤其是GIP杂合体化合物。在一个实施方案中， 本发明的方法用于治疗或预防有需要的受试者的可以通过减少营养物 利用度来改善的状况或病症，所述方法包含，给所述受试者施用治疗 或预防有效量的本发明的GIP化合物。所述状况和病症包括但不限于， 高血压，血脂异常，心血管疾病，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥胖，和 任何种类的糖尿病，包括1型、2型、和妊娠糖尿病，糖尿病并发症(神 经病(基于，例如，毒蜥外泌肽-4的神经营养作用)，神经性疼痛(基于， 例如，胰淀素作用)，视网膜病变，肾病，胰腺β细胞团不足的状况(基 于，例如，毒蜥外泌肽-4和GLP-1的胰岛新生作用)。在状况与升高 的葡萄糖或高血糖症有关时，所述方法包含，单独地或与降糖剂(例如， 抗糖尿病剂)或抑制或减少胃排空的试剂或方法相组合地施用治疗或预 防有效量的GIP化合物。
除了作为减少食物摄取、体重减轻和/或治疗肥胖的结果而改善需 要的受试者的高血压以外，本发明的化合物可以用于治疗或预防低血 压和与之有关的状况。
在另一个方面，GIP类似物和杂合体可以用于减少或抑制骨重吸 收和维持或增加骨密度。当与适宜的第二种激素模块相组合时，GIP 杂合体可以用于治疗这些状况以及减少血钙，和/或诱导镇痛作用，尤 其用于治疗骨病例如骨质减少和骨质疏松症，和治疗疼痛的神经病。 在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和 /或sCT部分。例如，本发明的GIP-sCT或GIP-胰淀素/sCT杂合化合 物可以具有鲑鱼降钙素或胰淀素/sCT/胰淀素嵌合体的可选择性质，例 如减少骨丢失和骨重吸收或减少软骨更新(软骨保护)，和GIP的性质， 例如血糖降低(同时伴有本文所述的合成代谢方面)和/或抑制骨重吸 收和维持或增加骨密度。具有这样的可选择性质的GIP杂合体可以增 强骨质疏松症或高软骨更新的状况的治疗，尤其是也可以从血糖控制 获益的那些人，例如患有糖尿病或正在接受病危护理的受试者。
GIP化合物，尤其GIP类似物，任选地另外包含肽增强子(例如 异源的C-末端尾)的延长了半衰期的GIP杂合体(例如DPP-IV切割抗 性的(例如D-Ala2，N-乙酰基或N-焦谷氨酰基类似物)，和包含已知提 供有益的心血管作用的其它激素模块的GIP杂合体，可以用于治疗心 血管疾病和相关状况。如本文所证实的，GIP化合物会增加心肌收缩 力(dp/dt)，降低血压(例如通过急性血管舒张)，降低收缩压，降低舒 张压，且可以提供对心脏细胞直接有益的作用。GIP化合物也会通过 代谢作用提高心脏功能，所述代谢作用例如葡萄糖降低、胰岛素分泌、 β细胞增殖。但是，也提供了对心血管系统的直接作用，因此所述GIP 化合物令人惊奇地甚至是更有益的。
本发明的化合物也可以用于治疗或预防任意数量的与过度的胃分 泌、过度的肠电解质和水分泌以及降低的吸收有关的胃肠道病症，例 如，感染性(例如，病毒性或细菌性)腹泻，炎性腹泻，短肠综合征， 或通常在手术后发生的腹泻，所述手术例如回肠造口术(参见例如， Harrison’s principles of Internal Medicine，McGraw Hill Inc.，New York， 12th ed.)。感染性腹泻的实例包括但不限于，急性病毒性腹泻，急性 细菌性腹泻(例如，沙门氏菌，弯曲杆菌，和梭状芽胞杆菌)或原生动 物感染造成的腹泻，或旅行者腹泻(例如，诺瓦克病毒或轮状病毒)。 炎性腹泻的实例包括但不限于，吸收不良综合征，热带呕吐，慢性胰 腺炎，克隆氏病，腹泻，和肠易激综合征。本发明的GIP和GIP化合 物可以用于治疗或预防涉及胃肠道病症的急症或威胁生命的情境，例 如，在手术后或由于霍乱。此外，所述化合物可以用于治疗获得性免 疫缺陷综合征(AIDS)患者的肠功能障碍，尤其是在恶病质的过程中。 所述化合物也可以用于抑制小肠液和电解质分泌，和促进营养物运 输，以及增加胃肠道的细胞增殖，调节例如脂肪组织中的脂解作用， 和调节哺乳动物的血流量。本发明的GIP化合物也可以通过它们的胃 肠保护活性(例如，抑制胃分泌)，用于治疗或预防上述状况。因此， 本发明的GIP化合物可以用于治疗胃肠或粘膜损伤。损伤的示例类型 包括但不限于，炎性肠病，肠萎缩，特征在于肠粘膜或肠粘膜功能丧 失的状况，和胃肠道的其它状况，包括可以通过暴露于细胞毒性剂、 辐射、毒性、感染和/或损伤来产生的那些。此外，本发明的这些化合 物可以与镇痛药、抗炎剂、生长激素、肝素或可以用于治疗炎性肠病 或上述其它状况的任何其它治疗相组合。
在另一个实施方案中，GIP化合物可以用于治疗或预防胃炎，胰 腺炎，巴雷特食管，胃食管返流疾病(GERD)和与之有关的状况。这样 的状况包括但不限于，烧心，伴随胃/肠内容物反流进嘴或肺中的烧心， 吞咽困难，咳嗽，间歇性喘鸣和声带炎症(与GERD有关的状况)，食 管糜烂，食管溃疡，食管狭窄，食管组织化生(用异常上皮替代正常食 管上皮)，和肺吸入。GIP化合物可以具有抑制分泌性质，例如抑制胃 酸，抑制胆酸，和抑制胰酶。此外，GIP化合物也可以具有胃保护作 用。因此，本发明的GIP化合物可以具体地用于治疗或预防胃炎、胰 腺炎、巴雷特食管、和/或GERD和有关的或伴随的状况。
本发明也涉及药物组合物，其包含治疗或预防有效量的至少一种 本发明的新的GIP类似物或GIP杂合多肽，或其药学上可接受的盐， 以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或可 以用于递送GIP化合物的载体。
参考下面的实施方案和详述，可以更清楚地理解本发明的这些及 其它方面。
附图简述
图1A和1B显示了毒蜥外泌肽-4的Trp-笼的视图。图1A显示了 NMR-衍生的毒蜥外泌肽-4在30％含水三氟代乙醇中的总体结构。可 以看到Trp-笼折叠回毒蜥外泌肽的中央区域。图1B显示了来自毒蜥 外泌肽-4的溶液状态NMR总体结构的代表性结构的“Trp-笼”基序(残 基21-38)的CPK视图。
图2显示了参照序列和本发明的新的GIP类似物序列的序列和受 体结合和葡萄糖降低(在非糖尿病的NIH/Swiss小鼠中的口服葡萄糖 耐受试验(OGTT))活性。
图3A和3B显示了OGTT之后的葡萄糖变化抑制，和GIP和化 合物G在NIH/Swiss小鼠中的基础葡萄糖降低活性。在图3A中，条 代表着平均值±标准差，n＝6-10。在t＝-5，将肽腹膜内注射进禁食过夜 的NIH/Swiss小鼠。在t＝0施用灌胃(1.5g/kg)。在t＝30min取样。用 OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson&Johnson Company， Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈 特检验。在图3B中，各点代表着平均值±sem，n＝8-15。在t＝0，在 基线取样后立即将肽腹膜内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在 t＝60，120，和180分钟取样。用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.， a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体 对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。化合物G是(D-Ala2)GIP(1-30) -PSSGAPPPS酰胺形式：序列Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFV NWLLAQKPSSGAPPPS-NH2。化合物G具有提供DPP-IV抗性的N- 末端修饰和C-末端Trp-笼遮蔽(shield)。
图4显示了化合物G与全长GIP和毒蜥外泌肽-4在糖尿病的db/db 小鼠中的葡萄糖降低作用对比。各点代表着平均值±sem。n＝6-10。 在t＝0，在基线取样后立即将肽腹膜内注射进禁食2小时的db/db小 鼠。在t＝60，120，和180分钟取样。使用OneTouchUltra(LifeScan， Inc.，a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对 于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。
图5A-5D显示了包含GIP和胰淀素/降钙素样类似物肽的GIP杂 合体的实例。所述化合物具有GIP活性(例如，葡萄糖降低)和胃排空 的减少。
图6描述了本文提及的各种化学基团的结构。
图7描述了本文提及的各种化学Fmoc衍生物的结构。
图8A和8B描述了新的GIP类似物的葡萄糖降低作用。这些图 证实，在本文类似物的位置2的D-丙氨酸置换，会提高葡萄糖降低能 力。各点代表着平均值±sem。在t＝0，在基线取样后立即将肽腹膜内 注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60，120，180和240分 钟取样。使用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05； ANOVA，邓奈特检验。
图9描述了新的GIP类似物的葡萄糖降低作用，尤其是Trp-笼的 作用。各点代表着平均值±sem。在t＝0，在基线取样后立即将肽腹膜 内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60，120，180和240min 取样。使用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05； ANOVA，邓奈特检验。
图10A和10B描述了各种类似物的葡萄糖降低作用。在该实施例 中，Ac修饰和Pro3置换没有显著增加葡萄糖降低能力。各点代表着 平均值±sem。在t＝0，在基线取样后立即将肽腹膜内注射进禁食2小 时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60，120，180和240min取样。使用 OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson&Johnson Company， Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈 特检验。
图11证实了示例性的GIP杂合体0601GIP3794相对于天然GIP 的优越的蛋白酶抗性。
图12A-12AT描述了本发明的其它示例性的类似物和参照肽。意 在证实各种修饰和变体可以用于本发明，且可以如本文讨论地那样组 合。例如，术语毒蜥外泌肽尾或毒蜥外泌肽trp-笼基序包括任一种所 述的毒蜥外泌肽尾变体，其可以用作遮蔽序列(肽增强子)。其它感兴 趣的是，在图中显示的蛙GLP1C-末端延伸，它们也是可以用于替代 毒蜥外泌肽尾的遮蔽序列的另一个实例。
图13A和13B证实了GIP杂合体的食物摄取抑制和血糖降低。
图14.GIP杂合体在食物摄取测定中的作用。
图15.GIP杂合体在食物摄取测定中的作用。
图16A和16B证实了化合物10(图16A)和sCT(图16B)在食物摄 取测定中的作用。
图17证实了GIP杂合体在血糖降低中的作用。
图18A和18B描述了反应于不同剂量的测试化合物，即人GIP(1- 42)游离酸形式(图18A)和GIP杂合化合物G(图18B)，受体激活的全 心肌细胞中的cAMP生产。
图19A-E描述了通过遥测技术确定的施用GIP化合物的有意识的 大鼠的平均动脉压(图19A)、心率(图19B)、和血压改变速率(dP/dt， 图19C)、收缩压(图19D)和舒张压(图19E)的反应。平均动脉压显示 为在给药前30分钟测量的％给药前的值。图19C反映了对GIP化合 物的肌力反应。血压改变速率(dP/dt)是心脏收缩力的指标。
图20A，20B和20C描述了与毒蜥外泌肽-4相比，GIP(1-42)和GIP DPP-IV-抗性的类似物/毒蜥外泌肽-尾杂合体对食物摄取的急性作用。 胰激激素-胰淀素产生了预期的显著作用。
图21描述了与毒蜥外泌肽-4的作用相比，在饮食诱导的肥胖小 鼠中缺少体重减轻的作用。
图22提供了哺乳动物和非哺乳动物GIP的比对。位置Y1，E3， D9，S11，D15，F22，V23，L26，L27和K32在所有物种中都是保守 的。
图23A和B描述了GIP-胰淀素/sCT/胰淀素杂合体在降低胃排空 和减少细胞内钙水平方面的有益活性。
发明详述
抑胃多肽(GIP)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)是肠肽激素，它们通 过葡萄糖依赖性地刺激胰岛素分泌，发挥有效的葡萄糖调节作用。结 果，这些肠降血糖素激素具有作为潜在的抗糖尿病剂的吸引人的巨大 利益，并具有降低的低血糖风险。鉴于已经证实GLP-1、GLP-1类似 物和模拟物可以有效地控制2型糖尿病患者的葡萄糖水平，据报道与 正常个体相比，糖尿病受试者中GIP的促胰岛素作用显著减少(16-18)。 GLP-1(而不是GIP)的促胰岛素作用在相同糖尿病受试者中的保持， 表明2型糖尿病中的GIP信号转导受损。已经提出，胰腺β细胞中的 减少的GIP受体表达有助于糖尿病受试者的总体降低的肠降血糖素效 应(19)。尽管2型糖尿病受试者中存在的对GIP的促胰岛素应答减少， 但施用升高的药理学剂量的GIP或类似物，可能具有治疗效用。值得 注意的是，GIP缺少GLP-1(20)的胃肠效应，这已经限制了后一种肽 的治疗窗，从而允许更高的剂量方案的可能性(21)。
这些肠降血糖素激素的治疗性开发中的巨大障碍之一是，由于体 内酶降解，它们的较短的作用持续时间。二肽基肽酶IV(DPP-IV)在肽 的体内N-末端切割中起关键作用，最近，中性内肽酶24.11(NEP)也已 经被认为参与它们的降解(22-26)。几项研究已经报道了DPP-1V抗性 的GIP类似物在啮齿动物糖尿病模型中的更大的体内功效(27-28)。
本文提供了新的GIP类似物和含有GIP的杂合多肽，或其衍生物， 它们具有增强的或新的性质，包括增强的DPP-IV抗性，双激素活性， 和增加的血浆半衰期。本发明也提供了用于治疗或预防代谢疾病和病 症的方法，所述代谢疾病和病症包括可通过控制血糖水平、胰岛素水 平和/或胰岛素分泌来减轻的那些，例如糖尿病和糖尿病相关状况，且 所述状况和病症包括但不限于高血压，血脂异常，心血管疾病，摄食 障碍，胰岛素抵抗，肥胖，和任何种类的糖尿病，包括1型、2型、 和妊娠糖尿病。所述方法包含，给有需要的受试者施用治疗或预防有 效量的本文所述的GIP或GIP类似物，其片段或衍生物或新的GIP类 似物或GIP杂合体或其衍生物，它是单独地(单一疗法)或与另一种试 剂或疗法相组合(辅助疗法)，例如降糖剂(例如，抗糖尿病剂)或抑制或 减少胃排空的试剂或方法(本文提供了这样的试剂的实例)。
除了新的GIP类似物和衍生物以外，本发明涉及新的含有GIP的 可选择杂合多肽，其可以用作治疗和预防代谢疾病和病症的试剂，所 述代谢疾病和病症可通过控制血糖水平、胰岛素水平和/或胰岛素分泌 来减轻，例如糖尿病和糖尿病相关状况。这样的状况和病症包括但不 限于，高血压，血脂异常，心血管疾病，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥 胖，和任何种类的糖尿病，包括1型、2型、和妊娠糖尿病。
在一个方面，本发明涉及可基于“生物活性”(例如治疗效力、功 能范围、作用持续时间、物理化学特性和/或其它药代动力学特性)选 择的生理学、代谢学和/或药代动力学活性肽模块的模块化组装。
不受理论的限制，本发明至少部分涉及“工具箱”方法，其中生 物活性肽激素模块以二元、三元或更多元组合连接，以产生具有可选 择性质的新型有效治疗剂。“生物活性肽激素模块”可以是肽激素、 具有激素活性的肽片段，或赋予化学、代谢和/或其它药代动力学稳定 性的肽激素结构基序。肽激素可包括本领域已知的和本文描述的天然 肽激素以及肽激素类似物和衍生物。
在本发明的一个方面，业已发现两个或多个肽激素的某些物理化 学特征组合成单一形态，可利于在功能障碍性代谢循环中的几个位置 进行干预。因此，在本发明的一个方面，提供了合理设计的杂合多肽， 其将可选择的生物活性整合入单个多肽试剂中。在一个实施方案中， 本发明的可选择杂合多肽可包括使用化学稳定接头，以共价连接生物 活性模块。在另一个实施方案中，本发明的可选择杂合多肽可包括使 用可切割的接头，其自身可以是或构成生物活性模块的一部分。
此外，不受理论的限制，本发明的杂合多肽的设计一般可包括：(1) 鉴别、选择和配对用于得到需要的效力和治疗用途的生物活性肽激素 模块，和(2)直接或利用接头共价连接生物活性模块(例如天然肽激 素、具有激素活性的肽激素类似物或衍生物、具有激素活性的肽激素 的片段、稳定基序等)，而不损失组成模块的生物活性。在某些实施方 案中，模块选择标准可包括但不限于：(a)用于所需治疗或预防适应症 的所需体内效力，例如叠加和协同作用；(b)用于多种治疗或预防适应 症的连接的模块的任选协同或双重作用；和/或(c)所需化学稳定性、构 象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、受体相互作用、 蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物代谢动力学特性。
GIP，GIP类似物和新的GIP类似物。(本文使用的章节标题仅 用于编排目的，不能被解读为以任何方式限制所述主题。)参照序列 包括人GIP，截短的GIP，人GLP-1，毒蜥外泌肽-4，示例性的Trp- 笼，和示例性的“遮蔽”序列(例如短和长“毒蜥外泌肽尾”)：
  SEQ ID   NO：   描述   序列   GIP(1-42)酸   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKK   NDWKHNITQ-OH   GIP(1-30)   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-NH2   GLP-1   HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2   毒蜥外泌肽-4   HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSG   APPPS-NH2   Ex-4尾/长   ...................................................KNGGPSSG   APPPS   Ex-4尾/短   ...........................................................PSSG   APPPS   Trp-笼   ..........................................FIEWLKNGGPSS   GAPPPS
在本文公开的治疗和在本文公开的新的GIP杂合体中有用的是， 天然GIP肽激素，及其功能性肽类似物和衍生物。在本文中描述了某 些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物，但是应当认识到，本领域已 知的表现出激素活性的任意已知GIP肽，可以用作本文新的GIP类似 物或杂合体的组分，或用于本文公开的新的辅助疗法中。在一个实施 方案中，GIP肽类似物和衍生物具有天然GIP肽的至少一种激素活性。 在某些实施方案中，GIP肽类似物是天然GIP肽能特异性地结合的受 体的激动剂。示例性的GIP肽类似物和衍生物包括在本文的参考文献 中所述的那些，它们在本文引作参考。尽管本申请描述了GIP多肽化 合物作为用于本文所述方法和治疗中的GIP类似物、新的GIP类似物、 和新的GIP杂合体，进一步预见到，可以施用任何合适的GIP激动剂 来替代GIP化合物，这样的激动剂包括激动剂抗体和抗体片段和衍生 物，和小分子GIP受体激动剂。因此，当GIP化合物或多肽要用于特 定的治疗方法中时，在另一个实施方案中，预见到可以使用GIP激动 剂，尤其是激动剂抗体或其片段或衍生物。
在血清中，GIP会被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解。产生的较短生 物半衰期(在体内约2分钟)限制了GIP的治疗用途。
下面的参考文献涉及各种GIP类似物，基于它们在各种靶器官中 的功能，可以用于提供本发明的新的GIP类似物和GIP杂合体的组分， 用于本发明的新疗法中。
德国专利申请19921537公开了通过刺激生产胰岛素的β-细胞的 增殖和预防它们的程序性细胞死亡，延长它们的存活的方法。具体的 目标是，增加内源胰岛素含量和对升高的血糖水平的胰岛素应答。本 发明的一种重要组分是，反应于效应物(例如GLP-1，GIP，毒蜥外 泌肽-4或GLP-1受体激动剂或GIP-受体激动剂)的施用，激活生产 胰岛素的β-细胞中的蛋白激酶B/Akt。
欧洲专利申请0479210公开了式GIP(1-13)-X-GIP(15-30)-Y的GIP 类似物，其中X是除Met以外的氨基酸残基，且Y选自高丝氨酸(包 括高丝氨酸-内酯)(称作″Hse″)，高丝氨酸酰胺(Hse-NH2)，H-Gly-Lys- Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-Hse或H-Gly-Lys-Lys-Asn- Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-Hse-NH2。
2003年12月18日公开的Hinke等的美国专利申请20030232761 报道了GIP的C-末端截短的片段和N-末端修饰的类似物，以及各种 具有还原的肽键或邻近二肽基肽酶IV(DPP-IV)特异性切割位点的氨基 酸的改变的GIP类似物，所述改变提供DPP-IV抗性和延长的半衰期。 还报道了在GIP的潜在受体结合位点之间具有不同接头的类似物。
WO98/24464公开了基本上由与GIP序列的位置7-30相对应的24 个氨基酸的多肽组成的葡萄糖依赖性的促胰岛素多肽(GIP)的拮抗剂， 治疗非胰岛素依赖性糖尿病的方法，和提高非胰岛素依赖性糖尿病患 者的葡萄糖耐受性的方法。
WO 00/58360和EP1171465公开了肽，它们刺激胰岛素的释放。 公开内容提供了在N末端修饰GIP的方法，和该肽类似物用于治疗糖 尿病的用途。在该发明中公开的具体的肽类似物，包含至少15个来 自GIP(1-42)的N末端的氨基酸残基。在另一个实施方案中，公开了 Tyr1-葡糖醇GIP(1-42)。
WO 00/20592公开了GIP或GIP的抗独特型抗体或其作为GIP-类 似物的片段，用于维持或增加骨密度或骨形成。
Kuhn-Wache等(2000)公开了具有增加的二肽基肽酶IV抗性的 GIP类似物(Kuhn-Wache等，in Langner & Ansorge，Cellular peptidases in Immune Functions和Diseases 2.Kluwer Academic/Plenum Publishers，187-195.)
O’Harte等和Ghault等已经报道了GIP(1-30)类似物--Tyr1-葡糖 醇-GIP和(Pro3)GIP，其表现出DPP-IV抗性和增强的生物活性(O′Harte 等，NH2-terminally modified gastric inhibitory polypeptide exhibits amino-peptidase resistance and enhanced antihyperglycemic activity， Diabetes 48，758-765(1999))；并且参见Gault等“Characterization of the cellular and metabolic effects of a novel enzyme-resistant antagonist of Glucose-dependent insulinotropic polypeptide.”Biochemical and Biophysical Research Communications 290，1420-1426(2002))。
本领域已知的具体的有活性的GIP和GIP类似物包括：
  SEQ ID   No：   描述   序列   hGIP(1-42)   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKN   DWKHNITQ   hGIP(1-30)   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK   小鼠   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKS   DWKHNITQ   大鼠   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKN   DWKHNLTQ   猪   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKS   DWKHNITQ   牛   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKS   DWIHNITQ   GIP(1-14)   YAEGTFISDYSIAM   GIP(19-30)   QQDFVNWLLAQK   GIP(3-42)   拮抗剂   EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKND   WKHNITQ
特别感兴趣的是，在二肽基肽酶IV(DPP-IV)特异性切割位点处或 附近修饰的类似物，它们会提高DPP-IV抗性，并从而延长半衰期。 氨基酸改变包括被DPP-IV切割的GIP的前3或4个残基和/或残基2 和3之间的键的修饰。修饰和置换包括N-末端修饰，L-氨基酸，D-氨 基酸，蛋白质生成的和非蛋白质生成的氨基酸。蛋白质生成的氨基酸 定义为天然蛋白衍生的α-氨基酸。非蛋白质生成的氨基酸定义为不是 普通天然蛋白的基本单位的所有其它氨基酸。
进一步感兴趣的是，具有一个或多个本文所述修饰的新的GIP类 似物，它们在GIP部分的整个长度，表现出与天然GIP(1-30)、天然 GIP(1-26)、天然GIP(1-14)、天然GIP(1-39)、天然GIP(19-30)、天然 GIP(19-26)、天然GIP(19-39)、天然GIP(19-42)或天然GIP(1-42)的至 少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、 至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。
特别感兴趣的是，包含GIP的N-末端的至少11，12，13，14或 15个氨基酸残基的那些GIP化合物，例如GIP(1-42)，其具有至少一 个在位置1-3的氨基酸置换或修饰，且是生物活性的。这包括在至少 一个赖氨酸残基的ε氨基处添加脂肪酸的修饰，存在于或导入在分子 中。具体的修饰包括GIP的Tyr1-葡糖醇，例如Tyr1-葡糖醇GIP(1-42) 或Tyr1-葡糖醇GIP(1-30)。感兴趣的GIP类似物包括，包含选自下组 的置换或修饰的那些：在1、2和/或3号位置的D-氨基酸置换，和/或 N-末端糖化、烷化、乙酰化或酰化、或本文所述的其它N-末端修饰。 进一步感兴趣的是这样的类似物，其中在2或3号位置的氨基酸被赖 氨酸、丝氨酸、4-氨基丁氨酸、Aib、D-丙氨酸、肌氨酸或脯氨酸置 换。在GIP的1、2或3号位置、更具体地在2号位置的其它示例性 的置换是dAla，Val，dnorVal，dSer，Abu，dAbu，高-Ser，d-高Ser， dPro，环丙基Ala，d-环丙基Ala，环己基Ala，d-环己基Ala，A(NMe)， Aib，和环丙基Gly。
其它示例性的GIP类似物化合物具有在N-末端的修饰，保持它们 的GIP受体结合，其中所述N-末端修饰包括H，isocap，isoBuOCO， 辛基甘氨酸，Y(NMe)和琥珀酰基。其它示例性的GIP化合物包括， 具有脂肪酸修饰或本文所述修饰的组合的那些，同时保持它们的GIP 受体结合和受体激活活性，例如，N-末端修饰可以与在位置1、2或3 的置换或修饰(它赋予对本文所述DPP-IV的抗性)相组合，或与脂肪酰 基衍生物修饰(它可以减少肾清除)相组合。在另一个实施例中，在位 置1、2或3的置换或修饰与脂肪酰基衍生物相组合。例如，N-末端 辛基甘氨酸与在位置1、2的d-氨基酸、尤其在位置2的D-Ala相组 合。在一个实施方案中，脂肪酰基置换是用辛基甘氨酸置换在位置16 的赖氨酸或在位置14的甲硫氨酸。在其它实施方案中，在位置14的 甲硫氨酸缺失，且例如这可以进一步与用辛基甘氨酸置换在位置16 或30的赖氨酸相组合。另一种置换是酰化位置16或30的赖氨酸， 例如用辛基或棕榈酰基。其它实施方案包括，脂肪酰基置换，其中用 辛基甘氨酸置换在位置16或30的赖氨酸或在位置14的甲硫氨酸。 为了消除或减少氧化，位置14的甲硫氨酸缺失，或被例如亮氨酸或 其它小的疏水氨基酸置换，和/或位置25的色氨酸缺失，或被例如苯 丙氨酸置换。
在一个实施方案中，是在GIP的氨基酸1-30中具有至少1或2 个氨基酸缺失的类似物，在GIP的氨基酸4-30中具有1或2个缺失 的那些，在氨基酸4-15中具有1个或多个缺失的那些，和在氨基酸 1-30，4-30或4-15中具有1个氨基酸缺失的那些。当然，这样的修饰 可以与本文所述的至少一种其它变化相组合，所述其它变化例如赋予 DPP-IV抗性、减少或消除氧化、减少肾清除、改进受体结合、或改 进受体激活的变化。
其它示例性的置换是源自其它(非人)物种的GIP的那些，例如用 亮氨酸替代甲硫氨酸14，用E替代位置9或21的D，用丙氨酸、精 氨酸或赖氨酸替代组氨酸18，用丙氨酸、精氨酸或组氨酸替代位置30 的赖氨酸，用亮氨酸替代位置13的丙氨酸，和用丝氨酸替代位置28 的丙氨酸。
在一个实施方案中，GIP类似物具有一种或多种下述修饰：dAla2 修饰为Abu，Ala，Gly，或Ser；Met14-Leu；His18修饰为Ala，Arg， 或Lys；Asp21至Glu；Lys30修饰为Arg或His；和/或N-末端修饰为 Gly(Oct)。
在下面的化合物中显示了其它示例性的GIP修饰和组合：
 SEQ ID NO：   序列   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVNWLLAQR   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQR   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVNWLLAQR   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVNWLLAQH   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQH   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVNWLLAQH   YaEGTFISDYSIAMDKIHQVKFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQH   YaEGTFTADYSKALDKIHQQDFVNWLLAQK   YaEGTFTSDYSKALDKIHQQDFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSKAMDKIRQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALEKIRQQKFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIRQQDFVEWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQLFIEWLKNGG   YaEGTFISDYSIAMDKIRQQEFVNWLLAQK   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNFLLAQK   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNFLLAQK
因此，本文所述的修饰可以与本文所述的至少一种其它变化相组 合，所述其它变化例如赋予DPP-IV抗性、减少或消除氧化、减少肾 清除、改进受体结合、或改进受体激活的变化。例如，预见到具有一 种或多种本文所述的置换或修饰的具体类似物，例如GIP D-Ala2或 L-Ala2类似物，它也用Phe置换位置25的Trp。
GIP杂合多肽
生物活性的肽激素模块。如本文讨论的，本发明的GIP杂合多肽 (也称作“杂合体”)通常包含至少2个共价连接在一起的生物活性的肽 激素模块，其中GIP肽作为一个模块。生物活性的肽激素模块可以是： (a)天然组分肽激素，(b)保留激素活性的天然组分肽激素类似物或衍 生物，(c)保留激素活性的天然组分肽激素的片段，(d)保留激素活性 的天然组分肽激素类似物或衍生物的片段，(e)赋予杂合多肽希望的 化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、 受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物代谢动力 学特性的天然组分肽激素的结构基序；或(f)赋予杂合多肽希望的化 学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组织靶定、 受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物代谢动力 学特性的天然组分肽激素类似物或衍生物的结构基序。(e)和(f)的结构 基序在本文中集中称作“肽增强子”。肽增强子的一个实例是Trp笼序 列，尤其是源自毒蜥外泌肽-4的Trp笼序列，例如Ex-4短或长尾。
示例性的生物活性的肽激素模块包括选自下组的天然肽激素：胰 淀素，ADM，CT，CGRP，垂体中间叶激素，CCK(1-33)，CCK-8， 瘦蛋白，PYY(1-36)，PYY(3-36)，GLP-1(1-37)，GLP-1(7-37)，GLP- 1(7-36)，GLP-2，OXM，GIP，毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4，利钠肽 激素，尿皮质激素家族肽，例如，Ucn-2和Ucn-3，神经调节肽家族 肽，例如神经调节肽U25或剪接变体，和ANP，BNP，CNP或尿舒 张肽。
其它示例性的生物活性的肽激素模块包括选自下组的组分肽激素 的类似物和衍生物：胰淀素，ADM，CT，CGRP，垂体中间叶激素， CCK，瘦蛋白，PYY(1-36)，PYY(3-36)，GLP-1(1-37)，GLP-1(7-37)， GLP-1(7-36)，GLP-2，OXM，利钠肽激素，尿皮质激素家族肽，例如， Ucn-2和Ucn-3，神经调节肽家族肽，例如神经调节肽U25或剪接变 体，毒蜥外泌肽-3，和毒蜥外泌肽-4，其中所述类似物或衍生物表现 出组分肽激素的至少一种激素活性。所述类似物可以包含组分肽激素 的氨基酸序列的一个或多个插入、缺失或置换，且所述衍生物可以包 含类似物或组分肽激素的氨基酸残基的一个或多个化学修饰，如本文 更充分地描述的和本领域已知的。
更具体地，类似物和衍生物可以选自上述的和/或本领域已知的任 一种。表现出至少一种激素活性、可以用作本发明的生物活性的肽激 素模块的具体示例性的类似物和衍生物包括下面这些：
  胰淀素：   2Ala-h-胰淀素，2，7Ala-h-胰淀素，28Pro-h-胰淀素，25，28Pro-h-胰淀素，25，28，29Pro-h-胰淀   素，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素，18Arg，25，28Pro-h-胰淀素，18Arg，25，28，29Pro-h-胰   淀素，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素，18Arg，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素，18Arg23Leu，   25，28Pro-h-胰淀素，和2，7-Cyclo-[2Asp，7Lys]-h-胰淀素   CT：   14Glu-sCT，18Arg-sCT，11，18Arg-sCT，14Glu，18Arg-sCT，14Glu，11，18Arg-sCT   CGRP：   36D-Ser-CGRP，36D-Thr-CGRP，36D-Asp-CGRP，36D-Asn-CGRP，36Ser-CGRP，   36Hse-CGRP，36Asp-CGRP，36Thr-CGRP，36Asn-CGRP   AFP-6：   TQAQLLRVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY，   TQAQLLRVGCDTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY，   TQAQLLRVGMVLGTMQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY，   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY，   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQESAPVEPSSPHSY，   CCK：   DY(OSO3H)MGWMDF，DYMGWMDF，MGWMDF，GWMDF，WMDF，   KDY(OSO3H)MGWMDF，KDYMGWMDF，KMGWMDF，KGWMDF，KWMDF   瘦蛋白：   43Asp-瘦蛋白，43Glu-瘦蛋白，48Ala-瘦蛋白，49Glu-瘦蛋白，49Des-AA-瘦蛋白，75Ala-   瘦蛋白，89Leu-瘦蛋白，93Asp-瘦蛋白，93Glu-瘦蛋白，98Ala-瘦蛋白，139Leu-瘦蛋白，   PYY：   3Leu-PYY，3Val-PYY，4Arg-PYY，4Gln-PYY，4Asn-PYY，25Lys-PYY，34Pro-PYY，   34His-PYY，1，36Tyr-PYY，13Pro14Ala-PYY，31Leu34Pro-PYY，des-AA-4-PYY   GLP-l   9Gln-GLP-1(7-37)，D-9Gln-GLP-1(7-37)，16Thr-18LysGLP-1(7-37)，18Lys-GLP-1(7-   37)，8Gly-GLP-1(7-36)，9Gln-GLP-1(7-37)，D-9Gln-GLP-1(7-37)，乙酰基-9Lys-GLP-   1(7-37)，9Thr-GLP-1(7-37)，D-9Thr-GLP-1(7-37)，9Asn-GLP-1(7-37)，D-9Asn-GLP-   1(7-37)，22Ser23Arg24Arg26Gln-GLP-1(7-37)，16Thr18Lys-GLP-1(7-37)，18Lys-GLP-1(7-   37)，23Arg-GLP-1(7-37)，24Arg-GLP-1(7-37)   GIP   Y-dAla2-GIP   毒蜥外泌   肽   14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4，5Ala，14Leu，25Phe-毒蜥外   泌肽-4，和14Leu，22Ala，25Phe-毒蜥外泌肽-4
如本领域所知，这样的肽化合物可以优选地酰胺化，但在本发明 的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
其它示例性的生物活性的肽激素模块包括，选自以下的组分肽激 素的片段：胰淀素，ADM，CT，CGRP，垂体中间叶激素，CCK，瘦 蛋白，PYY(1-36)，PYY(3-36)，GLP-1(1-37)，GLP-1(7-37)，GLP-1(7- 36)，GLP-2，OXM，利钠肽，尿皮质激素家族肽，例如，Ucn-2和Ucn-3， 神经调节肽家族肽，例如神经调节肽U25或剪接变体，毒蜥外泌肽-3， 和毒蜥外泌肽-4，其中所述片段具有组分肽激素的至少一种激素活性。
其它示例性的生物活性的肽激素模块包括，选自以下的组分肽激 素类似物或衍生物的片段：胰淀素，ADM，CT，CGRP，垂体中间叶 激素，CCK，瘦蛋白，PYY(1-36)，PYY(3-36)，GLP-1(1-37)，GLP- 1(7-37)，GLP-1(7-36)，GLP-2，OXM，ANP，BNP，CNP，尿舒张肽， Ucn-2和Ucn-3，神经调节肽U25或剪接变体，神经调节肽，毒蜥外 泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，其中所述片段具有组分肽激素的至少一种激 素活性。此外，如本文更充分地描述的和本领域已知的，类似物可包 含组分肽激素氨基酸序列的一个或多个插入、缺失或置换，衍生物可 包含类似物或组分肽激素的氨基酸残基的一个或多个化学修饰。
表现出至少一种激素活性的某些示例性的片段包括以下物质。但 是，应当理解的是，预见到上述类似物和衍生物以及本领域已知片段 的组合，包括本文所述示例片段。
  胰淀素：   胰淀素(1-36)，胰淀素(1-35)，胰淀素(1-20)，胰淀素(1-18)，胰淀素(1-17)，   胰淀素(1-16)，胰淀素(1-15)，胰淀素(1-7)   CT：   CT(8-32)，CT(8-27)，CT(8-26)，CT(8-10)，CT(18-26)，CT(18-27)   AFP-6：   AFP-6(18-27)   CCK：   CCK-8，CCK-5，CCK-4   瘦蛋白：   瘦蛋白(22-167)，瘦蛋白(56-73)   PYY：   PYY(1-35)，PYY(1-30)，PYY(1-25)，PYY(1-15)，PYY(1-10)，PYY(2-36)，   PYY(3-36)，PYY(4-36)，PYY(5-36)   GLP-1   GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)，GLP-1(7-35)   GIP   GIP(1-14)，GIP(1-30)或更长，GIP(1-39)或更长   毒蜥外泌肽   毒蜥外泌肽-4(1-27)，毒蜥外泌肽-4(1-28)，毒蜥外泌肽-4(1-29)，毒蜥外   泌肽-4(1-30)或更长
此外，如本领域所知，这样的肽化合物可以优选地酰胺化，但在 本发明的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。而且， 上述示例性的片段可与本文论述或本领域已知的任何类似物或衍生物 组合。例如，示例性的类似物的片段可包括5Ala，14Leu，25Phe-毒蜥 外泌肽-4(1-28)，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)，5Ala，14Leu，25Phe- 毒蜥外泌肽-4(1-28)，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(1-27)或所公开的片段、 类似物和衍生物的任何其它组合。其它实施方案包括NN2211和ZP- 10。
其它示例性的生物活性肽模块包括“肽增强子”，即赋予杂合多 肽所需化学稳定性、构象稳定性、代谢稳定性、生物利用度、器官/组 织靶定、受体相互作用、蛋白酶抑制、血浆蛋白结合、和/或其它药物 代谢动力学特性的组分肽激素(包括其类似物和衍生物)的结构基序。 示例性的肽增强子包括以下物质。
  胰淀素家族   胰淀素(32-37)，胰淀素(33-37)，胰淀素(34-37)，胰淀素(35-37)，胰淀   素(36-37)，胰淀素(37)，ADM(47-52)，ADM(48-52)，ADM(49-52)，   ADM(50-52)，ADM(51-52)，ADM(52)，CT(27-32)，CT(27-32)，   CT(28-32)，CT(29-32)，CT(30-32)，CT(31-32)，CT(32)，CGRP(32-37)，   CGRP(33-37)，CGRP(34-37)，CGRP(35-37)，CGRP(36-37)，CGRP(37)，   垂体中间叶激素(42-47)，垂体中间叶激素(43-47)，垂体中间叶激素   (44-47)，垂体中间叶激素(45-47)，垂体中间叶激素(46-47)，垂体中间   叶激素(47)   PYY   PYY(25-36)，PYY(26-36)，PYY(27-36)，PYY(28-36)，PYY(29-36)，   PYY(30-36)，PYY(31-36)，PYY(32-36)，PYY(25-35)，PYY(26-35)，   PYY(27-35)，PYY(28-35)，PYY(29-35)，PYY(30-35)，PYY(31-35)，   PYY(32-35)   GLP-1和2   蛙GLP-1(29-37)；蛙GLP-1(30-37)；蛙GLP-2(24-31)，蛙GLP-2(25-31)   GIP   GIP(31-42)，GIP(32-42)，GIP(33-42)，GIP(34-42)，GIP(35-42)，   GIP(36-42)，GIP(37-42)，GIP(38-42)，GIP(39-42)，GIP(40-42)，   GIP(41-42)，GIP(42)   毒蜥外泌肽-4   毒蜥外泌肽-4(31-39)，毒蜥外泌肽-4(32-39)，毒蜥外泌肽-4(33-39)，   毒蜥外泌肽-4(34-39)，毒蜥外泌肽-4(35-39)，毒蜥外泌肽-4(36-39)，   毒蜥外泌肽-4(37-39)，毒蜥外泌肽-4(38-39)，毒蜥外泌肽-4(39)
此外，应当理解的是，预见到上述GIP类似物和衍生物以及以下 生物活性肽模块的组合。例如，还预见到本领域已知和/或上述的胰淀 素家族肽激素类似物和衍生物的最后6个氨基酸残基作为示例性的生 物活性肽模块。例如，如本文进一步讨论的，将肽增强子Ex-4短尾 (它是示例性的Trp-笼序列)或其类似物添加到任意GIP类似物的C- 末端，在其它实施方案中，使用接头来接头肽增强子。
在一个方面，新的GIP杂合体包括GIP部分，该GIP部分在GIP 部分的整个长度，表现出与天然GIP(1-30)、天然GIP(1-26)、天然 GIP(1-14)、天然GIP(1-39)、天然GIP(19-30)、天然GIP(19-26)、天然 GIP(19-39)、天然GIP(19-42)或天然GIP(1-42)的至少50％、至少60％、 至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、 至少95％或至少98％的序列同一性。
因此，在某些实施方案中，GIP杂合体的GIP部分可以包含trp- 笼基序。这样的希望的GIP杂合体包括N-末端GIP或新的GIP类似 物的片段，其与具有葡萄糖降低活性(例如，抗糖尿病剂，毒蜥外泌肽) 或抑制或减少胃排空的能力的C-末端多肽或其片段组合。这样的希望 的GIP杂合体包括N-末端GIP片段或新的GIP类似物的片段，其与 C-末端毒蜥外泌肽，GLP1，symlin(普兰林肽)，胰淀素，CCK，胃泌 素，PYY，胰泌素，GRP，神经调节肽，尿皮质激素，降钙素，或鲑 鱼降钙素，或其片段组合。在其它实施方案中，希望的GIP杂合体包 括C-末端GIP或新的GIP类似物的片段，其与具有葡萄糖降低活性(例 如，抗糖尿病剂，毒蜥外泌肽)或抑制或减少胃排空的能力的C-末端 多肽或其片段组合。在这样的实施方案中，嵌合多肽可以包括C-末端 GIP、新的GIP类似物(在该情况下，存在形成Trp-笼的序列)或其片段， 其与N-末端毒蜥外泌肽，GLP1，symlin(普兰林肽)，胰淀素，CCK， 胃泌素，PYY，胰泌素，GRP，神经调节肽，尿皮质激素，降钙素， 或鲑鱼降钙素，或其片段组合。
在其它实施方案中，所述GIP或新的GIP类似物与下述配体相组 合：胃泌素/CCK受体配体；胰淀素受体配体；降钙素受体配体；CGRP 受体配体，PYY受体配体，EGF受体配体；胰高血糖素样肽1受体配 体；胰高血糖素样肽2受体配体；抑胃多肽(GIP)受体配体；角质形成 细胞生长因子(KGF)受体1配体；二肽基肽酶IV抑制剂；REG蛋白 受体配体；生长激素受体配体；泌乳素(PRL)受体配体；胰岛素样生 长因子(IGF)受体配体；PTH-相关蛋白(PTHrP)受体配体；肝细胞生长 因子(HGF)受体配体；骨形态发生蛋白(BMP)受体配体，转化生长因 子(TGF受体配体；层粘连蛋白受体配体；血管活性肠肽(VIP)受体配 体；成纤维细胞生长因子(FGF)受体配体；神经生长因子(NGF)受体配 体；胰岛新生相关蛋白(INGAP)受体配体；Activin-A受体配体；血管 内皮生长因子(VEGF)受体配体；促红细胞生成素(EPO)受体配体；垂 体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)受体配体；粒细胞集落刺激因子(G- CSF)受体配体；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；血小板衍 生的生长因子(PDGF)受体配体，和胰泌素受体配体。
本发明的多肽优选地至少部分地保留天然人GIP的生物活性，例 如，本发明的多肽通常是GIP激动剂或拮抗剂。在一个实施方案中， 本发明的多肽表现出治疗和预防代谢状况和病症的生物活性。此外， 本发明的新的GIP类似物多肽可以包括内部接头化合物，可以包括位 于内部氨基酸残基处的化学修饰，或可以在N-末端或C-末端残基处 化学修饰。在另一个实施方案中，本发明的多肽仅包括天然L氨基酸 残基和/或修饰的天然L氨基酸残基。或者，在另一个实施方案中，本 发明的多肽不包括非天然氨基酸残基。
在示例性的GIP杂合体实施方案中，所述GIP部分包含GIP N-末 端区域，该区域被修饰或置换，以提供优于天然GIP的DPP-IV抗性。
示例性的肽组分家族
天然肽激素是本领域已知的，它们的类似物和衍生物也是如此。 作为参考，本文提供了几种天然肽激素的序列。
示例性的肽激素
SEQ ID     描述          序列
No：
           大鼠胰淀素    KCNTATCATQRLANFLVRS SNNLGPVLPPTNVGSNTY
           h-胰淀素：    KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
           h-ADM：       YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDN
               VAPRSKISPQGY
s-CT：         CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP
h-CT：         CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP
h-CGRPα：     ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF
h-CGRPβ：     ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF
h-AFP-6(1-47)  TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVD
               PSSPHSY
h-AFP-6(8-47)：VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY
小鼠AFP-6(1-   PHAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLVRPAGRRDSAPVDP
47)：          SSPHSY
小鼠AFP-6(8-   VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLVRPAGRRDSAPVDPSSPHSY
47)：
硫酸化的CCK-DY(SO3)MGWMDF
8：
h-瘦蛋白：     MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRI
               NDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI
               LTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETL
               DSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC
hPYY：         YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY
hPYY(3-36)     IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY
hGLP-1(1-37)： HDEFERHAEGTFTSDVSSTLEGQAALEFIAWLVKGRG
蛙GLP-1：      HAEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGKPKKIRYS-OH；
               HAEGTFTSDVTQQLDEKAAKEFIDWLINGGPSKEIIS-OH
h-GLP-1(7-36)：HAEGTFTSDVSSYLEGQAALEFIAWLVKGR
h-GLP-2        HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIETKITD
蛙GLP-2：      HAEGTFTNDMTNYLEEKAAKEFVGWLIKGRP-OH
OXM：          HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
毒蜥外泌肽-3： HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
毒蜥外泌肽-4   HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
当生理上表达时，这些肽通常是C-末端酰胺化的，但是对于本发 明的目的是不需要的。换而言之，这些肽的C-末端，以及本发明的GIP 杂合多肽，可以具有游离的-OH或-NH2基团。这些肽也可以具有其 它的翻译后修饰。本领域技术人员会明白，本发明的杂合多肽也可以 用N-末端甲硫氨酸残基构建。
也预见到，除了包含GIP杂合体以外，在其它实施方案中，本文 所述的激素可以用于辅助疗法，与本发明的GIP类似物一起施用。
胰淀素家族。如本文讨论的，在本发明中与GIP或新的GIP类似 物一起使用的组分肽激素包括胰淀素家族肽激素，包括胰淀素，肾上 腺髓质素(“ADM”)，降钙素(“CT”)，降钙素基因相关肽(“CGRP”)，垂 体中间叶激素(也称作“AFP-6”)和相关肽。天然胰淀素家族肽激素是本 领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是如此。在本文中描述了某 些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物，但是应当认识到，本领域已 知的表现出激素活性的任意已知胰淀素家族肽，可以与本发明联合使 用。本领域已知的任意胰淀素类似物或衍生物，可以与本发明联合使 用。
参与代谢疾病和病症的另一个肽激素家族是胰淀素家族的肽激 素，包括胰淀素，降钙素，降钙素基因相关肽，肾上腺髓质素，和垂 体中间叶激素(也称作“AFP-6”)。胰淀素是一种37个氨基酸的肽激素。 它经过分离，纯化，化学表征为人2型糖尿病胰岛中的淀粉样沉积物 的主要组分(Cooper等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：8628- 8632(1987))。胰淀素分子具有2种翻译后修饰：C-末端被酰胺化，位 置2和7的半胱氨酸交联形成N-末端环。人胰淀素基因的开放读码框 序列显示了Lys-Arg二碱基氨基酸蛋白水解切割信号的存在，在Lys 的N-末端密码子之前，且Gly在CLAIMS-末端位置的Lys-Arg蛋白 水解信号之前，即蛋白酰胺化酶PAM的酰胺化的典型序列(Cooper 等，Biochem.Biophys.Acta，1014：247-258(1989))。
认为胰淀素会调节胃排空，抑制胰高血糖素分泌和食物摄取，从 而调节葡萄糖在循环中的出现速率。它似乎是补充胰岛素的作用，后 者调节葡萄糖从循环中的消失速率、和周围组织对它的摄取。这些作 用得到了在啮齿动物和人类中的实验发现的支持，这些发现表明，胰 淀素通过至少3个独立的机理，补充胰岛素在餐后葡萄糖控制中的作 用，所有3个机理都影响葡萄糖的出现速率。首先，胰淀素会抑制餐 后胰高血糖素分泌。与健康成年人相比，1型糖尿病患者没有循环胰 淀素，2型糖尿病患者具有减少的餐后胰淀素浓度。此外，输注胰淀 素特异性的单克隆抗体(它结合循环胰淀素)，又会导致相对于对照 极大升高的胰高血糖素浓度。这两种结果都指出了内源胰淀素在调节 餐后胰高血糖素分泌中的生理作用。其次，胰淀素会降低胃肠蠕动性 和胃排空。最后，证实了大鼠胰淀素的下丘脑内注射会减少大鼠的进 食，并改变下丘脑的神经递质代谢。在某些研究中，在下丘脑内注射 大鼠胰淀素和大鼠CGRP后，显著减少食物摄取高达8小时。在人试 验中，已经证实胰淀素类似物普兰林肽会减少体重或体重增加。胰淀 素可以有用地用于治疗代谢状况，例如糖尿病和肥胖。胰淀素也可以 用于治疗疼痛、骨病、胃炎，调节脂质，尤其是甘油三酯，或影响身 体组成，例如优先消耗脂肪和保留无脂肪组织。
激素降钙素(CT)因为它反应于诱导的高钙血症而分泌和它的快速 降钙作用得名。它由甲状腺中的神经内分泌细胞产生和分泌，它们以 前称作C细胞。最深入研究的CT(1-32)的作用是，它对破骨细胞的 作用。CT的体外作用包括，皱褶缘的快速消失和溶酶体酶的释放减 少。最后，CT对破骨细胞功能的抑制，会导致骨重吸收的减少。但 是，在甲状腺切除术情况下血清CT的慢性减少、和在甲状腺髓样癌 中发现的增加的血清CT，似乎都与血清钙或骨量无关。因而最可能 地，CT(1-32)的主要功能是抵抗紧急情况下的急性高钙血症和/或保护 在“钙应激”阶段中的骨骼，所述“钙应激”阶段例如生长、怀孕和哺乳(综 述参见Becker，JCEM，89(4)：1512-1525(2004)和Sexton，Current Medicinal Chemistry 6：1067-1093(1999))。与此相一致的是最近从降 钙素基因敲除的小鼠(它去除了降钙素和CGRP-I肽)得到的数据， 表明小鼠具有正常水平的基础钙-相关值，但是具有增加的钙应答 (Kurihara H，等，Hypertens Res.2003Feb；26Suppl：S105-8)。
CT对血钙水平有作用，并抑制破骨细胞功能，广泛地用于治疗 骨质疏松症。在治疗上，鲑鱼CT(sCT)似乎会增加骨密度和降低骨折 率，具有最小的副作用。在过去的25年中，CT还已经成功地用作佩 吉特骨病的治疗，该病是一种慢性骨病，它可以导致在一个或多个骨 骼区域的骨变大或变形。也广泛地将CT用于骨质疏松症过程中经历 的骨疼痛的镇痛作用，尽管尚不清楚该作用的机理。
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种神经肽，它的受体在体内广泛分 布，包括神经系统和心血管系统。该肽似乎会调节感觉神经传递，是 迄今发现的最有效的内源血管舒张肽之一。报道的CGRP的生物作用 包括：调节炎症中的P物质，神经肌肉接头处的烟碱受体活性，刺激 胰酶分泌，减少胃酸分泌，周围血管扩张，心跳加速，神经调节，调 节钙代谢，成骨刺激，胰岛素分泌，体温的升高和食物摄取的减少。 (Wimalawansa，Amylin，calcitonin gene-related peptide，calcitonin and ADM：a peptide superfamily.Crit Rev Neurobiol.1997；11(2-3)：167- 239)。CGRP的一种重要作用是，通过它的有效的血管舒张作用，控 制向不同器官的血流量，如通过静脉内施用α-CGRP后平均动脉压的 降低所证实的。血管舒张作用也得到了最近对纯合的敲除的CGRP小 鼠的分析的支持，后者表现出升高的外周血管抗性和由增强的外周交 感神经活性造成的高血压(Kurihara H，等，Targeted disruption of ADM and αCGRP genes reveals their distinct biological roles.Hypertens Res. 2003Feb；26Suppl：S 105-8)。因而，CGRP似乎会引起血管舒张作 用、低血压作用和心率的增加，以及其它作用。
给充血性心力衰竭患者长期输注CGRP，已经表现出持续的对血 液动力功能有益的作用，没有副作用，这暗示着在心力衰竭中的应用。 CGRP的其它适应症用途包括肾衰竭，急性和慢性冠状动脉缺血，心 律失常的治疗，其它外周血管病例如雷诺现象，蛛网膜下腔出血，高 血压，和肺高压。也可以有效地治疗妊娠和早产的先兆子痫毒血症 (Wimalawansa，1997)。最近的治疗用途包括CGRP拮抗剂用于治疗偏 头痛的用途。
肾上腺髓质素(ADM)几乎非常普遍地表达在含有该肽的组织中表 达，在不含有该肽的组织中则不然。公开的ADM的综述(Hinson，J.P. 等，Endocrine Reviews(2000)21(2)：138-167)，详述了它对心血管系 统、细胞生长、中枢神经系统和内分泌系统的作用，它的许多生物作 用包括血管扩张，细胞生长，激素分泌的调节，和尿钠排泄。在大鼠、 猫、绵羊和人类中的研究证实，静脉内输注ADM会导致有效的和持 续的低血压，且与CGRP的作用相当。但是，ADM对麻醉的大鼠的 平均动脉压的降血压作用不会受到CGRP拮抗剂CGRP8-37的抑制， 表明该作用不是通过CGRP受体介导。给麻醉的、有意识的或高血压 的大鼠急性或慢性施用人ADM，会导致总外周抗性的显著降低，伴 有血压的降低，同时心率、心输出量和搏出量升高。
还已经提出，ADM是胚胎发生和分化的重要因子，是大鼠内皮 细胞的细胞凋亡存活因子。这得到了最近的小鼠ADM敲除研究的支 持，其中缺失ADM基因的小鼠纯合体在胚胎发生过程中表现出有缺 陷的血管形成，因而在妊娠中期死亡。据报道，ADM+/-杂合的小鼠 具有高血压以及对组织损害的易感性(Kurihara H，等，Hypertens Res. 2003Feb；26Suppl：S105-8)。
ADM会影响垂体、肾上腺、生殖器官和胰腺等内分泌器官。该 肽似乎在抑制垂体释放ACTH中起作用。在肾上腺中，它似乎影响大 鼠和人的肾上腺皮质的分泌活性，增加肾上腺血流量，作为完整大鼠 的肾上腺血管床的血管舒张剂起作用。已经证实，ADM存在于女性 生殖道中，在正常妊娠中的血浆水平升高。先兆子痫大鼠模型的研究 证实，当在妊娠晚期给大鼠施用时，ADM可以逆转高血压，降低幼 仔死亡率。因为它对妊娠早期或非妊娠的先兆子痫大鼠模型动物没有 类似的作用，这表明ADM可能在子宫胎盘心血管系统中起重要的调 节作用。在胰腺中，ADM最可能起抑制作用，因为它会减弱和延迟 对口服葡萄糖刺激的胰岛素应答，导致初期升高的葡萄糖水平。ADM 也可以影响肾功能。在周围施用的推注，可以显著降低平均动脉压和 增加肾血流量、肾小球滤过率和尿流。在有些情况下，也存在Na+排 泄的增加。
ADM也对骨和肺具有其它外周作用。就骨而言，研究已经支持 了超过心血管系统和流体体内稳态的作用，且已经证实，ADM作用 于胎儿和成年啮齿动物成骨细胞，以增加细胞生长，这与已知的成骨 细胞生长因子例如转化生长因子-α相当。这在临床上是重要的，因为 骨质疏松症研究中的重大挑战之一是开发通过成骨细胞刺激增加骨量 的治疗。在肺中，ADM不仅会造成肺血管舒张，而且会抑制组胺或 乙酰胆碱诱导的支气管收缩。使用雾化的ADM来治疗大鼠模型的肺 高压的最近研究证实，该状况的吸入治疗是有效的，正如用ADM治 疗的大鼠中平均肺动脉压和总肺阻力比施用盐水的那些显著降低的事 实所证实的。全身动脉压或心率没有变化地实现了该结果(Nagaya N 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.2003；285：H2125-31)。
在健康志愿者中，已经证实静脉内输注ADM会减少动脉压和刺 激心率、心输出量、cAMP的血浆水平、促乳素、去甲肾上腺素和肾 素。在这些患者中，没有观察到或观察到微弱的尿量或钠排泄增加。 在心力衰竭或慢性肾衰竭患者中，静脉内ADM具有与在正常受试者 中观察到的类似的作用，也诱导利尿和尿钠排泄，这取决于给药剂量 (Nicholls，MG等肽.2001；22：1745-1752)。还已经证实，实验性的 ADM治疗对于动脉和肺高压、感染性休克和缺血/再灌注损伤是有益 的(Beltowski J.，Pol J Pharmacol.2004；56：5-27)。ADM治疗的其它 适应症包括：外周血管疾病，蛛网膜下腔出血，高血压，妊娠和早产 的先兆子痫毒血症，和骨质疏松症。
AFP-6(即，垂体中间叶激素)的表达主要是在垂体和胃肠道。尚未 报道AFP-6的特异性受体；但是，结合研究表明，AFP-6结合胰淀素 家族的所有已知受体。已经证实，AFP-6增加表达内源CGRP受体的 SK-N-MC和L6细胞中的cAMP生产，并与标记的CGRP竞争结合 这些细胞中的受体。在公开的体内研究中，AFP-6施用会在正常的和 自发高血压的大鼠中导致血压降低，最可能是通过与CRLR/RAMP受 体的相互作用。小鼠体内施用会导致胃排空和食物摄取的抑制(Roh等 J Biol Chem.2004Feb 20；279(8)：7264-74)。
已经报道，胰淀素家族肽激素的生物作用通常通过结合两种密切 相关的II类G蛋白偶联的受体(GPCR)来介导：即降钙素受体(CTR)和 降钙素受体样受体(CRLR)。克隆和功能研究已经证实，CGRP、ADM 和胰淀素会与CTR或CRLR和受体活性修饰蛋白(RAMP)的不同组合 相互作用。许多细胞表达多种RAMP。认为RAMP和CTR或CRLR 之一的共表达，是产生降钙素、CGRP、ADM和胰淀素的功能性受体 所必需的。RAMP家族包含3个成员(RAMP1，-2，和-3)，它们具有 小于30％的序列同一性，但是具有共同的拓扑构造。CRLR和RAMP1 的共表达会导致CGRP的受体的形成。CRLR和RAMP2的共表达会 导致ADM的受体的形成。CRLR和RAMP3的共表达会导致ADM和 CGRP的受体的形成。hCTR2和RAMP1的共表达会导致胰淀素和 CGRP的受体的形成。hCTR2和RAMP3的共表达会导致胰淀素受体 的形成。
因而，包含胰淀素家族激素模块的GIP杂合体可以提供讨论的与 胰淀素家族模块(例如胰淀素，胰淀素/sCT/胰淀素，ADM，CGRP) 有关的功能和用途，以及GIP功能。
在一个实施方案中，胰淀素类似物和衍生物具有天然胰淀素的至 少一种激素活性。在某些实施方案中，胰淀素类似物是天然胰淀素能 够特异性结合的受体的激动剂。示例性的胰淀素类似物和衍生物包括 在US 2003/0026812A1中描述的那些，它引入本文作为参考。
示例性的胰淀素类似物包括：
  25，28，29Pro-h-胰淀素(普兰林肽)   des-1Lys-h-胰淀素   25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素   18Arg，25，28Pro-h-胰淀素   des-1Lys，18Arg，25，28Pro-h-胰淀素   18Arg，25，28，29Pro-h-胰淀素   des-1Lys，18Arg，25，28，29Pro-h-胰淀素   des-1，Lys25，28，29Pro-h-胰淀素   25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素   28Pro-h-胰淀素，2，7-Cyclo-[2Asp，7Lys]-h-胰淀素   2-37h-胰淀素   1Ala-h-胰淀素   2Ala-h-胰淀素   2，7Ala-h-胰淀素   1Ser-h-胰淀素   29Pro-h-胰淀素   25，28Pro-h-胰淀素   des-1Lys，25，28Pro-h-胰淀素   23Leu，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素   23Leu25Pro26Val28Pro-h-胰淀素   des-1Lys，23Leu，25Pro，26Val，28Pro-h-胰淀素   18Arg，23Leu，25Pro，26Val，28Pro-h-胰淀素   18Arg，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素   18Arg23Leu，25，28Pro-h-胰淀素
  17Ile，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素   17Ile，25，28，29Pro-h-胰淀素   des-1Lys，17Ile，23Leu，25，28，29Pro-h-胰淀素   17Ile，18Arg，23Leu-h-胰淀素   17Ile，18Arg，23Leu，26Val，29Pro-h-胰淀素   17Ile，18Arg，23Leu，25Pro，26Val，28，29Pro-h-胰淀素，   13Thr，21is，23Leu，26Ala，28Leu，29Pro，31Asp-h-胰淀素   13Thr，21His，23Leu，26Ala，29Pro，31Asp-h-胰淀素   des-1Lys，13Thr，21His，23Leu，26Ala，28Pro，31Asp-h-胰淀素   13Thr，18Arg，21His，23Leu，26Ala，29Pro，31Asp-h-胰淀素   13Thr，18Arg，21His，23Leu，28，29Pro，31Asp-h-胰淀素   13Thr，18Arg，21His，23Leu，25Pro，26Ala，28，29Pro，31Asp-h-胰淀素
如本领域所知，这样的胰淀素类似物可以优选地酰胺化，但在本 发明的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
本领域已知的任何ADM类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，ADM类似物和衍生物具有天然ADM的至少 一种激素活性。在某些实施方案中，ADM类似物是天然ADM能够特 异性结合的受体的激动剂。
本领域已知的任何CT类似物或衍生物都可与本发明联合使用。 在一个实施方案中，CT类似物和衍生物具有天然CT的至少一种激素 活性。在某些实施方案中，CT类似物是天然CT能够特异性结合的受 体的激动剂。示例性的CT类似物和衍生物包括描述于美国专利号 4,652,627；4,606,856；4,604,238；4,597,900；4,537,716；4,497,731； 4,495,097；4,444,981；4,414,149；4,401,593；和4,397,780中的那些， 它们在本文引作参考。
示例性的CT类似物包括：
  8Gly-CT   22Leu-CT   2Gly，3Ser，8Gly，22des-Tyr-CT   14Glu-sCT，   18Arg-sCT，   11，18Arg-sCT，   14Glu，18Arg-sCT，   14Glu，11，18Arg-sCT
如本领域所知，这样的CT类似物可以优选地酰胺化，但在本发 明背景下，任选可为酸形式，除非另有说明。
本领域已知的任何CGRP类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，CGRP类似物和衍生物具有天然CGRP的至 少一种激素活性。在某些实施方案中，CGRP类似物是天然CGRP能 够特异性结合的受体的激动剂。示例性的CGRP类似物和衍生物包括 描述于美国专利号4,697,002和4,687,839中的那些，它们在本文引作 参考。
示例性的CGRP类似物包括：
  36D-Ser-CGRP   36D-Thr-CGRP   36D-Asp-CGRP   36D-Asn-CGRP   36Ser-CGRP   36Hse-CGRP   36Asp-CGRP   36Thr-CGRP   36Asn-CGRP
本领域已知的任何AFP-6类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，AFP-6类似物和衍生物具有天然AFP-6的至 少一种激素活性。在某些实施方案中，AFP-6类似物是天然AFP-6能 够特异性结合的受体的激动剂。示例性的AFP-6类似物和衍生物包括 描述于WO 2003/022304的那些，它引入本文作为参考。
示例性的AFP-6类似物包括：
  SEQ ID   No：   序列   TQAQLLRVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   TQAQLLRVGCDTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   TQAQLLRVGMVLGTMQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQESAPVEPSSPHSY   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVDPSSPHSY   TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----DSAPVDPSSPHSY   RVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY   VGCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQDS APVEPSSPHSY   GCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   GCNTATCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVDPSSPHSY   GCNTATCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY   GCSNLSTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY   GCGNLSTCQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY   GCVLGTCQVQNLSHRLWQL----RQESAPVEPSSPHSY   CVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   QVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   VQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   VQNLSHRL----QLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY   GTMQVQNLSHRLWQL----RQDSAPVEPSSPHSY
如本领域所知，这样的AFP-6类似物可以优选地酰胺化，但在本 发明的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
CCK家族。CCK，包括hCCK(缩胆囊素)和物种变体及其各种类 似物，是本领域已知的。一般来说，CCK具有首先在人中鉴别出的33 个氨基酸的序列，包含据报导已在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、狗和人中 证实的8个氨基酸的体内C端片段(“CCK-8”)。其它物种变体包括 存在于猪、狗和豚鼠中的39个氨基酸的序列，存在于猫、狗和人中 的58个氨基酸的序列，和与CCK和胃泌素均同源的47个氨基酸的 序列。C端酪氨酸硫酸化的八肽序列(CCK-8)在种间相对保守，可能 是啮齿动物外周组织中最小的生物活性序列。因此，术语CCK-33一 般指人CCK(1-33)，而CCK-8(CCK(26-33))指C端八肽，其一般既可 硫酸化，也可未硫酸化，除非另有说明。此外，五肽胃泌素或CCK-5 是指C端肽CCK(29-33)，CCK-4是指C端四肽CCK(30-33)。
据报道，通过刺激胆囊收缩的能力，在1928年从肠提取物制品 中鉴别出了CCK。此后报道了CCK的其它生物作用，包括刺激胰腺 分泌，延迟胃排空，刺激肠蠕动和刺激胰岛素分泌。参见Lieverse等， Ann.N.Y.Acad.Sci.713：268-272(1994)。报道的CCK的作用也包括 对心血管功能、呼吸功能、神经毒性和癫痫发作、癌细胞增殖、镇痛、 睡眠、性和生殖行为、记忆、焦虑和多巴胺介导的行为的作用。Crawley 和Corwin，Peptides 15：731-755(1994)。CCK的其它报道的作用包括 刺激胰腺生长，刺激胆囊收缩，抑制胃酸分泌，胰多肽释放和蠕动的 收缩组分。CCK的其它报道的作用包括血管舒张。Walsh， ″Gastrointestinal Hormones，″In Physiology of the Gastrointestinal Tract (第3版，1994；Raven Press，New York)。
已经报道，注射胰高血糖素、CCK和铃蟾肽的组合，会抑制不空 腹大鼠的炼乳试验餐摄入，这超过了用单一化合物观察到的抑制。 Hinton等，Brain Res.Bull.17：615-619(1986)。还已经报道，胰高血 糖素和CCK会协同地抑制大鼠的假饲。LeSauter和Geary，Am.J. Physiol.253：R217-225(1987)；Smith和Gibbs，Annals N.Y.Acad.Sci. 713：236-241(1994)。还已经证实，雌二醇和CCK可以对饱感具有协 同作用。Dulawa等，Peptides 15：913-918(1994)；Smith和Gibbs， 同上。还已经提出，反应于小肠中的营养物从小肠发出的信号，可以 与CCK协同地相互作用，以减少食物摄取。Cox，Behav.Brain Res.38： 35-44(1990)。另外，已经报道，CCK会在几个物种中诱导饱感。例如， 已经报道，给大鼠腹膜内注射的CCK、给猪动脉内注射的CCK、给 猫和猪静脉内注射的CCK、注射进猴、大鼠、狗和绵羊脑室的CCK、 给肥胖和不肥胖的人静脉内注射的CCK，会造成进食抑制。参见 Lieverse等，同上。几个实验室的研究已经在报道中证实了低剂量的 CCK对进食抑制的行为特异性，其中在猴和大鼠中对比了对食物的反 应和对非食物增强剂的反应，并证实CCK会引起通常在进食后才会 观察到的行为次序(即，餐后饱感次序)。另外，对比CCK之后的行为 和单独进食或与CCK组合的进食之后的行为，已经在报道中揭示了 CCK和进食之间的行为相似性。Crawley和Corwin，同上。还已经报 道，在生理血浆浓度的CCK会抑制食物摄取，并增加瘦和肥胖人的 饱感。参见Lieverse等，同上。
在1966年，将CCK表征为33个氨基酸的肽。Crawley和Corwin， 同上。已经鉴别出了CCK氨基酸序列的物种-特异性的分子变体。据 报道，已经在猪、大鼠、鸡、毛丝鼠、狗和人中鉴别出了33个氨基 酸的序列和截短的肽，它的8个氨基酸的C-末端序列(CCK-8)。据报 道，在猪、狗和豚鼠中发现了39个氨基酸的序列。据报道，已经在 猫、狗和人中发现了58个氨基酸的序列。据报道，蛙和龟表现出与CCK 和胃泌素的47个氨基酸的序列的同源性。已经报道，非常新鲜的人 肠含有小量的甚至更大的分子，称作CCK-83。在大鼠中，据报道已 经鉴别出了基本的中间形式，称作CCK-22。Walsh，“Gastrointestinal Hormones，”In Physiology of the Gastrointestinal Tract(第3版，1994； Raven Press，New York)。已经报道了大鼠脑中的未硫酸化的CCK-8 和四肽(称作CCK-4(CCK(30-33))。C-末端五肽(称作CCK-4(CCK(29-33)) 保持与CCK的结构同源性，和与神经肽胃泌素的同源性。据报道，C- 末端硫酸化的八肽序列CCK-8在种间相对保守。据报道，来自大鼠甲 状腺癌、猪脑和猪肠的编码前胆囊收缩素原的cDNA的克隆和序列分 析，揭示了编码CCK的前体的345个核苷酸，所述前体是115个氨 基酸，且含有所有以前报道已经分离的CCK序列。Crawley和Corwin， 同上。
据称CCK分布在中枢神经系统和内分泌细胞和在小肠上端的肠 神经中。CCK激动剂包括CCK本身(也称作CCK-33)，CCK- 8(CCK(26-33))，未硫酸化的CCK-8，五胃泌素(CCK-5或CCK(29- 33))，和四肽，CCK-4(CCK(30-33))。在胰腺CCK受体处，据报道CCK-8 以比未硫酸化的CCK-8或CCK-4大1000-5000倍的效力替代结合， 且已经报道，CCK-8的刺激胰腺淀粉酶分泌的效力比未硫酸化的 CCK-8或CCK-4高约1000倍。Crawley和Corwin，同上。在大脑皮 质的匀浆中，据称CCK受体结合被未硫酸化的CCK-8和CCK-4替代， 后二者的浓度是等摩尔的，比硫酸化的CCK-8高10倍或100倍。上 文出处。据报道，已经在多种组织中鉴别出了CCK的受体，且已经 描述了2种基本亚型：A型受体和B型受体。已经报道了外周组织(包 括胰腺、胆囊、幽门括约肌和传入迷走神经纤维)和脑的离散区域中 的A型受体。已经报道，A型受体亚型(CCKA)对硫酸化的八肽是选 择性的。已经鉴别出了脑和胃中的B型受体亚型(CCKB)，据报道不 需要硫酸化或所有8个氨基酸。参见Reidelberger，J.Nutr.124(8Suppl.) 1327S-1333S(1994)；Crawley和Corwin，同上。
CCK类似物的各种体内和体外筛选方法是本领域已知的。实例包 括体内实验和体外实验，体内实验包括在快速静脉内注射要检测其 CCK样活性的化合物后观察狗或豚鼠胆囊的收缩，体外实验使用兔胆 囊条检测。参见Walsh，“Gastrointestinal Hormones”，In Physiology of the Gastrointestinal Tract(第3版，1994；Raven Press，New York)。
某些示例性的具有CCK活性的CCK和CCK类似物包括：
 SEQ ID NO：   序列   DY(SO3H)MGWMDF   DYMGWMDF   MGWMDF   GWMDF   WMDF   KDY(SO3H)MGWMDF   KDYMGWMDF   KMGWMDF   KGWMDF   KWMDF
如本领域所知，这样的CCK肽可以优选地酰胺化，但在本发明 的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
瘦蛋白家族。用于本发明的组分肽激素还包括瘦蛋白家族肽激 素。天然瘦蛋白家族肽激素是本领域已知的，功能性类似物和衍生物 也是已知的。本文描述了某些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物， 但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知瘦蛋白家族 肽都可以与本发明联合使用。
代谢疾病和病症涉及的另一个肽激素家族是瘦蛋白家族。循环瘦 蛋白的成熟形式是146个氨基酸的蛋白，它通常通过血脑屏障(BBB) 和血-CSF屏障从CNS排出。参见，例如，Weigle等，1995.J Clin Invest 96：2065-2070。瘦蛋白是调节食物摄取和体重的负反馈回路的传入信 号。瘦蛋白受体是细胞因子受体家族的一个成员。瘦蛋白的减食欲作 用依赖于结合该受体的Ob-Rb同种型的同型二聚体，后者编码长胞质 内结构域，包括蛋白-蛋白相互作用的几个基序。Ob-Rb在下丘脑中高 度表达，表明该脑区域是瘦蛋白作用的重要部位。已经证实，小鼠ob 基因的突变会导致在雄性和雌性纯合ob/ob肥胖小鼠中表现出病理生 理学的综合征，包括：肥胖，增加的体脂堆积，高血糖症，高胰岛素 血症，低体温，和受损的甲状腺和生殖功能(参见例如，Ingalis，等， 1950.J Hered 41：317-318。瘦蛋白或瘦蛋白受体的治疗用途包括：(i)糖 尿病(参见，例如，PCT专利申请WO 98/55139，WO 98/12224，和WO 97/02004)；(ii)造血作用(参见，例如，PCT专利申请WO97/27286和 WO98/18486)；(iii)不育症(参见，例如，PCT专利申请WO97/15322 和WO98/36763)；和(iv)肿瘤抑制(参见，例如，PCT专利申请WO 98/48831)，它们各自在本文中整体引作参考。
已经克隆了瘦蛋白受体(OB-R)基因(GenBank登记号AF098792)， 并绘制成db基因座图谱(参见，例如，Tartaglia，等，1995.Cell 83： 1263-1271)。还已经鉴别出了从替代剪接产生的OB-R的几种转录物。 OB-R中的缺陷会在突变型糖尿病ob/ob小鼠(它在表型上与ob/ob 小鼠相同)中产生综合征(参见，例如，Ghilardi，等，1996.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93：6231-6235)。但是，与ob/ob小鼠不同，给 C57BLKS/J-m ob/ob小鼠施用重组瘦蛋白，不会导致减少的食物摄取 和体重(参见，例如，Roberts和Greengerg，1996.Nutrition Rev.54： 41-49)。
报道了来自施用重组瘦蛋白、瘦蛋白片段和/或瘦蛋白受体变体的 体重减轻活性的大多数瘦蛋白-相关研究，已经将所述构建体直接施用 进脑室。参见例如，Weigle，等，1995.J Clin Invest 96：2065-2070； Barash，等，1996.Endocrinology 137：3144-3147。
其它研究已经证实了显著的体重减轻活性，这归因于通过腹膜内 (i.p.)施用给试验受试者施用瘦蛋白肽。参见，Grasso等，1997. Endocrinology 138：1413-1418。此外，已经报道，瘦蛋白片段、最尤 其是包含取自全长人瘦蛋白的残基的18个氨基酸的片段，会在体重 减轻中起作用，但是仅仅依赖于通过植入的插管直接施用给大鼠的侧 脑室。参见，例如，PCT专利申请WO97/46585，其在本文中整体引 作参考。
因而，包含瘦蛋白家族激素模块的GIP杂合体可以提供讨论的与 瘦蛋白家族模块(例如瘦蛋白，瘦蛋白片段)有关的功能和用途，以 及GIP功能。
本领域已知的任何瘦蛋白类似物或衍生物都可以与本发明联合使 用。在一个实施方案中，瘦蛋白类似物和衍生物具有天然瘦蛋白的至 少一种激素活性。在某些实施方案中，瘦蛋白类似物是天然瘦蛋白能 够特异性结合的受体的激动剂。示例性的瘦蛋白类似物和衍生物包括 描述于例如WO 2004/039832、WO 98/55139、WO 98/12224和WO 97/02004的那些，它们在本文引作参考。
示例性的瘦蛋白类似物包括这样的类似物：其中43位的氨基酸 被Asp或Glu取代；48位的氨基酸被Ala取代；49位的氨基酸被Glu 取代或缺失；75位的氨基酸被Ala取代；89位的氨基酸被Leu取代； 93位的氨基酸被Asp或Glu取代；98位的氨基酸被Ala取代；117位 的氨基酸被Ser取代，139位的氨基酸被Leu取代，167位的氨基酸被 Ser取代，或其任意组合。
某些示例性的瘦蛋白和具有瘦蛋白活性的瘦蛋白类似物包括：
  43Asp-瘦蛋白   43Glu-瘦蛋白   48Ala-瘦蛋白   49Glu-瘦蛋白   49Des-AA-瘦蛋白   75Ala-瘦蛋白   89Leu-瘦蛋白   93Asp-瘦蛋白   93Glu-瘦蛋白   98Ala-瘦蛋白   117Ser-瘦蛋白   139Leu-瘦蛋白   167Ser-瘦蛋白   43Asp，49Glu-瘦蛋白   43Asp，75Ala-瘦蛋白   89Leu，117Ser-瘦蛋白   93Glu，167Ser-瘦蛋白
PPF或PYY家族。用于本发明的组分肽激素还包括胰多肽家族 (PPF)肽激素，包括PP，NPY和PYY。天然PPF肽激素是本领域已知 的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文描述了某些示例性的 天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到，具有本领域已知激 素活性的任何已知PYY家族肽都可以与本发明联合使用。
代谢疾病和病症涉及的另一个肽激素家族是胰多肽家族(“PPF”)。 胰多肽(“PP”)作为胰岛素提取物的污染物而被发现，并因为它的起源 器官(而不是功能重要性)而得名(Kimmel等，Endocrinology 83： 1323-30(1968))。PP是一种含有独特结构基序的36个氨基酸的肽。随 后，在肠提取物中发现了相关肽，并因为N-和C-末端酪氨酸，命名 为肽YY(“PYY”)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：2514- 8(1982))。以后在脑提取物中发现了第三种相关肽，并命名为神经肽 Y(“NPY”)(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5485-9(1982)； Tatemoto等，Nature 296：659-60(1982))。
已经报道这3种相关肽会发挥不同的生物作用。PP的作用包括， 抑制胰腺分泌和舒张胆囊。中枢施用的PP会造成进食的适度增加， 这可能由位于下丘脑和脑干处的受体介导(综述参见Gehlert，Proc.Soc. Exp.Biol.Med.218：7-22(1998))。
PYY的释放发生在餐后。PYY的另一种分子形式是PYY(3-36) (Eberlein等，Peptides 10：797-803(1989)；Grandt等，Regul.Pept.51： 151-9(1994))。该片段占人和犬肠提取物的总PYY样免疫反应性的约 40％，占空腹状态总血浆PYY免疫反应性的约36％，在餐后略微超 过50％。显然，它是PYY的二肽基肽酶-IV(DPP4)切割产物。据报道， PYY(3-36)是在Y2和Y5受体处的选择性配体，所述受体在药理学上 是独特的，偏好NPY类似物的N-末端截短体(即，C-末端片段)。据 报道，外周施用PYY会减少胃酸分泌、胃蠕动、外分泌胰腺分泌 (Yoshinaga等，Am.J.Physiol.263：G695-701(1992)；Guan等， Endocrinology 128：911-6(1991)；Pappas等，Gastroenterology 91： 1386-9(1986))、胆囊收缩和肠蠕动(Savage等，Gut 28：166-70(1987))。 直接注射进后脑/脑干或其周围后观察到的中枢注射PYY对胃排空、 胃蠕动和胃酸分泌的作用(Chen和Rogers，Am.J.Physiol.269：R787- 92(1995)；Chen等，Regul.Pept.61：95-98(1996)；Yang和Tache，Am. J.Physiol.268：G943-8(1995)；Chen等，Neurogastroenterol.Motil.9： 109-16(1997))，可能不同于外周注射后观察到的那些作用。例如，中 枢施用的PYY具有一些不同于本文所述的外周注射的PYY(3-36)的作 用，因为刺激而不是抑制了胃酸分泌。仅仅与TRH刺激相结合时， 会抑制胃蠕动，但是在单独施用时则不会，它实际上在高剂量时是刺 激性的，通过推定的与PP受体的相互作用。已经证实，在中枢施用 后，PYY会刺激食物和水摄入(Morley等，Brain Res.341：200- 3(1985)；Corp等，Am.J.Physiol.259：R317-23(1990))。
本领域已知的任何PPF类似物或衍生物都可与本发明联合使用。 在一个实施方案中，PPF类似物和衍生物具有天然PPF多肽的至少一 种激素活性。在某些实施方案中，PPF类似物是天然PPF多肽能够特 异性结合的受体的激动剂。示例性的PPF类似物和衍生物包括描述于 WO 03/026591和WO 03/057235的那些，它们在本文中整体引作参考。 在一个实施方案中，具有至少一种PPF激素活性的示例性的PPF类似 物和衍生物一般包含至少两个PYY基序，包括聚脯氨酸基序和C端 尾基序。这样的类似物一般描述于2004年2月11日提交的美国临时 申请第60/543,406号，其在本文中引作参考。其它示例性的PPF类似 物公开于提交的题为“Pancreatic Polypeptide Family Motifs and Polypeptides Comprising the Same”的PCT/US2005/004351中，代理档 案号18528.832，其内容引入本文作为参考。作为背景，PYY家族肽 结合的受体通常称作Y受体，研究已提示，Y受体结合亲和性的差异 与二级和三级结构差异有关。参见，例如，Keire等，Biochemistry 2000， 39，9935-9942。天然猪PYY已表征为包含由残基23、24和25处的 结分隔的残基17-22和25-33两个C端螺旋节段、以残基12-14为中 心的转角以及在残基30和31附近折叠的N端。此外，全长猪PYY 已表征为包含PP折叠，由N端和C端残基中的疏水相互作用稳定。 参见上文出处。
“PYY”基序一般为天然PP家族多肽的一级、二级或三级结构 模块，其对生物活性是关键性的，即生物活性在基序缺失或紊乱时显 著下降。示例性的PYY基序包括天然PP家族多肽的N-端聚脯氨酸II 型基序、天然PP家族多肽的II型β-转角基序、在天然PP家族多肽C 末端的α-螺旋基序和天然PP家族多肽的C-端尾基序。更具体地说， 在N-端聚脯氨酸区中，对应于天然PP家族多肽的残基5和8的氨基 酸一般保守为脯氨酸。II型β转角基序一般包括对应于天然PP家族多 肽的残基12-14的氨基酸。α-螺旋基序一般可由对应于天然PP家族多 肽的大约残基14的氨基酸延伸至任意点，直到C末端并包含C末端， 只要α-螺旋基序包含足够数目的氨基酸残基，使得在溶液中形成α-螺 旋转角。α-螺旋基序还可包含对天然PP家族组列的氨基酸置换、插 入和缺失，只要α-螺旋转角仍在溶液中形成。C-端尾基序一般包含对 应于天然PP家族多肽最后约10个残基的氨基酸，更优选为天然PP 家族多肽的最后7、6或5个残基，更优选为氨基酸残基32-35。示例 性的PYY类似物包括在不对应于聚脯氨酸基序和/或C-端尾基序的 PYY分子区域中具有内部缺失、插入和置换的类似物。例如，预见到 在位置4、6、7、9或10的内部缺失。
其它肠降血糖素和肠降血糖素模拟物。用于本发明的组分肽激素 还包括GLP-1肽激素。天然GLP-1肽激素，包括GLP-1(1-37)、GLP- 1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，是本领域已知的，功能肽类似物和衍生 物也是已知的。本文使用的GLP-1指所有天然形式的GLP-1肽激素。 本文描述了某些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认 识到，具有本领域已知激素活性的任何已知GLP-1肽都可与本发明联 合使用。
许多代谢疾病和病症的中心是胰岛素水平和血糖水平的调节。胰 岛素分泌部分地受称作肠降血糖素的促分泌激素调控，后者由肠内分 泌细胞产生。肠降血糖素激素、胰高血糖素样肽-1(“GLP-1”)是一种由 肠细胞分泌的肽激素，已经在多项研究中证实，它会产生增强胰岛素 分泌的作用。GLP-1从肠中的胰高血糖素原加工而来，会增强营养物 诱导的胰岛素释放(Krcymann B.，等，Lancet，2：1300-1303(1987))。 已知各种截短形式的GLP-1会刺激胰岛素分泌(促胰岛素作用)和cAMP 形成(参见，例如，Mojsov，S.，Int.J.Pep.Pro.Res.，40：333-343(1992))。 已经建立了各种体外实验室试验和哺乳动物、尤其是人对外源施用 GLP-1、GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)酸的促胰岛素应答之间的关 系(参见，例如，Nauck，M.A.，等，Diabetologia，36：741-744(1993)； Gutniak，M.，等，New Eng.J.of Med.，326(20)：1316-1322(1992)； Nauck，M.A.，等，J.Clin.Invest.，91：301-307(1993)；和Thorens， B.，等，Diabetes，42：1219-1225(1993))。
GLP-1(7-36)酰胺通过刺激胰岛素敏感性和增强葡萄糖-诱导的生 理浓度的胰岛素释放，在胰岛素-依赖性的糖尿病中发挥显著的抗糖尿 病发生作用(Gutniak M.，等，New Eng.J.Med.，326：1316-1322(1992))。 当施用给非胰岛素依赖性糖尿病时，GLP-1(7-36)酰胺会刺激胰岛素释 放，降低胰高血糖素分泌，抑制胃排空和增强葡萄糖利用(Nauck， 1993；Gutniak，1992；Nauck，1993)。但是，由于该肽的血清半衰期 非常短，GLP-1型分子用于糖尿病的长期治疗的用途变得复杂。
更具体地，GLP-1是一种源自胰高血糖素原(一种160个氨基酸 的激素原)的30个氨基酸的肽。胰腺和肠中的不同激素原转化酶的 作用，导致胰高血糖素及其它不确定的肽的产生，而胰高血糖素原的 切割导致GLP-1和GLP-2以及2种其它肽的产生。GLP-1的氨基酸序 列在迄今研究的所有哺乳动物中是100％同源的，这暗示着关键的生 理作用。GLP-1(7-37)酸是C-末端截短的且酰胺化的，以形成GLP- 1(7-36)NH2。难以区分游离酸GLP-1(7-37)OH和酰胺GLP-1(7-36)NH2 的生物作用和代谢更新。按照约定，氨基酸的编号是基于从胰高血糖 素原加工的GLP-1(1-37)OH。生物学上有活性的GLP-1是进一步加工 的结果：GLP-1(7-36)NH2。因而，GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2 的第一个氨基酸是7His。
在胃肠道中，反应于腔内葡萄糖的刺激，由肠、结肠和直肠粘膜 的L-细胞产生GLP-1。有活性的GLP-1的血浆半衰期小于5分钟，它 的代谢清除率是约12-13分钟(Holst，Gastroenterology 107(6)：1848- 55(1994))。参与GLP-1代谢的主要蛋白酶是二肽基肽酶 (DPP)IV(CD26)，它切割N-末端His-Ala二肽，从而产生代谢产物 GLP-1(9-37)OH或GLP-1(9-36)NH2，它们各自被描述为GLP-1受体 的无活性的、弱激动剂或拮抗剂。GLP-1受体(GLP-1R)是G蛋白偶 联的463个氨基酸的受体，位于胰腺β细胞、肺中，更少地位于脑、 脂肪组织和肾中。GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2对GLP-1R的 刺激，会导致腺苷酸环化酶激活，cAMP合成，膜去极化，细胞内钙 的升高和葡萄糖-诱导的胰岛素分泌的增加(Holz等，J.Biol.Chem. 270(30)：17749-57(1995))。
GLP-1是反应于食物摄取，从肠粘膜分泌的一种有效的胰岛素促 分泌剂。通过GLP-1R敲除的小鼠不耐受葡萄糖的事实，可以理解 GLP-1的深奥的肠降血糖素效应。在糖尿病受试者中保持了静脉内输 注的GLP-1的肠降血糖素应答，尽管这些患者中对口服葡萄糖的肠降 血糖素应答受损。通过输注或皮下注射来施用GLP-1，可以控制糖尿 病患者的空腹葡萄糖水平，并维持胰岛素分泌的葡萄糖阈值(Gutniak 等，N.Engl.J.Med.326：1316-22(1992)；Nauck等，Diabet.Med.13： (9Suppl 5)：S39-S43(1996)；Nauck等，J.Clin.Endocrinol.Metab.76： 912-917(1993))。GLP-1已经表现出作为治疗剂的巨大潜力，其能以生 理方式促进胰岛素分泌，同时避免与磺酰脲药物有关的低血糖。
GLP-1对葡萄糖体内稳态的其它重要作用是，抑制胰高血糖素分 泌和抑制胃蠕动。GLP-1对胰腺α细胞分泌胰高血糖素的抑制作用， 会葡萄糖异生的减少和糖原分解，导致肝葡萄糖生产的减少。在糖尿 病患者中，保持了GLP-1的该抗胰高血糖素作用。
所谓的GLP-1回肠制动作用，其中胃蠕动和胃分泌受到抑制，是 通过迷走神经传出的受体或通过直接作用于肠平滑肌来实现。GLP-1 对胃酸分泌的减少，有助于营养物利用度的延迟期，从不需要快速的 胰岛素应答。总之，GLP-1的胃肠效应显著有助于延迟的葡萄糖和脂 肪酸吸收，并调控胰岛素分泌和葡萄糖体内稳态。
还已经证实，GLP-1会诱导β细胞特异性的基因，例如GLUT-1运 输子，胰岛素(通过PDX-1与胰岛素基因启动子的相互作用)，和己糖 激酶-1。因而，GLP-1可能潜在地逆转通常与老化有关的葡萄糖不耐 性，正如通过啮齿动物试验所证实的。另外，GLP-1可能有助于β细 胞新生和增加β细胞团，以及在β细胞不足状态时恢复β细胞功能。
GLP-1的重要作用包括增加与减少食物摄取相偶联的饱感，这通 过下丘脑GLP-1R的作用来实现。给II型糖尿病受试者48小时连续 皮下输注GLP-1，会减少饥饿和食物摄取，并增加饱感。这些厌食作 用在GLP-1R敲除的小鼠中不存在。
因而，包含肠降血糖素家族激素模块的GIP杂合体可以提供讨论 的与肠降血糖素家族模块(例如毒蜥外泌肽-4，GLP1，GLP2)有关 的功能和用途，以及具有GIP功能。
本领域已知的任何GLP-1肽类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，GLP-1肽类似物和衍生物具有天然GLP-1肽 的至少一种激素活性。在某些实施方案中，GLP-1肽类似物是天然 GLP-1肽能够特异性结合的受体的激动剂。示例性的GLP-1肽类似物 和衍生物包括描述于例如WO 91/11457的那些，它引入本文作为参考。
本领域已知的GLP-1类似物包括：
  9Gln-GLP-1(7-37)   D-9Gln-GLP-1(7-37)   16Thr-18Lys-GLP-1(7-37)   18Lys-GLP-1(7-37)   8Gly-GLP-1(7-36)   9Gln-GLP-1(7-37)   D-9Gln-GLP-1(7-37)   乙酰基-9Lys-GLP-1(7-37)   9Thr-GLP-1(7-37)   D-9Thr-GLP-1(7-37)   9Asn-GLP-1(7-37)   D-9Asn-GLP-1(7-37)   22Ser23Arg24Arg26Gln-GLP-1(7-37)   16Thr18Lys-GLP-1(7-37)   18Lys-GLP-1(7-37)   23Arg-GLP-1(7-37)   24Arg-GLP-1(7-37)
如本领域所知，这样的GLP-1类似物可以优选地酰胺化，但在本 发明的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
其它GLP-1类似物和衍生物公开于美国专利第5,545,618号，该 专利引入本文作为参考。一组示例性的GLP-1类似物和衍生物包括公 开于美国专利第6,747,006号的那些，该专利引入本文作为参考。还 预见到描述于美国专利第5,188,666号的分子在本发明中的用途，该 专利特地引入本文作为参考。用于本发明的另一组分子包括描述于美 国专利第5,512,549号的化合物，该专利特地引入本文作为参考。用 于本发明的另一组示例性的GLP-1化合物公开于WO 91/11457，其引 入本文作为参考。
在另一个实施方案中，有用的GIP或新的GIP类似物是具有Trp- 笼尾的GLP1类似物(例如，有或没有色氨酸(或类似残基)(其可以任选 地如所述提供，例如通过有利地位于激素中的色氨酸的存在，它是天 然存在的，或作为置换或作为接头的一部分而添加)的毒蜥外泌肽C- 末端序列)。它们包括：
GLP1(7-26)Gly8Ex-4(21-39)：
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKLFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH2；
GLP1(7-33)(G8，E30，K33)[Ex-4(28-39)]：HGEGTFTSDVSSYLEGQ AAKEFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2；
GLP1(7-33)(G8，K33)[EX4(28-39)]：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAK EFIAWLKNGGPSSGAPPPS-NH2；
GLP1(7-33)G8[Ex-4(28-39)]：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAW LVNGGPSSGAPPPS-NH2；和
GLP1(7-35)G8[Ex-4(30-39)]：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAW LVKGGPSSGAPPPS-NH2。
用于本发明的GIP杂合体的组分肽激素还包括GLP-2肽激素。天 然GLP-2肽激素，例如大鼠GLP-2及其同系物，包括牛GLP-2、猪 GLP-2、八齿鼠GLP-2、牛GLP-2、豚鼠GLP-2、仓鼠GLP-2、人GLP-2、 虹鳟鱼GLP-2和鸡GLP-2，是本领域已知的，功能肽类似物和衍生物 也是已知的。本文描述了某些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物， 但是，应当认识到，具有本领域已知激素活性的任何已知GLP-2肽都 可与本发明联合使用。
本领域已知的任何GLP-2肽类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，GLP-2肽类似物和衍生物具有天然GLP-2肽 的至少一种激素活性。在某些实施方案中，GLP-2肽类似物是天然 GLP-2肽能够特异性结合的受体的激动剂。示例性的GLP-2肽类似物 和衍生物包括描述于例如美国专利序号08/669,791和PCT申请 PCT/CA97/00252的那些，这两个文献都引入本文作为参考。本领域 已知的特异性GLP-2类似物包括：在2位改变或通过以Gly置换Ala 赋予DPP-IV抗性的大鼠或人GLP-2。
用于本发明的组分肽激素还包括泌酸调节肽(OXM)肽激素。天然 OXM肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。 本文描述了某些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认 识到，具有本领域已知激素活性的任何已知OXM肽都可与本发明联 合使用。
本领域已知的任何OXM肽类似物或衍生物都可与本发明联合使 用。在一个实施方案中，OXM肽类似物和衍生物具有天然OXM肽的 至少一种激素活性。在某些实施方案中，OXM肽类似物是天然OXM 肽能够特异性结合的受体的激动剂。
用于本发明的组分肽激素还包括毒蜥外泌肽激素。天然毒蜥外泌 肽激素是本领域已知的，功能性肽类似物和衍生物也是已知的。本文 描述了某些示例性的天然肽、肽类似物和衍生物，但是，应当认识到， 具有本领域已知激素活性的任何已知毒蜥外泌肽都可与本发明联合使 用。
毒蜥外泌肽是参与胰岛素分泌的另一个肽家族。毒蜥外泌肽存在 于毒蜥(亚利桑那州的一种蜥蜴)和墨西哥串珠蜥蜴的唾液中。毒蜥 外泌肽-3存在于墨西哥串珠蜥(Heloderma horridum)唾液中，毒蜥外泌 肽-4存在于希腊毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中(Eng，J.，等，J.Biol. Chem.，265：20259-62，1990；Eng.，J.，等，J.Biol.Chem.，267： 7402-05(1992))。毒蜥外泌肽与胰高血糖素样肽家族的几个成员具有某 些序列相似性，与GLP-1具有53％的最高同一性(Goke，等，J.Biol. Chem.，268：19650-55(1993))
毒蜥外泌肽-4结合在豚鼠胰腺的分散的腺泡细胞处、在胃腔壁细 胞处的分泌胰岛素的TC1细胞上的GLP-1受体；该肽也刺激生长抑 素释放和抑制分离的胃中的胃泌素释放(Goke，等，J.Biol.Chem.，268： 19650-55(1993)；Schepp，等，Eur.J.Pharmacol.，69：183-91(1994)； Eissele，等，Life Sci.，55：629-34(1994))。发现毒蜥外泌肽-3和毒蜥 外泌肽-4会结合胰腺腺泡细胞上的GLP-1受体，以刺激胰腺腺泡细胞 中的cAMP生产和胰腺腺泡细胞释放淀粉酶(Malhotra，R.，等， Relulatory Peptides，41：149-56(1992)；Raufman，等，J.Biol.Chem.， 267：21432-37(1992)；Singh，等，Regul.Pept.，53：47-59(1994))。 已经提出了毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4的促胰岛素活性在治疗糖尿 病和预防高血糖症中的应用(Eng，美国专利号5,424,286)。
已经报道，截短的毒蜥外泌肽例如毒蜥外泌肽[9-39](一种羧酸 酰胺化的分子)和片段3-39至9-39，是GLP-1的有效的和选择性的 拮抗剂(Goke，等，J.Biol.Chem.，268：19650-55(1993)；Raufman，J. P.，等，J.Biol.Chem.，266：2897-902(1991)；Schepp，W.，等，Eur.J. Pharm.，269：183-91(1994)；Montrose-Rafizadeh，等，Diabetes，45(Suppl. 2)：152A(1996))。毒蜥外泌肽[9-39]会体内地阻断内源GLP-1，导致 减少的胰岛素分泌(Wang，等，J.Clin.Invest.，95：417-21(1995)； D′Alessio，等，J.Clin.Invest.，97：133-38(1996))。已经从大鼠胰岛 细胞克隆出明显负责GLP-1的促胰岛素作用的受体(Thorens，B.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89：8641-8645(1992))。毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽 [9-39]结合克隆的GLP-1受体(大鼠胰腺-细胞GLP-1受体：Fehmann HC，等，Peptides，15(3)：453-6(1994)；人GLP-1受体：Thorens B， 等，Diabetes，42(11)：1678-82(1993))。在用克隆的GLP-1受体转染 的细胞中，毒蜥外泌肽-4是激动剂，即它会增加cAMP，而毒蜥外泌 肽[9-39]是拮抗剂，即它会阻断毒蜥外泌肽-4和GLP-1的刺激作用。 参见上文出处。
更具体地，毒蜥外泌肽-4是存在于希腊毒蜥(Heloderma suspectum) 唾液中的39个氨基酸的C-末端酰胺化的肽，与GLP-1肽序列具有53％ 氨基酸序列同一性。参见，例如，Eng，J.，等“Isolation and Characterization of exendin，and exendin-3 Analogue from Heloderma suspectum Venom，″J.Bio.Chem.，267：11，p.7402-7405(1992)，Young， A.A.，等，″Glucose-Lowering and Insulin-Sensitizing Actions of毒蜥 外泌肽-4，″Diabetes，Vol.48，p.1026-1034，May，1999。关于它的 活性，毒蜥外泌肽-4是GLP-1受体的高度特异性的激动剂，且象GLP-1 一样，能刺激胰岛素分泌。因此，象GLP-1一样，将毒蜥外泌肽-4视 作促胰岛素肽。
但是，与GLP-1不同，毒蜥外泌肽-4在人类中具有相对较长的半 衰期，因为它对在体内快速降解GLP-1序列的二肽基肽酶IV的抗性。 此外，已经证实，与GLP-1相比，毒蜥外泌肽-4具有更强的刺激胰岛 素分泌的能力，且更低浓度的毒蜥外泌肽-4可以用于获取这样的刺激 活性。参见，例如，在本文中引作参考的美国专利号5,424,286。因此， 毒蜥外泌肽-4肽或其衍生物(关于这样的衍生物的实例，参见，例如， 在本文中引作参考的美国专利号6,528,486，和它的对应国际申请WO 01/04156)具有比胰岛素或GLP-1更大的用于治疗涉及胰岛素水平失调 的状况(例如，糖尿病等状况)的应用潜力。因而，包含毒蜥外泌肽家 族激素模块的GIP杂合体可以提供讨论的与毒蜥外泌肽家族模块(例 如毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽尾)有关的功能和用途，以及具有GIP 功能。
本领域已知的任何毒蜥外泌肽类似物或衍生物都可与本发明联合 使用。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽类似物和衍生物具有天然毒蜥 外泌肽的至少一种激素活性。在某些实施方案中，毒蜥外泌肽类似物 是天然毒蜥外泌肽能够特异性结合的受体的激动剂。
示例性的毒蜥外泌肽类似物包括：
  14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4   5Ala，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4   14Leu，22Ala，25Phe-毒蜥外泌肽-4
如本领域所知，这样的毒蜥外泌肽类似物可以优选地酰胺化，但 在本发明的上下文中，其可以任选地是酸形式，除非另有说明。
另外的示例性毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年8月6 日提交的题为“Novel Exendin Agonist Compounds”的PCT申请号 PCT/US98/16387，其要求1997年8月8日提交的美国专利申请号 60/055,404的权益，这两个申请都引入本文作为参考。其它毒蜥外泌 肽类似物和衍生物描述于1998年11月13日提交的题为“Novel Exendin Agonist Compounds”的PCT申请号PCT/US98/24210，其要求1997 年11月14日提交的美国临时专利申请第60/065,442号的权益，这两 个申请都引入本文作为参考。其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于 1998年11月13日提交的题为“Novel Exendin Agonist Compounds” 的PCT申请号PCT/US98/24273，其要求1997年11月14日提交的美 国临时专利申请第60/066,029号的权益，这两个申请都引入本文作为 参考。其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1997年8月8日提交 的题为“Methods for Regulating Gastrointestinal Activity”的PCT申请 号PCT/US97/14199，其是1996年8月8日提交的美国专利申请号 08/694,954的部分继续申请，这两个申请都引入本文作为参考。其它 毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于1998年1月7日提交的题为“Use of Exendins and Agonist Thereof for the Reduction of Food Intake”的PCT 申请号PCT/US98/00449，其要求1997年1月7日提交的美国临时专 利申请第60/034,905号的优先权，这两个申请都引入本文作为参考。 其它毒蜥外泌肽类似物和衍生物描述于2003年12月19日提交的题 为“Compositions for the Treatment and Prevention of Neuropathy”的US 2004/0209803A1，该申请引入本文作为参考。
Catestatin家族。嗜铬粒蛋白A的catestatin片段是烟碱胆碱能传 递的内源抑制剂，在儿茶酚胺分泌的负反馈控制中起作用。我们研究 了catestatin的氨基酸序列的天然存在的多态性。鉴别出了3种人变体： Gly364Ser，Pro370Leu，和Arg374Gln。
下面显示了人catestatin的序列变体(人嗜铬粒蛋白A352-372)和 人与其它哺乳动物之间的种间同源性。以粗体显示了人catestatin的位 置变体处的氨基酸。在括号[RR]中给出了catestatin羧基末端位点处的 典型的二碱性蛋白水解切割位点。就人嗜铬粒蛋白A而言，该[RR]位 点是Arg373Arg374。在其它实施方案中，包括缺少任一个或两个精氨 酸的变体。含有catestatin家族成员、其类似物、衍生物或片段的GIP 杂合体，可以用于本发明的治疗方法中。例如，这样的杂合体可以用 于治疗本文讨论的心血管疾病和状况，包括高血压和充血性心力衰竭 和相关状况。与有活性的GIP激素模块相组合，所述化合物可以用于 本文所述的病危护理状况。Catestatin物种变体包括：
小鼠    RSMRLSFRTRGYGFRDPGLQL[RR]  CGA364-384
大鼠    RSMRLSFRARGYGFRDPGLQL[RR]  CGA367-387
牛      RSMRLSFRARGYGFRGPGLQL[RR]  CGA344-364
猪      RSMRLSFRAPAYGFRGPGLQL[RR]  CGA343-363
马      RSMKLSFRARAYGFRGPGLQL[RR]  CGA343-363
黑猩猩  SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL[RR]  CGA354-374
人
野生型  SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL[RR]  CGA352-372
变体    SSMKLSFRARAYSFRGPGPQL[RR]
变体    SSMKLSFRARAYGFRGPGLQL[RR]
变体    SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL[RQ]
利钠肽。利钠肽是由心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和C-型 利钠肽(CNP)组成的激素家族。它们作为3种不同的前体激素原而合 成和保存，它们是126氨基酸ANP，108氨基酸BNP，和104氨基 酸CNP。它们分别由各自的基因编码，并具有不同的合成部位和调节 机理。亲本利钠肽序列包括：
  SEQ ID   No：   描述   序列   151氨基酸人   ANP前激素原   MSSFSTTTVSFLLLLAFQLLGQTRANPMYNAVSN   ADLMDFKNLLDHLEEKMPLEDEVVPPQVLSDPN   EEAGAALSPLPEVPPWTGEVSPAQRDGGALGRG   PWDSSDRSALLKSKLRALLTAPRSLRRSSCFGGR   MDRIGAQSGLGCNSFRY   134氨基酸人   BNP前激素原   MDPQTAPSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGS   ASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQ   ESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR   SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH   126氨基酸人   CNP前CNP原   MHLSQLLACALLLTLLSLRPSEAKPGAPPKVPRT   PPAEELAEPQAAGGGQKKGDKAPGGGGANLKG   DRSRLLRDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYK   GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC
ANP激素原的主要合成部位是心房肌细胞，它在那里合成为151 个氨基酸的前激素原。在内质网中，从它的N末端去除25个氨基酸 的信号肽，剩下126个氨基酸的ANP激素原(ProANP)，即ANP在心 脏中中的主要储存形式。所述激素原由4个生物学上有活性的肽段组 成：氨基酸1-30(ProANF 1-30，也称作长效Na刺激剂)，31-67(ProANF 31-67，也称作血管扩张剂)，79-98(ProANF 79-98，也称作钾排泄剂)， 和99-126(ANF，也称作心房利钠因子)。
BNP最初分离自猪脑，但是在人类中，它由左心室合成和分泌。 序列分析揭示，preproBNP由134个残基组成，并切割成108个氨基 酸的ProBNP。从ProBNP的C-末端切割32个氨基酸的序列，产生人 BNP(77-108)，它是在血浆中的生理活性形式。
CNP是利钠肽系统的第三个成员，主要存在于人血管内皮细胞、 肾、和猪脑中。高浓度的CNP也存在于人下丘脑和中脑中。在人类 中，preproCNP是126个氨基酸的前体，通过从它的N-末端切割23 个残基，加工成proCNP。该23个氨基酸的序列用作信号肽。从proCNP 切割末端22(105-126)氨基酸，产生生物学上有活性形式的CNP。
尿舒张肽是利钠肽家族的一个肾-衍生的成员，从相同的ANP激 素原形成，由氨基酸95-126组成。除了4氨基酸N末端延伸外，它 与ANF(99-126)相同。尿舒张肽似乎是肾中钠和水处理的重要调节剂， 以及充血性心力衰竭(CHF)患者的钠排泄的介导剂。
利钠肽通过结合靶细胞表面上的高亲和力受体，发挥它们的生物 作用。已经分离了3种NPR亚型：NPR-A，NPR-B，和NPR-C。结 果，在一个实施方案中，提供了筛选用于促尿钠排泄受体结合和/或激 活的杂合体的方法。包含激素原变体的利钠肽，可以赋予本发明的杂 合体许多利钠肽激素活性。在感兴趣的其它实施方案中，是促尿钠排 泄拮抗剂杂合体。尿钠排泄是非常大量的钠向尿中的排泄。尿钠排泄 类似于利尿(非常大量的尿的排泄)，不同之处是，在尿钠排泄中，尿 是格外含盐的。尿钠排泄随着有些利尿剂和疾病(肾上腺疾病)而发生， 可以导致失盐综合征，其特征在于，脱水、呕吐、低血压、和猝死的 危险。外源施用ANP激素原的4种独立的循环肽(1-30，31-67，79-98， 和99-126)，会产生体内血管舒张、利尿、肾素-血管紧张素-醛固酮系 统的抑制和增强的尿钠排泄和/或尿钾排泄。ProANF 1-30，ProANF 31-67和ANF 99-126各自具有促尿钠排泄、降低血压和利尿性质， ProANF 31-67和ANF 99-126对血压具有最大影响。ANP肽对钾体内 稳态具有不同作用：ProANF 79-98会刺激钾排泄，而ProANF 31-67 会通过抑制髓质收集管细胞中的Na/K ATP酶，避免钾流失。对ANF 99-126特异性的是，血管紧张素II-介导的醛固酮分泌的剂量-依赖性 的抑制，而proANF 31-67具有通过前列腺素的产生来诱导尿钠排泄 的性质。
在正常人中，BNP会产生与ANF类似的生物作用。给正常人输 注BNP，会使钠排泄增加2倍，使血浆肾素、血管紧张素II和醛固酮 分泌减少50％，以及使血浆体积减少。
类似于其它利钠肽，CNP会诱导心血管作用，但是似乎不会介导 任何肾作用。当在等同剂量的ANF，将CNP输注给麻醉的狗时，血 浆cGMP升高，伴有平均值动脉压、右房压和心输出量的降低，但是 肾小球滤过率、肾血流量和钠排泄减少。
利钠肽可以在心力衰竭中提供治疗益处。充血性心力衰竭(CHF) 与加压素、内皮缩血管肽的增加有关，也与肾素-血管紧张素-醛固酮 系统和交感神经系统的激活有关，会介导血管收缩、钠和水保持和负 的血管和心脏重建模。除了心力衰竭患者的利钠肽水平升高外，还发 生这些作用。在本发明的一个实施方案中，是杂合体，它提供增加的 或治疗性血清水平的利钠肽活性，用于治疗或预防心脏相关疾病和状 况，包括CHF。尽管正常个体中的ANF输注可以导致持续的钠排泄 和尿流速率的增加，在心力衰竭患者中，可以得到明显有益的肾反应 的减少。BNP输注会显著增加心力衰竭患者的钠排泄，并发挥显著有 益的血液动力作用。相对于ANP，BNP的利尿和促尿钠排泄作用明显 更大。BNP比ANP更缓慢地清除，并发挥其它作用，包括抑制醛固 酮分泌和增加ANP的血清水平。BNP肽也可以提供有益的肺毛细血 管楔压、全身血管阻力、右房压和收缩期血压的降低，和为有征候的 CHF而住院的患者的心脏指数的升高。在代偿失调的心力衰竭患者 中，利钠肽杂合体可以提供有益的肺毛细血管楔压和升高的呼吸困难 评分的降低(呼吸困难是难以呼吸的不适感觉，通常与早期心力衰竭有 关)。具有1、2或3种促尿钠排泄激素功能的杂合体，提供施用药学 活性的组合物的方法，其可以用于预防和治疗性处理CHF患者，尤 其是代偿失调的CHF患者、慢性CHF患者、和高血压患者。当经治 疗有效阶段施用治疗有效剂量时，杂合体的促尿钠排泄部分足以给这 样的患者提供治疗有效量的利钠肽。
如本文讨论的，可以使用任一个家族的治疗有效的利钠肽或它们 的类似物。有用的利钠肽包括，例如，心房利钠肽(ANP)，脑利钠肽(BNP 或B-型利钠肽)和C-型利钠肽(CNP)。在本文引作参考的美国专利公 开20010027181中，公开了有用形式的利钠肽的序列。ANP的实例包 括人ANP(Kangawa等，BBRC 118：131(1984))或来自不同物种的那 些，包括猪和大鼠ANP(Kangawa等，BBRC 121：585(1984))。这样 的ANP包含28个氨基酸。这样的ANP可以作为具有ANP的环结构(基 于Cys，形成二硫键)和连接该环结构的C-末端部分的肽来施用。这 样的肽的一个实例是，具有ANP的7-位置至28-位置的氨基酸残基的 肽，它提供在美国专利申请公开号20010027181中。另一个实例是蛙 ANP。可以用于本发明的方法中的BNP的具体实例包括人 BNP(hBNP)。人BNP包含32个氨基酸，并参与二硫键的形成(Sudoh 等，BBRC 159：1420(1989))和美国专利号5,114,923，5,674,710， 5,674,710，和5,948,761，它们各自引作参考。也已知且可以使用人以 外的起源的各种BNP，包括猪BNP和大鼠BNP。另一个实例是鸡BNP。 可以用于本发明的方法中的CNP的实例包括猪CNP。猪CNP包含22 个氨基酸，并参与二硫键的形成，这与上述的ANP和BNP(Sudoh等， BBRC 168：863(1990))(人和大鼠具有相同的氨基酸序列)、鸡 CNP(Arimura等，BBRC 174：142(1991))一样。也可以使用蛙 CNP(Yoshihara等，BBRC 173：591(1990)。如本文讨论的，根据需要， 通过已知的方法，本领域技术人员可以将修饰(例如缺失、置换、添 加或插入)和/或化学修饰应用于已知利钠肽氨基酸序列的氨基酸残 基。得到的化合物具有作用于起始ANP、BNP或CNP的受体的活性。 因此，具有该活性的类似物包含在根据本发明的方法使用的杂合体 中。
在另一个实施方案中，具有一种或多种促尿钠排泄功能的杂合体 可以用于治疗高血压。在一个实施方案中，促尿钠排泄杂合体对心率 没有有害作用，且与心律失常无关。在一个实施方案中，所述杂合体 具有至少1、2或3种利钠肽功能，例如，ANP和BNP活性。一种或 多种促尿钠排泄激素功能可以与本文所述的任意其它激素功能或肽增 强子相组合物。在另一个实施方案中，促尿钠排泄部分是比天然利钠 肽更稳定的具有延长的体内半衰期的类似物。也预见到会阻止内源酶 (例如NEP)的意外切割的类似物。含有促尿钠排泄的杂合体还进一 步指向高血压降低，利尿诱因，尿钠排泄诱因，血管管道扩张或松弛， 利钠肽受体(例如NPR-A)结合，肾的肾素分泌抑制，肾上腺的醛固酮 分泌抑制，心血管疾病和病症的治疗，减少、终止或逆转充血性心力 衰竭的心脏重建模，肾疾病和病症的治疗；缺血性中风的治疗或预防， 和哮喘的治疗。可以将杂合体施用给会从诱导尿钠排泄、利尿和血管 舒张获益的患者。可以单独地或与一种或多种下述类型的化合物组合 地施用杂合体：ACE抑制剂，β-阻断剂，利尿剂，螺内酯，地高辛， 抗凝剂和抗血小板剂，和血管紧缩素受体阻断剂。其它疾病或状况包 括肾病症和疾病，哮喘，高血压和肺高压。杂合体也可以用于治疗炎 症-相关疾病，勃起机能障碍和血胆固醇过多。
肽模块选择的考虑事项、间隔物和连接基团
本发明的GIP杂合多肽一般包含至少两个本发明的生物活性肽激 素模块，其中至少一个生物活性肽激素模块(通常，GIP模块)表现 出至少一种激素活性。在本发明的上下文中，至少一个生物活性的肽 激素模块来自GIP肽激素、类似物、衍生物、片段、或肽增强子。 表现出至少一种激素活性的生物活性肽激素模块可位于杂合多肽的N- 末端、杂合多肽的C-末端，或者在杂合多肽包含两个以上生物活性肽 激素模块的情况下，可位于杂合多肽的内部。
在某些实施方案中，可优选定位表现出至少一种激素活性的生物 活性肽激素模块，使得生物活性肽激素模块的C-末端酰胺化。可通过 将模块定位在杂合多肽的C-末端，或通过将模块以C-端至N-端方向 排列在杂合多肽的N-末端，实现生物活性肽激素模块C-末端酰胺化。 在两种排列中，生物活性肽激素模块的C-末端都可用于酰胺化。其中 C-端酰胺化的特定组分肽激素可优选地包括胰淀素家族肽激素、 CCK、PYY、hGLP-1(7-36)和hGLP-2。其中不一定C-端酰胺化(除非 另有说明，否则其中在模块C-末端延长易被接受)的特定组分肽激素 包括毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4(1-28)、GLP-1(7-37)、蛙GLP-1(7-36) 和蛙GLP-2。但是，如果这些组分肽激素位于杂合多肽的C-末端，则 其仍可任选酰胺化，实际上可优选任选酰胺化。
生物活性肽激素模块可以本领域已知的任何方式共价连接。可使 用稳定的连接，或者可使用可切割的连接。在一个实施方案中，第一 个模块的羧基可直接连接至第二个模块的氨基。在另一个实施方案 中，可使用连接基团连接模块。此外，如果有需要，可使用本领域已 知的间隔物或转角诱导物稳定连接。作为实例，当N-端定位的生物活 性肽激素模块不需要C-末端酰胺化时，模块可直接地或使用本领域已 知的任何合适连接基团连接至第二个模块，所述连接基团例如烷基； PEG；氨基酸，例如Lys、Glu、β-Ala；聚氨基酸，例如聚-his、聚-arg、 聚-lys、聚-ala、Gly-Lys-Arg(GKR)等；双功能接头(参见例如Pierce catalog，Rockford，Il)；氨基已酰基(“Aca”)、β-丙氨酰，8-氨基-3，6- 二氧杂辛酰基，或本领域已知的其它可切割和不可切割的接头。如同 各自明确指出地，本文特别指出的是特定杂合体的实施方案，其中每 个示例的含有接头的杂合体中的接头被替换为Gly接头，尤其这样的 实施方案，其中Gly接头是Gly-Gly-Gly。作为一个实例，关于示例 的YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDF VNWLLAQK-接头-KCNTATCVLG RLSQELHRLQTYPRTNTGSETF(参见本文表)，也特别地预见到和公 开了它的Gly接头种类类似物：该种类是YAEGTFISDYSIAMDKIRQQ DFVNWLLAQK-Gly-Gly-Gly-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNT GSETF。在一个实施方案中，接头或间隔物的长度是1-30个残基，在 另一个实施方案中，是2-30个残基，在另一个实施方案中，是3-30 个残基，和2-30个的任意整数长度(包含端点)；包括每个整数单位， 例如2，3，4，5，6，7，等。在一个实施方案中，使用Gly接头， 在一个具体的实施方案中，使用3残基的接头Gly-Gly-Gly。
在本文讨论的一个实施方案中，所述GIP以C-末端至C-末端方 向结合到第二个生物活性的激素模块上。GIP的C-末端连接到第二个 生物活性的激素模块的C-末端上，任选地通过接头。正交化学可以用 于连接功能化的肽模块，任选地通过本文所述的接头。例如、可以使 用天然化学连接化学基团。如下面所示，其中R是良好的离去基团， 可以用Cys-Lys连接建立杂合体：

在另一个实例中，可以使用功能化的模块，制备杂合体：

以产生：

使用类似的方法，可以建立具有赖氨酸接头的杂合体：

特别感兴趣的是GIP-毒蜥外泌肽家族杂合体，它们C-末端至C- 末端连接，保持它们各自的受体激活N-末端不受阻碍。两种分子的 受体激活区存在于这样的杂合体中，例如使用本文的任意GIP和毒蜥 外泌肽和GLP1家族肽和类似物、活性片段和衍生物。例如，可以以 尾至尾的方式，通过合适地连接化学基团，将dAla(2)-GIP(1-30)类似 物连接到毒蜥外泌肽-4上。
此外，如本领域技术人员会认识到的，本发明的肽可以在C-末端 酰胺化，或可以作为游离酸存在。在示例性的实施方案中，本发明的 肽在C-末端酰胺化。当N-端定位的生物活性肽激素模块需要C-末端 酰胺化时，可使用本领域已知的任何合适连接基团将模块再连接至第 二个模块。更具体地说，在以C-端至N-端方向排列表现出至少一种 激素活性的生物活性肽激素模块而产生氨基至氨基键的情况下，示例 性的连接基团包括二羧酸、烷基、PEG和氨基酸，例如Lys、Cys和 Glu。
如上所述，杂合多肽还可优选地包括间隔物，以进一步稳定生物 活性肽激素模块的连接。可使用本领域已知的任何间隔物或转角诱导 物。作为实例，所提及的β-转角模拟物包括以下图示的模拟物A和模 拟物B，也叫做Ala-Aib和Ala-Pro二肽。它们的IUPAC名称是模拟 物A：N-(3S，6S，9S)-2-氧代-3-氨基-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9-甲酸。模 拟物B：N-(3S，6S，9R)-2-氧代-3-氨基-7-硫代-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9- 甲酸。

模拟物A    模拟物B
“激动剂”指激发天然人激素的生物活性的化合物。在一个示例 性的实施方案中，该术语指会引起葡萄糖降低的生物效应或天然人GIP 的其它活性的化合物。新的GIP类似物，例如在葡萄糖降低测定、胃 分泌抑制测定、dP/dt测定、血压测定、胰岛素分泌测定、骨密度测定、 或血浆稳定性测定中具有活性，优选地类似于或优于天然人GIP，和/ 或在GIP受体测定中或在与标记的GIP的竞争性结合测定中，特异性 地结合。优选地，在这样的测定中，激动剂会以大于1μM的亲和力、 更优选地以大于1-5nM的亲和力进行结合。在另一个实施方案中， 激动剂(或拮抗剂，视情况而定)IC50是小于或约100微摩尔，小于或 约50微摩尔，小于或约20微摩尔，和小于或约10微摩尔。这样的 激动剂可以包含多肽，其具有含有trp-笼基序(例如毒蜥外泌肽尾 PSSGAPS或变体)的GIP序列。
“氨基酸”和“氨基酸残基”指天然氨基酸、非天然氨基酸和修 饰的氨基酸。除非与此相反地规定，否则一般性或以名称具体指出的 任何氨基酸都包括D和L立体异构体，如果其结构允许这样的立体异 构体形式。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、 天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨 酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲 硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、 色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于 高赖氨酸、高精氨酸、氮杂环丁烷甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二 酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2- 氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘 氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙 酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖 氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙 氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基 缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌 可酸、硫代脯氨酸、肌氨酸和瓜氨酸。其它的非天然氨基酸包括修饰 的氨基酸残基，其可逆或不可逆地被化学封闭，或在其N-端氨基或其 侧链基团上被化学修饰，例如其中侧链官能团被化学修饰为另一个官 能团的N-甲基化D和L氨基酸或残基。例如，修饰的氨基酸包括甲 硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、天冬氨酸的一种修饰氨基酸--天冬氨酸- (β-甲酯)、甘氨酸的一种修饰氨基酸--N-乙基甘氨酸、或丙氨酸的 一种修饰氨基酸--丙氨酸甲酰胺。另外的可加入的残基描述于 Sandberg等，J.Med.Chem.41：2481-91，1998。
“Ahx”指6-氨基己酸。本文使用的：5Apa”指5氨基-戊酰基，“12 Ado”指12-氨基十二烷酰基，“PEG(8)”指3，6，-二氧基辛酰基，而 “PEG(13)”指1-氨基-4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰基。另外， 使用下面的缩写：″ACN″或″CH3CN″指乙腈。″Boc″，″tBoc″或″Tboc″ 指叔丁氧基羰基。″DCU”指N，N′-二环己基碳二亚胺。″Fmoc″指芴基 甲氧羰基.″HBTU″指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸 盐。″HOBt”指1-羟基苯并三唑一水合物。″高P″或“HPro″指高脯氨酸。 ″MeAla″或″Nme″指N-甲基丙氨酸。“Naph″指萘基丙氨酸。“pG″或 “pGly″指戊基甘氨酸。″tBuG″指叔丁基甘氨酸。″ThioP″或“tPro″指硫 代脯氨酸。“3Hyp″指3-羟基脯氨酸。“4Hyp″指4-羟基脯氨酸。“NAG″ 指N-烷基甘氨酸。“NAPG″指N-烷基戊基甘氨酸。″Norval″指正缬氨 酸。″Norleu″指正亮氨酸。“OctGly”指辛基-甘氨酸，其中甘氨酸氨基 酸侧基H被替换为8碳饱和脂族链。
示例性组合和具体实施方案
形成本发明的GIP杂合多肽的生物活性肽激素模块的示例性组合 包括，选自以下的两个或更多个生物活性肽激素模块的组合：天然肽 激素，表现出至少一种激素活性的肽激素类似物和衍生物，表现出至 少一种激素活性的天然肽激素的片段，表现出至少一种激素活性的肽 激素类似物和衍生物的片段，以及肽增强子，前提条件是，至少一个 模块表现出至少一种激素活性。
本发明的杂合多肽包含至少两个生物活性肽激素模块，其中至少 一个模块源自GIP肽激素，类似物，衍生物，片段或肽增强子。在一 个实施方案中，至少2个组分肽激素来自不同的肽激素家族，例如， 胰淀素家族，CCK，瘦蛋白家族，PPF，胰高血糖素原家族，利钠肽 家族，和毒蜥外泌肽家族。例如，GIP杂合体可以包含与生物活性的 模块相组合的GIP部分，有或没有尾序列，所述生物活性的模块包含 2个或多个激素模块(非-GIP激素杂合体)例如毒蜥外泌肽-胰淀素/sCT 杂合体或激素嵌合体例如胰淀素-sCT嵌合体。
在某些实施方案中，本发明的杂合多肽可包含两个或更多个表现 出至少一种激素活性的模块。例如，杂合多肽可包含表现出至少一种 激素活性的第一肽激素或类似物的片段，其共价连接至至少一个另外 的肽激素类似物的片段。另外的片段任选可表现出至少一种激素活 性。第一肽激素可与另外的肽激素相同或不同，前提条件是，至少一 个另外的肽激素与第一肽激素不同，第一个激素活性可与任选的另外 的激素活性相同或不同。
在其它实施方案中，本发明的杂合多肽可包含一个或多个表现出 至少一种激素活性的模块，其与一个或多个肽增强子模块组合。例如， 表现出至少一种激素活性的第一肽激素的片段可共价连接至肽增强 子，或表现出至少一种激素活性的第一肽激素的片段可共价连接至表 现出至少一种激素活性的第二肽激素，第二肽激素又连接至肽增强 子。或者，肽增强子可位于两个肽激素模块之间，作为稳定性间隔物。 此外，第一肽激素可与第二肽激素相同或不同，第一肽激素的活性可 与第二肽激素的活性相同或不同。
在另一个实施方案中，本发明的杂合多肽可包含2、3、4或更多 个生物活性肽激素模块。示例性的组合包括具有激素活性的模块与1、 2或3个肽增强子组合；两个具有激素活性的模块和1或2个肽增强 子组合；3个具有激素活性的模块和1个肽增强子组合等。
组分肽激素优选地选自胰淀素，肾上腺髓质素，降钙素，降钙素 基因相关肽，垂体中间叶激素，缩胆囊素，瘦蛋白肽YY，胰高血糖 素样肽-1，胰高血糖素样肽2，泌酸调节肽，ANP，BNP，CNP，尿 舒张肽，GIP，GLP1或毒蜥外泌肽-4。
更具体的说，示例性的模块组合包括含至少GIP和胰淀素(和/或 sCT)、BNP、CGRP、CT、CCK、瘦蛋白、PYY、GLP1、和毒蜥外泌 肽-4的组合。
在示例性的实施方案中，包含GIP肽的第一模块连接到第二生物 活性的肽激素模块上，后者包含表现出至少一种激素活性的胰淀素 肽。在另一个实施方案中，第二模块另外连接到第三生物活性的肽激 素模块上，后者包含表现出至少一种激素活性的降钙素肽。在另一个 实施方案中，第三模块可以另外连接到第四生物活性的肽激素模块 上，后者包含选自胰淀素肽的肽增强子。在一个实施方案中，第一模 块可以位于杂合多肽的C-末端。或者，第一模块可以位于杂合多肽的 N-末端。在某些实施方案中，如果需要，可以插入间隔物或接头(例 如βAla或Gly)，以连接模块。
示例性的毒蜥外泌肽-4肽包括：毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽-4(1- 27)，毒蜥外泌肽-4(1-28)，14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)，和5Ala， 14Leu，25Phe-毒蜥外泌肽-4(1-28)。也有用的是毒蜥外泌肽(7-15)和它 的Ser2类似物，HSEGTFTSD(SEQ ID NO.______)。表现出至少一种激素 活性的示例性的胰淀素肽包括：胰淀素，胰淀素片段例如胰淀素(1- 17)，胰淀素(1-16)，胰淀素(1-15)，和胰淀素(1-7)，和胰淀素类似物例 如普兰林肽，2Ala-h-胰淀素，2，7Ala-h-胰淀素，及其片段。表现出至少 一种激素活性的示例性的降钙素肽包括：sCT，sCT片段例如sCT(8- 10)，sCT(8-27)，和降钙素类似物例如11，18Arg-sCT，18Arg-sCT，14Glu， 18Arg-sCT，14Glu，11，18Arg-sCT，及其片段。示例性的胰淀素肽增强子 包括：胰淀素(32-37)，胰淀素(33-37)，和胰淀素(34-37)，及其类似物。 在本发明中有用的胰淀素/sCT组合包括：在本文中引作参考的 PCT/US2005/004631 Amylin Family Agonist，代理卷号18528.835中公 开的那些。对于建立本发明的含有GIP的杂合体特别有用的胰淀素/sCT 嵌合体是胰淀素-sCT-胰淀素嵌合体，例如h胰淀素(1-7)-11，18Arg- sCT(8-27)-胰淀素(33-37)，它具有序列 KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY，优选地是它C-末端 酰胺形式、及其类似物和衍生物(在本文和PCT/US2005/004631中描 述)。
在一个方面，模块组合包括，包含第一模块与第二模块的组合， 所述第一模块包括GIP，表现出至少一种激素活性的GIP片段，表现 出至少一种激素活性的GIP类似物或衍生物，或表现出至少一种激素 活性的GIP类似物的片段；所述第二模块包括CCK，表现出至少一种 激素活性的CCK片段，表现出至少一种激素活性的CCK类似物或衍 生物，或表现出至少一种激素活性的CCK类似物的片段。示例性的 CCK化合物包括：CCK-8，和CCK-8(Phe(CH2SO3))。在一个实施方案 中，第一模块可以位于杂合多肽的C-末端，第二模块可以位于杂合多 肽的N-末端。或者，第一模块可以位于杂合多肽的N-末端，第二模 块可以位于杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要，可以 插入间隔物或接头(例如βAla或Gly)，以连接模块。
在一个方面，示例性的模块组合包括，包含第一模块与第二模块 的组合，所述第一模块包括GIP，表现出至少一种激素活性的GIP片 段，表现出至少一种激素活性的GIP类似物或衍生物，或表现出至少 一种激素活性的GIP类似物的片段；所述第二模块包括胰淀素，表现 出至少一种激素活性的胰淀素片段，表现出至少一种激素活性的胰淀 素类似物或衍生物，或表现出至少一种激素活性的胰淀素类似物的片 段。胰淀素模块可以是本文公开的胰淀素/sCT嵌合体。在一个实施 方案中，第一模块可以位于杂合多肽的C-末端，第二模块可以位于杂 合多肽的N-末端。或者，第一模块可以位于杂合多肽的N-末端，第 二模块可以位于杂合多肽的C-末端。在某些实施方案中，如果需要， 可以插入间隔物或接头(例如βAla或Gly)，以连接模块。
其它示例性的模块组合包括，包含GIP、胰淀素和降钙素作为三 元或四元杂合体分子的组合。示例性的组合包括GIP/胰淀素/降钙素； GIP/胰淀素/降钙素/胰淀素；胰淀素/降钙素/GIP；和胰淀素/降钙素/胰 淀素/GIP组合，有和没有间隔物或连接基团。每个模块可以独立地是 肽增强子，或可以表现出激素活性，这取决于希望的杂合多肽的性质。
在另一个实施方案中，表现出至少一种激素活性的生物活性的肽 激素模块之一是GLP-1或其类似物或片段，且第二生物活性的肽激素 模块包含GIP。在另一种这样的杂合体中，杂合多肽包含第三生物活 性的肽激素模块。示例性的第三生物活性的肽激素模块包括胰淀素(包 括其类似物、衍生物和片段)和胰淀素-sCT嵌合体，PYY(包括其类似 物、衍生物和片段)和CCK(包括其类似物、衍生物和片段)。
GIP-神经调节肽杂合体的示例性的化合物包括
YaGIP(1-30)-β-Ala-β-Ala-FN-38：YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFV
NWLLAQK-β-Ala-β-Ala-FLFHYSKTQKLGKSNVVEELQSPFASQSRG
YFLFRPRN-NH2；
YaGIP(1-30)-β-Ala-β-Ala-神经调节肽(U25)：YAEGTFISDYSIAMD
KIHQQDFVNWLLAQK-β-Ala-β-Ala-FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRP RN-NH2；和
YaGIP(1-30)-β-Ala-β-Ala-神经调节肽(U-9)：YAEGTFISDYSIAMD
KIHQQDFVNWLLAQK-β-Ala-β-Ala-GYFLFRPRN-NH2。
β-Ala-β-Ala间隔物是任选的，可以替换为Gly-Gly-Gly，小-PEG 基团，或本领域已知的其它接头，尤其本文所述的那些。
GIP和利钠肽的示例性的化合物包括GIP-hBNP肽杂合体，包括 YaGIP(1-30)-β-Ala-β-Ala-hBNP，其中hBNP是
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH，和YaGIP(1-30)- 毒蜥外泌肽(31-39)-β-Ala-β-Ala-hBNP，其中hBNP是SPKMVQGSGCFG RKMDRISSSSGLGCKVLRRH。β-Ala-β-Ala间隔物是任选的，可以替 换为Gly-Gly-Gly，小-PEG基团，或本领域已知的其它接头，尤其本 文所述的那些。
实施方案包括：
  SEQ ID   NO.：   序列   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGKLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLS QELHRLQTLPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLS QELHRLQTYPPTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPPTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLANFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   ACNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNAATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CANLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSNASTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSNLATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSNLSACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-
  KCNTATCVLGRLSQELHKLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSGTP   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSALSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCLLQQLQKLLQKLKQYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTASCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTAVCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGK(For)LSQELHK(For)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-KCNTA(d-   Thr)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTA(dAh)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   ACNTATCVLGRLSQELHK(PEG5000)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-
  KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTA(Hse)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTA(Ahb)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTA(Ahp)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTAT(OPO3H2)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLG(Orn)LSQELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLG(Cit)LSQELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLG(homoK)LSQELH(homoK)LQTYP RTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCMLGRYTQDFHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   DSNLSTKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KDNTATKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(9Anc)   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(L-辛基甘氨酸)   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLG(homoR)LSQELH(homoR)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-
  FCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   ICNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLG(Cit)LSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(4ABU)   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSEAF   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPTNVGSEAF   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSRSLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVTHRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNT   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQNFVPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSETF   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   ACDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSKAF   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-
  KCDTATCVTHRLAGLLSRSQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLADALHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLAAFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   SCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTMPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTVPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLNEYLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   SCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLTEFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLAEFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLTDYLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLAQFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLADFLHRFHTFPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSGTP   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-
  KCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLFDFLHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLAAALHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   TCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSNLSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   CSNLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK-接头-   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY   GIP(1-30)-(12Ado)-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-   37)   GIP(1-30)-(12Ado)-1des-Lys-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰   淀素(33-37)   GIP(1-30)-(3，6-二氧杂辛酰基)-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h   胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(3，6-二氧杂辛酰基)-1des-Lys-h胰淀素(1-7)，11，18Arg-   sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(5Apa)-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(5Apa)-1des-Lys-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀   素(33-37)   GIP(1-30)-βAla-βAla-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-   37)   GIP(1-30)-βAla-βAla-1des-Lys-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(27)-h胰   淀素(33-37)   GIP(1-30)-(4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰亚胺基)-h胰淀素(1-   7)11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)
  GIP(1-30)-(4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰亚胺基)-1des-Lys-h   胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(Gly-Gly-Gly)-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素   (33-37)   GIP(1-30)-(Gly-Gly-Gly)-1des-Lys-h胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(27)-h   胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰亚胺基)-h胰淀素(1-   7)11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)   GIP(1-30)-(4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰亚胺基)-1des-Lys-h   胰淀素(1-7)-11，18Arg-sCt(8-27)-h胰淀素(33-37)
如本文已经讨论的，在本文的任意实施方案中，包括上述的杂合 体，可以包括讨论的其它变化。例如，在本文的任意实施方案中，包 括上述的杂合体，可以修饰位置1(包括N-末端)、2或3，以赋予DPP-IV 抗性。例如，本文具体示例的是本文每个实施方案以及上述种类的每 种D-Ala2类似物。
GIP和肽增强子杂合体。
在一个杂合体实施方案中，GIP在C-末端延伸出肽增强子，例如， 另一种激素(例如毒蜥外泌肽或GLP-1)的尾或C-末端部分，这提供 具有增强的体内功效的类似物。毒蜥外泌肽-4(图1)是一种有效的肠降 血糖素模拟物，它与GLP-1具有53％同源性，并反映了GLP-1的许 多关键生物作用。与GLP-1不同，毒蜥外泌肽-4对DPP-IV肽酶和NEP 的蛋白水解切割更有抗性。与GLP-1相比，这会赋予在人体中极大增 强的药代动力学和提高的体内功效。在水性介质和含有有机共溶剂的 介质中进行的毒蜥外泌肽-4的圆二色性(CD)和NMR研究，揭示了含 有序列LFIEWLKNGGPSSGAPPPS(残基21-39)的C-末端区段会形成 独特的疏水的Trp-笼簇，这源自Pro37与Phe22的相互作用和Pro38 与Trp25的相互作用(29-31)。该Trp-笼簇基序是肽显示出的蛋白样三 级结构的第一个实例，它能通过体内遮蔽分子的蛋白酶-敏感部位，赋 予更大的代谢稳定性(32)。
因此，在一个方面，示例性的模块组合包括，包含第一模块与肽 增强子的组合，所述第一模块包括GIP，表现出至少一种激素活性的 GIP片段，表现出至少一种激素活性的GIP类似物或衍生物，或表现 出至少一种激素活性的GIP类似物的片段。有用的肽增强子是本文所 述的毒蜥外泌肽-4和蛙GLP尾，以及PYY(25-36)，PYY(30-36)和 PYY(31-36)。在一个实施方案中，第一模块可以位于杂合多肽的C-末 端，肽增强子可以位于杂合多肽的N-末端。或者，第一模块可以位于 杂合多肽的N-末端，肽增强子可以位于杂合多肽的C-末端。在某些 实施方案中，如果需要，可以插入间隔物或接头(例如βAla或Gly)， 以连接模块。
感兴趣的具体化合物是 YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS-NH2(化合物 0601GIP3794；它具有在位置2的D-Ala，是酰胺形式)。具有在位置 2(即残基2)的修饰和它们的GIP受体结合和受体激活活性的示例性的 化合物包括Y-残基2-EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKP SSGAPPPS-NH2，其中残基2如下表所示(也参见图12)：
  化合物编号   残基2   GIP RBA   环化酶   0601GIP3794   dAla   3.8   38   0601GIP4189   V   12   ＞1000   0601GIP4145   dnorV   83   10000   0601GIP4146   dSer   20   171   0601GIP4147   Abu   7.4   126   0601GIP4148   dAbu   34   248   0601GIP4186   高-Ser   20   ＞1000   0601GIP4195   d-高Ser   52   10000   0601GIP4164   dPro   501   10000   0601G1P4187   环丙基Ala   67   ＞1000   0601GIP4188   d-环丙基Ala   214   10000   0601GIP4181   环己基Ala   0601GIP4182   d-环己基Ala
  0601GIP4237   A(NMe)   28   10000   BB   Aib   CC   环丙基Gly
具有在N-末端的修饰和它们的GIP受体结合和受体激活活性的其 它示例性的化合物包括：
N-末端-YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS- NH2，其中N-末端修饰如下表所示(也参见图12)：
  化合物编号   N-末端   GIP RBA   环化酶   0601GIP4794   H   3.8   38   0601GIP4196   Isocap   11   10000   0601GIP4180   isoBuOCO   0601GIP4178   辛基甘氨酸   1.5   96   0601GIP4238   Y(NMe)   4.2   144   0601GIP4291   琥珀酰基   179
具有本文所述的各种接头或脂肪酸修饰、或修饰组合、和它们的 GIP受体结合和受体激活活性的其它示例性的化合物如下表所示(也 参见图12)：
  化合物编号   序列   GIP   RBA   环化酶   0601GIP 3794   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPS   SGAPPPS-NH2   3.8   38   0601GIP 4179   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-   bAlabAla-PSSGAPPPS-NH2   3.3   56   0601GIP 4191   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-8-   Am-3，6-dioxaOct-PSSGAPPPS-NH2   10   81
  0601GIP 4294   G(Oct)-   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-   bAlabAla-PSSGAPPPS-NH2   0.92   0601GIP 4194   YaEGTFISDYSIAMDG(Oct)IHQQDFVNWLLA   QKPSSGAPPPS-NH2   68   933   0601GIP 4252   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPS   S-G(Oct)-APPPS-NH2   5.6   154   HH   YaEGTFISDYSIAG(Oct)DKIHQQDFVNWLLAQ   KPSSGAPPPS-NH2   II   YaEGTFISDYSIAK(Oct)DKIHQQDFVNWLLAQ   KPSSGAPPPS-NH2   0601GIP 4290   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQK-   bAla-PSSGAPPPS-NH2   0.35
0601GIP4294含有辛基甘氨酰基N-末端修饰和β-Ala接头。
描述了掺入来自其它(非人)物种的修饰、或本文所述修饰的组合、 和它们的GIP受体结合和受体激活活性的其它示例性的化合物如下表 所示(以粗斜体强调了来自化合物0601GIP3794的变化；和也参见图 12)。
  化合物编号   序列   GIP RBA   环化酶   0601GIP3794   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   3.8   38   0601GIP4190   YaEGTFISDYSIALDKIHQQDFVNW   LLAQKPSSGAPPPS-NH2   2.4   31   0601GIP4151   YaEGTFISEYSIAMDKIHQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   20   10000   0601GIP4152   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQEFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   2.3   22   0601GIP4150   YaEGTFISDYSIAMDKIAQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   1.6   14
  0601GIP4153   YaEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0.53   11.4   0601GIP4149   YaEGTFISDYSIAMDKIKQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   1.5   36   0601GIP4165   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVN   WLLAQAPSSGAPPPS-NH2   21   40   0601GIP4176   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVN   WLLAQRPSSGAPPPS-NH2   4.8   28   0601GIP4177   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVN   WLLAQHPSSGAPPPS-NH2   2.9   11   0601GIP4213   YaEGTFISDYSITMDKIHQQDFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   44   0601GIP4214   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVN   WLLSQKPSSGAPPPS-NH2   145
在一个实施方案中，GIP杂合体或其GIP部分具有一种或多种下 述修饰(仅仅参照式N-末端- YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-接头-PSSGAPPPS- NH2)：dAla2替换成Abu，Ala，Gly，或Ser；Met14替换成Leu；His18 替换成Ala，Arg，或Lys；Asp21替换成Glu；Lys30替换成Arg或 His；N-末端作为Gly(Oct)；和/或bAla-bAla或Gly-Gly-Gly接头。在 另一个实施方案中，对化合物0601GIP3794产生一种或多种这样的变 化。
可以用于本发明化合物的GIP部分的其它示例性的修饰(相对于 0601GIP3794)和含有它们的示例性的化合物，如下表所示(也参见图 12)：
  化合物编号   序列   GIP   RBA   环化酶   0601GIP4263   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVNWLLA   QRPSSGAPPPS-NH2   0.66   6.2   0601GIP4278   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNW   LLAQRPS SGAPPPS-NH2   0.24   3.5   0601GIP4279   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVN   WLLAQRPSSGAPPPS-NH2   2.1   14   0601GIP4279   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVN   WLLAQHPSSGAPPPS-NH2   2.1   14   OO   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVN   WLLAQHPSSGAPPPS-NH2   PP   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVN   WLLAQHPSSGAPPPS-NH2   0601GIP4235   YaEGTFISDYSIAMDKIHQVKFV   NWLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0601GIP4283   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0.41   0601GIP4284   YaEGTFISDYSIALDKIKQQEFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   1.8   0601GIP4285   YaEGTFISDYSIALDKIAQQEFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0.58   0601GIP4286   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVN   WLLAQHPSSGAPPPS-NH2   1000   0601GIP4287   YaEGTFTADYSKALDKIHQQDFV   NWLLAQKPS SGAPPPS-NH2   27   VV   YaEGTFTSDYSKALDKIHQQDFV   NWLLAQKPS SGAPPPS-NH2   WW   YaEGTFISDYSKAMDKIRQQEFV   NWLLAQKPSSGAPPPS-NH2
  XX   YaEGTFISDYSIALEKIRQQKFVN   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0601GIP4289   YaEGTFISDYSIALDKIRQQDFVE   WLLAQKPSSGAPPPS-NH2   0.58   ZZ   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQ   K-bAla-PSSGAPPPS-NH2   AAA   YaEGTFISDYSIALDKIRQQEFVNWLLAQ   K-bAla-PSSGAPPPS-NH2   0601GIP4215   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQLFIEWLKNG   GPSSGAPPPS-NH2   0601GIP4288   YaEGTFISDYSIAMDKIRQQEFVNWLLA   QKPSSGAPPPS-NH2   AAAA   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNFLLA   QKPSSGAPPPSNH2   BBBB   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNFLLA   QKPSSGAPPPSNH2
示例性的类似物也包括消除或减少氧化的氨基酸修饰。这样的替 换包括用亮氨酸替换甲硫氨酸14或去除，和/或用苯丙氨酸替换色氨 酸25或去除。因此，具体的示例性的类似物包括，通过使用一种或 多种这样的替换，产生的本文所述每种类似物的变体。一个实例是化 合物AAAA和BBBB，它是0601GIP3794的D-Ala2和L-Ala2类似物， 在位置25用Phe替换Trp。
其它示例性的“尾”修饰(相对于0601GIP3794)和含有它们的示例 性的化合物如下表所示(也参见图12)，以及受体结合和激活数据：
  化合物编号  序列   GIP   RBA   环化酶   0601GIP3794  YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  PSSGAPPPS-NH2   3.8   38   0601GIP4216   Trp笼   ″Leu21-Pro38″  YaEGTFISDYSIAMDKIHQQLFIEWLKNGGP  SSGAPPPS-NH2   12   122   0601GIP4233   fGLP1尾  YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  PKKIRYS-NH2   0.1   31   0601GIP4234   fGLP1尾  YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  PSKEIIS-NH2   3.4   83   0601GIP4236   毒蜥肽II尾  YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK  TSPRPPS-NH2   0.62   29
图12A-12AT描述了本发明的其它示例性的类似物和参照肽。如 本文讨论的，预见到显示的各种修饰和变体适用于本发明，且可以相 组合。例如，术语毒蜥外泌肽尾或毒蜥外泌肽trp-笼基序包括所述的 任一种毒蜥外泌肽尾变体，它们可以用作遮蔽序列(肽增强子)。进一 步感兴趣的是，图中所示的蛙GLP1C-末端延伸，它们是可以用于替 代毒蜥外泌肽尾的遮蔽序列的另一个实例。例如，在一个实施方案中， 本发明的GIP化合物包含蛙GLP1“尾”序列作为本文所述的肽增强子 (也参见图12)。特别感兴趣的是化合物0601GIP4179，0601GIP4233， 0601GIP4285，0601GIP4178，和0601GIP4467。
在本文任意GIP模块的另一个实施方案中，是丝氨酸2，天冬氨 酸3(即S2，D3)，即在GIP的N-末端的位置2和3的双置换。因而， 特别指出，对于本文所述的每个种类和公式，在本文中明确地公开了 每个S2，D3类似物，如同已经书写下来。关于本文所述的其它DPP- IV抗性修饰，S2，D3可以与1、2或更多种其它修饰相组合，例如脂 肪酰基衍生化，以降低血浆(例如肾清除)和/或增加作用持续时间，和/ 或与C-末端遮蔽序列相组合，和/与GIP种类氨基酸置换相组合。当 然，这些GIP类似物可以直接地使用，或用作GIP杂合体的GIP部分。
在小于约10nm时表现出优越的GIP受体结合活性的示例性的化 合物(参见例如图12)包括：0601GIP3794在3.8nM，0601GIP4283在 0.41nM，0601GIP4284在1.8nM，0601GIP4285在0.58nM， 0601GIP4288在0.28nM，0601GIP4289在0.58nM，0601GIP4290在 0.35nM，0601GIP4147在7.4nM，0601GIP4178在1.5nM，0601GIP4293 在0.12nM，0601GIP4292在0.17nM，0601GIP4238在4.2nM， 0601GIP4179在3.3nM，0601GIP4294在0.92nM，0601GIP4252在5.6 nM，0601GIP3794在3.8nM，0601GIP4190在2.4nM，0601GIP4152 在2.3nM，0601GIP4150在1.6nM，0601GIP4153在0.53nM， 0601GIP4149在1.5nM，0601GIP4176在4.8nM，0601GIP4177在2.9 nM，0601GIP4213在7.9nM，0601GIP4215在4.5nM，0601GIP4263 在0.66nM，0601GIP4278在0.24nM，0601GIP4264在0.4nM， 0601GIP4279在2.1nM，0601GIP4233在0.1nM，0601GIP4234在3.4 nM，0601GIP4236在0.62nM。这些化合物也表现出GIP受体激活和 适当的受体特异性(例如，在没有适当杂合体模块时，不会结合GLP1- R或胰高血糖素受体)。
如本文所证实的，与天然GIP相比，本发明的DPP-IV抗性的 杂合体具有增强的血浆稳定性。例如，5小时后，0601GIP3796酰胺 形式基本上100％存在于人血浆中，这与GIP(1-42)酸形式的约60％不 同。
本发明的实施方案还包括下面的内容。下面的内容也简短地描述 了每个种类和源自它们的亚属。
在一个实施方案中，新的GIP类似物或GIP杂合体包含具有式 D-L-C-S的多肽，其中
D包含二肽基肽酶IV抗性的GIP N-末端区域，
L包含接头，
C包含GIP C-末端区域，且
S包含遮蔽区域；并且
其中L任选地存在，且存在D或C中的至少一个，且其中当存 在C时，C-S包含trp-笼基序，或当不存在C时，L-S还包含trp-笼基 序，且所述多肽具有GIP受体结合和/或激活活性。当存在D或C中 的至少一个时，至少一个存在的D或C具有GIP受体激活和/或结合 活性。在另一个实施方案中，D和C都存在。任一个或两个D和C 可以具有GIP受体激活和/或结合活性。在一个实施方案中，所述多肽 可以特异性地结合GIP受体。通常，该结合比对另一种受体(例如肠 降血糖素受体，例如，GLP1R)的结合大至少2倍。该结合可以比对 另一种受体(例如肠降血糖素受体，例如，GLP1R)的结合大至少5、 10、50或甚至100倍。在一个实施方案中，新的GIP类似物包含GIP 激动剂活性。在一个实施方案中，多肽可以特异性地激活GIP受体。 通常，该激活比另一种受体(例如肠降血糖素受体，例如，GLP1R) 的激活大至少2倍。该激活可以比另一种受体(例如肠降血糖素受体， 例如，GLP1R)的激活大至少3、4、5、10、50或甚至100倍。
在另一个实施方案中，多肽包含至少一种需要的天然GIP的活性。 当需要的新的GIP杂合体的活性大于天然形式时，活性可以是至少2 倍。在其它实施方案中，需要的活性是天然GIP活性的至少3、4、5、 10、50或甚至100倍。活性可以是受体结合、受体激活、受体拮抗、 葡萄糖降低、胃分泌的抑制或减少、或任何其它活性，这可以是体外 的、离体的或体内的，可以是本领域已知的或本文提供的。
在其它实施方案中，新的GIP类似物或杂合体的D区域包含天然 GIP的11个N-末端氨基酸的序列或天然GIP的14个N-末端氨基酸 的序列。在其它实施方案中，D区域包含修饰的或取代的GIP的N-末 端部分，例如参见WO 00/58360，EP1171465或公开的美国专利申请 20030232761。
在其它实施方案中，区域C包含天然GIP的C-末端氨基酸19-26， 天然GIP的C-末端氨基酸19-30，天然GIP的C-末端氨基酸19-39 或天然GIP的C-末端氨基酸19-42。在一个这样的实施方案中，区域 C可以包含人、小鼠、猪或大鼠GIP的氨基酸19-26，19-30，19-39 或19-42。在其它实施方案中，C区域包含修饰的或取代的GIP的C- 末端部分，例如参见公开的美国专利申请20030232761。
在一个实施方案中，L包含来自天然GIP的序列，包括DKIH或 DKIH。在另一个这样的实施方案中，新的GIP类似物的D-L-C部分 包含天然GIP的氨基酸1-26，1-30，1-39，或1-42。在一个这样的实 施方案中，区域D-L-C包含人、小鼠、猪或大鼠GIP的氨基酸1-26， 1-30，1-39或1-42(参见例如Li等，Regulatory Peptides 121(1-3)第 107-112页(2004))。在另一个这样的实施方案中，新的GIP类似物的 D-L-C部分包含具有DPP-IV抗性的N-末端修饰或取代(在位置1-4中 的任一个)的GIP的氨基酸1-26，1-30，1-39，或1-42，例如参见WO 00/58360，EP1171465或公开的美国专利申请20030232761。
式D-L-C-S的新的GIP化合物可以包含序列
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(Tyr1-葡糖醇)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(Tyr1-焦谷氨酰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(Tyr1-葡糖醇)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(Tyr1-9-芴基甲氧羰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(Tyr1-棕榈酰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
YSEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，或
YGEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS。
在另一个实施方案中，新的GIP化合物包含序列
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
(Tyr1-葡糖醇)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
(Tyr1-焦谷氨酰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHINITQPSSGAPPPS，
(Tyr1-萄糖醇)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
(Tyr1-9-芴基甲氧羰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
(Tyr1-棕榈酰基)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
YSEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，或
YGEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS。
新的GIP化合物也可以包含序列
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
YAbuAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，或
YSarAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS。
在另一个实施方案中，新的GIP杂合体包含序列
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
YAbuAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，或
YSarAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS。
在新的GIP类似物或杂合体的一个实施方案中，D包含序列X1- X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，其中X1、X2和 X3中的至少一个是提供DPP-IV抗性的氨基酸置换或修饰。在另一个 这样的实施方案中，通过包含X2和X3之间的肽模拟键的修饰，提 供DPP-IV抗性。这样的键可以提供为式Ψ(CH2NH)的还原肽键，例 如当X1-X2-X3是Tyr1-AlaΨ(CH2NH)-Glu时。在另一个实施方案中， 新的GIP类似物的任意键是式Ψ(CH2NH)的还原肽键，尤其鉴别为对 蛋白酶或肽酶降解敏感的键。在另一个实施方案中，置换或修饰包含 在X1、X2和/或X3的D-氨基酸置换，和/或N-末端的糖化、烷化、 乙酰化或酰化。可以独立地选择位置X1-X14。在其它实施方案中， X12-X14中的一个或多个任选地缺失。
感兴趣的是新的GIP类似物或杂合体，其中X2和X3独立地是 Lys，Ser，4-氨基丁氨酸，Aib，D-Ala，肌氨酸或Pro。N-末端修饰可 以选自：糖化，烷化，乙酰化，烷氧基羰基化或芳基烷氧基羰基化。
在另一个实施方案中，X1是Tyr，脱氨基-Tyr，D-Tyr，Ala，D- 氨基酸，Tyr-葡糖醇，N-甲基化的氨基酸，和/或包含N-末端糖化，烷 化，乙酰化，烷氧基羰基化，芳基烷氧基羰基化或酰化。在另一个实 施方案中，当X1是Tyr时，酪氨酸残基的N-末端可以通过下述方式 修饰：烷化，烷氧基羰基化，芳基烷氧基羰基化，磺酰化，糖化，高 丝氨酸形成，焦谷氨酸形成，酰化，甲基化，叔丁基化，叔丁氧基羰 基化，4-甲基苄基化，苯甲氧基甲基化，苯甲氧基羰基化，4-甲苯磺 酰化，联苯基甲基化，2-溴苯甲氧基羰基化，9-芴基甲氧基羰基化， 酰化，甲酰化，乙酰化，苄基化，苯甲酰化，磷酸化，硫酸化，与戊 糖、脱氧已糖、葡糖胺或N-乙酰基葡糖胺的糖基化，法尼基化，生物 素化，棕榈酰化，硬脂酰化，二牦牛儿基化，谷胱甘肽基化，和硫辛 酸修饰。在另一个实施方案中，X1残基的N-末端可以通过下述方式 修饰：烷化，烷氧基羰基化，芳基烷氧基羰基化，磺酰化，糖化，高 丝氨酸形成，焦谷氨酸形成，酰化，甲基化，叔丁基化，叔丁氧基羰 基化，4-甲基苄基化，苯甲氧基甲基化，苯甲氧基羰基化，4-甲苯磺 酰化，联苯基甲基化，2-溴苯甲氧基羰基化，9-芴基甲氧基羰基化， 酰化，甲酰化，乙酰化，苄基化，苯甲酰化，磷酸化，硫酸化，与戊 糖、脱氧已糖、葡糖胺或N-乙酰基葡糖胺的糖基化，法尼基化，生物 素化，棕榈酰化，硬脂酰化，二牦牛儿基化，谷胱甘肽基化，和硫辛 酸修饰。
在另一个实施方案中，X2是Ala，AlaΨ(CH2NH)，Ser，D-氨基 酸，Lys，4-氨基丁氨酸，Aib，D-Ala，肌氨酸，Pro，Gly，磷酸化的 Ser，Val，Leu，Ile，Thr，或N-甲基化的氨基酸。在另一个实施方案 中，X2是天然残基或本文提供的X2残基的保守氨基酸改变。在另一 个实施方案中，X2是任意天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中， X2是任意非蛋白质生成氨基酸。
在另一个实施方案中，X3是Glu，D-Glu，L-Pro，(N-Me)Glu，Pro， D-氨基酸，Lys，Ser，4-氨基丁氨酸，Aib，D-Ala，肌氨酸，Pro，或 N-甲基化的氨基酸。在另一个实施方案中，X3天然残基或本文提供 的X3残基的保守氨基酸改变。在另一个实施方案中，X3是任意天然 存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X3是任意非蛋白质生成氨基 酸。
在另一个实施方案中，X4是Gly或Ala。在另一个实施方案中， X4是天然残基或本文提供的X4残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X5是Thr或Ser。
在另一个实施方案中，X6是Phe或Ala。在另一个实施方案中， X6是天然残基或本文提供的X6残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X7是Ile或Ala。在另一个实施方案中， X7是天然残基或本文提供的X7残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X8是Ser或Ala。在另一个实施方案中， X8是天然残基或本文提供的X8残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X9是Asp或Ala。在另一个实施方案中， X9是天然残基或本文提供的X9残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X10是Tyr或Ala。在另一个实施方案中， X10是天然残基或本文提供的X10残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X11是Ser或Ala。在另一个实施方案中， X11是天然残基或本文提供的X11残基的保守氨基酸改变。
在另一个实施方案中，X12是Ile，Ala，Ser，或Lys。在另一个 实施方案中，X12是天然残基或本文提供的X12残基的保守氨基酸改 变。在另一个实施方案中，X12是任意天然存在的氨基酸。在另一个 实施方案中，X12不存在。
在另一个实施方案中，X13是Ala，Tyr，谷氨酰胺，或Asp。在 另一个实施方案中，X13是天然残基或本文提供的X13残基的保守氨 基酸改变。在另一个实施方案中，X13是任意天然存在的氨基酸。在 另一个实施方案中，X13不存在。
在另一个实施方案中，X14是Met，Ala，或Leu。在另一个实施 方案中，X14是天然残基或本文提供的X14残基的保守氨基酸改变。 在另一个实施方案中，X14是任意天然存在的氨基酸。在另一个实施 方案中，X14不存在。
在某些实施方案中，新的GIP类似物和杂合体的修饰的D区域包 含序列Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met。
在某些实施方案中，D包含序列
Ala-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-lIe-Ser-Asp-Tyr-Ser-IIe-Ala-Met；
Tyr-Ala-Ala-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Ala-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Ala-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Ala-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser-ASp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ala-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Ala-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Ala-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ala-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ala-Ala-Met；或
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ala.
在其它实施方案中，D包含序列
TyrSerGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMet；
TyrGlyGluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMet；或
Tyr-DAla-GluGlyThrPheIleSerAspTyrSerIleAlaMet.
在其它实施方案中，D包含序列
YAEGTFISDYSIAM，(Tyr1-葡糖醇)AEGTFISDYSIAM，(Tyr1-焦 谷氨酰基)AEGTFISD，(Tyr1-葡糖醇)AEGTFISDYSIAM，(Tyr1-9-芴 基甲氧羰基)AEGTFISDYSIAM，(Tyr1-棕榈酰基)AEGTFISDYSIAM， YSEGTFISDYSIAM，或YGEGTFISDYSIAM。
在其它实施方案中，D包含序列
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAM，YAbuAEGTFISDYSIAM，或YSarAEGT FISDYSIAM。
在另一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体区域D可以在每 个对应序列的整个长度，表现出与天然GIP的对应区域(例如天然 GIP、优选人GIP的氨基酸1-11、1-12、1-13或1-14)的至少60％、65％、 70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％序列同一性。此外，新 的GIP类似物的区域D也可以表现出与修饰的或取代的GIP(例如参 见WO 00/58360，EP1171465或公开的美国专利申请20030232761)的 至少50％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或甚至100％序 列同一性。可以手工地或通过Vector NTI(Invitrogen；Carlsbad CA)中 的AlignX模块或用于总体比对的ClustalW算法的分析，确定同一性 百分比。天然区域DGIP序列包括源自人、小鼠、大鼠、猪或牛GIP 的那些。天然GIP序列包括人GIP(1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ)， 小鼠GIP(1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKSDWKHNITQ)，大 鼠GIP(1-42)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL LAQKGKKNDWKHNLTQ)，猪GIP(1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWKHNITQ)，或 牛GIP(1-42)(YAEGTFISDYSIAM DKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWIHNITQ)。在其它实施方案中，区 域D包含人、小鼠、大鼠、猪或牛GIP的氨基酸1-11，1-12，1-13 或1-14，例如其中区域D包含YAEGTFISDYS，YAEGTFISDYSI， YAEGTFISDYSIA或YAEGTFISDYSIAM。在其它实施方案中，区域 D氨基酸序列还包含除了位置X1、X2或X3中的任一个之外的修饰 的或取代的氨基酸。
在新的GIP类似物或杂合体的有些实施方案中，L可以不存在。 在其它实施方案中L包含
a)Aha，
b)Aha-Aha，
c)Aha-Aha-Aha，
d)氨基链烷酸(C5-C12)，
e)Glu-Lys-Glu-Lys，
f)Ala-Ala-Ala-Ala，
g)接头肽，其包含12个选自氨基酸残基、D-氨基酸和非蛋白质 生成氨基酸的氨基酸残基，
h)Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys，
i)ω-氨基脂肪酸(饱和的和不饱和的)ω-NH2-(CHx)n-COOH，其 中n＝10-34；或
j)序列X15-X16-X17-X18，其中X15-X18中的每一个独立地是任 意天然存在的氨基酸，非蛋白质生成氨基酸，D-氨基酸，或不存在。
在其它实施方案中，X15是D，E，或其保守氨基酸改变或天然 X15残基的保守氨基酸改变。在其它实施方案中，X16是K，G，E， 或其保守氨基酸改变或天然X16残基的保守氨基酸改变。在其它实施 方案中，X17是I，Q，E，或其保守氨基酸改变或天然X17残基的保 守氨基酸改变。在其它实施方案中，X18是H，R，A或其保守氨基 酸改变或天然X18残基的保守氨基酸改变。在新的GIP类似物中，L 可以包含序列D-K-I-H或D-K-I-R。在其它实施方案中，L包含修饰 的或取代的氨基酸。在一个这样的实施方案中，L在第一个位置(例如 X16)包含(杂)芳基(二者都任选地被取代)或3-7C环烷基，1-10C(杂)亚 烷基，2-10C(杂)亚烯基，2-10C(杂)亚炔基或苯基，在第二个C-末端 邻近位置(例如X17)包含通过-CO-连接到氨基酸主链的下一个残基上 的1-10C(杂)亚烷基，2-10C(杂)亚烯基，2-10C(杂)亚炔基，或苯基。 在其它实施方案中，区域L氨基酸序列还包含修饰的或取代的氨基 酸。
在本发明的一个实施方案中，区域C包含序列X19-X20-X21- X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30，每个位置独立地选择，其 中
X19是Q或其保守氨基酸置换
X20是Q或其保守氨基酸置换
X21是D或其保守氨基酸置换
X22是F，Y或其保守氨基酸置换
X23是V，I，A，或其保守氨基酸置换
X24是N，Q或其保守氨基酸置换
X25是W，F，Y，萘基丙氨酸或其保守氨基酸置换
X26是L，A或其保守氨基酸置换
X27是L，K，R，V，A，I或其保守氨基酸置换或不存在
X28是A，N，D，K，R，E或其保守氨基酸置换或不存在
X29是Q，G或其保守氨基酸置换或不存在，和
X30是K，G，R，G，P，R或其保守氨基酸置换或不存在。
在另一个方面，X26-X30中的任意1个、2个或3个在区域C中 不存在。
在另一个实施方案中，新的GIP类似物区域C包含GIP的8-24 个C-末端氨基酸(在GIP中与人GIP的位置X19(Gln)相对应的位置)， 至少前8个这样的氨基酸(例如，包含位置X19-X26，例如X19-27， X19-X28，X19-29)，至少前12个这样的氨基酸(例如，包含位置X19- X30，例如X19-X31，X19-X32，X19-X33，X19-X34，X19-X35， X19-X36，X19-X37，X19-X38)，至少前21个这样的氨基酸(例如包 含位置X19-X39，例如X19-X40，X19-X41)或至少24个这样的氨基 酸。特别地，在这些实施方案中，X27-X30可以独立地存在或不存在。 例如，区域C可以另外包含GIP或天然GIP的残基31-39，且X27-X30 可以任选地不存在。
在另一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体区域C可以在每 个对应序列的整个长度，表现出与天然GIP的对应区域(例如天然GIP 的氨基酸19-30，19-26，19-26或19-42)的至少60％、65％、70％、80％、 85％、90％、95％、98％或100％序列同一性。此外，新的GIP类似物 的区域C也可以表现出与修饰的或取代的GIP(例如参见WO 00/58360，EP1171465或公开的美国专利申请20030232761)的至少 50％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％ 序列同一性。天然区域C GIP序列包括源自人、小鼠、大鼠、猪或牛 GIP的那些。天然GIP序列包括人GIP(1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ)， 小鼠GIP                        (1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKSDWKHNITQ)，大 鼠GIP                          (1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNLTQ)， 猪GIP                          (1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWKHNITQ)，或 牛GIP                          (1-42) (YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWIHNITQ)。在 其它实施方案中，区域C包含人、小鼠、大鼠、猪或牛GIP的氨基酸 19-30，19-26，19-26或19-42，例如区域C包含 GlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnLys或 GlnGlnAspPheValAsnTrpLeuLeuAlaGlnArg。在其它实施方案中，区域 C氨基酸序列还包含修饰的或取代的氨基酸。
在新的GIP类似物或杂合体的一个实施方案中，区域S包含序列 X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37-X38-X39，各自独立地选择，其中 X31是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨 酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，G，S；
X32是Ser，Pro，His，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸， N-烷基甘氨酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸；
X33是Ser，Arg，Thr，Trp，Lys；
X34是Gly，Ser；
X35是Ala，Arg，Asp，Glu，Lys，Gly；
X36是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨 酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，A，不存在；
X37是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨 酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，A，不存在；
X38是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨 酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，Ala，Arg，Lys，His，或不 存在；并且
X39是Ser，Thr，Tyr，Leu，Ala，Lys，His，Pro，Lys，Arg，Gly， 或不存在，
其中如果氨基酸不存在，则所有后面的位置都不存在。
在另一个实施方案中，X31-X39中的至少一个含有本文为区域S 的实施方案列出的氨基酸的保守置换。在其它实施方案中，区域S包 含ProSerSerGlyAlaProProProSer，ProSerSerGlyAlaProProPro， ProSerSerGly AlaProPro，ProSerSerGlyAlaPro，ProSerSerGlyAla， ProSerSerGly，或Pro SerSer。在另一个实施方案中，区域S包含C- 末端酰胺。在另一个实施方案中，区域S包含这样的序列，其中X37 是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨酸，N-烷 基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，其能与区域C的Trp或Trp样残基相 互作用，形成Trp-笼。在另一个实施方案中，区域S包含这样的序列， 其中X31是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫代脯氨酸，N-烷基甘氨 酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，其能与区域C的Trp或Trp 样残基相互作用，形成Trp-笼。在另一个实施方案中，区域S包含这 样的序列，其中X31和X37都是Pro，高脯氨酸，3Hyp，4Hyp，硫 代脯氨酸，N-烷基甘氨酸，N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，其能 与区域C的Trp或Trp样残基相互作用，形成Trp-笼。在有些实施方 案中，区域S包含5-14个氨基酸、5-10个氨基酸、或6-9个氨基酸的 序列，其能与区域C形成Trp笼。
在一个实施方案中，修饰新的GIP类似物或杂合体。新的GIP杂 合体可以包含通过在至少一个赖氨酸残基的ε氨基添加脂肪酸进行的 修饰。
在一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体是GIP-受体激动 剂。新的GIP杂合体可以实现环状AMP生产。在另一个实施方案中， 新的GIP杂合体是GIP-受体拮抗剂。
在一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体包含式D-L-C-S的 序列，其中D包含在X2的D-氨基酸丙氨酸，且其中D，L，C和S 如本文所定义，是本文的任一个其它实施方案。例如，在另一个这样 的实施方案中，区域C包含GIP的氨基酸19-30，尤其人GIP，甚至 更具体地包含序列QQDFVNWLLAQK。在另一个这样的实施方案中， L是天然GIP、尤其人GIP的天然存在的序列X15-X18。在其它示例 性的实施方案中，S是包含PSSGAPPPS，PSSGAPPP，PSSGAPP， PSSGAP，PSSGA，或PSSG的序列。在另一个实施方案中，新的GIP 杂合体包含序列：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS；
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRPSSGAPPPS；
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS；
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS；
或
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS。
在另一个实施例中，这样的新的含有D-Ala2的GIP类似物或杂 合体的实施方案与任一种上述的类似物具有至少50％序列同一性，且 包含在位置X2的D-Ala。在其它实施方案中，所述实施方案还可以 包含序列PSSGAPPPS或KNGGKPSSGAPPPS。
在新的GIP类似物或杂合体区域的一个实施方案中，D包含式 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，其中X1和 X2不存在。在另一个实施方案中，区域D包含式X1-X2-X3-X4-X5- X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14，其中X1和X2不存在，且X3、 X4或X5中的至少一个是提供DPP-IV抗性的氨基酸置换或修饰，例 如本文定义的修饰或置换或还原的键。其它氨基酸位置如本文所定 义。通常，新的GIP类似物或杂合体的这样的实施方案具有GIP拮 抗剂活性。
在一个实施方案中，D不存在。在另一个实施方案中，当D不存 在时，新的GIP类似物可以包含L-C-S或C-S，其中区域L或C包含 N-末端修饰、置换或修饰，以提供蛋白酶抗性、尤其DPP-IV抗性。 在另一个实施方案中，是X18-X19-C-S，其中X18和X19中的一个 或2个不存在，所以就X18-X19-X20而言，是X19-X20-X21，和 X20-X21-X22，X18、X19、X20、X21或X22中的至少一个的氨基酸 置换或修饰或N-末端修饰提供DPP-IV抗性。
其它实施方案包括含有下述序列的化合物：
Y(DAla)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
Y(pSer)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
YA(N-MeGlu)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAP PPS，
YPEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
YVEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，
(D-Tyr)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS，或
YAPGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS。
其它实施方案包括含有下述序列的化合物：
Y(DAla)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
Y(pSer)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
YA(N-MeGlu)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
YPEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
YVEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，
(D-Tyr)AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS，或
YAPGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS。
在另一个实施方案中，任一种GIP多肽包含N-末端His，D-组氨 酸，脱氨基-组氨酸，2-氨基-组氨酸，β-羟基-组氨酸，高组氨酸，α- 氟代甲基-组氨酸，α-甲基组氨酸。其它实施方案包括含有下述序列的 化合物：HGEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS或 HGEGTFIS
DYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPSSGAPPPS。
在新的GIP类似物或杂合体的一个实施方案中，区域L和/或C 包含修饰的或取代的氨基酸。在某些实施方案中，新的GIP类似物包 含Cys，D-Cys，高Cys或青霉胺。在另一个实施方案中，接头L和/ 或区域C包含Cys，D-Cys，高Cys或青霉胺。插入这些氨基酸，作 为添加peg分子、脂质或连接到其它含有SH的分子(例如其它肽或 活性分子)的修饰位点。在另一个实施方案中，至少一个Cys、D-Cys、 高Cys或青霉胺被脂质或peg分子或反应基团修饰。通常，存在0、1、 2或3个这样的残基。
在一个这样的实施方案中，区域L和/或C包含至少1个Cys，D- Cys，高cys或青霉胺残基。在新的GIP类似物的一个这样的实施方 案中，X15-X18或X31-X40中的至少1个是Cys，D-Cys，高cys或 青霉胺。在另一个这样的实施方案中，X15-X18或X31-X40中不超过 2个是Cys，D-Cys，高cys或青霉胺。在另一个实施方案中，X15-X18 或X31-X40中不超过1个是Cys，D-Cys，高cys或青霉胺。在另一 个这样的实施方案中，X15-X18或X31-X40中的至少1个是Cys，D- Cys，高cys或青霉胺，且所述残基中的至少1个被脂质修饰。
在一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体包含PEG化的氨 基酸。至少一个PEG分子可以结合到多肽上。在一个这样的实施方案 中，每个peg分子结合到该化合物的D-Cys，高cys或青霉胺或Lys氨 基酸上，或结合到羧基末端氨基酸上。在另一个这样的实施方案中， 至少一个PEG分子结合在氨基酸的区域L和/或C。在另一个实施方 案中，PEG化的新的GIP类似物具有至少1小时的消除半衰期。其它 新的GIP类似物或杂合体可以包含1、2，或3个peg分子。在另一 个实施方案中，X15-X18或X31-X40中的至少1个是Cys，D-Cys， 高cys或青霉胺，且至少一个所述残基结合到peg分子上。此外， X15-X18或X31-X40中的至少1个、2个或3个是Cys，D-Cys，高cys 或青霉胺，且至少1个、2个或3个所述残基结合到peg分子上。
通过结合或偶联反应基团，可以修饰本发明的GIP化合物。因此， GIP化合物能通过该反应基团共价结合血液组分。反应基团通常与血 液组分上的氨基、羟基或巯基共价结合，从而将GIP肽共价连接到血 液组分上。优选地，反应基团与血液组分上的巯基反应。更优选地， 反应基团与血清白蛋白上的巯基反应。反应基团可以含有任意数量的 能形成共价键的化学反应物质。优选地，反应基团能与血液组分上的 巯基反应，形成二硫键。
能与巯基形成二硫键的反应基团包括具有激活的二硫键或S-磺酸 酯的那些。通过给GIP肽半胱氨酸(或半胱氨酸类似物)偶联激活基 团，可以衍生出具有激活的二硫键的反应基团，所述激活基团例如2，2′- 二硫二吡啶(DTDP)，2，2′-二硫双(5-硝基吡啶)(NPYS)，5，5′-二硫双(2- 硝基苯甲酸)(埃尔曼试剂)，或6，6′-二硫二烟酸。具有激活的二硫键的 反应基团在本文中称作激活的二硫键基团。另外，通过用巯基-激活的 羧酸酰化GIP肽的赖氨酸侧链，可以衍生出激活的二硫键基团。本发 明的另一个示例性的实施方案是，使用能与血液组分上的巯基反应、 形成硫醚键的反应基团。优选地，通过给GIP肽偶联来自含有马来酰 亚胺的基团的化学反应实体，例如γ-马来酰亚胺-丁酰基酰胺(GMBA)， 马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)，γ-马来酰亚胺基-丁酰基氧 琥珀酰亚胺酯(GMBS)，和马来酰亚胺基丙酸(MPA)，可以衍生出这样 的反应基团。这些及其它含有马来酰亚胺的基团在本文中称作马来酰 亚胺基团。在本发明的一个替代实施方案中，GIP化合物的反应基团 能共价结合血液组分上的伯胺，形成酰胺键。优选地，通过给GIP肽 偶联N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)， 形成NHS或磺基-NHS酯，可以衍生出这样的反应基团。这些琥珀酰 亚胺基可以有效地与血液组分蛋白N-末端上的α-胺基反应，条件是， 反应基团可接近或可利用这样的胺基。优选地，这些琥珀酰亚胺基会 与血液组分蛋白中的赖氨酸的ε-胺基反应，因为赖氨酸的ε-胺是与NHS 酯特异性地反应的唯一氨基酸侧链。在另一个实施方案中，本发明的 GIP化合物含有用于共价结合血液组分上的巯基的反应基团。结合巯 基示例性地优于结合氨基，因为巯基在体内不如氨基丰富。由此，与 结合氨基相比，通过结合巯基，靶定更少的血液组分，导致更大的结 合特异性。因此，示例性的GIP化合物含有用马来酰亚胺基团、或更 优选S-磺酸酯或激活的二硫键基团修饰的GIP肽。尽管本发明的GIP 化合物可以结合含有游离巯基的几种血液组分中的任一种，GIP化合 物优选地共价结合血清白蛋白上的巯基。血清白蛋白是最丰富的血液 蛋白，含有一个位于蛋白氨基酸残基34(Cys34)处的巯基，它在物种 间是高度保守的。GIP化合物与血清白蛋白的结合，不仅提供结合的 特异性，而且提供可再现的缀合形成，所述缀合物具有1∶1结合的GIP 化合物和血清白蛋白。使用GIP化合物作为治疗剂，需要该1∶1比率 的再现性，因为可再现的GIP化合物和血清白蛋白的缀合物，会导致 GIP化合物的施用。此外，离体或体外方案需要GIP化合物和血清白 蛋白的1∶1缀合物的可再现性，以形成用于治疗的缀合物。可以如下 离体地形成缀合物；使本发明的GIP化合物与血液混合，形成缀合物， 然后将含有缀合物的血液施用给宿主。或者，也可以体外地形成GIP 化合物-血清白蛋白缀合物：使GIP化合物与重组血清白蛋白混合， 形成可以施用的缀合物。GIP化合物和血清白蛋白的1∶1缀合物的可 再现性，提供了来自离体施用或体外分批制备的可再现缀合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了共价结合到一个或多个聚乙 二醇(peg)分子或其衍生物上的GIP化合物，其中每个peg结合在该肽 的Cys或Lys氨基酸或羧基末端，产生PEG化的GIP化合物，后者 具有至少1小时，至少4，6，10，15，20或24小时的半衰期。在一 个实施方案中，PEG化的GIP化合物包含本文教导的任一种新的GIP 化合物序列，其具有在1、2或3个残基处共价结合的peg分子。
在另一个预见到的实施方案中，上面或本文所述的实施方案以任 意一致的组合相组合。例如描述区域D的实施方案可以与描述区域L 的实施方案相组合，以描述具有区域D和区域L的组合变化的新的GIP 类似物实施方案。类似物还可以与第二激素模块相组合，形成GIP杂 合体。
在另一个实施方案中，本发明的新的GIP类似物或杂合多肽的长 度是至少25个氨基酸。在其它实施方案中，所述多肽的长度可以是 至少21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，和最 高达54的每个整数的氨基酸(例如GIP(1-42)+长毒蜥外泌肽尾(27- 39))。此外，在一个实施方案中，本发明的多肽仅仅包括天然L氨基 酸残基和/或修饰的天然L氨基酸残基。或者，在另一个实施方案中， 本发明的多肽不包括非天然氨基酸残基。
在另一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合体在每个对应序列 的整个长度，表现出与天然GIP(1-42)，GIP(1-30)，GIP(1-26)，GIP(1- 39)，GIP(19-30)，GIP(19-26)，GIP(19-39)，GIP(19-42)，GIP(1-11)， 或GIP(1-14)的至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或98％ 序列同一性。本发明的这样的多肽也可以表现出与修饰的或取代的GIP (例如参见WO 00/58360，EP1171465或公开的美国专利申请 20030232761)的至少50％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％ 或98％序列同一性。在另一个实施方案中，新的GIP类似物可以在每 个对应序列的整个长度，表现出与天然GIP(1-42)，GIP(1-30)，GIP(1- 26)，GIP(1-39)，GIP(19-30)，GIP(19-26)，GIP(19-39)，GIP(19-42)， GIP(1-11)，或GIP(1-14)的至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、 95％或98％序列同一性。天然GIP序列包括源自下述的那些：
人GIP(1-42)(YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKND WKHNITQ)，
人GIP(1-26)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL)，
人GIP(1-30)(YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK)，
人GIP(1-39)(YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKND WKHN)，
小鼠GIP(1-42)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKS DWKHNITQ)，
小鼠GIP(1-26)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL)，
小鼠GIP(1-30)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQR)，
小鼠GIP(1-39)(YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKS DWKHN)，
大鼠GIP(1-42)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKND WKHNLTQ，
大鼠GIP(1-26)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL，
大鼠GIP(1-30)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK，
大鼠GIP(1-39)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKND WKHN，
猪GIP(1-42)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSD WKHNITQ，
猪GIP(1-26)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL，
猪GIP(1-30)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK，
猪GIP(1-39)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSD WKHN，
牛GIP(1-42)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDW IHNITQ，
牛GIP(1-26)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWL，
牛GIP(1-30)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQK，或
牛GIP(1-39)YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDW IHN。
在另一个实施方案中，本发明的新的GIP类似物或杂合体的S区 域可以表现出与天然Trp-笼序列例如PSSGAPPPS的至少50％、60％、 65％、70％、80％、85％、90％、95％或98％的序列同一性。
在另一个实施方案中，本发明的新的GIP类似物或杂合多肽包含， 与本文公开的新的GIP类似物序列具有至少60％、65％、70％、80％、 85％、90％、95％或98％的序列同一性的序列。这样的新的GIP类似 物或杂合体序列也可以用于序列对比，包括：
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQPPSG APPPS(人GIP(1-42)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS(人GIP(1-30) 核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKSDWKHNITQPSSG APPPS(小鼠GIP(1-42)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRPSSGAPPPS(小鼠GIP(1- 30)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNLTQPSSG APPPS(大鼠GIP(1-42)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS(大鼠GIP(1- 30)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWKHNITQPSSG APPPS(猪GIP(1-42)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS(猪GIP(1-30) 核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWIHNITQPPSGA PPPS(牛GIP(1-42)核心)，或
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKPPSGAPPPS(牛GIP(1-30) 核心)。
其它新的GIP类似物或杂合体序列也可以用于上述的序列对比， 包括：
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLKNGGPSSGAPPPS(人GIP(1-26) 核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLKNGGPSSGAPPPS(小鼠GIP (1-26)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLKNGGPSSGAPPPS(大鼠GIP(1- 26)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLKNGGPS SGAPPPS(猪GIP(1- 26)核心)，或
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLKNGGPPSGAPPPS(牛GIP(1-26) 核心)。
其它新的GIP类似物或杂合体序列也可以用于上述的序列对比， 包括：
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNPPSGAPP PS(人GIP(1-39)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQRGKKSDWKHNPSSGAPP PS(小鼠GIP(1-39)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNPSSGAPP PS(大鼠GIP(1-39)核心)，
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWKHNPSSGAPP PS(猪GIP(1-39)核心)，或
YAEGTFISDYSIAMDKIRQQDFVNWLLAQKGKKSDWIHNPPSGAPPP S(牛GIP(1-39)核心)。
其它应用考虑事项和意图
在本文所述的每个组合中，应当理解，组分肽激素或模块包括类 似物、衍生物、片段以及与其相关的肽增强子。
提及的新的GIP类似物优选地C-末端酰胺化，但是不需要为了本 发明的目的而为之。换而言之，这些肽的C-末端可以具有游离的-OH 或-NH2基团。这些肽也可以具有其它翻译后修饰。本领域技术人员 会明白，本发明的新的GIP类似物多肽也可以用N-末端甲硫氨酸残基 构建。
在其它实施方案中，预见到每个序列的变体，其中GIP部分被1、 2或3个本文所述的修饰所修饰。示例性的修饰是在GIP的第一个(包 括末端NH2)、第二个或第三个N-末端氨基酸处的修饰，其赋予优于 天然GIP的DPP-IV抗性。特别感兴趣的是，至少具有在位置2的D- Ala置换的本文所述的GIP化合物。
更具体地，在一个方面，本发明涉及包含一个或多个氨基酸序列 修饰的新的GIP类似物多肽。这样的修饰包括单独的或组合的置换、 插入和/或缺失。在一个方面，GIP类似物或杂合多肽包括“非必需”氨 基酸残基的一个或多个修饰。在本发明上下文中，“非必需”氨基酸残 基是在天然人氨基酸序列中可改变(即缺失或置换)而不消除或基本不 降低GIP类似物或杂合体的GIP或组分肽激素受体激动剂活性的残 基。
置换。在一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合多肽可以 在天然GIP，GIP(1-30)，GIP(1-14)，GIP(1-26)，GIP(1-39)，GIP(19-26)， GIP(19-30)，GIP(19-39)或GIP(19-42)或区域S的氨基酸序列中，具有 一个或多个单独的或与一个或多个插入或缺失相组合的置换。优选 地，所述置换不消除或基本不降低GIP类似物多肽的GIP激动剂活性。 在一个方面，本发明涉及GIP类似物多肽，其具有天然人GIP的氨基 酸序列中的单个置换、或超过一个氨基酸残基的保守或非保守置换。 优选地，本发明的GIP类似物多肽包括1、2或3个氨基酸置换。在 一个实施方案中，天然GIP是人，大鼠、小鼠、猪或牛。
特别有用的置换包括保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其 中氨基酸残基被具有相似侧链或物理化学特征(例如静电、氢键键合、 等排、疏水特征)的氨基酸残基取代的置换。具有相似侧链的氨基酸残 基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖 氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷 氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨 酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、具有非极性 侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸、组氨酸)。在其它实施方案中，示例性的保守置换显示在下表的“示 例性置换”栏中。在其它实施方案中，保守置换选自“优选置换”栏中列 出的氨基酸。
  原始   残基   示例性置换   优选置换   Ala(A)  val；leu；ile   val   Arg(R)  Iys；gln；asn   lys   Asn(N)  gln；his；asp；lys；arg   gln   Asp(D)  glu；asn   glu   Cys(C)  ser；ala   ser   Gln(Q)  asn；glu   asn   Glu(E)  asp；gln   asp   Gly(G)  ala   ala   His(H)  asn；gln；lys；arg   arg   IIe(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu   Leu(l)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile   Lys(K)  arg；gln；asn   arg   Met(M)  leu；phe；ile   leu   Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   tyr   Pro(P)  ala   ala   Ser(S)  thr   thr   Thr(T)  ser   ser   Trp(W)  tyr；phe   tyr   Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   phe   Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
任选地，新的GIP类似物或杂合体与相比较的序列相比具有不超 过1个保守氨基酸置换，或者与相比较的序列相比具有不超过2，3， 4，5，6，7，8，9，或10个保守氨基酸置换。
在另一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合多肽可以包括， 将一个或多个非天然和/或非氨基酸(例如，氨基酸模拟物)置换进GIP 序列。在一个示例性的实施方案中，插入GIP序列中的非氨基酸可以 是β-转角模拟物或接头分子，例如-NH-X-CO-，其中X＝(CH2)n(其中 n可以是2-20)或-NH-CH2CH2(-O-CH2CH2-O-)m-CH2-CO-(其中m＝1- 5)。示例性的接头分子包括氨基己酰基(“Aca”)，β-丙氨酰基，和8-氨 基-3，6-二氧杂辛酰基。β-转角模拟物可商业上得到(BioQuadrant Inc， Quebec，Canada)，且已经记载在文献中(Hanessian等，Tetrahedron 12789-854(1997)；Gu等，Tetrahedron Letters 44：5863-6(2003)；Bourguet 等，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 13：1561-4(2003)；Grieco 等，Tetrahedron Letters 43：6297-9(2002)；Souers等，Tetrahedron 57： 7431-48(2001)；Tsai等，Bioorganic&Medicinal Chemistry 7：29- 38(1999)；Virgilio等，Tetrahedron 53：6635-44(1997))。示例性的β- 转角模拟物包括本文所述的模拟物A和模拟物B。它们的IUPAC名 称是模拟物A：N-(3S，6S，9S)-2-氧代-3-氨基-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9- 甲酸。模拟物B：N-(3S，6S，9R)-2-氧代-3-氨基-7-硫代-1-氮杂二环[4.3.0]- 壬烷-9-甲酸。
包含氨基酸序列β-转角模拟置换的示例性的GIP类似物或杂合 多肽包括天然的人GIP，其中在位置x和x+1的氨基酸被选自模拟物 A和模拟物B的β-转角模拟物置换，其中x选自天然的人GIP的氨基 酸位置8-14处的氨基酸(除了模拟物A和B之外，Ala-Aib和Ala-Pro二 肽是良好的转角诱导物)。这些接头特别适用于包含本发明的D-L-C-S 新的GIP类似物的区域“L”。
缺失和截短。在另一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合 多肽可以具有从天然GIP或区域S的氨基酸序列缺失的一个或多个氨 基酸残基，这是单独的或与一个或多个插入或置换相组合。在一个方 面，本发明的GIP类似物或杂合多肽可以具有从天然GIP的N-末端 或C-末端缺失的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发 明的GIP类似物或杂合多肽可以具有从天然GIP的氨基酸位置1-42、 GIP(1-14)、GIP(1-26)、GIP(1-30)、GIP(1-39)、GIP(19-26)、GIP(19-30)、 GIP(19-39)或GIP(19-42)或区域S缺失的一个或多个氨基酸残基。这 样的缺失可以包括超过1个保守或非保守缺失。在一个示例性的实施 方案中，当区域是例如毒蜥外泌肽(31-39)或毒蜥外泌肽(27-39)时，从 天然GIP、从GIP(1-30)、GIP(1-14)、GIP(1-26)、GIP(1-39)、GIP(19-30)、 GIP(19-26)、GIP(19-39)或GIP(19-42)或从区域S，缺失不超过1、不 超过2、不超过3、不超过4或不超过5个氨基酸。在一个实施方案 中，天然GIP是人、大鼠、小鼠、猪或牛。
插入。在另一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合多肽可 以具有插入来自GIP(1-30)、GIP(1-14)，GIP(1-26)、GIP(1-39)、 GIP(19-30)、GIP(19-26)、GIP(19-39)或GIP(19-42)或区域S的天然GIP 氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，这是单独的或与一个或多个 缺失和/或置换相组合。在一个方面，本发明涉及GIP类似物或杂合多 肽，其具有向天然GIP、GIP(1-30)、GIP(1-14)、GIP(1-26)、 GIP(1-39)、GIP(19-30)、GIP(19-26)、GIP(19-39)或GIP(19-42)或 区域S的氨基酸序列中的超过1个氨基酸残基的单个插入、或保守或 非保守插入，例如毒蜥外泌肽(27-39)和毒蜥外泌肽(31-39)。在一个实 施方案中，天然GIP是人、大鼠、小鼠、猪或牛。
在另一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合多肽可以包括 向GIP、GIP(1-30)、GIP(1-14)、GIP(1-26)、GIP(1-39)、GIP(19- 30)、GIP(19-26)、GIP(19-39)或GIP(19-42)或区域S的序列中插入1 个多个非天然氨基酸和/或非氨基酸，例如毒蜥外泌肽(27-39)和毒蜥外 泌肽(31-39)。在一个示例性的实施方案中，插入GIP、GIP(1-30)、 GIP(1-14)、GIP(1-26)、GIP(1-39)、GIP(19-30)、GIP(19-26)、 GIP(19-39)或GIP(19-42)或区域S的序列中的非天然氨基酸，例如毒 蜥外泌肽(27-39)和毒蜥外泌肽(31-39)，可以是β-转角模拟物或接头分 子。在其它这样的实施方案中，天然GIP可以是人、大鼠、小鼠、猪 或牛GIP。在有些实施方案中，区域S至少保持在X37的脯氨酸(或 脯氨酸类似物)，以便与Trp(或Trp类似物)相互作用，促进Trp笼形 成。在其它示例性的实施方案中，在位置X31保留Pro，以便还与在 X25的Trp相互作用。在N-末端截短的毒蜥外泌肽-4类似物(Trp-笼) 的情况下，已经确认在用Trp25/Pro31疏水钩环加帽，或完整形成Trp- 笼之前，螺旋并未显著装配。完整Trp-笼形成用作非常有效的螺旋C- 帽。也有半-笼结构(在X36，X37，X38单元的Pro未脱离)、尤其是 熔化的Trp-笼种类的贡献的证据。
因此，尽管显示的化合物具有任选的连接基团，在本文序列的一 个实施方案中，接头是Gly接头，例如Gly-Gly-Gly，或βAla接头， 例如βAla-βAla；它们都被特别地预见到。特别感兴趣的接头分子包 括氨基己酰基(“Aca”)，β-丙氨酰基，和8-氨基-3，6-二氧杂辛酰基。此 外，在其它实施方案中，使用β-转角模拟物，包括模拟物A：N- (3S，6S，9S)-2-氧代-3-氨基-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9-甲酸，模拟物B： N-(3S，6S，9R)-2-氧代-3-氨基-7-硫代-1-氮杂二环[4.3.0]-壬烷-9-甲酸， 以及Ala-Aib和Ala-Pro二肽。
在另一个实施方案中，本发明的GIP类似物或杂合多肽可以包括 在多肽的任一个末端插入聚氨基酸序列(例如，聚-his，聚-arg，聚-lys， 聚-ala，等)，称作“延伸”或“尾”。
在有些实施方案中，包含氨基酸序列插入的新的GIP类似物或杂 合多肽包括在沿着天然GIP、GIP(1-30)、GIP(1-14)、GIP(1-26)、 GIP(1-39)、GIP(19-30)、GIP(19-26)、GIP(19-39)或GIP(19-42)，或区 域S的长度的每个氨基酸位置的丙氨酸置换，例如毒蜥外泌肽(27-39) 和毒蜥外泌肽(31-39)。
衍生物。本发明还涉及GIP类似物和杂合多肽的衍生物。这样的 衍生物包括缀合至一种或多种水溶性聚合物分子(例如聚乙二醇 (“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰、棕榈酰、辛酰等))或 加入聚氨基酸(例如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸和聚丙氨酸)的GIP 类似物和杂合多肽。对多肽的修饰还可包括小分子取代基，例如短烷 基和受限的烷基(例如支链的、环状的、稠合的、金刚烷基)和芳基。 水溶性聚合物分子优选具有约500至约20,000Da的分子量。
这样的聚合物缀合和小分子取代基修饰可单独地发生在GIP类似 物和杂合多肽序列中的N端或C端或氨基酸残基的侧链上。或者，沿 着GIP类似物和杂合多肽可有多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、 谷氨酸或半胱氨酸置换一个或多个氨基酸，可提供另外的衍生化位 点。参见例如美国专利号5,824,784和5,824,778。优选地，GIP类似 物和杂合多肽可缀合至1、2或3种聚合物分子。
水溶性聚合物分子优选地连接至氨基、羧基或巯基，可连接在N 端或C端，或在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上。或 者，水溶性聚合物分子可与二胺和二羧基连接。在一个示例性的实施 方案中，本发明的GIP类似物和杂合多肽通过赖氨酸氨基酸上的ε氨 基缀合1、2或3个PEG分子。
本发明的GIP类似物和杂合多肽衍生物还包括一个或多个氨基酸 残基具有化学改变的GIP类似物和杂合多肽。这样的化学改变包括酰 胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可 单独地发生在GIP类似物和杂合多肽序列的N端或C端或氨基酸残 基的侧链上。在一个实施方案中，这些肽的C-端可具有游离-OH或-NH2 基团。在另一个实施方案中，N-末端可用异丁氧基羰基、异丙氧基羰 基、正丁氧基羰基、乙氧基羰基、异已酰基(isocap)、辛酰基、辛基甘 氨酸基(G(Oct))或8-氨基辛酸基或Fmoc加帽。在一个示例性实施方案 中，可通过形成二硫键酰化。或者，沿着GIP类似物和杂合多肽可有 多个化学改变位点。
已经描述了许多通常不会影响肽结构和生物活性的拟肽键。该方 案的一个实例是，置换逆-反拟肽键(″Biologically active retroinverso ahalogues of thymopentin″，Sisto A.等in Rivier，J.E.和Marshall，G. R.(eds)″Peptides，Chemistry，Structure and Biology″，Escom， Leiden(1990)，pp.722-773)和Dalpozzo，等(1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41：561-566，在本文中引作参考)。根据该修饰，肽的氨基酸 序列可以与本文所述的GIP序列相同，例外之处是，一个或多个肽键 被替换为逆-反拟肽键。优选地，大部分N-末端肽键被置换，因为这 样的置换会赋予对作用于N-末端的外肽酶的蛋白水解的抗性。通过用 具有类似结构的其它化学基团替换氨基酸的化学基团，也可以产生其 它修饰。已知会增强对酶切割的稳定性、且没有或具有微小的生物活 性丧失的另一种合适的拟肽键是还原的电子等排拟肽键(Couder，等 (1993)，Int.J.Peptide Protein Res.，41：181-184，在本文中整体引作 参考)。
因而，这些肽的氨基酸序列可以与新的GIP类似物和杂合肽的序 列相同，例外之处是，一个或多个肽键被替换为电子等排拟肽键。优 选地，大部分N-末端肽键被置换，因为这样的置换会赋予对作用于N- 末端的外肽酶的蛋白水解的抗性。具有一个或多个还原的电子等排拟 肽键的肽的合成，是本领域已知的(Couder，等(1993)，同上)。其它实 例包括导入酮基亚甲基或甲基硫键，以替代肽键。
在另一个实施方案中，将作为DPP-IV切割靶位的第二个和第三 个残基之间的键替换为本文公开的肽酶-抗性的键。
GIP类似物和杂合肽的类肽衍生物代表者另一类肽模拟物，它们 会保留生物活性的重要结构决定簇，并消除肽键，从而赋予对蛋白水 解的抗性(Simon，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：9367-9371(1992)， 在本文中整体引作参考)。类肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已经描 述了许多N-烷基基团，每个对应着天然氨基酸的侧链(Simon，等 (1992)，同上)。GIP肽的有些或全部氨基酸可以被替换为与替换的氨 基酸相对应的N-取代的甘氨酸。
在一个实施方案中，新的GIP类似物或杂合多肽包括上述修饰 (即，缺失，插入和置换)的组合。
在本发明的范围内也包括通式的GIP类似物或杂合多肽，其中指 定的氨基酸残基被化学修饰或衍生化(例如，通过脂肪酸衍生化，PEG 化，酰胺化，glycolization，等)。示例性的实施方案包括赖氨酸残基 的衍生化，尤其在位置16或30。在本发明的范围内也包括指定的氨 基酸的D-氨基酸残基。在另一个实施方案中，示例性的GIP类似物或 杂合多肽包括通式的多肽，其具有缺失，尤其在与本文所述活性部位 相对应的区域。
包含非天然氨基酸置换的示例性的GIP类似物或杂合多肽。本发 明的GIP类似物或杂合多肽的示例性的衍生物包括聚合物-缀合的GIP 类似物或杂合多肽，其中GIP类似物或杂合多肽包括任一种上述的插 入、缺失、置换或其组合，且所述聚合物分子缀合在赖氨酸残基上。
另外特别预见到本文每种GIP序列的D-Ala2变体(例如，参见 表)。在其它实施方案中，预见到每种上述序列的变体，其中GIP部 分被1、2或3种本文所述的修饰所修饰。示例性的修饰是在GIP的 第一个、第二个或第三个N-末端氨基酸处的修饰，其赋予优于天然GIP 的DPP-IV抗性。在另一个实施方案中，新的GIP化合物包含C-末端 酰胺。
在另一个实施方案中，新的GIP类似物或GIP杂合体具有至少是 人GIP(1-30)酰胺的2倍的半衰期。此外，半衰期可以是至少6小时。
在另一个实施方案中，是新的GIP类似物或杂合体的药学上可接 受的盐。新的GIP类似物和杂合体可以配制在包含药学上可接受的载 体的组合物中。
在一个实施方案中，使用用亮氨酸替代位置14的Met的exenatide 类似物，作为杂合体组分或用于GIP杂合体的辅助疗法中： HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2。
优选地，在葡萄糖降低方面，本发明的GIP类似物或杂合多肽会 保留天然的人GIP的至少约25％、优选约30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、95％、98％，或99％生物活性。在另一个实施方案中，本 发明的GIP类似物或杂合多肽表现出提高的GIP激动剂活性。优选地， 本发明的GIP类似物或杂合多肽表现出天然人GIP的至少约110％、 125％、130％、140％、150％、200％、或更高的生物活性。相反地， 新的GIP类似物或杂合体可以是拮抗剂。
示例性的GIP类似物或杂合多肽是在相同测定中具有等于或大于 GIP(1-42)或GIP(1-30)的效力的那些。或者，示例性的本发明的GIP 类似物或杂合多肽可以表现出比GIP(1-42)或GIP(1-30)提高的生产容 易性、稳定性和/或配制容易性。
也预见到，本发明的新的GIP类似物、以及GIP类似物，可以与 试剂一起施用，所述试剂例如小分子或抗体，根据情况，可以是本文 提及的肽激素和生长因子的作为激动剂或拮抗剂。
在具有本文所述的毒蜥外泌肽-4的天然存在的C-末端氨基酸序 列、尤其PSSGAPPPS序列的GIP杂合体的其它实施方案和用途中， 特别地排除的是如WO2004/103390所述在“P’1”位置具有修饰的那 些。
在序列表、表格和实施例部分中，提供了本发明的类似物和杂合 多肽的其它实例。
杂合多肽在治疗或预防疾病状况或障碍中的其它用途
代谢疾病和病症有多种形式，包括肥胖，糖尿病，血脂异常，胰 岛素抗性，细胞凋亡，等。在美国和世界范围内，肥胖和它的相关病 症是常见的且非常严重的公共卫生问题。上身肥胖是2型糖尿病的已 知的最危险的因素，且是心血管疾病的高危因素。肥胖是高血压、动 脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼 吸暂停、生殖病症(例如多囊卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌、结肠 癌)和全身麻醉并发症的高发病率的公认危险因素(参见，例如， Kopelman，Nature 404：635-43(2000))。它会减少寿命，并造成上述 并发病以及感染、静脉曲张、黑棘皮病、湿疹、运动不耐性、胰岛素 抗性、高血压血胆固醇过多、胆石症、矫形损伤和血栓栓塞性疾病等 病症的严重危险(Rissanen等，Br.Med.J.301：835-7(1990))。肥胖也 是称作胰岛素抗性综合征或“X综合征”的状况的危险因素。最近估计， 世界范围内肥胖和相关病症的医疗费用是15千万美元。认为肥胖的 发病机理是多原因的，但是基本问题是，在肥胖受试者中，营养物利 用度和能量消耗不能达到平衡，直到存在过多的脂肪组织。肥胖目前 是较难治疗的、慢性的、特别顽固的代谢病症。对于肥胖人的体重减 轻有用的治疗剂对它们的健康具有深远的有益作用。
糖尿病是一种碳水化合物代谢病症，其特征在于由胰岛素的不足 生产或利用引起的高血糖症和糖尿。在发达国家中，糖尿病严重影响 大量人群的生命质量。胰岛素的不足生产表征为1型糖尿病，胰岛素 的不足利用是2型糖尿病。但是，现在广泛地公认，存在许多不同的 糖尿病相关疾病，它们在诊断出患者患有明显的糖尿病之前很久就已 经发作。另外，糖尿病中的葡萄糖代谢的次优控制产生的作用，会引 起广谱的相关脂质和心血管病症。
血脂异常或血浆中脂蛋白的异常水平，经常发生在糖尿病中。血 脂异常的典型特征是血液中升高的血浆甘油三酯、低HDL(高密度脂 蛋白)胆固醇、正常至升高水平的LDL(低密度脂蛋白)胆固醇和升高水 平的小密度LDL(低密度脂蛋白)颗粒。血脂异常是糖尿病受试者冠心 病和死亡的高发病率的主要原因之一。通过证实糖尿病受试者冠心病 死亡比非糖尿病受试者高数倍，流行病学研究已经证实了该观点。已 经描述了糖尿病受试者的几种脂蛋白异常。
胰岛素抗性是减弱的胰岛素在广浓度范围发挥它的生理作用的能 力。在胰岛素抗性中，身体会分泌异常大量的胰岛素，以补偿该缺陷 和受损的葡萄糖耐受性形成的状态。由于不能补偿有缺陷的胰岛素作 用，血糖浓度不可避免地升高，导致糖尿病的临床状态。公认胰岛素 抗性和相关的高胰岛素血症在肥胖、高血压、动脉粥样硬化和2型糖 尿病中起贡献作用。胰岛素抗性与肥胖、高血压和咽峡炎的关联，已 经描述为一种综合征，即X综合征，其具有胰岛素抗性作为共同的致 病关联。
细胞凋亡是细胞自我破坏的主动过程，其受到正常发育过程中发 生的外部和内部信号的调节。有资料证明，细胞凋亡在胰腺内分泌β细 胞的调节中起关键作用。越来越多的证据表明，在成年哺乳动物中， β-细胞团会发生动态改变，以适应胰岛素生产，维持特定状况例如妊 娠和肥胖中的血糖正常。β细胞团的控制，依赖于细胞增殖、生长和 程序性细胞死亡(细胞凋亡)之间的微妙平衡。该平衡的失调，可能导 致葡萄糖体内稳态的损害。例如，值得注意的是，当β细胞复制速率 减少时，葡萄糖不耐性随着老化而发展，人尸体解剖研究重复地证实， 非胰岛素依赖型糖尿病患者中β细胞团比非糖尿病受试者减少了40- 60％。通常认为，胰岛素抗性永远伴随着肥胖，但是通过补偿的高胰 岛素血症维持血糖量正常，直到β细胞变得能满足升高的对胰岛素的 要求，在此刻发生2型糖尿病。
治疗与糖尿病有关的多种异常状况的尝试，已经提出了施用几种 抗糖尿病药物，以便解决不同患者中的这些异常状况。但是，如本文 讨论的GIP类似物、GIP杂合体和GIPR激动剂当以治疗有效量施用 时，可以用于单一疗法或辅助疗法中，用于治疗或预防这些和在本文 中讨论的其它疾病和状况。
抑胃多肽(GIP)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)是肠肽激素，它们通 过葡萄糖-依赖性地刺激胰岛素分泌，发挥有效的葡萄糖调节作用。研 究已经证实，GIP和GLP-1协同地起作用，以便发挥它们的肠降血糖 素效应[1-3]。结果，这些肠降血糖素激素具有作为潜在的抗糖尿病 剂的吸引人的巨大利益，并具有降低的低血糖风险。鉴于已经证实 GLP-1、GLP-1类似物和模拟物(例如exenatide)可以有效地控制2 型糖尿病患者的葡萄糖水平，与正常个体相比，糖尿病受试者中GIP 的促胰岛素作用显著减少[4-6]。GLP-1(而不是GIP)的促胰岛素作 用在相同糖尿病受试者中的保持，表明2型糖尿病中的GIP信号转导 受损。已经提出，胰腺β细胞中的减少的GIP受体表达有助于糖尿病 受试者的总体降低的肠降血糖素效应[7]。该假说得到了啮齿动物研究 的支持，该研究显示了在糖尿病肥胖的Zucker大鼠的β-细胞上减少 的GIP受体表达和在2型糖尿病患者的一级亲属中观察到减少的GIP 肠降血糖素效应[8-9]。但是，最近的研究已经证实了静脉内推注施用 GIP引起的2型糖尿病中血浆胰岛素水平的显著增加，这与连续GIP 输注引起的胰岛素分泌的微弱增加明显相反[10]。对2型糖尿病患者 和健康对照受试者的GIP推注的类似相对β-细胞敏感性，表明不太可 能出现特异性的GIP受体缺陷[10]。然而，急性GIP施用之后和连续 GIP施用过程中胰岛素分泌的差异，指示着2型糖尿病患者中GIP对 葡萄糖的晚期胰岛素应答的受损的放大，然而在早期的应答几乎得以 保持[11-12]。不受理论的约束，认为尽管在持续的高血糖症过程中减 弱了GIP的肠降血糖素效应，一旦提高了这些个体中的葡萄糖控制， GIP或它的类似物有可能以与它们在正常受试者中的作用类似的效力 在糖尿病患者中起作用。
Amylin Pharmaceuticals，Inc.已经进行了3个关键的临床研究， 以评价exenatide在2型糖尿病患者中的作用，使用单独的二甲双胍、 单独的磺脲、或使用二甲双胍和磺脲的组合，没有达到目标血糖浓度。 通过HbAlc测得，所有3个研究都满足基本葡萄糖控制终点。在完成 了最高剂量的exenatide(10μg，每天2次)的研究的患者中，3期方案 的HbAlc的平均减少是约1％。另外，约40％的这些患者达到了7％ 或更低的HbAlc测量。临床数据表明，无论exenatide的功效如何， 有些糖尿病个体不能达到正常的葡萄糖浓度。
在本发明的一个实施方案中，治疗的糖尿病患者的高血糖症的减 少(例如，通过exenatide)，设定了GIP干预的阶段。鉴于2型糖尿病 患者的慢性高血糖状况会减弱GIP的促胰岛素应答，源自exenatide 治疗的提高的血糖控制，会恢复胰腺β-细胞对GIP刺激的应答性。 因此，药理剂量的GIP或新的GIP类似物或杂合体与exenatide(或其 它降糖剂或减少或抑制胃排空的试剂或方法)的辅助疗法，例如共同施 用GIP杂合体，会在糖尿病患者或经受与升高的葡萄糖有关的状况的 患者中达到希望的血糖量正常。GIP缺少GLP-1的胃排空作用[13-14]， 这是GLP-1治疗过程中发生恶心的可能原因，且会限制肽的治疗窗 [15]。因而，应当允许使用更高的GIP给药方案。
由于目前已知的抗糖尿病剂(二甲双胍，磺脲，TZD，等)能达到 不同程度的血糖控制，GIP或新的GIP类似物或杂合体与任一种这样 的治疗的组合，也会引起提高的应答，导致葡萄糖水平的正常化。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法是基于下述观点，即通 过用其它抗糖尿病剂(例如GLP-1，GLP-1类似物或毒蜥外泌肽-4或 其它试剂，例如二甲双胍，磺脲，噻唑烷二酮(TZD)，普兰林肽，胰 岛素，阿卡波糖，二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂)事先降低葡萄糖，可 以预处理GIP治疗的患者。DPP-IV抑制剂是众所周知的，且记载在 例如公开的申请US20050004117，美国专利6710040，和美国专利 6645995中，它们在本文中引用它们的化合物作为参考。作为磺脲(SFU) 的实例，格列美脲作用于胰腺组织，以产生胰岛素。
代谢上稳定的GIP类似物或杂合体或新的GIP类似物或杂合体与 exenatide(或其它抗糖尿病剂)的辅助疗法，会在具有升高的葡萄糖有 关的状况的患者、例如2型糖尿病患者中，提供比单独任一种增强的 促胰岛素应答。这样的治疗方案会导致葡萄糖浓度的正常化、β-细胞 功能的提高，和通过它们对β细胞的营养活性减缓疾病进程，以排除 或减少对胰岛素治疗的需要。
本发明的GIP杂合体可以用于减少食物摄取，减少食欲，减少热 量摄取，诱导饱感，减少营养物利用度，造成体重减轻，影响机体组 成，改变体能含量或能量消耗，改进脂质谱(包括减少LDL胆固醇和 甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)，减慢胃肠蠕动，延迟胃排 空，减轻餐后血糖偏移，预防或抑制胰高血糖素分泌，和减少血压。 在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰 淀素和/或sCT部分。
因而，在某些实施方案中，本发明的杂合体可以用于治疗或预防 通过减少营养物利用度可以缓解的状况或病症，所述方法包含，给所 述受试者施用治疗或预防有效量的本发明的化合物。这样的状况和病 症包括但不限于，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥胖，异常的餐后高血糖 症，任何种类的糖尿病，包括I型、II型和妊娠糖尿病，代谢综合征， 倾倒综合征，高血压，血脂异常，心血管疾病，高脂血症，睡眠呼吸 暂停，癌症，肺高压，胆囊炎，和骨关节炎。在一个实施方案中，这 样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。
心血管状况或疾病的非限制性实例是高血压，心肌缺血，和心肌 再灌注。本发明的化合物也可以用于治疗或预防其它与肥胖有关的状 况，包括中风，癌症(例如子宫内膜癌，乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌)， 胆囊疾病，睡眠呼吸暂停，生育力降低，和骨关节炎，(参见Lyznicki 等，Am.Fam.Phys.63：2185，2001)。在其它实施方案中，本发明的 化合物可以用于改变身体组成(为了美感的原因)、增强身体能力、 或产生更少脂肪的肉来源。杂合体可以用于改变身体组成，其通过减 少脂肪而不显著减少肌肉块，从而产生希望的身体脂肪减少，同时保 持无脂肪体重。在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽， GLP1，胰淀素和/或sCT部分。
在本发明的另一方面，提供了治疗或预防肥胖的方法，其中所述 方法包含施用治疗或预防有效量的杂合多肽给有需要的受试者。在一 个示例性的实施方案中，受试者是肥胖的或超重的受试者。尽管“肥 胖”一般定义为体重指数超过30，但对本说明书来说，需要或希望减 轻体重的任何受试者，包括体重指数低于30的受试者，都包括在“肥 胖”的范围内。为胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受或具有任何形式糖尿病(例 如1型、2型或妊娠糖尿病)的受试者均可从这些杂合体获益。在一个 实施方案中，这样的GIP杂合体含有毒蜥外泌肽，PYY，GLP1，胰 淀素和/或sCT部分。
在本发明的其它方面，提供了减少食物摄取、降低营养物利用度、 引起体重下降、影响机体组成、改变机体能含量或增加能量消耗、治 疗糖尿病以及改善脂质谱(包括降低LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或 改变HDL胆固醇水平)的方法，其中所述方法包含，给受试者施用有 效量的本发明杂合多肽。在一个示例性的实施方案中，本发明的方法 用于治疗或预防有需要受试者中可通过降低营养物利用度而减轻的状 况或病症，所述方法包含，给所述受试者施用治疗或预防有效量的本 发明的杂合多肽。这样的状况和病症包括但不限于高血压，血脂异常， 心血管疾病，摄食障碍，胰岛素抵抗，肥胖，和任何种类的糖尿病。 在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，PYY，GLP1，胰 淀素和/或sCT部分。
在一个实施方案中，其中PPF或PYY家族成员包含GIP-杂合体 组分，和不受理论的限制，认为通过与PP家族中的或类似于PP家族 的一种或多种独特受体类别相互作用，测定外周施用GIP杂合多肽在 减少食物摄取、延迟胃排空、降低营养物利用度和引起体重下降中的 作用。更具体地说，似乎涉及类似于PYY优选(或Y7)受体的一种或 多种受体。
用于本发明的其它测定包括可测定GIP杂合体化合物(尤其含有 毒蜥外泌肽，PPF，PYY，GLP1，胰淀素和/或sCT部分的那些)对 机体组成的作用的实验。示例性测定可以是，包括使用代谢疾病的膳 食诱导肥胖(DIO)小鼠模型的测定。在治疗期之前，可于4周龄开始， 喂饲雄性C57BL/6J小鼠高脂肪饮食(#D12331，58％的卡路里来自脂 肪；Research Diets，Inc.，)，持续6周。在研究过程中，小鼠可继续 吃高脂肪饮食。在整个研究中，水可任意提供。为了与DIO组对比代 谢参数，可对一组相似年龄的非肥胖小鼠喂饲低脂肪饮食(#D12329， 11％的卡路里来自脂肪)。
DIO小鼠可皮下(SC)肩胛内植入渗透泵，以传递载体(50％二甲基 亚砜(DMSO)的水溶液)或本发明化合物。后一组的泵可设定为传递任 意量，例如7-28天内传递1000μg/kg/天的本发明化合物。在整个研 究阶段内，可以固定间隔检测体重和食物摄取。可使用全动物间接测 热法(Oxymax，Columbus Instruments，Columbus，OH)测定呼吸商(RQ， 定义为CO2产生÷O2消耗)和代谢率。可用过量异氟烷麻醉小鼠，检 测肥胖指数(两侧附睾脂垫重量)。而且，在测定附睾重量之前，可使 用双能X-射线吸光测定(DEXA)仪器，按照生产商的说明(Lunar Piximus，GE Imaging System)，分析每只小鼠的机体组成(瘦组织量、 脂肪量)。在本发明方法中，可以鉴别出这样的GIP杂合体(尤其包 含毒蜥外泌肽，PPF，PYY，GLP1，胰淀素和/或sCT部分的那些)： 其在本文描述的一种测定(优选为食物摄取、胃排空、胰腺分泌、体重 下降或机体组成测定)中所具有的效力高于组分肽激素在相同测定中的 效力。
作为减少食物摄取、体重下降或治疗肥胖的结果，除了在有需要 的患者中改善高血压之外，本发明的化合物还可用于治疗低血压。
在另一个一般方面，本发明的杂合体可以用于抑制ghrelin的分 泌。因此，本发明的化合物可以利用该机理来治疗或预防ghrelin相 关病症，例如普拉德-威利综合征，所有类型的糖尿病和并发症，肥胖， 饮食过多，高脂血症，或与营养过度有关的其它病症。在一个实施方 案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和/或sCT部分。
本发明的化合物还可用于加强、诱导、增强或恢复胰岛或细胞中 的葡萄糖反应性。这些作用可用于治疗或预防与代谢疾病相关的病 症，例如描述于美国专利申请号US2004/0228846的疾病。测定此活 性的实验是本领域已知的。例如，在公开的美国专利申请号 US2004/0228846(其通过引用整体结合到本文中)中，描述了用于胰岛 分离和培养的实验以及测定胎儿胰岛成熟度的实验。在专利申请 US20040228846的实施例中，包括胰多肽(PP)、神经肽Y(NPY)、神 经肽K(NPK)、PYY、肠促胰液素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和铃蟾 肽在内的肠源激素肽购自Sigma。XI型胶原酶得自Sigma。RPMI 1640 培养基和胎牛血清得自Gibco。含抗胰岛素抗体的放免测定试剂盒 ([125I]-RIA试剂盒)购自Linco，St Louis。
产后大鼠胰岛得自P-02岁大鼠。成年大鼠胰岛得自6-8周龄大鼠。 胎大鼠胰岛如下获得。在妊娠日E21处死妊娠雌性大鼠。由子宫中取 出胎儿。从各幼仔中解剖出10-14个胰腺，用Hanks缓冲液清洗两次。 合并胰腺，悬浮在6ml 1mg/ml胶原酶(XI型，Sigma)中，并于37℃ 以恒定振荡温育8-10分钟。通过加入10体积的冰冷Hanks缓冲液， 终止消化，接着用Hahks缓冲液清洗3次。然后利用Ficoll梯度纯化 胰岛，并在有或没有加入1μM IBMX的10％胎牛血清(FBS)/RPMI培 养基中培养。在第5天结束时，将20个胰岛人工挑选入各个试管中， 并检测静态胰岛素释放。一般地讲，首先用KRP缓冲液清洗胰岛， 然后与1ml含3mM(低)葡萄糖的KRP缓冲液在恒定振荡下于37℃温 育30分钟。在收集上清液后，接着将胰岛与17mM(高)葡萄糖于37 ℃温育1小时。使用[125I]-RIA试剂盒，通过放免测定(RIA)检测低或 高葡萄糖刺激释放的胰岛素。在200ng/ml PYY，PP，CCK，NPK， NPY，胰泌素，GLP-1或铃蟾肽存在下，培养E21胎胰岛5天。
还提供使用Zucker糖尿病肥胖(ZDF)雄性大鼠的示例性体内实 验，ZDF是在喂饲标准啮齿动物膳食Purina 5008的所有fa/fa雄性大 鼠中自发表现出糖尿病的近交(＞F30代)大鼠模型。在ZDF fa-fa雄性 大鼠中，在约7周龄开始出现高血糖，葡萄糖水平(喂饲)通常在10-11 周龄达到500mg/DL。在发展糖尿病的过程中胰岛素水平(喂饲)较高。 但是，到第19周龄时，胰岛素降低至约同窝出生的瘦大鼠对照的水 平。肥胖大鼠的甘油三酯和胆固醇水平一般高于瘦大鼠的水平。在检 测中，3组(每组6只大鼠)7周龄ZDF大鼠通过ALZA泵接受输注 治疗14天：1)载体对照，2)和3)，具有两种不同剂量的PYY，分别 为100pmol/kg/小时和500pmol/kg/小时。在输注前和输注后的第7天 和第14天，进行4种检测：1)血糖水平，2)血浆胰岛素水平，和3)血 浆甘油三酯(TG)水平，以及口服葡萄糖耐受(OGTT)测试。因此，这些 测定可与本发明的化合物一起用于测试所需活性。
杂合体也可以用于治疗性和预防性处理与神经元损失或功能障碍 有关的神经学和神经系统病症，包括但不限于帕金森病，阿耳茨海默 病，亨延顿舞蹈病，ALS，中风，ADD，和神经精神病综合征，和用 于增强或促进哺乳动物的学习、记忆和认知。在这方面尤其有用的是 含有ing毒蜥外泌肽或GLP1活性部分的GIP杂合体，更具体地，至 少包含N-末端7-15个氨基酸或其类似物例如HSEGTFTSD(SEQ ID NO._____)的那些。
杂合多肽的其它设想用途包括降低中枢神经系统中铝(Al)浓度的 方法(参见美国专利6,734,166，其通过引用整体结合到本文中)，用于 治疗、预防或延迟阿耳茨海默病发作。测定对Al的作用的实验是本 领域已知的，可见于使用二倍体和Ts小鼠的美国专利6,734,166。这 些小鼠单独圈养在Nalgene牌代谢笼或聚丙烯笼中，在实验前给小鼠 3天时间适应笼。在实验过程中小鼠自由获取食物(LabDietNIH大 鼠和Moust/Auto 6F5K52，St.Louis，Mo.)和水，除了在安乐死前16 小时以外，在此时不提供食物。每天对小鼠皮下注射活性化合物或盐 水。对于一个实验，在第13天结束时处死小鼠，对另一个实验，在 第3天结束时处死小鼠，收集样品。在干净的聚四氟乙烯衬垫中制备 小鼠脑样品并称重，用于在低痕量元素级硝酸中通过微波消化进行分 析。然后使用电感耦合等离子体质谱测定法(Nuttall等，Annals of Clinical and Laboratory Science 25，3，264-271(1995))分析样品的Al 含量。分析过程中的所有组织处理都在使用HEPA空气过滤系统的洁 净室环境中进行，以使本底污染最小化。
本发明的杂合体可以用于预防和治疗肾病，包括高血压性和糖尿 病性肾病，和与胰岛素抗性和代谢综合征有关的肾病。杂合体尤其通 过下述方式达到这些目的：改善或预防高血压的恶化，内皮功能，肾 功能，和肾小球硬化症。在一个实施方案中，本发明提供了预防或治 疗肾病(包括高血压性和糖尿病性肾病，或与胰岛素抗性有关的肾病) 的方法，其包含施用本发明的化合物。杂合体还可以用于改善具有减 少的血管舒张能力、具有肾小球硬化症或肾小球流动的任何其它减少 的患者的内皮功能。这样的内皮功能的改善，可以用于降低高血压和 改善肾小球毛细血管的功能。在其它实施方案中，本发明的分子可以 用于预防肾病向ESRD的发展，预防、减缓蛋白尿和/或肾小球硬化症 的发展，治疗或改善蛋白尿和/或肾小球硬化症。
杂合体可以用于减少经受心律失常的风险，预防或治疗心律失 常。杂合体可以在心脏缺血、心脏缺血-再灌注、和充血性心力衰竭患 者中提供抗心律失常作用。例如，已经发现肠降血糖素GLP-1会减少 心脏损害，并增强具有这些病症的患者的恢复。肠降血糖素，包括 GLP-1，是葡萄糖-依赖性的促胰岛素激素。GLP-1和毒蜥外泌肽可以 有效地增强外周葡萄糖摄入，而不诱导危险的低血糖。它们也可以有 力地抑制胰高血糖素分泌，这独立于它的促胰岛素作用，从而基本上 比胰岛素更有力地减少血浆游离脂肪酸(FFA)水平。已经将高FFA水 平视作心肌缺血过程中的一个重要中毒机理。在另一个实施方案中， 杂合体可以用于预防和治疗心律失常，其可靠地减少与再灌注和缺血 有关的损伤，并增强患者恢复。在另一个实施方案中，急性中风或出 血之后的杂合体治疗、优选静脉内给药，会通过抑制胰高血糖素和维 持血糖正常或轻度低血糖，没有严重低血糖或其它不利副作用的危 险，提供优化胰岛素分泌、增加脑合成代谢、增强胰岛素效力的方式。 在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有GLP1或毒蜥外泌肽部分。
在另一个实施方案中，能降低胰岛素抗性或增强胰岛素敏感性的 杂合体可以用于治疗多囊性卵巢综合征(PCOS)。施用本发明的杂合 体，可以减少或预防经受PCOS的受试者中的胰岛素抗性。在另一个 实施方案中，杂合体会预防经受PCOS的受试者中的2型糖尿病的发 作。其它杂合体可以恢复经受PCOS的受试者的规则的月经、排卵或 生育力。在一个实施方案中，这样的GIP杂合体含有GLP1或毒蜥外 泌肽部分，用于结合和激活GLP1受体。
通过选择激素组分模块，本发明的化合物可以表现出广范围的生 物活性，有些与它们的抗分泌抗蠕动性质有关。化合物可以通过与上 皮细胞直接相互作用，或者可能通过抑制刺激肠分泌的激素或神经递 质的分泌，抑制胃肠分泌。抗分泌性质包括胃和/或胰腺分泌的抑制， 且可以用于治疗或预防疾病和病症，包括胃炎，胰腺炎，巴雷特食管， 和胃食管返流疾病，以及与之有关的状况，包括烧心，与胃/肠内容物 反流进嘴或肺中有关的烧心，吞咽困难，咳嗽，间歇性喘鸣和声带炎 症(与GERD有关的状况)，食管糜烂，食管溃疡，食管狭窄，食管组 织转化(用异常上皮替代正常食管上皮)，巴雷特食管腺癌，和肺吸入。 在另一个实施方案中，含有胰淀素和/或sCT部分的GIP杂合体可以 用于治疗或预防这些疾病和状况，例如巴雷特食管，胃食管返流疾病 (GERD)和本文公开的与之有关的状况。这样的杂合体具有特别有效的 抗分泌性质，例如抑制胃酸、抑制胆酸、和抑制胰酶。此外，这样的 杂合体可以具有胃保护功能，这使得它们特别适用于治疗或预防肠疾 病和状况和巴雷特食管，和/或GERD和本文所述的相关或伴随状况。
本发明的化合物用于治疗许多胃肠疾病(参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill Inco，New York，第12 版)，这些胃肠疾病与过量肠电解质和水分泌和降低的吸收相关，例如 传染性腹泻、炎性腹泻、短肠综合症或通常在手术(例如回肠造口术) 后发生的腹泻。传染性腹泻的实例包括但不限于急性病毒性腹泻、急 性细菌性腹泻(例如沙门氏菌、弧形杆菌和梭状芽胞杆菌或由于原生动 物感染)或旅行者腹泻(例如诺瓦克病毒或轮状病毒)。炎性腹泻的实例 包括但不限于吸收障碍综合征、热带口炎性腹泻、慢性胰腺炎、克隆 氏病、腹泻和肠易激综合征。还已经发现，本发明的肽可用于治疗涉 及胃肠道病症的急症或威胁生命的情境，例如，在手术后或由于霍乱。
和仅用于治疗肠损伤相关综合症(例如腹泻)相反，本发明的化合 物还可用于治疗或预防肠损伤，包括胃肠损伤。这样的肠损伤可为溃 疡性结肠炎、炎性肠病、肠萎缩、肠粘膜脱落和/或肠粘膜功能丧失， 或为这些疾病的后果(参见WO 03/105763，其在本文中整体引作参 考)。如WO 03/105763所述，用于此活性的测定包括处于12∶12昼∶夜 循环中圈养的250-300g11周龄雄性HSD大鼠，允许其随意获取标准 啮齿动物膳食(Teklad LM 485，Madison，WI)和水。动物在实验前空 腹24小时。先前Morris GP等，“Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon”1989；96：795-803已描 述了慢性结肠炎的简单且可重现的大鼠模型。其具有相对较长的炎症 和溃疡时程，提供了以明确可控方式研究结肠炎疾病病理生理学和评 价潜在可应用于人炎性肠病的新治疗的机会。
用3％异氟烷麻醉大鼠，将大鼠置于设定在37℃的可调节加热垫 上。将管针经直肠插入结肠7cm。如Mazelin，等，″Protective role of vagal afferents in experimentally-induced colitis in rats.″Juton Nerv Syst.73： 38-45(1998)所述，通过管针将溶解在50％乙醇(v/v)中的半抗原三硝基 苯磺酸(TNBS)以30mg/kg剂量、0.4-0.6mL总体积传递入结肠腔中。 对照组结肠内接受盐水溶液(NaCl 0.9％)。
诱发结肠炎后4天，切除麻醉大鼠的结肠，然后使大鼠断头安乐 死。检测离体的结肠和脾的重量，对结肠拍照，以记录总体形态学损 伤。炎症被定义为充血和肠壁变厚的区域。
在另一个方面，GIP杂合体可以用于治疗或预防胰腺炎，胰腺癌， 和胃炎，尤其用于治疗和预防已经经历内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP) 的患者的胰腺炎。当与生长抑素相组合时，含有胰淀素和/或sCT的GIP 杂合体激动剂可以具有令人惊奇的优良的治疗效果。因此，在某些实 施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包含，给受试者施用这样的杂合 体和施用生长抑素和生长抑素激动剂。本发明的杂合多肽也可以用于 治疗或预防巴雷特食管腺癌或胰腺肿瘤(例如，抑制胰腺肿瘤的增殖)。 本发明的方法包括减少肿瘤细胞的增殖。根据本发明可以治疗的良性 胰腺肿瘤细胞的类型包括浆液性囊腺瘤、微囊性肿瘤和实体-囊性肿 瘤。该方法还有效降低恶性胰腺肿瘤细胞(例如由胰腺导管、腺泡或胰 岛产生的癌)的增殖。在这方面特别有用的GIP杂合体是包含PYY或 PPF家族的激素模块组分的那些。美国专利5,574,010(其通过引用整 体结合到本文中)提供了测试抗增殖特性的示例性测定。例如，′010专 利指出，PANC-1和MiaPaCa-2是两种人胰腺腺癌细胞系，可由提供 者如美国典型培养物保藏中心ATCC(Rockville，Md)购买获得。在 NAPCO水夹套式5％CO2培养箱中，在补加10％胎牛血清、29.2mg/L 谷氨酰胺、25μg庆大霉素、5ml青霉素、链霉素和两性霉素B溶液(JRH Biosciences，Lenexa，Kans.)的RPMI-1640培养基中，于37℃培养两 种肿瘤细胞。当肿瘤细胞达到铺满单层时，1周1-2次用0.25％胰蛋 白酶(Clonetics，San Diego，Calif.)分离所有细胞系。在冷冻离心机中 于4℃以500g沉淀细胞7分钟，将细胞重悬浮在无胰蛋白酶的强化 RPMI 1640培养基中。用血细胞计数板和锥虫蓝计数活细胞。
将每种类型的10,000、20,000、40,000和80,000细胞以每孔200μl 培养基总体积加入到96孔微量培养板(Costar，Cambridge，Mass.)中。 在加入PYY或测试肽之前，使细胞贴壁24小时。在加入肽之前更换 新鲜培养基。将胰腺肿瘤细胞和PYY或测试化合物一起继续在体外 温育6小时和36小时。将PYY以250pmol、25pmol和2.5pmol/孔 的剂量加到细胞中(N＝14)。将测试化合物以400pmol、40pmol和4 pmol/孔的剂量加到细胞中(N＝14)。对照孔接受2μl 0.9％盐水，以模 拟体积和对贴壁肿瘤细胞的物理干扰。每个96孔板都含有18个对照 孔，使得可在实验过程中在每个板内进行对比。对于PANC-1和 MiaPaCa-2细胞，均使用各种浓度的PYY或测试化合物重复6次96 孔板检测。
在温育期结束时，将溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2-基)-2，5-二苯基 四唑-溴化MTr四唑(Sigma，St.Louis，Mo.)以0.5mg/ml加入到 新鲜培养基中。更换培养基，将肿瘤细胞与溴化MTT四唑于37℃ 温育4小时。在温育结束时，对培养基抽气。将甲晶体沉淀溶解在 200μl二甲基亚砜(Sigma，St.Louis，Mo.)中。通过用ELISA读数器 (Molecular Devices，Menlo Park，Calif.)获得500nm波长的吸光读数， 对溶解的甲进行定量。MTT实验检测线粒体NADH依赖性脱氢酶 活性，其已成为定量肿瘤细胞体外化疗反应性的最敏感和最可靠的方 法之一(Alley，M.C.，等，Cancer Res.，48：589-601，1988；Carmichael， J.，等，Cancer Res.，47：936-942，1987；McHale，A.P.，等，Cancer Lett.，41：315-321，1988；和Saxton，R.E.，等，J.Clin.Laser Med. 和Surg.，10(5)：331-336，1992.)。通过对相同测试条件的孔分组， 并利用单因素ANOVA鉴别对照和各种肽浓度治疗之间的差异，分析 550nm的吸光读数。
还提供了示例性的体内测定。利用肽PYY和测试化合物检测人 胰腺导管腺癌Mia Paca-2的体内生长抑制。将数千至100,000个人Mia PaCa-2细胞同位移植至48只雄性无胸腺小鼠中。1周后，用PYY或 测试化合物以200pmol/kg/小时经微渗透泵治疗动物4周。对应的培 养物接受盐水。在处死时，检测肿瘤大小和质量。通过组织学切片证 实，对照小鼠在胰腺中有显著的人癌生长。在第9周时，90％的对照 小鼠具有实质性转移疾病。测试治疗小鼠中肿瘤质量降低了60.5％， PYY治疗小鼠中降低了27％。
在另一个一般方面，杂合体可以用于减少骨重吸收，减少血钙， 和/或诱导镇痛作用，尤其是用于治疗骨病例如骨质减少和骨质疏松 症。在其它实施方案中，杂合体可以用于治疗疼痛和疼痛性神经病。 在一个实施方案中，这样的杂合体含有毒蜥外泌肽，GLP1，胰淀素和 /或sCT部分。例如，本发明的GIP-sCT或GIP-胰淀素/sCT杂合化合 物可以具有鲑鱼降钙素或胰淀素/sCT/胰淀素嵌合体的可选择性质，例 如减少骨丢失和骨重吸收或减少软骨转角(软骨保护)，和GIP的性质， 例如降低血糖(伴有本文所述的抗分解代谢方面)和/或抑制骨重吸收 和维持或增加骨密度。具有这样的可选择性质的GIP杂合体可以增强 骨质疏松症或高软骨转角的状况的治疗，尤其是在也可以从血糖控制 获益的那些人中，例如具有糖尿病或正在接受病危护理的受试者。
GIP化合物，尤其GIP类似物，另外任选地包含肽增强子(例如 一个异源的C-末端尾)的延长了半衰期的GIP杂合体(例如DPP-IV切 割抗性的(例如D-Ala2，N-乙酰基或N-焦谷氨酰基类似物))，和包含 已知提供有益的心血管作用的其它激素模块的GIP杂合体，可以用于 治疗心血管疾病和相关状况。如本文所证实的，GIP化合物会增加心 肌收缩力(dp/dt)，降低血压(例如通过急性血管舒张)，降低收缩压， 降低舒张压，且可以提供对心脏细胞直接有益的作用。GIP化合物也 会通过代谢作用提高心脏功能，所述代谢作用例如葡萄糖降低、胰岛 素分泌、β细胞增殖。也通过提供对心血管系统的直接作用，GIP化 合物令人惊奇地是更有治疗益处的。
因此，本文提供了治疗、预防或缓解心血管疾病和状况的方法， 其中给需要这样的治疗的患者施用治疗有效量的GIP化合物，它是单 独的或与另一种提供心血管益处的试剂相组合。关于在本说明书中讨 论的其它状况，GIP化合物可以与另一种试剂同时、先后或交替施用。
因此，在一个实施方案中，所述心血管疾病或状况是高血压(包括 1期、2期和3期高血压，舒张压或收缩压)，肺高压，充血性心力衰 竭，心功能不全，搏出量减少，心肌病(扩张性，肥厚性或限制性)， 心脏收缩力降低，与心血管状况有关的肺充血，肺和全身水肿，心输 出量降低，左心室功能异常，舒张压异常，与心脏收缩力降低有关的 肾衰竭，心血管危险增加(例如与伴有正常舒张压的收缩压升高有关； 与伴有正常收缩压的舒张压升高有关；与舒张和收缩压升高有关；与 平均动脉血压升高有关)和非缺血性或缺血性心脏组织退化(例如源自 心肌梗塞)。在一个实施方案中，减少了与这些疾病和状况有关的发病 率或死亡率中的任一种或两种。
需要治疗的患者包括糖尿病的(例如患有糖尿病性心肌病)、肥胖 的、经历重症监护的、经历手术的、或其组合的患者，或否则是正常 的患者。患者可以已经具有这样的疾病或状况或处于具有它的危险 中。例如，心肌梗塞后需要预防进一步的心力衰竭的患者，可以从本 文方法获益。
预防疾病或状况，例如，心血管疾病或状况，包括预防疾病或状 况的起始、延迟疾病或状况的起始、预防疾病或状况的进展或发展、 减慢疾病或状况的进展或发展、延迟疾病或状况的进展或发展、和将 疾病或状况从晚期阶段向较不晚期的阶段逆转。
在一个实施方案中，所述方法提供了治疗或延迟这样的或状况的 发作。例如，受损的收缩力可以减少搏出量。这又可以导致充血性心 力衰竭。因而，在一个实施方案中，治疗心力衰竭指治疗作为心力衰 竭的基础的任一种或多种状况，包括但不限于心脏收缩力降低，异常 的舒张顺应性，搏出量减少，高血压，肺充血，和心输出量降低。
在一个实施方案中，提供了诱导收缩力反应、减少血压、减少舒 张压、减少舒张压、增加血管舒张或上述的任意组合的方法，有或没 有GIP的伴随有益代谢作用，例如葡萄糖降低，胰岛素分泌，或β细 胞增殖，该方法包含施用治疗有效量的GIP化合物，以提供这样的希 望的有益作用。这些方法可以用于治疗需要这样的益处的患者中的可 通过增加心脏收缩力、降低血压、降低舒张压、降低舒张压、增加血 管舒张或上述组合来缓解的状况或病症。
收缩力的化合物是会诱导收缩作用(例如，增加心脏的收缩力)的 化合物，它们已经被公认为可以用于治疗例如，充血性心力衰竭。充 血性心力衰竭是工业化国家中死亡和失能的最常见原因之一，在第五 年时的死亡率是约50％(Goodman和Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.McGraw Hill，N.Y.，pp.809-838)。美国心脏 协会(AHA)建立的标准、测试和指南，适用于诊断本文所述的心血管 疾病和状况。
GIP化合物表现出希望的积极收缩力作用，而没有实质的、伴随 的血压升高。经历心力衰竭或心血管疾病或状况的受试者中的这样的 血压变化，会造成心脏功能的其它恶化。实际上，如本文所证实的， GIP化合物可以起降低血压或血压变化速率的功能。
可得到的收缩力试剂的问题，解释了对具有下述特性的治疗的需 要和希望的能力：它是收缩力的，具有快速的作用起始，具有延长的 作用持续时间(包括持久作用，没有快速耐受)，具有低毒性(较高的毒 性/治疗剂量比)，不存在或具有较低的恶心作用，且具有方便的给药 途径(非-静脉内)。GIP化合物可以提供这些益处。
本发明的GIP化合物、尤其GIP杂合体(其包含DPP-IV抗性的 具有肽增强子例如毒蜥外泌肽尾的GIP类似物(例如化合物G))的其 它有益作用，源自缺少或减少的厌食作用、和缺少或相对不明显的恶 心作用，这对于本文讨论的患者群体是重要的。
也提供了治疗病危患者的方法，所述病危患者例如危重得足以转 移至重症监护病房(ICU)并从抗分解代谢治疗或非分解代谢治疗获益的 那些，所述方法包含，给需要这样的治疗的患者施用治疗有效量的GIP 类似物或杂合体，它是单独的或与另一种有益试剂相组合。不受理论 的限制，所述方法意在有利于其中GIP激动剂类似物和杂合体的刺激 胰岛素分泌和实现与强烈胰岛素治疗(GIK治疗；葡萄糖-胰岛素-钾)有 关的益处的效应的患者，且没有与与胰岛素/葡萄糖输注有关的危害和 复杂性，也没有据报道与使用有些胰高血糖素样肽-1激动剂有关的副 作用。此外，现在观察到，GIP可以有利地影响患者的代谢状态，以 及简单地间接地调节反应于食物摄入的葡萄糖水平。因此，GIP化合 物可以用于降低病危患者的发病率和死亡率。
如本文所证实的，GIP化合物提供有益代谢作用，例如萄萄糖降 低，胰岛素分泌和/或β细胞增殖。GIP化合物也会提高心脏功能，这 通过增加心肌收缩力(dP/dt)、减少血压(例如通过急性血管舒张)、和 减少收缩压、减少舒张压、和提供对心脏细胞直接有益的作用来实现。 由于许多病危患者已经具有心血管疾病或状况或处于心血管疾病或状 况的危险中，或伴有心血管疾病或状况，这些心血管作用可以提供额 外的益处。还通过提供对心血管系统的直接作用，GIP化合物令人惊 奇地具有附加的治疗价值。
因此，本文提供了治疗、预防或减轻病危护理的状况和疾病的方 法，其中给需要这样的治疗的病危患者施用治疗有效量的GIP化合物， 它是单独的或与提供希望的益处的另一种试剂相组合。关于在本说明 书中讨论的其它状况，GIP化合物可以与另一种试剂同时、先后或交 替施用。
″重症监护病房”可以是医院的治疗病危患者的一部分，当然可能 官方地不采用名称″重症监护病房”。如果在其中进行相同的或类似的 活动，ICU也包括疗养所、诊所，例如，私人诊所等。
术语″病危患者”可以是由于疾病或损伤具有持续的急性威胁生命 的单或多器官系统衰竭或处于该危险中的患者，接受手术并接着发生 并发症的患者，和已经在最后一周在关键器官进行手术或已经在最后 一周进行重大手术的患者。病危患者可以是需要关键器官支持(机械地 例如使用机械换气或透析等，或药理学地例如使用收缩力试剂或血管 升压药物)、否则就不能存活的患者。表述″病危护理”、“重症监护”和 “病危”可互换地使用。病危患者是通常经历不稳定的代谢状态的患者。 该不稳定的代谢状态，例如分解代谢状态，可以是底物代谢变化的结 果，所述物质代谢变化可能导致有些营养物的相对缺乏和/或脂肪和肌 肉的增加的氧化(例如消耗)，不希望的加速的蛋白分解，高血糖症和 高浓度的血清甘油三酯及其它脂质。病危患者的非限制性实例是需要 心脏手术、脑手术、胸腔手术、腹部手术、血管手术、或移植的患者， 或经受脑外伤、呼吸机能不全、病危多发性神经病、多创伤或严重烧 伤的患者，或正在机械换气的患者。
因此，在一个实施方案中，病危护理疾病或状况分成医学的、手 术的(例如创伤)或冠状动脉护理，进一步可以分成败血病和呼吸护理。 特别感兴趣的是需要确保GIK治疗的那些分类，例如感染性休克或心 肌梗塞。
分解代谢变化(例如，体重减轻)是病危患者的不利的危险度因子。 尽管大多数转入ICU的患者会接受递送一些形式的卡路里的静脉内输 液，加拿大的ICU营养支持研究报道，通常仅能供给每天所需的58％， 仅26％接受肠胃外营养。因此，提供了一种方法，其中给需要预防或 减轻分解代谢作用(例如体重减轻)的病危患者施用治疗有效量的本 文提供的GIP化合物，以预防或减轻分解代谢。需要治疗的病危患者 包括非糖尿病患者(没有诊断出具有糖尿病或糖尿病前)、糖尿病患者、 糖尿病前患者和/或肥胖患者。患者可以已经具有所述疾病或状况，或 处于该危险中。
使用GIP化合物可以减少或避免与GLP-1有关的危险，以引起GIK 样益处。减慢胃排空可以使口服药物的递送变得复杂(例如，通过改 变它们的动力学)和降低营养物摄入；例如，GLP-1激动剂，胰淀素 激动剂，CCK激动剂，和胰泌素激动剂，会减慢胃排空。如本文所证 实的，在治疗范围内，GIP化合物的剂量不会减慢胃排空或仅仅表现 出微弱的作用，在所有情况下，都远远低于GLP1和毒蜥外泌肽4。 通常，可以用选择性胰淀素拮抗剂(例如普兰林肽)阻断该作用，表 明该作用是增强的β-细胞分泌胰淀素的间接结果，后者是迄今鉴别出 的最有效的胃排空内源抑制剂。GIP给药因而与胃排空的直接抑制无 关。重要的是，本文已经证实，GIP自身不会急性抑制小鼠的食物摄 取。GIP不会造成饮食诱导的肥胖小鼠的体重减轻，GIP类似物杂合 体0601GIP3794也不会。此外，据报道，相当于与体重减轻和肥胖有 关的GLP-1激动剂，GIP会发挥脂肪节约效应。脂肪节约效应可能归 因于脂肪细胞的抗解脂效应或脂蛋白脂肪酶的促进、胰岛素信号传递 的放大和/或掺入脂肪细胞脂质中的脂肪酸的增加等效应。令人感兴趣 地，0601GIP3794提供了体脂肪百分比的轻微下降、体蛋白的增加， 且没有伴有体重下降，表明身体组成受到影响。众所周知，体能储存 的减少预示着病危护理的不利结果，而体能储存的保持会促进有益结 果。减食欲作用的缺少或下降、恶心的缺少或下降、和/或体重减轻的 缺少或下降、有或没有身体组成的改善，对于经历分解代谢作用的患 者(例如病危患者)是有利的。尽管已经在心脏组织中检测出GIP受 体mRNA，迄今尚未检测出心脏中的激素结合。但是，如本文所证实 的，GIP会结合和激活心肌细胞，并在体内表现出正性肌力作用。关 于尿过少患者的肾衰竭、尤其急性肾衰竭的治疗，尽管尝试通过建立 尿排出的方案(例如通过使用髓袢利尿剂和渗透压性利尿剂)来增加 尿流，通常尝试会增加心肌收缩力的收缩力试剂的干预。因而，本文 讨论的GIP化合物会为具有受损心肌或处于该危险和某些其它状况(例 如肾衰竭)的患者提供其它益处，这独立于它的促胰岛素作用。其它 方法包括给需要的患者施用治疗有效量的GIP化合物，其提供心肌的 节约，否则会倾向于在分解代谢状态中萎缩。
因此，在一个实施方案中，病危护理患者具有与下述病症有关的 分解代谢变化的疾病或状况：病危、败血病、创伤后、手术后、休克 后、昏迷患者，应激诱导的高血糖症(例如血管事件后)，中风，心肌 梗塞，急性肠系膜缺血，呼吸窘迫，呼吸机依赖性，肾衰竭，充血性 心力衰竭，水肿，冬眠心肌，心肌病(缺血性的，糖尿病的)，BNP的 降低，勃起功能障碍，高血压，多发性神经病，缺血/再灌注损伤(例 如溶血栓治疗后，心脏手术后)，器官床的组织保护，心肌梗塞(死亡 率，功能，症候学)，急性冠状动脉综合征(稳定的/不稳定的咽峡炎， 非-Q波梗死，ECG阳性的)，传导或节律的紊乱，乳头肌功能障碍， 和/或肺水肿。例如，在一个实施方案中，所述方法包含减弱、改善或 减少这样的疾病或状况，包括手术前或手术后的分解代谢变化，所述 方法包含，给需要的患者施用GIP化合物。GIP化合物用于提供治疗 益处，例如测量为例如APACHE评分的降低、死亡率的降低、住院天 数的减少、再住院需求的减少、住院治疗费用的减少的益处。
在一个实施方案中，是治疗需要的病危患者的方法，以预防或降 低血流感染、败血病或脓毒性休克的发病率，以降低与病危护理有关 的发病率，以降低与病危护理有关的死亡率(例如住院死亡率)，以预 防或降低长期炎症的发病率，以预防或降低急性肾衰竭和/或肾替补疗 法的发病率，以预防或降低病危护理多发性神经病的发病率，以减少 抗生素的使用，以预防或降低免疫介导的β细胞破坏的发病率，以减 少炎症和/或炎性反应中标志物紊乱的可能性，以预防或降低全身炎症 反应综合征(SIRS)的发病率，以减少红细胞输注量，以减少应激诱导 的高血糖症，以保护免于胆汁淤积，以减少侵入性治疗的需求，以预 防或降低神经内水肿的发病率，以减少透析或血液过滤，以减少或消 除关键器官系统支持的需求，以允许通常正常的肠途径摄入至少约1/3 分卡路里需求，以减少多器官衰竭的危险或可能性，以减少与败血病 或感染性休克有关的多器官衰竭的危险或可能性，以减少机械辅助呼 吸的使用，以减少紊乱的肾功能参数的可能性，以减少高胆红素血的 可能性，或以治疗、预防或减轻或减少本文提及的一种或多种其它病 危护理状况的发病率，所述方法包含施用治疗有效量的GIP化合物。 在另一个实施方案中，给药会实现血糖量正常或血糖正常，降低血糖， 胰岛素分泌，如本文讨论的心血管益处，分解代谢作用的减少，或其 任意组合。
病危护理患者可以包括经受呼吸窘迫的患者，其中作为肺功能障 碍的结果，患者具有呼吸困难。患者可以表现出不同程度的低氧血症， 后者能或不能通过补充供氧来控制。呼吸窘迫可能发生在具有受损的 肺功能患者中，由于直接肺损伤，例如源自肺炎、胃内容物吸入，肺 挫伤，脂肪栓，近乎溺死，吸入性损伤，高海拔和再灌注肺水肿，或 源自间接肺损伤，如源自败血病，具有休克和多次输血的严重创伤， 心肺转流术，药物过量，和急性胰腺炎。病危患者可能具有与慢性低 氧血有关的肺病，后者可能导致肺循环内的高压，称作肺高压。病危 患者可能具有肺源性心脏病，后者是肺动脉和心脏右心室中的长期高 血压造成的心脏右侧的衰竭。病危患者可能具有急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)或慢性阻塞性肺病(COPD)，包括肺气肿和慢性支气管炎，它 们也会造成呼吸窘迫。
在另一个实施方案中，病危护理患者是具有紊乱的葡萄糖代谢例 如胰岛素抗性、但是没有明显的糖尿病的患者，以及由于任何原因不 能通过消化道接受营养的患者。这样的患者包括手术患者，昏迷的患 者，休克的患者，具有胃肠病的患者，具有消化激素疾病的患者等。 更具体地，肥胖患者，动脉粥样硬化患者，血管病患者，妊娠糖尿病 的患者，具有肝病例如肝硬化的患者，肢端肥大症患者，糖肾上腺皮 质激素过多(例如氢化可的松治疗或库欣病)的患者，具有激活的反 调节激素(例如创伤、意外事故和手术等之后发生)的患者，高甘油 三酸酯血症患者和慢性胰腺炎患者，可以根据本发明容易地和合适地 营养，不会使患者发生低血糖症或高血糖症，同时减少不希望的分解 代谢变化和/或提供心血管益处。
在一个实施方案中，单独地或与其它试剂一起施用GIP化合物， 会减少病危患者(他们需要重症监护)的发病率或死亡率，或它们停留 在ICU中的时间。发病率的降低指病危患者发展其它疾病、状况或症 状的可能性的减少，或其它疾病、状况或症状的严重性的减少。例如， 通过减少菌血症或败血病或与多器官衰竭有关的并发症的发病率，可 以实现发病率的降低。
这些适应症不限于具有血糖代谢障碍的患者，也不需要达到血糖 正常。它们也不限于促胰岛素机理，或能以增加的胰岛素分泌作出反 应的那些个体。尽管已经在2型糖尿病中报道了GIP抗性，没有预期 GIP的对促胰岛素作用的抗性是病危患者的一项特征，包括具有急性 应激诱导的血糖代谢障碍的患者。正常的葡萄糖-依赖性的胰岛素分泌 的刺激，发生在大多数病危患者中，和使用高GIP剂量或使用本文公 开的GIP类似物和杂合体可以达到对GIP功效的抗性的那些患者中。
因而，在一个实施方案中，提供了诱导促胰岛素应答的方法，提 供抗-或非-分解代谢效应(例如减少分解代谢效应)或提供本文讨论的任 一种心血管益处或上述的任意组合的方法，其包含施用治疗有效量的 GIP化合物，以提供这样的希望的有益作用。这些方法可以用于治疗 需要这样的益处的病危患者中的可通过这样的作用缓解的病危护理状 况或病症，优选地与分解代谢效应的减少相组合。
GIP化合物包括GIP和GIP类似物和杂合体，尤其是本文所述的 新的GIP类似物，任选地另外包含肽增强子(例如一个异源的C-末端 尾)的延长了半衰期的GIP杂合体(例如DPP-IV切割抗性的(例如D- Ala2，N-乙酰基或N-焦谷氨酰基类似物)，和包含已知为接受危重或 重症监护的患者提供有益益处的至少一种激素模块的GIP杂合体。例 如，特别有用的本发明的GIP化合物是，包含具有肽增强子(例如毒 蜥外泌肽尾)的DPP-IV抗性的GIP类似物(例如化合物G)的GIP杂 合体，或包含GIP类似物和胰淀素家族或鲑鱼降钙素激素模块的GIP 杂合体，它们通过缺少或减少的厌食作用、同时维持希望的葡萄糖降 低、促胰岛素和/或心血管益处，额外地有益。
在一个实施方案中，施用GIP化合物会减少与肠胃外营养有关的 问题。经常难以将希望量的葡萄糖输给甚至具有健康代谢、没有令人 讨厌的高血糖症的人。这在病危护理患者中会加重。在有GIP化合物 存在下，可以控制肠胃外营养过程中的胰岛素分泌，使得血糖增加小 于没有GIP化合物时。因此，可以在24-小时时间段内递送更多的葡 萄糖。因而可以更好地满足在肠胃外营养的患者中观察到的卡路里缺 乏。因此，提供了非饮食的营养方法，其包含，提供肠胃外途径，给 需要肠胃外营养的患者施用营养有效量的一种或多种选自下组的营养 物：碳水化合物，氨基酸，脂类，游离脂肪酸，单或二甘油酯，甘油 及其任意组合；和GIP化合物，其中营养物的施用会在患者中产生每 分升血液约80-180mg葡萄糖的血糖水平，将给药速率调至，每天给 每位患者递送最高约1000g葡萄糖或它的等同物。在另一个实施方案 中，患者通过正常的肠途径接受至少约1/3的卡路里需求，通过正常 的肠途径接受至少约1/2的卡路里需求，或通过正常的肠途径接受至 少约2/3的卡路里需求。当营养源是碳水化合物时，碳水化合物来源 的浓度可以是每升约2％-约50％(按重量计)葡萄糖或它的等同物。 在另一个实施方案中，通过肠胃外途径施用营养有效量的一种或多种 营养物或其任意组合和一种或多种促胰岛素肽，增强下述患者的营养 物代谢：具有紊乱的葡萄糖代谢的患者，手术患者，昏迷的患者，休 克的患者，具有胃肠病的患者，具有消化激素疾病的患者，肥胖患者， 动脉粥样硬化患者，血管病患者，妊娠糖尿病的患者，具有肝病的患 者，肝硬化患者，糖肾上腺皮质激素过多的患者，库欣病患者，具有 激活的反调节激素(例如在创伤或疾病之后发生)的患者，高甘油三 酸酯血症患者或慢性胰腺炎患者。在另一个实施方案中，需要通过非 饮食途径的增强的肠胃外营养的患者是病危护理患者。
在病危护理用途和肠胃外营养增强用途的一个实施方案中，通过 连续静脉内输注来施用GIP化合物，以达到小于200mg/dl、或范围 为80-150mg/dl、或范围为80-110mg/dl的血糖水平。例如，可以施 用GIP化合物来维持血糖低于约160-180毫克/分升的“肾阈值”。鉴于 GIP化合物提供的额外的抗分解代谢和心血管益处，也可以治疗没有 经受高血糖症的患者。
如本文讨论的，预见到许多许多途径的急性和慢性给药可以用于 病危护理用途和肠胃外营养的增强。在病危护理用途的一个实施方案 中，以约0.1-100pmol/kg/min、约0.1-50pmol/kg/min、约0.5-30 pmol/kg/min、约0.1-10pmol/kg/min、约0.5-5pmol/kg/min、或约1.0- 3.0pmol/kg/min的速率，连续输入GIP化合物。如本文别处讨论的， 也可以通过持续释放制剂(例如包含微球或凝胶基质)提供GIP化合 物，和/或通过离散的或重迭的剂量、通过皮下、鼻的、静脉内或其它 途径给药。GIP化合物可以在病危护理(例如手术)开始之前、过程 中和/或之后施用。
GIP、GIP类似物、新的GIP类似物或GIP杂合体、或其衍生物 的治疗有效剂量，取决于许多因素，包括但不限于，患者的性别、体 重和年龄，调节血糖障碍的严重性，调节血糖障碍的根本原因，是否 同时施用葡萄糖或另一种碳水化合物来源，给药途径和生物利用度， 在体内的停留时间，剂型和效力。确定达到希望的临床结果所需的GIP 化合物的剂量和给药途径，属于普通医师的常识。
多肽生产和纯化
可使用本领域已知的标准重组技术或化学肽合成技术，例如使用 自动化或半自动化肽合成仪，或这二者，制备本文描述的多肽。
可按照常规技术，在溶液中或固相支持体上合成本发明的多肽。 这样的方法记载在例如，本文中和美国专利号6,610,824和美国专利 号5,686,411和专利申请系列号454,533(1999年12月6日提交)，它 们整体在本文中引作参考。可获得市售的各种自动化合成仪，并可按 照已知的方法使用。参见例如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)；Tam等，J.Am.Chem. Soc.105：6442(1983)；Merrifield，Science 232：341-7(1986)；以及 Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，New York，1-284(1979)。可用使用NMP/HOBt(选项1)系统的 自动化肽合成仪(例如430A型，Applied Biosystems Inc.，Foster City， California)和包含加帽的tBoc或Fmoc化学法(参见Applied Biosystems 关于ABI 430A肽合成仪的用户指引，1.3B版，1998年7月1日，第 6章，49-70页，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)进 行固相肽合成。还可使用Advanced Chem Tech合成仪(MPS 350型， Louisville，Kentucky)组装肽。可使用例如Waters Delta Prep 3000系统 和C4、C8或C18制备型柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia， California)，通过RP-HPLC(制备型和分析型)纯化肽。通过会聚性方 法，例如“天然化学连接”及其变体，其中通过天然酰胺键形成，连接 2个或多个具有适当正交反应末端的肽片段，可容易地合成活性肽。 可以进一步连接新形成的肽，以制备甚至更长的多肽。可以根据需要， 衍生化各个起始肽，或可以在连接步骤之后衍生化。
使用PAL-PEG-PS树脂(Applied Biosystems)，以0.2mmol/g(0.25 mmol量级)的装载，在Pioneer连续流肽合成仪(Applied Biosystems)上 合成肽类似物。使用4.0当量的HBTU、4.0当量的HOBT、8.0当量 的DIEA，激活Fmoc氨基酸(4.0当量，1.0mmol)残基，并偶联到树 脂上1小时。通过用在二甲基甲酰胺中的20％(v/v)哌啶进行处理，去 除Fmoc基团。通过用试剂B(93％TFA，3％苯酚，3％水和1％三异 丙基硅烷)处理树脂2-3小时，进行最终的去保护和从固体支持物切割 肽。使用叔丁基甲基醚，沉淀切割的肽，通过离心进行沉淀，并低压 冻干。将沉淀重新溶于水(10-15mL)。过滤，并经过使用C-18柱和含 有0.1％TFA的乙腈/水梯度的反相HPLC进行纯化。低压冻干纯化的 产物，通过ESI-LC/MS和分析型HPLC进行分析，证实是纯的(＞98％)。 质量结果都与计算值相一致。
或者，使用Rink酰胺树脂(Novabiochem，San Diego，CA)，以 0.43-0.49mmol/g的装载，以0.050-0.100mmol，在Symphony肽合 成仪(蛋白Technologies，Inc.，Woburn，MA)上装配肽。将Fmoc氨 基酸(Applied Biosystems，Inc.5.0当量，0.250-0.500mmol)残基以0.10 M的浓度溶于1-甲基-2-吡咯烷酮。将所有其它试剂(HBTU，HOBT 和N，N-二异丙基乙胺)制备成0.55M二甲基甲酰胺溶液。然后，使 用HBTU(2.0当量，0.100-0.200mmol)、HOBT(1.8当量，0.090-0.18 mmol)、N，N-二异丙基乙胺(2.4当量，0.120-0.240mmol)，将Fmoc保 护的氨基酸偶联到树脂结合的氨基酸上2小时。在最后一个氨基酸偶 联之后，使用在二甲基甲酰胺中的20％(v/v)哌啶去保护肽1小时。一 旦完成肽序列，启动Symphony肽合成仪的切割树脂程序。使用由93％ TFA、3％苯酚、3％水和1％三异丙基硅烷组成的试剂混合物，从树 脂三氟醋酸(TFA)切割肽。使用叔丁基甲基醚沉淀切割的肽，离心进 行沉淀，并低压冻干。将沉淀溶于醋酸中，低压冻干，然后溶于水中， 过滤，并经过使用C-18柱和含有0.1％TFA的乙腈/水梯度的反相HPLC 进行纯化。使用分析型HPLC评估肽的纯度，通过LC/MS和MALDI- MS证实同一性。
可以容易地合成有活性的蛋白，然后在用于鉴别反应肽的筛选测 定中进行筛选。
或者，可通过本领域众所周知的重组技术生产本发明的类似物和 杂合多肽。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)。通过重组技术产生的这 些GIP类似物或杂合多肽可由多核苷酸表达。本领域技术人员会认识 到，包括DNA和RNA在内的编码这样的GIP类似物或杂合多肽的多 核苷酸，可由野生型cDNA获得，例如GIP，GLP1，胰淀素，并考虑 密码子选择的简并性，或者可根据需要工程改造。这些多核苷酸序列 可掺入有利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。按照本领 域众所周知的方法，可容易地构建这种生产序列。参见例如WO 83/04053。以上多核苷酸还可任选地编码N-端甲硫氨酰残基。可利用 本领域已知的方法制备用于本发明的非肽类化合物。例如，可使用本 领域已知的方法制备含磷酸酯的氨基酸和含这些氨基酸的肽。参见例 如Bartlett和Landen，Bioorg Chem.14：356-77(1986)。
可利用多种表达载体/宿主系统，以包含和表达GIP多肽编码序 列。这些系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒 DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达 载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰 菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染或用细菌表达载体(例 如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。用于 重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI38、BHK、 HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。下文 描述了蛋白重组表达的示例性方案。
因此，本发明提供的多核苷酸序列用于产生新且有用的病毒和质 粒DNA载体、新且有用的转化的和转染的原核和真核宿主细胞(包括 在培养基中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)、以及能够表达所述GIP 多肽的宿主细胞的新且有用的培养生长方法。在待缓解杂合体的GIP 或其它组分肽激素生产不足或要满足其水平增加需要的情况下，编码 本文GIP类似物或杂合体的多核苷酸序列可用于基因治疗。
本发明还提供了本发明GIP多肽的重组DNA生产方法。提供了 由含GIP多肽的编码核酸的宿主细胞生产GIP多肽的方法，其包括： (a)在有利于表达此DNA分子的条件下，培养所述含GIP多肽的编码 多核苷酸的宿主细胞；和(b)获得该GIP多肽。
宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括细菌、哺乳动物细胞(例 如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或其它 细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统对本领域技术人员来说也是众 所周知的。可根据加工表达蛋白或生产某些用于提供蛋白活性的翻译 后修饰的特定能力，选择宿主细胞株。这样的多肽修饰包括但不限于 乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前原”形式蛋 白的翻译后加工对正确的插入、折叠和/或功能可能也很重要。不同的 宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对这样的翻 译后活性具有特定的细胞机器和特征机制，可对宿主细胞进行选择， 以确保导入的外源蛋白的正确修饰和加工。
或者，可使用酵母系统生产本发明的GIP多肽。通过PCR扩增 GIP多肽cDNA的编码区。使用一个含α交配因子基因核苷酸1-20的 引物和与该基因核苷酸255-235互补的另一个引物，在PCR反应中由 酵母基因组DNA扩增编码酵母前-原-α前导序列的DNA(Kurjan和 Herskowitz，Cell，30：933-43(1982))。将前-原-α前导编码序列和GIP 多肽编码序列片段连接入含酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中， 使得该启动子引导由融合至成熟GIP多肽的前-原-α因子组成的融合蛋 白的表达。如Rose和Broach，Meth.Enz.185：234-79，Goeddel编 辑，Academic Press，Inc.，San Diego，California(1990)所述，载体进 一步包含克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-μ”复制起点、 酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基 因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别用于细菌和酵 母中的选择。leu-2d基因还有利于增加质粒在酵母中的拷贝数，以诱 导较高水平的表达。REP1和REP2基因编码蛋白参与质粒拷贝数的调 节。
使用已知方法，例如醋酸锂处理(Steams等，Meth.Enz.185：280-97 (1990))，将在前述章节中描述的DNA构建物转化入酵母细胞中。当 生长培养基中的葡萄糖耗尽时诱导ADH2启动子(Price等，Gene 55： 287(1987))。前-原-α序列影响细胞分泌融合蛋白。与此相伴的是酵母 KEX2蛋白切开成熟PYY类似物多肽和前-原序列(Bitter等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 81：5330-4(1984))。
还可以使用市售的表达系统，例如Pichia表达系统(Invitrogen，San Diego，California)，按照生产商的说明，在酵母中重组表达本发明的 杂合多肽。此系统也依靠前-原-α序列引导分泌，但插入片段的转录在 甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)驱动。通过例如用于由细菌和哺乳动物 细胞上清液纯化杂合多肽的方法，由酵母生长培养基中纯化分泌的杂 合多肽。
或者，可将编码GIP多肽的cDNA克隆入杆状病毒表达载体 pVL1393(PharMingen，San Diego，California)中。然后按照生产商的 指引(PharMingen)，使用该GIP-化合物编码载体感染无sF9蛋白培养 基中的草地夜蛾细胞，并生产重组蛋白。使用肝素-Sepharose柱 (Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和串接的分子量筛分柱(Amicon， Beverly，Massachusetts)，由培养基中纯化和浓缩蛋白，并重悬浮在PBS 中。SDS-PAGE分析显示单一条带，确定蛋白大小，用Proton 2090肽 测序仪进行Edman测序，确认其N-端序列。
例如，可将编码预测成熟的GIP类似物或杂合多肽的DNA序列 克隆入含所需启动子和任选前导序列的质粒中(参见例如Better等， Science 240：1041-3(1988))。该构建物的序列可通过自动化测序确认。 然后使用采用CaCl2温育和细菌热休克处理的标准方法，将质粒转化 入大肠杆菌菌株MC1061中(Sambrook等，出处同上)。转化的细菌在 补加羧苄青霉素的LB培养基中培养，通过在合适的培养基中生长， 诱导表达蛋白的生产。如果存在前导序列，则前导序列会影响成熟的 GIP类似物或杂合多肽的分泌，并在分泌过程中被切除。利用下文描 述的方法，由细菌培养基中纯化分泌的重组蛋白。
或者，本发明的GIP多肽可在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的 昆虫系统是本领域技术人员周知的。在一个这样的系统中，使用苜蓿 银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为在草地夜蛾细胞或银纹夜蛾 (Trichoplusia larvae)中表达外源基因的载体。将GIP多肽编码序列克 隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并处于多角体蛋白 启动子控制之下。GIP类似物或杂合多肽的成功插入将使多角体蛋白 基因失活，产生没有外壳蛋白包被的重组病毒。然后使用重组病毒感 染草地夜蛾细胞或银纹夜蛾，在其中表达GIP类似物或杂合多肽(Smith 等，J.Virol.46：584(1983)；Engelhard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91： 3224-7(1994))。
在另一个实施例中，可通过PCR扩增编码GIP多肽的DNA序列， 并将其克隆入合适的载体中，例如pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway， New Jersey)。pGEX载体用于生产融合蛋白，其包含由载体编码的谷 胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入到载体克隆位点中的DNA片段编码 的蛋白。可生产含例如合适切割位点的PCR引物。然后可由融合蛋白 的GST部分切割重组融合蛋白。将pGEX-3X/GIP类似物多肽构建体 转化入大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，La Jolla，California)中， 分离单个转化子，并在LB培养基(补加羧苄青霉素)中于37℃培养至 600nm波长的光密度为0.4，接着在0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳 糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)存在下再温育4小时。 纯化单个转化子的质粒DNA，并使用自动化测序仪部分测序，以确认 存在正确方向的目的GIP多肽编码基因插入片段。
可如下纯化预期可作为不溶性包涵体在细菌中生产的融合蛋白。 通过离心收集细胞；用0.15M NaCl、10mM Tris(pH 8)、1mM EDTA 清洗；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于室温处理15分 钟。超声澄清裂解物，通过以12,000×g离心10分钟沉淀细胞碎片。 将含融合蛋白的沉淀重悬浮在50mM Tris(pH 8)和10mM EDTA中， 经50％甘油分层，并以6000×g离心30分钟。沉淀重悬浮在无Mg++ 和Ca++的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在变性SDS聚丙烯酰胺 凝胶中分级分离重悬浮沉淀，进一步纯化融合蛋白(Sambrook等，出 处同上)。凝胶浸泡在0.4M KCl中，以显现蛋白，切下蛋白，并在没 有SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST/GIP多肽多肽融合蛋 白在细菌中作为可溶性蛋白生产，则其可使用GST纯化模块(Pharmacia Biotech)纯化。
融合蛋白可经历消化，以切开GST和成熟的GIP类似物或杂合 多肽。消化反应物(20-40μg融合蛋白、20-30单位人凝血酶(4000U/mg (Sigma)的0.5mL PBS溶液)于室温温育16-48小时，并加入变性SDS- PAGE凝胶，以分级分离反应产物。将凝胶浸泡在0.4M KCl中，以 显现蛋白条带。使用自动化测序仪(Applied Biosystems 473A型，Foster City，California)，通过部分氨基酸序列分析，可确认对应于GIP类似 物或杂合多肽预期分子量的蛋白条带的同一性。
在特别示例性的本发明GIP多肽重组表达方法中，可通过磷酸钙 法，用在pCMV载体(5′CMV启动子，3′HGH聚腺苷酸序列)中含GIP 类似物或杂合多肽cDNA的质粒和pSV2neo(含neo抗性基因)共转染 293细胞。优选地，载体应当在转染前用ScaI线性化。同样，可使用 替代性构建物，其使用相似的pCMV载体，具有掺入的neo基因。通 过在含0.5mg/mL G418(新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释 10-14天，由单细胞克隆选择稳定细胞系。通过ELISA或蛋白印迹， 筛选细胞系的GIP类似物或杂合多肽表达，并扩增高表达细胞系，以 用于大规模生长。
优选地，将转化细胞用于长期、高产的蛋白生产，因此需要稳定 表达。一旦应用含选择标记以及所需表达盒的载体转化这样的细胞， 就可使细胞在营养培养基中生长1-2天，然后将其转换至选择培养基。 选择标记用于赋予选择抗性，它的存在使得成功表达导入序列的细胞 可生长和回收。可使用适于该细胞的组织培养技术，增殖稳定转化细 胞的抗性簇(Resistant clumps)。
可使用多种选择系统回收已转化用于重组蛋白生产的细胞。这样 的选择系统包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸 苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移 酶基因。另外，抗代谢抗性可用作dhfr、gpt、neo、also和hygro的选 择基础，所述dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性，所述gpt赋予对霉酚酸的 抗性，所述neo赋予对氨基糖苷G418的抗性，所述also赋予对氯磺 隆的抗性，而所述hygro赋予对潮霉素的抗性。其它可使用的选择基 因包括trpB或hisD，所述trpB允许细胞利用吲哚代替色氨酸，所述 hisD允许细胞利用组氨醇代替组氨酸。产生用于鉴别转化子的目测指 示的标记包括花色素苷、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其 底物荧光素。
可使用自动化肽合成和重组技术二者的组合生产本发明的多种 GIP多肽。例如，本发明的GIP多肽可包含PEG化和修饰的组合，包 括缺失、置换和插入。这样的杂合多肽可分阶段生产。在第一阶段， 可通过所述的重组技术生产含缺失、置换、插入及其任意组合的修饰 的中间体GIP多肽。接着，在如下所述的任选纯化步骤后，通过用合 适的PEG化试剂(例如得自Nectar Transforming Therapeutics，San Carlos，California)，通过化学修饰PEG化中间体GIP多肽，以产生 所需GIP多肽。本领域技术人员会认识到，上述步骤可推广应用于含 修饰组合的GIP多肽，所述修饰选自缺失、置换、插入、衍生化以及 本领域众所周知和本发明设想的其它修饰手段。
可能需要纯化本发明生产的GIP多肽。肽纯化技术是本领域技术 人员众所周知的。这些技术包括在一个水平上将细胞环境粗分离为多 肽和非多肽级分。在将多肽及其它蛋白分离后，可使用层析和电泳技 术进一步纯化目的多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至均一)。特 别适合于纯肽制备的分析方法是离子交换层析、排阻层析、聚丙烯酰 胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化法是反相HPLC，接着通 过液相色谱/质谱法(LC/MS)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱 法特征鉴定纯化产物。通过确定氨基酸分析结果获得对纯度的额外证 实。
本发明的某些方面涉及编码的蛋白或肽的纯化，在具体的实施方 案中，涉及编码的蛋白或肽的大致纯化。本文使用的术语“纯化的肽” 意指可与其它组分分离的组合物，其中所述肽相对于其天然可获得的 状态被纯化至一定的程度。因此，纯化的肽还指脱离其可能天然存在 的环境的肽。
一般地讲，“纯化的”指已经过分级分离而去除各种其它组分的 肽组合物，该组合物基本保留了其表达的生物活性。在使用术语“大 致纯化的”时，该名称指其中肽构成组合物主要组分的组合物，例如 在组合物中肽占约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％ 或更高。
适用于肽纯化的各种技术是本领域技术人员众所周知的。这些技 术包括用例如硫酸铵、PEG、抗体等；热变性后离心；层析步骤，例 如离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析、羟磷灰石层析和亲和层 析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术及其它技术的组合。如本领 域一般所已知的，相信可改变进行各种纯化步骤的顺序，或可省略某 些步骤，仍可得到用于制备基本纯化的蛋白或肽的方法。
一般不要求肽总是以其最纯状态提供。实际上，设想在某些实施 方案中使用纯化程度较小的产物。通过使用较少纯化步骤的组合，或 利用不同形式的相同通用纯化流程，可实现部分纯化。例如，人们意 识到，使用HPLC装置进行的阳离子交换柱层析一般产生比使用低压 层析系统的相同技术更高“倍”的纯化。具有较低程度的相对纯化的 方法在蛋白产物总回收率或保持表达蛋白活性方面可能具有优势。
可任选地纯化和分离GIP多肽和由该方法获得的其它组分。纯化 多肽的方法可见于美国专利第5,849,883号。这些文件描述了分离和 纯化G-CSF组合物的具体示例性方法，这些方法可用于分离和纯化本 发明的GIP多肽。在已知这些专利公开内容的情况下，本领域技术人 员显然会意识到，可使用各种纯化技术由给定的来源纯化GIP多肽。
另外，设想可使用阴离子交换和免疫亲和层析的组合生产本发明 的纯化的GIP多肽组合物。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含治疗或预防有效量的至少一种 本发明GIP多肽或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂、 防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或用于传递GIP多肽的载体。这样 的组合物可包括：各种缓冲内容物(例如醋酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐， 磷酸盐，Tris-HCl)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如表面活性 剂和增溶剂(例如，去水山梨糖醇单油酸酯，卵磷脂，Pluronics，吐温 20&80、Polysorbate 20&80，丙二醇，乙醇，PEG-40，十二烷基硫 酸钠)、抗氧化剂(例如，单硫代甘油，抗坏血酸，乙酰基半胱氨酸， 亚硫酸盐(重亚硫酸盐和偏亚硫酸氢盐))、防腐剂(例如，苯酚，间甲酚， 苯甲醇，对羟苯甲酸酯(对羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸丙酯，对羟苯甲 酸丁酯)，苯扎氯铵，三氯叔丁醇，thimersol，苯基汞盐(醋酸盐，硼 酸盐，硝酸盐))，和张力剂/填充剂(甘油，氯化钠，甘露醇，蔗糖，海 藻糖，葡萄糖)；将材料掺入到特定聚合化合物制品中，例如聚乳酸、 聚乙醇酸等；或与脂质体结合。这样的组合物将影响本发明GIP类似 物多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例 如Remington′s Pharmaceutical Sciences 1435-712，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990)。
任选地，GIP或新的GIP类似物可以与第二种活性剂一起配制(或 者，在与第二种活性剂的辅助疗法中施用，或者，与共价连接或融合 的第二种活性剂一起施用)。这样的试剂具有会补充或增强GIP作用 的活性。在一个实施方案中，这样的试剂具有葡萄糖降低活性或抗糖 尿病的活性。在另一个实施方案中，所述试剂会抑制或减少胃排空。 在其它实施方案中，所述试剂可以具有任何其它希望的活性，例如增 加骨密度，减少食物摄取等。
一般来说，本发明GIP类似物和杂合多肽的使用方式可以和鉴于 GIP和/或单个组分多肽(在杂合体的情况下)的药理学特性而使用它们 的方式相同。通常，外周施用GIP多肽，用于治疗或预防代谢状况和 病症。具体地说，本发明化合物具有作为降糖剂、促胰岛素剂、减少 或抑制胃分泌、实现体重减轻、减少营养物利用度、减少食物摄取、 抑制食欲、改善病危(重症)监护应用的发病率和死亡率、提供提高的 记忆及其它神经学益处、增加或维持骨密度、实现心血管益处、提供 心脏保护、和实现本文讨论的其它治疗益处的活性。在另一个实施方 案中，一个示例性的用途是施用这样的杂合多肽，用于治疗糖尿病或 糖尿病相关状况和病症，肥胖，和心血管疾病和状况。本发明的GIP 多肽可配制用于外周给药，包括配制用于注射、口服给药、鼻给药、 肺给药、局部给药或本领域技术人员了解的其它给药类型。更具体地 说，可通过任何普通途径施用本发明的药物组合物，只要经过该途径 可到达靶组织。在一个示例性的实施方案中，可通过任何常规外周方 法，例如通过静脉内、皮内、肌肉内、皮下、乳房内、腹膜内、鞘内、 眼球后、肺内(例如末端释放)；通过口服、舌下、鼻、颊、气管内、 肛门、阴道、透粘膜、肺或透皮递送，通过栓剂或通过在特定部位手 术植入，将药物组合物导入到受试者中。在一个实施方案中，给药是 肠胃外的(包括静脉内，皮内，腹膜内，肌肉内和皮下)。
治疗可由一段时间内的单剂量或多剂量组成。还设想了可控持续 释放本发明的组合物。
也可以在组合物中掺入补充性活性成分。对于医师的使用，化合 物提供在剂量单位形式中，所述形式含有一定量的GIP或新的GIP类 似物，有或没有另一种治疗剂，例如，降糖剂，胃排空调控剂，降脂 剂，或食物摄取抑制剂。用于例如控制血糖或控制胃排空和有益地减 慢或调节胃排空的状况的GIP或新的GIP类似物的治疗有效量，是能 降低餐后血糖水平的量，优选地降低至不超过约8或9mM，或根据 需要降低血糖水平。在糖尿病的或葡萄糖不耐受的个体中，血糖水平 高于正常个体。在这样的个体中，可以得到有益的餐后血糖水平降低 或″平滑″。本领域技术人员会认识到，治疗剂的有效量随许多因素而 变化，包括患者的身体状况，血糖水平或要达到的胃排空的抑制水平， 或希望的食物摄取降低水平，及其它因素。在有些情况下，可以方便 地提供GIP多肽和至少一种其它的活性剂，例如另一种食物摄取减少 剂、降糖剂或血脂改变剂，例如毒蜥外泌肽或GLP1或其激动剂，胰 淀素，胰淀素激动剂类似物，CCK或CCK激动剂，或瘦蛋白或瘦蛋 白激动剂或小分子大麻素CB1受体拮抗剂，β-羟基甾族化合物脱氢酶 -1抑制剂，西布曲明和销售的用于治疗糖尿病或肥胖的其它药物，它 们在用于一起施用的单一组合物或溶液中。如本文已经讨论的，GIP 多肽可以是包含至少一种其它这样的活性剂的GIP杂合体。在其它情 况下，可以更有利地施用与所述GIP多肽分开的其它试剂。
在一个实施方案中，GIP多肽可单独地施用，或与一种或多种其 它化合物和组合物一起施用，所述其它化合物和组合物对降低血糖、 减少或抑制胃排空或减少或抑制胃分泌、或降低营养物利用度具有长 期或短期作用，包括但不限于含胰淀素或胰淀素类似物激动剂、鲑鱼 降钙素、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白)或瘦蛋白 激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂或者GLP-1或GLP-1 类似物激动剂的其它化合物和组合物。合适的胰淀素激动剂包括例如 [25，28，29Pro-]人胰淀素(也称为“普兰林肽”，描述于美国专利第5,686,511 和5,998,367号)。使用的CCK优选为CCK八肽(CCK-8)，更优选它 的硫酸化形式。瘦蛋白论述于例如(Pelleymounter等，Science 269：540-3 (1995)；Halaas等，Science 269：543-6(1995)；Campfield等，Science 269：546-9(1995))。合适的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌 肽-4，毒蜥外泌肽激动剂化合物包括例如描述于PCT公开WO 99/07404、WO 99/25727和WO 99/25728的化合物。合适的试剂也包 括各种抗糖尿病剂，例如二甲双胍，磺脲，TZD。在另一个实施方案 中，提供了GIP类似物或杂合体(例如0601GIP3794)与肠降血糖素 模拟物(例如，exenatide或liraglutide)的联合治疗。在另一个实施 方案中，使用亚治疗剂量的肠降血糖素模拟物，当与GIP化合物相组 合时，它提供治疗益处。
因此，在一个实施方案中，尤其在具有与升高的葡萄糖水平有关 的状况的患者中，如糖尿病的或葡萄糖不耐受的个体，更尤其是2型 糖尿病患者，其中血糖水平高于正常个体，这样个体中的GIP治疗会 从施用GIP或新的GIP类似物之前或同时的餐后血糖水平的有益降低 或″平滑″获益。
与GLP-1、GLP-1类似物和模拟物(例如已经证实可以有效地控 制2型糖尿病患者的葡萄糖水平的exenatide)不同，与正常个体相比， 糖尿病受试者中GIP的促胰岛素作用显著减少。不受理论的约束，认 为尽管在持续的高血糖症过程中减弱了GIP的肠降血糖素效应，一旦 提高了这些个体中的葡萄糖控制，GIP或它的类似物会以与它们在正 常受试者中的作用类似的效力在糖尿病患者中起作用。因而，根据本 发明，通过适当的试剂或措施，在施用GIP或新的GIP类似物之前或 同时，在需要的患者中实现葡萄糖降低或餐后血糖水平的减少或“平 滑”，可以降低GIP不敏感性，所述GIP或新的GIP类似物会实现或 延长甚至进一步的葡萄糖降低。在一个实施方案中，在施用GIP之前 至少一天，提供所述试剂或措施。在另一个实施方案中，提供所述试 剂或措施，并在施用GIP之前观察到足够的葡萄糖降低。
本文所述合适的试剂包括exenatide，二甲双胍，磺脲，或其组合。 通过本领域医师已知的方式，可以测量基本的葡萄糖控制端点。一种 方法是简单地测定餐后血糖水平。另一种方法是测量HbAlc水平，如 本领域已知的。
特别合适的目标群体是在降糖剂(例如exenatide)治疗过程中不能 达到正常葡萄糖浓度的那些患者。当葡萄糖结合血红蛋白时，会形成 一类称作血红蛋白Alc(HbAlc)的血红蛋白。这仅仅发生在血糖水平 较高时。血红蛋白Alc水平可以用于测量受试者的既往平均血糖，例 如2-3个月。非糖尿病人的正常HbAlc值是约4.0-6.2％。美国糖尿病 人联合会推荐，对于糖尿病人，它应答低于7％，以使糖尿病并发症 最小化。尽管有降低葡萄糖的治疗(例如exenatide)，大量患者仍然 保持升高的HblAc。结果，在一个实施方案中，他们的HbAlc水平(尽 管有降糖剂的治疗)保持超过正常值至少7％、至少8％、至少9％或 至少10％的受试者，是GIP治疗和本发明的新的辅助疗法治疗的合适 的受试者。在另一个实施方案中，HblAc水平高于正常值，但是不超 过6.5％、不超过7％、不超过7.5％、不超过8.0％、不超过8.5％、不 超过9.0％、不超过9.5％、或不超过10％。在另一个实施方案中，当 用单一疗法没有将HblAc水平降低至正常水平时，优选地从GIP给 药或应用本发明的新的辅助疗法之前的治疗前水平降低至少10％、至 少20％、至少30％、40％、50％、60％、70％、80或至少90％。在 这样的患者中，根据本发明适用GIP辅助疗法，因为在治疗的患者(例 如糖尿病患者)中高血糖症的减少(例如，通过exenatide)，平衡了降 低的GIP不敏感性的患者。尽管2型糖尿病患者的慢性高血糖状况会 减弱GIP的促胰岛素应答，源自exenatide治疗的提高的血糖控制会 例如恢复胰腺β-细胞对GIP刺激的应答性。因此，GIP治疗、或药理 学剂量的GIP或新的GIP类似物与exenatide(或其它降糖剂，或会降 低葡萄糖或减少或抑制胃排空的试剂或方法)的新辅助疗法(例如共同 给药，GIP杂合体，GIP融合蛋白)，会达到GIP敏感性，并在糖尿病 患者或经受与升高的葡萄糖有关的状况的患者中导致希望的血糖量正 常。由于GIP缺少GLP1的胃排空作用，可以避免恶心，从而允许使 用比GLP1更高的GIP给药方案。在另一个实施方案中，GIP治疗或 新的辅助疗法会将HblAc水平降低至至少正常水平，或从治疗前(GIP 治疗前或新辅助疗法前)水平降低至少10％、至少20％、至少30％、 40％、50％、60％、70％、80或至少90％。
在另一个实施方案中，GIP治疗或新的辅助疗法可以至少累加地、 优选协同地起作用，以减少与本文所述另一种试剂有关的治疗的剂 量、给药、量、频率、或范围。例如，这样的GIP或新的辅助疗法可 以使与其它试剂有关的治疗的量、剂量、给药频率或长度减少至少10 ％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80或90％。所述试剂可 以是降糖剂，例如毒蜥外泌肽-4或任何其它试剂，其用于糖尿病或可 从本发明所述方法和组合物获益的其它状况。
可制备本发明的GIP多肽，作为与表面活性剂(例如，去水山梨 糖醇单油酸酯，聚氧乙烯去水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)，聚氧乙 烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)，卵磷脂，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚 物(Pluronics)，羟丙基纤维素)或络合剂(例如，羟丙基-b-环糊精，硫丁 醚-b-环糊精(Captisol)，聚乙烯吡咯烷酮)适当混合的游离碱或药学上 可接受盐的水溶液施用。药学上可接受盐包括酸加成盐(与蛋白的游离 氨基形成)，其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如醋酸、草酸、 酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐还可来源于无机碱(例 如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例 如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。这样的产物易于通过本领 域技术人员众所周知的方法制备。还可以制备在甘油、液体聚乙二醇 及其混合物和油中的分散液。在一般的储存和使用条件下，这些制品 包含防腐剂，以防止微生物生长。
在一个实施方案中，配制本发明的药学组合物以适于胃肠外施 用，例如通过注射或输注施用。优选地，GIP多肽悬浮在水性载体中， 例如在pH约3.0至约8.0的缓冲溶液中，优选pH在约3.5-约7.4，约 3.5-约6.0，约3.5-约5.0或约3.7-约4.7。有用的缓冲液包括醋酸钠/醋 酸，乳酸钠/乳酸，抗坏血酸酸，柠檬酸钠/柠檬酸，碳酸氢钠/碳酸， 琥珀酸钠/琥珀酸，组氨酸，苯甲酸钠/苯甲酸，和磷酸钠以及Tris(羟 甲基)氨基甲烷。可使用一种储存或“贮存”缓释的制剂形式，以在经 皮注射或传递后的数小时或数天内，将治疗有效量的制剂传递入血流 中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散液和用于即 时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。就一切情况而论，剂型应 当是无菌的，流动性应达到保持易注射能力的程度。还需要本发明的 GIP多肽在生产和储存条件下是稳定的，其必须防腐，以对抗微生物(例 如细菌和真菌)的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，包含例如水、 乙醇、多元醇(例如，山梨糖醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、 二甲基乙酰胺、cremorphor EL、其合适的混合物以及植物油(例如， 大豆油，芝麻油，castor，棉籽油，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯， glycofurol，玉米油)。可保持适当的流动性，例如通过使用包衣剂(例 如卵磷脂)、在分散液情况下通过保持所需颗粒大小和使用表面活性 剂。可利用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如间甲酚，苯甲醇，对羟苯 甲酸酯(对羟苯甲酸甲酯，对羟苯甲酸丙酯，对羟苯甲酸丁酯)，三氯 叔丁醇，苯酚，苯基汞盐(醋酸盐，硼酸盐，硝酸盐)，山梨酸，硫柳 汞等，达到对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包含张度剂(例 如糖或氯化钠)。通过在组合物中使用吸收延迟剂(例如一硬脂酸铝和 明胶)，可实现可注射组合物的延长吸收。
可通过向合适溶剂中加入需要量的活性化合物，以及根据需要加 入以上列举的各种其它成分，接着过滤除菌，制备无菌注射溶液。一 般来说，通过将各种无菌活性成分加入到无菌载体中制备分散液，所 述无菌载体含有基础分散介质和以上列举物质中的所需其它成分。对 于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，示例性的制备方法是真空干 燥和冷冻干燥技术，产生来自其先前除菌过滤的溶液的活性成分和任 何其它需要成分的粉末。
一般来说，根据受者的年龄、体重以及疾病或代谢状况或病症的 情况或严重性，确定本发明GIP多肽的治疗或预防有效量。参见例如 Remington′s Pharmaceutical Sciences 697-773。另参见Wang和Hanson， Parenteral Formulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，附录42：2S(1988)。通常，可使用约0.001μg/kg体重 /天至约1000μg/kg体重/天的剂量，但熟练医师认识到，可使用更大 或更小的剂量。给药可为每日1、2、3、4次或多次，或频率更低， 例如每周1次、每月1次、或每季1次，这取决于制剂，且可与本文 描述的其它组合物联合施用。应当指出，本发明不限于本文提及的剂 量。
可通过使用已确立的测定代谢状况或病症水平的实验连同相关的 剂量-反应数据，确定合适的剂量。最终的给药方案由主治医师考虑改 变药物作用的因素来确定，这些因素例如为药物的具体活性，损伤的 严重性和患者的反应性，患者的年龄、身体状况、体重、性别和饮食， 任何感染的严重性，给药时间及其它临床因素。随着研究的进行，将 显露出关于具体疾病和病症的合适剂量水平和治疗时程的进一步信 息。
对于50kg患者，有效剂量通常为约0.5-30μg至约5mg/天、优 选约10-30μg至约2mg/天、更优选约5-100μg至约约1mg/天、最 优选约5μg至约500μg/天，以单剂量或分剂量和/或控制连续释放施 用2、3、4或多次。在一个实施方案中，以每天约0.5μg-约5mg的 剂量，以单剂量或分剂量或控制连续释放外周施用GIP化合物，或以 每剂量约0.01μg/kg-约500μg/kg，更优选约0.05μg/kg-约250μg/kg， 最优选低于约50μg/kg。
因此，从一天要施用的药量和一天施用的给药次数，可以衍生出 示例性的剂量。例如，示例性的剂量可以是约0.125μg/剂(一天施用4 次，共0.5μg)至约2mg/剂(一天施用1次，共2mg)。其它剂量可以 是约0.01-约100μg/kg/剂。要施用的确切剂量可由本领域技术人员确 定，其取决于具体化合物的效力，以及个体的年龄、体重和状况。施 用应当在需要治疗益处(例如抑制营养物利用度、食物摄取、体重减 轻或控制、血糖或血浆脂质降低或调节)的时候开始，例如，在病症 最初有征兆的时候或在诊断出肥胖、糖尿病或胰岛素抵抗综合症后不 久开始。在一个实施方案中，预防性地施用GIP化合物。可通过任何 途径施用，例如注射(优选皮下或肌内注射)、口服、鼻、透皮等。由 于生物利用度降低，用于某些途径(例如口服给药)的剂量可增加，例 如增加约5-100倍。
通常，可以将GIP化合物配制成稳定的、安全的药物组合物，以 施用给患者。预见到用于本发明的方法中的药物制剂可以包含约0.01- 20％(w/v)、优选0.05-10％的GIP化合物。GIP化合物可以是在醋酸盐、 磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲液中，使最终组合物的pH是约3.0- 约7.0；其含有碳水化合物或多元醇作为张力调节剂，和任选的约0.005 -5.0％(w/v)的选自下组的防腐剂：间甲酚，苯甲醇，对羟基苯甲酸甲 酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，和 苯酚。如果要将配制的肽包含在多用产品中，通常包含这样的防腐剂。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的药物制剂可以含有 一定浓度范围的GIP化合物，在该实施方案中，例如，约0.01％-约98％ w/w，或约1-约98％w/w，或优选80％-90％w/w，或优选约0.01％-约 50％w/w，或更优选约10％-约25％w/w。可以用足够量的注射用水得 到需要的溶液浓度。可以低压冻干本文所述的药物制剂。示例性的制 剂可以是1mg/mL GIP化合物在10mM醋酸钠缓冲溶液中，pH 4.2， 含有9.3％蔗糖作为渗透压调节剂。
在一个实施方案中，在要胃肠外施用药用制剂时，配制组合物， 以便传递0.1μg/kg至100mg/kg体重/天的GIP多肽剂量，优选1mg/kg 至约50mg/kg体重/天的剂量。示例性的每天量可以在下限2，5，10， 20，40，60或80至上限80100，150，200，或250的范围内。可用 初始快速推注、接着持续输注，进行胃肠外施用，以保持药品的治疗 循环水平。本领域一般技术人员易于优化有效剂量和施用方案，这可 根据良好医疗规范和个体患者的临床病症确定。
给药频率取决于药物的药代动力学参数和施用途径。本领域技术 人员可根据施用途径和需要的剂量确定最佳的药物剂型。参见例如 Remington′s Pharmaceutical Sciences，出处同上，1435-1712页。这样 的剂型可影响施用药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清 除速率。根据施用途径，可按照体重、体表面积或器官大小计算合适 的剂量。本领域一般技术人员不需要过多实验，即可常规作出确定合 适治疗剂量必需的更精细计算，尤其是在依据本文公开的剂量信息和 实验以及在动物或人体临床实验中观察到药代动力学数据的情况下。
在一个实施方案中，本发明的制剂是液体、固体或半固体贮藏、 缓释或连续释放制剂，其能经至少1小时的时间段，递送本发明的一 种活性成分(或多种活性成分，如用于本文所述的附加治疗中)。释放 可以发生24小时至4个月。在有些实施方案中，这样的缓释或延迟 释放制剂可以包含活性成分，后者是缓慢溶解形式或制剂，例如缓慢 溶解肽晶体(例如公开在，例如，美国专利号6,380,357)，在基质中， 或在包衣中，例如，肠溶包衣或缓慢溶解包衣(例如，活性成分的包衣 颗粒)。缓释基质通常是可生物降解的聚合物，不可生物降解的聚合物， 蜡，脂肪材料等，且是本领域已知的(例如，参见美国专利号6,368,630 和相关专利6,379,704和相关专利)。另外，通过制备聚合微胶囊、基 质、溶液、植入物和装置，并肠胃外地施用它们或通过手术方式，可 以实现肠胃外控释递送。由于有些肽包埋在聚合物基质或装置中，这 些剂型通常具有更低的生物利用度(参见例如，美国专利号6,379,704， 6,379,703，和6,296,842)。
如本文讨论的，当用于治疗尤其是与升高的葡萄糖有关的状况 时，和进一步当用于辅助疗法中时，本领域普通技术人员可以容易地 确定本发明的GIP或新的GIP类似物的频率、时机和剂量。例如，可 以首先确定目标试剂的葡萄糖降低效应随时间的剂量-应答关系，然后 确定加入的GIP或新的GIP类似物关于为其它试剂选择的剂量的剂量 -应答关系。在一个实施例中，在分开的几天，在过夜空腹后随机皮下 注射安慰剂和不同量的试剂之后，治疗并评估2型糖尿病患者，注射 后，立即摄入标准化的Sustacal餐(7kcal/kg)，然后在随后的300分 钟内，以频繁的间隔收集血糖样品。可以将Glycemic应答定量为5小 时时间段内血糖浓度的时间-加权平均(±SE)变化。测定葡萄糖降低作 用的ED50，选择会降低餐后血糖浓度的合适试剂剂量。随后，在类似 的研究中，将该剂量施用给患者，同时施用不同剂量的GIP或新的GIP 类似物，以便确定会与第一种试剂协同作用的GIP合适剂量，以进一 步降低或延长葡萄糖降低。
此外，如果需要，检查相对于施用第一种试剂的时间和持续时间、 施用GIP给药的时机，以便鉴别最佳给药方案。例如，exenatide的剂 量可以在第1天施用，随后在第2天施用GIP，优选地在观察到单独 的exenatide导致的葡萄糖降低反应时。在另一个实施方案中，提供了 与GIP给药交替的试剂给药。所述试剂可以与GIP给药交替地间隔一 定时间段施用。所述时间段可以是1、2，3，4，5，6，或7天，1，2， 3，或4周，或1、2，3，4，5或6个月。所述时间段可以变化，例 如在试剂后2天进行GIP给药，并在GIP治疗后7天进行试剂给药。 持续释放制剂或方法会延长每种情况下的时间段。此外，可以将GIP 或新的GIP类似物提供在与β细胞新生治疗或胰岛或β细胞移植的辅 助疗法中(或在停止β细胞新生治疗或胰岛或β细胞移植后)，其中β细 胞的数量增加，从而提供治疗后的葡萄糖降低。结果，在一个实施方 案中，这样的治疗尽管没有完全建立血糖量正常，但是会给患者提供 充分降低的葡萄糖水平，减弱对GIP的抗性，从而在餐后达到进一步 的或更正常的葡萄糖水平。
在一个实施方案中，在开始GIP给药之前至少24小时，已经施 用试剂或已经应用所述方法。更具体地，间隔时间段可以是24，36， 48，60或72小时至4，5，6，7或更多天，至2，3，4，5，6或更多 周，或上述范围内以小时或分钟计的任意特定间隔时间。或者，可以 如本领域已知的，施用本领域众所周知的方法，在施用试剂过程中和/ 或之后，常规地或餐后监视血糖水平，以测量降糖剂的效果。然后， 可以在受试者表现出指示降低的对GIP的抗性反应水平(例如，血糖 水平)时，施用GIP，在该时刻或之后，可以施用GIP或新的GIP类 似物。
如本文讨论的，在与GIP或新的GIP类似物的辅助疗法的另一个 实施方案中，治疗包含会减慢向十二指肠(或其它更远的营养感知GIP- 分泌部位)供给营养物的试剂或方法，导致与没有该试剂或方法相比， 降低葡萄糖水平。在另一个实施方案中，辅助疗法包含会减慢胃排空 的试剂或方法。除了例如本文所述的粘度减慢剂(例如，糖和纤维)之 外，试剂包括胃排空的药理学减慢剂，并包括对其而言胃减慢是一个 生理事件的肠激素。这样的试剂包括胰淀素的激动剂(例如普兰林肽)， GLP1和毒蜥外泌肽的激动剂(例如exenatide，NN2211，ZP-10. liraglutide)，CCK的激动剂，PYY的激动剂，胰泌素的激动剂，GRP 的激动剂，神经调节肽的激动剂，和尿皮质激素的激动剂。在其它实 施方案中，是会直接或间接促进生理胃减慢剂的激动剂信号传递的试 剂。这样的试剂包括内源胃减慢剂的促分泌剂，和它们的降解酶的抑 制剂，包括二肽基二肽酶抑制剂，或它们的清除(尤其在肾中)的其 它抑制剂。在其它实施方案中，是会减慢在GIP-分泌细胞处营养物刺 激的出现的治疗策略。实例包括通过抑制消化剂分泌(例如胃酸，胰酶， 胆汁)或通过抑制这种分泌的消化作用(例如酸中和，酶抑制，胆汁隔 离)，调控消化功能。抑制消化剂分泌可以通过直接达到该目的的试剂 (例如生长抑素，胰淀素，降钙素，PYY)或通过干扰内源促分泌途径 的试剂(例如腔CCK-释放因子)来实现。在一个实施方案中，辅助疗法 包含会减慢胃排空和减少营养物摄入的方法，例如减少在GIP分泌细 胞处的营养物驱动力。在一个这样的实施方案中，是胃分流手术，例 如Roux-En-Y胃分流手术，束胃带，或从十二指肠物理地转移营养 物流的物理装置。
在其它实施方案中，辅助疗法包含会刺激胃减慢剂的分泌或减慢 胃减慢剂的降解的方法。所述的瓜儿胶摄入是一个实例，例如每餐10 克瓜尔胶粉。另一种试剂是黄原胶。营养物吸收的其它减慢剂包括纤 维，例如提供在高纤维饮食中，和作为面包中的粗纤维，和糠。另一 种试剂是糖苷酶抑制剂，例如阿卡波糖，它会减慢肠刷状缘二糖酶从 蔗糖产生葡萄糖(和果糖)的速率。另一种试剂是米格列醇，即另一种 糖苷酶抑制剂。
在另一个实施方案中，通过施用肽或肽激动剂来实现或介导胃排 空。基于大鼠，已经确定了下述肽剂量来减慢胃排空，并完全适用作 本发明的附加治疗的试剂：胰淀素(例如，普兰林肽剂量为60-600μg/ 天)；GLP1或毒蜥外泌肽激动剂(例如，exenatide剂量为10-50μg/天)； CCK和激动剂(参见Young等“Dose-responses for the slowing of gastric emptying in a rodent model by glucagon-like peptide(7-36)NH2，amylin， cholecystokinin，and other possible regulators of nutrient uptake.” Metabolism 451-3(1996)；在本文中引作参考)。其它试剂包括胰泌素和 激动剂，CGRP和激动剂，神经调节肽激动剂，尿皮质激素激动剂， GRP和铃蟾肽激动剂，和PYY和激动剂。
在本文的实施方案中，定义剂量的一种方法可以是基于希望的减 慢程度，这可以容易地确定。例如，普兰林肽的治疗剂量(30，60，90μg； 参见Kong等″The effect of single doses of pramlintide on gastric emptying of two meals in men with IDDM.″Diabetologia.41577- 583(1998))约是胃半排空时间的2倍。因此，在一个实施方案中，辅 助疗法包含会使胃半排空时间增加约200％的试剂或方法，但是在其 它实施方案中，可以使胃半排空时间增加超过约25％、50％、75％、 100％、200％、300％和甚至400％或更多。
作为实例，已经报道exenatide减慢胃排空的ED50是约 0.05μg/kg(例如，大致目前使用的临床剂量)(参见Kolterman等 “Dose-response for inhibition of glucagon secretion and gastric emptying by synthetic毒蜥外泌肽-4(AC2993)in subjects with type 2 diabetes.” Diabetes 49(suppl 1)A114 Abstract 460-P(2000))。在与GIP或新的GIP 类似物的辅助疗法中，这样的减慢会为受试者提供增加的益处。结果， 在一个实施方案中，在药学上可接受的剂量提供等价胃排空减慢的试 剂或方法，是合适的试剂或方法。如本文讨论的，辅助疗法的其它实 施方案包含哺乳动物胰淀素，(25，28，29)脯氨酸-人胰淀素类似物(普 兰林肽)，和鲑鱼降钙素，它们属于最有效的。其它合适的肽和它们的 EC50(EC(50)Nmol/kg_sem(EC(50)in μg)：普兰林肽，0.09_0.08log (0.07μg)；人胰淀素，0.19_0.11log(0.15μg)；大鼠胰淀素，023_0.08 log(0.18μg)；鲑鱼降钙素，0.28_0.07 log(0.19μg)；大鼠降钙素，0.94 _0.18 log(0.64μg)；大鼠CGRP，2.13_0.29 log(1.62μg)；GLP-1(7-36) NH2，2.76_0.12 log(1.82μg)；胰泌素，3.09_0.20 log(1.87μg)； CCK-8，12.8_0.20 log(2.93μg)；胃泌素释放肽，49.9_0.05 log(28.5μg) (参见Gedulin等″Comparison of 21 peptides on inhibition of gastric emptying in conscious rats.″Dig.Dis.Week.A742(abstract 2967) (1996)；该研究报道了21种肽在有意识大鼠的剂量-反应研究in(n＝约 18只大鼠/肽，大鼠重量约200g)中调控胃排空的效力和效果。皮下注 射肽，5分钟后，强饲acaloric染料标记的甲基纤维素凝胶。20分钟 后处死动物，分光法测量胃的染料含量，以评估排空。发现仅10种 肽在最高达100ug/大鼠的剂量会完全抑制胃排空。发现在100μg的剂 量微弱活性或无活性的肽，是血管活性肠肽(VIP)，抑胃肽(GIP)，胰 多肽，神经肽Y，胰高血糖素，胰岛素(如果血糖维持恒定)，胃泌素， 生长抑素，垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)，肾上腺髓质素和去 酰胺基的普兰林肽)。在本发明的其它实施方案中，试剂包含本文所述 任一种肽的激动剂，例如抗体或抗体片段激动剂或小分子激动剂。
如本文所述，这样的试剂(或它们的组合)可以分开地或与GIP一 起施用，或可以包含含有GIP的嵌合分子，例如，化学地连接或重组 的融合体。如本文所述(例如，参见本文所述的时间和时间段)，当分 开施用时，GIP可以在施用试剂或方法之后指定的时间点施用，或可 以在已经通过先前施用试剂或方法得到希望的效果(这样的效果与减 少受试者的GIP抗性有关)之时或之后不久施用。
要认识到，本发明的药物组合物和治疗方法可用于人类医药和兽 医领域。因此，要治疗的受试者可为哺乳动物，优选为人或其它动物。 对于兽用目的，受试者包括例如家畜(包括牛、绵羊、猪、马和山羊)、 宠物(例如狗和猫)、外来动物和/或动物园动物、实验室动物(包括小鼠、 大鼠、兔、豚鼠和仓鼠)；以及家禽(例如鸡、火鸡、鸭和鹅)。
另外，本发明包括一种试剂盒，其包含本发明的GIP类似物或杂 合多肽、适于制备所述本发明GIP化合物多肽的组分、和使用用于药 物用途的GIP化合物多肽和组分的说明书。
为帮助理解本发明，纳入以下的实施例。涉及本发明的实施例当 然不应当被解释为对本发明的具体限制，现在已知或以后开发的本发 明的这些改变应属于本领域技术人员的能力范围，这些改变被认为属 于本文描述的和后文要求保护的本发明范围。
实施例
实施例解释了本发明GIP多肽的制备，本发明的这些GIP多肽的 体外和/或体内测试。
实施例1.GIP多肽的制备
可使用以0.050-0.100mmol装量为0.43-0.49mmol/g的Rink酰胺 树脂(Novabiochem)，或0.63mmol/g预装填Wang树脂(Fmoc- Tyr(tBu)-Wang树脂)(Novabiochem)，在Symphony肽合成仪(Protein Technologies，Inc.)上组装本发明的肽。以0.10M浓度将Fmoc氨基酸 (5.0当量，0.250-0.500mmol)残基溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中。所有 其它试剂(HBTU、1-羟基苯并三唑水合物和N，N-二异丙基乙胺)都制 备为0.55M二甲基甲酰胺溶液。然后使用HBTU(2.0当量，0.100-0.200 mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(1.8当量，0.090-0.18mmol)、N，N-二 异丙基乙胺(2.4当量，0.120-0.240mmol)，将Fmoc保护的氨基酸与结 合树脂的氨基酸偶联2小时。在最后的氨基酸偶联后，使用20％(v/v) 哌啶的二甲基甲酰胺溶液对肽去保护1小时。一旦肽序列完成， Symphony肽合成仪就按照程序切割树脂。使用93％TFA、3％苯酚、 3％水和1％三异丙基硅烷，对肽与树脂进行1小时的三氟醋酸(TFA)切 割。使用叔丁基甲基醚沉淀切割的肽，通过离心沉淀，并低压冻干。 沉淀再溶解在水(10-15mL)中，过滤，经使用C 18柱和含0.1％TFA 的乙腈/水梯度的反相HPLC纯化。通过反相HPLC，将得到的肽纯化 至均一，并通过LCMS证实纯度。
用脂肪酸(例如辛酸和硬脂酸)N-加帽本发明肽的一般方法如下： 将在Rink酰胺树脂上的肽(0.1mmol)悬浮在NMP(5mL)中。在单独 的小瓶中，将HBTU(0.3mmol)、HOBt(0.3mmol)溶解在DMF(5mL) 中，接着加入DIEA(0.6mmol)。将该溶液加入到树脂中，振摇该悬浮 液2小时。过滤溶剂，用NMP(5mL×4)和CH2Cl2(20mL)彻底清洗， 干燥，并进行1小时的TFA切割。在切割和纯化后，目的肽的产量约 为40mg。
可使用市售的活化的PEG酯，在溶液中对赖氨酸的游离ε氨基或 纯化肽的末端氨基进行PEG修饰。通过反相HPLC，将获得的PEG 化衍生物纯化至均一，通过LC/MS和MALDI-MS确认纯度。
实施例2.结合实验
可使用本领域技术人员周知的结合实验方法，在各种受体(例如 GIPR，GLP-1R，胰淀素受体)结合实验中测试本发明的GIP多肽。 这样的实验包括以下描述的实验。
胰淀素结合实验：可如下在由大鼠脑制备的伏核膜中对本发明的 某些示例性化合物与胰淀素受体的结合进行评价。断头处死雄性 Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。取出脑，并置于冷磷酸缓冲盐水(PBS) 中。从腹侧面开始，制作由嘴至下丘脑的切口，侧面以嗅束为界，并 由这些嗅束向中线以45°角延伸。此基础前脑组织包含伏核和周围区 域，对其称重并在冰冷的20mM HEPES缓冲液(20mM HEPES酸， 于23℃用NaOH将pH调节至7.4)中匀浆。通过以48,000×g离心15 分钟，用新鲜缓冲液清洗膜3次。将最终的膜沉淀重悬浮在含0.2mM 苯甲基磺酰氟(PMSF)的20mM HEPES缓冲液中。
为检测125I-胰淀素结合(参见Beaumont K等，Can J Physiol Pharmacol.1995Jul；73(7)：1025-9)，将4mg原始湿重组织的膜与12-16 pM125I-胰淀素的20mM HEPES缓冲溶液(其含0.5mg/ml杆菌肽、0.5 mg/ml牛血清白蛋白和0.2mM PMSF)温育。溶液于2℃温育60分钟。 通过GF/B玻璃纤维滤器(Whatman Inc.，Clifton，N.J.)过滤终止温育， 该滤器预先在0.3％聚乙烯亚胺中浸泡4小时，以便减少放射性标记肽 的非特异性结合。在过滤前立即用5ml冷PBS清洗滤器，在过滤后 立即用15ml冷PBS清洗滤器。取下滤器，在Y-计数器中以77％的计 数效率评测放射性。通过在10-12-10-6M未标记测试化合物存在下检测 结合，产生竞争曲线，并通过使用4-参数逻辑斯谛方程的非线性回归 (Inplot program；GraphPAD Software，San Diego)分析竞争曲线。
CGRP受体结合实验：除了使用由SK-N-MC细胞制备的膜以外， 基本如对胰淀素的描述评价本发明化合物与CGRP受体的结合，已知 SK-N-MC细胞表达CGRP受体(Muff，R.等，Ann NY Acad.Sci.1992： 657，106-16)。除了使用13,500cpm 125I-hCGRP/孔或21.7pM/孔 (Amersham)以外，如对胰淀素的描述进行结合实验。
肾上腺髓质素结合实验：使用含肾上腺髓质素受体的HUVEC (Kato J等，Eur J Pharmacol.1995，289：383-5)，使用用于环状AMP 的Perkin Elmer AlphaScreenTM实验，使用优化的25-30,000细胞/孔， 可研究与肾上腺髓质素受体的结合。相比于CHO细胞，HUVEC的 cAMP水平提升不大。因此，可选择CHO细胞作为阴性对照，因为 如果需要的话，其可不表达肾上腺髓质素受体。
降钙素受体结合实验：如本领域所知，可使用同样表达降钙素受 体的CHO细胞或T47D细胞(Muff R.等，Ann N YAcad Sci.1992，657： 106-16和Kuestner R.E.等，Mol Pharmacol.1994，46：246-55)研究与 降钙素受体的结合。
瘦蛋白结合实验：常规使用两个体外生物实验评测瘦蛋白结合和 受体活化(参见例如White等，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94： 10657-10662)。可通过用长(信号转导)形式小鼠OB受体(“OB-RL”) 转染的COS-7细胞，在没有或有重组小鼠瘦蛋白(阳性对照)或肽的情 况下，用碱性磷酸酶(“AP”)-瘦蛋白(“OB”)融合蛋白(“AP-OB”) 检测瘦蛋白结合抑制。信号转导实验可在用AP受体和OB-RL构建物 共转染的GT1-7细胞中进行。可通过化学发光检测在小鼠瘦蛋白或肽 刺激作用下的分泌性碱性磷酸酶(“SEAP”)活性。
Y1受体结合实验：由内源性表达神经肽Y1受体的SK-N-MC细 胞的铺满培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与60pM[125I]- 人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽 于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集 在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
Y2受体结合实验：由内源性表达神经肽Y2受体的SK-N-BE细 胞的铺满培养物制备膜。在96孔聚苯乙烯板中，将膜与30pM[125I]- 人肽YY(2200Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽 于室温温育60分钟。然后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集 在96孔玻璃纤维板上。将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上计数。
Y4受体结合实验：用编码神经肽Y4基因的cDNA瞬时转染 CHO-K1细胞，然后在48小时后由铺满的细胞培养物制备膜。在96 孔聚苯乙烯板中，将膜与18pM[125I]-人胰多肽(2200Ci/mmol， PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然 后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。 将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上 计数。
Y5受体结合实验：用编码神经肽Y5基因的cDNA瞬时转染 CHO-K1细胞，然后在48小时后由铺满的细胞培养物制备膜。在96 孔聚苯乙烯板中，将膜与44pM[125I]-人肽YY(2200Ci/mmol， PerkinElmer Life Sciences)和未标记PPF多肽于室温温育60分钟。然 后使用Perkin Elmer板收集器将孔内容物收集在96孔玻璃纤维板上。 将干燥的玻璃纤维板与闪烁体混合，并在Perkin Elmer闪烁计数器上 计数。
GLP-1受体结合实验：可使用结合置换实验检测GLP-1受体结合 活性和亲和性，在结合置换实验中，受体源是RINm5F细胞膜，配体 是[125I]GLP-1。将在20mM HEPES缓冲液中的均质RINm5F细胞膜与 40,000cpm[125I]GLP-1示踪剂和各种浓度的测试化合物于23℃、恒定 混合下温育2小时。反应混合物通过预先用0.3％PEI溶液浸泡并用冰 冷磷酸缓冲盐水淋洗的玻璃纤维垫过滤。使用闪烁计数器测定结合数 目。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego， CA)计算结合亲和性。
实施例3：小鼠食物摄取实验
可在小鼠食物摄取实验中测试本发明GIP杂合多肽的食欲抑制 性，并在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中测试本发明GIP杂合多肽对体 重增加的作用。用于筛选的实验方法如下所述。
以12∶12小时昼∶夜循环分组圈养雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)， 光照由06:00时开始。水和标准丸状小鼠饲料可随意获取，注明处除 外。动物在实验前1天约15:00时开始空腹。在实验日早晨，将动物 分为各实验组。在典型的研究中，n＝4笼，每笼3只小鼠。
在时间＝0分钟时，以约10nmol/kg-75nmol/kg的量，给所有动物 腹膜内注射溶媒或化合物，并立即给予预称重量(10-15g)的标准饲料。 取出食物，并于30、60和120分钟称重，以确定食物消耗量(Morley， Flood等，Am.J.Physiol.267：R178-R184，1994)。通过由时间＝0时 开始提供的食物重量中减去例如30、60、120、180和/或240分钟时 间点后剩余的食物重量，计算食物摄取。以ANOVA鉴定出显著治疗 效果(p＜0.05＝。当存在显著差异时，使用邓奈特检验(Prism v.2.01， GraphPad Software Inc.，San Diego，California)比较测试平均值和对照 平均值。
在食物摄取实验中的活性和与GIP一起用于合成本文杂合体的亲 本分子的序列包括：
  小鼠食物摄取，％基数   描述   化合物   编号   60minED50   (nmol/kg)   序列   30min   60min   120min   180min   剂量   PYY(3-36)   1   3   IKPEAPGEDASPEELNRY   YASLRHYLNLVTRQRY-   NH2   -31   -38   -40   -26   10   nmol/Kg   毒蜥外泌肽-4   5   HGEGTFTSDLSKQMEEE   AVRLFIEWLKNGGPSSGA   PPPS-NH2   -41   -60   -61   -60   4.8   nmol/Kg   毒蜥外泌肽-   4(1-28)   11   0.3   HGEGTFTSDLSKQMEEE   AVRLFIEWLKN-NH2   -50   -62   -49   -49   16.3   nmol/Kg   毒蜥外泌肽-4   (1-28)[Ala5，   Leu14，Phe25]   12   13   HGEGAFTSDLSKQLEEE   AVRLFIEFLKN-NH2   -53   -61   -50   -53   16.7   nmol/Kg   大鼠胰淀素   9   KCNTATCATQRLANFLV   RSSNNLGPVLPPTNVGSN   TY-NH2   -58   -40   -36.5   -35.5   25   nmol/Kg   h胰淀素(1-7)-   11，18Arg-sCT(8-   27)-胰淀素   (33-37)   10   26   KCNTATCVLGRLSQELH   RLQTYPRTNTGSNTY-   NH2   -60   -47   -42.5   -32   25   nmol/Kg   CCK-8   26   DY(SO3)MGWMDF-NH2   -92   -56   -27   10   nmol/Kg
实施例4：催肥的C57B1/6(膳食诱导肥胖，或DIO)小鼠的体重 增长
喂饲雄性C57BL/6小鼠(在研究开始时为4周龄)高脂肪(HF，58％ 的膳食千卡为脂肪)或低脂肪(LF，11％的膳食千卡为脂肪)饲料。在饲 料喂养4周后，每只小鼠都植入渗透泵(Alzet#2002)，该泵在两周内 持续地皮下传递预定剂量的杂合多肽。每周检测体重和食物摄取 (Surwit等，Metabolism-Clinical and Experimental，44：645-51，1995)。 测试化合物的作用表示为每个治疗组至少14只小鼠体重变化百分率 (即由起始重量变化的百分率)的平均值±标准差(p＜0.05 ANOVA， 邓奈特检验，Prism v.2.01，GraphPad Software Inc.，San Diego， California)。
实施例5.测试含有一个异源C-末端尾的GIP杂合体
在水性介质和含有有机共溶剂的介质中进行的毒蜥外泌肽-4的圆 二色性(CD)和NMR研究，揭示了含有序列LFIEWLKNGGPSSGAPPPS (残基21-39)的C-末端区段会形成独特的疏水的Trp-笼簇，这源自Pro37 与Phe22的相互作用和Pro38与Trp25的相互作用(14-16)。令人感兴 趣地，没有在含有十二烷基磷酸胆碱(DPC)的水中(即模拟生物膜环 境的胶束状态)形成Trp-笼的证据。NMR光谱数据揭示了8个C-末 端残基的快速摆动，推测因为Trp-笼是去稳定的，这是由于Trp残基 与磷酸胆碱头基团的能量上有利的结合。该Trp-笼簇基序是肽显示的 蛋白样三维结构的第1个实例，可能是通过遮蔽体内分子中的蛋白酶 敏感部位，赋予更大的代谢稳定性的原因(17)。
因而，通过将毒蜥外泌肽尾序列添加到截短的GIP肽GIP-(1-30) 和GIP-(1-26)的C-末端，设计GIP类似物或杂合体，前提是，这些肽 能呈现为毒蜥外泌肽-4报道的Trp笼结构。另外，置换在GIP N-末 端的Tyr和Ala残基，以赋予对DPP-IV肽酶降解的抗性。这些代谢 稳定的GIP类似物或杂合体可以用作单一疗法或与毒蜥外泌肽-4(或其 它GLP-1激动剂)或抗糖尿病药物(例如二甲双胍，磺酰脲，噻唑烷 二酮，普兰林肽和胰岛素)的辅助疗法，用于治疗2型糖尿病。
可以在NIH Swiss或糖尿病db/db小鼠的GIP受体结合和急性葡 萄糖降低测定中，筛选类似物。参见图2-4。进行体外GLP-1和胰高 血糖素受体结合反筛选，以评估受体特异性。还通过将肽与肾刷状缘 膜提取物(来自RINm5F细胞和纯化的中性内肽酶24.11的膜提取物) 一起温育，测试这些GIP类似物或杂合体的酶稳定性，然后通过LC- MS/MS分析切割产物(数据未显示)。
可以进一步表征类似物，以评估它们的抗糖尿病作用，更具体地， 发现化合物G在正常小鼠中的葡萄糖降低作用明显比全长GIP更有效 (图3A和3B)。如图4所示，化合物G在降低糖尿病小鼠模型葡萄糖 方面显示出显著且长效的作用，而10倍剂量的GIP的作用是不大的， 并随时间而减弱。化合物G的葡萄糖降低效果也不同于毒蜥外泌肽- 4(化合物K)，后者具有更快速的作用起始。
实施例6.GIP类似物和杂合体的增强的葡萄糖降低作用
测定了新的GIP类似物或杂合体的体内葡萄糖降低作用。图8A 和8b提供了一个这样的研究的结果。各点代表着平均值±sem。在t＝0， 在基线取样后立即将肽腹膜内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。 在t＝60，120，180和240分钟取样。使用OneTouchUltra(Life Scan， Inc.，a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对 于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。
测试了：
化合物编号A，人GIP酸形式：
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ- OH；
化合物编号I，D-Ala2GIP酸形式：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKH NITQ-OH；和
化合物编号G，D-Ala2GIP(1-30)-PSSGAPPPS酰胺形式：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS- NH2。
数据证实，本文新的GIP类似物或杂合体的位置2处的D-丙氨 酸置换会提高体内葡萄糖降低能力。甚至将D-Ala添加至全长，也会 比未修饰的GIP提高葡萄糖降低：在第1个小时观察到提高的活性， 但是随时间减弱。相反地，当存在蛋白酶抗性的N-末端和Trp-笼C- 末端遮蔽时，观察到明显优越的且令人惊奇的特性。例如，包含2个 方面的类似物(参见化合物G)表现出逐渐增加的活性，在t＝120min达 到峰值，且比天然GIP或它的D-Ala2形式更持久。
图9描述了新的GIP类似物的葡萄糖降低作用，尤其是Trp-笼的 作用。各点代表着平均值±sem。在t＝0，在基线取样后立即将肽腹膜 内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60，120，180和240min 取样。使用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson&Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05； ANOVA，邓奈特检验。
测试了：
化合物编号H，(D-Ala2)GIP(1-30)酰胺形式：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-NH2；和
化合物编号G，(D-Ala2)GIP(1-30)-PSSGAPPPS酰胺形式：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS- NH2。
数据证实，C-末端Trp-笼序列的存在会为GIP活性提供显著的且 令人惊奇的益处，尤其在截短的GIP类似物或杂合体中。
测定了各种类似物和杂合体的体内葡萄糖降低作用，并显示在图 10A和10B中。在该实施例中，Ac修饰和Pro3置换没有显著增加 葡萄糖降低能力。各点代表着平均值±sem。在t＝0，在基线取样后立 即将肽腹膜内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60，120，180 和240min取样。使用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson& Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照，p＜0.05； ANOVA，邓奈特检验。
测试了：
化合物A，人GIP酸形式：
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ；
化合物B：(AcY)(D-Ala)GIP(1-30)-PSSGAPPPS酰胺形式：
Ac-Y(DAla)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPP S-NH2；
化合物C：(Ac-Y)GIP酸形式：
AcY-AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNI TQPSSGAPPPS；
化合物D，Pro3GIP(1-30)-PSSGAPPPS酰胺：
YAPGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS-NH2；
化合物E，Pro3GIP(1-42)酸形式：
YAPGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ；
化合物F，Pro3GIP(1-30)酰胺：
YAPGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-NH2；和
化合物G，(D-Ala2)GIP(1-30)-PSSGAPPPS酰胺(也称作0601GIP 3794)：
Y(D-Ala)EGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPSSGAPPPS- NH2。
为了对比反应于静脉内葡萄糖刺激的各种GIP类似物杂合体的促 胰岛素作用，以100pmol/kg/min输注剂量，在大鼠静脉内葡萄糖耐 受试验(IVGTT测定)中测试GIP类似物杂合体。选择表现出显著的体 内葡萄糖降低的GIP化合物。例如，当天然GIP没有表现出或表现出 微小的基础葡萄糖降低(在0％时的基础葡萄糖降低(％最大降低)和约 10％的OGTT反应)活性时，类似物0601GIP4042和类似物杂合体 0601GIP 3794和0601GIP 4178分别表现出非常短暂的约11％、约20％ 和延迟发作约20％的基础葡萄糖降低，和在OGTT测定中“ND”(未检 出)、约21％和约20％降低。0601GIP 4178的延迟发作与下述观点相 一致，即它会结合缓慢释放出它的血浆蛋白。
GIP、0601GIP3794和0601GIP4042(dAla2-GIP(1-42)酸形式)产 生了显著增强的对静脉内葡萄糖刺激的促胰岛素应答(IVGTT测定)， 其量级类似于exenatide和GLP-1的作用(数据未显示)。0601GIP4178(辛 基甘氨酸-GIP(1-30)-毒蜥外泌肽-4-(31-39))表现出了减小的促胰岛素应 答，可能是由于它通过辛基甘氨酸与血浆蛋白的结合，但是提供甚至 进一步延长的作用持续时间的补偿益处。GIP、0601GIP3794和 0601GIP4178在葡萄糖刺激之前产生了胰岛素水平的显著升高。所有 3种类似物产生了反应于葡萄糖刺激的葡萄糖变化的明显降低(数据未 显示)。如所述的，通过股动脉和静脉，给饲养的、异氟烷麻醉的HSD 雄性大鼠插入导管，并允许稳定化1小时。稳定化后，开始静脉内输 注盐水、GIP、或GIP类似物杂合体(t＝-30)。在t＝0，经2分钟静脉内 推注5.7mmol/kg D-葡萄糖。在葡萄糖输注之前和之后(0-90分钟)的不 同时间点，采取用于测量葡萄糖和胰岛素浓度的样品。
在IVGTT测定中有活性的其它GIP杂合体包括：
0601GIP4252[dAla2]GIP-(1-30)-[辛基甘氨酸34]毒蜥外泌肽-4 (31-39)；
0601GIP4285[dAla2，Leul4，Ala18，glu21]GIP-(1-30)-毒蜥外 泌肽-4(31-39)；
0601GIP4233[dAla2]GIP-(1-30)-fGLP-1v2-(31-37)；和
0601GIP4179[dAla2，Leu14，β-Ala31，β-Ala32]GIP-(1-32)-毒 蜥外泌肽-4(31-39)。
实施例7.肽稳定性和蛋白酶抗性
根据Hupe-Sodmann等(肽18(5)：625-632(1997))的方法，使用细 胞系RINmF5，测定对蛋白酶的抗性。该分化较好的细胞系普遍接受 为胰腺β-细胞模型。将指定的GIP化合物(30μM)与RINm5F细胞膜提 取物一起在37℃温育，使用LC-MS，以不同的间隔监视与亲本肽的 ％年龄成比例的肽的降解6小时。数据(参见图11)表明，[DAla2]- GIP(1-30)-PSSGAPPPS GIP杂合体(化合物G(也称作0601GIP3794)； 具有C-末端Trp-笼遮蔽(例如，毒蜥外泌肽-4尾))比它的没有遮蔽的亲 本分子GIP(1-30)或全长GIP(1-42)更稳定。因此，与没有Trp-笼或存 在替代性非笼-形成序列(例如天然GIP C-末端序列)相比，Trp-笼遮 蔽的添加，提供令人惊奇的优越的蛋白酶抗性。此外，数据表明， GIP(1-30)截短体可以在它的C-末端接纳外来序列，更具体地，可以接 纳Trp-笼遮蔽序列。
也测试了类似物在人血浆中的稳定性。将测试化合物溶于水(或非 常稀的DMSO，根据需要)，加入人血浆，在37℃温育时间段(0，1， 2，3，4，和5小时)，用甲醇(1∶4比率)提取，通过LC/MS/MS分析上 清液。在人血浆稳定性测定中，将“稳定”评作在人血浆处理5小时时 剩余超过约90％，将“中等稳定”评作在2小时时剩余超过约75％， 且在5小时时剩余小于约90％，将“不稳定”评作在2小时时剩余小 于约75％。不稳定的类似物和杂合体通常不适用于本文所述的方法 中。测试了示例性的化合物。评定为稳定的化合物是0601GIP3794， 0601GIP 4150和0601GIP4233。评定为中等稳定的化合物是 0601GIP4149，0601GIP4152，0601GIP4153，0601GIP4176， 0601GIP4177，0601GIP4215，0601GIP4284，和0601GIP4289。评定 为不稳定的化合物是0601GIP1540，0601GIP4147，0601GIP4292， 0601GIP4293，和0601GIP4294。含有辛基甘氨酸的GIP化合物 0601GIP4178被评为不稳定的，但是它是DPP-IV抗性的，且会结合 血浆蛋白，使它的提取和检测复杂化；尽管如此，认为它是用于本文 方法的目的的稳定的化合物。GIP类似物杂合体0601GIP3794令人惊 奇地比毒蜥外泌肽-4更稳定。
实施例8.其它示例性的GIP/胰淀素-sCT杂合体
制备了其它示例性的GIP杂合体，酰胺形式(如本文使用的，小 写单氨基酸代码表示“D”氨基酸。例如，YaE表示在位置2的D-丙 氨酸)
  SEQ ID   No：   化合物   编号   描述   序列   1   GIP(1-30)dAla2-毒蜥外泌   肽4(31-39)   YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKPS SGAPP   PS   2   GIP(1-30)dAla2-小PEG(8)-   h胰淀素(1-7)-11，18Arg-   sCT(8-27)-胰淀素(33-37)   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-小   PEG(8)-   K(CNTATC)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2   3   GIP(1-30)dAla2-bAla-bAla-   h胰淀素(1-7)-11，18Arg-   sCT(8-27)-胰淀素(33-37)   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-bAla-   bAla-   K(CNTATC)VLGRLSQELHRLQTYPRTN、TGSNTY-NH2   4   GLP(7-36)   HAEGTFTSDVSSYLEGQAALEFIAWLVKGR   10   h胰淀素(1-7)-11，18Arg-   sCT(8-27)-胰淀素(33-37)   KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-NH2   GIP(1-30)dAla2-   GlyGlyGly-h胰淀素(1-7)-   11，18Arg-sCT(8-27)-胰淀素   (33-37)   YaEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQK-Gly-Gly-   Gly-K(CNTATC)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY-   NH2
如本文所述，测试了化合物的受体结合：
  化合物   编号   GIP RBA   GLP RBA   CT RBA(C1A)   AMY   RBA   CGRP   RBA   环化酶   3   0.10   448   0.15   0.20   108   199   4   0.13   664   0.12   0.30   110   215   10   Nd   nd   0.03   0.03   2.30   1.40   1   3.8   1000   nd   nd   nd   519
杂合体会有效地且选择性地结合和激活相关受体。
还如本文所述，测定了化合物的食物摄取抑制、降低血糖试验和 口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。在食物摄取测定(图13A，14，15和 16A-16B)中，各点代表着n＝4笼的平均值+/-标准差(3只小鼠/笼)。在 t＝0，腹膜内注射肽。注射后立即导入食物，在t＝30，60，120，和180 分钟测量消耗的量。*相对于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检 验。
在图13B中，横条代表着平均值+/-标准差。在t＝-5分钟，将肽 腹膜内注射进4-小时空腹的NIH/Swiss雌性小鼠。在t＝0施用灌胃 (1.5g/kg)。在t＝30分钟取样。*相对于载体对照，p＜0.05；ANOVA， 邓奈特检验。在图17中，各点代表着平均值+/-sem。在t＝0，在基线 取样后立即将肽腹膜内注射进禁食2小时的NIH/Swiss小鼠。在t＝60， 120，和180分钟取样。用OneTouchUltra(LifeScan，Inc.，a Johnson &Johnson Company，Milpitas，CA)测量血糖。*相对于载体对照， p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。如图23A和23B所示，GIP-胰淀素/sCT/ 胰淀素杂合体会减慢胃排空和降低细胞内钙，它们是胰淀素家族激素 模块的标志。因而，这些GIP杂合体化合物具有GIP类似物的促胰岛 素作用(及其它作用)，所述GIP类似物具有胰淀素模拟物的胃排空作 用或有益的钙调控作用(例如关于骨密度维持)。在一个实施方案中， 对于每种这样的GIP杂合体，使用Gly接头，例如GlyGlyGly。
实施例9.GIP化合物对心肌细胞的直接作用
环状AMP(3’，5’-环状单磷酸腺苷)是G-蛋白偶联的受体(GPCR)信 号传递途径的关键第二信使。配体与受体的结合，导致G蛋白激活， 后者又调节腺苷酰基环化酶，该酶负责调控细胞内的cAMP水平。 cAMP水平的测量，被广泛用作受体功能的指示剂。测定心肌细胞Gs- 和Gi-偶联的受体的激活，作为cAMP生产的度量。
细胞分离。使用可商业得到的系统，分离新生心肌细胞。Cellutron 分离试剂盒(nc-6031)(Cellutron，NJ)和方法用于细胞分离。断头处死 Sprague Dawley新生大鼠(1-2天龄)，取出搏动的心脏放入消化缓冲 液(Cellutron D1缓冲液)中，以分离细胞。对于15个大鼠心脏，用6ml 缓冲液(Cellutron D2缓冲液)消化8次是足够的。在缓冲液(Cellutron D3 缓冲液)中温育重新悬浮的细胞足够的时间，以允许最佳分散，并使吸 液来打碎团块的需要最小化。抛弃从前2次消化释放出的细胞，因为 它们的大部分是红细胞。过滤重新悬浮的细胞，在培养箱内塑料板中 的NS培养基(Cellutron，NJ)中预涂布1小时，以便去除成纤维细胞。 预涂布1小时后，去除漂浮的细胞，用NS培养基冲洗摇瓶。合并漂 浮的细胞和在冲洗培养基中的细胞，并计数。不计数剩余的红细胞， 它们比心肌细胞小。
细胞涂布。在实验的第0天，分离细胞，并以8,000/384孔，50,000/96 孔或500,000/12孔，在NS培养基中涂布24小时。在第1天，将NS 培养基替换为新鲜的NS培养基。观察到推荐的NW(Cellutron，NJ)培 养基通常不支持充分的细胞生长或形态。
cAMP测定。测试了GIP化合物对分离的、培养的心肌细胞的cAMP 诱导。基本上根据生产商所述(也参见Gabriel等，High throughput screening technologies for direct cyclic AMP measurement，Assay&Drug Dev.Technol.2：291-303(2003)和Cenni等，HTRF(r)cyclic AMP assay： new optimized cell-based assay for better investigation of Gi coupled receptors，in Smart assays for screening，IIR Congress，Zurich(CH) (2003))，使用Gs/Gi 384-孔粘附形式的可商业得到的CisBio(Bedford MA)HRTF(均匀的时间分辨的荧光)cAMP动态测定，测试化合物诱 导的cAMP水平。测定剂量效应。
关于Gs测定，阳性对照是10uM福斯高林，阴性对照是缓冲液。 关于Gi测定，阳性对照是缓冲液，阴性对照是10uM福斯高林。在37 ℃，在刺激缓冲液((200mls含有198.3ml 1X HBSS，1ml 1M Hepes，670ul 30％BSA，用1M NaOH滴定至pH 7.4)中温育测试化合物和细胞30 分钟。为了测量生成的cAMP，裂解细胞，并根据生产商的说明书， 测定cAMP。在图18A(GIP：人GIP(1-42)酸形式)和18B(GIP杂合化 合物G)中显示了示例性的结果。Y-轴是在665nM进行的时间分辨的 荧光测量除以在620nM的测量的比率。在该实验中，GIP杂合体的EC50 是11.7nM，GIP的EC50是9.1nM。GLP-1和毒蜥外泌肽-4表现出 非常低至没有显著的活性(数据未显示)。此外，从心肌细胞Gs-偶联 的受体激活的3个独立实验得知，GIP的EC50(nM)是15.6，尿皮质 激素的EC50(nM)是0.7，GIP杂合化合物G的EC50(nM)是29.8。尿 皮质激素是用作阳性对照的一种已知的心肌细胞Gs-偶联的受体激活 剂。GIP和GIP杂合体通常会产生大于50％的受体激活反应。Usdin等 (Endocrinology 133：2861-2870(1993))报道了大鼠GIP受体的克隆和 它与不同大鼠组织中的RNA的原位杂交，所述大鼠组织包括心脏， 尤其是心内皮，这与主要血管内皮的标记相一致。结果表明，GIP化 合物可以提供对心脏的直接作用。
实施例10.施用GIP化合物后，通过遥测术测量有意识大鼠的循 环系统作用
使用在12∶12小时光∶暗周期下在22.8±0.8℃图养的雄性Harlan Sprague Dawley大鼠，使用遥测术研究测试化合物对循环系统的作 用。实验在光照周期过程中进行。通过植入有意识的、未麻醉的、无 限制的大鼠中的无线发射器，遥测允许实时血液动力学读数，包括动 脉血压，心率和动脉dP/dt。在本实施例中，通过远距离静脉内给药， 给大鼠注射载体、80nmol/kg GIP(人GIP(1-42)酸形式)，或80nmol/kg 的0601GIP3794。通过内在的血管通路口(Access Technologies(Skokie， IL)，实现远距离静脉内给药。该口安置在肩胛骨之间皮肤下面的基底 肌肉中。导管插入颈静脉中。在注射后，收集最多60分钟的数据。
如图19A-E所示，与GIP(人GIP(1-42)酸形式)相比，GIP杂合体 的增加心率的效果是短暂的(图19B)，GIP杂合体会降低平均动脉压， 而GIP没有效果(图19A)，两种化合物类似地增加dP/dt(图19C)。图 19D和19E证实，与载体或GIP相比，GIP杂合体会持续降低收缩压 和舒张压。
从数据可以看出，GIP会在完整大鼠中表现出正性肌力作用，而 不会升高动脉压。GIP也表现出了变时性(心率升高)作用。GIP杂合 体表现出了比GIP延长的收缩作用(在这里表现为动脉压增长率峰值； dP/dt)，没有造成心脏加速，并引起动脉压降低。因此，GIP杂合体可 以表现出血管舒张和灌注益处，这与心脏工作的增加无关。另外，收 缩压或舒张压或二者的持续降低，是公认的有益的心血管效应，其与 减少高血压和心血管相关发病率和死亡率事件相关联。
实施例11.GIP对体重减轻没有作用
如本文所述，测试了GIP(1-42)和GIP DPP-IV抗性的类似物/毒 蜥外泌肽尾杂合体(0601GIP3794)对DIO小鼠的食物摄取和体重减轻 的作用。如图20A所示，观察到GIP没有很快抑制小鼠的食物摄取。 相反地，与对照相比，1/10剂量的大鼠胰淀素在30min内造成食物摄 取的显著减少。GIP在较迟的时间点(60，120min)降低食物摄取的趋 势，可能已经成为间接作用，这是由于它对胰淀素分泌的刺激。各点 代表着n＝4笼的平均值±标准差(3只小鼠/笼)。在t＝0，腹膜内注射肽。 注射后立即导入食物，在t＝30，60，和120min测量消耗的量。*相对 于载体对照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。类似地，包含毒蜥外泌 肽尾的DPP-IV抗性的GIP类似物杂合体化合物0601GIP3794没有 很快抑制食物摄取，如在30min时与载体对照摄取没有差异所反映的 (图20B)。关于GIP，该化合物在较迟的时间点(60，120min)降低食 物摄取的趋势，可能是由于它对胰淀素分泌的刺激。各点代表着n＝4 笼的平均值±标准差(3只小鼠/笼)。在t＝0，腹膜内注射肽。注射后立 即导入食物，在t＝30，60，和120min测量消耗的量。*相对于载体对 照，p＜0.05；ANOVA，邓奈特检验。与GIP和GIP激动剂不同，exenatide 和GLP1激动剂直接地且迅速地抑制食物摄取，这独立于它们刺激胰 淀素分泌的作用。在第一个时间点，食物摄取的减少是明显的(图 20C)。类似地，已经报道了GLP-1和exenatide对1型糖尿病受试者 的胃排空和餐后葡萄糖曲线的作用，表明该作用不依赖于β细胞或胰 淀素的存在。
如图21所示，GIP没有造成饮食诱导的肥胖小鼠的体重减轻。在 通过饲喂高脂肪饮食已经增加了体重的小鼠(HF盐水组)中，通过小渗 透泵输入GIP2周，对体重变化没有影响。相反地，在低30倍的速率 摄入的exenatide，会将体重变化减少至在用低脂肪饮食饲喂的小鼠(LF 组)中观察到的水平。*P＜0.05；ANOVA相对于HF盐水。这证实了 GIP的抗-或无-分解代谢作用。相反地，在本文中观察到，具有适当 选择的第二激素模块的GIP杂合体(例如胰淀素/sCT/胰淀素嵌合体)， 没有造成食物摄取的减少和体重减轻。
尽管已按照示例性的实施例和实施方案描述了本发明，但要理解 的是，本领域技术人员会考虑到改变和修饰。因此，所附权利要求书 意在覆盖所有这样的等价改变，这些改变属于本发明要求保护的范 围。
相关申请
本申请要求享有共同拥有并未决的下述美国临时申请的优先权： 2005年2月11日提交的美国临时申请号60/652,662，2005年2月15 日提交的美国临时申请号60/653,433，2005年2月11日提交的美国 临时申请号60/651,647，2005年8月11日提交的美国临时申请号 60/707,244，2005年8月11日提交的美国临时申请号60/707,369，2005 年8月17日提交的美国临时申请号60/709,320，和2005年8月17日 提交的美国临时申请号60/709,316，它们各自在这里整体引作参考。 本申请在这里整体引入下述共同拥有的申请作为参考：2005年2月11 日提交的PCT/US05/04178，公开为WO2005/077072；2005年2月11 日提交的PCT/US2005/004351；2005年2月11日提交的 PCT/US2005/004631；2005年12月15日提交的PCT/US2005/045471； 2005年8月10日提交的美国专利申请号11/055,093，美国专利申请 号11/201664；和2005年8月17日提交的USSN 206,903。这些申请 教导了与本发明有关的和有用的化合物和用途。
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在本申请中，提及了多种出版物。这些出版物的公开内容特此整 体引入本申请中作为参考，以便更完整地描述本发明所属领域的状 态。