用于降低脂蛋白颗粒对动脉壁酶引起的致动脉粥样硬化性聚集的敏感度的方法和试剂盒
阅读：977发布：2021-02-24
专利汇可以提供用于降低脂蛋白颗粒对动脉壁酶引起的致动脉粥样硬化性聚集的敏感度的方法和试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且降低人或其他动物中致动脉粥样硬化性颗粒对由鞘磷脂酶引起的聚集的敏感度的方法，所述方法包括向所述动物施用囊泡。还有类似的针对胆固醇结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集和ApoB的变性的方法。，下面是用于降低脂蛋白颗粒对动脉壁酶引起的致动脉粥样硬化性聚集的敏感度的方法和试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种降低动物中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由鞘磷脂酶(SM酶)引起的聚集的敏感度的方法，所述动物包括SM酶和所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒，所述方法包括向所述动物施用囊泡(或脂质体)，以引起所述敏感度的降低，条件是所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇，并且其中人被认为是一种动物，并且其中所述动物包括封闭的循环系统，所述封闭的循环系统包括动脉。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法被应用于人。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述囊泡进行胃肠外施用。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述囊泡是LEV。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述囊泡包含一种或多种磷脂，条件是所述囊泡不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述囊泡包含选自由以下组成的组的磷脂：磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油和POPC。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述囊泡包含POPC。
8.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中对聚集的敏感度由SM酶引起的致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒包括载脂蛋白B。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒选自由以下组成的组：LDL、残粒脂蛋白、富含胆固醇和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(一起称为C-TRL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、小VLDL(sVLDL)、富含胆固醇的残粒脂蛋白、β-VLDL、VLDL残粒、乳糜微粒残粒、餐后残粒、中间密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白(a)[Lp(a)]和富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒为LDL。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中每kg人体重施用的总囊泡剂量在
10mg/kg至1600mg/kg的范围内(优选在100mg/kg至1600mg/kg的范围内、最优选在300mg/kg至1000mg/kg的范围内)，所述总剂量作为单个剂量施用或分成多个剂量施用，其中所述分开的多个剂量在至多短的时间段(诸如24小时)内施用；并且其中所述总的囊泡剂量施用至少一次。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉的滞留利用评估系统来确定，所述评估能够测量这种敏感度和/或滞留。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述评估系统为离体系统或体外系统。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述离体评估系统或体外评估系统选自由以下组成的组：(1)测量已经从血浆分离然后与SM酶一起离体孵育的LDL的聚集的程度或速率(又称为所述LDL对由SM酶引起的聚集的敏感度)，(2)从血浆分离然后与SM酶一起离体孵育的apoB-脂蛋白的聚集，(3)从血浆分离然后与动脉壁酶一起孵育的LDL或另一种apoB-脂蛋白的聚集，(4)仍在分离自所述人或其他动物的血浆中的含apoB的脂蛋白的聚集或与其他血浆组分的聚集，(5)在加入了酶诸如动脉壁酶的血浆组分的存在下，含apoB的脂蛋白的聚集，(6)apoB-脂蛋白通过物理手段(诸如涡旋)的聚集，(7)apoB-脂蛋白通过氧化反应诸如脂质过氧化反应的聚集，(8)在脂酶和/或蛋白酶的存在下apoB-脂蛋白的聚集，(9)LDL或其他致动脉粥样硬化性脂蛋白与动脉段离体孵育，以及(10)用于确定apoB-脂蛋白的组成的系统。
15.如权利要求14所述的方法，其中在用于评估对聚集的敏感度的体外测定中使用的动脉壁酶优选选自由以下组成的组：SM酶、人SM酶、人重组SM酶、在酸性pH下使用的SM酶、磷脂酶、磷脂酶A2、脂肪酶、胆固醇酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶、半胱天冬酶、弗林蛋白酶、细胞内蛋白酶、钙蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶、细胞外蛋白酶、从细胞释放的细胞内水解酶。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述动脉壁酶为哺乳动物重组SM酶。
17.如权利要求12所述的方法，其中所述评估系统用于体内评估所述颗粒。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述评估系统用于体内评估所述致动脉粥样硬化性颗粒在所述动脉中的滞留，并且选自由以下组成的组：动脉壁内apoB-脂蛋白聚集和/或滞留的体内测定、动脉壁内滞留和/或聚集的脂蛋白的成像方法、健康动脉段中脂蛋白聚集和/或滞留的测定、患病动脉段中脂蛋白聚集和/或滞留的测定、成像方法(诸如心导管插入术、血管内超声(IVUS)、MRI、有对比的MRI、CT扫描、有对比的扫描、有对比剂的成像方法，其中所述对比剂包括纳米颗粒，以及核医学研究)、包括将所述apoB-脂蛋白注射到动物内的方法、包括对所述apoB-脂蛋白加标签然后将其注射到动物(所述动物包括人和非人动物)内的方法、以及包括体内评估内源apoB-脂蛋白的方法。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：基于利用在所述人或其他动物中的评估获得的结果改变囊泡剂量(例如LEV剂量)，以使得如果剂量(参考剂量)导致选自由较少的聚集、指示较小的聚集敏感度的致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒组成的改变、动脉壁中较少的滞留、动脉中对聚集的LDL或其他apoB-脂蛋白的不良反应的评估，诸如巨噬细胞积累、激活或M1极化，和/或蛋白酶、蛋白酶活性、组织因子或致动脉粥样硬化性细胞因子的表达组成的组的结果，则下一个LEV剂量与所述参考剂量相比减少和/或所述参考剂量和下一个剂量之间的时间间隔与所述参考剂量和之前的剂量之间的时间间隔相比增长。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法影响所述人或其他动物的LDL(或其他apoB-脂蛋白)的组成方面的至少一种改变，所述改变选自由以下组成的组：鞘磷脂与磷脂酰胆碱的摩尔比(SM:PC)降低、为POPC的PC的摩尔分数的升高、未酯化胆固醇与磷脂酰胆碱的比率(UC:PC)的降低、溶血性PC:PC比率的降低、PC:蛋白的比率的升高、POPC:蛋白的比率的升高、PC与apoB的比率的升高、POPC与apoB的比率的升高、PC与胆固醇酯的比率(PC:ChE)的升高、POPC:ChE的比率的升高、PC与甘油三酯的比率(PC:TG)的升高、POPC:TG的比率的升高、UC:蛋白比率的降低、以及指示LDL(或其他apoB-脂蛋白)在PC和/或POPC的富集和/或在SM、溶血性PC、UC和apoC-III的消耗的任何其他测量。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述方法中使用的囊泡或脂质体包括与在所述LDL或其他apoB-脂蛋白中摩尔分数将升高的磷脂相同的磷脂。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法应用于有(中度、高的或很高的)动脉粥样硬化性心血管风险的人。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述人的特征是存在选自由以下组成的组的一个或多个特征：已知存在动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、高ASCVD事件风险(例如通过ASCVD风险计算器表明的)、LDL的高血浆浓度、apoB的高血浆浓度、apoB-脂蛋白的高血浆浓度、高血压、高血压史、吸烟、吸烟史、糖尿病、代谢综合征、代谢综合征的成分、动脉粥样硬化代谢综合征、C反应蛋白的高血浆浓度、高的冠状动脉钙化积分、异常的颈动脉超声、指示易损斑块的成像方法、显示动脉壁中的巨噬细胞激活的成像方法、显示动脉壁中的蛋白酶活性的成像方法、显示LDL或其他apoB-脂蛋白对聚集的高敏感度和/或动脉滞留的测定。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述人的特征是存在使其倾向于加速ASCVD的疾病。
25.如权利要求24所述的方法，其中使人倾向于加速ASCVD疾病的疾病选自有以下组成的组：家族性高胆固醇血症、杂合家族性高胆固醇血症、纯合家族性高胆固醇血症、“多基因”家族性高胆固醇血症、IIa型高脂血症、IIb型高脂血症、III型高脂血症、IV型高脂血症、由导致高胆固醇血症的隐性、共显性或显性突变导致的疾病、混合型高脂血症和家族性混合型高脂血症(FCHL)。
26.如权利要求24所述的方法，其中使人倾向于加速ASCVD疾病的疾病是具有高的apoB血浆浓度(“高于正常”)的病症。
27.如权利要求24所述的方法，其中使人倾向于加速ASCVD疾病的疾病是与暴露于SM酶后血浆LDL和/或其他apoB-脂蛋白对聚集的敏感度高于正常敏感度相关的病症。
28.一种测量在人或其他动物中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由鞘磷脂酶(SM酶)引起的聚集的敏感度的方法，所述方法包括步骤(1)从已对其施用囊泡或脂质体的人或其他动物获得血浆样品；和(2)使该样品经历针对其致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由SM酶引起的聚集的敏感度的测试；其中所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇。
29.如权利要求28所述的方法，其中步骤(1)和开始步骤(2)之间的时间优选不超过7天、更优选不超过3天、最优选不超过1天。
30.如权利要求29所述的方法，其中在步骤(1)和开始步骤(2)之间的间隔内所述血浆样品优选贮存在不超过环境温度(例如，约25摄氏度(℃))。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述囊泡或脂质体与至少一种其他药物一起施用。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述囊泡或脂质体与选自由以下组成的组的药物组合：胆固醇合成抑制剂、他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、贝特、SGLT2抑制剂、GLP1激动剂、减重药物、CETP抑制剂、PCSK9抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、依泽替米贝、低剂量阿司匹林、乙酰-CoA羧化酶(ACC)抑制剂、ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)抑制剂、降低LDL的药物、降低甘油三酯的药物、gemcabene、硫酸酯酶-2的抑制剂、硫酸酯酶-2产生或分泌的抑制剂、bempedoic acid、微粒体甘油三酯转移蛋白的抑制剂、针对APOB mRNA的反义寡核苷酸、apoB脂蛋白的分泌的抑制剂、鱼油、鱼油脂肪酸和胆汁酸结合剂。
33.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述人或其他动物不患有血脂异常。
34.一种用于降低人(或其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)囊泡；和
(2)所述试剂盒能够用于降低人(或其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度的印刷声明，
其中所述囊泡不包含鞘磷脂，并且其中所述印刷声明可以在一张纸上、标签上或包装上，或者从网络资源可获得(优选以印刷形式作为所述试剂盒的一部分的印刷声明)，以使得假如所述试剂盒包括印刷声明，在所述印刷声明处使用者能够找到(例如去网站上查找到)所述试剂盒能够用于降低人(或其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度，则满足本发明的试剂盒的印刷声明的要求。
35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述试剂盒意图降低致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由SM酶引起的聚集的敏感度，并且其中该意图在所述印刷声明中具体说明。
36.如权利要求34或35所述的试剂盒，其中所述囊泡是LEV。
37.如权利要求34、35或36所述的试剂盒，其中所述囊泡包含一种或多种磷脂，条件是所述囊泡不包含显著量的鞘磷脂和/或未酯化胆固醇。
38.如权利要求34至37中任一项所述的试剂盒，其中所述囊泡包含选自由以下组成的组的磷脂：磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、POPC及其衍生物。
39.如权利要求34至38中任一项所述的试剂盒，其中所述囊泡包含POPC。
40.如权利要求34至39中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒意图降低以下致动脉粥样硬化性脂蛋白的SM酶引起的聚集：LDL、残粒脂蛋白、富含胆固醇和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(一起称为C-TRL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、小VLDL(sVLDL)、富含胆固醇的残粒脂蛋白、β-VLDL、VLDL残粒、乳糜微粒残粒、餐后残粒、中间密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白(a)[Lp(a)]和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(TRL)，并且所述印刷声明任选地可以说明所述试剂盒针对那些脂蛋白颗粒中的哪些。
41.一种系统，所述系统包括如权利要求34至40中任一项所述的试剂盒，并且还包括用于测量所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉滞留的评估系统。
42.如权利要求41所述的系统，其中所述系统还包括印刷声明上的说明书，说明脂质体施用的剂量和/或时间安排能够基于用所述评估系统获得的结果调整。
43.如权利要求34至42中任一项所述的试剂盒或系统，所述系统还包括所述印刷声明上的说明书，说明所述试剂盒或系统能够用于治疗患者，所述患者具有选自由以下组成的组的病症：与致动脉粥样硬化性脂蛋白的增加的聚集相关的病症、与致动脉粥样硬化性脂蛋白的增加的动脉滞留相关的病症、与其apoB-脂蛋白对聚集的增加的敏感度有关的病症、以及与其apoB-脂蛋白对滞留的增加的敏感度有关的病症。
44.一种降低动物中促致动脉粥样硬化性参数的方法，所述参数选自由胆固醇结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集和apoB的变性组成的组，所述方法包括向所述动物施用囊泡(或脂质体)，以使得在给定的时间段内形成、富集或变性的所述参数的量小于在不存在所述施用下其将会是的量，条件是所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇，并且其中人被认为是动物，并且其中所述动物包括封闭的循环系统，所述封闭的循环系统包括动脉。
45.一种降低动物中促致动脉粥样硬化性参数的量的方法，所述方法包括向所述动物施用囊泡(或脂质体)，以使得在给定的时间段内形成的所述促致动脉粥样硬化性参数的量小于在不存在所述施用下其将会是的量，条件是所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇，并且其中人被认为是动物，并且其中所述动物包括封闭的循环系统，所述封闭的循环系统包括动脉，其中所述促致动脉粥样硬化性参数选自由以下组成的组：炎性小体活化、NLRP3炎性小体的活化、促致动脉粥样硬化性T细胞的激活、有害细胞因子(诸如白介素(IL)-1β(IL1β)和IL6)的释放、斑块进展、斑块不稳定以及C反应蛋白(CRP)的释放。
46.一种用于降低人(或其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)囊泡；和
(2)所述试剂盒能够用于降低人或其他动物中促致动脉粥样硬化性参数的印刷声明，所述参数选自由胆固醇结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集和apoB的变性组成的组，其中所述囊泡不包含鞘磷脂，并且其中所述印刷声明可以在一张纸上、标签上或包装上，或者可以从网络资源可获得(优选以印刷形式作为所述试剂盒的一部分的印刷声明)，以使得假如所述试剂盒包括印刷声明，在所述印刷声明处使用者能够找到(例如去网站上查找到)所述试剂盒能够用于降低人或其他动物中的促致动脉粥样硬化性参数，则满足本发明的试剂盒的印刷声明的要求，所述参数选自由胆固醇结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集和apoB的变性组成的组。
用于降低脂蛋白颗粒对动脉壁酶引起的致动脉粥样硬化性聚
集的敏感度的方法和试剂盒
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2016年9月1日提交的美国临时申请序列号62/382,368的权益。前述临时申请的整个公开以其整体并入本文引作参考。
技术领域
背景技术
[0004] 降低人体内动脉粥样硬化性损伤的程度的能力是现代医学的重大目标。
[0005] 尽管血浆LDL-降低疗法在治疗动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)中的成功，用最佳的他汀类疗法(1，2)以及甚至新的PCSK9抑制剂(3，4)治疗的患者表现出对ASCVD事件的相当大的剩余风险。对目前的降低血浆LDL水平的手段之外的新方法存在需求。
[0006] 低密度脂蛋白颗粒(LDL)和相关致动脉粥样硬化性脂蛋白通常进入并且离开动脉壁。动脉粥样硬化由一定比例的这些脂蛋白滞留或陷入在动脉壁内引起，主要通过它们与动脉内膜中的细胞外基质分子(特别是蛋白多糖)的结合(5)。滞留的致动脉粥样硬化性脂蛋白产生变化，并且主要变化是聚集(还可以包括颗粒融合的过程)(6)。一旦这些脂蛋白(其每一个包含一分子的载脂蛋白B(apoB))变得聚集，它们从动脉壁离开就变得不太可能。它们的移动在空间上受其较大的尺寸的阻碍，并且它们对动脉基质的亲和力增加。此外，聚集的apoB-脂蛋白被局部的巨噬细胞贪婪地(avidly)摄取，对其加载胆固醇，从而产生“泡沫细胞”(动脉粥样硬化的一种标志)。因此，动脉壁内LDL和相关脂蛋白的聚集是动脉粥样硬化的发展和进展的关键步骤。
[0007] 这种聚集似乎由鞘磷脂酶(SM酶)介导：在高胆固醇血小鼠中，分泌型SM酶(酸性鞘磷脂酶基因的产物)的缺乏通过动脉壁内的作用与LDL滞留和动脉粥样硬化性损伤的减少相关联，而不改变apoB-脂蛋白的血浆浓度(7)。其他动脉壁酶也可以做出贡献，诸如其他磷脂酶(诸如磷脂酶A2)和脂蛋白脂酶(后者主要作为物理桥梁)。对改变体内LDL和相关脂蛋白的方法存在需要，以使这些颗粒对聚集大大地不敏感，从而使致动脉粥样硬化性较低。
[0008] 已经显示磷脂(“PL”)诸如卵磷脂(磷脂酰胆碱)在水性介质中的分散导致PL自组装进复层脂质体，即包括同心球面双分子层的囊泡(也被称为复层囊泡或MLV)。多种制备方法，诸如挤出(例如 挤出机)和高剪切和/或高压方法(例如 均化技术)，可以用来产生指定尺寸的单层囊泡(意味着包括单个脂质双分子层的囊泡)。根据习惯命名法，至少50nm直径的单层囊泡在本文被称为大的‘空’囊泡(LEV)，因为它们不需要包含包封的药物用于本文的应用(尽管如此，也构思了包封的药物)。LEV有时候也被称为大的单层囊泡(LUV)，相对于小的单层囊泡(SUV)，其直径通常为约30nm。胃肠外(通常静脉内)施用至实验动物或人受试者后，甚至足够剂量的无胆固醇或低胆固醇LEV在循环中保持为完整颗粒，并且具有从外周组织抽取胆固醇的能力(参见(8)中的讨论)。
[0009] 然而，之前未表明LEV对于LDL和相关致动脉粥样硬化性颗粒(具有载脂蛋白B作为它们主要载脂蛋白的那些颗粒)对SM酶引起的聚集的敏感度的影响。这样的验证会是有用的，因为它会产生另外的用于针对动脉粥样硬化性损伤的发展和进展的治疗干预的方法。本发明基于这样的验证：其测量血浆LDL对SM酶引起的聚集的体外敏感度。将看到，在来自LEV处理的动物的LDL中，这种敏感度已经大大降低。
[0010] LDL的主要载脂蛋白是apoB。包含apoB的其他致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对SM酶也是敏感的。结果，可以预期LEV对于LDL在暴露于SM酶时对聚集体的敏感度发生有益影响，那些其他的包含apoB的致动脉粥样硬化性颗粒(总体地，LDL和这些其他的致动脉粥样硬化性颗粒有时被称为‘含apoB脂蛋白’或更简单地称为‘apoB-脂蛋白’)也一样。那些其他的致动脉粥样硬化性颗粒是残粒脂蛋白、富含胆固醇和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(一起称为C-TRL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、小VLDL(sVLDL)、富含胆固醇的残粒脂蛋白、β-VLDL、VLDL残粒、乳糜微粒残粒、餐后残粒、中间密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白(a)[Lp(a)]和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(TRL)。尽管乳糜微粒也包含apoB，但是乳糜微粒通常太大而无法开始有效进入动脉壁并导致动脉粥样硬化(参见Borén J和Williams KJ.The central role of arterial retention of cholesterol-rich apoB-containing lipoproteins in the pathogenesis of atherosclerosis:a triumph of simplicity Curr Opin Lipidol.2016,印刷中.doi:10.1097/MOL.0000000000000330)。
[0011] 与MLV和SUV相比，LEV具有优势。通过只具有单个磷脂双分子层，LEV的大多数脂质内容物被直接暴露，即可用于有益地改变LDL和其他apoB脂蛋白。相反，MLV的复层结构意味着内部的双分子层被遮蔽，因此在改变LDL和其他致动脉粥样硬化性脂蛋白以变得对聚集较不敏感方面效率较低。
[0012] 此外，SUV具有抑制肝脏中LDL受体表达的有害副作用，从而增加LDL的血浆浓度(8)。LEV避免了抑制LDL受体的副作用，从而避免了升高LDL的血浆浓度的副作用(8)。
[0013] 本发明还涉及动脉壁内未酯化的胆固醇的结晶体(“胆固醇结晶体”)和其他有害物质的形成。此类其他有害物质包括但不限于危险脂质和富含脂质的结构、修饰的apoB100和apoB48及其片段。
[0014] 已经显示动脉壁内来自残留并聚集的apoB-脂蛋白(诸如LDL、残粒脂蛋白、Lp(a)和小VLDL)的过量未酯化的胆固醇导致并加快很多适应不良性反应。这些适应不良性反应包括但不限于已报道的未酯化胆固醇的结晶体和微结晶体的形成，未酯化胆固醇的结晶体和微结晶体然后激活炎性小体，特别是NLRP3炎性小体，炎性小体然后导致白介素(IL)-1β(IL 1β)、IL6的活化和释放，导致下游损害(参考文献21-25)。本领域的典型公开内容是Guarino等，其报道了鞘磷脂酶和胆固醇酯酶对促进由酶促修饰的LDL起始的胆固醇结晶体成核的联合影响21。此外，Haka等报道了动脉粥样硬化斑块中的重要细胞类型巨噬细胞抓紧细胞外聚集的LDL并消化聚集的LDL的临近或接近巨噬细胞的区域，导致显著量的未酯化胆固醇的释放26。该未酯化胆固醇是细胞外胆固醇结晶体形成的可能起源。
[0015] 来自残留并聚集的apoB-脂蛋白的胆固醇的另外的适应不良性反应包括细胞膜的异常未酯化胆固醇富集26，细胞膜的异常未酯化胆固醇富集然后激活吞噬途径28、toll样受体29、炎性小体30和产生前滞留性动脉基质(pro-retentive arterial matrix)的酶31-33。
[0016] 另外，去脂化或变性的apoB激活促致动脉粥样硬化性T细胞杂交瘤(如由IL2、[3H]胸苷掺入和其他已知方法表明的)34。SM酶引起的LDL聚集导致实质性apoB变性35。
[0017] 然而，本领域尚未公开LEV可以被用于抑制apoB-脂蛋白的聚集，并从而抵制胆固醇结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集、apoB的变性以及源自在鞘磷脂酶的存在下聚集的apoB-脂蛋白的其他有害物质的发展。
[0018] 本发明解决了对于靶向诱发这些适应不良性免疫反应的初始步骤的方法和组合物的需求。
[0019] 此外，本发明避免了副作用，包括由于目前抑制IL 1β、IL6和其他免疫介质或功能的方法引起的免疫抑制和其他免疫紊乱24,25,36,37。例如，近期的临床试验显示，施用至心血管患者的IL 1β的抑制剂与安慰剂相比在这些患者中与更高的致命感染的发生率相关25,36,37。此外，目前针对抑制免疫功能的方法未解决apoB-脂蛋白聚集和滞留以及胆固醇结晶体、异常胆固醇富集膜、变性apoB和其他有害脂蛋白来源物质的形成的根本原因。相反，本发明是疾病特异性的，即针对动脉粥样硬化斑块的初始、进展和不稳定中发生的过程。结果，本发明在解决剩余风险或未认知的心血管风险的临床问题方面表现出重大的进步。附图说明
[0020] 图1是显示以纳米计LDL颗粒的平均聚集尺寸(纵轴)与纯化的LDL制品和SM酶一起孵育并允许聚集的小时数(横轴)的关系的图。(预期几乎所有的鞘磷脂的酶消化在早期发生；结果是apoB构造的改变，导致在接下来的18-24小时期间逐渐聚集-参见参考文献(9)和(10)。)
[0021] 图2显示了从图1的第0至5小时的数据，使用了放大的横轴和纵轴刻度。
[0022] 图3显示了通过挤出制备的典型POPC LEV制品的平均直径和窄尺寸分布，通过动态光散射测定。横轴显示了以纳米(nm)计颗粒的直径。计数速率为每秒235200次计数(kcps)。“Z-平均直径尺寸”为110.8nm。多分散性指数(“PDI”)为0.041，并且PDI宽度为22.38nm。峰区域的平均直径为116.9nm。
发明内容
[0024] 本发明是将LEV施用至人体(或其他动物)以降低LDL和相关脂蛋白对形成聚集体的敏感度。这些脂蛋白的聚集体是胆固醇和其他有害物质的动脉内积累并从而形成动脉粥样硬化斑块的主要贡献因素，动脉粥样硬化斑块导致心脏病发作、中风、外周血管疾病和其他形式的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)。
[0025] 在前述变型中，施用LEV以抑制未酯化胆固醇的结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集、apoB的变性、源自在鞘磷脂酶的存在下聚集的apoB-脂蛋白的其他有害物质的发展、炎性小体活化(特别是NLRP3炎性小体)、促致动脉粥样硬化性T细胞的激活、有害细胞因子(诸如IL 1β和IL6)的释放、斑块进展和不稳定、以及C反应蛋白(“CRP”)的释放。这些作用在没有免疫抑制下得以实现。
具体实施方式
[0026] 术语
[0027] 人在本文被认为是一种“动物”。
[0028] “apoB”指载脂蛋白B，包括全长形式(apoB100)和截短形式(apoB48)两者的一个术语。
[0029] “LDL”和“LDL颗粒”两者均指低密度脂蛋白颗粒。
[0030] “SM酶”指鞘磷脂酶。如本文使用的，其是所有鞘磷脂酶的总体简称。动脉壁中参与动脉粥样硬化性斑块发展的主要鞘磷脂酶是分泌型SM酶(“S-SM酶”)。
[0031] “VLDL”指极低密度脂蛋白颗粒。
[0032] “IDL”指中间密度脂蛋白颗粒。
[0033] “Lp(a)”指脂蛋白(a)，包含载脂蛋白(a)的一种LDL形式。
[0034] “C-TRL”总体地指富含胆固醇和甘油三酯的含apoB的脂蛋白，包括特别是富含胆固醇和甘油三酯的含apoB的残粒脂蛋白的一组脂蛋白。
[0035] “TRL”指富含甘油三酯的脂蛋白，包括富含甘油三酯的含apoB的残粒脂蛋白的一组脂蛋白。
[0036] “β-VLDL”(即，β-VLDL)特别地指在III型异常脂蛋白血症和apoE敲除小鼠中观察到的富含胆固醇的残粒脂蛋白颗粒类型。
[0037] “sVLDL”、“小VLDL”和“sVLDL颗粒”指小的极低密度脂蛋白颗粒。
[0038] “LEV”代表“大的空囊泡”。LEV也被称为“LUV”，其代表大的单层囊泡。术语“LUV”和“LEV”可互换使用。
[0039] “POPC”代表棕榈酰油酰磷脂酰胆碱又称为1-棕榈酰,2-油烯基磷脂酰胆碱、又称为棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱。
[0040] 术语“囊泡”和“脂质体”在本文中可互换使用。
[0041] 如本文使用的术语“致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒”指致动脉粥样硬化性载脂蛋白颗粒，包括载脂蛋白B。
[0042] 如本文使用的“富含TG的apoB-脂蛋白”指致动脉粥样硬化性富含TG的apoB-脂蛋白。
[0043] 本发明的方面
[0044] 在总体方面，本发明是降低包含SM酶和致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒的动物中所述致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由鞘磷脂酶(SM酶)引起的聚集的敏感度的方法(“本发明的方法”)，所述方法包括向所述动物施用囊泡(或脂质体)以引起所述敏感度的降低，条件是所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇，并且其中人被认为是一种动物，并且其中所述动物包含封闭的循环系统，所述封闭的循环系统包括动脉。
[0045] 与鞘磷脂有关的“不包含显著量”平均而言将意指囊泡或脂质体包含使得LEV中的鞘磷脂:磷脂(SM:PL)摩尔比在0.07以下的鞘磷脂水平。优选地，SM:PL摩尔比不超过0.033，更优选不超过0.0165，甚至更优选不超过0.0033，并且最优选不超过0.00165。
[0046] 与未酯化胆固醇有关的“不包含显著量”平均而言将意指囊泡或脂质体包含使得LEV中的未酯化胆固醇:磷脂(UC:PL)摩尔比在0.1以下的未酯化胆固醇水平。优选地，UC:PL摩尔比不超过0.05，更优选不超过0.01，甚至更优选不超过0.003，并且最优选不超过0.001。
[0047] 在本发明的方法的前述方面的一个子方面，所述方法不应用于患有血脂异常的人。感兴趣的会是患有ASVCD的人，其正接受用他汀、依折麦布(ezetimibe)和/或PCSK9抑制剂治疗并且已经获得了针对血浆中的LDL或apoB浓度的治疗靶点。这种人可以不再患有血脂异常，但仍具有动脉粥样硬化性斑块并且可能仍然具有剩余的心血管风险。因此，特别感兴趣的是有高ASCVD事件风险(已被认知的或尚未被认知的)但当时不再患有血脂异常(归因于成功的LDL降低疗法)的个体。
[0048] 在一个特别感兴趣的方面，本发明的方法应用于人。
[0049] 在另一感兴趣的方面，本发明的方法应用于有(中等、高的、或很高的)动脉粥样硬化性心血管风险的人。这类人可以通过存在选自由以下组成的组的一个或多个特征来鉴定：已知存在动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD；例如如通过ASCVD风险计算器表明的)、LDL的高血浆浓度、apoB的高血浆浓度、apoB-脂蛋白的高血浆浓度、高血压、高血压史、吸烟、吸烟史、糖尿病、代谢综合征、代谢综合征的成分、动脉粥样硬化代谢综合征(atherometabolic syndrome)、C反应蛋白的高血浆浓度、高的冠状动脉钙化积分、异常的颈动脉超声、指示易损斑块的成像方法、显示动脉壁中的巨噬细胞激活的成像方法、显示动脉壁中的蛋白酶活性的成像方法、显示LDL或其他apoB-脂蛋白对聚集的高敏感度和/或动脉滞留的测定。这类人可以通过使其倾向于加速ASCVD的罕见疾病或常见疾病的存在来鉴定。
[0050] 在前述另一感兴趣的方面的一个子方面，所述方法不应用于患有血脂异常的人。
[0051] 前面提到的使人易罹患ASCVD的“罕见疾病或常见疾病”可以选自由以下组成的组：家族性高胆固醇血症、杂合家族性高胆固醇血症、纯合家族性高胆固醇血症、“多基因”家族性高胆固醇血症、IIa型高脂血症、IIb型高脂血症、III型高脂血症、IV型高脂血症、由导致高胆固醇血症的隐性、共显性或显性突变导致的疾病、混合型高脂血症、家族性混合型高脂血症(FCHL)、具有高的Lp(a)血浆浓度的病症以及具有高的apoB血浆浓度的病症。还构思了与暴露于SM酶后血浆LDL和/或其他apoB-脂蛋白对聚集增加的敏感度相关的病症。
[0052] 这些罕见疾病和常见疾病的子集是家族性高胆固醇血症、杂合家族性高胆固醇血症、纯合家族性高胆固醇血症、“多基因”家族性高胆固醇血症、IIa型高脂血症、IIb型高脂血症、III型高脂血症、IV型高脂血症、由导致高胆固醇血症的隐性、共显性或显性突变导致的疾病、混合型高脂血症和家族性混合型高脂血症(FCHL)。
[0053] 此类罕见疾病和常见疾病的另一个子集是使人倾向于加速ACSVD疾病的那些疾病，诸如与高的(“高于正常的”)apoB血浆浓度相关的病症。被认为高于期望或建议的apoB血浆浓度取决于心血管风险；本领域众所周知的是，<80mg/dL和<100mg/dL的apoB水平可以分别是有很高的CV风险和高CV风险的个体的合理目标(11的第2352页)。对于本专利申请的目的，100mg/dL或更高的apoB水平被认为高于正常。
[0054] 此类罕见疾病和常见疾病的另一个子集是使人倾向于加速ACSVD疾病的那些疾病，诸如与暴露于SM酶后血浆LDL和/或其他apoB-脂蛋白对聚集高于正常的敏感度相关的病症。
[0055] ACSVD风险评估是本领域熟知的，并且最近已被汇总于文献(11)。
[0056] 优选地，胃肠外施用囊泡。优选地，所述囊泡是LEV。优选地，囊泡包含一种或更多种磷脂，条件是囊泡不包含显著量的鞘磷脂。
[0057] 在本发明的方法的特定实施方案中，所述囊泡包含选自由以下组成的组的磷脂：磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油和POPC。
[0058] 在本发明的方法的特定实施方案中，对聚集的敏感度由SM酶引起的致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒包括载脂蛋白B。那些颗粒优选选自由以下组成的组：LDL、残粒脂蛋白、富含胆固醇和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(一起称为C-TRL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、小VLDL(sVLDL)、富含胆固醇的残粒脂蛋白、β-VLDL、VLDL残粒、乳糜微粒残粒、餐后残粒、中间密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白(a)[Lp(a)]和富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)。要理解，载脂蛋白B(apoB)指全长apopB100(在人体内大部分由肝脏分泌)，以及截短的apoB48(在人体内大部分由肠分泌)。
[0059] LDL是特别感兴趣的颗粒。要理解，这些脂蛋白可与其同类型的脂蛋白聚集和/或与其他的apoB-脂蛋白聚集，例如，LDL可以与LDL聚集，LDL颗粒还可以与C-TRL一起形成混合聚集体等。同样地，C-TRL可以彼此聚集。
[0060] 优选地，在本发明的方法中，每kg人体重施用的总囊泡剂量在10mg/kg至1600mg/kg的范围内(优选在100mg/kg至1600mg/kg的范围内、最优选在300mg/kg至1000mg/kg的范围内)，所述总剂量作为单个剂量施用或分成多个剂量施用，其中所述分开的多个剂量在至多短的时间段内(诸如24小时)施用；并且其中所述总的囊泡剂量施用至少一次。
[0061] 在本发明的方法和系统的一些特定实施方案中，致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉的滞留利用一种评估系统来确定，所述评估能够测量这种敏感度和/或滞留。此类评估系统在以下“用于测量致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉的滞留的评估系统”部分详细描述。
[0062] 在一个相关方面，本发明是测量在人或其他动物中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由鞘磷脂酶(SM酶)引起的聚集的敏感度的方法，所述方法包括步骤(1)从已对其施用囊泡或脂质体的人或其他动物获得血浆样品；和(2)使该样品经历针对其致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由SM酶引起的聚集的敏感度的测试；其中所述囊泡或脂质体不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇。
[0063] 在所述测量在人或其他动物中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由鞘磷脂酶(SM酶)引起的聚集的敏感度的方法中，步骤(1)和开始步骤(2)之间的时间优选不超过7天，更优选不超过3天、最优选不超过1天。在步骤(1)和开始步骤(2)之间的间隔内，血浆样品优选贮存在不超过环境温度下，例如约25摄氏度(℃)。
[0064] 在本发明的方法的一个特定方面，所述方法延伸至包括以下步骤：基于利用在人或其他动物中的评估获得的结果改变囊泡(例如LEV)剂量，以使得如果剂量(参考剂量)导致选自由较少的聚集、指示较小的聚集敏感度的致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒组成的改变、动脉壁中较少的滞留、动脉中对聚集的LDL或其他apoB-脂蛋白的不良反应的评估(诸如巨噬细胞积累、激活或M1极化，和/或蛋白酶、蛋白酶活性、组织因子或致动脉粥样硬化性细胞因子的表达)组成的组的结果，则下一个LEV剂量与参考剂量相比减少和/或参考剂量和下一个剂量之间的时间间隔与参考剂量和之前的剂量之间的时间间隔相比增长。当然，如果参考剂量是第一个剂量，则这样的时间间隔调整将不可能。
[0065] 关于基于来自评估系统的结果的囊泡剂量的这种改变，剂量是如上讨论的-在至多短的时间段内施用的单个剂量或多个剂量。LEV剂量无法导致足够的较少的聚集、较小的聚集敏感度、较少的滞留和/或动脉中对聚集的LDL或其他apoB-脂蛋白的不良反应的评估(诸如巨噬细胞积累、激活或M1极化，和/或蛋白酶、蛋白酶活性、组织因子或致动脉粥样硬化性细胞因子的表达)，表明应考虑增加剂量(更高的量和/或更频繁施用)。此外，对于与血浆LDL和/或其他apoB-脂蛋白对聚集增加的敏感度相关的病症和/或当这些评估指示致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度增加和/或其被一种或多种动脉的滞留增加时，开始LEV治疗是高度期望的。
[0066] 与前述相一致的，本发明的一个方面是改变人或其他动物中的囊泡剂量的方法，所述方法包括以下步骤：
[0067] 1)将一个剂量(“参考剂量”)的囊泡或脂质体施用至人或其他动物，以改变所述人或其他动物内致动脉粥样硬化性颗粒对SM酶引起的聚集的敏感度；
[0068] 2)基于利用评估系统获得的结果评估所述人或其他动物中的结果，所述结果选自由以下组成的组：较少的聚集、指示较小的聚集敏感度的致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒组成的改变、动脉壁中较少的滞留、动脉中对聚集的LDL或其他apoB-脂蛋白的不良反应的评估(诸如巨噬细胞积累、激活或M1极化，和/或蛋白酶、蛋白酶活性、组织因子或致动脉粥样硬化性细胞因子的表达)；以及
[0069] 3)如果参考剂量导致所述敏感度的降低，则施用下一个囊泡或脂质体剂量，以使得所述下一个剂量小于参考剂量和/或所述参考剂量和所述下一个剂量之间的时间间隔少于参考剂量和所述参考剂量之前的剂量之间的时间间隔。在前述方法的一个子集中，所述方法不应用于患有血脂异常的人。
[0070] 在本发明的方法的其他方面，脂质体或囊泡与另一种药物一起施用。此类可能的药物在以下讨论。
[0071] 在另一个方面，本发明的方法用于影响人或其他动物的LDL(或其他apoB-脂蛋白)的组成方面的至少一种改变，所述改变选自由以下组成的组：鞘磷脂与磷脂酰胆碱的摩尔比(SM:PC)降低、为POPC的PC的摩尔分数的升高、未酯化胆固醇与磷脂酰胆碱的比率(UC:PC)的降低、溶血性PC:PC比率的降低、PC:蛋白的比率的升高、POPC:蛋白的比率的升高、PC与apoB的比率的升高、POPC与apoB的比率的升高、PC与胆固醇酯的比率(PC:ChE)的升高、POPC:ChE的比率的升高、PC与甘油三酯的比率(PC:TG)的升高、POPC:TG的比率的升高、UC:
蛋白比率的降低、以及指示LDL(或其他apoB-脂蛋白)在PC和/或POPC的富集和/或在SM、溶血性PC、UC和apoC-III的消耗的任何其他测量。
蛋白比率的降低、以及指示LDL(或其他apoB-脂蛋白)在PC和/或POPC的富集和/或在SM、溶血性PC、UC和apoC-III的消耗的任何其他测量。
[0072] 在影响LDL(或其他apoB-脂蛋白)的组成方面的至少一种改变的一个相关特定方面，在该方法中使用的囊泡或脂质体包括与在LDL或其他apoB-脂蛋白中摩尔分数将升高的磷脂相同的磷脂。
[0073] 在另一个总体方面，本发明是试剂盒(“本发明的试剂盒”)。所述试剂盒用于降低人体(或其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度，所述试剂盒包括：
[0074] (1)囊泡；和
[0076] 其中囊泡不包含显著量的鞘磷脂。
[0077] 所述试剂盒意图降低致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对由SM酶引起的聚集的敏感度，并且可以在印刷声明中具体说明。
[0078] 在本发明的试剂盒的特定方面，囊泡是LEV。优选地，囊泡包含一种或多种磷脂，条件是囊泡不包含显著量的鞘磷脂或未酯化胆固醇。在特定方面，囊泡包含选自由以下组成的组的磷脂：磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、POPC、其组合及其衍生物。POPC是高度优选的磷脂。
[0079] 在本发明的试剂盒的特定方面，所述试剂盒意图降低以下致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒的SM酶引起的聚集：LDL、残粒脂蛋白、富含胆固醇和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(一起称为C-TRL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、小VLDL(sVLDL)、富含胆固醇的残粒脂蛋白、β-VLDL、VLDL残粒、乳糜微粒残粒、餐后残粒、中间密度脂蛋白(IDL)、脂蛋白(a)[Lp(a)]和富含甘油三酯的残粒脂蛋白(TRL)。
[0080] 在本文的上下文中，前缀“apo-”指脂蛋白的蛋白组分，例如在脂蛋白的脂质被移除后，载脂蛋白可以被分离。
[0081] 印刷声明可以在一张纸上、标签上或包装上。假如试剂盒包括印刷声明，在该印刷声明处使用者可以找到(例如去网站上查找到)试剂盒可以用于降低人体(或具有封闭循环系统的其他动物)中致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度，则满足本发明的试剂盒的印刷声明的要求。
[0082] 在特定方面，本发明的试剂盒与用于测量致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒的聚集和/或其在人或其他动物的一种或多种动脉或动脉段中的滞留的程度的评估系统组合。此类评估系统在以上关于本发明的方法，特别是在关于可以用于确定LEV剂量是否应改变的系统中被讨论。
[0083] 当试剂盒包括评估系统时，其可以被称为本发明的系统。
[0084] 在一个另外的方面，本发明是如下方法：其中施用囊泡(或脂质体)以抑制未酯化胆固醇的结晶体的形成、细胞膜的异常胆固醇富集、apoB的变性、源自在鞘磷脂酶的存在下聚集的apoB-脂蛋白的其他有害物质的发展、炎性小体活化(特别是NLRP3炎性小体)、促致动脉粥样硬化性T细胞的激活、有害细胞因子(诸如IL 1β和IL6)的释放、斑块进展和不稳定、以及C反应蛋白(“CRP”)的释放。在一个相关方面，本发明是监测这些方法的效用的方法。这些作用在无有害免疫抑制或其他有害免疫紊乱下得以实现。
[0085] 前面提及的监测效用的方法包括但不限于以下测定：动脉壁内apoB-脂蛋白积累、动脉壁内apoB-脂蛋白聚集、动脉壁内胆固醇结晶体形成、炎性小体的激活、动脉壁内炎性小体的激活、T细胞活化、动脉壁内的T细胞活化、有害细胞因子(诸如活化IL 1β和IL6)的释放、IL2的释放和标志物CRP的水平。
[0086] 动脉壁内apoB-脂蛋白积累的测定的一个实例是施用加标签的脂蛋白，然后评估动脉壁内其标签的积累。
[0087] 动脉壁内apoB-脂蛋白聚集的测定的一个实例是施用加双重标签的脂蛋白，以使得其聚集淬灭或增强标签。
[0089] 炎性小体激活的测定的一个实例是相关细胞因子和下游产物(诸如IL1β、IL6和CRP)的释放。
[0090] 动脉壁内炎性小体激活的测定的一个实例是炎性小体特异性成像。
[0091] T细胞活化的测定的一个实例是T细胞特异性细胞因子的释放。
[0092] 动脉壁内T细胞活化的测定的一个实例是T细胞特异性成像。
[0093] 有害细胞因子(诸如IL1β、IL6和IL2)的释放的测定的一个实例是血浆或血清或其他体液中它们的浓度的定量测定。
[0094] CRP的水平的测定的一个实例是本领域熟知的，并且从常规临床化学实验室商购可得。
[0095] 用于测量致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉滞留的评估系统
[0096] 如以上提及的，在本发明的方法的一些特定实施方案中，致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉滞留在评估系统中评估。
[0097] 同样如以上提及的，在本发明的系统的一些特定实施方案中，致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒对聚集的敏感度和/或其被动脉滞留在评估系统中评估，所述评估系统构成本发明的系统的一部分。
[0098] 对于对聚集的敏感度的评估，这样的评估系统是体外测定和/或用于体内评估那些颗粒的系统，和/或通过感兴趣的人或其他动物中的聚集指示物的水平的测定。
[0099] 用于评估对聚集的敏感度的体外(或离体)测定优选选自由以下组成的组：(1)测量已经从血浆分离然后与SM酶一起离体孵育的LDL的聚集的程度或速率(又称为所述LDL对由SM酶引起的聚集的敏感度)，(2)从血浆分离然后与SM酶一起离体孵育的apoB-脂蛋白的聚集，(3)从血浆分离然后与动脉壁酶一起孵育的LDL或另一种apoB-脂蛋白的聚集，(4)仍在分离自人或其他动物的血浆中的含apoB的脂蛋白的聚集或与其他血浆组分的聚集，(5)在加入了酶(诸如动脉壁酶)的血浆组分的存在下，含apoB的脂蛋白的聚集，(6)apoB-脂蛋白通过物理手段(诸如涡旋)的聚集，(7)apoB-脂蛋白通过氧化反应(诸如脂质过氧化反应)的聚集，(8)在脂酶和/或蛋白酶的存在下apoB-脂蛋白的聚集，(9)LDL或其他致动脉粥样硬化性脂蛋白与动脉段离体孵育，以及(10)用于确定apoB-脂蛋白的组成的系统。
[0100] 用于确定apoB-脂蛋白的组成的系统将是能够确定apoB-脂蛋白的组分的相对浓度的任何系统。可以从这样的确定推测出敏感度。
[0101] 在用于评估对聚集的敏感度的体外测定中使用的动脉壁酶优选选自由以下组成的组：SM酶、人SM酶、人重组SM酶、在酸性pH下使用的SM酶、磷脂酶、磷脂酶A2、脂肪酶、胆固醇酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、蛋白酶、基质金属蛋白酶、半胱天冬酶、弗林蛋白酶(furin)、细胞内蛋白酶、钙蛋白酶、蛋白酶体、组织蛋白酶、细胞外蛋白酶、从细胞释放的细胞内水解酶。
[0102] 要理解，LDL聚集性或组成的(或其他致动脉粥样硬化性脂蛋白的)测定可以是自动的，诸如临床自动分析仪、自动质谱法、浊度测定法、ELISA测定和类似ELISA的测定、浊度分析、速率区带离心和/或动态光散射(DLS)。
[0103] 用于体内评估动脉内致动脉粥样硬化性颗粒的滞留的系统优选选自由以下组成的组：动脉壁内apoB-脂蛋白聚集和/或滞留的体内测定、动脉壁内滞留和/或聚集的脂蛋白的成像方法、健康动脉段中脂蛋白聚集和/或滞留的测定、患病动脉段中脂蛋白聚集和/或滞留的测定、成像方法(诸如心导管插入术、血管内超声(IVUS)、MRI、有对比的MRI、CT扫描、有对比的扫描、有对比剂的成像方法，其中所述对比剂包括纳米颗粒，以及核医学研究)、包括将所述apoB-脂蛋白注射到动物内的方法、包括对所述apoB-脂蛋白加标签然后将其注射到动物(所述动物包括人和非人动物)内的方法、以及包括体内评估内源apoB-脂蛋白的方法。还构思了人工纳米颗粒的动脉滞留(例如，参见Cormode DP、Frias JC、Ma Y、Chen W、Skajaa T、Briley-Saebo K、Barazza A、Williams KJ、Mulder WJ、Fayad ZA和Fisher EA.HDL as a contrast agent for medical imaging.Clin Lipidol.2009；4:493-500.doi:10.2217/clp.09.38)。
[0104] LEV的化学组成
[0105] 允许脂质体结构或胶束(micellar)结构的任何两亲性物质可以用于制备LEV。磷脂是优选物质。但是，要避免在LEV中包括显著量(如上定义的)的鞘磷脂或未酯化胆固醇，并且这一事实应理解为本文中LEV结构和组成的所有讨论中的提醒。
[0106] 用于形成LEV的优选磷脂是磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰甘油、卵磷脂、P,y-二棕榈酰-a-卵磷脂、磷酯酰丝氨酸、磷脂酸、N(2,3二(9-(Z)-十八碳烯基氧基))-丙-1-基-N,N,N-三甲基氯化铵(N(2,3di(9-(Z)-octadecenyloxy))-prop-1-yl-N,N,N-trimethylammonium chloride)、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、脑磷脂、心磷脂、脑苷脂、磷酸二鲸蜡脂、二油酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、硬脂酰基-棕榈酰磷脂酰胆碱、二-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、二-硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二-肉豆蔻酰-磷脂酰丝氨酸、二-油酰基-磷脂酰胆碱(di-oleyl-phosphatidylcholine)、其组合及其衍生物。本领域人员将知晓可以通过使用与此处详细说明的那些化合物相似的两亲性化合物来扩展该清单。
[0107] 在前述优选的磷脂中，用于形成LEV的高度优选的磷脂是磷脂酰胆碱(特别是蛋磷脂酰胆碱)、磷脂酰甘油(特别是蛋磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、POPC、其组合及其衍生物。
[0108] 特别高度优选的磷脂是POPC，并且因此包含POPC的LEV是特别高度优选的。
[0109] 可以看出，包括磷脂酰胆碱作为其化学组成的一部分的磷脂分子是优选的一组分子。
[0110] 在制备LEV时，POPC或其他磷脂LEV组分可以用少量的其他脂质或分子补充，诸如鞘氨醇-1-磷酸酯(S1P)和/或特定类型的溶血性PC，它们干扰LDL和相关脂蛋白的SM引起的聚集。
[0111] 脂质体还可以与多种蛋白和多肽结合以增加内源LDL的重构。使载脂蛋白(脱辅基蛋白)与脂质体结合是特别有用的。如本文使用的，“结合至脂质体(bound to liposomes)”或“结合至脂质体(binding to liposomes)”表示目标化合物共价或非共价结合至脂质体的表面或完全或部分地包含于脂质体的内部。脱辅基蛋白A-I(apoA-I)、脱辅基蛋白A-II(apoA-II)和脱辅基蛋白E(apoE)通常是与脂质体结合的最有用的脱辅基蛋白。这些小的两亲性可替换脱辅基蛋白抑制LDL和相关的致动脉粥样硬化性含apoB脂蛋白的聚集。apoA-I模拟肽(诸如4F肽)可类似使用。在本发明中，其他的两亲性肽可类似使用。
[0112] 本发明的方法、试剂盒或系统中使用的脂质体可以单独的或以任何组合和摩尔比率与以下分子结合：脱辅基蛋白A-I、脱辅基蛋白A-II、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶和/或小的两亲性肽(诸如载脂蛋白A-I模拟肽、4F肽和/或模拟来自蛋白或脱辅基蛋白(诸如apoA-I、apoE、apoC、apoJ、apoM、和apoB)的两亲性序列的肽)。另外的蛋白或其他非蛋白分子也可以用于结合脂质体以增强脂质体稳定性、半衰期和其他特性，以及重构LDL和相关apoB-脂蛋白。这些另外的蛋白或其他非蛋白分子包括但不限于聚乙二醇、烷基硫酸酯、溴化铵和白蛋白。(术语“不限于”意指在列举的那些之外存在其他的此类蛋白或其他的非蛋白分子。)[0113] 不含磷脂质也可以用于本发明的组合物的脂质体。这些脂质包括但不限于硬脂胺、十二烷基胺、乙酰基棕榈酸酯和脂肪酸酰胺。适合用于本发明的LEV的另外的脂质是本领域技术人员熟知的，并且在很多熟知的资料中引用(参见例如参考文献12)。
[0114] 为了无菌和稳定的目的，LEV制品可以用与待静脉内(iv)施用的其他药物制品一起使用的化合物补充。
[0115] 但是，合成的非变应性磷脂优选于天然存在的磷脂。例如，合成的POPC优选于蛋PC。
[0116] 之前使用的LEV的实例
[0117] 由磷脂酰胆碱制备的LEV已经成功用于之前的与将胆固醇从外周组织转运至肝脏有关的实验。(参见参考文献(8)中的讨论)。其生产已经被描述于Rodrigueza等(8)，其中它们被称为LUV。其中，具有直径为约100nm(“纳米”)的小孔的挤出膜产生约123+/-35nm的LUV。这将它们与具有34+/-30nm的直径的小的单层囊泡“SUV”区分开。
[0118] 参考文献8中提及的磷脂酰胆碱分离自蛋，而合成的磷脂酰胆碱如果它们在体温为液体(或液晶)状态(即不为凝胶或固体状态)(可能它们在脂肪酰侧链中具有至少一个双键)还抵抗氧化(不具有很多双键)也可使用。一个实例是POPC。由POPC构建的LEV被用于以下实施例。
[0119] LEV的物理化学特性
[0120] 通常，期望LEV由在37℃、往往在35℃、以及甚至在32℃为液体(或液晶)的脂质组成。液体-结晶状态的脂质体通常接受和提供伴随LDL和相关apoB-脂蛋白的组分分子，比凝胶(或固体)状态的脂质体更高效。因为患者通常具有约37℃的核心温度，由在37℃为液体-结晶的脂质组成的脂质体在治疗期间通常为液晶状态，并从而优化LDL和其他有害apoB-脂蛋白的重构。
[0121] LEV的尺寸
[0122] 优选囊泡是LEV。优选LEV的平均直径是至少50nm、更优选至少100nm。优选LEV的平均直径不超过1000nm(1.0mm)、更优选不超过250nm、最优选不超过150nm。单层囊泡优选于复层囊泡，以利于将脂质体组分暴露于LDL和相关apoB脂蛋白，以使这些颗粒的重构最大化。
[0123] 高度优选的尺寸是不会改变肝脏代谢而升高总血浆LDL浓度的尺寸(8)。
[0124] 脂质体囊泡的尺寸可以通过动态光散射(DLS)、准弹性光散射(QELS)(13)、尺寸排阻色谱分析、电子显微术和本领域熟知的其他方法来确定。平均LEV直径，如果期望，可以通过超声处理形成的LEV和/或通过较小孔尺寸的膜排阻和/或高剪切技术减小。这些方法的间歇应用可以与DLS、QELS或其他评估方法交替，以优化LEV形成。存在评价磷脂分散体的脂双层的方法，诸如31P-核磁共振(NMR)以监测磷脂的磷信号，在将不可渗透顺磁性试剂或展宽试剂(其将以与暴露于外部介质的脂质的分数成比例的量降低初始31P-NMR信号的强度)加入到外部介质之前与之后进行对比，对于大的单层脂质体诸如LEV，其应基本上为50％。(14)
[0125] 药物载体
[0126] 本发明的LEV组合物还包含药学上可接受的载体。在本发明的组合物中可以采用很多药学上可接受的载体。通常，将采用标准盐水作为药学上可接受的载体，通常是缓冲的盐水，诸如磷酸盐缓冲盐水。其他合适的载体包括例如包含糖蛋白用于增强稳定性(诸如白蛋白、载脂蛋白、球蛋白等)的0.4％盐水、半标准盐水、0.3％甘氨酸等。这些组合物可以通过常规熟知的灭菌技术无菌化。得到的水溶液可以包装用于使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干的制品在施用之前与无菌水溶液组合。组合物可以按需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节和缓冲剂、紧张性调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。
[0127] 脂质体在载体中的浓度可以变化。通常，浓度将是约20-500mg脂质体脂质/ml载体，通常约50-200mg/ml、并且最通常约100-200mg/ml。技术人员可以改变这些浓度以优化用不同脂质体组分的治疗或优化特定患者的治疗。例如，可以增加浓度以降低与治疗有关的流体荷载。在患有动脉粥样硬化相关充血性心力衰竭或严重高血压的患者中，这可能是特别期望的。或者，可以稀释由刺激性脂质组成的脂质体以降低浓度，以减少施用部位的炎症。
[0128] LEV的施用
[0129] 通常，为了方便，脂质体将经由外周静脉施用。有时，LEV将被施用至大的中心静脉，诸如上腔静脉或下腔静脉，以允许高度浓缩的溶液施用至大体积和流动的血管。另外，LEV还可以经由多种其他途径施用，所述其他途径允许它们接近血浆含apoB的脂蛋白或接近动脉内含apoB的脂蛋白。在该意义上，“接近”可以意指直接接近或间接接近。
[0130] LEV施用的模式优选选自由以下组成的组：胃肠外施用、静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、经皮施用、腹膜内施用、鞘内施用、经由淋巴管、血管内施用(包括施用至毛细血管、动静脉短路、以及血管支架用于长持续时间释放)、直肠施用、经由长期留置导管施用、以及经由即时放置导管施用。
[0131] 施用的频率和每次施用的剂量将被选择以使用所需的最小剂量来实现对患者最大的有益作用而无显著副作用。通过使用用于测量致动脉粥样硬化性脂蛋白颗粒聚集的程度和/或其对聚集的敏感度和/或其在人或其他动物的动脉中的滞留的评估系统，将有助于这种选择。此类评估系统在以上关于本发明的方法，特别是在关于可以用于确定LEV剂量是否应改变的系统中被讨论。
[0132] 剂量和给药时间表在以上被讨论。但是，要注意的是，如果LEV静脉内施用，往往给予患者多次治疗，例如每周一次或每周两次。如果治疗持续约4至16周(4到32次治疗)或更久，这将并不意外。要理解，LEV的剂量、施用的频率和每次治疗过程的长度可以基于临床或生物反应调整。
[0133] LEV与其他药物的共施用
[0134] 将LEV与其他药物共施用会有益处。例如，使用LEV来重构LDL以对聚集更不敏感可以有利地与他汀(其将降低LDL的总体血浆浓度)组合。
[0135] 可以与LEV组合的示例性试剂可以选自由以下组成的组：胆固醇合成抑制剂、他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、贝特(fibrate)、SGLT2抑制剂、GLP1激动剂、DPP4抑制剂、二甲双胍、减重药物、CETP抑制剂、PCSK9抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、依泽替米贝、低剂量阿司匹林、乙酰-CoA羧化酶(ACC)抑制剂、ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)抑制剂、降低LDL的药物、降低甘油三酯的药物、gemcabene、硫酸酯酶-2的抑制剂、硫酸酯酶-2产生和分泌的抑制剂、bempedoic acid、微粒体甘油三酯转移蛋白的抑制剂、针对APOB mRNA的反义寡核苷酸、apoB脂蛋白的分泌的抑制剂、鱼油、鱼油脂肪酸、鱼油脂肪酸酯和胆汁酸结合剂。
[0136] 所述其他药物可以通过其常用途径施用(例如他汀通过口服给予)或者可以将它们并入LEV。
[0137] 实施例
[0138] 实施例1
[0139] 来自LEV处理的高胆固醇血小鼠的LDL颗粒对SM酶介导的聚集的敏感度远不及来自PBS处理的高胆固醇血小鼠的LDL颗粒
[0140] 设计该实施例以在体外(测试管)测试中显示，来自LEV处理的小鼠的LDL对SM酶介导的聚集的耐受比来自对照(盐水处理的)小鼠的LDL大得多。根据现有文献(9、10、16)进行LDL对聚集的敏感度的测试。该实施例是重要的，因为预期SM酶介导的LDL聚集对于与心血管疾病有关的动脉粥样硬化性斑块是重要促成因素。
[0141] LEV的生产
[0142] 在本实施例中用于从POPC制备LEV的程序如下：在无菌的生物柜中，在净化的气氛下(例如HEPA-过滤的空气)进行程序，所有的表面和设备经清洁并无菌化。通过涡旋将来自Avanti Polar Lipids,Inc.的合成的、纯的、干燥的、颗粒状POPC分散在无菌的医院级磷酸盐缓冲盐水中(但是，很多不同的水性缓冲液可以用于制备脂质体)，以制备浓度为200mg POPC/ml的MLV。
[0143] 为了产生LEV，在中等压力(250至300psi)下通过已经安装进装有10-mL水夹套的热屏障挤出机(Lipex Biomembranes)的两个叠加的聚碳酸酯滤器(100nm孔径)将MLV挤出10次。然后通过穿过0.45-μm孔径滤器而使LEV滤器无菌化，并通过内毒素测试验证等份无内毒素、基本上无内毒素或低内毒素(例如<0.50EU/ml)。通过这些研究中使用的典型POPC LEV制品的动态光散射(准弹性光散射)，图3显示了尺寸分布，其中LEV的平均直径为
116.9nm，并且其尺寸分布紧密集中在该平均值附近。
116.9nm，并且其尺寸分布紧密集中在该平均值附近。
[0144] 用LEV注射剂(或对照盐水缓冲液)处理高胆固醇血小鼠，从这些小鼠分离LDL，然后评估这些LDL样品当与鞘磷脂酶一起孵育时对聚集的敏感度
[0145] 将16只高胆固醇血的人apoB100(huApoB100)转基因小鼠随机分成2组，每组8只小鼠。一组中的小鼠用LEV以1000mg POPC/kg体重的剂量注射，而另一组中的小鼠用无LEV的等体积PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液注射。1小时以后从每只小鼠取血浆。将这16个血浆样品中的每一个升高至1.063g/ml的密度，然后超离心(使VLDL、LDL和LEV(存在时)上浮的过程)。通过Superose 6柱使上清液经历尺寸排阻层析，以将大的VLDL和LEV与较小的LDL分开。为了确保LDL的纯度，一些LDL样品第二次经过尺寸排阻柱。使16个纯化的LDL样品的每一个达到标准浓度，然后与SM酶一起孵育显示的时间(图1和2中的横坐标)。
[0146] 更具体地，在微量滴定板的孔中在pH5.5在37℃将LDL颗粒(100μl，1mg/ml)与人重组鞘磷脂酶(hrSM酶)一起孵育。(对于LDL与hrSM酶一起孵育的实例，参见Sneck M、Nguyen SD等(10)。)聚集的LDL颗粒的平均直径通过在孵育期间在不同时间点的动态光散射(DLS)来确定(10)。获得的结果汇总于图1和2。
[0147] 每个时间点的每个LDL样品的聚集被定量为通过动态光散射确定的聚集体的平均尺寸(图1和2的纵坐标)。图1和2中还显示了SEM(“平均值的标准误差”)，由误差线表示(n＝每组8只小鼠，从而每组8个LDL样品)。图1中不存在误差线表明小于绘制符号的误差。利用学生双尾非配对t检验在每个时间点比较两组之间的值。单星号表示P<0.02，双星号表示P<0.001，意指在该时间点在来自注射LEV的小鼠的LDL聚集体的平均直径与来自注射PBS的小鼠的LDL聚集体的平均直径之间存在统计学显著差异。在t＝0处，来自两组的LDL的平均直径在统计学上不可区分(P>0.4，即不显著(“ns”))。
[0148] 结论
[0149] 前述实验的结果表明，来自LEV处理的高胆固醇血小鼠的LDL比来自对照(盐水处理的)高胆固醇血小鼠的LDL对SM酶引起的聚集相当地更不敏感。因此，体内注射LEV快速地改变LDL，变得对聚集更不敏感。
[0150] 实施例2
[0151] LEV处理对LDL组成的影响
[0153] 结果显示于图4。在图4中，星号表示在用注射LEV的小鼠和注射PBS的小鼠获得的结果之间存在统计学显著差异。用单次注射LEV处理小鼠导致在小鼠的LDL中鞘磷脂与磷脂酰胆碱的摩尔比(SM:PC)减小。
[0154] 与来自注射PBS的小鼠(对照)的LDL相比，在来自注射LEV的小鼠的LDL样品中，在整体的PC:蛋白比率方面存在统计学显著增加，并且在UC:PC比率、UC:蛋白比率和整体的溶血性PC:PC比率方面存在统计学显著降低。另外，LDL中的PC类型向实质性地更多的POPC移动。
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2017-08-28&eun＝g491951d0r.
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