发明背景

细胞的结构及生物学行为是通过特定时间的细胞内基因表达模式 确定的。长期以来，基因表达的干扰一直被认为是大量疾病产生的原 因，这些疾病包括多种形式的癌症、血管病、神经元和内分泌疾病。 目前已知，扩增、缺失、基因重排、丧失或获得功能性突变形式的异 常表达模式都将导致疾病细胞的异常行为。异常的基因表达也被认为 是某些生物避开病原体威胁的一种防御机制。

医学的主要挑战之一便是调控广泛多种生理反应所牵涉的靶基因 的表达。虽然在真核细胞内，外源导入转基因的过表达相对简单，但 以特定基因为目标的抑制仍然较难实现。抑制基因表达的传统方法， 包括位点定向基因破坏、反义RNA或协同抑制或注射，需要复杂的遗 传基因操纵，或常常超出宿主细胞毒性耐受水平的大剂量抑制物。

RNA干扰(RNAi)是一种描述了双链(ds)RNA依赖基因的特异 遗传转录后沉默的现象。利用该现象实验性地操纵哺乳动物细胞的最 初尝试受阻于在响应长dsRNA分子过程中激活的强烈且非特异性的抗 病毒防御机制。Gil et al.Apoptosis 2000，5：107-114。该领域在 证实21个核苷酸RNA的合成双链体可介导哺乳动物细胞中的基因特 异RNAi，而不引发遗传抗病毒防御机制的基础上获得了显著进展。 Elbashir et al.Nature 2001，411：494-498；Caplen et al.Proc Natl Acad Sci 2001，98：9742-9747。小的干扰RNA(siRNA)因而成为剖 析基因功能的有力工具。化学合成小RNA是一种途径，并已获得有希 望的结果。许多研究小组也寻求开发可于细胞内产生这种siRNA的基 于DNA的载体。最近，个别研究小组实现了这一目标，并发表了相似 的方案，这些方案通常包括短发夹(sh)RNA的转录，这些短发夹RNA 可被有效加工而于细胞内形成siRNA。Paddison et al.PNAS 2002， 99：1443-1448；Paddison et al.Genes & Dev 2002，16：948-958；Sui et al.PNAS 2002，8：5515-5520；及Brummelkamp et al.Science 2002， 296：550-553。这些报导均描述了产生可特异性地靶定众多内源及外 源表达基因的siRNA的方法。

发明概述

本发明的一个方面提供了一种包含RNAi构建体的稳定呼吸配方， 该RNAi构建体被配制为用于将治疗有效量的RNAi构建体通过肺部或 鼻部送递至患者肺部。某些实施方案中，RNAi构建体被配制为平均直 径小于20微米，更优选平均直径为0.5-10微米的微粒。某些实施 方案中，该微粒由生物可降解聚合物形成。某些实施方案中，该微粒 由选自多糖、二酮哌嗪、聚羟酸、聚酐、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、 聚烷撑、聚乙烯基化合物、聚硅氧烷、丙烯酸与异丁烯酸的聚合物、 聚氨酯、纤维素、聚丁酸(butic acid)、聚戊酸、聚(交酯-共-己 内酯)或其共聚物中的一种或多种聚合物形成。

某些实施方案中，该微粒通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取或 热融封装形成；而另一些实施方案中，该微粒为干燥或冻干形式。在 另一些实施方案中，RNAi构建体被配制在脂质体内。

还有一些实施方案中，RNAi构建体被配制为包括多维聚合物网状 结构的超分子复合物。优选的超分子复合物由阳离子聚合物形成，诸 如聚(L)赖氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β-环糊精聚合物(βCD 聚合物)或其共聚物。更为优选的超分子复合物由环糊精改性的聚合 物形成，例如，具有下式的结构的环糊精改性的聚氮丙啶：

其中

对每种情况而言，R独立代表H、低级烷基、环糊精部分或

且

对每种情况而言，m独立代表2-10,000，优选10-5,000，或者100 -1,000中的一个整数。

某些实施方案中，包含RNAi构建体的呼吸配方包括推进剂。

某些实施方案中，呼吸配方被容纳在计量剂量吸入器、干粉吸入 器或喷气式雾化器内。一种优选实施方案中，RNAi构建体的配制量以 1-10个计量剂量提供治疗有效量。

本发明的另一个方面提供了计量剂量气溶胶分配器，该分配器中 含有用于肺部或鼻部送递的、包含RNAi构建体的可呼吸配方的气溶 胶药物组合物。

本发明还有另一个方面提供了实现RNAi构建体的全身给药的方 法，该方法包括通过肺部给药方式，将RNAi构建体的可呼吸配方给 予患者，其中该RNAi构建体被深肺部吸收的量可实现该RNAi构建体 全身剂量的送递。

本发明还有另一个方面提供了包含至少一种RNAi构建体，以及药 学可接受载体的药物制剂，其中RNAi构建体被配制为用于肺部或鼻 部送递。该药学可接受载体任选选自药学可接受盐、酯、及这些酯的 盐。某些优选实施方案中，本发明提供了包含该药物制剂，以及指导 将该制剂给予人类患者的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其 中该药物制剂包含至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，该RNAi 构建体配制为用于肺部或鼻部送递。

本发明的另一个方面提供了一种组合物，包含一种或多种被配制 在超分子复合物中，且配制量足以通过RNA干扰机制减弱所处理细胞 中靶基因的表达的RNAi构建体。例如，该RNAi构建体是长度优选为 19-30个碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体为具有 编码序列的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在所处理 细胞内产生siRNA的转录产物。任选地，RNAi构建体为在所处理细胞 内被加工成siRNA的发夹RNA。某些实施方案中，该组合物被用于体 内或处理体外细胞。

某些实施方案中，超分子复合物被聚集在平均直径为20-500nm， 更优选20-200nm的粒子内。

进一步举例说明，超分子复合物可以是包括线性聚合物或支链聚 合物的多维聚合物网状结构。典型聚合物为阳离子聚合物，如聚(L) 赖氨酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β-环糊精聚合物(βCD-聚合物) 或其的共聚物。某些实施方案中，超分子复合物由环糊精改性的聚合 物形成，例如，具有下式的结构的环糊精改性的聚氮丙啶：

其中

对每种情况而言，R独立代表H、低级烷基、环糊精部分或

且

对每种情况而言，m独立代表2-10,000，优选10-5,000，或者 100-1,000中的一个整数。

本发明的另一个方面提供了减弱体内细胞靶基因表达的方法，该 方法包括给予被配制在超分子复合物中的RNAi构建体，给药量足以 通过RNA干扰机制减弱靶基因的表达，从而改变所处理细胞的生长、 存活或分化。

本发明还有另一个方面提供了包含至少一种RNAi构建体，以及药 学可接受载体的药物制剂，其中RNAi构建体被配制在超分子复合物 内。该药学可接受载体任选选自药学可接受盐、酯、及这些酯的盐。 某些优选实施方案中，本发明提供了包含该药物制剂，并附有指导给 药人类患者该制剂的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其中该 药物制剂包含至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，其中RNAi 构建体被配制在超分子复合物内。

本发明的另一个方面提供了应用于医用装置表面的涂层，该涂层 包含内部分散有RNAi构建体的聚合物基质，当被植入患者体内的位 点时，RNAi构建体从基质内释放，并改变植入的装置附近细胞的生长、 存活或分化。典型医用装置包括螺钉、板片、垫圈、缝合线、假体锚 定装置、平头钉、卡钉、电导联、瓣膜、膜、导管、可植入血管通路 端口、储血袋、输血管、中央静脉导管、动脉导管、血管植入物、主 动脉内球囊泵、心脏瓣膜、心血管缝合线、人造心脏、起搏器、心室 辅助泵、体外装置、血液滤器、血液透析组件、血液灌注组件、血浆 置换组件以及适于血管内展开的滤器。某些优选实施方案提供了涂布 的支架。

某些实施方案中，涂层中的RNAi构建体是长度优选为19-30个碱 基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体为具有编码序列的 表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在所处理细胞内产生 siRNA的转录产物。任选地，该RNAi构建体为在所处理细胞内被加工 成siRNA的发夹RNA。

举例说明，涂层中的RNAi构建体减弱选自细胞周期蛋白依赖性激 酶、c-myb、c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子β(TGF- β)、转录因子核因子κB(NF-κB)、E2F、HER-2/neu、PKA、TGF-α、EGFR、 TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、Bc1-2、VEGF、MDR、铁蛋白、转铁 蛋白受体、IRE、C-fos、HSP27、C-raf及金属硫蛋白基因中至少一种 靶基因的表达。

某些优选实施方案中，RNAi构建体通过抑制基因表达减少平滑肌 细胞的增殖和/或迁移。

本发明还有另一个方面提供了采用一种或多种RNAi构建体涂布医 用装置的方法，该方法包括：

a)配制用于涂布装置表面的RNAi构建体，使得该装置被植入患 者体内的位点时，该RNAi构建体从表面释放；及

b)将配制的RNAi构建体涂布在医用装置表面，

其中涂布有RNAi构建体的医用装置减弱了植入的装置附近细胞 中一个或多个基因的表达。

本发明的另一个方面提供了包含一种或多种RNAi构建体的组合 物，RNAi构建体被配制为用于经皮心包内送递至动物。一种实施方案 中，该组合物中的RNAi构建体减弱基因表达，导致梗塞心肌内及周 围的血管产生增加并/或减少局部缺血性损伤。任选地，该RNAi构建 体是全身可利用的，并减弱心包腔远端细胞中一个或多个基因的表 达。

某些实施方案中，组合物中的RNAi构建体被封装于脂质体或与脂 质体缔合。例如，该脂质体是由阳离子囊泡形成脂质所形成的阳离子 脂质体。任选地，该组合物中脂质体的平均直径小于大约200nm。

另其它实施方案中，RNAi构建体被配制为包括多维聚合物网状结 构的超分子复合物。优选的聚合物为阳离子聚合物，如聚(L)赖氨 酸(PLL)、聚氮丙啶(PEI)、含β环糊精的聚合物(βCD聚合物)或 其共聚物。

某些实施方案中，组合物中的超分子复合物由环糊精改性的聚合 物形成，例如，具有下式的结构的环糊精改性的聚氮丙啶：

其中

对每种情况而言，R独立代表H、低级烷基、环糊精部分或

且

对每种情况而言，m独立代表2-10,000，优选10-5,000，或者100 -1,000中的一个整数。

某些实施方案中，组合物中的RNAi构建体是长度优选为19-30个 碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体为具有编码序列 的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在所处理细胞内产 生siRNA的转录产物。任选地，该RNAi构建体为在所处理细胞内被 加工成siRNA的发夹RNA。一种优选实施方案中，该组合物给予人。

一种实施方案中，本发明提供了包含至少一种RNAi构建体，以及 药学可接受载体的药物制剂，RNAi构建体配制用于经皮心包内送递。 该药学可接受载体可任选选自药学可接受盐、酯及这些酯的盐。某些 优选实施方案中，本发明提供了包含药物制剂，以及指导将该制剂给 予人类患者的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其中该药物制 剂包括至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，该RNAi构建体 配制用于经皮心包内送递。

本发明还有另一个方面提供了用于经皮心包内体内送递一种或多 种RNAi构建体的方法，该方法包括将RNAi构建体配方给药至动物 的心包腔，其中存在的RNAi构建体的量足以减弱所治疗动物体内细 胞的一个或多个靶基因的表达。例如，心包腔被用作RNAi构建体的 送递贮存处。某些实施方案中，该方法的RNAi构建体被局部送递至 心脏及其周围血管系统中。另一些实施方案中，该方法的RNAi构建 体被用于减少平滑肌细胞的增殖和/或迁移，更为优选的是用于治疗 心肌梗塞。

本发明的另一个方面提供了包含一种或多种RNAi构建体的组合 物，该RNAi构建体被配制在脂质体内，可通过RNA干扰机制减弱体 内细胞中靶基因的表达。某些优选实施方案中，RNAi构建体是长度优 选为19-30个碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体 为具有编码序列的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在 所处理细胞内产生siRNA的转录产物。任选地，该RNAi构建体为在 所处理细胞内被加工成siRNA的发夹RNA。优选的细胞为哺乳动物细 胞，如人类细胞。

某些实施方案中，组合物中的脂质体是包括阳离子囊泡形成脂质 的阳离子脂质体。其它实施方案中，该脂质体的平均直径小于大约 200nm。

本发明还有另一个方面提供了减弱患者细胞中靶基因的表达的方 法，该方法包括将被配制在脂质体中的RNAi构建体给予患者，给药 量足以通过RNA干扰机制减弱靶基因的表达，从而改变所述细胞的生 长、存活或分化。某些优选实施方案中，该方法的RNAi构建体是长 度优选为19-30个碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构 建体为具有编码序列的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多 种在所处理细胞内产生siRNA的转录产物。任选地，该RNAi构建体 为在所处理细胞内被加工成siRNA的发夹RNA。该方法的优选的细胞 为哺乳动物细胞，如人类细胞。

某些实施方案中，该方法的脂质体为包括阳离子囊泡形成脂质的 阳离子脂质体。其它实施方案中，该脂质体的平均直径小于大约 200nm。

某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种RNAi构建体，以及 药学可接受载体的药物制剂，该RNAi构建体被配制在脂质体内。该 药学可接受载体任选选自药学可接受盐、酯及这些酯的盐。某些优选 实施方案中，本发明提供了包含该药物制剂，以及指导将该制剂给予 人类患者的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其中该药物制剂 包括至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，其中RNAi构建体 被配制在脂质体内。

本发明的另一个方面提供了包含一种或多种RNAi构建体的组合 物，配制的RNAi构建体被配制用于电穿孔进入体内细胞。例如，该RNAi 构建体被配制在超分子复合物或脂质体内。某些实施方案中，靶细胞 为上皮细胞或肌细胞。

本发明还有另一个方面提供了一种通过电穿孔将一种或多种RNAi 构建体送递给患者的方法，该方法包括通过电穿孔将足量的RNAi构 建体给予动物，其中RNAi构建体减弱患者体内细胞中靶基因的表达。 例如，该方法的RNAi构建体被配制在超分子复合物或脂质体内。某 些实施方案中，该方法的细胞为上皮细胞或肌细胞。

一种实施方案中，本发明提供了包含至少一种RNAi构建体，以及 药学可接受载体的药物制剂，该RNAi构建体被配制用于电穿孔进入 体内细胞。该药学可接受载体任选选自药学可接受盐、酯及这些酯的 盐。某些优选实施方案中，本发明提供了包含该药物制剂，以及指导 将该制剂给予人类患者的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其 中该药物制剂包含至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，该RNAi 构建体被配制用于电穿孔进入体内细胞。

本发明的另一个方面提供了包含一种或多种配制的RNAi构建体的 组合物，用于抑制体内不希望的细胞生长，其中通过RNA干扰机制， RNAi构建体减少了对细胞有丝分裂和/或阻止该细胞凋亡而言必不可 少的靶基因的表达。

某些优选实施方案中，该方法的RNAi构建体是长度优选为19-30 个碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体为具有编码序 列的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在所处理细胞内 产生siRNA的转录产物。例如，该表达载体选自附加型表达载体、整 合表达载体、病毒表达载体。另一种优选实施方案中，RNAi构建体为 在所处理细胞内被加工成siRNA的发夹RNA。

某些实施方案中，该组合物中的RNAi构建体抑制细胞增殖。可选 的RNAi构建体促进该细胞凋亡。

典型RNAi构建体抑制靶基因，即致癌基因的表达，如c-myc、c-myb、 mdm2、PKA-I、Ab1-1、Bc12、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、细胞 周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、 jun、mos、src或Bcr/Ab1融合基因。

某些实施方案中，RNAi构建体被用于处理转化细胞，如抑制或减 弱增生性细胞生长，并且可以是对这类癌症治疗的一部分。

另一些实施方案中，RNAi构建体被用于抑制淋巴细胞的活化，包 括治疗或预防免疫介导的炎性疾病。

还有一些实施方案中，RNAi构建体被用于抑制平滑肌细胞的增殖， 包括治疗或预防再狭窄。

还有另一些实施方案中，RNAi构建体被用于抑制上皮细胞的增殖 (如作为化妆品制剂的一个成分)。

某些实施方案中，该组合物中的RNAi构建体被配制在超分子复合 物内。该超分子复合物任选包含至少一种聚合物，例如，含环糊精的 聚合物。可选地，该RNAi构建体被封装于脂质体或与脂质体缔合， 例如，由阳离子囊泡形成脂质所形成的阳离子脂质体。任选地，与RNAi 构建体复合的脂质体具有典型地小于大约200nm的基本均一尺寸。

一种优选实施方案中，动物为人类患者。

本发明还有另一个方面提供了一种抑制体内不希望的细胞生长的 方法，该方法包括给予动物足量的配制的RNAi构建体，其中通过RNA 干扰机制，RNAi构建体减少了对细胞有丝分裂和/或阻止该细胞凋亡 而言必不可少的靶基因的表达。

某些优选实施方案中，该方法的RNAi构建体是长度优选为19-30 个碱基对的小的干扰RNA(siRNA)。可选的RNAi构建体为具有编码序 列的表达载体，所述编码序列被转录产生一种或多种在所处理细胞内 产生siRNA的转录产物。例如，该表达载体选自附加型表达载体、整 合表达载体、病毒表达载体。另一种优选实施方案中，RNAi构建体为 在所处理细胞内被加工成siRNA的发夹RNA。

某些实施方案中，组合物中的RNAi构建体抑制细胞增殖。可选的 RNAi构建体促进细胞凋亡。

某个优选实施方案中，靶基因为致癌基因，如c-myc、c-myb、mdm2、 PKA-I、Ab1-1、Bc12、Ras、c-Raf激酶、CDC25磷酸酶、细胞周期蛋 白、细胞周期蛋白依赖性激酶、端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、 mos、src或Bcr/Ab1融合基因。某些实施方案中，细胞为转化细胞， 因此RNAi构建体被用于治疗增生性细胞生长，包括癌症的治疗。另 一些实施方案中，RNAi构建体被用于抑制淋巴细胞的活化，包括治疗 或预防免疫介导的炎性疾病。还有一些实施方案中，RNAi构建体被用 于抑制平滑肌细胞的增殖，包括治疗或预防再狭窄。还有另一些实施 方案中，RNAi构建体被用于抑制上皮细胞的增殖(如作为化妆品制剂 的一个成分)。

另一些实施方案中，该方法的RNAi构建体被配制在超分子复合物 内。该超分子复合物任意地包含至少一种聚合物，例如含环糊精的聚 合物。

可选地，RNAi构建体被封装于脂质体或与脂质体缔合，例如，由 阳离子囊泡形成脂质所形成的阳离子脂质体。任意地，与RNAi构建 体复合的脂质体具有典型地小于大约200nm的基本均一尺寸。

一种优选实施方案中，该方法中的动物为人类。

本发明的另一个方面提供了包含至少一种RNAi构建体，以及药学 可接受载体的药物制剂，该RNAi构建体被配制用于抑制不希望的细 胞生长。该药学可接受载体任选选自药学可接受盐、酯，及这些酯的 盐。某些优选实施方案中，本发明提供了包含该药物制剂，以及指导 将该制剂给予人类患者的说明书(文字和/或图示)的药物包装，其 中该药物制剂包含至少一种RNAi构建体，以及药学可接受载体，其 中该RNAi构建体被配制用于抑制不希望的细胞生长。另一种实施方 案中，本发明提供了包含至少一种RNAi构建体的化妆品制剂，该RNAi 构建体被配制用于抑制不希望的细胞生长。

本发明还有另一个方面提供了诱导细胞死亡的方法，该方法包括 给予体内靶细胞双链RNA，或可转录具有足够长度以激活靶细胞中PKR 应答的双链RNA的表达载体，该双链RNA被配制为超分子复合物的一 部分。

某些优选实施方案中，双链RNA的长度超过35个碱基对，还要更 为优选的是超过75、100、200或甚至400个碱基对。某些实施方案 中，靶细胞为哺乳动物细胞，包括转化细胞。某些实施方案中，超分 子复合物是包括线性聚合物或支链聚合物的多维聚合物网状结构。优 选的超分子复合物由阳离子聚合物形成，如聚(L)赖氨酸(PLL)、 聚氮丙啶(PEI)、含β环糊精的聚合物(βCD-聚合物)及其共聚物。

某些实施方案中，超分子复合物由环糊精改性的聚合物形成，包 括具有下式的结构的环糊精改性的聚氮丙啶：

其中

对每种情况而言，R独立代表H、低级烷基、环糊精部分或

且

对每种情况而言，m独立代表2-10,000，优选10-5,000，或者100 -1,000中的一个整数。

本发明还有另一个方面提供了一种进行药品商业的方法，该方法 包括：

a)鉴定抑制体内靶细胞增殖，并减小涉及不希望的靶细胞增殖的 疾病的影响的RNAi构建体；

b)进行步骤a)中所鉴定的RNAi构建体的效力及毒性的治疗特征 分析；及

c)配制包含一种或多种经步骤b)鉴定为具有可接受治疗特征的 RNAi构建体的药物制剂。

优选地，进行药品商业的方法包括另一个步骤，即建立将该药物 制剂分装以用于销售的分装系统，并(任选地)建立营销该药物制剂 的销售团体的补充步骤。

本发明还有另一个方面提供了一种进行药品商业的方法，该方法 包括：

a)鉴定抑制体内靶细胞增殖，并减小涉及不希望的靶细胞增殖的 疾病的影响的RNAi构建体；

b)(任选地)进行步骤a)中所鉴定的RNAi构建体的效力及毒性 的治疗特征分析；及

c)将进一步开发RNAi构建体的权利授予第三方。

附图简述

图1显示将编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒和/或编码siRNA寡核 苷酸的有义链和反义链的质粒送递至HEK 293-EcR细胞内。在0.5ml 的opti-MEM中，使一(多)种质粒以15N/P的比例与分支PEI25k-hi-CD 聚合物复合，再将其送递至细胞内。相对GFP表达是采用所指示的一 (多)种质粒转染细胞后测定的。

图2显示β-CD聚合物4/DNA配比及血清条件对BHK-21细胞中的转 染效力(●和■)及细胞存活情况的影响。采用点线和实线分别显示10％ 血清和无血清培养基中的转染结果。报告数据为三个样品的平均+/- S.D.。

发明详述

I.概述

本发明提供了减弱体内靶基因表达的方法及组合物。通常，该方 法包括给予RNAi构建体(如靶定特定mRNA序列的小的干扰RNA(即 siRNA)，或可于细胞内产生siRNA的核酸物质)，给药量足以通过RNA 干扰机制，如以序列依赖性、PKR不依赖性方式减弱靶基因表达。特 别是本发明方法可以被用于改变细胞生长、存活或分化，从而达到治 疗和美容的目的。

本发明的一个方面涉及应用RNAi构建体减弱增殖调节基因(包括 凋亡抑制基因)的表达。这种实施方案可作为治疗或美容治疗程序的 一部分，可抑制或至少减少体内不希望的细胞生长，尤其是转化细胞 的生长。

本发明的另一个方面涉及用于肺部给药的RNAi构建体，如可呼吸 RNAi构建体配方。这种配方可被用于局部或全身性送递RNAi构建体， 并构成将用于任意多种适应症，如不限于治疗增生性疾病的RNAi构 建体给予患者的简便方法。仅举例证明，本发明的某些RNAi组合物 可被用于降低血管收缩剂的表达，或降低该血管收缩剂的受体水平， 以降低全身性及肺动脉高血压患者的血压。

本发明还有另一个方面涉及采用RNAi构建体，通过经皮心包内药 物送递方式治疗患者的方法，其中心包腔有效被用作RNAi构建体的 送递贮存处。虽然该技术在RNAi构建体的全身性送递中有效，仍然 可预期其对局部送递至心脏及其周围血管系统而言将尤其有效。

例如，在心肌梗塞的治疗中，本发明提供了给予血管生成性RNAi 构建体的方法，以促进血管产生，并从而促进梗塞心肌内及周围组织 的恢复和/或预防对其的进一步损伤。例如，本发明方法可被用于送 递可抑制负调节NF-κB转录因子的活性得蛋白质表达的RNAi构建体， 例如，通过抑制NF-κB阻抑物IκB的表达，或者负调节其它任何可减 少体内基底成纤维细胞生长因子所诱导血管产生的细胞因子的活性。 RNAi介导减弱的其它目标包括编码C-反应蛋白(CRP)的基因。CRP 可抑制由基础内皮生长因子和血管内皮生长因子刺激的血管生成。

心包内药物送递也可被用于送递RNAi构建体，该RNAi构建体减少 平滑肌细胞的增殖和/或迁移，从而可用于治疗新内膜增生，如再狭 窄，关节硬化等。仅举例证明，新内膜增生的抑制可通过给予RNAi 构建体而得以实现，所述RNAi构建体减弱c-myb、c-myc、增殖细胞 核抗原(PCNA)、转化生长因子-β(TGF-β)、诸如核因子κB(NF-κB) 和E2F的转录因子的基因表达。除了心包内药物送递以减少新内膜增 生以外，本发明也具体考虑了“于支架上”的RNAi构建体送递，或 通过将RNAi构建体直接涂布至少一部分的支架，或借助于可释放该 RNAi构建体的聚合物涂层，而实现送递。

本发明的另一个方面涉及涂布的医用装置。例如，某些实施方案 中，本发明方法提供了至少一个表面附有涂层的医用装置，其中该涂 层包括本发明的聚合物基质和RNAi构建体。这种涂层可应用在外科 手术器械上，如螺钉、板片、垫圈、缝合线、假体锚定装置、平头钉、 卡钉、电导联、瓣膜、膜。该装置可以是导管、可植入血管通路端口、 储血袋、输血管、中央静脉导管、动脉导管、血管植入物、主动脉内 球囊泵、心脏瓣膜、心血管缝合线、人造心脏、起搏器、心室辅助泵、 体外装置、血液滤器、血液透析组件、血液灌注组件、血浆去除组件， 及适于血管内展开的滤器。

本发明还有另一个方面提供了适合电穿孔进入体内细胞的RNAi构 建体的组合物，如电穿孔至上皮组织内(皮肤、黏膜等)以及肌肉内 (平滑肌或骨骼肌)。

本发明的另一个方面，RNAi构建体被配制在超分子复合物内，并 适合作为药剂使用，如基本上无热源物质。例如，该超分子复合物可 由包含线性聚乙烯亚胺或含环糊精线性聚合物，以及支链聚乙烯亚胺 或支链环糊精聚合物的多维聚合物网状结构形成。某些优选实施方案 中，将该表达构建体与环糊精，如环糊精细胞送递体系配制在一起。

本发明还有另一个方面涉及利用长双链RNA激活某些细胞内非序列 依赖性dsRNA的应答，如激活ds-RNA依赖性蛋白质激酶PKR。PKR介 导的对长dsRNA(如长度超过35个碱基对，还要更为优选的是超过39、 50、75、100或者甚至200个碱基对的dsRNA)的应答是一种主要于 病毒感染细胞内被激活，并诱导细胞死亡的有效生长抑制蛋白。此处 所描述用于实现序列依赖RNA干扰的组合物可方便地被调整用于将长 dsRNA(如长度足以激活PKR，并诱导细胞死亡的dsRNA分子，如长度 在40-1000个碱基对，优选的100-800个碱基对，还要更为优选的 200-500个碱基对的范围内)送递至希望发生细胞死亡的细胞内。一 种实施方案中，本发明的长dsRNA配方可被用于杀死癌症细胞。

II.定义

为方便起见，下文集中了本说明书、实施例及所附权利要求中应 用到的特定术语。

此处所用术语“动物”指哺乳动物，优选的哺乳动物如人类。同样， 有待于本发明方法治疗的“患者”或“受试者”可以指人类或非人类 的动物。

术语“凋亡”或“程序性细胞死亡”指不希望或无用的细胞于发育 及其它正常生物学过程期间被清除的生理学过程。凋亡是于正常生理 学条件下发生的细胞死亡模式，且该细胞为其自身死亡(“细胞自杀”) 的积极参与者。该现象最为常见于正常细胞更新及组织平衡、胚胎形 成、免疫耐受性的诱导及维持、神经系统的发育及内分泌依赖性组织 萎缩期间。正在凋亡的细胞显示出特有的形态及生化特征。这些特征 包括染色质聚集、核与细胞质凝聚、细胞质与核分配到包含核糖体、 形态完整的线粒体及核物质的膜包围得囊泡(凋亡体)中。在体内， 巨噬细胞或相邻的上皮细胞可迅速识别并吞噬这些凋亡体。这种清除 体内凋亡细胞的有效机制的存在避免了引发炎症反应。在体外，凋亡 体及残留细胞碎片最终膨胀并裂解。体外细胞死亡的末期被冠以术语 “次级坏死”。

“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在此处是可互换使用的 术语。应当理解这些术语不仅指特定受检细胞，还指这些细胞的后代 或潜在后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能在后续的世代中出 现，这种后代实际上可能与其母细胞不完全一致，但仍然被包括在此 处所用该术语的范畴内。

“疾病相关的”或“引发疾病的”基因指对不希望的细胞表型而言， 其表达必不可少或起重要作用的任何基因。该基因可能是以异常高水 平表达的基因；可能是以异常低水平表达的基因，其中改变的表达与 疾病的发生和/或进行有关。疾病相关基因也指具有一(多)种突变 或遗传变异的基因，这些突变或遗传变异或者是疾病病因的直接原 因，或者与造成疾病病因的基因处于连锁不平衡状态中。其转录或翻 译产物可能是已知或未知的，且可能处于正常或异常水平。

此处所用术语“dsRNA”指siRNA分子，或其它具有双链特征，并 且可于细胞内被加工为siRNA的RNA分子，如发夹RNA部分。

另外，如果上下文未指明，术语“编码”将指包括编码多肽的DNA 序列，该术语被典型应用时，也包括被转录为抑制性反义分子的DNA 序列。

对于基因序列而言的术语“表达”指该基因的转录，以及从得到的 mRNA转录产物到蛋白质的适当翻译。因此，从上下文中应当清楚的是 编码序列的蛋白质的表达是该编码序列转录和翻译的结果。

细胞的“生长状态”指该细胞的增殖速率及分化状态。

此处所用“无限增殖化细胞”指已经由化学、遗传和/或重组方式 被改变的细胞，该细胞因而具有在培养经过无限的分裂次数后仍能够 生长的能力。

“基因表达的抑制”指源自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物水平上 的缺乏(或可观察到的减少)。“特异性”指抑制靶基因的同时对该细 胞其它基因无明显影响的能力。抑制结果可通过检验该细胞或生物体 的外在属性或(如下文实施例所介绍)或通过诸如RNA溶液杂交、核 酸酶保护、Northern杂交、逆转录、微阵列基因表达监测、抗体结合、 酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫实验(RIA)、其 它免疫实验及荧光激活细胞分析(FACS)的生化技术得以证实。

术语“功能丧失”，当涉及本发明RNAi方法所抑制的基因时，该术 语指与缺乏RNAi构建体时的基因表达水平相比，基因表达水平上的 减少。

此处所用短语“介导RNAi”指(表明)判别哪些RNA可以被该RNAi 方法降解的能力，如以序列特异方式，而不是通过非序列依赖的dsRNA 应答，如PKR应答所发生的降解。

术语“鼻部送递”指通过经由鼻部吸入并进入鼻内的方式将RNAi 构建体全身性地送递至患者体内。

此处所用术语“核酸”指诸如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时也指核 糖核酸(RNA)的多核苷酸。当适用于所描述的实施方案时，该术语 也应当被理解为包括单链(如有义或反义)和双链多核苷酸。

当描述两个DNA区域之间的关系时，“可操作地连接”指它们功能 上彼此相关。例如，启动子或其它转录调节序列如果可以控制某个编 码序列的转录，便可以被可操作地连接到该编码序列上。

术语“药学可接受盐”指本发明的化合物中生理学及药学可接受的 盐类，即保留了期望的母体化合物生物学活性，而未获得不希望的毒 理效果的盐。

此处所用“增殖的”和“增殖”指进行有丝分裂的细胞。

“蛋白质编码序列”或“编码”特定多肽或肽的序列指当处于适当 调节序列控制之下时，于体外或体内被转录(DNA情况下)和翻译(mRNA 情况下)为多肽的核酸序列。该编码序列的边界由位于5’(氨基)末 端的起始密码子及位于3’(羧基)末端的翻译终止密码子界定。编码 序列可以包括，但不限于，原核或真核mRNA来源的cDNA、原核或真 核DNA来源的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。转录终止序 列将通常被定位于该编码序列的3’末端。

术语“肺部送递”和“呼吸送递”指通过经由嘴部吸入并进入肺部 的方式将RNAi构建体全身性送递至患者体内。

“重组病毒”指已经过遗传改造的病毒，如通过将异源核酸构建体 添加或插入该病毒粒子中的方式。

此处所用术语“RNAi构建体”是贯穿本说明书所采用的一个通称， 该术语包括小的干扰RNA(siRNA)、发夹RNA，及其它可于体内被裂 解并形成siRNA的RNA种类。此处的RNAi构建体也包括具有如下功 能的表达载体(也被称为RNAi表达载体)，即引发可于细胞内形成dsRNA 或发夹RNA的转录产物，和/或引发可于体内产生siRNA的转录产物。

“RNAi表达载体”(此处也被称为“dsRNA编码质粒”)指被用于表 达(转录)RNA的可复制核酸构建体，其中该RNA可于表达该构建体 的细胞内产生siRNA部分。这种载体包括的转录单位包含如下三种物 质的集合，(1)在基因表达中发挥调节作用的一(多)种遗传元件， 例如启动子、操纵子或增强子，这些遗传元件被可操作地连接到(2) 被转录并产生双链RNA(于细胞内退火并形成siRNA的两个RNA部分， 或可被加工成siRNA的单个发夹RNA)的“编码”序列，及(3)合适 的转录起始和终止序列。启动子及其它调节元件的选择通常根据所计 划的宿主细胞的不同而变化。通常，重组DNA技术利用的表达载体常 常为“质粒”形式，即指圆形双链DNA环，以该载体形式存在的表达 载体不与染色体结合。本说明书中，当质粒为载体最常用的形式时， “质粒”和“载体”可互换使用。不过，本发明计划包括可发挥相当 功能并随后被本领域所知的其它形式的表达载体。

该表达载体中，控制转录的调节元件通常可以来源自哺乳动物、 微生物、病毒或昆虫基因。并且可以另外掺入通常由复制起点所赋予 的宿主内复制能力，以及有助于识别转化体的选择基因。也可应用来 源自诸如逆转录病毒、腺病毒等病毒的载体。

术语“小的干扰RNA”或“siRNA”指长度大约为19-30个核苷酸， 更为优选21-23个核苷酸的核酸。该siRNA为双链，并且可能在每 一末端包括短突出端。优选地，位于3’末端的突出端长度为1-6个 核苷酸。本领域已知该siRNA可以被化学合成，或来源自更长的双链 RNA或发夹RNA。该siRNA具有与靶RNA类似的重要序列，因此该siRNA 可与靶RNA配对，并通过RNA干扰机制导致该靶RNA的序列特异性降 解。任选地，该siRNA分子包括3’羟基。

术语“超分子复合物”指由至少一种聚合物形成的多维聚合物网状 结构。该聚合物分子可以是线性或分支的，例如聚(L)赖氨酸(PLL)、 聚氮丙啶(PEI)、含β-环糊精聚合物(βCD-聚合物)及其的共聚物。 某些实施方案中，本发明涉及被配制为超分子复合物的RNAi构建体。

“转录调节序列”是贯穿本说明书用来指DNA序列的通称，如可诱 导或控制特定编码序列转录的起始信号、增强子、启动子等，其中该 编码序列与该转录调节序列是可操作连接的。

此处所用术语“转导”和“转染”是被普遍接受的技术，意指通过 核酸介导的基因转移，将核酸，如一种表达载体，导入受体细胞内。 此处所用的“转化”指由于外源DNA或RNA的细胞摄取导致细胞基因 型改变的一个过程，例如，该转化细胞表达RNAi构建体。当一种核 酸构建体可被细胞的子代继承时，则该细胞已被该核酸构建体“稳定 转染”了。

此处所用“转化细胞”指自然转变为无限制生长状态的细胞，即它 们在培养中获得了经过无限分裂次数仍然生长的能力。根据生长控制 的丧失程度，转化细胞可由诸如瘤的、未分化的和/或增生性的术语 表征。对本发明目的而言，术语“恶性哺乳动物细胞的转化表型”和 “转化表型”可以包括但不限于，下列与哺乳动物细胞的细胞转化相 关的表型特性中的任意一种：无限增殖化、形态学或生长转化、致肿 瘤性，正如所检测到的在细胞培养中的生长延长，可于半固体培养基 中生长，或者在免疫缺陷或同基因动物体内中的致肿瘤生长。

“瞬时转染”指外源DNA未整合至已转染细胞的基因组内的情况， 如当附加型DNA被转录为mRNA，并被翻译成蛋白质时。

此处所用术语“载体”指一种核酸分子，该核酸分子可将另一个核 酸转移至其已连接的部分。一种类型的载体为基因组整合载体，或“整 合载体”，该类型载体可以被整合进宿主细胞的染色体DNA内。另一 种类型的载体为附加型载体，即可于染色体外复制的核酸。可将基因 表达引导到操作性地连接的载体在此处被称为“表达载体”。本说明 书中，如上下文无另外指明，“质粒”和“载体”可互换使用。

III.典型RNAi构建体

该RNAi构建体含有可于细胞生理条件下，与待抑制基因(即“靶” 基因)至少一部分的mRNA转录产物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。 该双链RNA仅需与已具有介导RNAi能力的天然RNA充分相似即可。 因此，本发明具有能够耐受可能由于遗传突变、菌株多态性或进化趋 异而被预期到的序列变异的优势。靶序列与该RNAi构建体序列之间 容许的核苷酸错配数目为5个碱基对中不超过一个，或10个碱基对 中不超过一个，或20个碱基对中不超过一个，或50个碱基对中不超 过一个。SiRNA双链体中心的错配最为关键，并且可能基本破坏靶RNA 的裂解。与之相比，位于与靶RNA互补的siRNA链的3’末端的核苷酸 对靶识别的特异性而言并无显著作用。

通过本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux， Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，及其所引用的 参考文献)，并通过，例如采用默认参数的BESTFIT软件程序实现的 Smith-Waterman算法(如University of Wisconsin Genetic Computing Group)，计算核苷酸序列之间的百分比差异，便可最优化序列同一性。 抑制性RNA和部分靶基因之间的序列同一性超过90％，或者甚至100％ 是优选的。可选地，该RNA的双链体区域可能在功能上被定义为可与 靶基因转录产物的一部分杂交的核苷酸序列(如400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mMEDTA、50℃或70℃杂交12-16小时；继而洗涤)。

通过化学合成方法或重组核酸技术可以进行RNAi构建体的产生。 所处理细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内的转录，或者克隆的RNA 聚合酶可被用于体外转录。该RNAi构建体可以包括对磷酸-糖主链或 核苷的修饰，如，降低对细胞核酸醇的感受性，改善生物利用率、配 方特性，和/或改变其它药物代谢动力学特性。例如，天然RNA的磷 酸二酯键可以被修饰为包括至少一个氮或硫的杂原子。RNA结构上的 修饰可以被修整为允许特异性的遗传抑制，而同时避免对dsRNA的一 般应答。另外，可以对碱基进行修饰以阻断腺苷脱氨酶的活性。该RNAi 构建体可通过酶促或通过部分/总有机合成获得，通过体外酶促或有 机合成的方法可以导入任何修饰的核糖核苷酸。

化学修饰RNA分子的方法也可以适用于修饰RNAi构建体(见例如， Heidenreich et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：776-780；Wilson et al.(1994)J Mol Recog 7：89-98；Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：2661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7：55-61)。仅举例说明，可以采用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、 二硫代磷酸酯、嵌合膦酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸、含寡聚物或糖修 饰(如2’-替代的核糖核苷，a-构型)的5-丙炔基-嘧啶修饰RNAi构 建体的主链。

该双链结构可通过单条自身互补RNA链或两条互补RNA链形成。RNA 双链体的形成可于细胞内或外启动。可以被导入的RNA量应能够实现 每个细胞至少送递一个拷贝。双链物质的较高剂量(如每个细胞至少 5、10、100、500或1000个拷贝)可以产生更为有效的抑制，而较低 剂量也可能对某些特定应用有效。抑制为序列特异，因为与该RNA双 链体区域相应的核苷酸序列被靶定用于遗传抑制。

某些实施方案中，本发明的RNAi构建体为“小的干扰RNA”或者 “siRNA”。这些核酸的长度大约为19-30个核苷酸，还要更为优选 的长度为21-23个核苷酸，如在长度上与通过核酸酶“切割”较长 双链RNA所获得的片段对应。该siRNA被认为补充了核酸酶复合物， 并通过与特定序列配对，将该复合物引导至靶mRNA。结果是，该靶mRNA 被蛋白质复合物中的核酸酶降解。一种特定实施方案中，长度为21- 23个核苷酸的siRNA分子包含3’羟基。

利用本领域技术人员已知的多种技术均可获得本发明的siRNA分 子。例如，利用本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA。例如， 可以合成短的有义和反义RNA寡聚物，并将其退火以形成每一末端均 具有2-核苷突出端的双链RNA结构(Caplen，et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA，98：9742-9747；Elbashir，et al.(2001)EMBO J，20：6877-88)。随后，如下所述，或者通过被动摄取，或者选定的 送递体系，便可将这些双链siRNA结构直接导入细胞内。

某些实施方案中，可通过加工较长双链RNA获得siRNA构建体，例 如，在dicer酶存在的情况中。一种实施方案中，采用的是果蝇体外 系统。该实施方案中，dsRNA与果蝇胚胎来源的可溶性提取物混合， 产生了一种联合体系。该联合体系被维持在dsRNA可以被加工成长度 为大约21到大约23个核苷酸的RNA分子的条件下。

利用本领域技术人员已知的多种技术均可纯化该siRNA分子。例 如，利用凝胶电泳纯化siRNA。可选地，可利用非变性方法，如非变 性柱层析纯化该siRNA。另外，可以利用色谱法(如大小排阻色谱法)、 甘油梯度离心、采用抗体的亲和纯化的方法纯化siRNA。

某些优选实施方案中，该siRNA分子的至少一条链具有一个3’突 出端，其长度为大约1到大约6个核苷酸，不过也可以是2-4个核 苷酸的长度。更为优选的3’突出端长度为1-3个核苷酸。某些实施 方案中，一条链具有一个3’突出端，另一条链则被钝端化，或者也具 有一个突出端。每条链的突出端长度可以相同或不同。为进一步增强 siRNA的稳定性，可对该3’突出端进行抗降解稳定化。一种实施方案 中，通过包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟嘌呤核苷酸以稳定RNA。可选 地，由修饰的类似物替代嘧啶核苷酸，如可由2’-脱氧胸腺嘧啶核苷 替代尿嘧啶核苷酸3’突出端，且不影响RNAi的效力。2’羟基的缺乏显 著增强了组织培养基中突出端的核酸酶抗性，并且可能在体内是有利 的。

另一些实施方案中，RNAi构建体的形式为长双链RNA。某些实施方 案中，RNAi构建体至少包含25、50、100、200、300或400个碱基。 某些实施方案中，RNAi构建体长度为400-800个碱基。该双链RNA 在细胞内被消化，如在细胞内产生siRNA序列。不过，体内利用长双 链RNA并不总是有效，可能是因为非序列依赖性的dsRNA应答所引起 的毒性效应。这些实施方案中，利用局部送递体系和/或可减少干扰 素或PKR效应的药剂是优选的。

某些实施方案中，RNAi构建体的形式为发夹结构(被命名为发夹 RNA)。该发夹RNA可以是外源合成的，或体内RNA聚合酶III启动子 转录形成。在例如Paddison et al..，Genes Dev，2002，16：948-58； McCaffrey et al.，Nature，2002，418：38-9；McManus et al.，RNA， 2002，8：842-50；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2002， 99：6047-52的文献中描述了制备并将这种发夹RNA应用在哺乳动物细 胞中基因沉默的实例。优选的，这种发夹RNA被工程设计在细胞中或 动物体内，以确保对靶基因连续且稳定的抑制。本领域已知于细胞内 加工发夹RNA可以产生siRNA。

还有另一些实施方案中，采用质粒送递双链RNA，如作为转录产物 的双链RNA。这些实施方案中，质粒被设计为包括分别对应于该RNAi 构建体的有义和反义链的两个“编码序列”。这两个编码序列可以是 相同的序列，如，由两个倒置的启动子位于其侧翼，或者可以是分别 处于两个独立启动子的转录控制下的两个独立序列。该编码序列被转 录后，互补RNA转录产物碱基配对便形成了双链RNA。

PCT申请WO01/77350描述了一种用于双向转录转基因，以于真核 细胞内产生相同转基因的有义和反义RNA转录产物的典型载体。相应 地，某些实施方案中，本发明提供了具有下述独特特征的重组载体： 包含病毒复制子，该复制子内的两个相反方向上排列有两个重叠转录 单位，并且位于一个转基因的侧翼，该转基因被用于我们感兴趣的RNAi 构建体，其中这两个重叠转录单位可以在宿主细胞内的从相同转基因 片段产生有义和反义RNA转录产物。

IV.典型配方

本发明的RNAi构建体也可与其它分子、分子结构或化合物的混合 物，例如脂质体、聚合物、受体靶定的分子、口服、直肠、局部或其 它配方混合、封装、结合或经由其它方式缔合，以辅助摄取、分配和 /或吸收。本发明的RNAi构建体可以被提供在也包括穿透增强剂、载 体化合物和/或转染剂的配方中。

讲述了制备可适用于送递RNAi构建体，尤其是siRNA分子的摄取、 分配和/或吸收辅助配方的方法的代表性美国专利包括，但不仅限于， U.S.5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291； 5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899； 5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633； 5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295； 5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和 5,595,756。

本发明的RNAi构建体也包括任何药学可接受盐、酯或这些酯的盐， 或者其它任何在对包括人类在内动物给药的基础上，可以(直接或间 接地)提供其生物学活性代谢物或残余物的化合物。相应地，例如， 该公开内容也涉及RNAi构建体和siRNA的药学可接受盐、这种RNAi 构建体的药学可接受盐，以及其它生物等效物。

药学可接受碱加成盐由金属或胺形成，如碱和碱土金属或有机胺。 被用作阳离子的金属实例为钠、钾、镁、钙等。合适的胺实例为N，NI- 二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、 N-甲基葡糖胺及普鲁卡因(见例如Berge et al.，“Pharmaceutical Salts，”J.of Pharma Sci.，1977，66，1-19)。酸性化合物的碱加成 盐是通过常规方式，使游离形式的酸与足量指定的碱接触后产生盐， 而得以制备的。游离酸可通过使盐与酸接触，并以常规方式分离该游 离酸后得以再生。该游离酸与其相应的盐在某些物理属性，诸如在极 性溶剂中的溶解度方面略有差异，但另一方面，对本发明的目的而言， 该盐与其相应的游离酸等效。此处所用“药物加成盐”包括本发明组 合物中任一组分酸形式的药学可接受盐。这包括胺的有机或无机酸 盐。优选的酸盐为盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐、磷酸盐。本 领域技术人员还熟知其它合适的药学可接受盐，包括多种无机和有机 酸的碱性盐。

对siRNA寡核苷酸而言，药学可接受盐的优选实例包括，但不仅限 于(a)由诸如钠、钾、铵、镁、钙的阳离子，诸如精胺和亚精胺的 多胺，等形成的盐；(b)由例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等 的无机酸形成的酸加成盐；(c)由诸如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、 马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹 宁酸、棕榈酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、 荼二磺酸、聚半乳糖醛酸等的有机酸形成的盐；(d)由诸如氯、溴和 碘的元素阴离子形成的盐。

A.超分子复合物

某些实施方案中，本发明RNAi构建体被配制为“超分子复合物” 的一部分。进一步举例证明，该RNAi构建体可与至少一种聚合物接 触，形成一种合成物，随后，在足以形成包含该RNAi构建体和多维 聚合物网状结构的超分子复合物的条件下处理该合成物的聚合物。该 聚合物分子可以是线性或分支的。相应地，一组两个或多个聚合物分 子可以是线性、分支或者线性和分支聚合物的混合物。该合成物可通 过本领域已知的任何适当方法制备。例如，通过使该RNAi构建体与 聚合物简单接触、混合或分散，便可形成该合成物。也可通过使可能 相同或不同，且能够在该表达构建体的存在条件下形成线性或分支聚 合物的单体聚合，而制备该合成物。可采用至少一种配体进一步修饰 该合成物，如可以引导该表达构建体的细胞摄取，或者相反，影响该 表达构建体在体内的组织或细胞分配。该合成物可以是任意合适的形 式，优选的形式为粒子。

某些优选实施方案中，本发明RNAi构建体与阳离子聚合物被配制 在一起。典型阳离子聚合物包括聚(L)赖氨酸(PLL)和聚氮丙啶(PEI)。 某些优选实施方案中，本发明的表达构建体与含β-环糊精聚合物(βCD 聚合物)被配制在一起。βCD-聚合物能够与核酸一起形成多聚复合物， 并转染所培养的细胞。该βCD聚合物可以例如通过使二氨基-环糊精 单体A与二酰亚胺酯共聚单体B缩合而被合成。环糊精是α-(1，4) 键中含天然存在的D(+)-吡喃葡糖单位的环状多糖。最常见的环糊精 为分别含有6、7或8个吡喃葡糖单位的α-环糊精、β-环糊精和γ环 糊精。在例如Gonzalez等人的PCT申请WO00/01734和Davis PCT申 请WO00/33885中描述了可方便地被调整用于送递本发明RNAi构建体 的典型环糊精送递体系。

某些实施方案中，该超分子复合物被聚集在粒子中，例如，平均 直径为20-500纳米(nm)，还要更为优选的是20-200nm的粒子配 方。

B.其它阳离子、非脂质配方

某些实施方案中，该RNAi构建体被提供在阳离子、非脂质载体中， 并且被配制应用在经由呼吸道的气溶胶送递中。采用聚(乙烯亚胺) 和诸如dsRNA和dsRNA-编码质粒的大分子的配方可以在雾化过程中导 致高水平的肺部转染并提高稳定性。PEI-核酸配方也可以显示出对肺 部的高程度特异性。

除了采用PEI配制RNAi构建体以外，本发明也设想应用环糊精改 性的聚合物，诸如环糊精改性的聚氮丙啶。某些实施方案中，该聚合 物具有如下结构式：

其中

对每种情况而言，R独立代表H、低级烷基、环糊精部分或

且

对每种情况而言，m独立代表2-10,000，优选10-5,000，或者100 -1,000中的一个整数。

某些实施方案中，对至少大约1％，更为优选的至少大约2％，或者 至少大约3％，直至大约5％或甚至10％可能为伯胺的氮原子而言，R代 表的是环糊精部分(即R代表H的两种情况)，而对环糊精部分而言， 则并非如此。

某些实施方案中，按重量计算，环糊精部分组成了环糊精改性的 聚合物的至少大约2％、3％或4％，直至5％、7％，甚至10％。

某些实施方案中，按重量计算，聚合物中至少大约2％、3％或4％， 直至5％、7％，甚至10％的氮丙啶亚单位是由环糊精部分修饰的。

具有易与环糊精部分发生衍生作用的亲核氨基取代基团的聚氮丙 啶共聚物也可以被用于制备本发明范畴内的环糊精改性的聚合物。

典型环糊精部分包括主要由7-9个糖部分组成的环状结构，如环 糊精和氧化环糊精。环糊精部分任选包含在环状结构和聚合物主链之 间形成共价键的连接部分，优选的链中含1-20个原子，如烷基链， 包括二羧酸衍生物(如戊二酸衍生物、琥珀酸衍生物等)，和异烷基 链，如寡乙二醇链。

C.脂质体配方

某些实施方案中，本发明提供了包含被封装于脂质体或以其它方 式与脂质体缔合的dsRNA或dsRNA-编码质粒的组合物。仅举例证明， 可利用聚阳离子缩合剂缩合dsRNA部分或dsRNA-编码质粒，并将其悬 浮于低离子强度的水性培养基中，阳离子囊泡形成脂质便形成了阳离 子脂质体。可调整脂质体脂质与质粒的比例以获得最大转染效果。纳 摩尔脂质体脂质/微克质粒的比例常常超过5，但小于25，优选的超 过8，但小于18，更为优选的超过10，但小于15，最为优选的12-14。 这种复合物优选地具有典型地小于大约200nm，并优选地在50-200nm 范围内的基本均一的尺寸(即在尺寸上±20％，优选的±10％，更为优选 的±5％)。

此处所用的脂质体指具有外部脂质壳且封闭有亲水性内部的脂质 囊泡，该外部脂质壳典型地形成于一个或多个脂质双层上。一种优选 实施方案中，该脂质体是由介于大约20-80摩尔百分数的阳离子囊 泡形成脂质，与其余成中性囊泡形成脂质，和/或其它组分所组成的 阳离子脂质体。此处所用“囊泡形成脂质”指任何具有疏水和极性头 基团部分的两性脂质，如磷脂所例证的，其自身在水中可自动形成双 层囊泡。优选的囊泡形成脂质为二酰基链脂质，如磷脂，其酰基链长 度典型地为大约14-22个碳原子，且具有可变的不饱和度。

阳离子囊泡形成脂质是在操作pH，如pH4-9条件下，极性头基团 具有净正电荷的脂质。典型实例包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺，其极性 头基团是由带正电部分，作为例证如赖氨酸衍生的，例如由L-赖氨酸 衍生的脂质DOPE(LYS-DOPE)(Guo，et al.，1993)。该类脂质也包 括糖脂，如具有阳离子极性头基团的脑苷脂和神经节苷脂。

可应用的另一种阳离子囊泡形成脂质是胆甾醇胺及相关的阳离子 甾醇。典型阳离子脂质包括1，2-二油基氧基-3-(三甲氨基)丙烷 (DOTAP)；N-[1-(2，3-双十四烷氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴 化铵(DMRIE)；N-[1-(2，3，-二油基氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙 基溴化铵(DORIE)；N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯 化铵(DOTMA)；3β[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基]胆甾醇(DC- Chol)；和二甲基双十八烷基铵(DDAB)。

该脂质体的其余部分由中性囊泡形成脂质形成，意指囊泡形成脂 质无净电荷，或者可能包括小比例的在极性头基团中具有负电荷的脂 质。该类脂质还包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、 磷脂酰环己六醇(PI)、神经鞘磷脂(SM)、胆甾醇、胆甾醇衍生物及 其它无电荷甾醇。

上述脂质是商业可提供的，或根据已公开方法制备而得。本发明 包括的其它脂质为糖脂，如脑苷脂和神经节苷脂。

本发明的一种实施方案中，dsRNA或dsRNA-编码质粒-脂质体复合 物包括具有以亲水聚合物链为表面涂层的脂质体，该涂层可有效延长 该质粒/脂质体复合物的血液循环时间。合适的亲水聚合物包括环糊 精(CD)、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、 聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯 酰胺、聚二甲基丙烯酰胺，及衍生的纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙 基纤维素。优选的亲水聚合物链为聚乙二醇(PEG)，优选的PEG链分 子量为500-10,000道尔顿，更优选为1,000-5,000道尔顿。该亲水 聚合物可能在水和非水性溶剂，如氯仿中均具有可溶性。

该涂层优选地通过下述方法制备，即将磷脂或其它二酰基链脂质包 含在囊泡形成脂质内，并采用该聚合物链将其头部基团衍生。制备这 种脂质，并由其形成聚合物涂布脂质体的典型方法在U.S.Pat.Nos. 5,013,556和5,395,619中有所描述，在此引入作为参考。

应当理解，亲水聚合物可稳定地与该脂质偶联，或经由一个不稳定 键偶联，该不稳定键使该聚合物涂布的质粒-脂质体复合物可以在血 流循环期间，或在定位于目标位点之后便摆脱或“释放”亲水聚合物 涂层。亲水聚合物，尤其是聚乙二醇(PEG)，可通过一个有助于释放 该聚合物链以应答刺激物的键，附着在囊泡形成脂质上，在例如此文 所引作参考的WO 98/16202、WO 98/16201中，以及Kirpotin，D.等 人(FEBS Letters，388：115-118(1996))均描述了这种情况。

一种实施方案中，可释放键是通过给药合适的释放剂，或在选择性 生理条件下，如在酶或还原剂存在条件下而被裂解的化学可释放键。 例如，酯酶或肽酶裂解酯键和肽键。二硫键是通过给药诸如谷胱甘肽 或抗坏血酸的还原剂，或通过体内存在的还原剂，如存在于血浆和细 胞中的半胱氨酸而得以裂解的。

其它可释放键包括pH敏感键以及暴露于葡萄糖、光或热时便裂解 的键。例如，亲水聚合物链可通过pH敏感键可附着到脂质体上，并 且该质粒-脂质体复合物被靶定在某个位点上，如肿瘤区，该位点的pH 值可有效裂解该pH敏感键，并释放亲水链。典型pH敏感键包括酰氧 基烷基醚、缩醛和缩酮键。另一实例中，可裂解键为二硫键，此处被 广泛用于指含硫键。含硫键可以被合成，以实现设定的不稳定性程度， 而且包括二硫键、混合硫醚-砜键和硫醚-亚砜键。这三种键中，二硫 键最不易感于硫解作用，硫醚-亚砜键则最为易感。

这种可释放键有助于调整亲水聚合物片段从脂质体复合物中释放的 速率。例如非常不稳定的二硫键可以被用于靶定血液细胞或内皮细 胞，因为这些细胞很容易接近，而且较短的脂质体血液循环寿命已足 够。另一个极端方面，当目标为肿瘤组织或其它器官时，为使复合物 抵达指定目标，通常需要较长的脂质体血液循环寿命，这时便可采用 持久或稳定的二硫键。

使亲水聚合物链附着在脂质体上的可释放键在体内被裂解的原因典 型的是环境的改变，例如，该脂质体到达稍低pH的特定位点，如肿 瘤组织区域，或具有还原条件的位点，如缺氧肿瘤的情况中。体内的 还原条件也可以通过给药某种还原剂而得以实现，诸如抗坏血酸、半 胱氨酸或谷胱甘肽。可裂解键在对外部刺激，诸如光或热的应答中也 可能被破坏。

另一种实施方案中，脂质体复合物包括可有效地特异性结合到治疗 所针对靶细胞上的亲和部分或导向配体。这种部分可附着在脂质体表 面，或亲水聚合物链的末端。如PCT申请Nos.WO US94/03103，WO 98/16202和WO 98/16201所描述的，典型的部分包括抗体和用于特异 结合靶细胞表面受体的配体等。该部分也可以是有利于该复合物与靶 细胞融合的疏水片段。

被用于缩合dsRNA和dsRNA-编码质粒的聚阳离子缩合剂可以是多重 带电阳离子聚合物，并且优选是生物聚合物，如亚精胺、精胺、聚赖 氨酸、鱼精蛋白、总组蛋白、诸如H1、H2、H3、H4的特定组蛋白组 分，及其它聚阳离子多肽，也可以包括生物相容聚合物，如多粘菌素 B。应当理解，这些聚阳离子缩合剂可以被利用的形式为游离碱或盐， 例如，硫酸鱼精蛋白和聚赖氨酸氢溴酸盐。一种优选实施方案中，聚 阳离子缩合剂为组蛋白，此处所指组蛋白包括总组蛋白或特定组蛋白 组分。

某些实施方案中，聚合物-脂质结合物中的疏水片段为疏水多肽序 列。优选的，该多肽序列由大约5-80，更优选为10-50，最优选为 20-30个非极性和/或脂肪族/芳香族氨基酸残基组成。这些序列可有 效启动某些有被膜的病毒与宿主细胞的融合，这些病毒包括副流感病 毒，诸如仙台病毒、猿猴病毒-5(SV5)、麻疹病毒、新城疫病毒(NDV) 和呼吸道合胞病毒(RSV)。其它实例包括人类逆转录病毒，诸如人类 免疫缺陷病毒-1(HIV-1)，即AIDS的病原体，可通过该病毒被膜与 宿主细胞质膜的融合感染细胞。融合在生理性(即中性)pH条件下发 生，继而该病毒遗传物质(核壳体)便被注入宿主细胞的细胞质部分 中。

D.配体导向的配方

某些实施方案中，本发明的超分子复合物和脂质体可与一种或多种 配体缔合，该配体可有效结合到靶细胞上的特定细胞表面蛋白或基 质，从而有利于该复合物对靶细胞的捕获，某些情况中，可以增强细 胞对该RNAi构建体的摄取。仅举例证明，适用于将本发明的超分子 复合物和脂质体靶定至特定细胞类型的配体实例如下表所列。

E.可呼吸RNAi构建体

本发明的另一个方面提供了适用于将RNAi构建体送递至呼吸道的 气溶胶。呼吸道包括上气道、下气道，其中上气道包括口咽和喉，下 气道包括气管以及直达支气管和细支气管的分枝。上气道和下气道被 统称为传导性气道。末端细支气管接着分成通入最终呼吸区，即肺泡 或深肺部的呼吸细支气管。

据此看来，吸入给药可以是口服和/或鼻给药。适用于气溶胶送递 的药用装置实例包括计量剂量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和 喷气式雾化器。在例如，美国专利5,756,353、5,858,784和PCT申请 WO98/31346、WO98/10796、WO00/27359、WO01/54664、WO02/060412中 描述了可被方便地调整用于送递本发明RNAi构建体的典型吸入式核 酸送递体系。美国专利6,294,153、6,344,194、6,071,497和PCT申 请WO02/066078、WO02/053190、WO01/60420、WO00/66206中描述了可 用于送递双链RNA的其它气溶胶配方。此外，如Templin et al.， Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2000，10：359-68；Sandrasagra et al.，Expert Opin Biol Ther，2001，1：979-83；Sandrasagra et al.， Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2002，12：177-81所描述的，可 以将适用于吸入式送递其它寡核苷酸(如反义寡核苷酸)的方法调整 为适用于送递RNAi构建体的方法。

人类肺部可以在数分钟直至数小时的时间内，清除或迅速降解可通 过水解裂解的沉积气溶胶。在上气道中，有纤毛的上皮细胞有助于“黏 膜纤毛活动梯”，通过它便可向嘴部方向从气道清除存在的粒子。如 Pavia，D.，“LungMucociliary Clearance”，Aerosols and the Lung： Clinical and Experimental Aspects，Clarke，S.W.和Pavia，D.， Eds.，Butterworths，London，1984中所描述的。在深肺部中，肺泡 巨噬细胞能够在粒子沉积后不久便将其吞噬。如Warheit et al.， Microscopy Res.Tech.，26：412-422(1993)和Brain，J.D.， “Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages”The Reticuloendothelial System，S.M.Reichard和J.Filking，Eds.， Plenum，New.York.，pp.315-327，1985中所描述的。深肺部或肺泡 均是全身性送递RNAi构建体所用的吸入治疗性气溶胶的主要目标。

一些优选实施方案中，尤其是希望实现RNAi构建体的全身性剂量 给药时，气溶胶化的RNAi构建体被配制为微粒。直径为0.5-10微 米的微粒可以穿透肺部，并通过大部分天然屏障。通过喉部所要求的 微粒直径小于10微米；避免被呼出时，所要求的微粒直径大于或等 于0.5微米。

某些优选实施方案中，本发明的RNAi构建体被配制在超分子复合 物中，如上所述，其直径为0.5-10微米，并且可以被组合在直径为 0.5-10微米的粒子中。

另一些实施方案中，本发明的RNAi构建体被提供在经过适当配制 后适合肺部送递的脂质体或超分子复合物(如上所述)中。

(i)用于形成微粒的聚合物

除上述超分子复合物以外，还有大量其它聚合物可被用于形成微 粒。此处所用术语“微粒”包括微球(均匀球体)、微胶囊(具有一 个核心和聚合物外层)及不规则形状粒子。

聚合物优选的是在一定的时间段内或相对不久之后，通常1年内， 更为典型的几个月，还要更为典型的几天到几周内，可随时间被生物 降解并释放RNAi构建体的聚合物。生物降解既可以指微粒的破裂， 即形成微粒的聚合物和/或聚合物本身的离解。其发生原因可以为下 述几种，从粒子所在的载体到其被给药后所释放位点的pH变化，如 二酮哌嗪的情况，水解，如聚羟酸的情况，诸如钙的离子从微粒的扩 散，如在通过诸如海藻酸盐的聚合物离子结合所形成的微粒情况中， 以及酶作用，如多数的多糖和蛋白质情况中。某些情况中，线性释放 可能是最为有用的，尽管其它情况中脉冲释放或“大量释放”也可能 获得更为有效的结果。

代表性的合成材料为：二酮哌嗪，诸如聚乳酸、聚羟基乙酸的聚羟 酸及其共聚物，聚酐，诸如聚原酸酯的聚酯，聚酰胺，聚碳酸酯，诸 如聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸亚乙酯的 聚烷撑，诸如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙烯基乙酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯的聚乙烯基化合 物，聚硅氧烷，丙烯酸与异丁烯酸的聚合物，包括聚甲基丙烯酸甲酯、 聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲 基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基 丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚 丙烯酸十八酯，聚氨酯及其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基 纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维 素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤 维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素、羧乙基 纤维素、三醋酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚丁酸、聚戊酸及聚(交 酯-共-己内酯)。

天然聚合物包括海藻酸盐，及包括葡聚糖和纤维素的其它多糖、胶 原、白蛋白及其它亲水蛋白、玉米蛋白及其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白， 其共聚物和混合物。此处所用的其化学衍生物指诸如烷基、亚烷基的 化学基团的取代、加成，羟基化，氧化及本领域技术人员常规进行的 其它修饰。

生物附着性聚合物包括H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell 在Macromolecules，1993，26，581-587中所描述的生物可侵蚀性水凝 胶，还包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、 海藻酸盐、壳聚糖和聚丙烯酸酯。

进一步举例说明，通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取及本领域技 术人员已知的其它方法，均可使聚合物形成基质。有文献描述了制备 适用于药物送递的微球的方法，例如Mathiowitz和Langer， J.Controlled Release 5，13-22(1987)；Mathiowitz，et al.，Reactive Polymers 6，275-283(1987)；和Mathiowitz，et al.，J.Appl. Polymer Sci.35，755-774(1988)。如Mathiowitz，et al.，Scanning Microscopy 4，329-340(1990)；Mathiowitz，et al.，J.Appl.Polymer Sci.45，125-134(1992)；和Benita，et al.，J.Pharm.Sci.73， 1721-1724(1984)所描述的，方法的选择取决于所选聚合物、尺寸、 外部形态、所希望的结晶度。

如Mathiowitz，et al.，(1990)，Benita，和Jaffe的U.S.Pat.No. 4,272,398所描述的，在溶剂蒸发情况中，聚合物被溶解在可挥发的 有机溶剂中。以可溶形式或微粒形式分散的RNAi构建体被添加至该 聚合物溶液中，混合物便悬浮在含表面活性剂，如聚乙烯醇的水相中。 搅动获得的乳浊液，直至大部分有机溶剂挥发，便留下了固体微球。

通常，该聚合物可以溶解在二氯甲烷中。可以采用若干不同的聚合 物浓度，例如，0.05-0.20g/ml。将药物加入该溶液中后，将所获溶 液悬浮于200ml剧烈搅拌的含1％(w/v)聚乙烯醇(Sigma Chemical Co.， St.Louis，Mo.)的蒸馏水中。搅拌4小时后，有机溶剂从聚合物挥 发，再以水洗涤所获得的微球，并于冷冻干燥机中干燥过夜。

通过适用于获得相对稳定聚合物，如聚酯和聚苯乙烯的方法，可以 获得不同尺寸(1-1000微米，尽管气溶胶应用要求小于10微米)和 形态的微球。不过，不稳定的聚合物，如聚酐则可能由于暴露于水而 降解。对这些聚合物而言，热融封装并脱除溶剂的方法可能是优选的。

在热融封装过程中，聚合物首先被融化，并与RNAi构建体的固体 粒子混合，优选地是通过筛分获得合适尺寸。将该混合物悬浮在不易 混合的溶剂，如硅油中，并进行连续搅拌，加热至高于该聚合物熔点 5℃的温度。一旦该乳浊液稳定，便将其冷却直至该聚合物粒子凝固。 通过采用石油醚倾析的方法洗涤所获得的微球，以获得自由流动的粉 状物。采用该方法可以获得直径为1-1000微米的微球。采用该技术 制备的微球外表面通常光滑且致密。该操作可用于水不稳定聚合物， 但采用分子量为1000-50000的聚合物时则有局限性。

在喷雾干燥过程中，聚合物被溶解在有机溶剂，如二氯甲烷 (0.04g/ml)中。将已知量的RNAi构建体悬浮(如果不可溶)或共 溶(如果可溶)于该聚合物溶液中。继而喷雾干燥该溶液或分散体系。 采用该方法可以获得直径为1-10微米的微球，形态则取决于所选择 的聚合物。

由凝胶类型聚合物，如海藻酸盐、聚膦嗪或其它二羧基聚合物制成 的水凝胶微球的制备方法如下，将该聚合物溶解在水溶液中，将待整 合的材料悬浮于该混合物中，挤压该聚合物的混合物通过一种配置有 氮气喷射器的微滴形成装置。如Salib，et al.，Pharmazeutische Industrie 40-111A，1230(1978)所描述，获得的微球落入缓慢搅拌 的离子硬化浴中。如Lim et al.，J.Pharm.Sci.70，351-354(1981) 所描述，该体系的优势是可以在加工完成后，可通过采用聚阳离子聚 合物，如聚赖氨酸涂布的方法，进一步修饰微球表面。例如，在海藻 酸盐的情况中，通过海藻酸盐与钙离子的离子交联，继而于加工完成 后，使微粒的外表面与聚阳离子，如聚赖氨酸交联，便可以形成水凝 胶。采用不同尺寸的挤压机、聚合物流速及气体流速，便可以控制该 微球粒子的尺寸。

通过将聚合物溶解于酸性溶液，并与三聚磷酸盐交联的方法可以制 备壳聚糖微球。例如，羧甲基纤维素(CMC)微球是通过使聚合物溶 解于酸溶液，并采用铅离子沉淀微球的方法制备而得。可以制备海藻 酸盐/聚乙烯亚胺(PEI)以减少海藻酸盐微胶囊上羧基基团的量。

(ii)药物组合物

该微粒可以悬浮于任何适当的药物载体中，如用于给予患者的盐 水。在最优选实施方案中，以干燥或冻干形式保存微粒，直至给药前。 继而可以将其悬浮于足量溶液中，例如适用于以气溶胶或干粉形式给 药的水溶液。

(iii)导向给药

该微粒可以被送递至特定细胞，尤其是吞噬细胞和器官。淋巴集结 内的吞噬细胞似乎可以选择性地摄取口服给药的微粒。网状内皮系统 的吞噬细胞也可摄取静脉给药的微粒。可以利用肺部巨噬细胞对微粒 的吞噬，使该微粒靶定脾脏、骨髓、肝脏和淋巴结。

如上所述，通过附着可以特异或非特异地结合特定靶的配体，也可 使微粒导向。这种配体的实例也包括抗体、含可变区的片段、外源凝 集素、激素或其它在靶细胞表面上具有受体的有机分子。

(iv)微粒的保存

优选实施方案中，该微粒是冻干保存的。剂量的确定是根据所封装 RNAi构建体的量、肺系统内的释放速率以及该化合物的药物代谢动力 学。

(v)微粒的送递

可采用多种方法送递微粒，范围从直接给药进鼻道以使部分粒子抵 达肺系统，到利用粉末滴注装置，或利用直达肺部管道的导管或管状 物。尽管利用烃类推进剂的那些装置已不再被利用，而且那些依赖于 患者呼吸摄取量的装置会导致剂量变动，仍然有商业可提供的干粉吸 入器。合适推进剂的实例包括氢氟烷推进剂，如1，1，1，2-四氟乙烷 (CF3CH2F)(HFA-134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟-正丙烷(CF3CHFCF3) (HFA-227)、全氟乙烷、单氯氟甲烷、1，1-二氟乙烷及其组合。

F.用于释放RNAi构建体的医用装置涂层

本发明的另一个方面涉及涂布有涂层的医用装置。例如，某些实施 方案中，本发明提供了至少一个表面附有涂层的医用装置，其中该涂 层包含本发明的聚合物基质和RNAi构建体。这种涂层可应用于外科 手术器械，如螺钉、板片、垫圈、缝合线、假体锚定装置、平头钉、 卡钉、电导联、瓣膜、膜。该装置可以是导管、可植入血管通路端口、 储血袋、输血管、中央静脉导管、动脉导管、血管植入物、主动脉内 球囊泵、心脏瓣膜、心血管缝合线、人造心脏、起搏器、心室辅助泵、 体外装置、血液滤器、血液透析组件、血液灌注组件、血浆置换组件 及适于血管内展开的滤器。

在某些根据本发明的实施方案中，形成聚合物的单体与RNAi构建 体组合，将二者混合，使该RNAi构建体均匀分散在单体溶液中。继 而根据常规涂层方法，将该分散体系添加至支架或其它装置，之后由 常规引发剂，如UV光起动交联过程。在根据本发明的其它实施方案 中，聚合物组合物与RNAi构建体组合，形成分散体系。继而将该分 散体系用于医用装置的表面，聚合物发生交联便形成了固体涂层。在 根据本发明的另一些实施方案中，聚合物和RNAi构建体与合适的溶 剂组合，形成分散体系，继而以常规方式将该分散体系用于支架。之 后通过常规方法，如热蒸发，便可除去溶剂，而聚合物和RNAi构建 体(共同形成持续释放药物送递体系)则作为涂层保留在支架上。在 将RNAi构建体溶解在聚合物组合物中的情况里也可应用类似方法。

在根据本发明的某些实施方案中，体系包含相对硬的聚合物。另一 些实施方案中，体系包含柔软且可伸展的聚合物。还有一些实施方案 中，体系包含具有粘附特性的聚合物。聚合物的硬度、弹性、粘性及 其它特性是广泛可变的，如下文更为具体论述的，这些特性取决于体 系的特定最终形态。

根据本发明的体系的实施方案具有多种不同形式。某些实施方案 中，体系由悬浮或分散在聚合物中的RNAi构建体组成。其它某些实 施方案中，体系由RNAi构建体和半固体或凝胶聚合物组成，可经由 注射器被注射进体内。在根据本发明的另一些实施方案中，体系由RNAi 构建体和柔软可弯曲的聚合物组成，可通过适当外科方法被插入或植 入体内。在根据本发明更进一步的实施方案中，体系由硬的固体聚合 物组成，可通过适当外科方法被插入或植入体内。在进一步的实施方 案中，体系包含悬浮或分散有RNAi构建体的聚合物，其中RNAi构建 体和聚合物混合物在诸如螺钉、支架、起搏器等外科手术器械上形成 了涂层。在根据本发明的特定实施方案中，该装置由硬的固体聚合物 组成，被定型为外科手术器械的形式，如外科螺钉、板片、支架等， 或这些器械的某一部分。在根据本发明的另一些实施方案中，体系包 括缝合线形式，且分散或悬浮有RNAi构建体的聚合物。

在根据本发明的某些实施方案中，提供了含基质的医用装置，该基 质具有一个表面，例如外表面及其上的涂层。该涂层含聚合物，而该 聚合物中分散有RNAi构建体，并且可使RNAi构建体穿透，或者生物 降解后释放该RNAi构建体。在根据本发明的某些实施方案中，该装 置包含悬浮或分散在合适聚合物中的RNAi构建体，其中该RNAi构建 体和聚合物被涂布在整个底物上，如外科手术器械。这种涂布可通过 喷涂或浸涂方式实现。

在根据本发明的另一些实施方案中，该装置包含RNAi构建体和聚 合物悬液或分散体系，其中该聚合物是硬的，并且形成了待插入或植 入体内的装置的一个组成部分。例如，在根据本发明的特定实例中， 该装置为涂布有悬浮或分散在聚合物中的RNAi构建体的外科螺钉、 支架、起搏器等。在根据本发明的另一些特定实施方案中，悬浮有RNAi 构建体的聚合物形成了外科螺钉的尖端或头部，或其部分。在根据本 发明的另一些实施方案中，悬浮或分散有RNAi构建体的聚合物被涂 布在诸如外科用管状物(如结肠造口术、腹腔灌洗导管和静脉内管) 的外科器械上。在根据本发明更进一步的实施方案中，该装置为涂布 有聚合物和RNAi构建体的静脉注射针。

如上所论述，根据本发明的涂层包含生物可侵蚀或非生物可侵蚀的 聚合物。对生物可侵蚀和非生物可侵蚀聚合物的选择是基于体系或装 置的计划最终用途。在根据本发明的某些实施方案中，该聚合物可以 被有利地生物侵蚀。例如，当体系为诸如螺钉、支架、起搏器等外科 可植入装置上的涂层时，该聚合物是可以被有利地生物侵蚀的。根据 本发明，聚合物可以被有利地生物侵蚀的其它实施方案包括某些装 置，该装置是RNAi构建体于聚合物中形成的可植入、吸入或注射的 悬液或分散体系，其中该装置未利用其它组件(如螺钉或锚定物)。

在根据本发明，聚合物难以穿透和难以生物侵蚀的某些实施方案 中，该聚合物的生物侵蚀速率有利地充分低于RNAi构建体的释放速 率，因此该聚合物在RNAi构建体被释放后的一个较长时间段内仍保 留在原位，但最终还是被生物侵蚀并重新吸收进周围组织中。例如， 在装置为包含悬浮或分散在生物可侵蚀聚合物中的RNAi构建体的生 物可侵蚀缝合线的情况中，该聚合物的生物侵蚀速率有利地充分低， 该RNAi构建体以线性方式在大约3到大约14天的时间内被释放，而 缝合线仍存留大约3周到大约6月。根据本发明的类似装置包括含有 悬浮或分散在生物可侵蚀聚合物中的RNAi构建体的外科手术卡钉。

在根据本发明的其它实施方案中，聚合物的生物侵蚀速率有利地与 RNAi构建体的释放速率位于同一数量级。例如，在体系含有悬浮或分 散在聚合物中的RNAi构建体，而该聚合物涂布在外科手术器械，诸 如矫形螺钉、支架、起搏器或非生物可侵蚀缝合线上的情况中，该聚 合物有利地以某一速率被生物侵蚀，该速率情况下，直接暴露于周围 机体组织的RNAi构建体的表面积随着时间基本上保持恒定。

在根据本发明的另一些实施方案中，聚合物载体可被周围组织，如 血浆中的水份穿透。在这些情况中，水溶液可穿透该聚合物，从而接 触到RNAi构建体。该溶出速率可能受一组复杂的变量控制，如聚合 物的渗透性、RNAi构建体的溶解度、pH、离子强度，以及生理性流体 的蛋白质组成等。

在根据本发明的某些实施方案中，聚合物为非生物可侵蚀的。在体 系包含有待于被涂布在某些外科手术器械上，并形成其一个组成部分 的聚合物的情况中，其中这些外科手术器械适合被永久地，或者半永 久地插入或植入体内，则非生物可侵蚀聚合物是尤其有效的。有聚合 物有利地形成外科手术器械上的永久性涂层的典型装置包括矫形螺 钉、支架、假体关节、人工瓣膜、永久性缝合线、起搏器等。

在经皮经腔冠状血管成形术之后，可能利用到多种不同的支架。尽 管根据本发明可能利用到许多支架，为简化起见，本发明的典型实施 方案中将描述到有限数量的支架。本领域技术人员应认识到与本发明 有关的许多支架均可能被利用到。另外，如上所述，也可能利用其它 医用装置。

支架通常被用作导管腔左内侧的管状结构以缓解梗阻症状。通常， 支架以未展开形式被插入管腔内，并继而自动地，或者在原位第二装 置的帮助下伸展开。典型伸展方法的实现是通过利用安装在导管上的 血管成形术球囊，该球囊在变窄的血管或机体通道内膨胀，可剪切并 破坏与血管壁组成相连的阻塞，从而获得扩大的管腔。

利用多种方法均可制作本发明的支架。例如，从可能利用激光、电 火花加工、化学侵蚀或其它方式机械加工过的空心或成形的不锈钢管 可以制作该支架。将未伸展的支架插入机体，并将其置于预期位点。 一种典型实施方案中，通过球囊导管可使支架在血管内展开，其中该 支架的最终直径随所用球囊导管的直径不同而变化。

应当理解，根据本发明的支架可由形状记忆材料体现，这种形状记 忆材料包括，例如镍和钛或不锈钢的适当合金。

通过使不锈钢以预定方式成形的方法，例如将其扭曲成麻花状构 型，可以将不锈钢形成的构型制成自伸展性的。在该实施方案中，形 成支架后，可将其压缩，以使其占用的空间充分小到可通过插入方式 被插入在血管或其它组织内，其中该插入方式包括合适的导管或弹性 杆。

从导管中脱出时，可使支架成形伸展为预期构型，该伸展是自动或 通过压力、温度或电刺激的改变引发的。

无论支架的设计如何，优选的是含RNAi构建体的支架，其中该RNAi 构建体具有足够的特异性，以及可于损伤区提供有效剂量的充分浓 度。在这点上，涂层中的“贮存尺寸”优选地经过估量，以在预定位 点充分提供预期量的RNAi构建体。

另一种典型实施方案中，支架的全部内外表面均可涂布治疗剂量的 RNAi构建体。不过，重点是指出该涂层技术的变动可能取决于RNAi 构建体。同样，该涂层技术的变动也可能取决于包含支架或其它腔内 医用装置的材料。

腔内医用装置具有持续释放药物送递涂层。借助常规涂层方法，如 浸渍涂布、喷涂和浸涂，可将RNAi构建体涂层涂布在支架上。

一种实施方案中，腔内医用装置包括延长的放射状伸展的管状支 架，该支架具有一个腔内表面和一个沿支架纵轴线伸展的相对的外表 面。该支架可以包括永久可植入支架、可植入移植支架或临时性支架， 其中临时性支架被定义为可于血管内伸展，之后可由血管取回的支 架。支架构形可以包括盘绕支架、记忆盘绕支架、Nitinol支架、网 状支架、脚手支架、套筒支架、可渗透支架、含温度传感器的支架、 多孔支架等。根据常规方法，如通过可膨胀球囊导管、通过自展开机 制(从导管释放之后)，或者通过其它适当方式，均可使支架展开。 该延长的放射状伸展的管状支架可以是移植支架，其中该移植支架是 在移植物内或外部具有支架的一个复合装置。该移植物可以是血管植 入物，诸如ePTFE移植物、生物学移植物或编织移植物。

有若干方法可将RNAi构建体整合到或附着在支架上。典型实施方 案中，RNAi构建体被直接整合进聚合基质中，并被喷涂在支架外表面。 RNAi构建体随时间从聚合基质中释放，进入周围组织。RNAi构建体 优选地保留在支架上至少3天直至大约6个月，更优选为7-30天。

某些实施方案中，根据本发明的聚合物包括生物学耐受聚合物，即 其可使RNAi构建体透过，而其具有的渗透性并非RNAi构建体从聚合 物中释放速率的主要速率决定因素。

在根据本发明的某些实施方案中，聚合物是非生物可侵蚀的。本发 明利用的非生物可侵蚀聚合物的实例包括聚(乙烯聚-共-乙酸乙烯 酯)(EVA)、聚乙烯醇和聚氨酯，如以聚碳酸酯为基础的聚氨酯。在 本发明的其它实施方案中，聚合物为生物可侵蚀的。本发明利用的生 物可侵蚀聚合物的实例包括聚酐、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚原酸酯、 聚烷基氰基丙烯酸酯或其衍生物和共聚物。如下文更具体描述的，有 经验的技术人员应认识到对聚合物的生物侵蚀性或非生物侵蚀性的选 择取决于体系的最终物理形态。其它典型聚合物包括有机硅聚合物和 透明质酸衍生的聚合物。有经验的技术人员应理解根据本发明的聚合 物是在适合赋予渗透性的条件下制备而得，因此其并非RNAi构建体 从聚合物中释放的主要速率决定因素。

此外，合适的聚合物包括与体液及哺乳动物组织生物可相容，并且 基本上不溶于与之接触的体液的天然存在(胶原、透明质酸等)或合 成的材料。另外，合适的聚合物基本上可以阻止分散/悬浮于该聚合 物中的RNAi构建体与体液中蛋白质组成之间的相互作用。某些情况 中，鉴于聚合物可能溶解，或者与能够影响药物释放恒定性的蛋白质 组成相互作用，因此应避免采用快速溶解的聚合物、高度可溶于体液 或容许RNAi构建体与蛋白质组成相互作用的聚合物。

其它合适的聚合物包括聚丙烯、聚酯、聚乙烯乙酸乙烯酯(PVA或 EVA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚环氧丙烷、聚羧酸、聚烷基丙烯酸酯、 纤维素醚、硅酮、聚(d1-丙交酯-共-乙交酯)、多种Eudragrit(例 如NE30D、RS PO和RL PO)、聚烷基-烷基丙烯酸酯共聚物、聚酯-聚 氨酯嵌段共聚物、聚醚-聚氨酯嵌段共聚物、聚对二氧六环酮、聚β 羟基丁酸酯、聚乳酸(PLA)、聚己内酯、聚羟基乙酸和PEO-PLA共聚 物。

形成本发明的涂层可通过如下方法进行，即将一种或多种合适的单 体与合适的RNAi构建体混合，继而使单体聚合形成聚合物体系。通 过该方式，RNAi构建体便被溶解或分散在聚合物中。另一些实施方案 中，RNAi构建体被混合进液体聚合物或聚合物分散体系中，继而进一 步加工该聚合物以形成本发明的涂层。合适的其它加工步骤可以包括 与合适的交联RNAi构建体交联、液体聚合物或聚合物分散体系的进 一步聚合、与合适的单体共聚、与合适的聚合物决嵌段共聚等。进一 步的加工步骤使RNAi构建体陷于聚合物中，从而使该RNAi构建体悬 浮或分散在聚合物载体中。

许多非可侵蚀的聚合物均可与RNAi构建体结合应用。可被用于本 申请中涂层的成膜聚合物可以是可吸收或非可吸收的，并且必须是生 物相容的，以最小化对血管壁的刺激。该聚合物可以是生物稳定或生 物可吸收的，取决于聚合物的预期释放速率或预期稳定性程度，但生 物可吸收聚合物可能是优选的，因为与生物稳定聚合物不同，生物可 吸收聚合物不会在植入后长期存在并引起任何有害、慢性局部反应。 此外，生物可吸收聚合物不存在如下所述的风险，即由于可能排斥涂 层并且甚至在支架被封入组织后仍然可能引入进一步的难题的生物环 境的压力，导致支架与涂层之间的附着随着时间的延长而丧失。

可采用的合适成膜生物可吸收聚合物包括选自脂肪族聚酯、聚氨基 酸、共聚醚-酯、聚草酸亚烷基酯、聚酰胺、聚亚氨基碳酸酯、聚原 酸酯、polyoxaester、聚酰氨基酯、含酰氨基团的polyoxaester、聚 酐、聚磷腈、生物分子及其混合物的聚合物。对本发明目的而言，脂 肪族聚酯包括交酯的均聚物和共聚物(包括乳酸d-，1-和内消旋交 酯)、ε-己内酯、乙交酯(包括羟基乙酸)、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯、 对二氧六环酮、碳酸亚丙酯(及其烷基衍生物)、1，4-dioxepan-2-酮、 1，5-dioxepan-2-酮、6，6-二甲基-1，4-二噁烷-2-酮及其聚合物混合 物。对本发明而言，聚亚氨基碳酸酯包括Kemnitzer和Kohn在Domb， Kost和Wisemen编辑的the Handbook of Biodegradable Polymers， Hardwood Academic Press，1997，251-272页所描述的聚合物。对 本发明而言，共聚醚-酯包括Cohn and Younes在Journal of Biomaterials Research，Vol.22，993-1009页，1988，以及Cohn在 Polymer Preprints(ACS Division of Polymer Chmistry)Vol.30(1)， 498页，1989(如PEO/PLA)所描述的共聚醚-酯。对本发明而言，聚 草酸亚烷基酯包括美国专利Nos.4,208,511；4,141,087； 4,130,639；4,140,678；4,105,034；和4,205,399(在此引入作为参考) 中描述的那些。如Allcock在The Encyclopedia of Polymer Science， Vol.13，31-41页，Wiley Intersciences，John Wiley & Sons，1988 以及Vandorpe，Schacht，Dejardin和Lemmouchi在Domb，Kost和 Wisemen编辑的Handbook of Biodegradable Polymers，Hardwood Academic Press，1997，161-182页(在此引入作为参考)所描述的 由L-丙交酯、D，L-丙交酯、乳酸、乙交酯、羟基乙酸、对二氧六环酮、 碳酸亚丙酯和ε-己内酯制成的聚磷腈，共-、三元-和基于更高级数 混合的单体的聚合物。由HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH形式的二 酸形成的聚酐，其中m为2-8中的一个整数，及其与直至12个碳的 脂肪族α-ω二酸形成的共聚物。在美国专利Nos.5,464,929； 5,595,751；5,597,579；5,607,687；5,618,552；5,620,698；5,645,850； 5,648,088；5,698,213和5,700,583(在此引入作为参考)中的一个 或多个专利中均描述了polyoxaester polyoxaamides和含胺和/或酰 胺基的polyoxaester。聚原酸酯如Heller在Domb，Kost和Wisemen 编辑的Handbook of Biodegradable Polymers，Hardwood Academic Press，1997，99-118页(在此引入作为参考)所描述。对本发明而 言，成膜聚合生物分子包括可于人体内被酶降解，或者在人体内水解 不稳定的天然存在的物质，如纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、弹性蛋 白，以及可吸收的生物相容多糖，如壳聚糖、淀粉、脂肪酸(及其酯 类)、葡糖聚糖和透明质酸。

具有相对低的慢性组织反应的合适成膜生物稳定聚合物，如聚氨 酯、硅酮、聚(甲)丙烯酸酯、聚酯、聚环氧烷(聚环氧乙烷)、聚 乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮，以及那些诸如由交联的聚乙 烯基吡咯烷酮和聚酯形成的水凝胶也可以被采用。也可采用其它聚合 物，只要其可以溶解、固化或聚合在支架上即可。这些聚合物包括聚 烯烃、聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸聚合物(包括甲基丙烯 酸酯)和共聚物、乙烯基卤聚合物和共聚物，如聚氯乙烯；聚乙烯基 醚，如聚乙烯基甲基醚；聚偏二卤乙烯，如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯 乙烯；聚丙烯腈、聚乙烯基酮；聚乙烯芳香烃，如聚苯乙烯；聚乙烯 酯，如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体彼此和烯烃所形成的共聚物，如乙 烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂和乙烯- 乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺，如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂； 聚碳酸酯；聚甲醛；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂、聚氨酯；人造纤维； 人造纤维-三乙酸酯、纤维素、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素；赛璐 玢；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚(即羧甲基纤维素和羟烷基 纤维素)；及其组合。对本申请而言，聚酰胺也包括-NH-(CH2)n-CO-和 NH-(CH2)x-NH-CO-(CH2)y-CO形式的聚酰胺，其中n优选的为6-13中 的一个整数；x为6-12中的一个整数；y为4-16中的一个整数。

以上所列聚合物仅为举例，不对本发明构成限制。

被用作涂层的聚合物可以是分子量足够高而不会蜡化或发粘的成膜 聚合物。该聚合物也应当能附着在支架上，并在沉积于支架上后，不 应当易变形而在血液动力的压力下被移走。该聚合物分子量应足以提 供充分的韧性，从而在支架的输送或伸展期间，该聚合物不被摩擦掉， 并且在支架伸展期间不破裂。某些实施方案中，该聚合物的融化温度 在40℃以上，优选的大约45℃以上，更为优选的50℃以上，最为优 选的55℃以上。

通过将一种或多种治疗性RNAi构建体与涂层聚合物混合形成涂层 混合物便可配制出涂层。RNAi构建体的存在形式可为液体、细碎固体， 或其它任意适当物理形态。该混合物可任意包括一种或多种添加物， 如无毒辅助性物质，诸如稀释剂、载体、赋形剂、稳定剂等。其它合 适的添加物可连同聚合物和RNAi构建体一起配制。例如，可以将选 自上文所列生物相容成膜聚合物中的亲水聚合物添加至生物相容疏水 涂层中，以改进释放特性(或可将疏水聚合物添加至亲水涂层中，以 改进释放特性)。一个实例是将选自聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素及其组合的亲水聚合物添加 至脂肪族聚酯涂层中，以改良释放特性。合适的相对量可通过监测治 疗性RNAi构建体的体外和/或体内释放特性而得以确定。

涂层厚度可决定RNAi构建体从基质释放的速率。基本上，RNAi构 建体是通过经由聚合物基质扩散的方式从基质中释放。聚合物为可渗 透的，从而允许固体、液体和气体从其中释放。聚合物基质的总厚度 范围在大约1微米到大约20微米之间，或者更大范围。重要的是指 出可以在将聚合基质附着在医用装置上之前，利用引物层和金属表面 处理，例如，酸洗、碱洗、盐化和聚对亚苯基二甲基沉积均可被用作 所述全部过程中的一部分。

进一步举例证明，有许多方式可以将聚(乙烯-共-乙烯乙酸酯)、 聚甲基丙烯酸丁酯和RNAi构建体溶液掺入支架内或外。例如，可以 将该溶液喷涂在支架上，或者将支架浸入该溶液内。其它方法包括旋 涂和RF等离子聚合。一种典型实施方案中，该溶液被喷涂在支架上， 继而使其干燥。另一种典型实施方案中，可将该溶液通电而加以一个 极性，而支架被通电加以另一个相反极性。以该方式，溶液和支架将 彼此吸引。在采用这种类型的喷涂方法中，可减少损耗，并且可以实 现对涂层厚度更为精确的控制。

另一个典型实施方案中，RNAi构建体可以被掺入成膜聚氟共聚物 中，该共聚物含一定量的选自聚合的亚乙烯基氟和聚合的四氟乙烯的 第一个部分，和一定量的不同于第一个部分的第二个部分，第二个部 分与第一个部分共聚后，可产生聚氟共聚物，第二个部分能够提供该 聚氟共聚物的韧性或弹性性能，其中第一个部分与第二个部分的相对 量可有效赋予该涂层和其所产生的膜某些特性，可将这些特性有效地 应用在处理可植入医用装置的过程中。

在根据本发明的一种实施方案中，本发明的腔内医用装置中，可伸 展管状支架的外表面包含根据本发明的涂层。具有涂层的支架外表面 为接触组织表面，并且是生物相容的。“持续释放RNAi构建体送递体 系涂布的表面”与“涂布的表面”同义，其中表面被涂布、覆盖或浸 渗有根据本发明的持续释放RNAi构建体送递体系。

一种可选实施方案中，本发明的腔内医用装置中，延长的迅速可伸 展管状支架的腔内表面或整个表面(即内和外表面)均具有涂布的表 面。含本发明持续释放RNAi构建体送递体系的腔内表面也是接触流 体的表面，并且是生物相容和血液相容的。

V.典型应用

在一个方面，本发明方法被用于抑制，或至少减少体内不希望的细 胞生长，尤其是转化细胞的生长。某些实施方案中，本发明方法利用 RNAi选择性地抑制编码增殖调节蛋白的基因表达。例如，可采用本发 明方法抑制某些基因产物的表达，该基因产物对靶细胞的有丝分裂， 和或阻止靶细胞凋亡而言是必不可少的。本发明的RNAi构建体可以 被设计成与编码靶定的增殖调节蛋白的mRNA的编码序列或其它部分 对应。当采用该RNAi构建体进行处理时，靶细胞中出现的表达丧失 表型将致使该细胞处于休眠或者开始凋亡。

某些实施方案中，选择本发明的RNAi构建体以抑制可刺激细胞生 长和有丝分裂的基因产物的表达。可通过本发明方法靶定的基因种类 是那些已知的致癌基因。此处所用术语“致癌基因”指刺激细胞生长 的基因，并且当其在该细胞内的表达水平降低时，细胞生长速率便降 低或者该细胞开始休眠。本发明的上下文中，致癌基因包括细胞内蛋 白质，以及可能通过自分泌或旁分泌功能刺激细胞增殖的细胞外生长 因子。RNAi构建体可以被设计针对的人类致癌基因实例包括c-myc、 c-myb、mdm2、PKA-I(I型蛋白质激酶A)、Ab1-1、Bc12、Ras、c-Raf 激酶、CDC25磷酸酶、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)、 端粒酶、PDGF/sis、erb-B、fos、jun、mos、src、以上仅列举了少数 几种。本发明的上下文中，致癌基因也包括染色体易位导致的融合基 因，例如，Bcr/Ab1融合致癌基因。

某些优选实施方案中，是根据抑制对转化细胞，尤其是肿瘤细胞的 增殖必不可少的基因表达的能力选择本发明的RNAi构建体。可以采 用这种RNAi构建体作为针对体内赘生的、未分化的和/或增生性细胞 生长的治疗或预防的一部分，包括作为肿瘤治疗的一部分。c-myc蛋 白质在多种形式的癌症中不受调节，导致表达增加。体外c-myc RNA 水平的降低将诱导凋亡。因此互补于c-myc的siRNA可能可以被用作 抗癌症治疗的治疗剂。优选地，可将本发明的RNAi构建体应用在慢 性淋巴细胞性白血病的治疗中。慢性淋巴细胞性白血病通常是由于染 色体9和12易位产生Bcr/Ab1融合产物导致的。所获得的融合蛋白 被用作致癌基因；因此，对Bcr/Ab1融合mRNA的特异性排除便可能 导致白血病细胞的死亡。实际上，将特异于Bcr/Ab1融合mRNA的siRNA 分子转染进培养的白血病细胞中，不仅可以减少融合mRNA及相应的 肿瘤蛋白，还可以诱导这些细胞的凋亡(见，例如Wilda et al.， Oncogene，2002，21：5716-5724)。

另一些实施方案中，是根据抑制对淋巴细胞的活化，如B细胞或T 细胞的增殖，尤其是抗原介导的淋巴细胞活化必不可少的基因表达的 能力选择本发明的RNAi构建体。可采用这种RNAi构建体作为免疫抑 配方，如作为对免疫介导的炎性疾病的治疗或预防的一部分。

某些实施方案中，可应用此处描述的方法治疗自身免疫疾病。例如， 根据抑制编码或调节细胞因子表达的基因表达的能力选择本发明的 RNAi构建体。相应地，可以采用导致细胞因子，如THFα、IL-1α、IL-6 或IL-12或其组合的表达受抑制或减少的构建体作为治疗或预防类风 湿性关节炎的一部分。类似地，可以将导致炎症所涉及细胞因子表达 受抑制或减少的构建体应用在炎症和炎症相关疾病，如多发性硬化的 治疗或预防中。

另一些实施方案中，根据抑制糖尿病发作或进行所牵涉基因表达的 能力选择本发明的RNAi构建体。例如，实验性糖尿病被发现与肾小 球肥大所涉及的p21WAF1/CIP1(p21)和TGF-β1表达增加相关(见例 如A1-Douahji，et al.Kidney Int.56：1691-1699)。相应地，可以 将导致这些蛋白质表达受抑制或减少的构建体应用在糖尿病的治疗或 预防中。

另一些实施方案中，根据抑制ICAM-1(细胞内粘附分子)表达的 能力选择本发明的RNAi构建体。抑制ICAM-1表达的反义核酸是由Isis pharmaceutics公司针对牛皮癣研发的。另外，针对ICAM-1基因的反 义核酸被认为可以预防急性肾衰竭和再灌注损伤，并延长肾脏同基因 移植的存活期(见例如，Haller et al.(1996)Kidney Int.50：473-80； Dragun et al.(1998)Kidney Int.54：590-602；Dragun et al.(1998) Kidney Int.54：2113-22)。相应地，本发明考虑了RNAi构建体在上 述疾病中的用途。

另一些实施方案中，根据抑制对平滑肌细胞或血管内皮的其它细胞 增殖，诸如新内膜形成涉及的增殖细胞必不可少的基因表达的能力选 择本发明的RNAi构建体。这些实施方案中，本发明方法可作为治疗 或预防再狭窄的一部分。

仅举例说明，于血管成形术后应用于血管内皮细胞的RNAi构建体 可以在手术后减少这些细胞的增殖。仅举例说明，特定实例是互补于 c-myc(一种致癌基因)的siRNA。c-myc的下调抑制了细胞生长。因 此，可以通过合成下列寡核苷酸制备siRNA：

5′-UCCCGCGACGAUGCCCCUCATT-3′

3′-TTAGGGCGCUGCUACGGGGAGU-5′

除了粗体显示的脱氧核糖核酸，即胸腺嘧啶核苷以外，所有碱基均 为核糖核酸(为了更高的稳定性)。通过将等摩尔浓度的寡核苷酸混 合在含10mM Tris-Cl(pH 7.0)和20mM NaCl的溶液中，加热至95℃ 后，然后缓慢冷却至37℃，便可获得双链RNA。继而通过琼脂糖凝胶 电泳可以纯化所获siRNA，并将其送递至游离的或者与送递体系，诸 如基于环糊精的聚合物复合的细胞。对体外实验而言，通过生长曲线 分析、RT-PCR或对c-myc蛋白质的蛋白质印迹分析可以监测siRNA的 效果。

已证实直接针对c-myc基因的反义寡脱氧核苷酸，当于冠状支架移 植之后被立即局部送递时，能够抑制再狭窄(见例如Kutryk et al. (2002)J Am Coll Cardiol.39：281-287；Kipshidze et al.(2002) J Am Coll Cardiol.39：1686-1691)。因此，本发明考虑将针对c-Myc 基因的RNAi构建体(即c-Myc RNAi构建体)连同渗透物送递体系送 递至支架移植位点(Interventional Technologies，San Diego， California)。优选地，将该c-Myc RNAi构建体直接涂布在支架上， 以抑制再狭窄。类似地，可以局部送递c-Myc RNAi构建体，以抑制 经皮经腔冠状血管形成术(PTCA)之后出现的肌内膜增生，这种局部 送递的典型方法在例如Kipshidze et al.(2001)Catheter Cardiovasc Interv.54：247-56中有所描述。优选的，采用例如硫代磷酸酯或氨 基磷酸酯化学修饰RNAi构建体。

早期生长反应因子-1(即Egr-1)是于机械性损伤期间被激活，并 且调节细胞增殖和迁移所涉及的许多基因的转录的转录因子。因此， 该蛋白质的下调也可能是预防再狭窄的途径。通过合成下列寡核苷酸 可以制备针对Egr-1的siRNA：

5′-UCGUCCAGGAUGGCCGCGGTT-3′

3′-TTAGCAGGUCCUACCGGCGCC-5′

同样，除了粗体显示的脱氧核糖核酸，即胸腺嘧啶核苷以外，所有 碱基均为核糖核酸。从这些寡核苷酸便可制备siRNA，并如上所述将 其导入细胞内。

实施例

上文一般性地描述了本发明，参考下述实施例便可以更容易地理解 本发明，将这些实施例包括在内仅为例证本发明的某些方面和实施方 案，并不对本发明构成限制。

1.编码siRNA的质粒DNA的体外送递

将人类胚胎肾细胞(HEK 293-EcR)以每孔200,000个细胞接种进6 孔培养板中。这些HEK 293-EcR细胞已经由编码蜕皮激素受体的质粒 稳定转染。2-3天后，采用pIND-rev-GFP(一种编码可诱导元件以及 绿色荧光蛋白质的质粒)和pTZU6+1/siRNA(一种编码siRNA寡核苷 酸的有义和反义链的质粒)共同转染细胞。于0.5ml opti-MEM中， 以15N/P的比例将该质粒(见Lee et al.(2002)Nature Biotechnology， 20：500-505)与支链PEI25k-hi-CD聚合物(高环糊精接枝度)复合。 4小时后，以2ml完全培养基替换该培养基。第24小时，由5μM松甾 酮A诱导细胞，以诱导GFP靶细胞表达。第72小时，通过versene 移出细胞，将其收集，并通过流式细胞仪分析其GFP表达。如图1所 示，siRNA的转染以剂量依赖方式下调GFP表达。采用2微克siRNA 时，观测到GFP表达下降大约50％，而当采用4微克siRNA时，则观 测到GFP表达下降大约40％。上述实验证实，借助于β环糊精聚合物 可以成功地将RNAi构建体送递进培养细胞中，并通过RNA干扰机制 减弱基因表达。

2.体外的DNA质粒送递与荧光素酶表达

将BHK-21细胞接种进24孔培养板中，并于无血清条件下，采用以 多种不同配比与β环糊精聚合物(βCDPs)复合的1μg pGL3-CV质粒 (一种含荧光素酶基因的质粒)转染。通过对荧光素酶蛋白质活性的 检定以确定转染效率，结果用相对光单位(RLUs)表示(见图2)。以 转染后48小时所获得细胞溶解产物中的蛋白质量衡量细胞存活力。 通过Biorad’s DC蛋白分析(Hercules，CA)确定转染细胞的蛋白质 水平，并采用由裸DNA转染过的细胞的蛋白质水平进行标准化。根据 细胞培养裂解缓冲液中的牛IgG(Biorad)的不同浓度标绘出蛋白质 标准曲线。上述实验证实，通过调节β环糊精聚合物与RNAi构建体 之间的配比可以优化转染效率。

3.小鼠体内的DNA质粒送递及荧光素酶表达

除了DNA是通过0.2μm滤器过滤除菌，并于使用前冻干以外，其它 材料不变。于10％葡萄糖中制备线性环糊精聚合物，并将其添加至等 体积含pGL3-CV质粒(一种含荧光素酶基因的质粒)的水中，使最终 溶液为5％葡萄糖溶液。制备5+/-的粒子，且最终DNA浓度为0.5mg/mL。 采用200μL含100μg荧光素酶DNA的聚合物溶液经由门静脉注射进雌 性Balb/C小鼠体内。DNA给药4小时后，麻醉小鼠，将荧光素注射 进其腹膜内腔，并利用Xenogen照相机成像以获得荧光素酶蛋白质活 性。质粒给药后4小时内，在肝脏内观测到荧光素酶表达。上述实验 证实与β环糊精聚合物复合的RNAi构建体可以被送递进体内(如小 鼠体内)。

4.siRNA寡核苷酸的体外送递

将人类急性白血病K562悬浮细胞(具有p210Bcr-Ab1融合物的内 源表达)以每孔1,000,000个细胞接种进每孔含0.5ml opti-MEM的6 孔培养板中。多聚体是采用0.25ml opti-MEM中的2μMdsRNA(Dharmacon Research，Inc.)与也在0.25ml opti-MEM中的线性PEI-hi-CD聚合 物，以15N/P的比例形成。下列dsRNA寡核苷酸被设计成可以识别 Bcr-Ab1融合体mRNA剪接物1靶：

5′-GCAGAGUUCAAAAGCCCUUdTdT-3′

3′-dTdTCGUCUCAAGUUUUCGGGAA-5′

将0.5ml转染培养基添加在0.5ml细胞中。4小时后，每孔补充4ml 完全培养基。第48小时，收集细胞，洗涤，并裂解。测定蛋白质浓 度，并将20μg蛋白质上样至SDS-PAGE凝胶中，开始电泳。将蛋白质 转移至PVDF膜上，由1％BSA封闭，并由抗Bcr抗体印迹。通过化学 发光(Amersham)检测p210信号，并通过与未经处理样品比较，条 带强度的降低以观测下调。上述实验证实被配制在超分子复合物(如 β环糊精聚合物)中的siRNA可以被送递并用于急性白血病的基因治 疗。

5.小鼠体内的DNA酶送递

将采用250μL含1mg荧光标记DNA酶的D5W配制的粒子注射进携带 瘤裸鼠体内。配方含有如上所述[Bellocq，2002#459]的CD聚合物、 AD-PEG和AD-PEG-转铁蛋白(用于靶定肿瘤)。注射后24小时处死小 鼠，并通过荧光立体显微镜分析所提取的肿瘤。细胞内DNA酶定位是 通过共焦显微镜肉眼观察。越过肿瘤冠而进入肿瘤细胞内的穿透是借 助于转铁蛋白修饰的粒子才实现的。上述实验证实β环糊精聚合物可 以被用于体内送递其它表达构建体(如DNA酶)，以进行基因治疗。

6.小鼠体内的长RNA送递

除了RNA是通过0.2μm滤器过滤除菌，并于使用前冻干以外，其它 材料不变。于10％葡萄糖中制备线性环糊精聚合物，并将其添加至等 体积含荧光素酶RNA的水中，使最终溶液为5％葡萄糖溶液。制备5+/- 的粒子，且最终RNA浓度为0.5mg/mL。将200μL含100μg荧光素酶RNA 的聚合物溶液经由门静脉注射进雌性Ba1b/C小鼠体内。RNA给药4 小时后，麻醉小鼠，将荧光素注射进其腹膜内腔，并利用Xenogen照 相机成像以获得荧光素酶蛋白质活性。荧光素酶RNA给药后4小时内， 在肝脏内观测到荧光素酶表达。上述实验证实与β环糊精聚合物复合 的长RNA可以被送递进体内(如小鼠体内)。