本发明枯草芽孢杆菌杀菌肽的体外表达及其方法属于现代生物技术领域。

现有技术：

早在1960年以前，人们就对微生物的拮抗作用进行了广泛的生理生化研究， 对各类拮抗物质进行了分门别类，对医药学的发展作出很大贡献。近年来人们 对从乳酸杆菌中分离得到的肽类抗生素的作用机制和分子遗传学研究扩展的非 常广泛和深入(综述文章有Klaenhammer，T.R.(1993).Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.FEMS Microbiol Rev 12，39-86.和Jack，R.W.，Tagg，J.R.& Ray，B. (1995).Bacteriocins of gram-positive bacteria.Microbiol Rev 59，171-200.)。因为它们同其 它的抗生素不同之处在于它们几乎不会引起微生物的抗药性，比如乳酸链球菌肽 (nisin)作为食品的防腐剂已有五十年的历史，但是并没发现有腐败菌产生抗性 的现象。因此肽类抗生素将在今后的食品业和医药业拥有巨大应用前景(Breukink， E.，Wiedemann，I.，van Kraaij，C.，Kuipers，O.P.，Sahl，H.G.& de Kruijff，B.(1999).Use of the Cell Wall Precursor Lipid II by a Pore-Forming Peptide Antibiotic.Science 287，2361- 2364.)。

杀菌肽LCI是我们实验室从枯草芽孢杆菌AO14的培养液中分离出的碱性多 肽，分子量为5.4 kDa。它对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae strain G.)水稻条斑病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzea S2)马铃薯 青枯病菌(Pseudomonas solanacearum POl)烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum T62，T64)和辣椒青枯病菌(Pseudomonas solanacearum PE1) 有明显的抑制作用。其全部氨基酸序列为：

AIKLVQSPNG NFAASFVLDG TKWIFKSKYY DSSKGYWVGI YEVWDRK

通过对国际基因及蛋白质数据库(Genbank和Swiss-port)的检索，没有发 现与此杀菌肽序列结构相似的蛋白或基因。该结果已发表(刘进元，陈章良， 抗菌多肽LCI的一级结构，自然科学进展，1994，4(3)：365-367)。

枯草芽孢杆菌拮抗性广，拮抗物质变化多样。我们国内近些年来对枯草芽 孢杆菌的抗菌蛋白的研究也时有报道，在分子生物学方面的研究尚不深入(比 如辛玉成，秦淑莲，金静，张迎春，徐坤，苹果霉心病生防菌株抗菌蛋白的提 纯与部分性质初报，莱阳农学院学报，1999，16(1)。孙建，枯草芽孢杆菌B-903 菌株抗生物质对植物病原真菌的抑制作用，植物病理学报，1995，25(1)：69～ 72)。

发明的目的

在广泛的研究利用植物、动物和昆虫来源的抗植物病原菌和病虫害基因进 行农作物抗病育种，并取得许多成果的同时，研究来源于拮抗微生物的抗病基 因并应用于植物基因工程目前还比较少。

本实验室在1990年以来就已从大田中分离出数种拮抗能力强的枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)，并分离纯化出数种对植物病原真菌和病原细菌的体 外生长有抑制作用的多肽和蛋白质。进一步克隆出这些抗病基因，利用它们不 同的作用机理而产生的可能的协同作用，将其同时导入植物，有希望使转基因 植物即获得广谱抗菌能力又对单一病原菌的抗性增强。具有广谱抗菌，对人畜 无毒的肽类抗生素同样可以用于基于生物基因工程的食品与医药产业。

分离和纯化特异的抗菌类多肽，对它们进行生理生化特性以及结构和功能 的研究分析，主要是拮抗机理的阐明，这在植物基因工程和植物病理学领域具 有重要的理论和应用价值。阐明多肽的结构与功能在很大程度上要依赖于该多 肽基因的克隆和体外的表达，从而为克隆出该多肽的其它相关基因、研究基因 的表达与调控提供分子生物学基础，同时为获得转基因抗菌农作物打下了物质 基础。

发明的内容及方案

1.按照已有的LCI氨基酸序列合成其基因。

2.将LCI基因克隆到中间载体pBC7。

3.将LCI基因克隆到表达载体pBVAB16。

4.LCI杀菌肽在大肠杆菌中的诱导表达。

5.表达的LCI的分离纯化。

6.表达的LCI的杀菌活性检测。

7.表达的LCI对体外转录的抑制作用。

优点及效果

将重组表达载体pBV AB16转入大肠杆菌DH5α中，经42℃高温诱导，在5小 时时LCI的表达量达到最高，经对电泳凝胶的扫描分析，LCI的表达量占大肠杆 菌的总蛋白含量8.7％。

杀菌肽LCI是胞外释放的质粒编码的核糖体合成的肽链，具有低分子量、 带正电荷和热稳定性。

纯化的LCI能专门杀死水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae) 菌株G，LCI最低有效浓度为2.5μg/ml，该菌的在0.13mg/ml的LCI处理下存活率 为10-3。

LCI含有同其它细菌素相似的保守的序列结构，它们主要是乳酸菌的第二 类细菌素。根据推测的LCI的二级结构以及LCI的体外转录抑制活性，可以初 步推断LCI是进入细菌体内，抑制了RNA的转录活动而引起细菌死亡。不同 于其它细菌素只能杀死革兰氏阳性菌，LCI能杀死革兰氏阴性菌的这个特征将 大大有利于核糖体合成的细菌素在基因工程抗病育种的应用，该基因可望首先 应用于植物抗病育种及特效菌肥的生产。

附图说明

图1.LCI基因序列及其对应的氨基酸序列。A：丙氨酸，I：异亮氨酸， K：赖氨酸，L：亮氨酸，V：缬氨酸，Q：谷氨酰胺，S：丝氨酸，P：脯氨酸， N：天冬酰胺，G：甘氨酸，F：苯丙氨酸，D：天冬氨酸，T：苏氨酸，W：色氨 酸，Y：酪氨酸，E：谷氨酸，R：精氨酸。下划线的区域为化学合成的片段。

图2.LCI在不同浓度下对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株G生长的抑制作用。LCI的浓度为0μg/ml(●)；0.6μg/ml(O)； 2.5μg/ml(△)；4.9μg/ml(▲)；9.8μg/ml(■)。

图3.LCI对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌株G杀 死能力的测定。LCI的两个浓度为0.13mg/ml(●)和0.066mg/ml(■)。

图4.LCI不同浓度对对体外转录的影响。LCI的浓度：第1道为不加LCI 的对照，第2道0.11mg/ml，第3道0.22mg/ml，第4道0.39mg/ml。

图5.LCI的二级结构以及与其它细菌素多肽序列的比较。图中的方框、下 划线、阴影和黑体都代表保守区域。CF：Chou-Fasman；GOR：Garnier- Osguthorpe-Robson。

实施例

1、LCI基因的化学合成及其克隆

杀菌肽LCI产生于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A014的培养液。 它总共由47个氨基酸组成，含有6个赖氨酸、1个精氨酸和3个色氨酸。根据 LCI的氨基酸序列，使用植物体偏爱的密码子，加上起始和终止密码子以及ClaI 和Hind III两个酶切位点，人工合成了的LCI的DNA基因片段(见图1.)。四个 加下划线的核酸片段是用DNA合成仪ABI381A(LKB)以固相亚磷酰胺法合成 的：

1. 5′atatcgatggctatcaagctggtgcagtccccaaacggcaacttcgccgct 3′

2. 5′acttgaagatccacttagtaccgtccagcacgaaggaagcggcgaagttgc 3′

3. 5′taagtggatcttcaagtccaaatactatgactccagcaagggctactgggt 3′

4. 5′cgaagcttacttgcggtcccacacctcgtagatgccgacccagtagccctt 3′

每个片断含有51个核苷酸残基。它们是用含有8M尿素的16％的丙烯酰胺 凝胶电泳纯化的。含有DNA片断的胶段浸入0.5M NaCl溶液中过夜，而后上 清液经DEAE-Sepharose进一步纯化，脱盐、冷冻干燥。每个DNA片断以200pmol 等量混合后在水浴中85℃加热5分钟，而后渐渐冷却到室温。再加入dNTP和 T4DNA多聚酶，在37℃进行填平反应。

2、LCI表达载体的构建

合成的LCI基因片段经Cla I和Hind III双酶切，用T4 DNA连接酶将它 连接到经同样的这两种酶处理过的pBluescript II KS质粒上，经过转化大肠杆 菌DH5α和筛选，得到含有LCI基因的克隆质粒pBC7。该质粒经序列分析证实 含有正确的LCI基因。

pBC7质粒经Cla I酶消化后用DNA多聚酶I Klenow大片断进行补平， 而后用BamH I消化，用2％的琼脂糖回收LCI基因片段。质粒pBV220经EcoR I消化后用DNA多聚酶I Klenow大片断进行补平，而后用BamH I消化。将 LCI基因片段连接到pBV220质粒中后，经过转化大肠杆菌DH5α和筛选，制成 质粒pBVAB16。 

3.超表达的LCI的提取和纯化

含有质粒pBVAB16的大肠杆菌DH5α，在LB液体培养基中活化，其中氨苄 青霉素含量为50mg/l，按1％的接种量接入新鲜的同种培养基中，30℃培养2.5 小时，而后42℃诱导培养5小时，转速均为200rpm。

诱导表达的大肠杆菌经离心4000rpm 10分钟回收后，用50mM Tris-HCl， pH7.8缓冲液洗两遍，冰浴中超声破碎400W 30次，每次15秒，间隔10秒， 60℃加热20分钟，10000rpm离心20分钟，去掉沉淀。而后经离子交换液相 色谱CM-Sepharose Fast Flow C26/20以0～0.6M NaCl线性梯度洗脱。得到 的活性色谱峰加入4M硫酸铵调成2M，加入0.5M，pH6.5的磷酸二氢钾调成50 mM，微虑后用疏水作用液相色谱Phenyl-Superose HR5/5以1.7～0M硫酸铵 进行线性洗脱，得到的主峰即为纯化的LCI。此LCI样品经PD-10Sephadex G-25 M(Pharmacia)脱盐后冻干，保存于-20℃备用。用Tris-tricine SDS-PAGE电 泳确定LCI的纯度。LCI的浓度由280nm紫外吸收法和Lowry法测定。LCI 的表达量由薄层扫描仪对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶分析确定。

由于pBV AB16质粒有以下特点，使LCI在大肠杆菌中得到了高效的表达： 1、质粒中含有SD序列，其后紧接多克隆位点，若位于起始密码子AUG上游3～ 11个核苷酸处，与16s rRNA的3’端序列互补，能促进蛋白质的高效翻译；2、PR 和PL两个启动子串联，而且PL受CI蛋白抑制，可通过温度的变化来诱导它的 表达，从而增强了表达的稳定性和强度；3、来自大肠杆菌的rrB核糖体基因的 转录终止信号具有强的终止作用，能够避免密码子的通读，有利于质粒—宿主 系统的稳定。

利用LCI热稳定的特性，在E.coli中超表达的LCI可以从超声波破碎的 细胞悬液中抽提出来，并且用热水浴的办法使大部分蛋白质受热变形沉淀下来， 从而很容易地用CM-Sepharose Fast Flow及Phenyl-Superose HR5/5或者Mono S液相色谱纯化得到电泳纯的LCI。通过薄层扫描测定LCI的表达量为大肠杆 菌总蛋白量的8.7％。表达的LCI电泳表观分子量为3.5kDa。

应该指出的是，经离心去除的细胞碎片和60℃热处理产生的沉淀中都有抑 菌活性，也就是说，有相当一部分LCI没有被回收到。若这些沉淀用缓冲液再 冲洗两次，合并洗涤液，有希望提高得率。

4.LCI的抗菌活性检测

1、96孔板浊度比色法确定LCI的抑菌比活：

用水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzea strain G)为指示菌， 将它用LB液体培养基过夜活化(200rpm，28℃)后，取20μl，加入100μl新鲜 的LB培养基，20μl不同浓度的LCI水溶液(从1.1mg/ml LCI开始，以二倍 法稀释八次)，加入96孔板，重复两次。无抑制对照为将20μl LCI液换成20 μl无离子水，空白对照为120μl LB培养基和20μl无离子水。96孔板于 培养箱中28℃培养。每隔一小时，在微量分光光度计(Microplate Autoreader EL310，BIO-TEK INSTRUMENTS)上，于540nm的光线下测量每个样品孔的 光密度。

由病原细菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae G不同的生长曲线可以确定LCI 的抑菌的最低浓度为2.5μg/ml(见图2.)。

2、平板扩散法分析LCI的抑菌谱：

在LB培养基平板上，倒入1ml活化的被测菌(包括Xanthomonas oryzae pv.oryzea strain G)培养悬浊液，涂平，3分钟后移去多余的液体，晾干。在 平板的不同位置上分别滴加5μl LCI溶液，5μl相应的缓冲液为对照，于28℃ 过夜培养，观测抑菌圈大小。另外一种方法是将5μl LCI溶液，5μl相应的 缓冲液为对照先分别滴加在平板的同一条线上，待液滴消失后，用接种环蘸取 活化好的菌液沿着两个液滴的位置划一直线。一个平板可以同时测定数种不同 的细菌。28℃过夜培养，观测抑菌圈。实验发现LCI对Xanthomonas oryzae pv. oryzae G有特殊的抑制作用。

3、LCI的杀菌能力测试

将过夜活化的X.oryzae pv.oryzae strain G用LB液体培养基稀释到0.035 OD 600nm。经微虑除菌的LCI样品(0.53mg/ml)作一次二倍稀释后，分别以 100μl的量与300μl的稀释菌液混合与微量离心管中，在室温下存放。每隔一 定的时间，取出20μl于980μl的LB液体培养基中混匀，而后取出100μl涂于 LB琼脂板上，28℃过夜培养。通过对在平板上形成的克隆数可以确定LCI的 杀菌能力。从图3.可以看出LCI并不是立即杀死细菌，细菌的数目在加入LCI 后大约半小时开始下降，下降过程持续到八个小时。水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae strain G)对LCI的两个浓度0.13mg/ml(●)和0.066mg/ml(■)都 表现大概一致的敏感趋势，在高的LCI浓度下，该菌的存活率大约为10-3。

在大肠杆菌中表达的LCI可能没有转录后的修饰，但是天然的LCI则有可 能，而且这种修饰往往会赋予杀菌肽更多的活性特征。另外现在还很难说明增 加在N端的蛋氨酸是否会影响LCI的杀菌特性。

水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae G是革兰氏阴性菌，而在通常条件下 革兰氏阳性菌产生的细菌素只对革兰氏阳性菌有作用。目前已知的植物病原细 菌大都是革兰氏阴性菌，因此LCI能杀死革兰氏阴性菌的这个特征将大大有利 于核糖体合成的细菌素在基因工程抗病育种的应用。

5.LCI对体外转录的抑制实验

用Riboprobe Combination System(Promega)和SP6多聚酶来测定LCI可 能的转录抑制活性。体外转录分析在20μl的反应体系中含有：40mM Tris-HCl， pH7.5，6mM MgCl2，2mM亚精胺，10mM NaCl，10mM DTT，500μM each ATP， GTP，CTP and UTP，40 U Recombinant RNasin Ribonuclease inhibitor，0.5μg pGEM Express Positive Control Template，20 U SP6多聚酶，在37℃反应80分钟。 在不同的反应中加入不同量的LCI。反应产物经1％琼脂糖(含0.5μg/ml溴化 乙锭)电泳后，于254nm的紫外光下观测RNA的合成量。如图4所示，LCI 的三个不同浓度：第2道0.11mg/ml，第3道0.22mg/ml和第4道0.39mg/ml 相对于不加LCI的对照(第1道)都表现出对RNA合成的影响，而且在0.39mg/ml 浓度时，RNA的合成几乎全被抑制。

6.LCI的序列分析

对LCI的序列通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov网点用BLAST软件在″nr″ 数据库里进行了搜索，结果没有发现相似的多肽或基因。LCI的二级结构通过 GCG软件用Chou-Fasman(CF)和Garnier-Osguthorpe-Robson(GOR)两种方法分 析确定。LCI的计算分子量为5595.12 Da它的计算等电点pI＝10.25。如图5 所示，根据预测的二级结构和与其它细菌素氨基酸序列的对比可以发现，在LCI 的N端到第23位的色氨酸的肽段中可能含有一个βsheet的结构，而在此色氨 酸之后到肽链的C端可能形成一个能够跨越质膜的双亲结构，有如细菌素 piscicocins V1。细菌素中肽段结构的互补作用对于它的活性十分重要，就象 lactococcin G，plantaricin A和plantaricin S的活性要求它的alpha与beta链协 同作用一样。

杀菌肽LCI的一级结构与许多其它种类的细菌素有三处相同之处，其中还 包括羊毛硫抗生素。第一、第二类细菌素的保守序列YGNGV在LCI中结构不 全，在相同的位置它只有NG。参考肽链中色氨酸的位置，可以发现第十位的 甘氨酸是十分保守的，如图5的方框所示。它在许多细菌素中都是如此，如lactacin F和lacticin 481等等。第二、细菌素中色氨酸的残基数含量从1个到4个不等， 大多数含有2至3个，但是它们的分布却是规律性的，尽管并不是十分严谨。 在细菌素divercin V41中的任何一个色氨酸经过N-溴琥珀酰胺化会使细菌素 失去活性，因此推测LCI中的3个色氨酸对其杀菌活性同样起者重要的功能。 第三、LCI肽链中的第28到30位的KYY结构在细菌素enterocin I(enterocin L50A) 也存在，在细菌素enterocin L50B在则含有类似的结构KFY。KYY及其类似结 构在其它一些细菌素中也有，只是不在肽链的中部，而是在N端区域，同时在 此位置代替KYY结构的是异亮氨酸残基。

根据这些特征，推断LCI与乳酸菌中第二类细菌素的pediocin家族的细菌 素最为相似，它们是curvacin A(sakacin A)，divercin V41，enterocin I(L50A)， enterocin L50B，pediocin PA-1(AcH)和sakacin P。