一种含有RSPO1的靶向给药系统及其制备与应用
阅读：670发布：2021-02-14
专利汇可以提供一种含有RSPO1的靶向给药系统及其制备与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于药物制剂领域，具体涉及一种含有RSPO1的靶向 给药 系统及其制备与应用。所述靶向给药系统含有：RSPO1偶联载体分子、药物以及药物载体粒子，RSPO1在药物载体粒子表面。所述靶向给药系统，在降低药物毒 副作用 的 基础 上能够显著提高药物的靶向性以及 肿瘤 治疗 效果。，下面是一种含有RSPO1的靶向给药系统及其制备与应用专利的具体信息内容。
1.一种RSPO1偶联载体分子，其结构式为：RSPO1-载体分子，所述RSPO1与载体分子之间通过共价键连接。
2.根据权利要求1所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述RSPO1与载体分子之间通过硫醚键连接。
3.根据权利要求1所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，载体分子连接在所述RSPO1N端第6位半胱氨酸的巯基上。
4.根据权利要求1所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述RSPO1与载体分子之间的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述RSPO1偶联载体分子的结构式为：RSPO1-linker-R，所述RSPO1与linker之间通过共价键连接，所述linker与R之间通过共价键连接。
6.根据权利要求5所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述RSPO1与linker之间通过硫醚键连接。
7.根据权利要求5所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，linker连接在所述RSPO1N端第6位半胱氨酸的巯基上。
8.根据权利要求5所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述RSPO1、linker、R之间的摩尔比为1：1：1。
9.根据权利要求5所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述R选自脂质、聚合物材料中的任一种。
10.根据权利要求9所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述脂质选自磷脂、脂肪酸、胆固醇中的任一种。
11.根据权利要求10所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、DlinPE、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、十七烷基酰磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺中之任一。
12.根据权利要求10所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述脂肪酸选自C8酸辛酸、C10酸癸酸、C12酸月桂酸、C14酸肉豆蔻酸、C16酸棕榈酸、C18酸硬脂酸之任一。
13.根据权利要求9所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述聚合物材料选自嵌段共聚物材料、交替共聚物材料、无规共聚物、接枝共聚物材料中的任一种。
14.根据权利要求13所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述嵌段共聚物材料选自PLA、PLGA、PLG、Pluronic、PEO、PEI、PPO、PEG中的任一种或它们中两种或两种以上的复合物。
15.根据权利要求5所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述linker选自聚乙二醇、短肽、寡核苷酸中的任一种。
16.根据权利要求15所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量范围是400～8000Da。
17.根据权利要求15所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述短肽选自Gn、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、RGD中的任一种。
18.根据权利要求15所述的RSPO1偶联载体分子，其特征在于，所述寡核苷酸的分子量范围是600-8000Da。
19.如权利要求1～18任一权利要求所述RSPO1偶联载体分子的制备方法，包括以下步骤：将RSPO1和载体分子/linker-R通过共价键偶联反应制备即可。
20.如权利要求1～18任一权利要求所述RSPO1偶联载体分子在制备靶向给药载体或靶向给药系统中的用途。
21.一种靶向给药载体，含有如权利要求1～18任一权利要求所述RSPO1偶联载体分子。
22.根据权利要求21所述的靶向给药载体，其特征在于，所述靶向给药系统含有：RSPO1偶联载体分子以及药物载体粒子。
23.根据权利要求22所述的靶向给药载体，其特征在于，所述药物载体粒子表面有RSPO1。
24.根据权利要求22所述的靶向给药载体，其特征在于，每个所述药物载体粒子表面有
5～10000个RSPO1。
25.根据权利要求22所述的靶向给药载体，其特征在于，所述药物载体粒子的粒径范围是10～1000nm。
26.根据权利要求22所述的靶向给药载体，其特征在于，所述药物载体选自脂质体、脂质纳米粒、聚合物纳米粒中的任意一种。
27.根据权利要求26所述的靶向给药载体，其特征在于，所述脂质体的组成成分选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、精胺-5-羧基氨基乙酸二十八烷基酰胺(DOGS)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙基二甲基丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、MVL5中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
28.根据权利要求26所述的靶向给药载体，其特征在于，所述聚合物纳米粒的组成成分为：PLA、PLGA、PLG、Pluronic、PEO、PEI、PPO、PEG中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
29.如权利要求21～28任一权利要求所述靶向给药载体的构建方法，选自以下任一：方法一、包括下列步骤：
将RSPO1偶联载体分子作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构建药物载体的材料直接混合自组装来制备靶向给药载体；方法二、后插入法，包括以下步骤：
(1)先构建药物载体；
(2)将RSPO1偶联载体分子与已构建好的药物载体混合，即可；
方法三：后连接法，包括以下步骤：
(1)采用载体分子作为药物载体材料之一，构建含有载体分子的药物载体；
(2)将RSPO1与步骤(1)中构建好的含有载体分子的药物载体通过共价键偶联反应，构建所述靶向给药载体。
30.如权利要求21～28任一权利要求所述靶向给药载体在制备靶向给药系统中的用途。
31.一种靶向给药系统，含有如权利要求21～28任一权利要求所述靶向给药载体以及药物分子。
32.根据权利要求29所述的靶向给药系统，其特征在于，所述药物选自抗肿瘤药物；抗代谢药物；细胞毒性药物；抗生素；光敏剂；激酶抑制剂；抗炎药物；免疫抑制剂；抗感染用药物；抗病毒药物。
33.根据权利要求29所述的靶向给药系统，其特征在于，所述药物选自目的基因、反义基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、siRNA、mRNA、或上述基因的组合，或含上述基因的真核表达载体DNA。
34.如权利要求29～31任一权利要求所述靶向给药系统的构建方法，选择以下任一：
方法一、包括下列步骤：
将RSPO1偶联载体分子作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构建药物载体的材料以及药物直接混合自组装来制备靶向给药系统；
方法二、后插入法，包括以下步骤：
(1)先构建携带药物的药物载体；
(2)将RSPO1偶联载体分子与已构建好的携带药物的药物载体混合，即可；
方法三：后连接法，包括以下步骤：
(1)采用载体分子作为药物载体材料之一，构建含有载体分子的携带药物的药物载体；
(2)将RSPO1与步骤(1)中构建好的含有载体分子的携带药物的药物载体通过共价键偶联反应，构建所述靶向给药系统。
35.如权利要求29～31任一权利要求所述靶向给药系统在制备超声造影剂、放射造影剂、核医学造影剂中的用途。
36.一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将如权利要求29～31任一权利要求所述靶向给药系统施用于患者。
一种含有RSPO1的靶向给药系统及其制备与应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种含有RSPO1的靶向给药系统及其制备与应用。
背景技术
[0002] 传统的肿瘤药物治疗(化疗)在杀伤肿瘤细胞的同时会对机体正常细胞也有杀伤，因此产生的毒副作用不仅影响治疗效果甚至会危及患者的生命。因此，近年来人们一直致力于提高化疗对肿瘤细胞的特异性。为了实现这个目的，科学家们尝试了很多方法，其中包括利用药物载体对肿瘤进行靶向给药来实现提高疗效、降低毒副作用的目标。
[0003] 抗肿瘤药物载体的成分多种多样，已涉及蛋白质、脂质、无机材料、高分子材料以及无机和高分子的复合材料。目前研发的纳米载体系统包括聚合物纳米粒、脂质体、树状聚合物、纳米乳、纳米金或其他金属纳米颗粒等。药物载体的靶向作用包括被动靶向和主动靶向。例如，脂质体是一种常用的药物载体，在其表面修饰亲水性的聚乙二醇(PEG)后可制得隐形脂质体，从而显著增加体内的循环时间，并通过EPR效应被动靶向肿瘤组织。隐形阿霉素脂质体是目前应用最广、时间最长的肿瘤靶向脂质体药物。与普通阿霉素相比，隐形阿霉素脂质体具有更长的体内半衰期和更强的药效。但是基于被动靶向发挥作用，药物在细胞间质被释放后通过扩散进入肿瘤细胞，对治疗效果的改善并不明显，而且在临床上产生了新的毒副作用，如肢端红肿症(palmar-plantar erythrodysesthesia,PPE)等。目前使用最多的主动靶向载体是抗体介导的靶向药物载体。已有多个抗体偶联载体进入临床研究阶段，如转铁蛋白抗体片段修饰的载有DNA质粒的脂质体等已进入II期临床。
[0004] Wnt信号转导通路参与多种生物学过程的调控，包括胚胎的生长和形态发育、组织的稳、能量代谢的平衡以及干细胞的维持。Wnt通路的过度激活与多种癌症(包括结肠癌、胃癌、乳腺癌等)的发生紧密联系。Wnt信号通路同时也能促进癌细胞的转移，因此被认为是肿瘤治疗的新靶点。目前针对Wnt通路的肿瘤药物主要是小分子化合物和Wnt/Fzd蛋白抗体。2012年FDA批准Hedgehog信号通路的小分子抑制剂——Vismodegib(Erivedge)上市，用于治疗恶性基底细胞癌。但是药物对Wnt通路的抑制不可避免的造成许多副作用，包括肌肉痉挛、脱发、味觉障碍、体重降低等。
[0005] R-spondin1(RSPO1)是近年来新发现的Wnt通路配体蛋白。RSPO1蛋白通过激活并协同Wnt信号通路参与对细胞增殖和分化的调控。现有技术当中，急需利用Wnt通路靶向配体从而特异性高效靶向Wnt通路过度活跃肿瘤细胞的靶向给药系统。
发明内容
[0006] 为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种可特异性高效靶向Wnt通路过度激活肿瘤细胞的靶向给药系统及其制备与应用。
[0007] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面提供了一种RSPO1偶联载体分子，其结构式为：RSPO1-载体分子，所述RSPO1与载体分子之间通过共价键连接。
[0009] 优选地，所述RSPO1与载体分子之间通过硫醚键连接。
[0010] 进一步优选地，载体分子连接在所述RSPO1N端第6位半胱氨酸的巯基上。
[0011] 进一步优选地，所述RSPO1与载体分子之间的摩尔比为1：1。
[0012] 进一步优选地，所述RSPO1偶联载体分子的结构式为：RSPO1-linker-R，所述RSPO1与linker之间通过共价键连接，所述linker与R之间通过共价键连接。
[0013] 优选地，所述RSPO1与linker之间通过硫醚键连接。
[0014] 优选地，linker连接在所述RSPO1N端第6位半胱氨酸的巯基上。
[0015] 优选地，所述RSPO1、linker、R之间的摩尔比为1：1：1。
[0016] 优选地，所述R选自脂质、聚合物材料中的任一种。
[0018] 进一步优选地，所述磷脂选自所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、DlinPE、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、十七烷基酰磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺中的任意一种。
[0019] 在本发明的优选实施例中，所述磷脂选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺。
[0020] 进一步优选地，所述脂肪酸选自C8酸辛酸、C10酸癸酸、C12酸月桂酸、C14酸肉豆蔻酸、C16酸棕榈酸、C18酸硬脂酸中的任一种。
[0021] 本发明优选实施例中，所述脂肪酸选用C12酸月桂酸。
[0022] 进一步优选地，所述聚合物材料选自嵌段共聚物材料、交替共聚物材料、无规共聚物、接枝共聚物材料中的任一种。
[0023] 优选地，所述嵌段共聚物材料选自PLA、PLGA、PLG、Pluronic、PEO、PEI、PPO、PEG中的任一种或它们中两种或两种以上的复合物。
[0024] 本发明的优选实施例中，R选用PLA。
[0025] 优选地，所述linker选自PEG、短肽、寡核苷酸中的任一种。
[0026] 短肽，短链肽简称，英文名称Short chain polypeptide，由3-9个的氨基酸残基组成的短链肽，有时也叫低聚肽。
[0028] 进一步优选地，所述聚乙二醇的分子量范围是400～8000Da。进一步优选地，所述聚乙二醇的分子量范围是400～5000。进一步优选地，所述聚乙二醇的分子量范围是2000～5000。
[0029] 例如，所述聚乙二醇选自但不限于PEG400、PEG550、PEG750、PEG1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇3400、聚乙二醇4000、聚乙二醇5000中的任意一种。
[0030] 在本发明的优选实施例中，所述聚乙二醇选用PEG2000、聚乙二醇5000。
[0031] 优选地，所述短肽选自Gn、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、RGD中的任一种。本发明的优选实施例中，n＝2～40。
[0032] 优选地，所述寡核苷酸的分子量范围是600-8000Da。
[0033] 本发明的第二方面提供一种制备前述RSPO1偶联载体分子的方法，包括以下步骤：将RSPO1和载体分子/linker-R通过共价键偶联反应制备即可。
[0034] 优选地，所述RSPO1需要进行游离巯基的活化。进一步优选地，可采用还原剂TCEP活化R-Spondin1中的游离巯基。
[0035] 本发明的优选实施例，给出了制备RSPO1-聚乙二醇-磷脂的方法，所述方法具体包括如下步骤：
[0037] (2)将游离巯基已活化的R-Spondin1加入到步骤(1)所得胶束溶液中，在4～25摄氏度，氮气保护条件下反应2～20小时。
[0038] 进一步优选地，步骤(1)中采用的水合液的pH范围在6.5-7.5。
[0039] 进一步优选地，步骤(2)中采用还原剂TCEP活化R-Spondin1中的游离巯基。
[0040] 本发明第三方面，提供前述RSPO1偶联载体分子在制备靶向给药载体或靶向给药系统中的用途。
[0041] 本发明的第四方面，提供了一种靶向给药载体，含有前述RSPO1偶联载体分子。
[0042] 进一步地，所述靶向给药载体，含有RSPO1偶联载体分子以及药物载体粒子。
[0043] 优选地，所述药物载体粒子表面有RSPO1。
[0044] 进一步优选地，RSPO1通过共价连接于所述药物载体粒子的表面。
[0045] 优选地，每个所述药物载体粒子表面有一个以上RSPO1。进一步优选地，每个所述药物载体粒子表面有5～10000个RSPO1。
[0046] 本发明实施例中，每个所述药物载体表面有5～1000个R-Spondin1。
[0047] 优选地，RSPO1偶联载体分子与药物载体粒子的摩尔比例范围是：(0.01～100)：1000。
[0048] 本发明实施例中，R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂与药物载体的摩尔比例范围是：(0.5～100)：1000。
[0049] 优选地，所述药物载体粒子的粒径范围是10～1000nm。
[0050] 优选地，所述药物载体粒子选自但不限于脂质体、纳米粒、聚合物纳米粒、阳离子脂质纳米粒、聚合物胶束、乳剂、微囊、微球、纳米囊、纳米球中的任意一种。
[0051] 进一步地，所述药物载体还可进行其他修饰。
[0052] 优选地，所述脂质体的组成成分选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(DC-Chol)、精胺-5-羧基氨基乙酸二十八烷基酰胺(DOGS)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(DOSC)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙基二甲基丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、MVL5中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
[0053] 优选地，所述聚合物纳米粒的组成成分为：PLA、PLGA、PLG、Pluronic、PEO、PEI、PPO、PEG中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。
[0054] 本发明的第五方面，还提供了前述靶向给药载体的构建方法，选自以下任一：
[0055] 方法一、包括下列步骤：
[0056] 将RSPO1偶联载体分子作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构建药物载体的材料直接混合自组装来制备靶向给药载体；
[0057] 方法二、后插入法，包括以下步骤：
[0058] (1)先构建药物载体；
[0059] (2)将RSPO1偶联载体分子与已构建好的药物载体混合，即可；
[0060] 方法三：后连接法，包括以下步骤：
[0061] (1)采用载体分子作为药物载体材料之一，构建含有载体分子的药物载体；
[0062] (2)将RSPO1与步骤(1)中构建好的含有载体分子的药物载体通过共价键偶联反应，构建所述靶向给药载体。
[0063] 本发明的第六方面，提供了前述靶向给药载体在制备靶向给药系统中的用途。
[0064] 本发明的第七方面，提供了一种靶向给药系统，含有前述靶向给药载体及药物。
[0065] 优选地，所述药物选自但不限于抗肿瘤药物；抗代谢药物；细胞毒性药物；抗生素；光敏剂；激酶抑制剂；抗炎药物；免疫抑制剂；抗感染用药物；抗病毒药物。
[0066] 优选地，所述药物选自但不限于目的基因、反义基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、siRNA、mRNA、或上述基因的组合，或含上述基因的真核表达载体DNA。
[0067] 例如，本发明一实施例中，还选用了siRNA或者shRNA质粒表达载体(pGPU6/GFP/Neo)作为模型药物。
[0068] 进一步优选地，所述药物为抗肿瘤药物。本发明所述抗肿瘤药物可以为现有的任意种类的抑制肿瘤细胞生长、增殖、分化、转移的药物，包括但不限于：小分子化学药、核酸分子、碳水化合物、脂类、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0069] 本发明的优选实施例中，选用阿霉素作为模型药物。
[0070] 优选地，所述靶向给药系统针对的靶细胞为肿瘤细胞。
[0071] 本发明的所述靶向给药系统可携带抗肿瘤药物并靶向作用于肿瘤细胞。
[0072] 优选地，所述肿瘤为实体肿瘤或转移性肿瘤。进一步优选地，所述肿瘤为LGR5高表达的肿瘤。
[0073] 更优选地，所述肿瘤选自但不限于直肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌或成神经胶质细胞癌。
[0074] 本发明的第八方面，提供了前述靶向给药系统的构建方法，选自以下任一：
[0075] 方法一、包括下列步骤：
[0076] 将RSPO1偶联载体分子作为构建药物载体的材料之一，与其他用于构建药物载体的材料以及药物直接混合自组装来制备靶向给药系统；
[0077] 方法二、后插入法，包括以下步骤：
[0078] (1)先构建携带药物的药物载体；
[0079] (2)将RSPO1偶联载体分子与已构建好的携带药物的药物载体混合，即可；
[0080] 方法三：后连接法，包括以下步骤：
[0081] (1)采用载体分子作为药物载体材料之一，构建含有载体分子的携带药物的药物载体；
[0082] (2)将RSPO1与步骤(1)中构建好的含有载体分子的携带药物的药物载体通过共价键偶联反应，构建所述靶向给药系统。
[0084] 本发明的第十方面，还提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将前述靶向给药系统施用于患者。所用剂量，医师可根据实际情况选择。
[0085] 所述患者可以是肿瘤患者。所述肿瘤选自但不限于直肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌或成神经胶质细胞癌。
[0086] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0087] (1)本发明──RSPO1蛋白偶联载体分子，可以特异性地靶向Wnt通路活跃的肿瘤细胞，通过被动和主动双重靶向作用既提高化疗药物的药效又能减小其副作用。采用RSPO1偶联载体分子对药物载体进行修饰，尤其是所述RSPO1与载体分子之间通过硫醚键连接以及所述RSPO1与载体分子之间的摩尔比为1：1这两方面的因素，对于RSPO1偶联载体分子成为高效的“靶向头”尤为关键。本发明大量的研究表明，含有RSPO1的靶向给药系统，药物载体表面的RSPO1，能够特性高效地将药物载体定向地运送到Lgr5高表达的肿瘤组织中，分布到靶组织中的药物载体能够与肿瘤细胞表面的靶蛋白结合，并诱导药物载体内吞或药物释放等过程，从而发挥药效。RSPO1修饰的靶向给药系统对Lgr5高表达的肿瘤细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的靶向给药系统对Lgr5高表达的肿瘤细胞的抑制作用高达未经RSPO1修饰给药系统的5倍左右。
[0088] (2)本发明以脂质体作为药物载体模型，进行R-Spondin1修饰，通过荧光示踪法，考查LGR5高表达的LoVo直肠癌细胞分别对RSPO1修饰脂质体和普通脂质体的摄取，结果证明RSPO1在体外能高效介导脂质体进入LGR5高表达的细胞。具体地，LoVo细胞对RSPO1修饰的脂质体的摄取大概是对没有修饰的脂质体摄取量的7倍多。
[0089] (3)通过以阿霉素为模型药物，脂质体为药物载体模型，考察了RSPO1修饰脂质体/DOX对LGR5高表达的LoVo直肠癌细胞的体外生长抑制作用和体内生长抑制作用，在体外RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞的抑制作用大概是未修饰脂质体的，体内RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌肿瘤生长的抑制率高达59％，比未修饰脂质体对直肠癌肿瘤的生长抑制率高25％。表明RSPO1修饰能显著增加阿霉素脂质体对LGR5高表达的癌细胞和肿瘤组织的生长抑制作用。
[0090] (4)本发明研究结果提示，本发明R-Spondin1修饰的靶向给药系统，具有被动和主动双重靶向作用，能够高效地将抗肿瘤药物等药物靶向至LGR5表达的原发肿瘤和转移病灶，使得药物能够准确送达肿瘤细胞内部，实现真正的靶向治疗，大大提高治疗效果。经过试验发现，与未经R-Spondin1修饰的靶向给药系统相比，本发明的R-Spondin1修饰的靶向给药系统治疗肿瘤的效果提高四倍以上。附图说明
[0091] 图1为本发明实施例1所制备的RSPO1-PEG2000-DSPE的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。
[0092] 图2为本发明实施例3所制备的RSPO1修饰的FITC标记脂质体体外肿瘤细胞靶向性研究结果。
[0093] 图3为本发明实施例4所制备的RSPO1修饰的DiI标记脂质体体外肿瘤细胞靶向性研究。
[0094] 图4A为24h时，本发明实施例5所制备的RSPO1修饰的阿霉素脂质体对LoVo直肠癌细胞的体外生长抑制作用。
[0095] 图4B为48h时，本发明实施例5所制备的RSPO1修饰的阿霉素脂质体对LoVo直肠癌细胞的体外生长抑制作用。
[0096] 图5为本发明实施例5所制备的RSPO1修饰的阿霉素脂质体对LoVo直肠癌细胞的体内生长抑制作用。
[0098] 图6B为24h时，本发明实施例7制备RSPO1修饰的荧光标记阳离子脂质基因复合纳米粒子被LoVo细胞摄取实验结果。
[0099] 图7为LoVo细胞对本发明实施例8中制备的RSPO1修饰的脂质体的摄取量远大于没有修饰的脂质体。
具体实施方式
[0100] 本发明的发明人经过广泛而深入的研究，在优选实施例中首次合成并提供了一种R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂，所述R-Spondin1、聚乙二醇、磷脂之间的摩尔比为1：1：1。
[0102] 所述R-Spondin1为现有蛋白，其在Genebank中的登录号为NC_000001.11。可通过商购途径获得。在本发明中，可将R-Spondin1简称为RSPO1。
[0103] 所述聚乙二醇，又名PEG，可通过商购途径获得。本发明对聚乙二醇的分子量没有特别的限制，聚乙二醇分子量可优选在400～8000。在本发明的优选实施例中，所述聚乙二醇选用PEG2000，还可采用其他分子量的聚乙二醇，并不限于实施例所列举的具体分子量的聚乙二醇。
[0104] 所述磷脂可通过商购途径获得。本发明对于磷脂没有特别的限制，可选用短链磷脂，分子量与聚乙二醇的分子量相当或稍小。例如：所述磷脂可选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺中的任意一种。在本发明的优选实施例中，所述磷脂选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，还可选用其他的磷脂，并不限于实施例所列举的具体磷脂。
[0105] 本发明对于R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂的制备方法没有特别的限制，只要可成功制备获得该共聚物即可。本发明的优选实施例中，采用共价键偶联法制备R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂，还可采用其他制备方法，并不限于实施例中所列举的制备方法。
[0106] 本发明还提供了一种靶向给药系统，含有前述R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂。进一步地，所述靶向给药系统含有：R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂、药物以及药物载体。
[0107] 本发明对所述药物没有特别的限制。例如，所述药物可以是抗肿瘤药物。本发明的优选实施例中，选用阿霉素作为模型药物，来研究本发所述靶向给药系统输送的抗肿瘤药物的靶向能力。另一实施例中，还选用siRNA或shRNA质粒表达载体(pGPU6/GFP/Neo)作为模型药物，来研究所述靶向给药载体输送基因药物的靶向能力。
[0108] 所述药物载体是指药物载体是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。本发明对于药物载体没有特别的限制，只要能够实现成功携带所述药物即可。例如，所述药物载体可选用脂质体、阳离子脂质纳米粒、聚合物胶束、乳剂、微囊、微球、纳米囊、纳米球中的任意一种。本发明的优选实施例中，选用脂质体和阳离子脂质纳米粒作为模型药物载体，当然还可选用其他合适的药物载体，并不限于实施例所列举的具体药物载体。药物载体的构建方法为本领域的技术人员能够获知的内容。
[0109] 本发明对靶向给药系统的构建方法没有特殊的限制。可按照需要进行靶向给药系统的构建，例如，可以先构建携带药物的药物载体，然后加入R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂，混合即可。也可以，先构建含有聚乙二醇-磷脂的携带药物的药物载体，然后加入R-Spondin1通过共价键偶联反应，构建所述靶向给药系统。再例如，还可以直接将R-Spondin1-聚乙二醇-磷脂、药物以及用于构建药物载体的材料混合来制备靶向给药系统。
[0110] 进一步地，所述给药载体还可经其他修饰，例如，单个或多个感兴趣抗体、配体多糖的修饰等等，并不仅限于本发明的R-Spondin1修饰。
[0111] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0112] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0113] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0114] 实施例1 RSPO1-PEG2000-DSPE的制备
[0115] (1)除气HEPES溶液的配制：超纯水加热沸腾，充N2饱和至冷却，加入HEPES盐至浓度50mM，NaOH调节pH至7.0，整个过程N2保护；
[0116] (2)称取DSPE-PEG2000-MAL粉末，加入除气HEPES盐溶液，水合成为胶束溶液；在N2保护下将TCEP还原后的RSPO1加入该胶束溶液中；反应在温度为10℃，转速为500rpm条件下恒温振荡，反应24h后得到最终产物RSPO1-PEG2000-DSPE。
[0117] 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果，参见图1，如图1，显示连接DSPE－PEG2000后的RSPO1蛋白条带上移～3K，经ImageJ计算连接效率在95％以上，充分说明RSPO1-PEG2000-DSPE合成成功。
[0118] 实施例2 RSPO1修饰的脂质体的制备
[0119] 以磷脂、胆固醇、DSPE－PEG2000为原材料制备脂质体，各原材料HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/DSPE－PEG2000(聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)的摩尔比为55：42：3。具体方法包括步骤：按配比，取各原材料混溶于适量氯仿中，37℃水浴下减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，水浴超声；依次挤压通过100nm和80nm聚碳脂膜，即可先制备得到PEG修饰的脂质体。
[0120] 然后将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例上述制备获得的PEG修饰的脂质体中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，24小时后得到RSPO1修饰的脂质体。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径为90±10nm。
[0121] 实施例3 RSPO1修饰的FITC标记脂质体的制备及体外肿瘤细胞靶向性研究[0122] (1)RSPO1修饰的FITC标记脂质体的制备
[0123] 以磷脂、胆固醇、DSPE－PEG2000，FITC－DHPE为原材料制备脂质体，各原材料HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/DSPE－PEG2000(聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)/FITC-DHPE的摩尔比为55：42：3：1。具体方法包括步骤：按配比，取各原材料混溶于适量氯仿中，37℃水浴下减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，水浴超声；依次挤压通过100nm和80nm聚碳脂膜，得FITC修饰的脂质体。
[0124] 将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例FITC修饰的脂质体中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，24小时后得到RSPO1修饰的FITC标记脂质体。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径为95±10nm。
[0125] (2)RSPO1修饰的FITC标记脂质体体外肿瘤细胞靶向性研究
[0126] 取对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化单层培养细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配成单细胞悬液，以每孔4X105个细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔体积2ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37摄氏度，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁。隔日，用不含胎牛血清的培养基配置FITC标记脂质体及RSPO1修饰的FITC标记脂质体。将培养板中的培养基吸出，加入FITC标记脂质体及RSPO1修饰的FITC标记脂质体，37摄氏度孵育1h，吸弃上清液。用预冷的PBS溶液洗板两次，0.25％胰蛋白酶/EDTA消化细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，细胞吹打成单细胞悬液后加入多聚甲醛固定10分钟。离心收集细胞，吸弃上清液，加入PBS重悬，重复两次。最后使用流式细胞仪检测单细胞悬液中细胞内化情况。参见图2，结果显示，LoVo细胞对RSPO1修饰的脂质体的摄取量远大于没有修饰的脂质体。具体地，LoVo细胞对RSPO1修饰的脂质体的摄取大概是对没有修饰的脂质体摄取量的7倍多。
[0127] 实施例4 RSPO1修饰的DiI标记脂质体的制备及靶向研究
[0128] (1)RSPO1修饰的DiI标记脂质体的制备
[0129] 以磷脂、胆固醇、DSPE－PEG2000、DiI为原材料制备脂质体。各原材料HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/DSPE－PEG2000(聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)/DiI的摩尔比为55：42：3：0.8。具体方法包括步骤：按配比，取各原材料混溶于适量氯仿中，37℃水浴下减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，水浴超声；依次挤压通过100nm和80nm聚碳脂膜，得DiI修饰的脂质体。
[0130] 将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例制备的DiI修饰的脂质体中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，24小时后得到RSPO1修饰的DiI标记脂质体。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径为95±10nm。
[0131] (2)RSPO1修饰的DiI标记脂质体体外肿瘤细胞靶向性研究
[0132] 取对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化单层培养细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配成单细胞悬液，以每孔2X105个细胞接种于24孔板中的14mm盖玻片上，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37摄氏度，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁。隔日，用不含胎牛血清的培养基配置DiI标记脂质体及RSPO1修饰的DiI标记脂质体。将培养板中的培养基吸出，加入DiI标记脂质体及RSPO1修饰的DiI标记脂质体，37摄氏度孵育15min，30min，1h后，吸弃上清液。用预冷的PBS溶液清洗三次，加入多聚甲醛固定10分钟，PBS洗两遍后取出盖玻片置于载玻片上加封片液封片，在荧光显微镜下观察细胞内化情况。参见图3，RSPO1修饰的DiI标记脂质体和DiI标记脂质体于37摄氏度分别与LoVo细胞作用15分钟、30分钟、一小时后的荧光显微照片。结果显示，DiI标记脂质体基本不能被LoVo细胞摄取，而RSPO1修饰的脂质体则被大量摄取，说明在RSPO1的介导作用下，RSPO1修饰脂质体对直肠癌细胞具有良好的体外靶向性。
[0135] 以磷脂、胆固醇、DSPE－PEG2000为原材料制备脂质体。各原材料HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/DSPE－PEG2000(聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)的摩尔比为55：42：3。具体方法包括步骤：按配比，取各原材料混溶于适量氯仿中，37℃水浴下减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入一定体积的硫酸铵溶液水化1h，水浴超声得脂质体混悬液。60度水浴中，使用微量挤出器，依次挤压通过400nm，200nm，100nm和80nm聚碳脂膜，得空白脂质体；通过透析更换外水相后，按照药脂比1:10(w/w)加入阿霉素水溶液，60度水浴20分钟；透析除去游离药物，得阿霉素脂质体。
[0136] 将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例所制备的阿霉素脂质体中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，24小时后得到RSPO1修饰的阿霉素脂质体。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径为95±10nm。
[0137] (2)RSPO1修饰的阿霉素脂质体对LoVo直肠癌细胞的体外生长抑制作用[0138] 采用CCK-8试剂盒测定RSPO1修饰的阿霉素脂质体对LoVo直肠癌细胞的体外生长抑制作用。取处于对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配成单细胞悬液，细胞计数，以每孔1X104个细胞接种于96孔板中，每孔体积100ul，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37摄氏度，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁。隔日，用细胞培养基将RSPO1修饰的阿霉素脂质体和阿霉素脂质体稀释至阿霉素浓度30ug/ml、15ug/ml、7.5ug/ml，吸去96孔板内细胞培养液，各孔加入100ul各浓度的脂质体药液孵育4小时后换成完全培养基继续培养24小时、48小时。每个浓度均设三个复孔，留出三个孔仅加入培养液作为对照孔。每孔加入10微升CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续孵育3小时，震荡混匀2分钟后酶标仪检测450nm吸光度，以及600nm吸光度作为背景值参考。结果参见图4A和4B所示，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞的抑制作用大概是未修饰脂质体的5倍。
[0139] (3)RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌肿瘤组织的体内生长抑制作用[0140] 取处于对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化，PBS洗涤，6
细胞计数，分散于PBS中，以1X10 个细胞(100ul)皮下注射接种于裸鼠右侧腋下部位，SPF环境下饲养。将21只已形成LoVo皮下肿瘤(肿瘤体积50～100mm3)的裸鼠随机分为3组(每组7只)，分别设为PBS，阿霉素脂质体和RSPO1修饰的阿霉素脂质体组。从分笼第一天开始将
100ul相应的制剂尾静脉注射到裸鼠体内，每三天注射一次，每次阿霉素剂量为0.5mg/kg,一共注射8次，总剂量为4mg/kg。每周测量皮下肿瘤组织大小，肿瘤组织
细胞计数，分散于PBS中，以1X10 个细胞(100ul)皮下注射接种于裸鼠右侧腋下部位，SPF环境下饲养。将21只已形成LoVo皮下肿瘤(肿瘤体积50～100mm3)的裸鼠随机分为3组(每组7只)，分别设为PBS，阿霉素脂质体和RSPO1修饰的阿霉素脂质体组。从分笼第一天开始将
100ul相应的制剂尾静脉注射到裸鼠体内，每三天注射一次，每次阿霉素剂量为0.5mg/kg,一共注射8次，总剂量为4mg/kg。每周测量皮下肿瘤组织大小，肿瘤组织
[0141] 体积计算公式如下：
[0142] V(mm3)＝(d2X D)/2
[0143] 其中d和D分别为肿瘤组织的短径和长径，单位为mm。如图5，结果显示与阿霉素脂质体相比，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对肿瘤生长的抑制作用显著增强。具体的，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌肿瘤生长的抑制率高达59％，而未修饰脂质体对直肠癌肿瘤生长的抑制率只有34％。
[0144] 实施例6 RSPO1修饰的阳离子脂质基因复合纳米粒子的制备
[0145] 将DSPC、胆固醇、DLin-MC2-MPZ以及DSPE-PEG2000按20/38.5/40/1.5的比例溶于一定量乙醇中，在匀速条件下注入一定体积的pH4.0缓冲液中，乙醇与缓冲液的体积比为2:8。按同等醇水比配制相应的siRNA的溶液，并将其与脂质溶液等体积混合均匀，37度条件下孵育50分钟；4度条件下，将步骤2最终所得溶液先经4小时pH4.0缓冲液透析，尽可能除去脂质基因复合纳米粒子中的乙醇；再由pH7.4缓冲液透析8小时至12小时，使脂质基因复合纳米粒子在pH7.4条件下保持其电中性。
[0146] 然后将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例上述制备获得的PEG修饰的脂质基因复合纳米粒子中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，20-24小时后得到RSPO1修饰的脂质基因复合纳米粒子。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径约为170nm，zeta电势约为-15.8mV，琼脂糖凝胶电泳测其siRNA包封率为80％～90％。
[0147] 实施例7 RSPO1修饰的荧光标记阳离子脂质基因复合纳米粒子的制备及体外肿瘤细胞靶向性研究
[0148] (1)RSPO1修饰的荧光标记阳离子脂质基因复合纳米粒子的制备
[0149] 将DSPC、胆固醇、DLin-MC2-MPZ以及DSPE-PEG2000、DiI按20/38.5/40/1.5/1的比例溶于一定量乙醇中，在匀速条件下注入一定体积的pH4.0缓冲液中，乙醇与缓冲液的体积比为2:8。按同等醇水比配制相应的Cy5-Luciferase siRNA的溶液，并将其与脂质溶液等体积混合均匀，37度条件下孵育50分钟；4度条件下，将步骤2最终所得溶液先经4小时pH4.0缓冲液透析，尽可能除去脂质基因复合纳米粒子中的乙醇；再由pH7.4缓冲液透析8小时至12小时，使脂质基因复合纳米粒子在pH7.4条件下保持其电中性。然后将实施例1中得到的RSPO1-PEG2000-DSPE加入本实施例上述制备获得的PEG修饰的荧光脂质基因复合纳米粒子中，在37℃，转速为300rpm条件下恒温振荡，20-24小时后得到RSPO1修饰的荧光标记脂质基因复合纳米粒子。
[0150] (2)RSPO1修饰的荧光标记阳离子脂质基因复合纳米粒子的体外肿瘤细胞靶向性研究
[0151] 取对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化单层培养细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配成单细胞悬液，以每孔2X105个细胞接种于24孔板中的14mm盖玻片上，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37摄氏度，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁。隔日，将培养板中的培养基吸出，加入用不含胎牛血清的培养基配置的荧光标记脂质基因复合纳米粒子及RSPO1修饰的荧光标记脂质基因复合纳米粒子，37摄氏度孵育1h和24h后，吸弃上清液。用预冷的PBS溶液清洗三次，加入多聚甲醛固定10分钟，PBS洗两遍后取出盖玻片置于载玻片上加封片液封片，在荧光显微镜下观察细胞内化情况。参见图7，RSPO1修饰的荧光标记脂质基因复合纳米粒子和荧光标记脂质基因复合纳米粒子于37摄氏度分别与LoVo细胞作用1小时和24小时后的荧光显微照片。结果显示，荧光标记脂质基因复合纳米粒子只能少量被LoVo细胞摄取，而RSPO1修饰的荧光标记脂质基因复合纳米粒子则被大量摄取。同时可以观察到无修饰的纳米粒组几乎看不到荧光修饰的siRNA进入细胞，而RSPO1修饰的纳米粒组中大量荧光修饰的siRNA进入到细胞内。说明在RSPO1的介导作用下，RSPO1修饰脂质基因复合纳米粒子对直肠癌细胞具有良好的体外靶向性。
[0152] 实施例8 表面连接法制备RSPO1修饰的FITC标记脂质体及其体外肿瘤细胞靶向性研究
[0153] (1)表面连接法制备RSPO1修饰的FITC标记脂质体
[0154] 除气HEPES溶液的配制：超纯水加热沸腾，充N2饱和至冷却，加入HEPES盐至浓度50mM，NaOH调节pH至7.0，整个过程N2保护；
[0155] 以磷脂、胆固醇、DSPE－PEG5000、DPPE-PEG5000-Maleimide、FITC-DHPE为原材料制备脂质体。各原材料HSPC(氢化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/DSPE－PEG5000(聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)/DPPE-PEG5000-Maleimide/FITC-DHPE的摩尔比为55：42：3：1：1。具体方法包括步骤：按配比，取各原材料混溶于适量氯仿中，37℃水浴下减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml除气HEPES溶液水化1h，水浴超声；依次挤压通过100nm和80nm聚碳脂膜，得到带马来酰亚胺修饰的FITC标记脂质体。在N2保护下将TCEP还原后的RSPO1蛋白加入制备好的脂质体中，反应在温度为10℃，转速为500rpm条件下恒温振荡，反应24h后得到最终产物RSPO1修饰的FITC标记脂质体。使用激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径，显示粒径为120±10nm。
[0156] (2)RSPO1修饰的FITC标记脂质体体外肿瘤细胞靶向性研究
[0157] 取对数生长期的单层培养LoVo细胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化单层培养细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基配成单细胞悬液，以每孔4X105个细胞接种于12孔细胞培养板中，每孔体积2ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37摄氏度，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁。隔日，用不含胎牛血清的培养基配置FITC标记脂质体及RSPO1修饰的FITC标记脂质体。将培养板中的培养基吸出，加入FITC标记脂质体及RSPO1修饰的FITC标记脂质体，37摄氏度孵育1h，吸弃上清液。用预冷的PBS溶液洗板两次，0.25％胰蛋白酶/EDTA消化细胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，细胞吹打成单细胞悬液后加入多聚甲醛固定10分钟。离心收集细胞，吸弃上清液，加入PBS重悬，重复两次。最后使用流式细胞仪检测单细胞悬液中细胞内化情况。参见图7，结果显示，LoVo细胞对RSPO1修饰的脂质体的摄取量远大于没有修饰的脂质体。
[0158] 实施例9 RSPO1-PEG-PLA的制备及肿瘤细胞靶向性研究
[0159] RSPO1-PEG-PLA的制备：
[0160] (1)除气HEPES溶液的配制：超纯水加热沸腾，充N2饱和至冷却，加入HEPES盐至浓度50mM，NaOH调节pH至7.0，整个过程N2保护；
[0161] (2)称取PLA-PEG-MAL溶于乙腈中，旋转蒸发成膜，加入除气HEPES盐溶液，水合成为胶束溶液；在N2保护下将TCEP还原后的RSPO1加入该胶束溶液中；反应在温度为10℃，转速为500rpm条件下恒温振荡，反应24h后得到最终产物RSPO1-PEG-PLA。
[0162] RSPO1修饰的脂质体的制备及体外靶向性研究：
[0163] 参照实施例5中的方法制备获得RSPO1修饰的阿霉素脂质体，并进行体外肿瘤细胞靶向性研究。结果表明，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞的抑制作用大概是未修饰脂质体的5倍。
[0164] 实施例10 RSPO1-(GGGGS)n-Pluronic的制备及肿瘤细胞靶向性研究[0165] RSPO1-(GGGGS)n-Pluronic的制备：
[0166] (1)取羧基化的Pluronic共聚物溶于乙腈，旋转蒸发成膜，加入纯水后水合成为胶束溶液；加入1-乙基-3_(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，200rpm旋转搅拌15min以活化羧基，加入(GGGGS)n多肽，200rpm旋转搅拌2h，以氢氧化钠调整pH值至7，得(GGGGS)n－Pluronic胶束；
[0167] (2)(GGGGS)n－Pluronic胶束中加入1-乙基-3_(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)及N-[马来酰亚胺基己酸]酰肼三氟乙酸(EMCH)，200rpm旋转搅拌15min以活化羧基，在N2保护下将TCEP还原后的RSPO1加入该胶束溶液中；常温振荡反应2h后得到最终产物RSPO1-(GGGGS)n-Pluronic。
[0168] RSPO1修饰的脂质体的制备及体外靶向性研究：
[0169] 参照实施例5中的方法制备获得RSPO1修饰的阿霉素脂质体，并进行体外肿瘤细胞靶向性研究。结果表明，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞的抑制作用高达未修饰脂质体的5倍。
[0170] 实施例11 RSPO1-CpG ODN-月桂酸的制备及肿瘤细胞靶向性研究
[0171] RSPO1-CpG ODN-月桂酸的制备：
[0173] (2)叠氮月桂酸和TBTA粉末分别溶于DMF，震荡混合均匀。
[0174] (3)离心管中依次加入硫酸铜溶液、TBTA溶液、三乙胺乙酸缓冲液、CpG ODN溶液、叠氮月桂酸溶液和抗坏血酸钠溶液，每加一种物质后震荡混匀，全部加完后密闭，室温震荡反应过夜得CpG ODN－月桂酸。
[0175] (4)将CpG ODN－月桂酸与PMPI(N-[p-马来酰亚胺苯]异氰酸酯)溶液混合后加入TCEP还原后的RSPO1；转速为500rpm条件下常温振荡，反应2h后得到最终产物RSPO1-CpG ODN-月桂酸。
[0176] RSPO1修饰的脂质体的制备及体外靶向性研究：
[0177] 参照实施例5中的方法制备获得RSPO1修饰的阿霉素脂质体，并进行体外肿瘤细胞靶向性研究。结果表明，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的阿霉素脂质体对直肠癌LoVo细胞的抑制作用高达未修饰脂质体的5倍。
[0178] 本发明的发明人经过上述广泛而深入的研究发现，采用RSPO1偶联载体分子对药物载体进行修饰，尤其是所述RSPO1与载体分子之间通过硫醚键连接以及所述RSPO1与载体分子之间的摩尔比为1：1这两方面的因素，对于RSPO1偶联载体分子成为高效的“靶向头”尤为关键。本发明大量的研究表明，含有RSPO1的靶向给药系统，药物载体表面的RSPO1，能够特性高效地将药物载体定向地运送到Lgr5高表达的肿瘤组织中，分布到靶组织中的药物载体能够与肿瘤细胞表面的靶蛋白结合，并诱导药物载体内吞或药物释放等过程，从而发挥药效。RSPO1修饰的靶向给药系统对Lgr5高表达的肿瘤细胞具有更强的生长抑制作用。具体的，RSPO1修饰的靶向给药系统对Lgr5高表达的肿瘤细胞的抑制作用高达未经RSPO1修饰给药系统的5倍左右。而对于RSPO1偶联载体分子中的其他载体分子、靶向给药系统中的其他药物载体以及其他药物，本发明不再一一赘述。
[0179] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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