具有双光子激发的STED荧光显微术
专利汇可以提供具有双光子激发的STED荧光显微术专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于使样本中的用 荧光 染料标记的结构高空间分辨地成像的方法，其中，将脉冲化的激发光(5)聚焦到该样本中，以便激发处于一个焦点区域中的 荧光染料 自发发射荧光，其中，使具有与激发光(5)不同的 波长 的退激光(10)指向该样本，以便使荧光染料在一个相对于该焦点区域缩小的测量区域外部在自发发射荧光之前退激，其中，记录由该荧光染料自发发射的荧光，其中，这样选择该激发光(5)的波长，使得该激发光(5)通过多 光子 过程激发该荧光染料，该退激光(10)具有比该激发光(5)短的波长，该退激光在该激发光(5)的多个脉冲(19)上连续地指向该样本。，下面是具有双光子激发的STED荧光显微术专利的具体信息内容。
1.用于使样本中的用荧光染料标记的结构高空间分辨地成像的方法，其中，将脉冲化的激发光聚焦到该样本中，以便激发处于一个焦点区域中的荧光染料自发发射荧光，其中，使具有与激发光不同的波长的退激光指向该样本，以便使被激发的荧光染料在一个相对于该焦点区域缩小的测量区域外部在该荧光染料自发发射之前退激，其中，记录由该荧光染料自发发射的荧光，其特征在于：这样选择该激发光(5)的波长，使得该激发光(5)通过多光子过程激发该荧光染料；该退激光(10)具有比该激发光(5)短的波长，该退激光在该激发光(10)的多个脉冲(19)上连续地指向该样本(2)。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于：在该激发光(5)的多个脉冲(19)上连续地记录由该荧光染料自发发射的荧光(13)。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于：用二极管激光器(9)提供该退激光(10)。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于：以至少80MHz、优选至少100MHz、更优选至少120MHz、最优选至少150MHz的频率将该激发光(5)脉冲化。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其特征在于：该激发光(5)的各个脉冲(19)具有其脉冲间距的最高十分之一、优选最高百分之一、更优选最高千分之一、最优选最高万分之一的持续时间。
6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于：对具有该测量区域或多个同类测量区域的所述样本(2)在三维上进行扫描，对来自所述多个同类测量区域的、由该荧光染料自发发射的荧光(13)在空间上分开地进行记录。
7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于：该退激光(10)在该激发光(5)的光学轴线的方向上在该测量区域之前和之后指向该样本(2)。
8.根据权利要求1至7之一的方法，其特征在于：该激发光(5)和该退激光(10)分别在该激发光(5)的多个脉冲(19)之后中断一个有限时间间隔(18)。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于：所述中断的有限时间间隔(18)具有0.5至50μs、优选1至2μs的持续时间。
10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于：该激发光(5)的多个脉冲(19)的一个时间间隔是100ns至50μs、优选0.5至2μs。
11.用于使样本中的用荧光染料标记的结构高空间分辨地成像的装置，该装置具有：用于脉冲化的激发光的激发光源；将该激发光聚焦到该样本中的光学装置，用于激发处于一个焦点区域中的荧光染料自发发射荧光；用于退激光的退激光源，该退激光具有与该激发光不同的波长；使该退激光指向该样本的光学装置，用于使该荧光染料在一个相对于该焦点区域缩小的测量区域外部退激；以及探测器，该探测器记录由该荧光染料自发发射的荧光，其特征在于：该激发光源(3)辐射出该激发光(5)，该激发光具有这样的波长，使得该激发光(5)通过多光子过程激发该荧光染料；该退激光源(8)使该退激光(10)在该激发光(5)的多个脉冲(19)上连续地指向该样本(2)，该退激光具有比该激发光(5)短的波长。
12.根据权利要求11的装置，其特征在于：该探测器(12)在该激发光(5)的多个脉冲(19)上连续地记录由该荧光染料自发发射的荧光(13)。
13.根据权利要求11或12的装置，其特征在于：该退激光源(8)具有二极管激光器(9)。
14.根据权利要求11至13之一的装置，其特征在于：该激发光源(5)具有脉冲激光器(6)，该脉冲激光器输出该激发光(5)，该激发光呈脉冲(19)形式，所述脉冲具有至少80MHz、优选至少100MHz、更优选至少120MHz、最优选至少150MHz的频率。
15.根据权利要求11至14之一的装置，其特征在于：该激发光源(3)具有脉冲激光器(4)，该脉冲激光器输出该激发光(5)，该激发光呈单个脉冲(19)形式，所述脉冲具有所述脉冲的间距的最高十分之一、优选最高百分之一、更优选最高千分之一、最优选最高万分之一的持续时间。
16.根据权利要求11至15之一的装置，其特征在于：设置有扫描装置(16)，该扫描装置对具有该测量区域或多个同类测量区域的所述样本(2)在三维上进行扫描，该探测器(12)对来自所述多个同类测量区域的、由该荧光染料自发发射的荧光(13)在空间上分开地进行记录。
17.根据权利要求11至16之一的装置，其特征在于：使该退激光(10)指向该样本的光学装置(6)这样改变该退激光的平面波前，使得该退激光(10)在该激发光(5)的光学轴线的方向上在该测量区域之前和之后具有强度最大值。
18.根据权利要求11至17之一的装置，其特征在于：设置有控制装置，该控制装置使该激发光(5)和该退激光(10)的入射分别在该激发光(5)的多个脉冲(19)之后中断一个有限时间间隔(18)。
19.根据权利要求8的装置，其特征在于：所述有限时间间隔(18)至少可在1至2μs、优选0.5至3μs的持续时间的范围内调节。
20.根据权利要求8或9的装置，其特征在于：该激发光(5)的多个脉冲(19)的一个时间间隔至少可在100ns至50μs、优选0.5至2μs的范围内调节。
技术领域
本发明涉及用于使样本中的用荧光染料标记的结构高空间分辨地成像的具有独立权利要求1前序部分特征的方法和具有独立权利要求11前序部分特征的装置。
背景技术
具有独立权利要求1前序部分特征的方法和具有独立权利要求11前序部分特征的装置已由US 5,731,588公知。在此提一下，激发光源可以是连续波激光器(英文：continous wave Laser＝cw-激光器)，而退激光源可以是脉冲激光器，该脉冲激光器与探测器同步，以便分别在退激光的一个脉冲衰退之后才记录样本的荧光。以此方式避免探测器检测到由样本反射的退激光或其发射由退激光激励并且因此不是源于所感兴趣的测量区域的荧光。作为提取自发发射的荧光的替换可能性，描述了激发光的极化和在相对于激发光的极化正交的方向上由样本投射到探测器上的光的极化滤波。
在具有独立权利要求1前序部分特征的STED荧光显微术的一个方法中，为了当在激发光的每个脉冲之后在测量区域外部使荧光染料又退激时实现期望的饱和，有意义的是，供退激光使用的平均光强度也集中于脉冲，这些脉冲尽可能在时间上接近激发光脉冲地施加在样本上，以便给荧光染料在测量区域外部尽可能少地提供自发发射荧光的条件。所述在时间上接近可通过直接序列或者部分或甚至完全的时间重叠来实现。但该序列的前提条件是必要时除了探测器与退激光脉冲同步之外退激光脉冲与激发光脉冲同步。
因此，实际实现STED荧光显微镜的投入或者用于STED荧光显微术的传统荧光显微镜的改装的投入之所以高，只是因为用于激发光和退激光的可同步的脉冲激光器昂贵。还有就是激光脉冲不是从一开始就具有STED荧光显微术所需的脉冲持续时间。除了同步之外，脉冲的所需的时间延续和通过色散光学元件如光栅或玻璃纤维装置的准备导致技术财力上的投入高并且导致功能易受干扰。
在cw-激光器的领域内，原则上可提供成本较低廉的激光器，例如呈所谓二极管激光器的形式，这种二极管激光器具有一个或多个电泵浦激光二极管。由此自动取消脉冲准备和同步化。但如果将二极管激光器改变用于辐射脉冲，则通过这种二极管激光器原则上不能在技术财力上带来优点。
在STED荧光显微术的公知形式中，被证实困难的是，使测量区域沿着光学轴线收缩，因为通过荧光染料的单光子激发原则上不可将激发限制到焦平面或焦体积上。完全一样，也不可将退激光限制到焦平面上。这意味着，荧光染料在焦平面的下方或上方被激发并且由此也通过退激光退激或必须通过退激光退激。虽然可通过在探测器之前使用共焦孔眼光阑来使测量区域沿着光学轴线减小到焦平面，但这意味着，荧光染料在焦平面外部被多余地激发和退激，这导致荧光染料通过退激射束显著脱色，由此在染料很多的情况下妨碍3D图像的拍摄。
作为将样本的荧光显微成像限制到焦平面上并且沿着光学轴线实现选择性的可能性，已经公知，用激发光通过多光子过程激发荧光染料。在此，激发光原则上可具有不同波长的份额，并且，三个或者甚至更多个单个光子可参与多光子过程。但在荧光染料的多光子激发的实际中，通常用仅一个波长的激发光进行双光子激发，其中，光子分别为多光子过程所需全部光子能量的一半作出贡献。在焦平面上激发的选择性在此基于激发光的强度与荧光染料在其通过多光子过程发荧光的状态中的激发概率之间的非线性。在双光子激发中，这种激发概率与激发光强度的平方相关，由此集中到样本中激发光的焦点区域的衍射主最大值上。鉴于荧光染料基于多光子过程的跃迁概率原则上较小，为了获得样本的荧光的足够增益，而无需用极大强度的激发光加载样本，已经公知，将激发光在时间上聚集成单个脉冲。只是由于激发光的这种在时间上的集中以及激发光的每一个脉冲中随之而来的提高的光子集中，荧光的增益相对于连续地、即以在时间上恒定的强度入射到样本上的激发光明显提高。例如在双光子激发的情况下，激发光在时间上集中到时间的十分之一使得激发光的强度在时间的十分之一中提高到十倍，由此使得在时间的该十分之一期间荧光的增益提高到102＝100倍。由此，平均在该时间上在平均功率相同的情况下荧光强度总是上升100/10＝10倍。
由DE 102005027896.5A1例如在STED荧光显微术中、但也在荧光染料的多光子激发下的荧光显微术中已经公知，投射到样本上的光学信号的在时间上的重复间距在至少0.1μs至2μs的范围内变化，以便使荧光增益最大化。在此，如果设置有一个用于用光学信号在空间上扫描样本的扫描装置，则光学信号可来自连续波激光器，所述扫描装置具有这样的扫描速度，使得出现期望的重复间距。通过重复间距提供的停顿允许使荧光染料从暗态、尤其是三重态衰减返回到其能发荧光的单态中。
由WO 2007/030835A2公知了一种用于使样本中的用荧光染料标记的结构高空间分辨地成像的方法以及适用于该方法的装置。荧光染料涉及具有暗态和荧光状态的化合物，在该暗态中，该化合物不可被激发出荧光，在该荧光状态中，该化合物可被激发光激发出荧光。化合物可通过接通光从暗态接通到荧光状态中，其中，到荧光状态的跃迁应经由中间状态进行，化合物应可在接通光的一个脉冲之后通过转回光的一个脉冲从该中间状态跃回到暗态中。接通的状态通过该转回光而相对于接通光的焦点区域缩小到测量区域。真正的测量于是通过激发光进行，该激发光在荧光状态中将化合物激发出荧光。该激发光可具有与转回光相同的波长，但具有不同的空间分布并且在任意情况下同时作为关断光起作用，该关断光使接通到荧光状态中的化合物关断返回到其暗态中。为了在此之后可继续测量，必须将接通光的另一个脉冲与转回光的下一个脉冲投射到样本上。脉冲化的接通光可具有这样的波长，使得该接通光将化合物通过多光子过程接通到其荧光状态中。同时作为关断光起作用的激发光可通过连续波激光器、例如二极管激光器来提供，该连续波激光器按照需求可被接通和关断。根据WO2007/030835A2不使用在自发发射荧光之前又使被激发出荧光的化合物退激的退激光。由该文献公知的方法以及为此所使用的装置的投入大，因为必须提供具有至少三个不同波长的光和/或空间分布，即接通光、转回光和也作为关断光起作用的激发光。此外必须提供彼此间精确同步的脉冲形式的接通光和转回光，因为其上可作用转回光的可转换的化合物的中间状态寿命短。在此，可转换的荧光团的使用已经是基本投入，该基本投入远远超过了简单荧光染料的投入。
在具有独立权利要求1前序部分特征的方法和具有独立权利要求11前序部分特征的装置中，由US 6,958,470B2已经公知，通过具有大约80MHz重复率的两个彼此同步的脉冲化的激光来提供激发光和退激光。
发明内容
本发明的任务通过具有独立权利要求1前序部分特征的方法以及通过具有独立权利要求11前序部分特征的装置来解决。该新方法的优选实施形式在从属权利要求2至10中定义，而从属权利要求12至20描述了新装置的优选实施形式。
在该新方法中，这样选择激发光的波长，使得激发光通过多光子过程激发该荧光染料。通常在此涉及双光子过程。将退激光脉冲化用于多光子激发，这以公知方式有利地影响基于多光子激发的荧光增益，而具有比激发光短的波长的退激光在激发光的多个脉冲上连续地或在一定程度上连续地指向样本。由于用激发光通过多光子过程激发荧光染料，其中进行荧光染料有效激发的焦点区域与通过单光子过程进行的可能激发相比明显在空间上得到限制。尤其是这种非线性的激发在大孔径物镜的情况下被限制到典型地～1μm的焦深上，该焦深相应于沿着光学轴线其衍射主最大值的大小。激发在空间上在3D上受到限制，由此，也必须使处于焦平面上方和下方的荧光染料很少退激或者甚至不退激。否则，尤其是处于焦点主最大值之外的荧光染料必须能通过单光子过程激发，不通过退激光退激。
优选这样选择退激光的波长，使得该波长落到染料的发射谱的红端中。因此原则上适用的是，用退激光加载不被激发的样本不导致褪色，因为该退激光的光子能量对于激发荧光染料而言太小。退激光因此可使已经被激发的荧光染料不仅如期望的那样退激，而且也脱色。通过退激光进行的脱色仅在已经被激发的荧光染料上进行。
即因为通过多光子激发进行的激发从一开始就三维地收缩到衍射主最大值，所以荧光染料在其中必须退激的区域也减小。因为每荧光染料分子不必要的退激的数量降低，所以脱色也降低，这显著简化并且在多种染料的情况下甚至刚好允许通过STED荧光显微术进行的纳米级3D成像。如果多光子激发仅在1μm厚的层中进行，则在10μm厚的样本的情况下不必要的退激的数量降低10倍。即如果样本的在其中需要退激光的区域相对于测量区域可显著缩小，则通过退激光造成的脱色相应地降低。这通过将荧光染料通过多光子过程激发出荧光来实现。
由此可实现：退激光以连续的形式即以特别有利的方式施加到样本上，而在此不使荧光染料承受过载。在此意义下不仅由于放弃退激光脉冲而且由于由此取消建立激发光脉冲与退激光脉冲之间的同步的必要性而产生成本优点。因此，尤其是用于通过反正已经被改装来多光子激发荧光染料的荧光显微镜执行该新方法的投入仅与最小的附加投入相联系。仅仅还须用简单的连续波激光器提供退激光并且以合适的方式将其输入耦合到荧光显微镜的物镜中。
也可完全取消用于由荧光染料自发发射的荧光的探测器与激发光或退激光的某些脉冲的任意同步。因此，探测器可在激发光的多个脉冲上连续地记录由荧光染料自发发射的荧光。在此，探测器可将荧光例如通过边缘滤波器或窄带带通滤波器从退激光提取出来，但或者通过极化滤波器提取出来，为此则也将退激光有目的地极化。
在该新方法中特别优选的是，用二极管激光器提供退激光。这种二极管激光器可作为连续波激光器来提供，其成本大致是用于在STED荧光显微术的情况下提供退激光的否则常用的脉冲激光器的成本的十分之一。
在该新方法中也可积极地看出，通过激发光对样本的有效的多光子激发在任意时刻也被限制到较小的空间区域，与荧光染料脱色的危险相应的激发光总负荷与荧光增益相比也降低。
在该新方法中，可以以至少80MHz、优选至少100MHz、更优选至少120MHz、最优选至少150MHz的相对高的频率将激发光脉冲化。至少通过最后两个数据超过通常在STED荧光显微术中使用的脉冲激光器的频率范围。该范围大致为80至100MHz。由于激发光的脉冲的非常高的频率，激发光的脉冲之间的停顿非常短。由此防止退激光的非常大的份额投射到样本上，而在那里荧光染料的非常大的份额不处于基本状态中。
激发光的各个脉冲如在荧光显微术中那样在荧光染料被多光子激发的情况下与其脉冲间距相比优选相对短。因此，激发光的各个脉冲可具有其脉冲间距的最高十分之一、优选最高百分之一、更优选最高千分之一、最优选最高万分之一的持续时间。如开头已经解释的那样，在激发射束的平均功率保持相同的情况下，样本的荧光的相对增益由此提高。
通过该新方法尤其是可对具有测量区域或多个同类测量区域的样本在三维上进行扫描，对来自所述多个同类测量区域的、由荧光染料自发发射的荧光在空间上分开地进行记录，其中，对在样本中用荧光染料标记的结构在三维上进行分辨。
为了尤其是在z方向上即在激发光的光学轴线的方向上获得所述分辨，有意义的是，退激光刚好在所述的方向上在测量区域之前和之后指向样本，如由文献Proc.Natl.Acad.Sc.USA，97，8206(2000)所公知的那样。在此，在测量区域处退激光的强度零点旁边的各一个最大值足以使在焦点区域中通过多光子激发来激发出荧光的荧光染料又退激。已经普遍公知了多个用于改变退激射束的方法和装置，这些方法和装置使得焦点测量区域有利地收缩：Phys.Rev.E，64，066613(2001)；Appl.Phys.B 77：11(2003)；New J.Phys.8：106(2006)。
也有利的是，在探测器之前设置一个共焦孔眼光阑，在多个焦点测量区域的情况下设置孔眼光阑的共焦阵列。孔眼光阑抑制退激射束和激发射束的散射光。在另一个特殊的实施形式中，荧光不通过光学扫描装置返回，而是以简化的光学方式、即如对于专业人员而言已经公知的“non-descanneddetection”被记录。
在该新方法的一个特殊实施形式中，激发光和退激光分别在激发光的多个脉冲之后中断一个有限时间间隔。这种中断的目的在于，期望在暗态在激发光的当前脉冲期间通过激发光已经以显著的程度迁移之后荧光染料从该暗态、尤其是其三重态衰减返回到其荧光单态中。暗态的这种迁移导致样本的荧光的增益减小，此外可与荧光染料的脱色危险的提高相联系。但在0.5至3μs、典型地1至2μs范围内的相对短的时间间隔上，暗态又逐渐衰退，由此，激发的相应中断导致样本的荧光的增益总体提高。有意义的是，与激发光的输入并行地也使退激光中断所述的时间间隔，以便并非不必要地对样本加载退激光。在激发光的停顿之间激发光的多个脉冲的时间间隔据此典型地取值为100ns至50μs、优选为0.5至2μs，在其上退激光连续地施加在样本上。该时间间隔的精确持续时间取决于：三重态或暗态实际上迁移多快。
在根据本发明的装置中，激发光源辐射出激发光，该激发光具有这样的波长，使得激发光通过多光子过程激发荧光染料，退激光源使退激光在激发光的多个脉冲上连续地指向样本，该退激光具有比激发光短的波长。
所述装置的探测器也在激发光的多个脉冲上连续地记录由荧光染料自发发射的荧光。
当退激光源具有连续发射的二极管激光器时，该新装置的实现是特别有利的。而激发光源具有脉冲激光器，该脉冲激光器输出激发光，该激发光呈脉冲形式，所述脉冲具有上述频率和就其间距而言相对的持续时间。在该新装置中设置有扫描装置，用于对具有测量区域或多个同类测量区域的样本在三维上进行扫描，探测器对来自所述多个同类测量区域的、由荧光染料自发发射的荧光在空间上分开地进行记录，该扫描装置原则上可使样本相对于荧光显微镜的其余部分运动。但优选也通过光学元件的移动来进行，该光学元件不仅属于使激发光聚焦到样本中的光学装置而且属于使退激光指向样本的光学装置。用于扫描被聚焦到样本上的射束的不同的装置对于专业人员已经充分由激光扫描显微术的文献公知。
为了使激发光和退激光的入射分别在激发光的多个脉冲之后中断有限时间间隔，该新装置可具有控制装置，该控制装置优选可调节，以便调节有限时间间隔以及多个脉冲的处于两个这样的有限时间间隔之间的时间间隔。这种控制装置优选包括声光或电光的射束调制器。该新装置的探测器在其它方面也不必与激发光和退激光中断的有限时间间隔同步，而是该探测器也可在这些时间间隔上连续记录由荧光染料自发发射的荧光，但这不发生。
从权利要求书、说明书和附图中得到本发明的有利的进一步构型。说明书前序部分中提到的特征和多个特征的组合的优点仅仅是示例性的并且可作为替换方案或累积地产生作用，而这些优点不必强制性地由根据本发明的实施形式来获得。其它特征可从附图、尤其是所示的几何结构和多个构件彼此间的相对尺寸以及其相对布置和作用连接中获知。本发明不同实施形式的特征或不同权利要求的特征的组合也可与权利要求的所选择的引用不同并且由此被进一步发掘。这也涉及在分开的附图中所示或者在其说明中所提及的特征。这些特征也可与不同权利要求的特征组合。权利要求书中描述的特征对于本发明其它实施形式也可取消。
附图说明
图1示出了一个新装置的实施形式的示意性结构，
图2在上方示出了激发光的强度的示意性时间变化曲线，在中间示出了退激光的强度的示意性时间变化曲线，在下方示出了在该新方法的实施形式中用于记录样本的荧光的探测器的灵敏度的示意性时间变化曲线。
具体实施方式
图2在上方示出了激发光5的强度的时间变化曲线。在激发光的强度为零的有限时间间隔18之间，激发光由单个脉冲构成，所述脉冲具有比所述脉冲的间距短的脉冲持续时间。有限时间间隔18具有1μs的典型持续时间。激发光5的脉冲19的频率大致在120MHz以上，其中，所述脉冲的间距至少是所述脉冲的持续时间的10倍。这些数值情况在图2中没有完全反映出来。图2在中间示出了退激光10在时间上的强度变化曲线。退激光10连续地即以恒定的强度施加在样本2上——除了在有限时间间隔18中，在所述有限时间间隔中该退激光的强度也为零。图2在下方示出了根据图1的探测器12在时间上的灵敏度20。该灵敏度是连续地、即也在有限时间间隔18上给出的。
参考标号清单
1 装置
2 样本
3 激发光源
4 脉冲激光器
5 激发光
6 光学装置
7 物镜
8 退激光源
9 二极管激光器
10 退激光
11 相位调制器
12 探测器
13 自发发射的荧光
14 二色性镜
15 二色性镜
16 扫描装置
17 光学元件
18 有限时间间隔
19 脉冲
20 敏感度
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