技术领域
[0001] 本
发明涉及
显微镜技术领域，尤其是涉及一种结合自适应再扫描技术的双光 子显微成像系统。
背景技术
[0002] 双光子
荧光显微成像技术利用
近红外的飞秒激光作为
光源，可以对较厚的生 物组织进行
生物显微成像，具有成像深度大、光损伤小、空间
分辨率和
对比度高 等特点。使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有
光漂白和光毒 性，所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、观察活细胞、 或用来进行定点光漂白实验，但是显微图像的分辨率对观察实验结果影响很大， 现有的双光子荧光显微成像技术在分辨率方面还有待改进。
发明内容
[0003] 针对上述技术问题，本发明提供了一种结合自适应再扫描技术的双光子显微 成像系统，通过简单的结构实现高分辨率的双光子荧光显微成像。所述技术方案 如下：
[0004] 本发明
实施例提供了一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，包 括激光发射源、
变形镜、物镜、分束镜、第一扫描振镜、第二扫描振镜以及图像 探测器；其中，由所述激光发射源发出的光束定向到所述第一扫描振镜，形成第 一光路；所述光束通过所述第一扫描振镜到达所述变形镜，形成第二光路；所述 光束从所述变形镜到所述物镜，形成第三光路；
[0005] 在所述第二光路还设有第一透镜对，所述第一透镜对用于构建所述第一扫描 振镜与所述变形镜的共轭关系；
[0006] 在所述第三光路还设有第二透镜对，所述第二透镜对设置于所述变形镜与所 述物镜之间；
[0007] 所述物镜，用于激发并收集荧光光束；
[0008] 所述分束镜，用于将通过所述物镜且沿着所述第三光路和所述第二光路返回 的荧光光束反射到所述第二扫描振镜；
[0009] 所述图像探测器，用于通过所述第二扫描振镜的成像光路获取图像。
[0010] 作为优选方案，所述的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，还包 括光学强度控制组件；所述光学强度控制组件设于所述第一光路，并且设于所述 激光发射源与所述第一扫描振镜之间。
[0011] 作为优选方案，所述光学强度控制组件包括二分之一波片和偏振片；其中， 所述激光发射源发出的光束首先透过所述二分之一波片再透过所述偏振片。
[0012] 作为优选方案，所述的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，还包 括若干设于所述第一光路的透镜和光阑；所述若干透镜、若干光阑在所述第一光 路交错排列。
[0013] 作为优选方案，所述透镜和所述光阑各有两个；所述两个透镜的焦距比为1:5。
[0014] 作为优选方案，所述的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，还包 括聚焦透镜；所述聚焦透镜设于所述第二扫描振镜的成像光路。
[0015] 作为优选方案，所述的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，还包 括滤光片；所述滤光片设于所述第二扫描振镜的成像光路。
[0016] 作为优选方案，所述的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，还包 括波前
传感器、第三透镜对以及回转镜；其中，所述回转镜改变所述第二扫描振 镜的成像光路，形成第四光路；
[0017] 所述回转镜和所述波前传感器分别设置于所述第四光路的首端和末端，所述 第三透镜对设置于所述回转镜和所述波前传感器之间的第四光路。
[0018] 作为优选方案，所述第二扫描振镜的扫描振幅为所述第一扫描振镜的两倍。
[0019] 作为优选方案，在所述第四光路还设有发射滤光片；所述发射滤光片设于所 述波前传感器的光收集口的前置
位置。
[0020] 相比于
现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
[0021] 本发明提供一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，包括：激光 发射源、变形镜、物镜、分束镜、第一扫描振镜、第二扫描振镜以及图像探测器； 所述激光发射源发出的光束依次经过所述第一扫描振镜、所述变形镜、所述物镜， 并通过所述物镜后在实验样品处产生衍射极限激发；荧光被激发后，由所述物镜 收集荧光，并且该荧光依次经过所述变形镜、所述分束镜、所述第二扫描振镜后 成像到图像探测器，从而获取到高分辨率的图像。本发明的结合自适应再扫描技 术的双光子显微成像系统有两个二维扫描振镜，第一扫描振镜用于激发扫描，第 二扫描振镜用于发射扫描，且所述第二扫描振镜的扫描振幅为所述第一扫描振镜 的两倍，实现了再扫描的原理，从而获得高分辨率的图像，进而提高图像的分辨 率。而且，本发明的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统结构简洁，易 于搭建，实用性强。
附图说明
[0022] 图1是本发明实施例中的一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统 的结构图；
[0023] 图2是本发明实施例中的一种优化的结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统的结构图；
[0024] 其中，1、飞秒
激光器；2、1/2波片；3、偏振器；4、第一反射镜；5、透镜； 6、光阑；7、透镜；8、光阑；9、第一扫描振镜；10、分束镜；11、第一透镜对 中的其中一个透镜；12、第二反射镜；13、第一透镜对中的另一个透镜；14、变 形镜；15、第二透镜对中的其中一个透镜；16、第二透镜对中的另一个透镜；17、 物镜；18、样品；19、第二扫描振镜；20、第三反射镜；21、第三透镜对中的其 中一个透镜；22、第三透镜对中的另一个透镜；23、发射滤光片；24、夏克哈特 曼波前传感器；25、回转镜；26、聚焦透镜；27、滤光片；28、图像探测器；29、 第一光路；30、第二光路；31、第三光路；32、成像光路；
[0025] 图中灰色的光路表示激发光光路，黑色的光路表示被激发的荧光光路。
具体实施方式
[0026] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳 动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027] 本发明提供一种示例性实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，包括：激光发射源、变形镜、物镜、分束镜、第一扫描振镜、第二扫描 振镜以及图像探测器；其中，由所述激光发射源发出的光束定向到所述第一扫描 振镜，形成第一光路；所述光束通过所述第一扫描振镜到达所述变形镜，形成第 二光路；所述光束从所述变形镜到所述物镜，形成第三光路；
[0028] 在所述第二光路还设有第一透镜对，所述第一透镜对用于构建所述第一扫描 振镜与所述变形镜的共轭关系；
[0029] 在所述第三光路还设有第二透镜对，所述第二透镜对设置于所述变形镜与所 述物镜之间；
[0030] 其中，所述第二透镜对用于将变形镜成像到物镜的后焦面，从而在样品处产 生衍射极限激发；荧光被激发后，所述物镜还用于收集荧光；
[0031] 所述分束镜，用于将通过所述物镜且沿着所述第三光路和所述第二光路返回 的荧光光束反射到所述第二扫描振镜；
[0032] 所述图像探测器，用于通过所述第二扫描振镜的成像光路获取图像。
[0033] 在本实施例中，所述激光发射源为飞秒激光器；所述第一透镜对、所述第二 透镜对的透镜焦距相等。
[0034] 请参见图1，具体成像过程：所述飞秒激光器1发出的光束定向到所述第一扫 描振镜9，随后该光束通过所述第一扫描振镜9后，通过所述第一透镜对并到达所 述变形镜14，在所述第一透镜对的作用下，所述第一扫描振镜9表面的每一个点 与所述变形镜14的位置共轭；经所述变形镜14反射后，该光束通过所述第二透镜 对到达所述物镜17；在所述第二透镜对的作用下，所述变形镜14成像到所述物镜 17的后焦面上，从而在样品上产生衍射受限的激发光。随后，受激发射产生荧光， 从所述物镜17收集荧光并形成荧光光束，该荧光光束沿着相同路径返回，并且经 过所述分束镜10时，所述分束镜10将荧光转移到所述第二扫描振镜19；在所述第 一透镜对的作用下，所述物镜17的后焦面的成像光能够到达所述第二扫描振镜19，从而实现了再扫描(原理近似于再扫描rescan显微镜)，然后利用所述图像 探测器28通过所述第二扫描振镜19的成像光路获取图像，从而生成了超分辨率的 图像。
[0035] 本发明的结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统有两个二维扫描振 镜，第一扫描振镜用于激发扫描，第二扫描振镜用于发射扫描，且所述第二扫描 振镜的扫描振幅为所述第一扫描振镜的两倍，实现了再扫描的原理，从而获得高 分辨率的图像，进而提高图像的分辨率。而且，本发明的结合自适应再扫描技术 的双光子显微成像系统结构简洁，易于搭建，实用性强。
[0036] 所述再扫描提升分辨率的原理如下：
[0037] 在再扫描系统中，第二扫描振镜的扫描振幅为第一扫描振镜扫描振幅的两倍 (即第二扫描振镜可将相邻的发射焦点被增大为原来距离的两倍)。
[0038] 假设点扩散函数为高斯函数，经过再扫描后光斑的横向宽度W(FWHM)的理 论表达式为：
[0039]
[0040] 其中，Wem和Wex分别为发射点扩散函数和激发点扩散函数的宽度，M为扫描 的扩展系数，即发射扫描振镜对相邻发射焦点之间增加距离的倍数。当取极限 M＝1时，W＝Wem，分辨率仅由发射光路决定，这时的显微镜相当于宽场荧光显 微镜。为放大解耦找到了最佳(最小)光斑宽度，即分辨率最高的情形，得到以下 关系式：
[0041]
[0042] 最佳(最小)光斑宽度为：
[0043]
[0044] 如果激发光斑和发射光斑的宽度相等，该式有最小值，此时可以得到M＝2[0045] 并且有 故设置两个扫描振镜进行二次扫描，第二扫描振镜 的扫描振幅为第一扫描振镜振幅的两倍的操作可以提高分辨率。
[0046] 本发明还提供一种优选实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，还包括光学强度控制组件；所述光学强度控制组件设于所述第一光路， 并且设于所述激光发射源与所述第一扫描振镜之间。
[0047] 所述光学强度控制组件包括二分之一波片和偏振片；其中，所述激光发射源 发出的光束首先透过所述二分之一波片再透过所述偏振片。
[0048] 可以理解的是，激光由飞秒激光器产生，通过二分之一波片和偏振片实现光 学强度的控制。
[0049] 本发明还提供一种优选实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，还包括若干设于所述第一光路的透镜和光阑；所述若干透镜、若干光阑 在所述第一光路上交错排列。
[0050] 所述透镜和所述光阑各有两个；所述两个透镜的焦距比为1:5。
[0051] 可以理解的是，所述透镜和所述光阑分别用于扩展光束和限制光束。
[0052] 本发明还提供一种优选实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，还包括聚焦透镜；所述聚焦透镜设于所述第二扫描振镜的成像光路。
[0053] 本发明还提供一种优选实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，还包括滤光片；所述滤光片设于所述第二扫描振镜的成像光路。
[0054] 本发明还提供一种优选实施例，一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成 像系统，还包括：波前传感器、第三透镜对以及回转镜；其中，所述回转镜改变 所述第二扫描振镜的成像光路，形成第四光路；
[0055] 所述回转镜和所述波前传感器分别设置于所述第四光路的首端和末端，所述 第三透镜对设置于所述回转镜和所述波前传感器之间的第四光路。
[0056] 所述第二扫描振镜的扫描振幅为所述第一扫描振镜的两倍。
[0057] 所述第三透镜对形成一组消色差透镜，发射滤光片用于过滤激发光和杂散的 荧光。
[0058] 所述波前传感器为夏克哈特曼传感器。
[0059] 夏克哈特曼传感器用于实现直接的波前传感，可变形镜用于像差校正。通过 夏克哈特曼传感器内部的
软件处理获取波前
信号，计算出变形镜上的校正
电压， 将该电压值施加到变形镜上减小像差。
[0060] 在所述第四光路还设有发射滤光片；所述发射滤光片设于所述夏克哈特曼传 感器的光收集口的前置位置。
[0061] 可以理解的是，在所述第二扫描振镜的成像光路，回转镜对成像光路进行翻 转，翻转后荧光光束通过第三透镜对和发射滤光片送至夏克哈特曼传感器进行测 量。
[0062] 本优选实施例有利于控制像差，为了控制像差，通过焦距相等的第二透镜对， 将物镜后焦面成像到变形镜上。焦距相同的第一透镜对确保变形镜与起激发扫描 作用的第一扫描振镜成光学共轭关系，从而可以在激发路径和发射路径中使用相 同的变形镜设置。变形镜通过分布在反射镜背面的作动器阵列向反射镜施加轴向 作用
力进行镜面面形控制及波面误差的校正，可用来对有像差的光学波前进行修 正。一旦变形镜进行了适当的校正，发射的荧光将不再传入波前传感器，而是通 过回转镜将校正后的光束成像到图像探测器。
[0063] 变形镜和夏克哈特曼通过开发商提供的相应的软件控制以纠样品中的光学 畸变。软件内部具体的实现过程：自适应光学像差修正包括三个步骤。首先，建 立了泽尼克波前模式的振幅与变形镜上的电压之间的相互作用矩阵。其次，用夏 克哈特曼传感器测量波前，并计算出变形镜上必要的校正电压。第三，对变形镜 施加校正电压，消除或减少像差。
[0064] 本优选实施例，针对光学系统中像差的存在会降低系统的成像
质量，通过引 入变形镜和波前传感器校正了像差，从而将双光子成像与自适应光学技术有机结 合起来，有效纠正光学畸变，提升图像分辨率。
[0065] 请参见图2，其示出了本发明的一种具体的实施例，一种结合自适应再扫描 技术的双光子显微成像系统，包括：飞秒激光器1、1/2波片2、偏振器3、第一反 射镜4、透镜5、光阑6、透镜7、光阑8、第一扫描振镜9、分束镜10、第一透镜对 中的其中一个透镜11、第二反射镜12、第一透镜对中的另一个透镜13、变形镜14、 第二透镜对中的其中一个透镜15、第二透镜对中的另一个透镜16、物镜17、实验 样品18、第二扫描振镜19、第三反射镜20、第三透镜对中的其中一个透镜21、第 三透镜对中的另一个透镜22、发射滤光片23、夏克哈特曼波前传感器24、回转镜 25、聚焦透镜26、滤光片27、图像探测器28。
[0066] 激光由飞秒激光器1产生，激光光束由飞秒激光器1到第一扫描振镜9，形成 第一光路29；1/2波片2和偏振片3设于第一光路29，光束通过1/2波片2和偏振片3 以实现光学强度的控制；光束经过第一反射镜4反射后，依次透过透镜5、光阑6、 透镜7、光阑8，实现光束扩展，扩展后的光束定向到第一扫描镜上9；第一扫描 振镜9激发扫描的光束，依次经过第一透镜对中的其中一个透镜11、第二反射镜 12、第一透镜对中的另一个透镜13后，最终到达变形镜14以形成第二光路30，在 变形镜14形成反射；从变形镜14到物镜17形成第三光路31，经过变形镜14反射的 光束依次透过第二透镜对15、16，并成像到物镜17的后焦面(即样品平面)，从 而在样品处产生衍射极限激发。荧光被激发后，物镜17收集荧光，沿着第三光路 31、第二光路30返回；在透镜11和第一扫描振镜9中间放置一个分束镜10，该分 束镜10使得激发的荧光光束反射到第二扫描振镜19上；由于共轭关系，使得物镜 17后焦面(样品平面)成像到第二扫描振镜19上；在所述第二扫描振镜19的成像 光路32，回转镜25对荧光光路进行翻转，并经过第三反射镜20反射后，透过第三 透镜对21、22和发射滤光片23的荧光光束传送至夏克哈特曼传感器24进行测量； 依据夏克哈特曼传感器24所得的测量值对变形镜14进行校正，一旦变形镜14进行 了适当的校正，发射的荧光将不再传入夏克哈特曼传感器24，在回转镜25的作用 下，校正后的光束通过聚焦透镜26、滤光片27，成像到图像探测器28从而得到高 分辨率的图像。
[0067] 在本发明实施例中，这四组透镜对均置于4f成像系统中，从而确保二维扫描 振镜平面、变形镜平面、物镜后焦平面的共轭关系，即实现了将物镜的后焦平面 (样品平面)映射到该传感器上。
[0068] 本实施例的一种结合自适应再扫描技术的双光子显微成像系统，结构简单， 占用空间小；一方面通过两个扫描振镜分别对激发光和发射光进行扫描，即再扫 描操作以提升分辨率；另一方面是通过变形镜和波前传感器的引入校正了像差， 由于光学系统中像差的存在会降低系统的成像质量，故对系统进行像差校正可提 升图像分辨率。
[0069] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也视为本发明的保护范围。
