发明领域

本发明涉及制备用于组织修复的生物材料的方法，更具体而言， 本发明涉及制备用于组织修复的生物材料的方法，其包括从哺乳动物 获得的基于胶原蛋白的组织的胶原蛋白交联，对组织进行去细胞，并 通过使用防冻液对不含细胞的组织进行冷冻干燥的步骤，还涉及由上 述方法制备的用于组织修复的生物材料。

现有技术的描述

多种可注射材料已经被用作软组织和皮肤组织的修复材料以治疗 多种皮肤病，诸如畸形脸，由于外伤引起的软组织损伤或沉陷以及发 育不全的软组织。修复材料的代表性例子为液体硅酮，牛胶原蛋白， 以及自身皮肤或者脂肪：

其中，在第二次世界大战期间液体硅酮主要用在军队中。自从医 用级液体硅酮‘360’于1963年在美国开发为人用以来，由于其在人 体内的长期效果，一直被有效用作早期移植的修复材料。但是，‘360’ 经证实不能令人满意，因为‘360’引起发炎，硬化，变色，溃疡，转 移，硅酮肉芽瘤等等(参见：Klein A.W.，Rish D.C.，J.Dermatol.Surg. Oncol.，11：337-339，1985；Nosanchuk J.S.，Arch.Surg.，97：583-585， 1968；Piechotta F.U.，Aesthetic Plast.Surg.，3：347-355，1979；Spira M.， Rosen T.，Clin.Plast.Surg.，20：181-188，1993)，这阻止其成为用于移植 的常用材料。

此外，已知在移植之前牛胶原蛋白需要在受体的皮肤上作敏感性 试验。而且，即使在移植之前敏感性试验检测正常，大约3％的移植 受体依然表现出超敏反应(参见：Elson M.L.，J.Am.Acad.Dermatol.，18： 707-713，1998)，且移植的持续时间相对较短，从3个月到6个月(参 见：Gromley D.E.，Eremia S.，J.Dermatol.Surg.Oncol.，16：1147-1151， 1990；Matti B.A.，Nicolle F.V.，Aesthetic Plast.Surg.，14：227-234， 1990)。另外，已经有报道移植后牛胶原蛋白引起多种瞬间副作用，例 如红斑，肿胀，皮肤的局部坏疽，以及脓肿(参见：Cooperman L.S.等 人，Aesthetic Plast.Surg.，9：145-151，1985；Frank D.H.等人，Plast. Reconstr.Surg.，87：1080-1088，1991；Hanke C.W.等人，J.Am.Acad. Dermatol.，25：319-326，1991；Matti B.A.等人，Aesthetic Plast.Surg.，14： 227-234，1990)。

或者，自身的皮肤已被用于本领域，因为，自身皮肤相对安全且 不需要敏感性试验，而且移植的持续时间从1年到2年。但是，其缺 点在于切除自身皮肤由于并发感染需要长时间恢复期，而且在皮肤切 除的身体部位留下可见的伤疤。

最后，随着脂肪抽吸术的发展，自身脂肪的使用已有所提高，但 是需要持续移植才能达到需要的治愈水平，因为自身脂肪的持续时间 较牛胶原蛋白的持续时间短(参见：Gromley D.E.，Eremia S.，J.Dermatol. Surg.Oncol.，16：1147-1151，1990)。

上述的每种修复材料在一方面或者多方面都有用于组织修复的不 同价值，但是没有一种材料满足用于软组织的理想修复材料的需要。

组织生物工程，包括生物材料技术，已经得到迅猛发展可以克服 上述缺点，现有技术中一些技术已被使用和商业化。在不久的将来， 可以产生理想的修复材料代替软组织和皮肤组织。但是通过传统技术 不能解决上述修复材料的所有缺点，因此需要相关技术的持续发展。 美国专利5,336,616公开了一种生产用于移植、基于胶原蛋白的非细 胞组织的方法，其包括从组织移去诱导免疫排斥的抗原细胞，然后用 防冻液处理组织以降低在冷冻干燥过程中胶原蛋白结构损伤的步骤。 基于胶原蛋白的非细胞组织开始普及，因为它不诱导移植排斥，而且 在使用前可以保存较长时间。但是上述方法在生产成本经济及防污高 度可行性方面不会令人满意。此外，还发现了一个严重的问题，由于 缺少在冷冻干燥前保护胶原蛋白组织结构的步骤，胶原蛋白组织在移 植后将受到损伤和迅速降解。

在现有条件下，有充分的理由开发和发展制备用于组织修复的新 生物材料的简单有效方法，所述新生物材料不会引起胶原蛋白组织结 构的损伤。

发明概述

本发明的发明者致力于以简单高效的方法生产用于组织修复的新 型生物材料，其不会引起胶原蛋白组织结构的损伤，并且发现：聚环 氧化合物的处理通过交联基于胶原蛋白的组织的方式稳定胶原蛋白组 织的结构；可以在含有透明质酸的防冻液中进行冷冻干燥；融化后， 加工的组织在体内成功移植。

因此，本发明的主要目的就是提供制备用于组织修复的生物材料 的方法。

本发明的其他目的就是提供一种用于组织修复的生物材料，其包 括来自哺乳动物基于胶原蛋白的生物组织的主要组分，所述生物材料 通过上述方法进行制备。

附图简述

本发明的上述目的和特征根据下列描述连同附图将更加明显，其 中：

图1显示在不同温度下交联指数的比较。

图2显示在不同聚环氧化合物浓度下交联指数的比较。

图3显示在不同pH下交联指数的比较。

图4显示通过胶原酶降解皮层。

图5显示通过多种研磨方法形成的粉末大小。

图6显示根据用于组织修复的生物材料大小和注射浓度在小鼠下 皮层中的持续时间。

图7a显示皮下注射1周后皮肤组织的照片。

图7b显示皮下注射1个月后皮肤组织的照片。

图7c显示皮下注射1年后皮肤组织的照片。

本发明的详细描述

本发明制备用于组织修复的生物材料的方法包括如下步骤：从哺 乳动物获得基于胶原蛋白的生物组织；用聚环氧化合物处理生物组织 获得具有交联胶原蛋白结构的生物组织；对获得的生物组织去细胞产 生不含细胞的组织；将不含细胞的组织浸入含有透明质酸的防冻液， 并将上述组织冷冻干燥。基于胶原蛋白的组织包括但不限于，优选哺 乳动物的筋膜，羊膜，胎盘或者皮肤。聚环氧化合物包括但不限于， 优选聚甘油聚缩水甘油醚，聚乙二醇缩水甘油醚或者其它市售的聚环 氧化合物。优选地，1-7％(w/v)的聚环氧化合物在pH 8-11、30-45℃的 条件下处理生物组织10-20小时。另外，冷冻干燥的不含细胞组织优 选通过物理方法进行研磨，例如，在研磨机中液氮环境下进行冷冻研 磨，以保护组织免遭加工过程中生成的热损伤。本发明的方法还包括 在冷冻研磨前在液氮环境中将冷冻干燥的不含细胞组织研磨成较小组 织的步骤，或者包括对冷冻干燥的不含细胞组织进行水合作用和切割 水合组织的步骤。

到目前为止，已经开发了多种交联技术来稳定胶原蛋白的结构， 同时保持胶原蛋白组织用于移植的机械强度和独特特征。除了交联技 术，还一直积极进行了关于去细胞技术的研究以减少在移植过程中抗 移植物的免疫排斥，从而在移植物中增殖细胞，并且发展用于组织工 程的新型生物材料。很多有关戊二醛的研究已被开展用于提高组织结 构的稳定性，研究发现了戊二醛在人体内具有强毒性的严重问题。基 于这种考虑，现有技术中已经深入研究了胶原蛋白组织交联的替代技 术，其中之一就是利用聚环氧化合物的胶原蛋白组织的交联技术。

聚环氧化合物具有多种长度和官能团的骨架。市售DenacolTM EX- 512(Nagase Chemical Company，日本)已经广泛用于组织的交联。

聚环氧化合物的交联反应机理和戊二醛不同。聚环氧化合物的环 氧基和多种诸如氨基，羧基，羟基，酚基和醇基的官能团高效反应， 而戊二醛只和蛋白中赖氨酸残基的ε-氨基反应。尤其是，含有17-25 个碳以及4-5个环氧基的骨架的聚环氧化合物表现出诸如胶原蛋白的 螺旋多肽分子的高效交联。

另外，聚环氧化合物的毒性比戊二醛的毒性低，在和诸如胶原蛋 白的螺旋多肽分子反应的情况下，组织的抗原性或者免疫反应的诱导 与反应时间成比例的降低。自然，它表现出相对较好的生物相容性(参 见：Lohre J.M.等人，Artif.Organs，16：630-633，1992；Uematsu M.等人， Artif.Organs，22：909-913，1998)。

胶原纤维的结构决定了基于胶原蛋白的组织的物理化学和生物机 械特征。胶原纤维含有由三种多肽组成的胶原蛋白，每种多肽彼此扭 曲缠绕形成螺旋结构，并且通过共价键的交联得以稳定。聚环氧化合 物的一个分子和胶原蛋白的两个或者多个氨基反应形成交联连接，这 对于可移植组织提供拉伸强度以及生物安全性。移植的基于胶原蛋白 的组织通常通过受体的蛋白酶进行降解，但是交联连接保护移植的基 于胶原蛋白的组织免受蛋白酶的作用。

基于理论知识，本发明的发明者添加了利用聚环氧化合物对胶原 蛋白进行交联的步骤以使胶原蛋白结构的损伤降低到最小，所述损伤 是传统方法生产用于移植的非细胞的基于胶原蛋白的组织的一个缺点 (参见：美国专利5,336,616)。即，在进行去细胞之前用聚环氧化合物 处理基于胶原蛋白的组织，以在胶原纤维之间或者在胶原纤维中形成 交联连接，从而加强并稳定基于胶原蛋白的组织的结构。

此外，已经对去细胞技术进行了积极的研究以从基于胶原蛋白的 组织中完全去除诱导免疫排斥的细胞。去细胞技术的进行就是为了通 过化学，酶或者机械方法将全细胞移去同时不损失胞外基质组分。该 技术已被认为是发展用于组织修复的生物材料的重要步骤，因为通过 细胞分裂再生静脉以及重建移植材料在去细胞组织中更活跃，所述去 细胞组织已经保持了其自身机械特征。在去细胞的步骤中，完全移去 碎片以及细胞以避免移植后的免疫排斥是必要的。几种方法已经用于 该技术中，虽然去污剂优选用于组织的去细胞，但是例如诸如十二烷 基硫酸钠(SDS)的离子去污剂，或者诸如表面活性剂Triton(Triton X- 100)，吐温(吐温20，吐温80)，以及NP(NP-10，NP-40)的非离子去污 剂被用作去污剂。

冷冻干燥(或者冷干)技术用于保护组织，使得组织或者细胞不受 损伤。在冷冻干燥之前，组织首先浸入防冻液以保护组织免受冷冻损 伤。防冻液由缓冲液和冷冻干燥保护剂组成，其中缓冲液在保持冷冻 保护液的离子强度和渗透压方面起作用，冷冻干燥保护剂保护组织在 冷冻干燥过程中免受物理或者化学损伤。另外，冷冻干燥保护剂抑制 在冷冻干燥过程中由冰晶重结晶诱导的组织塌陷，并且通过提高玻璃 转换温度的方式增强组织的稳定性。在干燥步骤中，如果组织的温度 高于玻璃转换温度，通过重结晶冰晶变大，结果引起组织的损伤。但 是，冷冻干燥保护剂不仅将对组织的损伤降低到最小，而且还缩短了 组织的干燥时间，这是由于冷冻干燥保护剂提高了玻璃转换温度，导 致玻璃状冰晶或者立方冰晶的比例在冷冻组织中提高的缘故，所述玻 璃状冰晶或者立方冰晶比六方冰晶不稳定并且更小。

作为冷冻干燥保护剂，根据它们的使用目的，诸如DMSO(二甲 亚砜)，葡聚糖，蔗糖，丙二醇，甘油，甘露醇，山梨醇，果糖，海藻 糖，棉子糖，2，3-丁二醇，HES(羟乙基淀粉)，PEG(聚乙二醇)，PVP(聚 乙烯吡咯烷酮)，脯氨酸，羟乙基淀粉(hetastarch)和血清白蛋白的材料 组合通常用于本领域中。这些材料被证明对人类是安全的。但是，已 经显示生产方法成本昂贵的缺点，因为组合条件非常复杂。

根据本发明，透明质酸被用作冷冻保护剂以提高用于移植的不含 细胞组织的稳定性以及移植以后的生物相容性。透明质酸是和水分子 具有高效反应的多糖，还是由多束D-葡萄糖醛酸/N-乙酰-D-葡糖胺二 糖单元形成的无支链的多糖，并且富含诸如皮肤或者软骨的多种组织 的细胞外基质。

透明质酸的主要功能包括填充间隙，稳定结构，细胞包被以及细 胞保护。透明质酸和纤维蛋白在细胞外基质形成整体系统，以提供具 有弹性，粘性，保护，润滑和稳定特征的基质。此外，透明质酸的高 度流动性在细胞外基质的水合作用中具有重要作用，并且使得代谢产 物以相对的浓度迅速扩散。

在本发明中，发现透明质酸由于其自身多糖结构用作冷冻保护 剂，因此，移植后在受体内提高了不含细胞组织的生物相容性。

本发明进一步描述在下列实施例中，但是下列实施例并不限制本

发明的范围。

实施例1：确定聚环氧化合物的处理条件

收集的猪皮保存在4℃、含50ng/ml两性霉素B(A-9528，Sigma， USA)和1mM EDTA的RPMI-1640(13200-076，Gibco-BRL，USA)培养 基中。然后，猪皮切割成1×2cm2小块制备试验样品。将样品温育 在330mM EDTA溶液中2小时以后，外皮层脱落。然后，用PB S清 洗皮层多次。清洗后的样品用不同浓度的DenacolTM EX-512(Nagase Chemical Company，Japan)在不同温度和pH下进行处理，然后测定样 品的交联指数并且彼此比较。

实施例1-1：在不同温度测定交联指数

试验样品在25℃或者37℃温育在50ml、pH 9.5的4％(w/v) DenacolTM EX-512溶液中，同时以30±5rpm进行振荡。温育3，6， 9，12，15，18或者24小时以后，利用水合茚三酮分析方法测定游离 氨基的含量。水合茚三酮和胶原蛋白的氨基酸反应形成蓝紫色。非交 联的样品用作对照。

在上述温育时间获得的样品在100℃和水合茚三酮反应20分钟， 并在570nm用分光光度计(Biomate 3，Thermo Spectronix)测定吸光度。 不同浓度的N-δ-乙酰赖氨酸用作标准曲线的校准值，样品中胶原蛋 白的摩尔浓度与游离氨基摩尔浓度成对照的值视为游离氨基。根据下 列公式计算交联指数(参见：图1)。

交联指数＝100×{1-(水合茚三酮的计算值)样品÷(水合茚三酮的计 算值)对照}

图1显示不同温度交联指数的比较。如图1所示，其说明：交联 指数随着反应时间的延长而成比例增加直到9小时，9小时以后轻微 增加；15小时以后，观察到交联形成；并且，随着温度的增加，交联 指数开始增加。

实施例1-2：在不同聚环氧化合物浓度下测定交联指数

试验样品在37℃温育在50ml、pH 9.5的0.5、1和4％(w/v) DenacolTM EX-512溶液中，同时以30±5rpm进行振荡。温育3，6，9， 12，15，18和24小时以后，参照实施例1-1测定游离氨基的含量， 并计算交联指数(参见：图2)。图2显示聚环氧化合物不同浓度下交联 指数的比较。如图2所示，交联指数随着聚环氧化合物浓度而成比例 增加。

实施例1-3：在不同pH下测定交联指数

试验样品37℃下温育在50ml的pH 8.5、9.5和10.5的4％(w/v) DenacolTM EX-512溶液中，同时以30±5rpm进行振荡。温育3，6，9， 12，15，18，和24小时以后，参照实施例1-1测定游离氨基的含量， 并计算交联指数(参见：图3)。图3显示不同pH下交联指数的比较。 如图3所示，发现随着pH值的增加交联指数开始增加。

从上述结果可以清楚地表明，样品的交联在4％(w/v)聚环氧化合 物，pH 9.5和37℃的条件下最优化。

实施例2：聚环氧化合物和透明质酸处理对于胶原蛋白结构降解的抑 制效果

收集的猪皮保存在4℃以下，含5μg/ml庆大霉素(G-1397，Sigma， USA)，50ng/ml两性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培养基 中。然后，将猪皮的真皮面向下放入24.5×24.5cm2的生物测定皿 (Nalgene，USA)中，并将猪皮的一角切开以辨别表皮面和真皮面。然 后猪皮切割成6×10cm2的长方形制备试验样品。将样品转入无菌平 皿(每个平皿三个样品)中，并将50ml含330mM EDTA的0.5％鱼精 蛋白溶液倒入每个平皿中，并在室温下温育2小时，同时以45±5rpm 振荡。随后，利用小镊子将表皮层和真皮层分开。用PBS多次清洗真 皮层，然后分成三个实验组：

第一组(PE+HA)在37℃下温育在50ml含1％(w/v)Tween 20的4％ (w/v)DenacolTM EX-512溶液中15小时，同时以30±5rpm振荡并用 PBS清洗。样品在37℃下温育在50ml的0.5％透明质酸中1小时，同 时以30±5rpm振荡。去除透明质酸溶液以后，用PBS清洗样品，并 且再次在37℃下温育在50ml的0.5％透明质酸中1小时，同时以30 ±5rpm振荡。

第二组(PE)用和第一组类似的方式进行处理，除了不用透明质酸 处理。

第三组(无PE和HA)在室温下温育在50ml的0.5％(w/v)SDS溶 液中12小时，并用PBS清洗。然后，样品在室温下温育在50ml的10 ％(v/v)甘油中2小时。

在上述实验组温育之后，将样品的真皮面向上放入生物测定皿 中。生物测定皿放入冷冻干燥器(Ultra 35super LE，Virtis，USA)中，所 述冷冻干燥器的架子温度最低为-50℃，冷凝器温度最低为-60℃。然 后样品以每分钟-2.5℃的降低速率将架子温度迅速降低到-40℃，并保 持10分钟。然后，在真空条件下非常缓慢提高架子的温度达到30℃， 历时30到40小时，目的是干燥样品。干燥样品的最终湿度低于5％ (w/w)。干燥后，生物测定皿转入层流罩，其中干燥的真皮通过真空包 装的方法进行包装，并保存在4℃。

每个实验组冷冻干燥的样品被切割成1×3cm2的小块，在37℃ 下温育在含胶原酶(1U/ml)的10mM CaCl2溶液中25小时，并且每隔1 小时进行收集。把这样收集的样品称重，并且和胶原酶处理之前的重 量进行比较以分析样品的降解水平(参见：图4)。图4显示胶原酶降解 皮层。如图4所示，发现聚环氧化合物和透明质酸的处理有效降低了 胶原酶的降解。

结果，可以清晰的发现，由聚环氧化合物和透明质酸处理的皮层 较传统处理方法有更稳定的胶原蛋白结构。

实施例3：利用牛胎盘制备用于组织修复的生物材料

收集的牛胎盘组织立即放入含有5μg/ml庆大霉素，50ng/ml两 性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培养基中，并且转入冰包 被容器，以保持温度低于4℃，直到传送到超净台。送来的胎盘组织 浸入含有5μg/ml庆大霉素的Dulbecco氏磷酸缓冲盐(21600-010， GIBCO-BRL，USA)中。将血液和碎片去除后，从胎盘组织分离羊膜。 将羊膜的基质面向下放入生物测定皿(Nalgene，USA)中，组织的一角 切开以辨别表皮面和真皮面。然后羊膜被切割成6×10cm2的长方形 小块，制备试验样品。样品转入平皿(每个平皿三个样品)，并将50ml 含330mM EDTA的0.5％鱼精蛋白溶液倒入每个平皿中，并在室温下 温育2小时，同时以45±5rpm振荡。在37℃下将样品温育在50ml 含0.5％(w/v)SDS的4％(w/v)DenacolTM EX-512溶液中15小时，同时 以30±5rpm振荡，并再次用PBS清洗。样品在37℃下温育在50ml 的0.5％透明质酸中1小时，同时以30±5rpm振荡。将透明质酸溶液 去除后，样品用PBS清洗并且再次在37℃下温育在50ml的0.5％透 明质酸中1小时，同时以30±5rpm振荡。如实施例2所述，上述样 品真皮面向上放入生物测定皿中并且进行冷冻干燥。

实施例4：分析根据研磨方法所得的粉末大小的分布

使用两种研磨方法研磨在实施例3中制备的用于组织修复的生物 材料，获得精细的可注射粉末：第一种方法就是在液氮的环境下通过 安装在研磨机上锯齿的机械转动来研磨5g冷冻干燥的用于组织修复 的生物材料；以及第二种方法就是在封闭容器中倾入5g冷冻干燥的 用于组织修复的生物材料，并用安装在冷冻研磨机(Freezer mill 6850， Spex CertiPrep，USA)中容器的冲击器研磨，同时向机器内通氮气。将 上述两种方法研磨的生物材料的粉末大小彼此比较(参加图5)。图5显 示由上述两种研磨方法研磨的粉末大小。如图5所示，显示利用冷冻 研磨机通过控制冲击器冲击数目的方式研磨可以获得大于70％、尺寸 为100-500μm的生物材料粉末，而利用转动速率不可控制的锯齿进 行研磨可以获得超过60％、尺寸大于500μm的生物材料粉末。

实施例5：确定用于移植的生物材料的最佳浓度

对8周龄的雄性小鼠(Joongang Laboratory Animals CO.LTD.， Korea)，进行皮下移植以优化实施例3制备的生物材料粉末的移植量。

在超净台上将生物材料粉末注射到由乙醚麻醉的小鼠腹部皮肤， 其中实验组根据粉末大小分成三个实验组，即100μm＞，100-500μ m.500μm＜，然后根据粉末浓度分成三个实验组，即250mg/ml， 350mg/ml，450mg/ml。

用于组织修复的可注射生物材料通过将每种含量的上述粉末和 1ml的PBS在leur-lok注射器中混合进行制备。0.5ml的混合物利用26 号针头皮下注射到腹部。在24周内以固定间隔(即1，2，4，8，12， 16，20和24周)用肉眼监控移植生物材料的持续时间(参见：图6)。 图6显示根据用于组织修复的生物材料的大小以及注射浓度在小鼠皮 下层中的持续时间。如图6所示，检测发现生物材料的持续时间不考 虑粉末大小在450mg/ml时最长，而尺寸为100-500μm表现出最长的 持续时间。

因此，可以很清楚地表明，为了在移植以后使生物材料的持续时 间最长，粉末的最佳大小为100-500μm，而粉末的最佳浓度为 450mg/ml。

实施例6：利用猪皮制备用于组织修复的生物材料和移植

收集的猪皮保存在4℃以下的含5μg/ml庆大霉素，50ng/ml两 性霉素B以及1mM EDTA的RPMI-1640培养基中。然后，将猪皮 的真皮面向下放入生物测定皿中，并将猪皮的一角切开以辨别表皮面 和真皮面。然后猪皮切割成6×10cm2的长方形小块制备试验样品。 将样品转入无菌平皿(每个平皿三个样品)，并将50ml含330mM EDTA的的0.5％鱼精蛋白溶液倒入每个平皿中，以及在室温下温育2 小时，同时以45±5rpm振荡。随后，利用小镊子将表皮层和真皮层 分开。用PBS清洗皮层，并且在37℃下温育在50ml含1％(w/v)Tween 20的4％(w/v)DenacolTM EX-512溶液中15小时，同时以30±5rpm 振荡，并再次用PBS清洗。清洗后的皮层在37℃下温育在50ml的0.5％ 透明质酸中1小时，同时以30±5rpm振荡。将透明质酸去除后，用 PBS清洗，皮层再次在37℃下温育在50ml的0.5％透明质酸中1小时， 同时以30±5rpm振荡。上述皮层如实施例2所述进行冷冻干燥。4g 的冷冻干燥生物材料如实施例4所述在冷冻研磨机中研磨成400μm 大小的粉末。可注射的生物材料以和实施例5类似的方式进行制备， 除了使用1.5ml的1％(v/v)利多卡因溶液代替1ml的PBS。

这样制备的可注射生物材料如实施例5所述注射到雄性小鼠的皮 下层。1周，1个月，和12个月以后，从注射区收集皮下组织，并用 溶血毒素和伊红(H&E)染色后进行观察检查小鼠细胞的渗透和分裂(参 见：图7a，7b和7c)。图7a，7b，和7c分别为显示皮下注射1周，1 个月和1年以后皮组织的照片。如图7a所示，移植1周以后在注射 区边缘有很多小鼠细胞被渗透和分裂，而中间有少数细胞开始分裂； 在图7b中，移植1个月以后，虽然移植生物材料和小鼠组织的边缘 明显，小鼠细胞在注射区的中间以及边缘分裂活跃，而且移植的生物 材料开始自身组织发生；在图7c中，在移植12个月以后，小鼠细胞 填充了注射区，边缘消失，完成自身组织发生。

如上所示和所述，本发明提供了制备用于组织修复的方法，其包 括从哺乳动物获得的基于胶原蛋白的组织胶原蛋白的交联，对组织进 行去细胞，并通过使用防冻液对不含细胞的组织进行冷冻干燥的步 骤，还提供了由上述方法制备的用于组织修复的生物材料。本发明制 备用于组织修复的生物材料的方法包括下列步骤：从哺乳动物获得基 于胶原蛋白的生物组织；用聚环氧化合物处理生物组织从而获得具有 交联胶原蛋白结构的生物组织；对获得的生物组织去细胞产生不含细 胞的组织；以及将不含细胞组织浸入含有透明质酸的冷冻保护液并将 上述组织冷冻干燥。根据本发明，具有更稳定的胶原蛋白结构用于组 织修复的生物材料可以通过较现有技术更简单的方法进行制备，这使 得经济制备多种用于组织修复的生物材料成为可能。

发明背景