一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法
专利汇可以提供一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公布了一种检测 生物 巯基的 荧光 探针及其制备方法与使用方法，检测生物巯基的荧光探针有两部分组成：2,4-二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化 硼 -二吡咯甲烷（BODIPY）衍生物为信息报告功能团。该探针分子可简单迅速地进入活细胞，与细胞内巯基发生特异性反应，导致荧光强度显著增强，进而可用于活 体细胞 中活性巯基的荧光检测和成像。本发明 稳定性 好，能够长期保存使用，适用于活细胞生长的多种环境，具有较高的巯基检测灵敏度，抗干扰能 力 强，具有优秀的选择性，与其它常见生物干扰分子无作用。可简单进入活细胞和活组织，能有效实现对生物体系内巯基的单一识别,因而能够用于活体细胞的荧光成像。，下面是一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法专利的具体信息内容。
1.一种检测生物巯基的荧光探针的制备方法，其特征在于：该检测生物巯基的荧光探针有两部分组成：2,4-二硝基苯磺酰基为识别基团，二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物为信息报告功能团，其结构如下；
检测生物巯基的荧光探针的制备路线如下：
检测生物巯基的荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤一， 的制备：在氩气的保护下，将0.6～1.2 g间羟基苯甲醛与1～
2 g 2,4-二甲基吡咯加入150 mL 的二氯甲烷中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL三氟乙酸，在室温下搅拌反应10～15小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离；
步骤二， 的制备：在氩气的保护下，将1.2～2.4 g式II化合物溶于100 mL二氯甲烷中，并向反应体系内滴加溶有1.3～2.6 g 2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ）的二氯甲烷溶液100 mL，继续搅拌反应4～6小时后，将体系以冰浴冷却，再向反应体系内快速滴入10 mL三乙胺和15～30 mL三氟化硼的乙醚溶液，继续搅拌反应3～4小时，减压除去溶剂，残留物溶于100 mL二氯甲烷中，以100 mL水分两次洗涤后，有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残留物用硅胶柱层析进行纯化；
步骤三，探针分子的制备：在氩气的保护下，将0.5～1 g式III化合物溶于50 mL二氯甲烷中，以冰浴冷却，并加入0.5 mL三乙胺，搅拌10～15分钟后，向反应体系内滴加溶有1.2～2.4 g 2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液20 mL，待滴加完全后，升至室温继续搅拌10～15小时，减压除溶剂，粗产品用硅胶柱层析进行分离纯化，以二氯甲烷：石油醚 =
10：3为洗脱剂洗脱，得到探针分子纯品。
2.一种检测生物巯基的荧光探针的使用方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤一，测量探针分子的核磁共振波谱及高分辨质谱数据
步骤二，测定探针分子对巯基的选择性
将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入以PBS缓冲液溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 μM，而待测样品的浓度为2 mM；反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性；
步骤三，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-浓度曲线
将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入不同浓度的L-半胱氨酸，使最终探针分子的浓度为0.1 μM；反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而得到荧光强度对浓度变化的曲线；
步骤四，测定探针分子对L-半胱氨酸的荧光-时间曲线
将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液；分别加入不同浓度的L-半胱氨酸，使最终探针分子的浓度为0.1 μM，而L-半胱氨酸的浓度为2 mM；反应一定时间，检测荧光强度，进而得到荧光强度对时间变化的曲线；
步骤五，探针分子对Mel细胞中活性巯基的荧光成像检测
待测Mel细胞用PBS缓冲液洗涤三次后，加入20 μM的荧光探针分子，在37℃下孵育
10分钟后，再用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后进行荧光成像检测。
一种检测生物巯基的荧光探针及其制备方法与使用方法
技术领域
背景技术
发明内容
步骤一，式II的制备：在氩气的保护下，将0.6～1.2 g间羟基苯甲醛与1～2 g
2,4-二甲基吡咯加入150 mL 的二氯甲烷中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL三氟乙酸，在室温下搅拌反应10～15小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离。
步骤二，测定探针分子对巯基的选择性
将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液。分别加入以PBS缓冲液溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 μM，而待测样品的浓度为2 mM。反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性。
10分钟后，再用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后进行荧光成像检测。
图3是荧光探针分子的高分辨质谱；
图4是荧光探针分子与巯基反应的选择性；
图5是荧光探针分子检测巯基化合物L-Cys的荧光强度-浓度曲线；
图6是荧光探针分子检测巯基化合物L-Cys的荧光强度-时间曲线。
具体实施方式
反应过程用以下反应流程表示：
1）式II的制备：在氩气的保护下，将0.6 g间羟基苯甲醛与1 g 2,4-二甲基吡咯加入
150 mL 的二氯甲烷中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL三氟乙酸，在室温下搅拌反应10小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离。
H NMR (400 MHz, CDCl3): 8.69 (brs, 1H), 8.50 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.27 (d,
1H, J = 8.0 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 8.0 Hz),7.33 (d,
13
1H, J = 8.0 Hz), 7.25 (brs, 1H), 6.00 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 1.36 (s, 6H)。 C NMR (100 MHz, CDCl3): 156.4, 149.2, 142.6, 137.5, 133.5, 132.3, 131.5, 128.2,
126.5, 126.0, 122.7, 122.4, 121.7, 120.6, 119.7, 14.6, 14.5；HRMS (TOF-MS- +
EI): calcd. for [C25H21BF2N4O7S], 570.1192, Found, 570.1188.
（3）测定探针分子对巯基的选择性
将探针分子以少量DMSO溶解，再用PBS缓冲液配置成溶液。分别加入以PBS缓冲液溶解的待测样品，使最终探针分子的浓度为0.1 μM，而待测样品的浓度为2 mM。反应0.5小时后在荧光光谱仪上进行测定，进而确定探针分子对巯基的选择性。
10分钟后，再用PBS缓冲液洗涤细胞三次，然后进行荧光成像检测。结果显示该探针分子确实能够对活体细胞内的巯基进行特异性标记。
反应过程同实施例1：
1）式II的制备：在氩气的保护下，将0.9 g间羟基苯甲醛与1.5 g 2,4-二甲基吡咯加入150 mL 的二氯甲烷中，搅拌溶解后，再加入0.5 mL三氟乙酸，在室温下搅拌反应12小时，待反应结束后，蒸干溶剂，以硅胶柱进行分离。
反应过程同实施例1。
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