PDE5抑制剂组合物及治疗心脏病征候的方法
阅读：807发布：2022-08-19
专利汇可以提供PDE5抑制剂组合物及治疗心脏病征候的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 方法及组合物的特征为，一种用于 治疗 或 预防 患者心脏病征候的PDE5 抑制剂 。，下面是PDE5抑制剂组合物及治疗心脏病征候的方法专利的具体信息内容。
1.强化心脏病症患者心脏功能的方法，而该心脏病症 选自由下列所构成的群组：心脏肥大、心脏收缩功能降 低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能保 留的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动 脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭， 该方法包括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中， 该抑制剂的投予增强了心脏功能。
2.如权利要求1的方法，其中，该方法降低或逆转心 脏腔室重塑。
3.如权利要求2的方法，其中，该方法降低或逆转心 脏扩张。
4.如权利要求1的方法，其中，该方法降低或逆转心 肌细胞重塑。
5.如权利要求4的方法，其中，该方法降低肌肉细胞 肥大。
6.如权利要求1的方法，其中，该方法降低或逆转分 子重塑。
7.如权利要求6的方法，其中，该PDE5抑制剂降低 试剂的表达，而该试剂选自由下列所构成的群组：金属 蛋白酶、钙调神经磷酸酶、有丝分裂原活化激酶、Akt 激酶、活化T细胞的核因子、RhoA及Rho激酶、PI3激 酶、gpl30/Stat-3途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、 和氧化氮合成酶未偶合相关的试剂以及和氧化压力相关 的试剂。
8.如权利要求6的方法，其中，该PDE5抑制剂降低 试剂的生物活性，而该试剂选自由下列所构成的群组： 金属蛋白酶、钙调神经磷酸酶、有丝分裂原活化激酶、 Akt激酶、NFAT、RhoA及Rho激酶、PI3激酶、gpl30/Stat-3 途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和氧化氮合成 酶未偶合相关的试剂以及和氧化压力相关的试剂。
9.如权利要求1的方法，其中，该PDE5抑制剂通过 蛋白激酶G来增强依赖于cGMP的信号。
10.如权利要求1的方法，其中，该心脏腔室、细胞 或分子重塑系由刺激所诱发。
11.如权利要求10的方法，其中，该刺激是压力超载。
12.如权利要求10的方法，其中，该刺激是神经激素 压力。
13.如权利要求10的方法，其中，该刺激是心肌梗塞。
14.如权利要求10的方法，其中，该刺激是容量超载。
15.如权利要求1的方法，其中，该心脏功能是由测 量与负载无关的松弛速率来评估的。
16.如权利要求1的方法，其中，该心脏功能是由测 量与负载无关的心脏收缩性来评估的。
17.如权利要求1的方法，其中，该心脏功能是由测 量与负载无关的心脏射出容积来评估的。
18.如权利要求1的方法，其中，该心脏功能是由测 量与负载无关的收缩末期容积来评估的。
19.如权利要求1至18中任一项的方法，其中，心脏 功能的测定方法选自由下列所构成的群组：多普勒超音 波心动图、二维回音多普勒、脉冲波多普勒、连续波多 普勒、示波臂套(oscillometric arm cuff)、心导管插入 术、核磁共振图像、正子放射型电脑断层扫描、胸部X 光、射出分率测定、心电图、核子扫描、侵袭性心脏压 力以及非侵袭性和非侵袭性地测量心脏压力-容积回圈 (电导心导管)。
20.预防具有心脏肥大发展倾向的患者心脏肥大的方 法，该方法包括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其 中，该抑制剂的投予预防了心脏肥大。
21.使具有心脏肥大的患者降低心脏肥大的方法，该 方法包括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中，该 抑制剂的投予降低了心脏肥大。
22.如权利要求21的方法，其中，该方法逆转心脏肥 大。
23.预防具有心脏扩张发展倾向的患者心脏扩张的方 法，该方法包括对该患投予有效量的PDE5抑制剂，其中， 该抑制剂的投予预防了心脏扩张。
24.使诊断出有心脏扩张的患者降低心脏扩张的方 法，该方法包括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其 中，该抑制剂的投予降低了心脏扩张。
25.如权利要求24的方法，其中，该方法逆转心脏扩 张。
26.如权利要求20至25中任一项的方法，其中，该 方法降低心脏腔室重塑。
27.如权利要求20至25中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂降低细胞重塑。
28.如权利要求27的方法，其中，该PDE5抑制剂降 低肌肉细胞大小。
29.如权利要求20至28中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂降低分子重塑。
30.如权利要求29的方法，其中，该PDE5抑制剂调 控试剂的表达，而该试剂选自由下列所构成的群组：金 属蛋白酶、钙调神经磷酸酶、有丝分裂原活化激酶、Akt 激酶、活化T细胞的核因子、RhoA及Rho激酶、PI3激 酶、gpl30/Stat-3途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、 和氧化氮合成酶未偶合相关的试剂以及和氧化压力相关 的试剂。
31.如权利要求29的方法，其中该PDE5抑制剂调控 试剂的生物活性，而该试剂选自由下列所构成的群组： 金属蛋白酶、钙调神经磷酸酶、有丝分裂原活化激酶、 Akt激酶、NFAT、RhoA及Rho激酶、PI3激酶、gpl30/Stat-3 途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和氧化氮合成 酶未偶合相关的试剂以及和氧化压力相关的试剂。
32.如权利要求31的方法，其中，该PDE5抑制剂改 变该试剂的活化作用。
33.如权利要求20至32中任一项的方法，其中， 该 PDE5抑制剂通过蛋白激酶G增强了依赖于cGMP的信 号。
34.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，使用 该PDE5抑制剂处理心脏状况不需要调控纤维化过程。
35.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，使用 该PDE5抑制剂处理心脏状况不需要调控压力负载。
36.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂增强与动脉血压效果无关的心脏功能。
37.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂增强与肺血压效果无关的心脏功能。
38.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂增强与血管舒张效果无关的心脏功能。
39.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到该PDE5抑制剂的 0.25×IC50。
40.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到该PDE5抑制剂的 0.5×IC50。
41.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度等于该PDE5抑制剂的 IC50。
42.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到该PDE5抑制剂的 5×IC50。
43.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到该PDE5抑制剂的 10×IC50。
44.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到该PDE5抑制剂的 50×IC50。
45.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，该 PDE5抑制剂选择性地抑制PDE5。
46.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到IC50为10nM。
47.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的浓度达到峰值浓度为 50nM。
48.如权利要求1至33中任一项的方法，其中，投予 该PDE5抑制剂使在血浆中的有效浓度达到0.1至100 nM。
49.如权利要求48的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆中的有效浓度达到0.1至75.0nM。
50.如权利要求49的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆中的有效浓度达到0.5至50.0nM。
51.如权利要求50的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆的有效浓度达到5至10nM。
52.如权利要求51的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆中的有效浓度达到10至20nM。
53.如权利要求50的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆中的有效浓度达到20至30nM。
54.如权利要求50的方法，其中，投予该PDE5抑制 剂使在血浆中的有效浓度达到30至40nM。
55.如权利要求48至54中任一项的方法，其中，该 有效浓度维持超过至少4至8个小时。
56.如权利要求55的方法，其中，该有效浓度维持超 过至少8至12个小时。
57.如权利要求56的方法，其中，该有效浓度维持超 过至少12至24个小时。
58.预防患者适应不良心脏改变的方法，该方法包括 对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中，该抑制剂防 止该适应不良心脏改变。
59.使有需要的患者降低适应不良心脏改变的方法， 该方法包括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中， 该抑制剂降低该适应不良心脏改变。
60.如权利要求59的方法，其中该方法逆转该改变。
61.如权利要求58或59的方法，其中，该改变与高 血压有关。
62.如权利要求58或59的方法，其中，该改变与病 症有关，而该病症选自由下列所构成的群组：心脏肥大、 心脏收缩功能降低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大 症、收缩功能保留的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血 压心脏病、大动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重 塑和心脏衰竭。
63.对有需要的患者增强心肌活力的方法，该方法包 括对该患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中，该抑制剂 的投予增强了心肌能量。
64.如权利要求63的方法，其中，心肌能量的分析通 过下列评估来进行：相对于高能磷酸盐的运用(腺核苷三 磷酸)的高能磷酸盐的储存(磷酸基肌酸)的评估；相对于 ADP的ATP的通量的评估；ADP和无机磷酸盐水平的评 估；与总心脏工作量有关的心脏对氧气的消耗量的评估； 以及与总肌肉工作量有关的分离心肌对氧气的消耗量的 评估。
65.治疗病症的组合物，而该病症选自由下列所构成 的群组：心脏肥大、心脏收缩功能降低、心脏舒张功能 降低、适应不良肥大症、收缩功能保留的心脏衰竭、舒 张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉狭窄、肥大性心 肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭，该组合物包含在医 药上可接受的赋形剂中的至少0.1至200毫克的PDE5抑 制剂，其中，将该组合物投予患者，在血浆中产生的有 效浓度至少为0.1至100nM。
66.治疗心脏肥大的组合物，该组合物包含在医药上 可接受的赋形剂中的至少0.1至200毫克的PDE5抑制 剂，其中，将该组合物投予患者，在血浆中产生的有效 浓度至少为0.1至100nM。
67.如权利要求65或66的组合物，其中，将该组合 物投予患者，产生的有效浓度为0.1至75nM。
68.如权利要求67的组合物，其中，将该组合物投予 患者，产生的有效浓度为0.5至50nM。
69.如权利要求68的组合物，其中，将该组合物投予 患者，在血浆中产生的有效浓度为1至25nM。
70.如权利要求69的组合物，其中，将该组合物投予 患者，在血浆中产生的有效浓度为5至10nM。
71.如权利要求69的组合物，其中，将该组合物投予 患者，在血浆中产生的有效浓度为10至20nM。
72.如权利要求68的组合物，其中，将该组合物投予 患者，在血浆中产生的有效浓度为20至30nM。
73.如权利要求68的组合物，其中，将该组合物投予 患者，在血浆中产生的有效浓度为30至40nM。
74.如权利要求65或66的组合物，其中，该组合物 包含至少10毫克的PDE5抑制剂。
75.如权利要求65或66的组合物，其中，该组合物 包含至少20毫克的PDE5抑制剂。
76.如权利要求65或66的组合物，其中，该组合物 包含至少100毫克的PDE5抑制剂。
77.如权利要求63或64的组合物，其中，该组合物 包含至少150毫克的PDE5抑制剂。
78.如权利要求65或66的组合物，其中， 该组合物 提供持续释放该PDE5抑制剂。
79.如权利要求78的组合物，其中，该组合物提供释 放该PDE5抑制剂超过至少4至8个小时。
80.如权利要求79的组合物，其中，该组合物提供释 放该PDE5抑制剂超过至少8至12个小时。
81.如权利要求80的组合物，其中，该组合物提供释 放该PDE5抑制剂超过至少12至24个小时。
82.如权利要求65或66的组合物，其中，该组合物 实质上由PDE5抑制剂所构成。
83.一种药物包装，其包含组合物，该组合物包含在 医药上可接受的赋形剂中的至少5毫克的PDE5抑制剂， 其中，该药物包装用于治疗或预防病症，而该病症选自 由下列所构成的群组：心脏肥大、心脏收缩功能降低、 心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能保留的 心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉狭 窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭。
84.一种药物包装，其包含组合物，该组合物包含在 医药上可接受的赋形剂中的至少5毫克的PDE5抑制剂， 其中，该药物包装用于治疗或预防心脏肥大。
85.如权利要求83或84的药物包装，其中，该药物 包装包含至少10毫克的PDE5抑制剂。
86.如权利要求83或84的药物包装，其中，该药物 包装包含至少20毫克的PDE5抑制剂。
87.如权利要求83或84的药物包装，其中，该药物 包装包含至少100毫克的PDE5抑制剂。
88.如权利要求83或84的药物包装，其中，该PDE5 抑制剂在持续释放的配方中被提供。
89.如权利要求83或84的药物包装，其中，该组合 物实质上由PDE5抑制剂所构成。
90.如权利要求83至89中任一项的药物包装，又包 含对患者投予该组合物以治疗或预防心脏肥大的文字说 明书。
技术领域
背景技术
心脏持续的处于血液动力学超负荷状态时，造成分 子、细胞、肌肉以及腔室形态上的改变，是典型的心脏 适应不良，将导致进一步心脏功能障碍，最后引发心脏 衰竭。触发此等反应的病理生理刺激，包括高血压、心 脏瓣膜疾病、神经激素压力及与帮浦功能衰退有关的腔 室过度充装。这些触发多重细胞信号和转录途径的改变， 将引发肌肉细胞生长、心肌功能恶化、肥大重塑和心脏 扩张。现有的疗法无法充分地防止这些病理变化。心脏 扩大是慢性且持续恶化的病症，最后导致心脏衰竭。超 过5百万个美国人受心脏衰竭所影响，单在美国每年就 有超过500,000个新病例，是死亡的主因。这些患者近半 有高血压和明显心脏收缩减小的心脏肥大症，此症状目 前没有特别经测试和认可的治疗方法。因此，对用于治 疗心脏病症譬如心脏肥大的改良组合物和方法， 实有迫 切的需求。
发明内容
本发明为治疗和预防心脏病症的方法和组合物。是 以发现PDE5A在心脏遭受慢性压力，譬如持续的压力负 载、儿茶酚胺刺激和其它型式的血液动力学负载，扮演 着重要角色；以及在这背景下，抑制PDE5A而预防并逆 转了形态、细胞和分子的心脏重塑，作为本发明的依据。
在一态样中，本发明大抵是强化患者(例如，人类病 患)心脏功能的方法，这些有心脏病症的患者选自由下列 所构成的群组：心脏肥大、心脏收缩功能降低、心脏舒 张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能持平的心脏衰 竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉狭窄、肥 大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭。方法包含对 患者投予有效的PDE5抑制剂量，由投予抑制剂来增强心 脏功能。在一具体实例中，该方法降低或逆转了心脏腔 室重塑、心脏扩张、心肌细胞重塑(例如，降低肌肉细胞 肥大)或分子的重塑。在另一具体实例中，PDE5抑制剂 降低了选自由下列所构成群组的试剂的表达或生物活 性：金属蛋白酶、钙调神经酶(calcineurin)、有丝分裂原 活化激酶(mitogen activated kinase)、Akt激酶、活化T 细胞的核因子(NFAT)，RhoA及Rho激酶、PI3激酶、 gpl30/Stat-3途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和 氧化氮合成酶未偶合有关联的试剂以及和氧化压力相关 的试剂。在另一具体实例中，PDE5抑制剂通过蛋白激酶 G来增强依赖于cGMP的信号。又在另一具体实例中， 心脏腔室、细胞或分子的重塑是由刺激所引发(例如，压 力超载、神经激素压力、心肌梗塞或容量超载)。又在另 一具体实例中，通过测量与负载无关的松弛速率；测量 与负载无关的心脏收缩性；测量与负载无关的心脏射出 容积；或量测与负载无关的收缩末期容积，来评估心脏 功能。使用选自由下列所构成群组的分析方法来测量心 脏的功能：多普勒超音波心动图、二维回音多普勒、脉冲 波多普勒、连续波多普勒、示波臂套(oscillometric arm cuff)、心导管插入术、核磁共振图像、正子放射型电脑 断层扫描、胸部X光、射出分率测定(ejection fraction test)、心动图、核子扫描、侵袭性心脏压力、侵袭性和 非侵袭性地测量心脏压力-容积循环(电导心导管)。
在另一态样中，本发明提供给有心脏肥大倾向的患 者(例如，人类病患)一种预防、降低或逆转心脏肥大的方 法，该方法包含对患者投予有效剂量的PDE5抑制剂，由 投予该抑制剂来预防心脏肥大。
在另一态样中，本发明提供给有心脏扩张倾向的患 者(例如，人类病患)一种预防、降低或逆转心脏扩张的方 法，该方法包含对患者投予有效剂量的PDE5抑制剂，由 投予抑制剂来预防心脏扩大。
以上任何态样的各种具体实例中，PDE5抑制剂降低 心脏腔室的重塑；降低细胞的重塑(例如，通过降低肌肉 细胞大小)；或降低分子的重塑(例如，通过调节选自由下 列所构成群组的试剂的表达或生物活性：金属蛋白酶、 钙调神经酶、有丝分裂原活化激酶、Akt激酶、活化T 细胞的核因子、RhoA及Rho激酶、PI3激酶、gpl30/Stat-3 途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和氧化氮合成 酶未偶合有关联的试剂以及和氧化压力相关的试剂。在 一具体实例中，PDE5抑制剂改变试剂的活化作用。在另 一具体实例中，PDE5抑制剂通过蛋白激酶G来增强依赖 于cGMP的信号。
在以上任何态样的各种具体实例中，用PDE5抑制剂 来治疗心脏病症，不需要调控纤维化过程或调控压力负 载。在以上任何态样的其它具体实例中，PDE5抑制剂增 强了与动脉血压效果无关、与肺脏血压效果无关、或与 血管扩张效果无关的心脏功能。在以上任何态样的各种 具体实例中，所投予PDE5抑制剂的浓度，达到血浆中有 0.25倍半抑制浓度0.25×IC50、0.5×IC50、相当于 IC50、5×IC50、10×IC50或50×IC50的PDE5抑制剂。 在以上任何态样的其它具体实例中，PDE5抑制剂选择性 地抑制PDE5。在以上任何态样的又其它具体实例中，所 投予PDE5抑制剂在血浆中达到IC50为10nM。在以上任 何态样的其它具体实例中，所投予PDE5抑制剂在血浆中 达到50nM的峰值浓度。在以上任何态样的又其它具体 实例中，所投予PDE5抑制剂在血浆中达到0.1至100、 0.1至75.0、0.5至50.0、5至10、10至20、20至30或 30至40nM的有效浓度。在以上任何态样的又其它具体 实例中，有效浓度维持至少4至8、8至12或12至24 个小时。
在其它态样中，本发明提供给有变化倾向的患者一 种预防、降低或逆转适应不良心脏改变的方法，该方法 包含对患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中该抑制剂防 止心脏适应不良改变(例如，与高血压或选自由下列所构 成群组的病症有关的改变：心脏肥大、心脏收缩功能降 低、心脏舒张功能降低、心脏适应不良肥大症、收缩功 能持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、 大动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰 竭)。
在另一态样中，本发明提供给有需求的患者一种增 强心肌能量的方法，该方法包含对患者投予有效量的 PDE5抑制剂，其中投予该抑制剂增强了心肌能量。在其 它具体实例中，心肌能量的分析通过下列评估来进行： 相对于高能磷酸盐的运用(腺核苷三磷酸，ATP)的高能磷 酸盐的储存(磷酸基肌酸)的评估；相对于腺核苷二磷酸 (ADP)的ATP的通量的评估；ADP和无机磷酸盐水平的 评估；与总心脏工作量有关的心脏对氧气的消耗量的评 估；以及与总肌肉工作量有关的分离心肌对氧气的消耗 量的评估。
在另一态样中，本发明提供组合物以用来治疗选自 由下列所构成群组的病症：心脏肥大、心脏收缩功能降 低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能持 平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动 脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭， 该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少0.1至 200毫克的PDE5抑制剂，其中对患者投予该组合物使该 组合物在血浆中的有效浓度至少达0.1至100nM(例 如，0.1至75nM)。
在另一态样中，本发明提供用来治疗心脏肥大的组 合物，该组成物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少 0.1至200毫克的PDE5抑制剂。
在以上态样的各种具体实例中，对患者投予该组成 物，使该组合物在血浆中的有效浓度至少达0.1至100nM (例如，0.1至75、0.5至50、1至25、5至10、10至20、 20至30或30至40nM)。在其它具体实例中，该组合物 包括至少10、20、100或150毫克的PDE5抑制剂。在以 上态样的其它具体实例中，该组合物提供持续释放PDE5 抑制剂。在其它具体实例中，该组合物提供持续释放 PDE5抑制剂至少超过4至8、8至12或12至24个小时。 在以上态样的其它具体实例中，该组合物实质上由PDE5 抑制剂所构成。
在另一态样中，本发明提供包括组合物的药物包装， 而该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少5毫 克的PDE5抑制剂，其中该药物包装是用于治疗或预防选 自由下列所构成群组的病症：心脏肥大、心脏收缩功能 降低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能 持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大 动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭。
在相关的态样中，本发明提供包括组合物的药物包 装，该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少5 毫克的PDE5抑制剂，其中该药物包装是用于治疗或预防 心脏肥大。
在以上态样的各种具体实例中，该药物包装包含至 少10、20或100毫克的PDE5抑制剂。在其它具体实例 中，提供PDE5抑制剂持续释放的配方。在其它具体实例 中，该组合物实质上由PDE5抑制剂所构成。在其它具体 实例中，又包括对患者投予该组合物以治疗或预防心脏 肥大的文字说明书。
附图说明
第1A、1B和1C图显示用昔多芬(sildenafil)抑制 PDE5A来预防压力负载所引发的心脏肥大。第1A图显 示心脏截面(上部)和M型心动图(下部)，尺标为一毫米。 简称和其所示的表意义如下：Con：进行假(sham)手术的老 鼠-手术后3星期，TAC：横向大动脉结扎术(transverse aortic constriction，该处置诱发压力超载)，+/-Sil：有或 没有昔多芬治疗。未使用昔多芬治疗的动物，在持续的 压力负载下产生了明显的心脏肥大和扩张。到了9星期， 心脏明显地重塑并呈现显着的心脏功能降低。注意，心 动图显示出扩张和脏壁短缩的减少。使用昔多芬治疗的 动物，其心脏肥大和腔室扩张的发展，显示出有明显的 降低，且心脏功能保留。第1B图提供三张关于控制组、 TAC手术后三个星期和九个星期的老鼠的下列总结图： 心脏重量对胫骨长度的比率、心肌短缩分率的百分比 (percent fractional shortening从超音波心动图中获得)及 左心室收缩终期内径(心脏扩张/重塑和收缩功能的测 定)。第1B图中的缩写及意义如下：HW/TL为心脏重量/ 胫骨长度，FS为心肌短缩分率以及LV-ESD为左心室收 缩终期内径，是由心动图得知(平均值±平均值标准差； 样本数n≥6；*表对载剂达p＜0.001。在未非使用昔多 芬治疗的动物，其心脏肥大的情形明显增加，而使用昔 多芬治疗的，则心脏肥大的情形减少超过50％。心脏经 治疗后，其功能亦改善。第1C图为六张显微镜图和一张 总结图。显微镜图显示经过碘酸希夫氏-六亚甲四胺染色 (PAS-methenamine-stained)的来自经载剂以及经昔多芬 治疗的动物的心肌层。深蓝色反映间质纤维化 (interstitial fibrosis)。尺标为100微米。下部的柱状图显 示肌细胞横截面直径(CSD)的总结数据；*表对载剂治疗 达p＜0.01。在持续压力超载期间，用昔多芬治疗阻止了 心肌细胞肥大的恶化，并且亦抑制间质纤维化的发展。
第2图是剂量对应曲线，显示每日口服剂量改变时， 在老鼠体内所达到的血浆游离昔多芬浓度。当剂量为100 毫克/公斤/日(此为第1图及本申请案整体所述研究的使 用剂量)，血浆中游离昔多芬的浓度为10.4±5.7nM，非 常接近该化合物的半抑制浓度(IC50)。
第3A至3C图显示用昔多芬抑制PDE5A逆转了已发 生的心脏肥大。第3A图包括三张图，此三张图显示出一 个星期的TAC诱发心脏肥大而无腔室扩张。图中的缩写与 第1图相同。脏壁厚度及左心室舒张终期容积(LV-EDD) 由超音波心动图判定。第3B图(左边)为二张显微镜图， 显示出经PAS-六亚甲四胺染色的心肌层，在1星期 TAC(治疗前)时，呈现肌肉细胞肥大和间质纤维化。后续 用昔多芬治疗2星期(TAC-3星期，2星期昔多芬)降低了 该肥大和间质纤维化。尺标为100微米。第3B图(右边) 为数据总结图；*表对Con达p＜0.05；表对TAC1星期 达p＜0.05。第3C图显示用昔多芬逆转心脏肥大的图形。 数据开始于TAC1星期之后(两组在此时具有相同的肥大 初始状态)。接着将动物随机化以接受安慰剂或昔多芬治 疗。用昔多芬治疗的那一组在接下来的2个星期期间显 示出心脏肥大的降低和心脏功能(心肌缩短分率， fractional shortening)的维持。相反地，经安慰剂治疗者， 心脏肥大和心脏功能障碍都更为恶化(undergo progressive)。P值用于治疗效果的共变数分析。
第4A及4B图显示相较于控制组，经昔多芬治疗的心 脏重塑较少，且收缩和舒张功能改善。第4A图显示藉由 压力-容积关系全面性第评估活体内的心脏功能，使用包 括假手术控制组老鼠(Con)、以昔多芬治疗3星期的控制 组老鼠(3星期Sil)、有以昔多芬治疗或没有以昔多芬治疗 的3星期的TAC老鼠，以及先以TAC引发老鼠心脏肥大1 星期，之后再加入昔多芬治疗二星期(3星期TAC+延迟的 Sil2星期)。在所有有TAC处置的例子中，收缩压的增加 是相似的，并且未因为昔多芬的治疗而改变。因而，所 有先前所显示在心脏形态学上以及心脏功能上存在的变 化都与压力负载本身的任何变化无关。未经治疗的心脏 也显示了回圈向右偏移，以及收缩终期压力-容积的关系 (连接左上角的线)与肥大重塑一致。以昔多芬治疗的假手 术控制组心脏(即没有TAC诱发的压力超载)，没有改变心 脏功能。只有当心脏处于压力增加时，在本文的例子中 前述心脏所处的压力是由TAC压力负载所造成的，才有观 察到昔多芬的作用。在这种情况，压力-容积回圈偏移至 较小的容积，而收缩终期压力-容量的关系依然维持在它 的正常位置。这反映了重塑的预防和整体心脏功能的改 善。第4B图是一系列的六张图，呈现出关于老鼠心脏功能 参数的总结数据。左上图显示动脉弹性量-后负载 (afterload)的量测(Ea)。在所有使用TAC的模式中，由TAC 所造成的动脉弹性量的增加都是相似的，且不因昔多芬 的治疗而减少。右上图所显示的射出分率(EF)是净心脏 收缩功能的量测。慢性TAC造成EF减少，而在以昔多芬 合并(concomitant)治疗的动物，其EF恢复至正常水平，且 在昔多芬治疗延迟1星期的动物，其EF亦恢复至正常水 平(亦即，逆转实验，reversal experiment)。重要的是，EF 回复的发生并没有改变用昔多芬治疗的那些动物的压力 负载。中间二个图显示与心脏负载无关的收缩性量测：最 大力量指数(PMXI)和前负载再充盈搏功(preload recruitable stroke work，Msw)。与未经治疗的TAC相较， 心脏经昔多芬治疗时，这二个测量值都大大地获得改善。 下方的图呈现舒张功能的测量：Tau(等体积松弛时间常 数)；dP/dtmn-压力下降的峰率。TAC导致心脏松弛作用 的延长且反映在二个参数上，并且以昔多芬治疗的动物 亦恢复至正常程度。*表对Con和3星期Sil达p＜0.001；表 对所有其它组达p＜0.05；表对Con、3星期Sil及3星 期TAC达p＜0.01。
第5A至5D图显示另一种专一性PDE5a抑制剂 (EMD360527)预防经TAC(3星期)所诱发的心脏肥大发展 且同时改善心脏功能的能力。第5A图是一系列以福尔 马林固定的心脏截面图(左区块)，且二张图显示出在有以 EMD360527治疗或没有以EMD360527疗，在假手术控 制组老鼠和TAC术后3星期老鼠的心脏重量/胫骨长度 (HW/TL)比率(中间区块)与心肌细胞横截面直径(CSD，右 区块)。第5A图中的简称如下：Con：3星期载剂治疗的假手 术老鼠、EMD：3星期EMD360527治疗的假手术老鼠、TAC： 3星期载剂治疗的TAC老鼠，TAC+EMD：3星期 EMD360527治疗的TAC老鼠。*表对Con达p＜0.05；表对 以载剂治疗的TAC达p＜0.05。如以昔多芬治疗者， EMD360527治疗防止了心脏肥大和所伴随的腔室扩张和 重塑的发展。第5B图呈现代表性的M型超音波心动图(左 区块)，以及显示基于侵入式压力-容积插管(invasive pressure-volume)的心脏机转的三张总结图。第5B图所用 简称如前所述或如下：Ea代表的是由TAC所造成的心室 后负载的增加在有使用EMD360527和没有使用 EMD360527的情况都是一样的。与TAC组相较，EMD-TAC 组中的最大心脏力量指数(PMXI)上升，且等体积舒张时 间(Tau)显着缩短。这些数据与那些使用昔多芬(即，第4 图)所测得的结果几乎相同。*表对Con和EMD达p＜0.05； 表对所有其它组达p＜0.05。第5C图显示墨点图(dot blot) 以及分析心脏胎儿基因(cardiac fetal gene)表达的总结 图。第5C图用到的简称如下：ANP：A型钠利尿肽 (natriuretic peptide)、BNP：B型钠尿肽、βMHC：β肌凝蛋 白重链、αSkA：α骨骼肌动蛋白、钙处理蛋白(calcium handing protein，PLB)：受磷蛋白(phospholamban)、 SERCA：肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticular calcium ATPase)(上区块)。总结数据以GAPDH常态化(normalized) 表示(下区块)。TAC导致胎儿基因重演(recapitulation)- 钠尿肽、βMHC和αSkA的表达增加，而PLB和SERCA减少。 PDE5A抑制作用逆转了胎儿基因重演，并且增进了经TAC 所改变的Ca2+处理蛋白的表达。*表对Con达p＜0.05，表 对TAC达p＜0.05。第5D图显示总心肌cGMP水平(whole myocardial cGMP level)在仅有TAC处置的情况下增加， 但在以EMD360527治疗的TAC则有轻微的减少。如下张 图所呈现，此反应与使用昔多芬者所观察到的结果相似， 且与钠利尿肽表达的显着下降相符，尽管PDE5受抑制。 *表对Con和EMD达p＜0.05，表对TAC达p＜0.05。
第6A至6D图显示，在使用压力超载来刺激以造成心 脏肥大和重塑的心脏，其中的PDE5a活性增加。在这情况 中，昔多芬抑制了PDE5a对蛋白激酶G-1(PKG-1)的刺激。 第6A图是显示整个心脏的PKG-1活性的图。图中，*表 对Con达p＜0.05，表对以载剂治疗的TAC组达p＜0.05。 PKG-1由cGMP活化，如果昔多芬抑制PDE5，则PKG-1 活性将依次提高。在休息的情况下，抑制PDE5对PKG-1 活化的净效能微小。相反地，昔多芬显着地增加肥大/重 塑的心脏的PKG-1活性，上述之心脏是由3星期的TAC 所造成的。第6B图是显示在假手术控制组心脏(Con)和3 星期TAC心脏(TAC)中的总cGMP酯酶活性。基线处的总活 性百分比约为30％，而该活性是透过与专一性的PDE5 A 抑制剂(昔多芬或他达拉非(tadalafil))共培养而阻断。使 用IBMX的广效PDE抑制(broad PDE inhibition)作用当作 控制组而显示。随着压力超载持续(TAC)，总cGMP酯酶 的活性提高(*表p＜0.005)。由PDE5所贡献的活性占比 (proportion)亦提高到将近全部(酵素活性的100％增加) 的60％(利用二因子变异数分析，2-way ANOVA，p＜0.001)。 第6C图是显示整个心脏的cGMP水平的图，图中*表对 Con达p＜0.05。第6D图(上区块)呈现钙依赖钙调神经磷 酸酶(calcium-dependent phosphatase calcineurin，Cn) 和有丝分裂原活化激酶(mitogen activated kinase)-细胞 外信号调节激酶(ERK1/2)的二个西方墨点法。第6D图 (下区块)提供总结西方墨点法结果的二张图(每张图的 样本数n＝4至5)。ERK1/2的总结结果以磷(p)对总(t)蛋 白质的比率表示，图中，*表对Con达p＜0.05；表对以载 剂治疗的TAC组(TAC)达p＜0.05。一星期TAC增加上述两 种酵素的表达和活性。昔多芬使该效能减弱。在晚期的 TAC时间点(later TAC time point，9星期)，只有钙调神 经酶依旧有显着地增加。在以昔多芬共同治疗的心脏中， 钙调神经酶仍然减少。
第7A至7D图显示使用昔多芬抑制PDE5A，通过钙调 神经酶/NAT依赖的途径来预防新生老鼠的心肌细胞肥 大。第7A图(左区块)是一系列的三张显微镜图。这些显 微镜图显示了脱羟肾上腺素(phenylephrine，PE)对肌细胞 肥大的作用，如肌小节组织增加(sarcomere organization increased)所显示(第7A图α-肌动蛋白染色(x1000))。第 7B图(右区块)是以具组织化肌节(with organized sarcomeres)的肌肉细胞中，3H-白氨酸混入的百分比来定 量蛋白质(*表对Con达p＜0.05，表对PE达p＜0.05)。使用 昔多芬治疗，减少了PE所刺激的肌肉细胞中的肌节组织 和蛋白质合成。第7C图是一系列十张的显微镜图，显示 以偶合至β-半乳糖苷酶的NFAT促进剂转染后的肌细胞(x 200)。染成蓝色者表示NFAT活化作用。第7C图中的简称 如下：PE-脱羟肾上腺素，BK-BayK 8644，AdCn-腺病 毒过度表达钙调神经酶(calcineurin overexpression by adenovirus)。区块(1、3、5)是利用相差过滤器处理(phase contrast filter，+fil)，其它则没有(-fil)。第7D图是一系 列的三张图， 显示NFAT(亦即，β-半乳糖苷酶)的定量分 析活性(*表对Con达p＜0.05；表对肥大刺激(PE、BK或 AdCn)的p＜0.05)。用昔多芬治疗，抑制了由PE和由BayK 8644引起的NFAT活化作用。然而，昔多芬不能阻断以本 质上有活性的钙调神经酶来活化细胞中NFAT。此提供了 药品效能更接近的标的。
第8A至8F图为显示腺病毒转染效率的显微镜图。 第8A和8C图呈现用表达细胞核标靶的β-半乳糖苷酶 的腺病毒进行转染，以及用X-gal染色的各别盘中新生老 鼠(neonatal)肌肉细胞显微镜图。对应的盘第8B和8D图 是同样的细胞在没有相差的情况下所观察。第8E和8F 图显示一盘细胞的较低倍率(第8E图有相差，第8F图没 有相差)，用来显示转染的均一性。转染效率是一致的 (consistent)且接近95％。
第9A至9C图是显示在以写入NFAT促进剂与萤光素 酶偶合密码的腺病毒转染的新生老鼠肌细胞中，NFAT促 进剂活化作用的评估。细胞接着暴露至脱羟肾上腺素 (PE)、钙增强(calcium enhancement)(BK)或写入活性钙调 神经酶(AdCn)密码的腺病毒中，然后与载剂或昔多芬共 培养。培养四十八小时以后，细胞是藉由光度计 (luminometer)来评估萤光素酶的活性。数据是以常态化 至控制组水平的变化百分比显示。昔多芬(Sil)抑制PE， 而BK诱导NFAT促进剂活性，但非由AdCn所诱导的活性。 这些结果与使用NFAT促进剂偶合至β半乳糖苷酶的病毒 的发现类似。图中，*表对Con达p＜0.05，表对心脏肥大 刺激(hypertrophy stimulation，PE、BK或AdCn)达p＜0.05。
第10A至10E图显示通过抑制PDE5A使Akt途径失 活。第10A图为在1和9星期的TAC时，磷(p)Akt和总 (t)Akt的西方墨点法及总结数据。第10B图显示Akt活性 分析试验的结果。第10C图显示PI3K活性分析试验的结 果(3星期TAC时的数据，S：只用昔多芬治疗)。PI3K活性 和Akt活性在1和9星期TAC时，皆显着地增加，且使用 昔多芬治疗抑制达控制组水平。第10D图为显示GSK3β 表达和活化作用的西方墨点法和数据总结图。GSK3β是 调控心脏肥大的下游激酶，受Akt和其它激酶活化。在 TAC9星期时，昔多芬降低了由TAC诱导的GSK3β活性， 但在TAC1星期时则否。第10E图显示昔多芬慢性作用对 在心脏中过度表达构成式激活的(constitutive active)Akt 的转基因老鼠的效能。上方为死后的心脏，下方为根据 超音波心动图和死后分析的总结数据。尺标标记是1mm。 从系列超音波心电图和死后研究所得的左心室质量显示 于下方，所有比较中，以AktTG的情况其左心室质量较大 (p＜0.05)。Akt过度表达本身导致较严重的心室肥大，而 昔多芬并未使重量的增加改变。这表示，昔多芬对Akt信 号(亦即，第A至C图)的作用是在Akt本身上游。图中，* 表对控制组达p＜0.05；表对TAC达p＜0.05；C表控制组；T 表TAC；T+S表TAC+昔多芬，而以上简称适用于第10A 至10E所有图。
第11A至11F图显示PDE5A抑制剂的抗肾上腺素对 单离成体老鼠肌细胞的作用，所述的单离成体老鼠肌细 胞是暴露至异丙肾上腺素(ISO)，接着暴露至ISO与昔多 芬组合(ISO+SIL)。第11A图显示在暴露至ISO组中肌小 节的缩短量增加，但合并暴露至PDE5抑制剂(昔多芬)， 该作用显着地减弱。第11B图显示由萤光染料Indo-2AM 所测量的钙瞬变(calcium transient)。染料信号是以二种 放射波长的比率表现。第11C和11D图是定量由第11A 和11B图所显示结果的图表。第11E图包括未受损伤的 老鼠心脏结果的两个压力容积循环。ISO造成压力容量循 环变宽且使上角点(心脏收缩终期)向左偏移。这反映出收 缩力的增加。使用SIL治疗组，ISO反应减弱，且收缩力 的增加是可忽略的。第11F图是总结基于压力上升的最 大速率(dP/dtmax)数据的柱状图。投予ISO组有dP/dtmaz 的上升，在重新建立基线之后，仅单独投予昔多芬。这 对处在休息状态的心脏并没有作用。当添加ISO，并没有 观察到在dP/dtmax所预期的收缩性的增加。
第12A和12β图包括三张图(图12A)以及一张柱状 图(图12B)。第12A图显示在未受损伤的心脏PDE5A对 ISO所诱导的慢性心脏肥大的作用。第12B图显示PDE5A 抑制作用对心脏重量/胫骨长度比率的效能。ISO藉由渗 透式帮浦输注至老鼠达2周，导致在左心室近50％的肥 大(心脏质量/胫骨长度)。与PDE5a抑制剂共同治疗能后 预防此反应。
第13A和第13B图是显示心房钠利尿肽并不如 PDE5A抑制作用般压制与β-肾上腺素有关的心脏变化。 当ANP以静脉内输注，会造成心肌cGMP显着增加(右区 块)。这没有抑制经异丙基肾上腺素刺激的收缩(左区呈现 血压上升的最大速率；基线、投予ISO、重新建立后的基 线、仅使用ANP，及ANP+ISO)。这与如前文所示投予 PDE5a抑制剂所观察到的情况非常不同。而投予PDE5a 抑制剂所量得的cGMP显示有较少的不同。不希望被任 何特定理论局限，这些结果可能意味，高度分区化的信 号是造成PDE5a的心肌作用的原因。
第14A和14B图是显示PDE5a抑制剂(昔多芬；SIL) 对经异丙基肾上腺素(ISO)刺激的单离成体心脏肌肉细胞 的收缩和钙瞬变的直接作用，该收缩和钙瞬变是处在经 ODQ所造成的鸟苷酸(guanylate cyclase，sGC)抑制作用 的状态或并非处在该抑制状态。sGC产生接下来会被 PDE5a所代谢掉的cGMP。藉由sGC(ODQ)阻断cGMP的 合成来避免PDE5a抑制剂减弱ISO反应。这支持了cGMP 调节机制对PDE5a抑制作用的重要性。
第15A、15B，和15C图是显示PDE5a抑制剂在单 离的成体心脏肌肉细胞中增加cGMP的图表。第15A图 显示蛋白激酶G-1(PKG-1)在肌细胞的活性。单独使用昔 多芬(SIL)治疗或单独使用他达拉非(tadalafil，TAD)治疗 仅些微地提升PKG-1的活性(p＜0.05)，但上述合并ISO 使用会增加PKG-1的活性达70％(p＜0.001)，较单独使用 ISO增加达30％(p＜0.001)。第15B图显示cGMP的产生， 该图是以cGMP敏感的萤光共振能量转移(FRET)在控制 组老鼠新生鼠的肌细胞中量测的。SIL(500nM)和 ISO(100nM)使细胞cGMP(p＜0.01)上升，且在两者合并使 用时有更大的改变。NO供体DEA/NO(5μM)的添加使 cGMP上升的更多。第12C图是显示FRET相对变化的数 据总结(*表对于未经治疗的细胞达p＜0.05)。
第16A至16E图显示PDE5A蛋白质在单离的成体肌 细胞或在整个心脏肌肉层中的表达和活性。第16A图显 示PDE5A蛋白质在单离的成体肌细胞表达(所加载的蛋 白质如所显示)的西方点墨(上区块)以及呈现的4至6个 分离的点(在每一群中含n≥6个心脏)。观察到双条带的形 式(double banding pattern；a，b)。肌细胞所用的加载量 是100μg，然而肺脏的量是1μg。第6B图是显示PDE5a 基因在肺脏、单离的心脏肌肉细胞(MYO)，以及整个心 肌层(HRT)表达的相对水平。相较于在肺脏，PDE5a在心 脏中表达的水平非常低，且在单离的肌细胞中比在整个 心脏中还要低10倍。第16C是显示在整个尸体心脏 (murine heart)中的PDE5A蛋白质表达，且肺脏和心脏都 使用20μg的加载量确认了在蛋白质水平表达的差异。 第16D和16E图显示cGMP酯酶活性分析试验在整个心 脏以及单离的成体心脏肌肉细胞中的结果的图表。总活 性大幅的被广效PDE抑制剂IBMX(50μM)所减弱，而昔 多芬(SIL，100nM)将该活性减弱达约30％(p＜0.001)。这 显示在正常心脏肌肉和肌肉细胞总cGMP酯酶活性有约 30％是由PDE5a所造成。
第17A至17F图显示心肌细胞PDE5A分布的共轭焦 萤光染色。第17A图显示在肌细胞中PDE5A萤光染色是 出现在细胞质且更明显的是在z带(z-band，左区块)。对 应的染色是为z带蛋白质α-肌动蛋白(α-actinin)(右区 块)。第17B图显示PDE5A染色是藉由与阻断性肽 (blocking peptide，细胞信号公司(cell signaling)，5：1 BP/Ab(左区块)；右区块：α-肌动蛋白)。第17C图显示 PDE1C染色不受该阻断性肽所影响(PDE1C：左；右区块： α-肌动蛋白)。第17D图显示在另一个心脏肌细胞中的 PDE5A染色。第17E图显示同样的细胞针对一氧化氮合 成酶3(NOS3，或eNOS)来染色，而第17F图显示在z带 处该染色与PDE5a一起存在。
第18A和18B图显示得自健康人类实验体的数据， 该数据是在以β-肾上腺素促效剂-多巴酚丁胺刺激之前 和之后所得，且每个这样的试验都是在服用昔多芬单次 口服剂量之前和之后进行(100mg，口服)。第18A图是一 系列四个区块显示例示的多普勒血流及血压。第18B图 是显示最大LV心室力量指数的图表，该心室力量指数是 用来评估心脏收缩力的。对初始试验多巴酚丁胺增加该 等参数达将近200％(1)；在使用昔多芬之后(虚线；2)， 该刺激作用显着的减少了。
第19图是一系列六张图，显示在实验流程的每个时 期的峰值力量指数(峰值LV力量除以舒张终期)、射出分 数、搏出容积、心脏收缩血压以及总外围血管阻力。这 些图提供了在健康人类自愿者的安慰剂控制组、双盲、 昔多芬随机选取测试结果的总结图。在每个实验体，先 进行多巴酚丁胺刺激挑战试验(dobutamine stimulation challenge test)然后接着口服本研究的药物(安慰剂或昔 多芬)。B1及B2指的是最初和第二次(即在研究药物以后) 的基线，而D1和D2分别指的是在多巴酚丁胺输注期间在 口服本研究药物之前和之后所量测的结果。得自组内 RMANOVA测试的P值是代表在接受本发明药物之前对于 接受药物之后，经多巴酚丁胺刺激的反应的变化。D1对 于B1和D2对于B2(*表p＜0.001，表p＜0.005)的组内对照 亦显示其配对的t-试验。相较于安慰剂，昔多芬显着地降 低经多巴酚丁胺增强的收缩力。然而，对总外围血管阻 力没有显着的作用。
第20图是一系列的十二张图，显示在接受本研究药 物-昔多芬或安慰剂之前(B，●)和之后(A，○)， 由多巴酚 丁胺所造成血液动力功能的变化。每个患者的组内配对 是由线所连接的数据点所确认。平均值是以在每个数据 组的左边或右边的方块所显示。每个个别图表上方的p 值是表示在每个组群中第一和第二多巴酚丁胺反应(对 于基线的变化)的比较。在每一组配对的图形上方黑体字 的p值是代表基于多巴酚丁胺试验(在研究药物投予前或 投予后)、多巴酚丁胺(有存在或没有)以及研究药物(昔多 芬对于安慰剂)的3向互动(3-way interaction)的 RMANOVA。图21A至21F显示PdE5A抑制性质在NOS3 结合和金属结合蛋白酶(metalloproteinase)作用。图21A 显示肥大的变化在TAC心脏上与仿真老鼠的正常心脏比 较。图21B是西方点墨法操作在一个非变性的胶体，显 示在3个星期术后处理，在TAC心脏，当NOS3单体的 (N0S3-m)浓度增加时，NOS3二聚体(NOS3-d)降低了。这 是表示NOS解联，NOS3从酵素转换，而其酵素主要是 合成一氧化氮进而产生过氧化物。图21C(更低区)是一 对显微镜图显示超氧化物阴离子萤光探针 (dihydroethidium)(DHE)-一种氧化应力敏感染料-在仿真 和TAC的老鼠心肌层染色。图21C(上区)是一对图表表 示，在手术以后，在TAC老鼠三个星期，钙相关NOS活 性引起一氧化氮的降低。图21D是由NOS3增加造成过 氧化物形成的图表。图21E西方点墨法显示，NOS3二聚 体(280kD)在TAC老鼠三个星期在压力超载以后，量降 低了，且昔多芬(sildenafil)的处理防止了二聚体(280kD 带)的流失。图21F是明胶酶酶(gelatinase zymogen)谱显 示昔多芬(sildenafil)抑制明胶酶(gelatinase)活性(金属结 合蛋白酶(metalloproteinase)MMP-2和MMP-9，都为明 胶酶(gelatinases))。
图22A，22B和22C是西部点墨法(图22A)和二张图 表(图22B和C)显示TAC和TAC+昔多芬(sildenafil)处理 的小GTP结合蛋白质Rho A的表现和活化效用相当于它 的下游激酶与ρ激酶(Rho kinase)(ROCK1和ROCK2 )。 图22A表示，RhoA及ROCK2在老鼠曝露3星期TAC， 蛋白质表现量增加。二者皆因由昔多芬(sildenafil)处理 造成PDE5A抑制性质钝化。图22B和22C表示，RhoA和 整体ROCK在老鼠曝露于TAC三个星期活性增加。活性 的增加受到昔多芬(sildenafil)的抑制。
图23A和23B是六张磷酸化点墨显示STAT3磷酸 化。图23A表示，STAT3(信号转换器和转录活化剂3) 磷酸化(即；活化作用)在TAC条件下一个星期，三个星 期，及九个星期后，量都有增加。以昔多芬(sildenafil) 处理预防了这活化作用。图23B实验是说明出生鼠肌肉 细胞的实验结果，介白素6(IL-6)活化 STAT3而不是 STAT1。以昔多芬(sildenafil)处理可防止STAT的活化。 p-STAT3和t-STAT3是被磷酸化且在各条件下都有表现， 并且大致相似STAT1线。昔多芬(sildenafil)于STAT3 转录方面没有作用是因为t-STAT3是未改变的。更近一 步的比较证实STAT3的活性是受到沉默RNA(SiRNA)的 压抑。将STAT3量降低，反而增加STAT1表现和活性。 这是以昔多芬(sildenafil)处理时尚未观察到的。
图24A和24B表示，昔多芬(sildenafil)处理能增强 心肌能学。图24A(左区)是在手术之后三星期TAC心脏 的一个核磁共振光谱图像。心脏被显示在横切面。图24A (上区)是核磁共振光谱显示在心脏高能磷酸盐的新陈代 谢。图24B是图表，在三个星期手术以后，磷酸肌酸 (phosphocreatine)(PCr)之于整体ATP的值在TAC心脏组 织较低。这个效用会因昔多芬(sildenafil)处理而钝化。
发明说明
定义
″心脏肥大″意谓任一非预期的心肌细胞生长；相对 于身体尺寸增加了心脏腔室重量；或增加正常体积或已 变大腔室体积时的心脏腔室壁厚度。
″心脏病症″意谓任一心脏疾病或失调。
″心脏腔室重塑″意谓心脏组织非预期的形态改变以 反应病理生理学的刺激(例如，高血压、心肌梗塞、神经 激素压力、容量超载)。
″细胞重塑″意谓心脏细胞非预期的改变以反应病理 生理学刺激。细胞重塑的改变包括，但不受限于，下列 任一或多个的变化：肌肉细胞肥大、钙处理(例如，肌肉 细胞刺激造成细胞内的钙循环性改变；从细胞内部储存 处譬如肌浆网，吸取和释放钙；钙与收缩蛋白质或调节 蛋白质的交互作用)、活化电流(例如，钠)和再极化电位 流(例如，钾)。
″分子重塑″意谓心脏组织中基因转录或表现的改变 或是蛋白质生物活性的改变，以反应病理生理的刺激。
″增强心脏功能″意谓使心脏的帮浦作用和容积产生 有利的改变。
″适应不良心脏改变″意谓心脏或心脏细胞非预期的 变化，以反应病理生理的刺激。
″PDE5抑制剂″意谓抑制磷酸二酯酶-5水解cGMP的 化合物。PDE5抑制剂较佳为降低PDE5酵素活性至少5％ (例如，10％、15％、20％、30％、50％、60％、75％、85％、 90％或95％)。应用习知技术分析PDE5抑制剂活性，本 文中有描述(例如，实施例4)。
″治疗″意谓降低、抑制、减弱、减低、停止或稳定 疾病的发展或进程。
″疾病″意谓损伤或干扰细胞、组织或器官正常功能 的任何病症或失调。
″调控″意谓生物功能或活性的任何改变(例如，增加 或降低)。
″降低″或″增加″分别意谓至少5％程度的负向或正向 改变。改变程度可为5％、10％、25％、30％、50％、75％ 或甚至100％。
″降低心脏肥大″意谓在形态、细胞或分子重塑产生 至少5％的降低。
″逆转心脏肥大″意谓在形态、细胞或分子心脏表现 型上产生预期的改变， 其中该经改变的表现型实质上系 使正常心脏组织特征化者。
″患者″意谓哺乳动物譬如人类病患，或动物(例如： 啮齿类动物、牛、马、猪、羊、犬、猫或其它家里饲养 的哺乳动物)。
″有效量″是指足够产生有利或预期临床结果的量。
在本揭示中，″包含(comprises)″、″包含(compring) ″、”含有(containing)″及″具有(having)″等，能具有在美 国专利法中所认为的意义，能意谓″包括(includes)″、″包 括(including)″等；″实质上由...构成(consisting essentially of)″或”实质上由...构成(consists essentially)″ 同样具有在美国专利法中所认为的意义，系开放性的用 语，允许出现多于所列举者，只要所列举者的基本或新 颖特征不受该多于所列举者所改变，但排除先前技术的 具体实例。
发明方法
这种发明包含PDE5抑制剂，对于预防或治疗心脏病 情况是有用的。发明的构成和方法是在形态上，细胞上， 或分子再成型描绘心脏病情况的治疗或预防是有用的。 典型地，这样的再成型发生以反应血液动力学的应力譬 如高血压，瓣膜方面疾病，神经激素应力，心脏病梗塞， 或容量超载。这个发明根据某一部分发现，功能强大的 PDE5被表现于心脏组织；这些标定物于心脏的再成型和 功能都是有效的调节者；并且特殊环状鸟粪嘌呤3′，5′单 磷酸二酯酶(PDE5)处理或防止心脏肥大和其它心脏病情 况。
此文中方法包括投以对实验体(包括实验体辨识和 需要如何的治疗)及在此文中描述有效数量的化合物，或 本文描述的化合物在心脏组织产生有利的效用。辨认一 个实验体需要如何的治疗是在实验体或医疗保健专家的 评断，可能是主观(即；观点)或客观(即可由测试或诊断 方法测量)。
依照此文中被使用，术语″处理(treat)″，”处理 (treating)″，″处理(treatment)″等等，提到降低或改良不 稳定及/或症状随即结合。大家的评鉴是，虽不妨碍，但 处理一个病状或症状并不需要不符合程序的疗程，症状 或征兆随即马上被排除。
依照此文提及，术语″预防(prevent)″，″预防 (preventing)″，″预防(prevention)″，″预防疾病的治疗 (prophylactic treatment)″等等提到在实验体降低病状发 展或病况的可能性，但是病状或是病况的发展是危险且 易受影响的。
本文提及发明中的治疗方法(包括预防疾病的治疗) 一般包括构成有助于治疗上地效益，譬如PDE5抑制剂 (即；伐地那非(vardenafil)，他达拉非(tadalafil)，或昔多 芬(sildenafil))对实验体(即；动物，人)亦需要如此，包 括哺乳动物，特别是人。这样的治疗对实验体，特别是 人，遭受从(from)，具有(having)，易受影响(susceptiable)， 或在危险中成为一种心脏病疾病，病状，或其症状。判 断那些实验体″在危险中″可能藉由实验体的一个诊断测 试或观点或医疗保健提供者(即；基因测试，酵素或蛋白 质标记，标记(依照此中被定义)，家族史，等等)。本文 中化合物也许亦可使用于肥大，包括形态，细胞的，或 分子再成型所有其它病状的治疗。
心血管的功能
心脏病症和适应不良心脏变化(maladaptive cardiac alternation)、心室、细胞的、和分子重塑有关，该等心 脏病诸如心脏肥大、心脏收缩功能降低、心脏舒张功能 降低、适应不良肥大症、仍保有心脏收缩功能的心脏衰 竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉和僧帽瓣 疾病、肺动脉瓣疾病、肥大性心肌病变(例如，源于基因 或由次发性原因的肥大性心肌病变)、缺血后和梗塞后心 脏重塑和心脏衰竭。本发明的组成物可以用来在心脏功 能减低的实验体增强心脏功能。所想要的是，心脏功能 增加5％、10％或至少20％，或甚至增加了25％，50％或 75％这幺多。最有利地，心脏功能被增强或损伤被逆转， 因此功能是实质上正常的(例如，健康控制组实验体心脏 作用的85％、90％、95％或100％)。或者，该等分析试验 在以PDE5A抑制剂治疗之前、期间或之后用于监控实验 体的情况。增加心脏功能的治疗在发明的方法中是有用 的。
任意数量的标准方法对检验心血管功能是可用的。 较佳地，心血管功能在实验体(例如，人类)是使用非侵入 性的方法评估， 诸如藉由影像方法测量净心脏射出(net cardiac ejection)(射出分率(ejection fraction)、缩短分数 (fractional shorting)和心室收缩末期容量(ventricular end-systolic volume))，该等成像方法诸如超音波心动图、 核子或放射对比性造影心室造影术或核磁共振成像，且 心脏收缩的组织速率如藉由组织多普勒成像方法量测。 心脏收缩的收缩力亦可使用血压量测结合对心脏流出量 的评估或结合对容量(评估肌肉硬化的峰值(peak muscle stiffening))的评估而非侵入性地量测。心血管舒张功能的 量测包括心室顺应性，该性质典型由同时量测压力和容 量而量测，左心室早期舒张的充血率和松弛率(可由音波 多普勒量测而评估)。其它心脏功能的测量包括心肌收缩 力(myocardial contractility)、休息时的每搏输出量 (resting stroke volume)、休息时的心率、休息时的心脏 指数(cardiac index，每单位时间的心脏输出量 [L/minute]，坐着测量并除以身体表面积[m2])、总有氧 容量、运动时的心血管效能(cardiovascular performance)、 峰值运动能力(peak exercise capacity)、峰值氧气(O2)消 耗，或藉由在此技术领域中所广知的或在本文中描述的 任何其它方法。血管功能的量测包括总心室后负荷 (ventricular afterload)的判断，心室后负荷取决于数种因 素，包括周边血管阻力、大动脉阻抗(aortic impedance)、 动脉顺应性、波反射，和大动脉脉搏波速(aortic pulse wave velocity)。
评估心血管功能的方法包括以下一者或多者：多谱勒 超音波心动图、二维回音多谱勒成像、脉冲波多谱勒、 连续波多谱勒、示波臂套(oscillometric arm cuff)、组织 多谱勒成像、心脏导管、核磁共振成像、正子放射断层 摄影术、胸部X光、X-射线对比心室造影术、核子成像 心室造影术、计算机断层造影术成像、快速螺旋计算机 断层造影术成像(rapid spiral computerized tomographic imaging)、三维超音波心动图、侵入性心脏压力(invasive cardiac pressures)、侵入性心脏血流(invasive cardiac flows)、侵入性心脏压力容量循环(invasive cardiac cardiac pressur-volume loops)(电导导管)、非侵入性心脏 压力容量循环。
疾病预防和治疗的应用
心脏病是每年造成超过二 百四十万的美国人死亡 的典型慢性和进行性疾病。每年约有五十万的心脏衰竭 新病例，单单是在美国就有估计五百万名的患者有这种 疾病。早期预防对保留心脏功能可能是最有效的。本发 明的方法是想要用来预防以及逆转和心脏疾病有关的形 态学的、细胞的，和分子的重塑。在一个具体实例中， 是藉由对有发展成心脏病症风险的实验体投以有效量的 PDE5抑制剂，来预防心脏疾病。为了判断实验体发展成 心脏病况的倾向，该实验体的心脏病风险是使用在此技 术领域中任何已知的标准方法评估。心脏病风险最重要 的指针是年龄、遗传性因素、体重、抽烟、血压、运动 史，和糖尿病。心脏病风险其它的指针包括实验体的脂 肪概况(lipid profile)，该概况典型地是使用血液试验评 估，或其它与心脏病或高血压相关的生物标记。评估心 脏病风险的其它方法包括，但不限于，EKG压力测试、 铊压力测试、EKG、CT扫瞄、超音波心动图、核磁共振 成像研究、非侵入性和侵入性动脉搏图(arteriogram)，和 心脏导管术。
PDE5抑制性质亦有用于处理涉及心室、细胞的，以 及分子重塑的适应不良心脏变化，该等变化会导致心脏 功能障碍、肥大、扩张和其它的心脏病指针。有益地， 本发明的方法对在心脏组织内形态学、细胞和分子重塑 的降低是有用的，上述的心脏组织是处在和压力超载、 神经内分泌压力、心肌梗塞、或容量超载有关的压力之 下。因此，本发明的方法在具有不受控制的高血压或具 有对心脏造成压力的任何其它慢性必病症的病人是特别 有用的。
PDE5抑制剂
PDE5是在全身以及肺动脉和静脉平滑肌(venous smooth muscle)细胞表达-尤其是在海绵体(corpus cavernosum)。根据这个立场表示，PDE5抑制剂最初有兴 趣的是在于使血管舒张(vasodilatory)的效能。例如昔多 芬(sildenafil)，起初是基于预期它对扩张冠状动脉的能 力，而当作抗心绞痛的药物来研究。昔多芬的早期临床 研究是作为心绞痛的治疗，然而，结果是令人是失望的， 因为它对动脉扩张的效果非常轻微。这些临床研究发现 勃起功能的增进是投予昔多芬的常见副作用。昔多芬会 增进勃起，这是由于昔多芬藉由减少cGMP的分解而因 此在阴茎的血液循环中延长由于对性刺激的反应而由一 氧化氮所导致的血管扩张效能。同样的环核苷酸信号途 径调节了对正常勃起作用所必需的一氧化氮的平滑肌放 松效能。这条途径的下调是许多种形式的勃起功能障碍 的病理生理的问题核心。
昔多芬对PDE5是有选择性的。在本发现于本文报导 之前，PDE5在心肌里的水平(level)被认为在功能上无意 义的(functional insignificant)。确实，即使到了2003年 这幺近期，在医药界此类的主要回顾中所提及，并不知 道PDE5对心肌有直接影响，且对动脉血压有微小效用。 这告诉我们，PDE5抑制剂不会降低在左心的负载到足以 造成心脏功能或型态(亦即，肥大)的改变，亦不改造 (modify)分子和细胞的重塑。事实上，PDE5在休息情况 下(under rest condition)在心脏的调节仅扮演次要的角色 -就像是汽车的制动器在空转的汽车上仅有很少的效能。
让人惊讶地是，本文所报导的结果指出，PDE5A在 心脏遭受压力时扮演重要的角色，并且PDE5A抑制作用 预防和逆转了在遭受压力的心脏的形态学、细胞，和分 子的重塑，上述的压力是与压力超载、神经内分泌压力、 心肌梗塞，或容量超载有关。令人惊讶的是，在加诸于 心脏的负载完全没有任何改变的情况下，PDE5抑制剂在 心脏功能、左心脏功能、心脏肥大及分子与细胞的重塑 达到其治疗效能。
PDE5抑制剂在此技术领域已充分了解，包括，但不 限于，昔多芬(化合物1)、伐地那非(vardenafil)(化合物 2)、他达拉非(tadalafil)(化合物3)、EMD 360527、DA 8159 等，或由磷酸二酯酶-5phosphodiesterase-5(PDE5)抑制 cGMP水解的其它化合物。
化合物1
化合物2
化合物3
某些适用于本发明的化合物及其医药上可接受的盐 能以下式结构(式I)来表示：
式I
，式中，R1是H、C1-C3烷基、C3-C5环烷基或C1-C3 全氟烷基；R2是H、视需要经OH取代的C1-C6烷基、 C1-C3烷氧基、C3-C6环烷基或C1-C3全氟烷基；R3是 C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、C3-C67环烷基、 C1-C6全氟烷基或(C3-C6环烷基)C1-C6烷基；R4与所附 接的氮原子一起形成4-N-(R6)六氢吡嗪基；R5是H、 C1-C4烷基、C1-C3烷氧基、NR7R8或CONR7R8；R6 是H、C1-C6烷基、(C1-C3烷氧基)C2-C6烷基羟基C2-C6 烷基、(R7R8N)C2-C6烷基、(R7R8NCO)C1-C6烷基、 CONR7R8、CSNR7R8或C(NH)NR7R8；R7和R8各自独 立的为H、C1-C4烷基、(C1-C3烷氧基)C2-C4烷基或羟 基C2-C4烷基。
其它用于本发明的较佳化合物及其盐、水合物、氮 的氧化物和结构异构物，揭示在美国专利第6,362,178号 中，能以下式结构(式II)来表示：
，式中，
R1代表氢或具有达4个碳原子的直链或支链烷基；
R2代表具有达4个碳原子的直链烷基；
R3和R4相同或不同，各代表氢或具有达8个碳原子的直 链或支链烯基或烷氧基，或代表具有达10个碳原子的直 链或支链烷基链，该烷基链视需要有氧原子插入，并且 视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进 行单或多取代；三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、卤素、羧 基、苯甲氧羰基、具有达6个碳原子的直链或支链烷氧 羰基及/或由下式基团进行取代：-SO3H、-(A)a-NR7R8、 -O-CO-NR7′R8′、-S(O)b-R9、-P(O)(OR10)(OR11)、
及/或
式中，
a和b相同或不同，各代表数0或1；
A代表CO或SO2基；
R7、R7’、R8和R8’相同或不同，各代表氢或代表具有3 至8个碳原子的环烷基、具有6至10个碳原子的芳基、 5至6环员的不饱和、部份不饱和或饱和并视需要与苯基 幷合的杂环，而该杂环具有达3个选自由S、N和O所构 成群组的杂原子，上述环系统视需要经选自由下列所构 成群组的相同或不同取代基进行单或多取代：羟基、硝基、 三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、卤素、具有达6个碳原 子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基，或由式 -(SO2)C-NR12R13基团进行取代，式中，
c代表数0或1；
R12和R13相同或不同，各代表氢或具有达5个碳原子的 直链或支链烷基；或
R7、R7’、R8和R8’各代表具有达6个碳原子的直链或支 链烷氧基，或代表具有达8个碳原子的直链或支链烷基， 该烷基视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取 代基进行取代：羟基、卤素、具有6至10个碳原子的芳基、 具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基，或 由式-(CO)d-NR14R15基团进行取代，式中，
R14和R15相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基；
d代表数0或1；或
R7和R8及/或R7’和R8’与附接的氮原子一起形成5至7 环员饱和杂环，该杂环视需要可再含有选自由S和O所构 成群组的杂原子，或含有式-NR16基团，式中，
R16代表氢、具有6至10个碳原子的芳基、苯甲基、5 至7环员芳香族或饱和杂环，该杂环具有达3个选自由S、 N和O所构成群组的杂原子，该杂环视需要经甲基取代， 或代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基，该烷基视 需要经羟基取代；
R9代表具有达6至10个碳原子的芳基，或代表具有达4 个碳原子的直链或支链烷基；
R10和R11相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基，及/或在R3/R4下该以上所列的烷基链 视需要经具有3至8个碳原子的环烷基、具有6个到10 个碳原子的芳基取代，或经5至7环员部份不饱和、饱 和或不饱和并视需要与苯基幷合的杂环取代，该杂环可 含有达4个选自由S、N和O所构成群组的杂原子，或含 有式-NR17基团，式中，
R17代表氢、羟基、甲醯基、三氟甲基、具有达4个碳原 子的直链或支链醯基或烷氧基，或代表具有达6个碳原 子的直链或支链烷基，该烷基视需要经选自由羟基和具 有达6个碳原子的直链或支链烷氧基所构成群组的相同 或不同取代基进行单或多取代，其中芳基和杂环视需要 经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或 多取代：硝基、卤素、-SO3H、具有达6个碳原子的直链 或支链烷基或烷氧基、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基， 及/或经式-SO2-NR18R19基团进行取代，式中，
R18和R19相同或不同，各代表氢或具有达6个碳原子的 直链或支链烷基；及/或
R3或R4代表式-NR20R21基团，其中R20与R21具有如上 述R18与R19的界定，且与R18、R19相同或不同；及/或
R3或R4代表金刚基(adamantyl)，或代表下式基团：
或代表环烷基具有3至8个碳原子、芳基具有6至10个 碳原子，或代表5至7环员部份不饱和、饱和或不饱和 并视需要与苯基幷合的杂环，该杂环可含有达4个选自 由S、N和O所构成群组的杂原子，或含有式-NR22基团， 其中，
R22具有如上述R16的界定，且与R16相同或不同，或代表 羧基、甲醯基或具有达5个碳原子的直链或支链醯基， 其中环烷基、芳基及/或杂环视需要经选自由下列所构成 群组的相同或不同取代基进行单或多取代：卤素、三唑基 (triazolyl)、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、具有达6个 碳原子的直链或支链醯基或烷氧羰基、硝基，及/或经下 式基团进行取代：-SO3H、-OR23、-(SO2)eNR24R25、- P(O)(OR26)(OR27)，其中，
e代表数0或1；
R23代表下式基团：
，或代表环烷基具有3至7个碳原子，或代表氢或具有 达4个碳原子的直链或支链烷基，该烷基视情况经具有3 至7个碳原子的环烷基、苯甲氧基、四羟吡喃基、四羟 呋喃基、具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧 羰基、羧基、苯甲氧羰基或苯基取代，该苯基可经选自 由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或多取 代：具有达4个碳原子的直链或支链烷氧基、羟基和卤 素，及/或烷基视情况经式-CO-NR28R29或-CO-R30基团 进行取代，其中，
R28和R29相同或不同，各代表氢或具有达8个碳原子的 直链或支链烷基；或
R28和R29与附接的氮原子一起形成5至7环员饱和杂环， 该杂环视情况可再含有选自由S和O所构成群组的杂原 子；
R30代表苯基或金刚基；
R24与R25具有如上述R18与R19的界定，且与R18、R19 相同或不同；
R26与R27具有如上述R10和R11的界定，且与R10、R11 相同或不同，及/或为环烷基、芳基，及/或该杂环视情况 经具有达6个碳原子的直链或支链烷基取代而该烷基视 情况经羟基、羧基取代，经5至7环员杂环取代而该杂 环具有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原子，或 经式-SO2-R31、P(O)(OR32)(OR33)或-NR34R35基团取代， 其中，
R31代表氢或具有如上述R9的界定，且与R9相同或不同；
R32与R33具有如上述R10与R11的界定，且与R10、R11 相同或不同；
R34和R35相同或不同，各代表氢或具有达6个碳原子的 直链或支链烷基，而该烷视情况经羟基或具有达4个碳 原子的直链或支链烷基取代；或
R34和R35与所附接的氮原子一起形成5至6环员饱和杂 环，该杂环可再含有选自由S和O所构成群组的杂原子， 含有式-NR36基团，其中，
R36代表氢、羟基、具有达7个碳原子的直链或支链烷氧 羰基，或具有达5个碳原子的直链或支链烷基，该烷基 视情况经羟基取代；或
R3和R4与所附接的氮原子一起形成5至7环员不饱和或 饱和或部分不饱和且视需要与苯基幷合的杂环，该杂环 可视需要含有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原 子，或含有式-NR37基团，其中，
R37代表氢、羟基、甲醯基、三氟甲基、直链或支链醯基、 具有达4个碳原子的烷氧基或烷氧羰基，或代表具有达6 个碳原子的直链或支链烷基，而该烷基视情况经选自由 下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或多取代： 羟基、三氟甲基、羧基、具有达6个碳原子的直链或支 链烷氧基或烷氧羰基，或经式-(D)f-NR38R39、 -CO-(CH2)g-O-CO-R40、-CO-(CH2)h-OR41或 -P(O)(OR42)(OR43)基团取代，其中， g和h相同或不同，各代表数1、2、3或4； f代表数0或1；
D代表式-CO或-SO2基团；
R38和R39相同或不同，各具有如上述R7和R8的界定；
R40代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基；
R41代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基；
R42和R43相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基；或
R37代表式-(CO)i-E基团，其中，i代表数0或1；
E代表具有3至7个碳原子的环烷基或苯甲基，代表具有 6至10个碳原子的芳基或5至6环员芳香族杂环，而该 杂环具有达4个选自由S、N和O所构成群组的杂原子， 其中， 该上述环系统视需要经选自由下列所构成群组的 相同或不同取代基进行单或多取代：硝基、卤素、-SO3H， 具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基、羟基、三氟甲 基、三氟甲氧基，或经式-SO2-NR44R45基团取代，其中， R44和R45具有如上述R18和R19的界定，并且与R18、R19 相同或不同；或
E代表下式基团：
列在R3和R4下，与附接的氮原子一起形成的杂环，视需 要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单 或多取代，如果适合亦能重复：羟基、甲醯基、羧基、具 有达6个碳原子的直链或支链醯基或烷氧羰基、硝基， 和式-P(O)(OR46)(OR47)、
＝NR48或-C(O)jNR49R50，
其中，
R46和R47具有如上述R10和R11的界定，且与R10、R11 相同或不同；
R48代表羟基或具有达4个碳原子的直链或支链烷氧基；
j代表数0或1；以及
R49和R50相同或不同，且具有如上述R14和R15的界定， 及/或列在R3和R4下，与附接的氮原子一起形成的杂环， 视需要经具有达6个碳原子的直链或支链烷基取代，该 烷基视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代 基进行单或多取代：羟基、卤素、羧基、环烷基或环烷氧 基各具有3至8个碳原子、具有达6个碳原子的直链或 支链烷氧基或烷氧羰基，或经式-SO3H、-NR51R52或 P(O)O R53OR54，基团取代，其中，
R51和R52相同或不同，各代表氢、苯基、羧基、苯甲基 或具有达6个碳原子的直链或支链烷基或烷氧基；
R53和R54相同或不同且具有如上述R10和R11的界定，及 /或该烷基视需要经具有6至10个碳原子的芳基取代，而 该芳基可经选自由卤素、羟基、具有达6个碳原子的直 链或支链烷氧基所构成群组的相同或不同取代基进行单 或多取代，或经式-NR51’R52’基团取代，其中，
R51’和R52’具有如上述R51和R52的界定，且与R51、R52 相同或不同，及/或列在R3和R4下与附接的氮原子一起形 成的杂环，视需要经具有6至10个碳原子的芳基取代， 或经5至7环员饱和、部分不饱和或不饱和杂环取代， 而该杂环具有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原 子，视需要亦通过氮原子的功能进行键结，其中该环系 统可经羟基或经具有达6个碳原子的直链或支链烷基或 烷氧基取代；或
R3和R4一起与氮原子形成下式基团：
R5和R6相同或不同，各代表氢、具有达6个碳原子的直 链或支链烷基、羟基或代表具有达6个碳原子的直链或 支链烷氧基。
其它适合的化合物包括该些具下式III的化合物及其医 药上可接受的盐和溶剂合物(例如，水合物)：
式中，R0代表氢、卤素或C1-6烷基；
R1代表氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素C1-6 烷基、C3-8环烷基C1-3烷基、芳基C1-3烷基或杂芳基C1-3 烷基；
R2代表视需要经取代的单环芳香族环，而该芳香族环是 选自苯、噻吩、呋喃和吡啶，或视需要经取代的双环：
R2通过苯环的一个碳原子与该化合物分子的其它部分键 结，其中，幷合的A环是5至6环员的环，该环可为饱和 或部分不饱和或完全不饱和，且该A环包含碳原子和视需 要有一或二个选自氧、硫和氮的杂原子；以及
R3代表C1-3烷基的氢，或R1和R3一起代表3或4员的烷 基或烯基链；
某些较佳的化合物亦包含该些具下式IV的化合物， 及其医药上可接受的盐和溶剂合物(例如水合物)：
于式IV中，R0代表氢、卤素或C1-6烷基；R1代表氢、C1-6 烷基、卤素C1-6烷基、C3-8环烷基C1-3烷基、芳基C1-3 烷基或杂芳基C1-3烷基；以及R2代表视需要经取代的单 环芳香环，而该芳香环是选自苯、噻吩、呋喃和吡啶， 或R2代表视需要经取代的双环：
R2通过苯环的一个碳原子与该化合物分子的其它部分键 结，其中，幷合的A环是5至6环员的环，该环能为饱和 或部分不饱和或完全不饱和，且该A环包含碳原子和视需 要有一或二个选自氧、硫和氮的杂原子。
用在本发明中的其它较佳化合物群为具下式V的化 合物，及其医药上可接受的盐和溶剂合物(例如，水合 物)：
，式V中：
R0代表氢、卤素或C1-6烷基；
R1代表氢或C1-6烷基；
R2代表双环：
，该双环视需要能经一或多个选自卤素和C1-3烷基的基 团取代；以及
R3代表代表氢或C1-3烷基。
关于上述式IV中R1，作为芳基C1-3烷基基团中一部 份的”芳基”术语，意指苯基或经选自卤素、C1-6烷基、 C1-6烷氧基和亚甲二氧基(methylenedioxy)的一或多个 (例如，1、2或3)取代基所取代。作为杂芳基C1-3烷基基 团中一部份的”杂芳基”术语，意指噻吩基、呋喃基或吡 啶基，并视需要经选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基的一 或多个(例如，1、2或3)取代基所取代。作为C3-8环烷基 C1-3烷基基团中一部份的”C3-8环烷基”术语，意指单环 结构包含3至8个碳原子。适合的环烷基环实例包括C3-6 环烷基环：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
关于上述式IV中R2，可供选择的苯环取代物为选自 包含卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、CO2Rb、卤 素C1-6烷基、卤素C1-6烷氧基、氰基、硝基和NRaRb的 一或多个(例如，1、2或3)原子或基团，其中Ra和Rb各 为氢或C1-6烷基，或Ra亦能代表C2-7烷醯基或C1-6烷磺 醯基。用在该环系统其余部份的可供选择的取代基，是 选自包含卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和如上所定义芳基 C1-3烷基的一或多个(例如，1、2或3)原子或基团。双环：
，例如，能代表萘、杂环例如苯幷恶唑(benzoxazole)、 苯幷噻唑、苯幷异恶唑、苯幷咪唑、喹啉(quinoline)、吲 哚、苯幷噻吩、苯幷呋喃，或
，其中，n为整数1或2，X和Y各能代表CH2、O、S或 NH。
参见美国专利：第6,916,927、6,911,542、6,903,099、 6,878,711、6,872,721、6,858,620、6,825,197、6,774,128、 6,723,719、6,699,870、6,670,366、5,859,006和5,250,534 号。其它适用在本发明方法的PDE5抑制剂在WO 03/063875、WO 03/1012761、WO 2004/037183和WO 98/38168中有描述。所有这些专利和专利申请书整个并 于本说明书中作为参考文献。
商业上可购得的昔多芬有25、50或100毫克三种剂 量，具有大约10nM的IC50。血浆中有效浓度是在1nM至 250nM间，该范围底限是任一在1nM至249nM间的整数； 该范围上限是任一在2nM至250nM间的整数。较佳地， 血浆中有效浓度是在5nM至100nM间，而更佳地，是在 10nM至50nM间(例如，15nM、20nM、25nM、30nM、 40nM或45nM)。
商业可购得的他达拉非有5、10或20毫克三种剂量， 具有大约1nM的IC50。对健康受试者给予20毫克的他 达拉非口服剂量后，他达拉非迅速地被吸收，且在投药 二小时后有378奈克/毫升的最高血浆中浓度。血浆中有 效浓度较佳是在5nM至100nM间，更佳是在10nM至 50nM间(例如，15nM、20nM、25nM、30nM、40nM或 45nM)。他达拉非有相当大而明显的体积分布(Vd/F) 62.6升，和明显低的口服清除率(CL/F)2.48升/小时。 结果，他达拉非的平均排除半衰期是大约17.5小时，实 质上比昔多芬或伐地那非的平均排除半衰期长。
商业上可购得的伐地那非有5毫克、10毫克和20 毫克三种剂量，具有大约0.7nM的IC50。伐地那非的血浆 中有效浓度是在0.1nM至5.0nM间。
熟于本领域技艺者将明了，降低PDE5活性的任何化 合物是适用在本发明方法中。其它适用在本发明方法中 的化合物实例包括UK-343,664(Walker等人， Xenobiotica，31：651-664)、UK-427,387、UK-357903[1- 乙基-4-{3-[3-乙基-6，7-二氢-7-侧氧基-2-(2-吡啶甲 基)-2H-吡唑[4，3-d]嘧啶-5-基]-2-(2-甲氧乙氧基)-5-吡啶 磺醯基}六氢吡嗪](Gardiner等人，J.Pharmacol Exp Ther.2005，312：265-271)、UK-371800(Pfizer)、 UK-313794(Pfizer)和UK-343664(Abel等人， Xenobiotica.2001 31：665-76)；TA-1790 from Tanabe Seiyaku；CP-248、CP-461和磺酸舒林酸(exisulind) (Deguchi等人，Molecular Cancer Therapeutics803-809， 2002)，该些可从OSI Pharmaceuticals公司购得；吡唑啉 酮(pyrazolinone)；EMD82639(4-(4-[2-乙基苯胺]亚甲 基)-3-甲基-5-侧氧基-4，5-二氢吡唑-1-基)苯甲酸(Senzaki 等人，FASEB Journal.2001，15：1718-1726)；[7-(3-氯-4- 甲氧基苯甲胺基)-1-甲基-3-丙基-1-氢-吡唑[4，3-d]嘧啶-5- 基甲氧基]乙酸(EMD360527)、4-[4-(3-氯-4-甲氧基苯甲胺 基)苯[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-2-基]环己基甲酸、乙醇胺盐 (EMD221829)和5-[4-(3-氯-4-甲氧基苯甲胺基)-5，6，7，8- 四氢苯[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-2-基]戊酸(EMD171827)，该 些可从Merck KgaA(Darmstadt，德国)购得，且在例如 Scutt等人中有说明(BMC Pharmacol.2004，4：10)；3-(1- 甲基-7-侧氧基-3-丙基-6，7-二氢-1H-吡唑[4，3-d]嘧啶-5- 基)-N-[2-(1-甲基吡咯啶-2-基)乙基]-4-丙氧基苯磺醯胺 (DA-8259)；E-4021(Dukarm等人，Am.J.Respir.Crit. Care Med.，1999，160：858-865)；己酮可可碱(pentoxifylline) 及FR22934(Fujisawa)。
医药上的组合物
本发明特征为医药上制剂，包含PDE5A抑制剂(例 如，昔多芬、伐地那非、他达拉非或其类似物)与医药上 可接受的载体，其中该化合物用于治疗实质上任何的心 脏征候，该征候特征为心脏组织的肥大形态、细胞或分 子的重塑。本发明的医药制剂具有治疗和预防疾病上的 应用。在一具体实例中，医药组合物包括有效量的PDE5 抑制剂。该组合应无菌且含有治疗上适合投予患者(例 如，人类病患)的PDE5抑制剂有效重量或体积。发明的 组合物和组合能是医药包的一部分，其中PDE5抑制剂以 个别的剂量型式呈现。
用在预防或治疗投药的本发明医药组合物应无菌。 利用通过无菌滤膜(例如，0.2微米的膜)的过滤法；伽玛 照射或任何其它习知的适当方法，能很快地达到无菌状 态。治疗用的组合物一般置入至具有无菌存取口的容器 中，例如，静脉溶液袋或药水瓶，而该药水瓶有瓶塞可 遭皮下射入针所刺穿。当作为水溶液或复水用的冻干配 方使用时，这些组合物通常以单位或多重剂量容器(例 如，经密封的安瓿瓶或药瓶)的方式存放。
PDE5抑制剂视需要可与医药上可接受的赋形剂相 组合。本文中所用的术语″医药上可接受的赋形剂″指的 是一或多种可兼容的固体或液体填充剂、稀释剂或使胶 囊化的物质，适合用在投入人体。术语″载体″表示有机 或无机成份，为天然或合成的，与活性成分相结合以促 进投药。医药组合物的成分亦能与本发明的PDE5抑制剂 共同混合，且以无实质上削弱所欲医药功效的交互作用 的方式，彼此相混合。
本发明的化合物能含有医药上可接受的赋形剂。赋 形剂较佳为含有微量的添加剂，譬如增强等渗压性和化 学稳定性的物质。这样材料在使用的剂量和浓度上对使 用者而言是无毒的，该材料包括缓冲剂譬如磷酸盐、柠 檬酸盐、丁二酸盐、醋酸盐、乳酸盐、酒石酸和其它有 机酸或其盐；参-羟甲基氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、碳 酸盐和其它有机碱及其盐；抗氧化剂譬如抗坏血酸；低 分子量(例如，约小于十个残基)多肽例如聚精氨酸、聚赖 氨酸、聚谷氨酸和聚天门冬氨酸；蛋白质譬如血清白蛋 白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物譬如聚乙烯吡咯烷 酮(PVP)、聚丙二醇(PPGs)和聚乙二醇(PEGs)；胺基酸譬 如甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或精 氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物包括纤维素或其衍 生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或硫酸化碳水化合 物的衍生物譬如肝素(heparin)、硫酸软骨素(chondroitin) 或硫酸葡聚糖(dextran sulfate)；多价金属离子譬如二价 金属离子包括钙离子、镁离子和锰离子；螯合剂譬如伸 乙二胺四醋酸(EDTA)；糖醇譬如甘露糖醇或山梨糖醇； 平衡离子譬如钠或氨；及/或非离子型界面活性剂譬如聚 山梨酯或泊洛沙姆(poloxamer)。可包括使用其它添加剂 譬如安定剂、抗菌剂、惰性气体、流体和营养素补充剂 (即，林格氏(Ringer’s)葡萄糖)、电解质补充剂等，以上 该些添加剂能以惯用的量来使用。
如上所述的组合物能以有效量来投予。有效量将取 决于投药方式、所治疗的特殊病症和预期的结果。它亦 可能取决于病症的阶段、患者的年龄和身体情况、同步 治疗的性质，以及若有的话，像为执业医生所习知的因 素。为了用在治疗，需有足够的剂量来达到在医疗上期 望的结果。
对于患有心脏疾病或与形态肥大、细胞或分子重塑 有关的病症的患者而言，有效量是足够用来预防、降低、 稳定或逆转与心脏病肥大有关的改变。对于患有心脏疾 病或病症的患者而言，有效量是充分稳定、减慢或降低 与心脏病症有关的剂量。通常，本发明化合物的剂量大 约从每天0.01毫克/公斤至大约每天1000毫克/公斤。在 一具体实例中，对患者投予25、50、75、100、125、150 或200毫克的PDE5抑制剂譬如昔多芬。较佳地，投予 100毫克的PDE5抑制剂。期望的是，所投予PDE5抑制 剂的量足够在血浆中达到10、25、50、75或100nM的峰 值浓度。较佳地，峰值浓度为50nM。有效剂量范围从 0.1nM至200nM，该范围底限是任一在1至199间的整 数，而该范围上限是任一在2至200间的整数。期望的 是，有效剂量产生的血浆中游离PDE5抑制剂浓度范围为 10至50nM，但能高达200nM或低至1至2nM。浓度实 例包括0.1、1、5、10、20、25、30、40或50nM。据估 计，剂量范围从大约5至大约2000毫克/公斤将是适当的， 视所使用的特定PDE5a抑制剂而定。更低的剂量将用在 某些投药方式，譬如静脉投药和配药。在患者对最初使 用剂量的反应不充分时，可使用较高的剂量(或以不同、 较局部的传递途径提高有效剂量)，而该剂量在病人可耐 受的范围。亦可考量每天多重剂量使本发明组合物达到 适当的全身浓度。
可使用各种的投药途径。本发明的方法，一般而论， 可应用任何医疗上可接受的投药方式，意谓任何产生活 性化合物有效浓度而没有导致临床不可接受不利影响的 方式。在一较佳具体实例中，本发明的组成物是口服投 药。其它投药的方式包括直肠、局部、眼内、口腔、阴 道、脑池、脑室、气管、鼻、透过皮肤、在插入管内/上 或非经肠的投药途径。术语″非经肠″包括皮下、气管、 静脉、肌肉、腹膜或注入。静脉或肌肉途径对于长期疗 法和预防并不是特别适当，然而，在紧急情况时，该途 径也许较佳。包含本发明组合物的组合物能添加至生理 流体譬如血液。口服给药对预防性的治疗较佳，因为便 于患者使用以及投药剂量安排。
本发明的医药组合物能包含一或多种pH缓冲化合 物，以使配方的pH值维持在反映生理pH值的给定范围 内，譬如大约5.0至大约8.0的范围。使用于水溶液配方 的pH缓冲化合物能是氨基酸或氨基酸混合物，譬如组氨 酸或氨基酸譬如组氨酸和甘氨酸的混合物。可选择地， pH缓冲化合物较佳是维持配方的pH值在给定范围内， 譬如维持在大约5.0至大约8.0的范围，该缓冲化合物不 螯合钙离子。此pH缓冲化合物的实例包括，但不限制于， 咪唑和醋酸根离子。pH缓冲化合物可以任何适合维持配 方的pH值在给定范围内的量存在。
本发明的医药组合物亦能含有一或多种渗透调控 剂，即调控配方渗透性质(例如，渗透性、渗透莫耳浓度 及/或渗透压)至对使用者个体的血液和血细胞是可接受 的程度。渗透调控剂能为不螯合钙离子的试剂。渗透调 控剂能为任何熟于本领域技艺者所习知或可得到的用来 调控配方渗透性质的化合物。熟于本技艺者可依经验来 确定所给予的渗透调控剂用在本发明配方的适合性。适 当渗透调控剂类型的实例包括，但不限制为，盐类譬如 氯化钠和醋酸钠；糖譬如蔗糖、葡萄糖和甘露糖醇；氨 基酸譬如甘氨酸；及一或多种这些试剂的混合物及/或试 剂类型。渗透调控剂可以任何足够来调控配方渗透性质 的浓度存在。
包含本发明化合物的组合物能含有多价金属离子譬 如钙离子、镁离子及/或锰离子。任何有助于稳定该组合 物且对使用者无不利影响的多价金属离子可予以使用。 熟于本领域技艺者，根据这二个准则，能凭经验确定适 当的金属离子，此金属离子的适当来源已习知，其来源 包括无机和有机盐。
本发明的医药组合物亦能为非水溶液液体配方。可 使用任何适当的非水溶液液体，只要该液体对含在其中 的活性试剂赋予稳定性。较佳地，非水溶液液体是亲水 性液体。适当非水溶液液体的例子包括：甘油；二甲亚 砜(DMSO)；聚二甲基硅氧烷(PMS)；乙二醇譬如乙二醇、 二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(″PEG″)200、PEG300 和PEG400；及丙二醇譬如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二 醇(″PPG″)425、PPG725、PPG1000、PPG2000、PPG3000 和PPG4000。
本发明的医药组合物亦能为混合的水溶液/非水溶液 液体配方。任何适当的非水液体配方譬如以上所述者， 能与任何水溶液液体配方一起使用譬如以上所述者，只 要该混合的水溶液/非水溶液液体配方对包含在其中的化 合物赋予稳定性。较佳地，在此配方中的非水溶液液体 是亲水性液体。适当非水溶液液体的例子包括：甘油； DMSO；PMS；乙二醇譬如PEG200、PEG300和PEG400； 及丙二醇譬如PPG425、PPG725、PPG1000、PPG2000、 PPG3000和PPG4000。
适当的稳定配方能允许活性试剂以冷冻或未冷冻的 液体状态储存。稳定的液体配方能存放在至少-70℃的温 度，亦能存放在至少0℃的较高温度，或存放在大约0.1 ℃至大约42℃间，根据组合物的性质而定。熟于技艺者 都知道，蛋白质和多肽对pH、温度和其它因子多样性的 改变是相当敏感的，而这些可能会影响治疗的效力。
其它传递系统能包括缓慢释放、延迟释放或持续释 放的传递系统。这样的系统能避免本发明组合物的重复 投予，因而增加对患者和医师的便利性。有许多类型的 释放传递系统可利用，对该些具本领域通常技艺者而言 是习知的。他们包括聚合物基本系统譬如聚乳酸 (polylactides)(美国专利第3,773,919号、欧洲专利第 58,481号)、聚乳酸甘醇酸(poly(lactide-glycolide))、共 聚草酸酯(copolyoxalates)、聚己内酯、聚酯醯胺、聚原 酸酯(polyorthoesters)、聚羟丁酸譬如聚-D-(-)-3-羟丁酸 (欧洲专利第133,988号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸 盐共聚合物(Sidman，K.R.等人，Biopolymers22： 547-556)、聚2-羟乙基异丁烯酸或乙酸伸乙基乙烯酯 (ethylene vinyl acetate)(Langer，R.等人，J.Biomed. Mater. Res.15：267-277；Langer，R.Chem.Tech. 12：98-105)，和聚酸酐。
持续性释放组合物的其它例子包括有具体化形状的 半通透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。传递系统亦 包括非聚合物系统，他们是：油脂包括甾醇譬如胆固醇、 胆固醇酯类和脂肪酸，或中性油脂譬如单、双和三甘油 酯；水凝胶释放系统譬如生物衍生出的生物再吸收水凝 胶(即，几丁质水凝胶或几丁聚糖水凝胶)；硅橡胶 (sylastic)系统；胜肽系系统；蜡涂层；使用习知结合剂和 赋形剂的压缩药片；部份融合的插入管等。具体例子包 括，但不限制为：(a)浸蚀系统，其中该试剂以在基质内 的形式包含在该系统中，而基质例如为该些美国专利第 4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660所揭示者； 及(b)扩散系统，其中活性成分以受控制的速率通透过聚 合物，而该聚合物例如为美国专利第3,832,253和 3,854,480所揭示者。
传递系统的其它类型能使用于发明方法和组合物的 是胶体分散系统。胶体分散系统包括油脂系的系统，包 括水包油乳化液、微胶粒、混合的微胶粒和微脂体。微 脂体是人造膜水泡，作为在活体内或在活体外的传递载 体。单层大水泡(LUV)的尺寸范围为0.2至4.0微米，能 将巨大的分子封入至水溶液内部，然后以具生物活性的 型式载送至细胞中(Fraley，R.，和Papahadjopoulos，D.， Trends Biochem.Sci.6：77-80)。
微脂体能通过与特定配位子譬如单株抗体、糖、醣 脂质或蛋白质的偶合而瞄准至特定的组织。微脂体可从 Gibco BRL公司购得，例如LIPOFECTINTM和 LIPOFECTACETM，是由阳离子脂质譬如氯化N-[1-(2，3- 二油基氧基)-丙基]-N，N，N-三甲铵(DOTMA)及溴化二甲 基二(十八基)铵(DDAB)。制造微脂体的方法为本领域所 习知，在许多出版物里已有叙述，例如德国专利D E 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国) 82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (美国)77：4030-4034(1980)；欧洲专利EP52,322；EP 36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利 申请案83-118008；美国专利4,485,045及4,544,545；以 及EP 102,324。微脂体亦已由Gregoriadis，G.于Trends Biotechnol.，3：235-241作回顾。
其它类型的载具是生物兼容性的微粒子或适于植入 哺乳动物使用者的植入管。依据本发明方法，适用的生 物浸蚀植入管揭示在PCT国际申请案PCT/US/03307(公 开号WO 95/24929，标题为″聚合物基因传递系统″)。 PCT/US/0307描述了在适当启动子的控制下，用于含外 生基因的生物兼容、较佳为生物可分解的聚合物基质。 能使用聚合物基质来达到患者体内外生基因或基因产品 的持续释放。
聚合物基质较佳为微粒子的形式，譬如微球体(试剂 分散在整个固体聚合物基质中)或微胶囊(试剂存放在聚 合物壳的核心中)。前述聚合物的微胶囊含有药物，已揭 示在例如美国专利5,075,109中。其它用于含试剂的聚合 物基质形式包括薄膜、涂层、胶体、植入管和支架。选 择聚合物基质装置的尺寸和组合物，以在导入基质的组 织中产生有利的释放动力学。又根据将使用的传递方法， 选择聚合物基质的尺寸。较佳地，当使用气胶路径时， 聚合物基质和组合物是包含在表面活性剂载具内。能选 择聚合物基质组合物，使二者都具有令人满意的降解速 率，并亦可由生物黏着剂材料所形成，以进一步增加转 移的效率。亦能选择非降解而是通过扩散方式在一段时 间内进行释放的基质组合物。传递系统亦能为具生物兼 容性的微球体，适合用于局部、特定位置的传递。这样 的微球体揭露在Chickering，D.E.，等人，Biotechnol. Bioeng.，52：96-101；Mathiowitz，E.，等人，Nature 386： 410-414。
能应用非生物可分解和生物可分解的聚合物基质来 将本发明的组合物传递至患者。这样的聚合物可为天然 或合成的聚合物。选择聚合物的根据是所期望的释放时 间期，通常为数小时至一年或更长。典型地，释放期间 从数小时至3至12个月是最适合的。聚合物视需为水凝 胶的型式，其在水中能吸收的量大约高达其重量的90％， 并且视需要进一步与多价离子或其它聚合物交联。
能用来形成生物可分解的传递系统的合成聚合物实 例包括：聚醯胺、聚碳酸酯、聚烯(polyalkylenes)、聚乙 二醇、聚烯氧化物(polyalkylene oxides)、聚烯对苯二甲 酸酯(polyalkylene terephthalates)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、 聚乙烯酯、聚乙烯卤化物(poly-vinyl halides)、聚乙烯吡 咯烷酮、聚羟乙酸(polyglycolides)、聚硅氧烷、聚氨基 甲酸酯(polyurethanes)和其共聚物、烷基纤维素、羟烷基 纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酯和 异丁烯酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙织 维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素 乙酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素乙酸丁酸酯、纤维素乙 酸邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三乙酸酯、纤 维素硫酸钠盐、聚异丁烯酸甲酯、聚异丁烯酸乙酯、聚 异丁烯酸丁酯、聚异丁烯酸异丁酯、聚异丁烯酸己酯、 聚异丁烯酸异癸酯、聚异丁烯酸月桂酯、聚异丁烯酸苯 酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、 聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚乙烯 氧化物、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯乙酸 酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、和乳酸及 羟乙酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酸酯、聚丁酸、聚戊酸、 乳酸-己内酯共聚合物，和天然聚合物譬如藻酸盐和其它 多醣体包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物 (代替物，加入化学基团例如烷基、烯基、羟化、氧化和 其它该些熟于本技艺者常用的修饰)、白蛋白和其它亲水 性蛋白质、玉米蛋白和其它醇溶性蛋白和疏水性蛋白、 其共聚物和混合物。通常，这些材料的降解不是通过酵 素水解就是暴露于体内水中，利用表面或整体的侵蚀。
治疗方法
在一具体实例中，本发明提供抑制患者心脏中PDE5 的方法，包含对患者投予PDE5抑制剂有效量的步骤，较 佳地，额外包含医药上可接受的载体作为组合物的一部 分。较佳地，这个方法是应用在治疗患有心脏病症或对 心脏病症敏感的患者，而该心脏病症选自由心脏肥大、 收缩功能降低、舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩 功能持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、 大动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰 竭。其它具体实例包括本说明书中的任何方法，其中该 患者经确认须要做该征候的治疗。
本发明的另一态样，是在制造用来增强患者心脏功 能或降低患者心脏形态上、细胞或分子的重塑的药剂时， 使用PDE5抑制剂。较佳地，该药剂是用来治疗或预防患 者前述所提的疾病、病症或症候。
套组
本发明提供套组用来治疗或预防与心脏肥大包括 形态上、细胞或分子重塑有关的心脏病症。在一具体实 例中，该套组包括药物包装，而该药物包装包含有效量 的PDE5抑制剂(例如，PDE5a抑制剂譬如昔多芬)。较 佳地，该组合物是以单位剂量型式呈现。在一些具体实 例中，该套组包含无菌容器，而该容器含有治疗或预防 用的组合物；这样的容器能是盒、安瓿瓶、瓶子、小瓶 子、管、包、袋、泡壳包装、或其它习知的容器。这样 的容器能由塑料、玻璃、积层纸、金属箔或其它适合承 载药剂的材料所制成。
如果所要的本发明组合物或其组合，与用来指示将 它们投予有与心脏肥大相关的病症演变或存在演变风险 的患者的说明书一起提供，则该说明书一般包括关于使 用该化合物来治疗或预防与心脏肥大相关的信息。在另 一具体实例中，该说明书包括至少下列一项：化合物或 化合物组合的叙述；治疗心脏病症或其征候的剂量安排 和投药方式；预防方法；警告；征候；反向症候；过量 用药信息；有害反应；动物药理；临床研究；及/或参考 文献。用药说明书可直接印在容器上(当有时)，或作为卷 标贴到容器，或作为分开的纸片、小册子、卡片 或折页 而放置在容器中内或与容器一起提供。
以下实施例用来阐述本发明，但并不用来限制本发 明。该些熟于本技艺者将了解，在符合以上所述的发明 下，以下所提供的特殊结构可用许多方式来进行改变， 而仍保留该化合物或其组合的关键特性。
在一态样中，本发明大抵是强化患者(例如，人类病 患)心脏功能的方法，这些有心脏病症的患者选自由下列 所构成的群组：心脏肥大、心脏收缩功能降低、心脏舒 张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能持平的心脏衰 竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉狭窄、肥 大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭。方法包含对 患者投予有效的PDE5抑制剂量，由投予抑制剂来增强心 脏功能。在一具体实例中，该方法降低或逆转了心脏腔 室重塑、心脏扩张、心肌细胞重塑(例如，降低肌肉细胞 肥大)或分子的重塑。在另一具体实例中，PDE5抑制剂 降低了选自由下列所构成群组的试剂的表达或生物活 性：金属蛋白酶、钙调神经酶(calcineurin)、有丝分裂原 活化激酶(mitogen activated kinase)、Akt激酶、活化T 细胞的核因子(NFAT)，RhoA及Rho激酶、PI3激酶、 gpl30/Stat-3途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和 氧化氮合成酶未偶合有关联的试剂以及和氧化压力相关 的试剂。在另一具体实例中，PDE5抑制剂通过蛋白激酶 G来增强依赖于cGMP的信号。又在另一具体实例中， 心脏腔室、细胞或分子的重塑是由刺激所引发(例如，压 力超载、神经激素压力、心肌梗塞或容量超载)。又在另 一具体实例中，通过测量与负载无关的松弛速率；测量 与负载无关的心脏收缩性；测量与负载无关的心脏射出 容积；或量测与负载无关的收缩末期容积，来评估心脏 功能。使用选自由下列所构成群组的分析方法来测量心 脏的功能：多普勒超音波心动图、二维回音多普勒、脉冲 波多普勒、连续波多普勒、示波臂套(oscillometric arm cuff)、心导管插入术、核磁共振图像、正子放射型电脑 断层扫描、胸部X光、射出分率测定(ejection fraction test)、心动图、核子扫描、侵袭性心脏压力、侵袭性和 非侵袭性地测量心脏压力-容积循环(电导心导管)。
在另一态样中，本发明提供给有心脏肥大倾向的患 者(例如，人类病患)一种预防、降低或逆转心脏肥大的方 法，该方法包含对患者投予有效剂量的PDE5抑制剂，由 投予该抑制剂来预防心脏肥大。
在另一态样中，本发明提供给有心脏扩张倾向的患 者(例如，人类病患)一种预防、降低或逆转心脏扩张的方 法，该方法包含对患者投予有效剂量的PDE5抑制剂，由 投予抑制剂来预防心脏扩大。
以上任何态样的各种具体实例中，PDE5抑制剂降低 心脏腔室的重塑；降低细胞的重塑(例如，通过降低肌肉 细胞大小)；或降低分子的重塑(例如，通过调节选自由下 列所构成群组的试剂的表达或生物活性：金属蛋白酶、 钙调神经酶、有丝分裂原活化激酶、Akt激酶、活化T 细胞的核因子、RhoA及Rho激酶、PI3激酶、gpl30/Stat-3 途径成分、硝基酪氨酸、氧化氮合成酶、和氧化氮合成 酶未偶合有关联的试剂以及和氧化压力相关的试剂。在 一具体实例中，PDE5抑制剂改变试剂的活化作用。在另 一具体实例中，PDE5抑制剂通过蛋白激酶G来增强依赖 于cGMP的信号。
在以上任何态样的各种具体实例中，用PDE5抑制剂 来治疗心脏病症，不需要调控纤维化过程或调控压力负 载。在以上任何态样的其它具体实例中，PDE5抑制剂增 强了与动脉血压效果无关、与肺脏血压效果无关、或与 血管扩张效果无关的心脏功能。在以上任何态样的各种 具体实例中，所投予PDE5抑制剂的浓度，达到血浆中有 0.25倍半抑制浓度0.25×IC50、0.5×IC50、相当于 IC50、5×IC50、10×IC50或50×IC50的PDE5抑制剂。 在以上任何态样的其它具体实例中，PDE5抑制剂选择性 地抑制PDE5。在以上任何态样的又其它具体实例中，所 投予PDE5抑制剂在血浆中达到IC50为10nM。在以上任 何态样的其它具体实例中，所投予PDE5抑制剂在血浆中 达到50nM的峰值浓度。在以上任何态样的又其它具体 实例中，所投予PDE5抑制剂在血浆中达到0.1至100、 0.1至75.0、0.5至50.0、5至10、10至20、20至30或 30至40nM的有效浓度。在以上任何态样的又其它具体 实例中，有效浓度维持至少4至8、8至12或12至24 个小时。
在其它态样中，本发明提供给有变化倾向的患者一 种预防、降低或逆转适应不良心脏改变的方法，该方法 包含对患者投予有效量的PDE5抑制剂，其中该抑制剂防 止心脏适应不良改变(例如，与高血压或选自由下列所构 成群组的病症有关的改变：心脏肥大、心脏收缩功能降 低、心脏舒张功能降低、心脏适应不良肥大症、收缩功 能持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、 大动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰 竭)。
在另一态样中，本发明提供给有需求的患者一种增 强心肌能量的方法，该方法包含对患者投予有效量的 PDE5抑制剂，其中投予该抑制剂增强了心肌能量。在其 它具体实例中，心肌能量的分析通过下列评估来进行： 相对于高能磷酸盐的运用(腺核苷三磷酸，ATP)的高能磷 酸盐的储存(磷酸基肌酸)的评估；相对于腺核苷二磷酸 (ADP)的ATP的通量的评估；ADP和无机磷酸盐水平的 评估；与总心脏工作量有关的心脏对氧气的消耗量的评 估；以及与总肌肉工作量有关的分离心肌对氧气的消耗 量的评估。
在另一态样中，本发明提供组合物以用来治疗选自 由下列所构成群组的病症：心脏肥大、心脏收缩功能降 低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能持 平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动 脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭， 该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少0.1至 200毫克的PDE5抑制剂，其中对患者投予该组合物使该 组合物在血浆中的有效浓度至少达0.1至100nM(例 如，0.1至75nM)。
在另一态样中，本发明提供用来治疗心脏肥大的组 合物，该组成物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少 0.1至200毫克的PDE5抑制剂。
在以上态样的各种具体实例中，对患者投予该组成 物，使该组合物在血浆中的有效浓度至少达0.1至100nM (例如，0.1至75、0.5至50、1至25、5至10、10至20、 20至30或30至40nM)。在其它具体实例中，该组合物 包括至少10、20、100或150毫克的PDE5抑制剂。在以 上态样的其它具体实例中，该组合物提供持续释放PDE5 抑制剂。在其它具体实例中，该组合物提供持续释放 PDE5抑制剂至少超过4至8、8至12或12至24个小时。 在以上态样的其它具体实例中，该组合物实质上由PDE5 抑制剂所构成。
在另一态样中，本发明提供包括组合物的药物包装， 而该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少5毫 克的PDE5抑制剂，其中该药物包装是用于治疗或预防选 自由下列所构成群组的病症：心脏肥大、心脏收缩功能 降低、心脏舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩功能 持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大 动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰竭。
在相关的态样中，本发明提供包括组合物的药物包 装，该组合物包含在医药上可接受的赋形剂中的至少5 毫克的PDE5抑制剂，其中该药物包装是用于治疗或预防 心脏肥大。
在以上态样的各种具体实例中，该药物包装包含至 少10、20或100毫克的PDE5抑制剂。在其它具体实例 中，提供PDE5抑制剂持续释放的配方。在其它具体实例 中，该组合物实质上由PDE5抑制剂所构成。在其它具体 实例中，又包括对患者投予该组合物以治疗或预防心脏 肥大的文字说明书。
附图说明
第1A、1B和1C图显示用昔多芬(sildenafil)抑制 PDE5A来预防压力负载所引发的心脏肥大。第1A图显 示心脏截面(上部)和M型心动图(下部)，尺标为一毫米。 简称和其所示的表意义如下：Con：进行假(sham)手术的老 鼠-手术后3星期，TAC：横向大动脉结扎术(transverse aortic constriction，该处置诱发压力超载)，+/-Sil：有或 没有昔多芬治疗。未使用昔多芬治疗的动物，在持续的 压力负载下产生了明显的心脏肥大和扩张。到了9星期， 心脏明显地重塑并呈现显着的心脏功能降低。注意，心 动图显示出扩张和脏壁短缩的减少。使用昔多芬治疗的 动物，其心脏肥大和腔室扩张的发展，显示出有明显的 降低，且心脏功能保留。第1B图提供三张关于控制组、 TAC手术后三个星期和九个星期的老鼠的下列总结图： 心脏重量对胫骨长度的比率、心肌短缩分率的百分比 (percent fractional shortening从超音波心动图中获得)及 左心室收缩终期内径(心脏扩张/重塑和收缩功能的测 定)。第1B图中的缩写及意义如下：HW/TL为心脏重量/ 胫骨长度，FS为心肌短缩分率以及LV-ESD为左心室收 缩终期内径，是由心动图得知(平均值±平均值标准差； 样本数n≥6；*表对载剂达p＜0.001。在未非使用昔多 芬治疗的动物，其心脏肥大的情形明显增加，而使用昔 多芬治疗的，则心脏肥大的情形减少超过50％。心脏经 治疗后，其功能亦改善。第1C图为六张显微镜图和一张 总结图。显微镜图显示经过碘酸希夫氏-六亚甲四胺染色 (PAS-methenamine-stained)的来自经载剂以及经昔多芬 治疗的动物的心肌层。深蓝色反映间质纤维化 (interstitial fibrosis)。尺标为100微米。下部的柱状图显 示肌细胞横截面直径(CSD)的总结数据；*表对载剂治疗 达p＜0.01。在持续压力超载期间，用昔多芬治疗阻止了 心肌细胞肥大的恶化，并且亦抑制间质纤维化的发展。
第2图是剂量对应曲线，显示每日口服剂量改变时， 在老鼠体内所达到的血浆游离昔多芬浓度。当剂量为100 毫克/公斤/日(此为第1图及本申请案整体所述研究的使 用剂量)，血浆中游离昔多芬的浓度为10.4±5.7nM，非 常接近该化合物的半抑制浓度(IC50)。
第3A至3C图显示用昔多芬抑制PDE5A逆转了已发 生的心脏肥大。第3A图包括三张图，此三张图显示出一 个星期的TAC诱发心脏肥大而无腔室扩张。图中的缩写与 第1图相同。脏壁厚度及左心室舒张终期容积(LV-EDD) 由超音波心动图判定。第3B图(左边)为二张显微镜图， 显示出经PAS-六亚甲四胺染色的心肌层，在1星期 TAC(治疗前)时，呈现肌肉细胞肥大和间质纤维化。后续 用昔多芬治疗2星期(TAC-3星期，2星期昔多芬)降低了 该肥大和间质纤维化。尺标为100微米。第3B图(右边) 为数据总结图；*表对Con达p＜0.05；表对TAC1星期 达p＜0.05。第3C图显示用昔多芬逆转心脏肥大的图形。 数据开始于TAC1星期之后(两组在此时具有相同的肥大 初始状态)。接着将动物随机化以接受安慰剂或昔多芬治 疗。用昔多芬治疗的那一组在接下来的2个星期期间显 示出心脏肥大的降低和心脏功能(心肌缩短分率， fractional shortening)的维持。相反地，经安慰剂治疗者， 心脏肥大和心脏功能障碍都更为恶化(undergo progressive)。P值用于治疗效果的共变数分析。
第4A及4B图显示相较于控制组，经昔多芬治疗的心 脏重塑较少，且收缩和舒张功能改善。第4A图显示藉由 压力-容积关系全面性第评估活体内的心脏功能，使用包 括假手术控制组老鼠(Con)、以昔多芬治疗3星期的控制 组老鼠(3星期Sil)、有以昔多芬治疗或没有以昔多芬治疗 的3星期的TAC老鼠，以及先以TAC引发老鼠心脏肥大1 星期，之后再加入昔多芬治疗二星期(3星期TAC+延迟的 Sil2星期)。在所有有TAC处置的例子中，收缩压的增加 是相似的，并且未因为昔多芬的治疗而改变。因而，所 有先前所显示在心脏形态学上以及心脏功能上存在的变 化都与压力负载本身的任何变化无关。未经治疗的心脏 也显示了回圈向右偏移，以及收缩终期压力-容积的关系 (连接左上角的线)与肥大重塑一致。以昔多芬治疗的假手 术控制组心脏(即没有TAC诱发的压力超载)，没有改变心 脏功能。只有当心脏处于压力增加时，在本文的例子中 前述心脏所处的压力是由TAC压力负载所造成的，才有观 察到昔多芬的作用。在这种情况，压力-容积回圈偏移至 较小的容积，而收缩终期压力-容量的关系依然维持在它 的正常位置。这反映了重塑的预防和整体心脏功能的改 善。第4B图是一系列的六张图，呈现出关于老鼠心脏功能 参数的总结数据。左上图显示动脉弹性量-后负载 (afterload)的量测(Ea)。在所有使用TAC的模式中，由TAC 所造成的动脉弹性量的增加都是相似的，且不因昔多芬 的治疗而减少。右上图所显示的射出分率(EF)是净心脏 收缩功能的量测。慢性TAC造成EF减少，而在以昔多芬 合并(concomitant)治疗的动物，其EF恢复至正常水平，且 在昔多芬治疗延迟1星期的动物，其EF亦恢复至正常水 平(亦即，逆转实验，reversal experiment)。重要的是，EF 回复的发生并没有改变用昔多芬治疗的那些动物的压力 负载。中间二个图显示与心脏负载无关的收缩性量测：最 大力量指数(PMXI)和前负载再充盈搏功(preload recruitable stroke work，Msw)。与未经治疗的TAC相较， 心脏经昔多芬治疗时，这二个测量值都大大地获得改善。 下方的图呈现舒张功能的测量：Tau(等体积松弛时间常 数)；dP/dtmn-压力下降的峰率。TAC导致心脏松弛作用 的延长且反映在二个参数上，并且以昔多芬治疗的动物 亦恢复至正常程度。*表对Con和3星期Sil达p＜0.001；表 对所有其它组达p＜0.05；表对Con、3星期Sil及3星 期TAC达p＜0.01。
第5A至5D图显示另一种专一性PDE5a抑制剂 (EMD360527)预防经TAC(3星期)所诱发的心脏肥大发展 且同时改善心脏功能的能力。第5A图是一系列以福尔 马林固定的心脏截面图(左区块)，且二张图显示出在有以 EMD360527治疗或没有以EMD360527疗，在假手术控 制组老鼠和TAC术后3星期老鼠的心脏重量/胫骨长度 (HW/TL)比率(中间区块)与心肌细胞横截面直径(CSD，右 区块)。第5A图中的简称如下：Con：3星期载剂治疗的假手 术老鼠、EMD：3星期EMD360527治疗的假手术老鼠、TAC： 3星期载剂治疗的TAC老鼠，TAC+EMD：3星期 EMD360527治疗的TAC老鼠。*表对Con达p＜0.05；表对 以载剂治疗的TAC达p＜0.05。如以昔多芬治疗者， EMD360527治疗防止了心脏肥大和所伴随的腔室扩张和 重塑的发展。第5B图呈现代表性的M型超音波心动图(左 区块)，以及显示基于侵入式压力-容积插管(invasive pressure-volume)的心脏机转的三张总结图。第5B图所用 简称如前所述或如下：Ea代表的是由TAC所造成的心室 后负载的增加在有使用EMD360527和没有使用 EMD360527的情况都是一样的。与TAC组相较，EMD-TAC 组中的最大心脏力量指数(PMXI)上升，且等体积舒张时 间(Tau)显着缩短。这些数据与那些使用昔多芬(即，第4 图)所测得的结果几乎相同。*表对Con和EMD达p＜0.05； 表对所有其它组达p＜0.05。第5C图显示墨点图(dot blot) 以及分析心脏胎儿基因(cardiac fetal gene)表达的总结 图。第5C图用到的简称如下：ANP：A型钠利尿肽 (natriuretic peptide)、BNP：B型钠尿肽、βMHC：β肌凝蛋 白重链、αSkA：α骨骼肌动蛋白、钙处理蛋白(calcium handing protein，PLB)：受磷蛋白(phospholamban)、 SERCA：肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticular calcium ATPase)(上区块)。总结数据以GAPDH常态化(normalized) 表示(下区块)。TAC导致胎儿基因重演(recapitulation)- 钠尿肽、βMHC和αSkA的表达增加，而PLB和SERCA减少。 PDE5A抑制作用逆转了胎儿基因重演，并且增进了经TAC 所改变的Ca2+处理蛋白的表达。*表对Con达p＜0.05，表 对TAC达p＜0.05。第5D图显示总心肌cGMP水平(whole myocardial cGMP level)在仅有TAC处置的情况下增加， 但在以EMD360527治疗的TAC则有轻微的减少。如下张 图所呈现，此反应与使用昔多芬者所观察到的结果相似， 且与钠利尿肽表达的显着下降相符，尽管PDE5受抑制。 *表对Con和EMD达p＜0.05，表对TAC达p＜0.05。
第6A至6D图显示，在使用压力超载来刺激以造成心 脏肥大和重塑的心脏，其中的PDE5a活性增加。在这情况 中，昔多芬抑制了PDE5a对蛋白激酶G-1(PKG-1)的刺激。 第6A图是显示整个心脏的PKG-1活性的图。图中，*表 对Con达p＜0.05，表对以载剂治疗的TAC组达p＜0.05。 PKG-1由cGMP活化，如果昔多芬抑制PDE5，则PKG-1 活性将依次提高。在休息的情况下，抑制PDE5对PKG-1 活化的净效能微小。相反地，昔多芬显着地增加肥大/重 塑的心脏的PKG-1活性，上述之心脏是由3星期的TAC 所造成的。第6B图是显示在假手术控制组心脏(Con)和3 星期TAC心脏(TAC)中的总cGMP酯酶活性。基线处的总活 性百分比约为30％，而该活性是透过与专一性的PDE5 A 抑制剂(昔多芬或他达拉非(tadalafil))共培养而阻断。使 用IBMX的广效PDE抑制(broad PDE inhibition)作用当作 控制组而显示。随着压力超载持续(TAC)，总cGMP酯酶 的活性提高(*表p＜0.005)。由PDE5所贡献的活性占比 (proportion)亦提高到将近全部(酵素活性的100％增加) 的60％(利用二因子变异数分析，2-way ANOVA，p＜0.001)。 第6C图是显示整个心脏的cGMP水平的图，图中*表对 Con达p＜0.05。第6D图(上区块)呈现钙依赖钙调神经磷 酸酶(calcium-dependent phosphatase calcineurin，Cn) 和有丝分裂原活化激酶(mitogen activated kinase)-细胞 外信号调节激酶(ERK1/2)的二个西方墨点法。第6D图 (下区块)提供总结西方墨点法结果的二张图(每张图的 样本数n＝4至5)。ERK1/2的总结结果以磷(p)对总(t)蛋 白质的比率表示，图中，*表对Con达p＜0.05；表对以载 剂治疗的TAC组(TAC)达p＜0.05。一星期TAC增加上述两 种酵素的表达和活性。昔多芬使该效能减弱。在晚期的 TAC时间点(later TAC time point，9星期)，只有钙调神 经酶依旧有显着地增加。在以昔多芬共同治疗的心脏中， 钙调神经酶仍然减少。
第7A至7D图显示使用昔多芬抑制PDE5A，通过钙调 神经酶/NAT依赖的途径来预防新生老鼠的心肌细胞肥 大。第7A图(左区块)是一系列的三张显微镜图。这些显 微镜图显示了脱羟肾上腺素(phenylephrine，PE)对肌细胞 肥大的作用，如肌小节组织增加(sarcomere organization increased)所显示(第7A图α-肌动蛋白染色(x1000))。第 7B图(右区块)是以具组织化肌节(with organized sarcomeres)的肌肉细胞中，3H-白氨酸混入的百分比来定 量蛋白质(*表对Con达p＜0.05，表对PE达p＜0.05)。使用 昔多芬治疗，减少了PE所刺激的肌肉细胞中的肌节组织 和蛋白质合成。第7C图是一系列十张的显微镜图，显示 以偶合至β-半乳糖苷酶的NFAT促进剂转染后的肌细胞(x 200)。染成蓝色者表示NFAT活化作用。第7C图中的简称 如下：PE-脱羟肾上腺素，BK-BayK 8644，AdCn-腺病 毒过度表达钙调神经酶(calcineurin overexpression by adenovirus)。区块(1、3、5)是利用相差过滤器处理(phase contrast filter，+fil)，其它则没有(-fil)。第7D图是一系 列的三张图， 显示NFAT(亦即，β-半乳糖苷酶)的定量分 析活性(*表对Con达p＜0.05；表对肥大刺激(PE、BK或 AdCn)的p＜0.05)。用昔多芬治疗，抑制了由PE和由BayK 8644引起的NFAT活化作用。然而，昔多芬不能阻断以本 质上有活性的钙调神经酶来活化细胞中NFAT。此提供了 药品效能更接近的标的。
第8A至8F图为显示腺病毒转染效率的显微镜图。 第8A和8C图呈现用表达细胞核标靶的β-半乳糖苷酶 的腺病毒进行转染，以及用X-gal染色的各别盘中新生老 鼠(neonatal)肌肉细胞显微镜图。对应的盘第8B和8D图 是同样的细胞在没有相差的情况下所观察。第8E和8F 图显示一盘细胞的较低倍率(第8E图有相差，第8F图没 有相差)，用来显示转染的均一性。转染效率是一致的 (consistent)且接近95％。
第9A至9C图是显示在以写入NFAT促进剂与萤光素 酶偶合密码的腺病毒转染的新生老鼠肌细胞中，NFAT促 进剂活化作用的评估。细胞接着暴露至脱羟肾上腺素 (PE)、钙增强(calcium enhancement)(BK)或写入活性钙调 神经酶(AdCn)密码的腺病毒中，然后与载剂或昔多芬共 培养。培养四十八小时以后，细胞是藉由光度计 (luminometer)来评估萤光素酶的活性。数据是以常态化 至控制组水平的变化百分比显示。昔多芬(Sil)抑制PE， 而BK诱导NFAT促进剂活性，但非由AdCn所诱导的活性。 这些结果与使用NFAT促进剂偶合至β半乳糖苷酶的病毒 的发现类似。图中，*表对Con达p＜0.05，表对心脏肥大 刺激(hypertrophy stimulation，PE、BK或AdCn)达p＜0.05。
第10A至10E图显示通过抑制PDE5A使Akt途径失 活。第10A图为在1和9星期的TAC时，磷(p)Akt和总 (t)Akt的西方墨点法及总结数据。第10B图显示Akt活性 分析试验的结果。第10C图显示PI3K活性分析试验的结 果(3星期TAC时的数据，S：只用昔多芬治疗)。PI3K活性 和Akt活性在1和9星期TAC时，皆显着地增加，且使用 昔多芬治疗抑制达控制组水平。第10D图为显示GSK3β 表达和活化作用的西方墨点法和数据总结图。GSK3β是 调控心脏肥大的下游激酶，受Akt和其它激酶活化。在 TAC9星期时，昔多芬降低了由TAC诱导的GSK3β活性， 但在TAC1星期时则否。第10E图显示昔多芬慢性作用对 在心脏中过度表达构成式激活的(constitutive active)Akt 的转基因老鼠的效能。上方为死后的心脏，下方为根据 超音波心动图和死后分析的总结数据。尺标标记是1mm。 从系列超音波心电图和死后研究所得的左心室质量显示 于下方，所有比较中，以AktTG的情况其左心室质量较大 (p＜0.05)。Akt过度表达本身导致较严重的心室肥大，而 昔多芬并未使重量的增加改变。这表示，昔多芬对Akt信 号(亦即，第A至C图)的作用是在Akt本身上游。图中，* 表对控制组达p＜0.05；表对TAC达p＜0.05；C表控制组；T 表TAC；T+S表TAC+昔多芬，而以上简称适用于第10A 至10E所有图。
第11A至11F图显示PDE5A抑制剂的抗肾上腺素对 单离成体老鼠肌细胞的作用，所述的单离成体老鼠肌细 胞是暴露至异丙肾上腺素(ISO)，接着暴露至ISO与昔多 芬组合(ISO+SIL)。第11A图显示在暴露至ISO组中肌小 节的缩短量增加，但合并暴露至PDE5抑制剂(昔多芬)， 该作用显着地减弱。第11B图显示由萤光染料Indo-2AM 所测量的钙瞬变(calcium transient)。染料信号是以二种 放射波长的比率表现。第11C和11D图是定量由第11A 和11B图所显示结果的图表。第11E图包括未受损伤的 老鼠心脏结果的两个压力容积循环。ISO造成压力容量循 环变宽且使上角点(心脏收缩终期)向左偏移。这反映出收 缩力的增加。使用SIL治疗组，ISO反应减弱，且收缩力 的增加是可忽略的。第11F图是总结基于压力上升的最 大速率(dP/dtmax)数据的柱状图。投予ISO组有dP/dtmaz 的上升，在重新建立基线之后，仅单独投予昔多芬。这 对处在休息状态的心脏并没有作用。当添加ISO，并没有 观察到在dP/dtmax所预期的收缩性的增加。
第12A和12β图包括三张图(图12A)以及一张柱状 图(图12B)。第12A图显示在未受损伤的心脏PDE5A对 ISO所诱导的慢性心脏肥大的作用。第12B图显示PDE5A 抑制作用对心脏重量/胫骨长度比率的效能。ISO藉由渗 透式帮浦输注至老鼠达2周，导致在左心室近50％的肥 大(心脏质量/胫骨长度)。与PDE5a抑制剂共同治疗能后 预防此反应。
第13A和第13B图是显示心房钠利尿肽并不如 PDE5A抑制作用般压制与β-肾上腺素有关的心脏变化。 当ANP以静脉内输注，会造成心肌cGMP显着增加(右区 块)。这没有抑制经异丙基肾上腺素刺激的收缩(左区呈现 血压上升的最大速率；基线、投予ISO、重新建立后的基 线、仅使用ANP，及ANP+ISO)。这与如前文所示投予 PDE5a抑制剂所观察到的情况非常不同。而投予PDE5a 抑制剂所量得的cGMP显示有较少的不同。不希望被任 何特定理论局限，这些结果可能意味，高度分区化的信 号是造成PDE5a的心肌作用的原因。
第14A和14B图是显示PDE5a抑制剂(昔多芬；SIL) 对经异丙基肾上腺素(ISO)刺激的单离成体心脏肌肉细胞 的收缩和钙瞬变的直接作用，该收缩和钙瞬变是处在经 ODQ所造成的鸟苷酸(guanylate cyclase，sGC)抑制作用 的状态或并非处在该抑制状态。sGC产生接下来会被 PDE5a所代谢掉的cGMP。藉由sGC(ODQ)阻断cGMP的 合成来避免PDE5a抑制剂减弱ISO反应。这支持了cGMP 调节机制对PDE5a抑制作用的重要性。
第15A、15B，和15C图是显示PDE5a抑制剂在单 离的成体心脏肌肉细胞中增加cGMP的图表。第15A图 显示蛋白激酶G-1(PKG-1)在肌细胞的活性。单独使用昔 多芬(SIL)治疗或单独使用他达拉非(tadalafil，TAD)治疗 仅些微地提升PKG-1的活性(p＜0.05)，但上述合并ISO 使用会增加PKG-1的活性达70％(p＜0.001)，较单独使用 ISO增加达30％(p＜0.001)。第15B图显示cGMP的产生， 该图是以cGMP敏感的萤光共振能量转移(FRET)在控制 组老鼠新生鼠的肌细胞中量测的。SIL(500nM)和 ISO(100nM)使细胞cGMP(p＜0.01)上升，且在两者合并使 用时有更大的改变。NO供体DEA/NO(5μM)的添加使 cGMP上升的更多。第12C图是显示FRET相对变化的数 据总结(*表对于未经治疗的细胞达p＜0.05)。
第16A至16E图显示PDE5A蛋白质在单离的成体肌 细胞或在整个心脏肌肉层中的表达和活性。第16A图显 示PDE5A蛋白质在单离的成体肌细胞表达(所加载的蛋 白质如所显示)的西方点墨(上区块)以及呈现的4至6个 分离的点(在每一群中含n≥6个心脏)。观察到双条带的形 式(double banding pattern；a，b)。肌细胞所用的加载量 是100μg，然而肺脏的量是1μg。第6B图是显示PDE5a 基因在肺脏、单离的心脏肌肉细胞(MYO)，以及整个心 肌层(HRT)表达的相对水平。相较于在肺脏，PDE5a在心 脏中表达的水平非常低，且在单离的肌细胞中比在整个 心脏中还要低10倍。第16C是显示在整个尸体心脏 (murine heart)中的PDE5A蛋白质表达，且肺脏和心脏都 使用20μg的加载量确认了在蛋白质水平表达的差异。 第16D和16E图显示cGMP酯酶活性分析试验在整个心 脏以及单离的成体心脏肌肉细胞中的结果的图表。总活 性大幅的被广效PDE抑制剂IBMX(50μM)所减弱，而昔 多芬(SIL，100nM)将该活性减弱达约30％(p＜0.001)。这 显示在正常心脏肌肉和肌肉细胞总cGMP酯酶活性有约 30％是由PDE5a所造成。
第17A至17F图显示心肌细胞PDE5A分布的共轭焦 萤光染色。第17A图显示在肌细胞中PDE5A萤光染色是 出现在细胞质且更明显的是在z带(z-band，左区块)。对 应的染色是为z带蛋白质α-肌动蛋白(α-actinin)(右区 块)。第17B图显示PDE5A染色是藉由与阻断性肽 (blocking peptide，细胞信号公司(cell signaling)，5：1 BP/Ab(左区块)；右区块：α-肌动蛋白)。第17C图显示 PDE1C染色不受该阻断性肽所影响(PDE1C：左；右区块： α-肌动蛋白)。第17D图显示在另一个心脏肌细胞中的 PDE5A染色。第17E图显示同样的细胞针对一氧化氮合 成酶3(NOS3，或eNOS)来染色，而第17F图显示在z带 处该染色与PDE5a一起存在。
第18A和18B图显示得自健康人类实验体的数据， 该数据是在以β-肾上腺素促效剂-多巴酚丁胺刺激之前 和之后所得，且每个这样的试验都是在服用昔多芬单次 口服剂量之前和之后进行(100mg，口服)。第18A图是一 系列四个区块显示例示的多普勒血流及血压。第18B图 是显示最大LV心室力量指数的图表，该心室力量指数是 用来评估心脏收缩力的。对初始试验多巴酚丁胺增加该 等参数达将近200％(1)；在使用昔多芬之后(虚线；2)， 该刺激作用显着的减少了。
第19图是一系列六张图，显示在实验流程的每个时 期的峰值力量指数(峰值LV力量除以舒张终期)、射出分 数、搏出容积、心脏收缩血压以及总外围血管阻力。这 些图提供了在健康人类自愿者的安慰剂控制组、双盲、 昔多芬随机选取测试结果的总结图。在每个实验体，先 进行多巴酚丁胺刺激挑战试验(dobutamine stimulation challenge test)然后接着口服本研究的药物(安慰剂或昔 多芬)。B1及B2指的是最初和第二次(即在研究药物以后) 的基线，而D1和D2分别指的是在多巴酚丁胺输注期间在 口服本研究药物之前和之后所量测的结果。得自组内 RMANOVA测试的P值是代表在接受本发明药物之前对于 接受药物之后，经多巴酚丁胺刺激的反应的变化。D1对 于B1和D2对于B2(*表p＜0.001，表p＜0.005)的组内对照 亦显示其配对的t-试验。相较于安慰剂，昔多芬显着地降 低经多巴酚丁胺增强的收缩力。然而，对总外围血管阻 力没有显着的作用。
第20图是一系列的十二张图，显示在接受本研究药 物-昔多芬或安慰剂之前(B，●)和之后(A，○)， 由多巴酚 丁胺所造成血液动力功能的变化。每个患者的组内配对 是由线所连接的数据点所确认。平均值是以在每个数据 组的左边或右边的方块所显示。每个个别图表上方的p 值是表示在每个组群中第一和第二多巴酚丁胺反应(对 于基线的变化)的比较。在每一组配对的图形上方黑体字 的p值是代表基于多巴酚丁胺试验(在研究药物投予前或 投予后)、多巴酚丁胺(有存在或没有)以及研究药物(昔多 芬对于安慰剂)的3向互动(3-way interaction)的 RMANOVA。图21A至21F显示PdE5A抑制性质在NOS3 结合和金属结合蛋白酶(metalloproteinase)作用。图21A 显示肥大的变化在TAC心脏上与仿真老鼠的正常心脏比 较。图21B是西方点墨法操作在一个非变性的胶体，显 示在3个星期术后处理，在TAC心脏，当NOS3单体的 (N0S3-m)浓度增加时，NOS3二聚体(NOS3-d)降低了。这 是表示NOS解联，NOS3从酵素转换，而其酵素主要是 合成一氧化氮进而产生过氧化物。图21C(更低区)是一 对显微镜图显示超氧化物阴离子萤光探针 (dihydroethidium)(DHE)-一种氧化应力敏感染料-在仿真 和TAC的老鼠心肌层染色。图21C(上区)是一对图表表 示，在手术以后，在TAC老鼠三个星期，钙相关NOS活 性引起一氧化氮的降低。图21D是由NOS3增加造成过 氧化物形成的图表。图21E西方点墨法显示，NOS3二聚 体(280kD)在TAC老鼠三个星期在压力超载以后，量降 低了，且昔多芬(sildenafil)的处理防止了二聚体(280kD 带)的流失。图21F是明胶酶酶(gelatinase zymogen)谱显 示昔多芬(sildenafil)抑制明胶酶(gelatinase)活性(金属结 合蛋白酶(metalloproteinase)MMP-2和MMP-9，都为明 胶酶(gelatinases))。
图22A，22B和22C是西部点墨法(图22A)和二张图 表(图22B和C)显示TAC和TAC+昔多芬(sildenafil)处理 的小GTP结合蛋白质Rho A的表现和活化效用相当于它 的下游激酶与ρ激酶(Rho kinase)(ROCK1和ROCK2 )。 图22A表示，RhoA及ROCK2在老鼠曝露3星期TAC， 蛋白质表现量增加。二者皆因由昔多芬(sildenafil)处理 造成PDE5A抑制性质钝化。图22B和22C表示，RhoA和 整体ROCK在老鼠曝露于TAC三个星期活性增加。活性 的增加受到昔多芬(sildenafil)的抑制。
图23A和23B是六张磷酸化点墨显示STAT3磷酸 化。图23A表示，STAT3(信号转换器和转录活化剂3) 磷酸化(即；活化作用)在TAC条件下一个星期，三个星 期，及九个星期后，量都有增加。以昔多芬(sildenafil) 处理预防了这活化作用。图23B实验是说明出生鼠肌肉 细胞的实验结果，介白素6(IL-6)活化 STAT3而不是 STAT1。以昔多芬(sildenafil)处理可防止STAT的活化。 p-STAT3和t-STAT3是被磷酸化且在各条件下都有表现， 并且大致相似STAT1线。昔多芬(sildenafil)于STAT3 转录方面没有作用是因为t-STAT3是未改变的。更近一 步的比较证实STAT3的活性是受到沉默RNA(SiRNA)的 压抑。将STAT3量降低，反而增加STAT1表现和活性。 这是以昔多芬(sildenafil)处理时尚未观察到的。
图24A和24B表示，昔多芬(sildenafil)处理能增强 心肌能学。图24A(左区)是在手术之后三星期TAC心脏 的一个核磁共振光谱图像。心脏被显示在横切面。图24A (上区)是核磁共振光谱显示在心脏高能磷酸盐的新陈代 谢。图24B是图表，在三个星期手术以后，磷酸肌酸 (phosphocreatine)(PCr)之于整体ATP的值在TAC心脏组 织较低。这个效用会因昔多芬(sildenafil)处理而钝化。
发明说明
定义
″心脏肥大″意谓任一非预期的心肌细胞生长；相对 于身体尺寸增加了心脏腔室重量；或增加正常体积或已 变大腔室体积时的心脏腔室壁厚度。
″心脏病症″意谓任一心脏疾病或失调。
″心脏腔室重塑″意谓心脏组织非预期的形态改变以 反应病理生理学的刺激(例如，高血压、心肌梗塞、神经 激素压力、容量超载)。
″细胞重塑″意谓心脏细胞非预期的改变以反应病理 生理学刺激。细胞重塑的改变包括，但不受限于，下列 任一或多个的变化：肌肉细胞肥大、钙处理(例如，肌肉 细胞刺激造成细胞内的钙循环性改变；从细胞内部储存 处譬如肌浆网，吸取和释放钙；钙与收缩蛋白质或调节 蛋白质的交互作用)、活化电流(例如，钠)和再极化电位 流(例如，钾)。
″分子重塑″意谓心脏组织中基因转录或表现的改变 或是蛋白质生物活性的改变，以反应病理生理的刺激。
″增强心脏功能″意谓使心脏的帮浦作用和容积产生 有利的改变。
″适应不良心脏改变″意谓心脏或心脏细胞非预期的 变化，以反应病理生理的刺激。
″PDE5抑制剂″意谓抑制磷酸二酯酶-5水解cGMP的 化合物。PDE5抑制剂较佳为降低PDE5酵素活性至少5％ (例如，10％、15％、20％、30％、50％、60％、75％、85％、 90％或95％)。应用习知技术分析PDE5抑制剂活性，本 文中有描述(例如，实施例4)。
″治疗″意谓降低、抑制、减弱、减低、停止或稳定 疾病的发展或进程。
″疾病″意谓损伤或干扰细胞、组织或器官正常功能 的任何病症或失调。
″调控″意谓生物功能或活性的任何改变(例如，增加 或降低)。
″降低″或″增加″分别意谓至少5％程度的负向或正向 改变。改变程度可为5％、10％、25％、30％、50％、75％ 或甚至100％。
″降低心脏肥大″意谓在形态、细胞或分子重塑产生 至少5％的降低。
″逆转心脏肥大″意谓在形态、细胞或分子心脏表现 型上产生预期的改变， 其中该经改变的表现型实质上系 使正常心脏组织特征化者。
″患者″意谓哺乳动物譬如人类病患，或动物(例如： 啮齿类动物、牛、马、猪、羊、犬、猫或其它家里饲养 的哺乳动物)。
″有效量″是指足够产生有利或预期临床结果的量。
在本揭示中，″包含(comprises)″、″包含(compring) ″、”含有(containing)″及″具有(having)″等，能具有在美 国专利法中所认为的意义，能意谓″包括(includes)″、″包 括(including)″等；″实质上由...构成(consisting essentially of)″或”实质上由...构成(consists essentially)″ 同样具有在美国专利法中所认为的意义，系开放性的用 语，允许出现多于所列举者，只要所列举者的基本或新 颖特征不受该多于所列举者所改变，但排除先前技术的 具体实例。
发明方法
这种发明包含PDE5抑制剂，对于预防或治疗心脏病 情况是有用的。发明的构成和方法是在形态上，细胞上， 或分子再成型描绘心脏病情况的治疗或预防是有用的。 典型地，这样的再成型发生以反应血液动力学的应力譬 如高血压，瓣膜方面疾病，神经激素应力，心脏病梗塞， 或容量超载。这个发明根据某一部分发现，功能强大的 PDE5被表现于心脏组织；这些标定物于心脏的再成型和 功能都是有效的调节者；并且特殊环状鸟粪嘌呤3′，5′单 磷酸二酯酶(PDE5)处理或防止心脏肥大和其它心脏病情 况。
此文中方法包括投以对实验体(包括实验体辨识和 需要如何的治疗)及在此文中描述有效数量的化合物，或 本文描述的化合物在心脏组织产生有利的效用。辨认一 个实验体需要如何的治疗是在实验体或医疗保健专家的 评断，可能是主观(即；观点)或客观(即可由测试或诊断 方法测量)。
依照此文中被使用，术语″处理(treat)″，”处理 (treating)″，″处理(treatment)″等等，提到降低或改良不 稳定及/或症状随即结合。大家的评鉴是，虽不妨碍，但 处理一个病状或症状并不需要不符合程序的疗程，症状 或征兆随即马上被排除。
依照此文提及，术语″预防(prevent)″，″预防 (preventing)″，″预防(prevention)″，″预防疾病的治疗 (prophylactic treatment)″等等提到在实验体降低病状发 展或病况的可能性，但是病状或是病况的发展是危险且 易受影响的。
本文提及发明中的治疗方法(包括预防疾病的治疗) 一般包括构成有助于治疗上地效益，譬如PDE5抑制剂 (即；伐地那非(vardenafil)，他达拉非(tadalafil)，或昔多 芬(sildenafil))对实验体(即；动物，人)亦需要如此，包 括哺乳动物，特别是人。这样的治疗对实验体，特别是 人，遭受从(from)，具有(having)，易受影响(susceptiable)， 或在危险中成为一种心脏病疾病，病状，或其症状。判 断那些实验体″在危险中″可能藉由实验体的一个诊断测 试或观点或医疗保健提供者(即；基因测试，酵素或蛋白 质标记，标记(依照此中被定义)，家族史，等等)。本文 中化合物也许亦可使用于肥大，包括形态，细胞的，或 分子再成型所有其它病状的治疗。
心血管的功能
心脏病症和适应不良心脏变化(maladaptive cardiac alternation)、心室、细胞的、和分子重塑有关，该等心 脏病诸如心脏肥大、心脏收缩功能降低、心脏舒张功能 降低、适应不良肥大症、仍保有心脏收缩功能的心脏衰 竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、大动脉和僧帽瓣 疾病、肺动脉瓣疾病、肥大性心肌病变(例如，源于基因 或由次发性原因的肥大性心肌病变)、缺血后和梗塞后心 脏重塑和心脏衰竭。本发明的组成物可以用来在心脏功 能减低的实验体增强心脏功能。所想要的是，心脏功能 增加5％、10％或至少20％，或甚至增加了25％，50％或 75％这幺多。最有利地，心脏功能被增强或损伤被逆转， 因此功能是实质上正常的(例如，健康控制组实验体心脏 作用的85％、90％、95％或100％)。或者，该等分析试验 在以PDE5A抑制剂治疗之前、期间或之后用于监控实验 体的情况。增加心脏功能的治疗在发明的方法中是有用 的。
任意数量的标准方法对检验心血管功能是可用的。 较佳地，心血管功能在实验体(例如，人类)是使用非侵入 性的方法评估， 诸如藉由影像方法测量净心脏射出(net cardiac ejection)(射出分率(ejection fraction)、缩短分数 (fractional shorting)和心室收缩末期容量(ventricular end-systolic volume))，该等成像方法诸如超音波心动图、 核子或放射对比性造影心室造影术或核磁共振成像，且 心脏收缩的组织速率如藉由组织多普勒成像方法量测。 心脏收缩的收缩力亦可使用血压量测结合对心脏流出量 的评估或结合对容量(评估肌肉硬化的峰值(peak muscle stiffening))的评估而非侵入性地量测。心血管舒张功能的 量测包括心室顺应性，该性质典型由同时量测压力和容 量而量测，左心室早期舒张的充血率和松弛率(可由音波 多普勒量测而评估)。其它心脏功能的测量包括心肌收缩 力(myocardial contractility)、休息时的每搏输出量 (resting stroke volume)、休息时的心率、休息时的心脏 指数(cardiac index，每单位时间的心脏输出量 [L/minute]，坐着测量并除以身体表面积[m2])、总有氧 容量、运动时的心血管效能(cardiovascular performance)、 峰值运动能力(peak exercise capacity)、峰值氧气(O2)消 耗，或藉由在此技术领域中所广知的或在本文中描述的 任何其它方法。血管功能的量测包括总心室后负荷 (ventricular afterload)的判断，心室后负荷取决于数种因 素，包括周边血管阻力、大动脉阻抗(aortic impedance)、 动脉顺应性、波反射，和大动脉脉搏波速(aortic pulse wave velocity)。
评估心血管功能的方法包括以下一者或多者：多谱勒 超音波心动图、二维回音多谱勒成像、脉冲波多谱勒、 连续波多谱勒、示波臂套(oscillometric arm cuff)、组织 多谱勒成像、心脏导管、核磁共振成像、正子放射断层 摄影术、胸部X光、X-射线对比心室造影术、核子成像 心室造影术、计算机断层造影术成像、快速螺旋计算机 断层造影术成像(rapid spiral computerized tomographic imaging)、三维超音波心动图、侵入性心脏压力(invasive cardiac pressures)、侵入性心脏血流(invasive cardiac flows)、侵入性心脏压力容量循环(invasive cardiac cardiac pressur-volume loops)(电导导管)、非侵入性心脏 压力容量循环。
疾病预防和治疗的应用
心脏病是每年造成超过二 百四十万的美国人死亡 的典型慢性和进行性疾病。每年约有五十万的心脏衰竭 新病例，单单是在美国就有估计五百万名的患者有这种 疾病。早期预防对保留心脏功能可能是最有效的。本发 明的方法是想要用来预防以及逆转和心脏疾病有关的形 态学的、细胞的，和分子的重塑。在一个具体实例中， 是藉由对有发展成心脏病症风险的实验体投以有效量的 PDE5抑制剂，来预防心脏疾病。为了判断实验体发展成 心脏病况的倾向，该实验体的心脏病风险是使用在此技 术领域中任何已知的标准方法评估。心脏病风险最重要 的指针是年龄、遗传性因素、体重、抽烟、血压、运动 史，和糖尿病。心脏病风险其它的指针包括实验体的脂 肪概况(lipid profile)，该概况典型地是使用血液试验评 估，或其它与心脏病或高血压相关的生物标记。评估心 脏病风险的其它方法包括，但不限于，EKG压力测试、 铊压力测试、EKG、CT扫瞄、超音波心动图、核磁共振 成像研究、非侵入性和侵入性动脉搏图(arteriogram)，和 心脏导管术。
PDE5抑制性质亦有用于处理涉及心室、细胞的，以 及分子重塑的适应不良心脏变化，该等变化会导致心脏 功能障碍、肥大、扩张和其它的心脏病指针。有益地， 本发明的方法对在心脏组织内形态学、细胞和分子重塑 的降低是有用的，上述的心脏组织是处在和压力超载、 神经内分泌压力、心肌梗塞、或容量超载有关的压力之 下。因此，本发明的方法在具有不受控制的高血压或具 有对心脏造成压力的任何其它慢性必病症的病人是特别 有用的。
PDE5抑制剂
PDE5是在全身以及肺动脉和静脉平滑肌(venous smooth muscle)细胞表达-尤其是在海绵体(corpus cavernosum)。根据这个立场表示，PDE5抑制剂最初有兴 趣的是在于使血管舒张(vasodilatory)的效能。例如昔多 芬(sildenafil)，起初是基于预期它对扩张冠状动脉的能 力，而当作抗心绞痛的药物来研究。昔多芬的早期临床 研究是作为心绞痛的治疗，然而，结果是令人是失望的， 因为它对动脉扩张的效果非常轻微。这些临床研究发现 勃起功能的增进是投予昔多芬的常见副作用。昔多芬会 增进勃起，这是由于昔多芬藉由减少cGMP的分解而因 此在阴茎的血液循环中延长由于对性刺激的反应而由一 氧化氮所导致的血管扩张效能。同样的环核苷酸信号途 径调节了对正常勃起作用所必需的一氧化氮的平滑肌放 松效能。这条途径的下调是许多种形式的勃起功能障碍 的病理生理的问题核心。
昔多芬对PDE5是有选择性的。在本发现于本文报导 之前，PDE5在心肌里的水平(level)被认为在功能上无意 义的(functional insignificant)。确实，即使到了2003年 这幺近期，在医药界此类的主要回顾中所提及，并不知 道PDE5对心肌有直接影响，且对动脉血压有微小效用。 这告诉我们，PDE5抑制剂不会降低在左心的负载到足以 造成心脏功能或型态(亦即，肥大)的改变，亦不改造 (modify)分子和细胞的重塑。事实上，PDE5在休息情况 下(under rest condition)在心脏的调节仅扮演次要的角色 -就像是汽车的制动器在空转的汽车上仅有很少的效能。
让人惊讶地是，本文所报导的结果指出，PDE5A在 心脏遭受压力时扮演重要的角色，并且PDE5A抑制作用 预防和逆转了在遭受压力的心脏的形态学、细胞，和分 子的重塑，上述的压力是与压力超载、神经内分泌压力、 心肌梗塞，或容量超载有关。令人惊讶的是，在加诸于 心脏的负载完全没有任何改变的情况下，PDE5抑制剂在 心脏功能、左心脏功能、心脏肥大及分子与细胞的重塑 达到其治疗效能。
PDE5抑制剂在此技术领域已充分了解，包括，但不 限于，昔多芬(化合物1)、伐地那非(vardenafil)(化合物 2)、他达拉非(tadalafil)(化合物3)、EMD 360527、DA 8159 等，或由磷酸二酯酶-5phosphodiesterase-5(PDE5)抑制 cGMP水解的其它化合物。
化合物1
化合物2
化合物3
某些适用于本发明的化合物及其医药上可接受的盐 能以下式结构(式I)来表示：
式I
，式中，R1是H、C1-C3烷基、C3-C5环烷基或C1-C3 全氟烷基；R2是H、视需要经OH取代的C1-C6烷基、 C1-C3烷氧基、C3-C6环烷基或C1-C3全氟烷基；R3是 C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、C3-C67环烷基、 C1-C6全氟烷基或(C3-C6环烷基)C1-C6烷基；R4与所附 接的氮原子一起形成4-N-(R6)六氢吡嗪基；R5是H、 C1-C4烷基、C1-C3烷氧基、NR7R8或CONR7R8；R6 是H、C1-C6烷基、(C1-C3烷氧基)C2-C6烷基羟基C2-C6 烷基、(R7R8N)C2-C6烷基、(R7R8NCO)C1-C6烷基、 CONR7R8、CSNR7R8或C(NH)NR7R8；R7和R8各自独 立的为H、C1-C4烷基、(C1-C3烷氧基)C2-C4烷基或羟 基C2-C4烷基。
其它用于本发明的较佳化合物及其盐、水合物、氮 的氧化物和结构异构物，揭示在美国专利第6,362,178号 中，能以下式结构(式II)来表示：
，式中，
R1代表氢或具有达4个碳原子的直链或支链烷基；
R2代表具有达4个碳原子的直链烷基；
R3和R4相同或不同，各代表氢或具有达8个碳原子的直 链或支链烯基或烷氧基，或代表具有达10个碳原子的直 链或支链烷基链，该烷基链视需要有氧原子插入，并且 视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进 行单或多取代；三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、卤素、羧 基、苯甲氧羰基、具有达6个碳原子的直链或支链烷氧 羰基及/或由下式基团进行取代：-SO3H、-(A)a-NR7R8、 -O-CO-NR7′R8′、-S(O)b-R9、-P(O)(OR10)(OR11)、
及/或
式中，
a和b相同或不同，各代表数0或1；
A代表CO或SO2基；
R7、R7’、R8和R8’相同或不同，各代表氢或代表具有3 至8个碳原子的环烷基、具有6至10个碳原子的芳基、 5至6环员的不饱和、部份不饱和或饱和并视需要与苯基 幷合的杂环，而该杂环具有达3个选自由S、N和O所构 成群组的杂原子，上述环系统视需要经选自由下列所构 成群组的相同或不同取代基进行单或多取代：羟基、硝基、 三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、卤素、具有达6个碳原 子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基，或由式 -(SO2)C-NR12R13基团进行取代，式中，
c代表数0或1；
R12和R13相同或不同，各代表氢或具有达5个碳原子的 直链或支链烷基；或
R7、R7’、R8和R8’各代表具有达6个碳原子的直链或支 链烷氧基，或代表具有达8个碳原子的直链或支链烷基， 该烷基视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取 代基进行取代：羟基、卤素、具有6至10个碳原子的芳基、 具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧羰基，或 由式-(CO)d-NR14R15基团进行取代，式中，
R14和R15相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基；
d代表数0或1；或
R7和R8及/或R7’和R8’与附接的氮原子一起形成5至7 环员饱和杂环，该杂环视需要可再含有选自由S和O所构 成群组的杂原子，或含有式-NR16基团，式中，
R16代表氢、具有6至10个碳原子的芳基、苯甲基、5 至7环员芳香族或饱和杂环，该杂环具有达3个选自由S、 N和O所构成群组的杂原子，该杂环视需要经甲基取代， 或代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基，该烷基视 需要经羟基取代；
R9代表具有达6至10个碳原子的芳基，或代表具有达4 个碳原子的直链或支链烷基；
R10和R11相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基，及/或在R3/R4下该以上所列的烷基链 视需要经具有3至8个碳原子的环烷基、具有6个到10 个碳原子的芳基取代，或经5至7环员部份不饱和、饱 和或不饱和并视需要与苯基幷合的杂环取代，该杂环可 含有达4个选自由S、N和O所构成群组的杂原子，或含 有式-NR17基团，式中，
R17代表氢、羟基、甲醯基、三氟甲基、具有达4个碳原 子的直链或支链醯基或烷氧基，或代表具有达6个碳原 子的直链或支链烷基，该烷基视需要经选自由羟基和具 有达6个碳原子的直链或支链烷氧基所构成群组的相同 或不同取代基进行单或多取代，其中芳基和杂环视需要 经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或 多取代：硝基、卤素、-SO3H、具有达6个碳原子的直链 或支链烷基或烷氧基、羟基、三氟甲基、三氟甲氧基， 及/或经式-SO2-NR18R19基团进行取代，式中，
R18和R19相同或不同，各代表氢或具有达6个碳原子的 直链或支链烷基；及/或
R3或R4代表式-NR20R21基团，其中R20与R21具有如上 述R18与R19的界定，且与R18、R19相同或不同；及/或
R3或R4代表金刚基(adamantyl)，或代表下式基团：
或代表环烷基具有3至8个碳原子、芳基具有6至10个 碳原子，或代表5至7环员部份不饱和、饱和或不饱和 并视需要与苯基幷合的杂环，该杂环可含有达4个选自 由S、N和O所构成群组的杂原子，或含有式-NR22基团， 其中，
R22具有如上述R16的界定，且与R16相同或不同，或代表 羧基、甲醯基或具有达5个碳原子的直链或支链醯基， 其中环烷基、芳基及/或杂环视需要经选自由下列所构成 群组的相同或不同取代基进行单或多取代：卤素、三唑基 (triazolyl)、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、具有达6个 碳原子的直链或支链醯基或烷氧羰基、硝基，及/或经下 式基团进行取代：-SO3H、-OR23、-(SO2)eNR24R25、- P(O)(OR26)(OR27)，其中，
e代表数0或1；
R23代表下式基团：
，或代表环烷基具有3至7个碳原子，或代表氢或具有 达4个碳原子的直链或支链烷基，该烷基视情况经具有3 至7个碳原子的环烷基、苯甲氧基、四羟吡喃基、四羟 呋喃基、具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基或烷氧 羰基、羧基、苯甲氧羰基或苯基取代，该苯基可经选自 由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或多取 代：具有达4个碳原子的直链或支链烷氧基、羟基和卤 素，及/或烷基视情况经式-CO-NR28R29或-CO-R30基团 进行取代，其中，
R28和R29相同或不同，各代表氢或具有达8个碳原子的 直链或支链烷基；或
R28和R29与附接的氮原子一起形成5至7环员饱和杂环， 该杂环视情况可再含有选自由S和O所构成群组的杂原 子；
R30代表苯基或金刚基；
R24与R25具有如上述R18与R19的界定，且与R18、R19 相同或不同；
R26与R27具有如上述R10和R11的界定，且与R10、R11 相同或不同，及/或为环烷基、芳基，及/或该杂环视情况 经具有达6个碳原子的直链或支链烷基取代而该烷基视 情况经羟基、羧基取代，经5至7环员杂环取代而该杂 环具有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原子，或 经式-SO2-R31、P(O)(OR32)(OR33)或-NR34R35基团取代， 其中，
R31代表氢或具有如上述R9的界定，且与R9相同或不同；
R32与R33具有如上述R10与R11的界定，且与R10、R11 相同或不同；
R34和R35相同或不同，各代表氢或具有达6个碳原子的 直链或支链烷基，而该烷视情况经羟基或具有达4个碳 原子的直链或支链烷基取代；或
R34和R35与所附接的氮原子一起形成5至6环员饱和杂 环，该杂环可再含有选自由S和O所构成群组的杂原子， 含有式-NR36基团，其中，
R36代表氢、羟基、具有达7个碳原子的直链或支链烷氧 羰基，或具有达5个碳原子的直链或支链烷基，该烷基 视情况经羟基取代；或
R3和R4与所附接的氮原子一起形成5至7环员不饱和或 饱和或部分不饱和且视需要与苯基幷合的杂环，该杂环 可视需要含有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原 子，或含有式-NR37基团，其中，
R37代表氢、羟基、甲醯基、三氟甲基、直链或支链醯基、 具有达4个碳原子的烷氧基或烷氧羰基，或代表具有达6 个碳原子的直链或支链烷基，而该烷基视情况经选自由 下列所构成群组的相同或不同取代基进行单或多取代： 羟基、三氟甲基、羧基、具有达6个碳原子的直链或支 链烷氧基或烷氧羰基，或经式-(D)f-NR38R39、 -CO-(CH2)g-O-CO-R40、-CO-(CH2)h-OR41或 -P(O)(OR42)(OR43)基团取代，其中， g和h相同或不同，各代表数1、2、3或4； f代表数0或1；
D代表式-CO或-SO2基团；
R38和R39相同或不同，各具有如上述R7和R8的界定；
R40代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基；
R41代表具有达6个碳原子的直链或支链烷基；
R42和R43相同或不同，各代表氢或具有达4个碳原子的 直链或支链烷基；或
R37代表式-(CO)i-E基团，其中，i代表数0或1；
E代表具有3至7个碳原子的环烷基或苯甲基，代表具有 6至10个碳原子的芳基或5至6环员芳香族杂环，而该 杂环具有达4个选自由S、N和O所构成群组的杂原子， 其中， 该上述环系统视需要经选自由下列所构成群组的 相同或不同取代基进行单或多取代：硝基、卤素、-SO3H， 具有达6个碳原子的直链或支链烷氧基、羟基、三氟甲 基、三氟甲氧基，或经式-SO2-NR44R45基团取代，其中， R44和R45具有如上述R18和R19的界定，并且与R18、R19 相同或不同；或
E代表下式基团：
列在R3和R4下，与附接的氮原子一起形成的杂环，视需 要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代基进行单 或多取代，如果适合亦能重复：羟基、甲醯基、羧基、具 有达6个碳原子的直链或支链醯基或烷氧羰基、硝基， 和式-P(O)(OR46)(OR47)、
＝NR48或-C(O)jNR49R50，
其中，
R46和R47具有如上述R10和R11的界定，且与R10、R11 相同或不同；
R48代表羟基或具有达4个碳原子的直链或支链烷氧基；
j代表数0或1；以及
R49和R50相同或不同，且具有如上述R14和R15的界定， 及/或列在R3和R4下，与附接的氮原子一起形成的杂环， 视需要经具有达6个碳原子的直链或支链烷基取代，该 烷基视需要经选自由下列所构成群组的相同或不同取代 基进行单或多取代：羟基、卤素、羧基、环烷基或环烷氧 基各具有3至8个碳原子、具有达6个碳原子的直链或 支链烷氧基或烷氧羰基，或经式-SO3H、-NR51R52或 P(O)O R53OR54，基团取代，其中，
R51和R52相同或不同，各代表氢、苯基、羧基、苯甲基 或具有达6个碳原子的直链或支链烷基或烷氧基；
R53和R54相同或不同且具有如上述R10和R11的界定，及 /或该烷基视需要经具有6至10个碳原子的芳基取代，而 该芳基可经选自由卤素、羟基、具有达6个碳原子的直 链或支链烷氧基所构成群组的相同或不同取代基进行单 或多取代，或经式-NR51’R52’基团取代，其中，
R51’和R52’具有如上述R51和R52的界定，且与R51、R52 相同或不同，及/或列在R3和R4下与附接的氮原子一起形 成的杂环，视需要经具有6至10个碳原子的芳基取代， 或经5至7环员饱和、部分不饱和或不饱和杂环取代， 而该杂环具有达3个选自由S、N和O所构成群组的杂原 子，视需要亦通过氮原子的功能进行键结，其中该环系 统可经羟基或经具有达6个碳原子的直链或支链烷基或 烷氧基取代；或
R3和R4一起与氮原子形成下式基团：
R5和R6相同或不同，各代表氢、具有达6个碳原子的直 链或支链烷基、羟基或代表具有达6个碳原子的直链或 支链烷氧基。
其它适合的化合物包括该些具下式III的化合物及其医 药上可接受的盐和溶剂合物(例如，水合物)：
式中，R0代表氢、卤素或C1-6烷基；
R1代表氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素C1-6 烷基、C3-8环烷基C1-3烷基、芳基C1-3烷基或杂芳基C1-3 烷基；
R2代表视需要经取代的单环芳香族环，而该芳香族环是 选自苯、噻吩、呋喃和吡啶，或视需要经取代的双环：
R2通过苯环的一个碳原子与该化合物分子的其它部分键 结，其中，幷合的A环是5至6环员的环，该环可为饱和 或部分不饱和或完全不饱和，且该A环包含碳原子和视需 要有一或二个选自氧、硫和氮的杂原子；以及
R3代表C1-3烷基的氢，或R1和R3一起代表3或4员的烷 基或烯基链；
某些较佳的化合物亦包含该些具下式IV的化合物， 及其医药上可接受的盐和溶剂合物(例如水合物)：
于式IV中，R0代表氢、卤素或C1-6烷基；R1代表氢、C1-6 烷基、卤素C1-6烷基、C3-8环烷基C1-3烷基、芳基C1-3 烷基或杂芳基C1-3烷基；以及R2代表视需要经取代的单 环芳香环，而该芳香环是选自苯、噻吩、呋喃和吡啶， 或R2代表视需要经取代的双环：
R2通过苯环的一个碳原子与该化合物分子的其它部分键 结，其中，幷合的A环是5至6环员的环，该环能为饱和 或部分不饱和或完全不饱和，且该A环包含碳原子和视需 要有一或二个选自氧、硫和氮的杂原子。
用在本发明中的其它较佳化合物群为具下式V的化 合物，及其医药上可接受的盐和溶剂合物(例如，水合 物)：
，式V中：
R0代表氢、卤素或C1-6烷基；
R1代表氢或C1-6烷基；
R2代表双环：
，该双环视需要能经一或多个选自卤素和C1-3烷基的基 团取代；以及
R3代表代表氢或C1-3烷基。
关于上述式IV中R1，作为芳基C1-3烷基基团中一部 份的”芳基”术语，意指苯基或经选自卤素、C1-6烷基、 C1-6烷氧基和亚甲二氧基(methylenedioxy)的一或多个 (例如，1、2或3)取代基所取代。作为杂芳基C1-3烷基基 团中一部份的”杂芳基”术语，意指噻吩基、呋喃基或吡 啶基，并视需要经选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基的一 或多个(例如，1、2或3)取代基所取代。作为C3-8环烷基 C1-3烷基基团中一部份的”C3-8环烷基”术语，意指单环 结构包含3至8个碳原子。适合的环烷基环实例包括C3-6 环烷基环：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
关于上述式IV中R2，可供选择的苯环取代物为选自 包含卤素、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、CO2Rb、卤 素C1-6烷基、卤素C1-6烷氧基、氰基、硝基和NRaRb的 一或多个(例如，1、2或3)原子或基团，其中Ra和Rb各 为氢或C1-6烷基，或Ra亦能代表C2-7烷醯基或C1-6烷磺 醯基。用在该环系统其余部份的可供选择的取代基，是 选自包含卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和如上所定义芳基 C1-3烷基的一或多个(例如，1、2或3)原子或基团。双环：
，例如，能代表萘、杂环例如苯幷恶唑(benzoxazole)、 苯幷噻唑、苯幷异恶唑、苯幷咪唑、喹啉(quinoline)、吲 哚、苯幷噻吩、苯幷呋喃，或
，其中，n为整数1或2，X和Y各能代表CH2、O、S或 NH。
参见美国专利：第6,916,927、6,911,542、6,903,099、 6,878,711、6,872,721、6,858,620、6,825,197、6,774,128、 6,723,719、6,699,870、6,670,366、5,859,006和5,250,534 号。其它适用在本发明方法的PDE5抑制剂在WO 03/063875、WO 03/1012761、WO 2004/037183和WO 98/38168中有描述。所有这些专利和专利申请书整个并 于本说明书中作为参考文献。
商业上可购得的昔多芬有25、50或100毫克三种剂 量，具有大约10nM的IC50。血浆中有效浓度是在1nM至 250nM间，该范围底限是任一在1nM至249nM间的整数； 该范围上限是任一在2nM至250nM间的整数。较佳地， 血浆中有效浓度是在5nM至100nM间，而更佳地，是在 10nM至50nM间(例如，15nM、20nM、25nM、30nM、 40nM或45nM)。
商业可购得的他达拉非有5、10或20毫克三种剂量， 具有大约1nM的IC50。对健康受试者给予20毫克的他 达拉非口服剂量后，他达拉非迅速地被吸收，且在投药 二小时后有378奈克/毫升的最高血浆中浓度。血浆中有 效浓度较佳是在5nM至100nM间，更佳是在10nM至 50nM间(例如，15nM、20nM、25nM、30nM、40nM或 45nM)。他达拉非有相当大而明显的体积分布(Vd/F) 62.6升，和明显低的口服清除率(CL/F)2.48升/小时。 结果，他达拉非的平均排除半衰期是大约17.5小时，实 质上比昔多芬或伐地那非的平均排除半衰期长。
商业上可购得的伐地那非有5毫克、10毫克和20 毫克三种剂量，具有大约0.7nM的IC50。伐地那非的血浆 中有效浓度是在0.1nM至5.0nM间。
熟于本领域技艺者将明了，降低PDE5活性的任何化 合物是适用在本发明方法中。其它适用在本发明方法中 的化合物实例包括UK-343,664(Walker等人， Xenobiotica，31：651-664)、UK-427,387、UK-357903[1- 乙基-4-{3-[3-乙基-6，7-二氢-7-侧氧基-2-(2-吡啶甲 基)-2H-吡唑[4，3-d]嘧啶-5-基]-2-(2-甲氧乙氧基)-5-吡啶 磺醯基}六氢吡嗪](Gardiner等人，J.Pharmacol Exp Ther.2005，312：265-271)、UK-371800(Pfizer)、 UK-313794(Pfizer)和UK-343664(Abel等人， Xenobiotica.2001 31：665-76)；TA-1790 from Tanabe Seiyaku；CP-248、CP-461和磺酸舒林酸(exisulind) (Deguchi等人，Molecular Cancer Therapeutics803-809， 2002)，该些可从OSI Pharmaceuticals公司购得；吡唑啉 酮(pyrazolinone)；EMD82639(4-(4-[2-乙基苯胺]亚甲 基)-3-甲基-5-侧氧基-4，5-二氢吡唑-1-基)苯甲酸(Senzaki 等人，FASEB Journal.2001，15：1718-1726)；[7-(3-氯-4- 甲氧基苯甲胺基)-1-甲基-3-丙基-1-氢-吡唑[4，3-d]嘧啶-5- 基甲氧基]乙酸(EMD360527)、4-[4-(3-氯-4-甲氧基苯甲胺 基)苯[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-2-基]环己基甲酸、乙醇胺盐 (EMD221829)和5-[4-(3-氯-4-甲氧基苯甲胺基)-5，6，7，8- 四氢苯[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-2-基]戊酸(EMD171827)，该 些可从Merck KgaA(Darmstadt，德国)购得，且在例如 Scutt等人中有说明(BMC Pharmacol.2004，4：10)；3-(1- 甲基-7-侧氧基-3-丙基-6，7-二氢-1H-吡唑[4，3-d]嘧啶-5- 基)-N-[2-(1-甲基吡咯啶-2-基)乙基]-4-丙氧基苯磺醯胺 (DA-8259)；E-4021(Dukarm等人，Am.J.Respir.Crit. Care Med.，1999，160：858-865)；己酮可可碱(pentoxifylline) 及FR22934(Fujisawa)。
医药上的组合物
本发明特征为医药上制剂，包含PDE5A抑制剂(例 如，昔多芬、伐地那非、他达拉非或其类似物)与医药上 可接受的载体，其中该化合物用于治疗实质上任何的心 脏征候，该征候特征为心脏组织的肥大形态、细胞或分 子的重塑。本发明的医药制剂具有治疗和预防疾病上的 应用。在一具体实例中，医药组合物包括有效量的PDE5 抑制剂。该组合应无菌且含有治疗上适合投予患者(例 如，人类病患)的PDE5抑制剂有效重量或体积。发明的 组合物和组合能是医药包的一部分，其中PDE5抑制剂以 个别的剂量型式呈现。
用在预防或治疗投药的本发明医药组合物应无菌。 利用通过无菌滤膜(例如，0.2微米的膜)的过滤法；伽玛 照射或任何其它习知的适当方法，能很快地达到无菌状 态。治疗用的组合物一般置入至具有无菌存取口的容器 中，例如，静脉溶液袋或药水瓶，而该药水瓶有瓶塞可 遭皮下射入针所刺穿。当作为水溶液或复水用的冻干配 方使用时，这些组合物通常以单位或多重剂量容器(例 如，经密封的安瓿瓶或药瓶)的方式存放。
PDE5抑制剂视需要可与医药上可接受的赋形剂相 组合。本文中所用的术语″医药上可接受的赋形剂″指的 是一或多种可兼容的固体或液体填充剂、稀释剂或使胶 囊化的物质，适合用在投入人体。术语″载体″表示有机 或无机成份，为天然或合成的，与活性成分相结合以促 进投药。医药组合物的成分亦能与本发明的PDE5抑制剂 共同混合，且以无实质上削弱所欲医药功效的交互作用 的方式，彼此相混合。
本发明的化合物能含有医药上可接受的赋形剂。赋 形剂较佳为含有微量的添加剂，譬如增强等渗压性和化 学稳定性的物质。这样材料在使用的剂量和浓度上对使 用者而言是无毒的，该材料包括缓冲剂譬如磷酸盐、柠 檬酸盐、丁二酸盐、醋酸盐、乳酸盐、酒石酸和其它有 机酸或其盐；参-羟甲基氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、碳 酸盐和其它有机碱及其盐；抗氧化剂譬如抗坏血酸；低 分子量(例如，约小于十个残基)多肽例如聚精氨酸、聚赖 氨酸、聚谷氨酸和聚天门冬氨酸；蛋白质譬如血清白蛋 白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物譬如聚乙烯吡咯烷 酮(PVP)、聚丙二醇(PPGs)和聚乙二醇(PEGs)；胺基酸譬 如甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或精 氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物包括纤维素或其衍 生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或硫酸化碳水化合 物的衍生物譬如肝素(heparin)、硫酸软骨素(chondroitin) 或硫酸葡聚糖(dextran sulfate)；多价金属离子譬如二价 金属离子包括钙离子、镁离子和锰离子；螯合剂譬如伸 乙二胺四醋酸(EDTA)；糖醇譬如甘露糖醇或山梨糖醇； 平衡离子譬如钠或氨；及/或非离子型界面活性剂譬如聚 山梨酯或泊洛沙姆(poloxamer)。可包括使用其它添加剂 譬如安定剂、抗菌剂、惰性气体、流体和营养素补充剂 (即，林格氏(Ringer’s)葡萄糖)、电解质补充剂等，以上 该些添加剂能以惯用的量来使用。
如上所述的组合物能以有效量来投予。有效量将取 决于投药方式、所治疗的特殊病症和预期的结果。它亦 可能取决于病症的阶段、患者的年龄和身体情况、同步 治疗的性质，以及若有的话，像为执业医生所习知的因 素。为了用在治疗，需有足够的剂量来达到在医疗上期 望的结果。
对于患有心脏疾病或与形态肥大、细胞或分子重塑 有关的病症的患者而言，有效量是足够用来预防、降低、 稳定或逆转与心脏病肥大有关的改变。对于患有心脏疾 病或病症的患者而言，有效量是充分稳定、减慢或降低 与心脏病症有关的剂量。通常，本发明化合物的剂量大 约从每天0.01毫克/公斤至大约每天1000毫克/公斤。在 一具体实例中，对患者投予25、50、75、100、125、150 或200毫克的PDE5抑制剂譬如昔多芬。较佳地，投予 100毫克的PDE5抑制剂。期望的是，所投予PDE5抑制 剂的量足够在血浆中达到10、25、50、75或100nM的峰 值浓度。较佳地，峰值浓度为50nM。有效剂量范围从 0.1nM至200nM，该范围底限是任一在1至199间的整 数，而该范围上限是任一在2至200间的整数。期望的 是，有效剂量产生的血浆中游离PDE5抑制剂浓度范围为 10至50nM，但能高达200nM或低至1至2nM。浓度实 例包括0.1、1、5、10、20、25、30、40或50nM。据估 计，剂量范围从大约5至大约2000毫克/公斤将是适当的， 视所使用的特定PDE5a抑制剂而定。更低的剂量将用在 某些投药方式，譬如静脉投药和配药。在患者对最初使 用剂量的反应不充分时，可使用较高的剂量(或以不同、 较局部的传递途径提高有效剂量)，而该剂量在病人可耐 受的范围。亦可考量每天多重剂量使本发明组合物达到 适当的全身浓度。
可使用各种的投药途径。本发明的方法，一般而论， 可应用任何医疗上可接受的投药方式，意谓任何产生活 性化合物有效浓度而没有导致临床不可接受不利影响的 方式。在一较佳具体实例中，本发明的组成物是口服投 药。其它投药的方式包括直肠、局部、眼内、口腔、阴 道、脑池、脑室、气管、鼻、透过皮肤、在插入管内/上 或非经肠的投药途径。术语″非经肠″包括皮下、气管、 静脉、肌肉、腹膜或注入。静脉或肌肉途径对于长期疗 法和预防并不是特别适当，然而，在紧急情况时，该途 径也许较佳。包含本发明组合物的组合物能添加至生理 流体譬如血液。口服给药对预防性的治疗较佳，因为便 于患者使用以及投药剂量安排。
本发明的医药组合物能包含一或多种pH缓冲化合 物，以使配方的pH值维持在反映生理pH值的给定范围 内，譬如大约5.0至大约8.0的范围。使用于水溶液配方 的pH缓冲化合物能是氨基酸或氨基酸混合物，譬如组氨 酸或氨基酸譬如组氨酸和甘氨酸的混合物。可选择地， pH缓冲化合物较佳是维持配方的pH值在给定范围内， 譬如维持在大约5.0至大约8.0的范围，该缓冲化合物不 螯合钙离子。此pH缓冲化合物的实例包括，但不限制于， 咪唑和醋酸根离子。pH缓冲化合物可以任何适合维持配 方的pH值在给定范围内的量存在。
本发明的医药组合物亦能含有一或多种渗透调控 剂，即调控配方渗透性质(例如，渗透性、渗透莫耳浓度 及/或渗透压)至对使用者个体的血液和血细胞是可接受 的程度。渗透调控剂能为不螯合钙离子的试剂。渗透调 控剂能为任何熟于本领域技艺者所习知或可得到的用来 调控配方渗透性质的化合物。熟于本技艺者可依经验来 确定所给予的渗透调控剂用在本发明配方的适合性。适 当渗透调控剂类型的实例包括，但不限制为，盐类譬如 氯化钠和醋酸钠；糖譬如蔗糖、葡萄糖和甘露糖醇；氨 基酸譬如甘氨酸；及一或多种这些试剂的混合物及/或试 剂类型。渗透调控剂可以任何足够来调控配方渗透性质 的浓度存在。
包含本发明化合物的组合物能含有多价金属离子譬 如钙离子、镁离子及/或锰离子。任何有助于稳定该组合 物且对使用者无不利影响的多价金属离子可予以使用。 熟于本领域技艺者，根据这二个准则，能凭经验确定适 当的金属离子，此金属离子的适当来源已习知，其来源 包括无机和有机盐。
本发明的医药组合物亦能为非水溶液液体配方。可 使用任何适当的非水溶液液体，只要该液体对含在其中 的活性试剂赋予稳定性。较佳地，非水溶液液体是亲水 性液体。适当非水溶液液体的例子包括：甘油；二甲亚 砜(DMSO)；聚二甲基硅氧烷(PMS)；乙二醇譬如乙二醇、 二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(″PEG″)200、PEG300 和PEG400；及丙二醇譬如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二 醇(″PPG″)425、PPG725、PPG1000、PPG2000、PPG3000 和PPG4000。
本发明的医药组合物亦能为混合的水溶液/非水溶液 液体配方。任何适当的非水液体配方譬如以上所述者， 能与任何水溶液液体配方一起使用譬如以上所述者，只 要该混合的水溶液/非水溶液液体配方对包含在其中的化 合物赋予稳定性。较佳地，在此配方中的非水溶液液体 是亲水性液体。适当非水溶液液体的例子包括：甘油； DMSO；PMS；乙二醇譬如PEG200、PEG300和PEG400； 及丙二醇譬如PPG425、PPG725、PPG1000、PPG2000、 PPG3000和PPG4000。
适当的稳定配方能允许活性试剂以冷冻或未冷冻的 液体状态储存。稳定的液体配方能存放在至少-70℃的温 度，亦能存放在至少0℃的较高温度，或存放在大约0.1 ℃至大约42℃间，根据组合物的性质而定。熟于技艺者 都知道，蛋白质和多肽对pH、温度和其它因子多样性的 改变是相当敏感的，而这些可能会影响治疗的效力。
其它传递系统能包括缓慢释放、延迟释放或持续释 放的传递系统。这样的系统能避免本发明组合物的重复 投予，因而增加对患者和医师的便利性。有许多类型的 释放传递系统可利用，对该些具本领域通常技艺者而言 是习知的。他们包括聚合物基本系统譬如聚乳酸 (polylactides)(美国专利第3,773,919号、欧洲专利第 58,481号)、聚乳酸甘醇酸(poly(lactide-glycolide))、共 聚草酸酯(copolyoxalates)、聚己内酯、聚酯醯胺、聚原 酸酯(polyorthoesters)、聚羟丁酸譬如聚-D-(-)-3-羟丁酸 (欧洲专利第133,988号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸 盐共聚合物(Sidman，K.R.等人，Biopolymers22： 547-556)、聚2-羟乙基异丁烯酸或乙酸伸乙基乙烯酯 (ethylene vinyl acetate)(Langer，R.等人，J.Biomed. Mater. Res.15：267-277；Langer，R.Chem.Tech. 12：98-105)，和聚酸酐。
持续性释放组合物的其它例子包括有具体化形状的 半通透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。传递系统亦 包括非聚合物系统，他们是：油脂包括甾醇譬如胆固醇、 胆固醇酯类和脂肪酸，或中性油脂譬如单、双和三甘油 酯；水凝胶释放系统譬如生物衍生出的生物再吸收水凝 胶(即，几丁质水凝胶或几丁聚糖水凝胶)；硅橡胶 (sylastic)系统；胜肽系系统；蜡涂层；使用习知结合剂和 赋形剂的压缩药片；部份融合的插入管等。具体例子包 括，但不限制为：(a)浸蚀系统，其中该试剂以在基质内 的形式包含在该系统中，而基质例如为该些美国专利第 4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660所揭示者； 及(b)扩散系统，其中活性成分以受控制的速率通透过聚 合物，而该聚合物例如为美国专利第3,832,253和 3,854,480所揭示者。
传递系统的其它类型能使用于发明方法和组合物的 是胶体分散系统。胶体分散系统包括油脂系的系统，包 括水包油乳化液、微胶粒、混合的微胶粒和微脂体。微 脂体是人造膜水泡，作为在活体内或在活体外的传递载 体。单层大水泡(LUV)的尺寸范围为0.2至4.0微米，能 将巨大的分子封入至水溶液内部，然后以具生物活性的 型式载送至细胞中(Fraley，R.，和Papahadjopoulos，D.， Trends Biochem.Sci.6：77-80)。
微脂体能通过与特定配位子譬如单株抗体、糖、醣 脂质或蛋白质的偶合而瞄准至特定的组织。微脂体可从 Gibco BRL公司购得，例如LIPOFECTINTM和 LIPOFECTACETM，是由阳离子脂质譬如氯化N-[1-(2，3- 二油基氧基)-丙基]-N，N，N-三甲铵(DOTMA)及溴化二甲 基二(十八基)铵(DDAB)。制造微脂体的方法为本领域所 习知，在许多出版物里已有叙述，例如德国专利D E 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国) 82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (美国)77：4030-4034(1980)；欧洲专利EP52,322；EP 36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利 申请案83-118008；美国专利4,485,045及4,544,545；以 及EP 102,324。微脂体亦已由Gregoriadis，G.于Trends Biotechnol.，3：235-241作回顾。
其它类型的载具是生物兼容性的微粒子或适于植入 哺乳动物使用者的植入管。依据本发明方法，适用的生 物浸蚀植入管揭示在PCT国际申请案PCT/US/03307(公 开号WO 95/24929，标题为″聚合物基因传递系统″)。 PCT/US/0307描述了在适当启动子的控制下，用于含外 生基因的生物兼容、较佳为生物可分解的聚合物基质。 能使用聚合物基质来达到患者体内外生基因或基因产品 的持续释放。
聚合物基质较佳为微粒子的形式，譬如微球体(试剂 分散在整个固体聚合物基质中)或微胶囊(试剂存放在聚 合物壳的核心中)。前述聚合物的微胶囊含有药物，已揭 示在例如美国专利5,075,109中。其它用于含试剂的聚合 物基质形式包括薄膜、涂层、胶体、植入管和支架。选 择聚合物基质装置的尺寸和组合物，以在导入基质的组 织中产生有利的释放动力学。又根据将使用的传递方法， 选择聚合物基质的尺寸。较佳地，当使用气胶路径时， 聚合物基质和组合物是包含在表面活性剂载具内。能选 择聚合物基质组合物，使二者都具有令人满意的降解速 率，并亦可由生物黏着剂材料所形成，以进一步增加转 移的效率。亦能选择非降解而是通过扩散方式在一段时 间内进行释放的基质组合物。传递系统亦能为具生物兼 容性的微球体，适合用于局部、特定位置的传递。这样 的微球体揭露在Chickering，D.E.，等人，Biotechnol. Bioeng.，52：96-101；Mathiowitz，E.，等人，Nature 386： 410-414。
能应用非生物可分解和生物可分解的聚合物基质来 将本发明的组合物传递至患者。这样的聚合物可为天然 或合成的聚合物。选择聚合物的根据是所期望的释放时 间期，通常为数小时至一年或更长。典型地，释放期间 从数小时至3至12个月是最适合的。聚合物视需为水凝 胶的型式，其在水中能吸收的量大约高达其重量的90％， 并且视需要进一步与多价离子或其它聚合物交联。
能用来形成生物可分解的传递系统的合成聚合物实 例包括：聚醯胺、聚碳酸酯、聚烯(polyalkylenes)、聚乙 二醇、聚烯氧化物(polyalkylene oxides)、聚烯对苯二甲 酸酯(polyalkylene terephthalates)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、 聚乙烯酯、聚乙烯卤化物(poly-vinyl halides)、聚乙烯吡 咯烷酮、聚羟乙酸(polyglycolides)、聚硅氧烷、聚氨基 甲酸酯(polyurethanes)和其共聚物、烷基纤维素、羟烷基 纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酯和 异丁烯酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙织 维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素 乙酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素乙酸丁酸酯、纤维素乙 酸邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三乙酸酯、纤 维素硫酸钠盐、聚异丁烯酸甲酯、聚异丁烯酸乙酯、聚 异丁烯酸丁酯、聚异丁烯酸异丁酯、聚异丁烯酸己酯、 聚异丁烯酸异癸酯、聚异丁烯酸月桂酯、聚异丁烯酸苯 酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、 聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚乙烯 氧化物、聚乙烯对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯乙酸 酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、和乳酸及 羟乙酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酸酯、聚丁酸、聚戊酸、 乳酸-己内酯共聚合物，和天然聚合物譬如藻酸盐和其它 多醣体包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物 (代替物，加入化学基团例如烷基、烯基、羟化、氧化和 其它该些熟于本技艺者常用的修饰)、白蛋白和其它亲水 性蛋白质、玉米蛋白和其它醇溶性蛋白和疏水性蛋白、 其共聚物和混合物。通常，这些材料的降解不是通过酵 素水解就是暴露于体内水中，利用表面或整体的侵蚀。
治疗方法
在一具体实例中，本发明提供抑制患者心脏中PDE5 的方法，包含对患者投予PDE5抑制剂有效量的步骤，较 佳地，额外包含医药上可接受的载体作为组合物的一部 分。较佳地，这个方法是应用在治疗患有心脏病症或对 心脏病症敏感的患者，而该心脏病症选自由心脏肥大、 收缩功能降低、舒张功能降低、适应不良肥大症、收缩 功能持平的心脏衰竭、舒张性心脏衰竭、高血压心脏病、 大动脉狭窄、肥大性心肌病、缺血后心脏重塑和心脏衰 竭。其它具体实例包括本说明书中的任何方法，其中该 患者经确认须要做该征候的治疗。
本发明的另一态样，是在制造用来增强患者心脏功 能或降低患者心脏形态上、细胞或分子的重塑的药剂时， 使用PDE5抑制剂。较佳地，该药剂是用来治疗或预防患 者前述所提的疾病、病症或症候。
套组
本发明提供套组用来治疗或预防与心脏肥大包括 形态上、细胞或分子重塑有关的心脏病症。在一具体实 例中，该套组包括药物包装，而该药物包装包含有效量 的PDE5抑制剂(例如，PDE5a抑制剂譬如昔多芬)。较 佳地，该组合物是以单位剂量型式呈现。在一些具体实 例中，该套组包含无菌容器，而该容器含有治疗或预防 用的组合物；这样的容器能是盒、安瓿瓶、瓶子、小瓶 子、管、包、袋、泡壳包装、或其它习知的容器。这样 的容器能由塑料、玻璃、积层纸、金属箔或其它适合承 载药剂的材料所制成。
如果所要的本发明组合物或其组合，与用来指示将 它们投予有与心脏肥大相关的病症演变或存在演变风险 的患者的说明书一起提供，则该说明书一般包括关于使 用该化合物来治疗或预防与心脏肥大相关的信息。在另 一具体实例中，该说明书包括至少下列一项：化合物或 化合物组合的叙述；治疗心脏病症或其征候的剂量安排 和投药方式；预防方法；警告；征候；反向症候；过量 用药信息；有害反应；动物药理；临床研究；及/或参考 文献。用药说明书可直接印在容器上(当有时)，或作为卷 标贴到容器，或作为分开的纸片、小册子、卡片 或折页 而放置在容器中内或与容器一起提供。
以下实施例用来阐述本发明，但并不用来限制本发 明。该些熟于本技艺者将了解，在符合以上所述的发明 下，以下所提供的特殊结构可用许多方式来进行改变， 而仍保留该化合物或其组合的关键特性。
具体实施方式
实施例
实施例1：抑制PDE5A使心脏肥大、重塑和纤维化钝化
成熟C57BL6老鼠进行1至3星期由横向主动脉收缩 (TAC)所引发的慢性压力超载收缩，或进行假手术，然后 同时用混合在固体食物中的PDE5A抑制剂-昔多芬(100 毫克/公斤/日)或赋形药治疗。TAC引发显着的心脏腔室 和细胞的肥大(3星期+100％)，9星期后演变成腔室扩张， 其心肌缩短分率减小。TAC的动物(见第1A和1B图)， 其肥大和腔室重塑皆受到PDE5A抑制剂-昔多芬的抑制， 但是昔多芬对假手术控制组没有影响。游离血浆中昔多 芬浓度平均约为10nM(见第2图)，恰巧落在适于PDE5A 的特定范围内，与使用标准临床剂量所达到的浓度相似。 TAC引发与时间有关的心肌纤维化及肌肉细胞肥大的加 遽，该二者皆受到PDE5A的抑制(见第1C图，例如，9 星期后心肌纤维化减少67％，p＜0.0001)。此效应是以药 理学上的适当剂量来达成(见第2图)。使用100毫克/公 斤/日的口服剂量，得到游离血浆中昔多芬浓度为10nM。 以可任择使用的高选择性PDE5A抑制剂(EMD 360527) 进行各别研究，得到支持药物级作用的相同结果(见第5A 图)。
实施例2：抑制PDE5A逆转了已形成的肥大
对于抑制PDE5A是否能逆转已存在的肥大的更多临 床上应用问题进行测试。老鼠处于TAC状态7至10天， 此使心脏重量增加63％(p＜0.005)而腔室未扩张(见第3A 图)。将实验动物分成二组，一组以昔多芬再治疗2星期， 而另一组(控制组)只使用赋形药。观察1星期TAC的肌 肉细胞肥大和间质纤维化，以昔多芬治疗后该二症状皆 向基线逆转(见第3B图)。以昔多芬治疗的动物，其一 连串超音波心动图显示，左心室重量和壁厚度逐渐减少， 而收缩射出持平(见第3C图)。
实施例3：尽管持续后负荷，心脏功能仍增强
以侵袭性压力-容积(PV)分析进行详细的心脏功能检 查。第4A图显示，在腔室前负荷瞬间减少前与瞬间减少 期间测定PV循环，以产生特定的收缩和舒张功能指数。 如实施例所示，TAC(3星期)的PV循环和对应的收缩与 舒张界限关系向右移动-此与腔室重塑相符合。以昔多芬 共同治疗，结果使心脏容积持平和使收缩功能提高(例 如，收缩末期压力和容积间关系的斜率，图中实线)。同 样治疗3星期的假手术控制组显示没有变化。在肥大形 成后投予昔多芬时，心脏功能亦获得改善。由此可见， 使用PDE5抑制剂治疗，预防或逆转了与心脏肥大相关的 心脏功能改变。
此分析的总结结果显示在第4B图。无视于治疗方式， TAC相等地提高心室后负荷(标示为Ea)，只有以赋形药治 疗的TAC动物显示出射出分率(EF)减小。昔多芬恢复或改 善了以与负载无关的参数(最大力量指数(PMXI)和前负 荷再充盈博功(Msw))所评估的控制组和只经TAC的心脏 收缩功能，而舒张功能(Tau及压力下降的峰速率-dP/dt 最小)也有类似的结果。其它的功能和超音波心动图数据显 示在表1和表2。
表1：昔多芬治疗对在有意识的老鼠的左心室结构和功能的连续 超音波心动图量测値的作用。
控制组 TAC-3周 TAC-6周 TAC-9周 以载剂治疗 n＝7 n＝12 n＝7 n＝8 脏壁厚度 mm 0.69±0.05 1.24±0.03 0.90±0.03 0.90±0.05 LV Dim(dia) mm 2.85±0.05 3.40±0.14 4.94±0.23 5.16±0.36 LV Dim(sys) mm 0.92±0.01 2.18±0.21 3.98±0.36 4.31±0.49 LV Mass mg 55.4±1.5 175.7±13.5 195.3±9.3 208.3±14.1 EF ％ 96.6±0.2 70.9±4.7 45.3±7.3 41.3±8.0 HR min-1 631±21 631±15 610±23 531±33 以昔多芬治疗 n＝9 n＝18 n＝7 n＝7 脏壁厚度 mm 0.71±0.02 0.82±0.02* 0.86±0.03 0.86±0.03 LV Dim(dia) mm 2.87±0.09 3.09±0.06* 3.67±0.24* 4.14±0.36* LV Dim(sys) mm 0.89±0.05 1.17±0.08* 2.24±0.37* 2.54±0.57* LV Mass mg 59.1±5.6 82.2±5.0* 115.6±14.2* 142.5±21.5* EF ％ 96.5±0.2 93.4±1.1* 74.9±7.1* 71.7±9.9* HR min-1 634±9 595±7 617±18 608±25
资料为平均值±标准差，LV Dim(LV短轴尺寸，short axis dimension)，dia-舒张；sys-收缩。LV Mass-根据截椭圆模式 (truncated ellipsoid model)所估计的LV质量；EF-射出比率；HR-心跳速率。*表对于载剂治疗达p＜0.05；表对于控制组达 p＜0.05；表对于TAC3周达p＜0.05。
表2：昔多芬治疗在有或没有TAC的情况下，对由血压-容积分析所获得的 心脏血液动力学的作用
控制组 n＝5 昔多芬3周 n＝5 3周TAC n＝6 3周TAC+昔多芬 n＝5 3星期TAC+延迟2星期后 加入昔多芬 n＝4 ANOVA HR ESP EDP Ea EDV ESV EF CO dP/dtmax dP/dtmx/IP PMXI Msw Eesn Tau dP/dtmin PFR/EDV MIN- mmHg mmHg mmHg/μL μL μL ％ mL/min mmHg/s sec-1 mmHg/s mmHg mmHg/μL/g Msec mmHg/s sec-1 522.6±13.7 102.0±2.0 5.4±1.0 5.5±0.4 29.0±2.0 10.2±1.0 65.1±2.1 9.9±0.7 13368±370 205.1±6.6 31.6±0.9 79.4±4.1 37.9±5.8 7.8±0.3 -10728±236 37.1±5.6 558.5±22.9 101.5±2.6 6.5±1.0 5.3±0.5 32.8±2.3 13.0±2.7 61.4±6.1 11.1±1.1 11843±681 183.7±6.9 32.7±3.5 84.0±5.7 47.6±5.8 7.6±0.4 -10689±399 34.1±1.9 520.0±12.9(a) 159.6±4.6(b) 7.1±1.4 10.4±0.5(b) 38.8±3.4(c) 23.3±3.3(d) 41.3±3.5(d) 8.0±0.3(e) 12602±620 192.2±6.9 41.5±1.9 120.8±12.6 70.2±13.4 9.7±0.5(d) -10508±500 24.4±1.4 598.8±23.8 163.6±5.6(b) 7.6±1.4 10.5±0.8(b) 22.2±1.5 6.4±1.7 72.6±5.7 9.4±0.5 18638±1379(f) 256.5±8.4(g) 63.0±6.7(h) 162.5±10.5(i) 133.0±25.1(i) 6.3±0.4 -16758±917(f) 43.1±4.9(k) 574.6±21.7 184.0±9.1(b) 7.5±0.6 9.9±0.6(b) 29.4±2.0 10.9±2.1 64.0±4.7 10.7±0.5 14879±898 209.4±11.1 58.6±7.1(i) 171.3±27.6(i) 111.0±31.4 7.5±0.3 -14325±445(j) 30.6±3.6 0.032 ＜0.0001 NS ＜0.0001 ＜0.001 ＜0.0005 0.001 0.026 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.0005 ＜0.0001 ＜0.005 ＜0.0001 ＜0.001 0.014
表2说明：数据为平均值±标准差。HR-心跳速率；ESP-LV收缩终期血压；EDP-LV 舒张终期血压；Ea-有效动脉弹性量-整体心室后负荷指数；EDV-LV舒张终期体积； ESV-LV收缩终期体积；EF-射出比率；CO-心脏输出。收缩舒张指数是：dP/dtmax-血 压上升的最快速率；
dP/dtmx/IP-dP/dtmax常态化至瞬时发展(instantaneous developed)的血压；PXMI-力量 指数：最大心室力量除以EDV2；
Msw-前负载再充盈搏功3；Eesn-收缩终期弹性量常态化至测量的心脏质量。后 四个指数是LV收缩功能的与负载无关(load-independent)的测量。舒张指数是：Tau- 压力松弛时间常数所衍生的函数，是使用代入一级指数并入非零压力渐近线4；
dP/dtmin-LV压力下降峰率；PFR/EDV-峰值心室舒张充血率对EDV常态化。后者反 映早期舒张性质，即在早期充血期间松弛和被动僵化(passive stiffness)。较高的值反 映心脏舒张功能的增进。所显示的p值是代表变异的单向分析。Tukey事后因果 (post-hoc)多重比较测试是用来鉴定组群间的特定差异(specific difference)：a)对于 3周TAC+Sil达p＝0.042；b)对于Con和昔多芬3周达p＜0.001；c)对于Con达p＜0.05， 对于3星期TAC+Sil达p＜0.001；d)对于所有其它小组达p＜0.05；e)对于昔多芬3星 期达p＝0.02；f)对于Con、昔多芬3周及3周TAC达p＜0.005；g)对于所有其它小组 达p＜0.01；h)对于Con、昔多芬3周及3周TA C达p＜0.05；i)对于Con和昔多芬达p＜ 0.05；j)对于Con、昔多芬3星期和3星期TAC达p＜0.01；k)对于3星期TAC达p＜0.01。
以EMD 360527抑制PDE5A产生几近相同的生理结 果(见第5B图)。这些研究进一步显示，抑制PDE5A逆转 了由TAC所引发的胎儿基因表达(例如，钠尿胜肽、α-骨骼 肌动蛋白)提高，并且降低受磷蛋白和肌浆网Ca2+腺苷三 磷酸酶表达(见第5C和5D图)。
实施例4：TAC的心脏有较高PDE5A活性和由昔多芬所 诱导的PKG-1活性
心肌中cGMP的主要下游作用激酶被认为是PKG-1， 且PKG-1的增加是直接(基因活化作用)或是通过钠尿胜 肽信号来阻止肥大反应。前提是测试慢性昔多芬增加 PKG-1活性(见第6A图)。在假手术控制组中，昔多芬对 活性没有作用-与它对静止时的心脏功能可忽略的作用 相符合。在TAC的心脏中，抑制PDE5A多于使PKG-1活性 加倍。此结果说明PDE5A活性是选择性地增加心肌层肥 大。所以测定归因于PDE5A的cGMP酯酶活性及活性成分 (见第6B图)。在假手术控制组中，PDE5A贡献总活性的 35至45％，与由狗1所获得的数据相似。在TAC的心脏中， 总cGMP酯酶活性增加20％超过控制组(p＜0.005)，而归 因于PDE5A的成分占该总活性60％(对控制组的 p＜0.001)。因此，TAC提高PDE5A活性，该现象恰巧解 释昔多芬对PKG-1活化作用的抑制性提高。
然而总心肌cGMP的浓度并没有反映抑制PDE5A对 依赖于cGMP的信号的冲击(见第6C图)。假手术控制组 的cGMP基线并没有随着以昔多芬治疗而改变。在TAC 的心脏中cGMP增加，但是当这些心脏以昔多芬共同治 疗时，cGMP减少。在使用可任择使用的PDE5A抑制剂 各别研究中，证实了相同的结果(见第5D图)。如钠尿胜 肽表达减少所说明的，这恰好反映伴随的cGMP合成变 化(即，与肥大和壁伸张相关的预防)(见第5C图)。抑 制PDE5A没有改变基本或TAC情况的心肌cAMP浓度。
实施例5：抑制PDE5A抑制了钙调神经酶/NFAT及 ERK1/2的活化作用
钙调神经磷酸酶的活化作用与NFAT(活化T细胞的 核因子)转录因子的核迁移偶合，因而造成心脏肥大和腔 室重塑2，3。这条途径能用PKG-1加以抑制，因为新生肌 肉细胞中已活化PKG-1的过度表达，抑制了钙调神经酶 /NFAT活化作用和细胞肥大4。因此，在TAC的心脏中， 以有或没有使用昔多芬治疗来检查钙调神经酶表达。TAC 1和9星期后，钙调神经酶蛋白质表达提高超过2倍，而 且在这二个时间点，钙调神经酶蛋白质表现因使用昔多 芬而显着降低(见第6D图)。
有丝分裂原活化激酶ERK1/2是由伸张及Gαq受体偶 合的信号5，6，以及钙调神经酶活化作用7所诱导，本身就 是肥大的贡献者8。TAC1星期后，ERK1/2受到活化(磷 酸化/总ERK1/2增加)，而此亦因使用昔多芬治疗而受到 抑制。然而，9星期后，ERK1/2活化作用回到基线值(尽 管钙调神经酶的量持续上升)，昔多芬并没有可显示的效 果(第6D图)。
为了阐明抑制PDE5A如何影响与钙调神经酶/NFAT 有关的肥大，因而对新出生老鼠肌肉细胞中的此信号进 行评估。当利用肌节组织(α辅肌动蛋白，见第7A图)及重 新蛋白质合成(混入[3H]-白氨酸，见第7B图)进行评估 时，与脱羟肾上腺素(PE)一起培养引发细胞肥大。通过 伴随的昔多芬治疗此肥大受到抑制。为了测试昔多芬是 否抑制NFAT活化作用，以表达NFAT促进剂(与β-半乳糖 苷酶偶合)的腺病毒转染肌肉细胞。转染效率一致地＞ 95％(见第8A至8F图)。肌肉细胞然后与PE、钙活化剂 BayK8644(BK)或本质上表达活化的鼠科动物钙调神经 酶A(AdCn)的腺病毒一起培养。三种触发剂皆增强NFAT 促进剂活性。昔多芬抑制了由PE或BK所刺激的活化作 用，但不抑制由AdCn所刺激的(见第7C图)。基于β-半乳 糖苷酶活性分析的总结结果显示在第7D图。使用可任择 使用的腺病毒(具有与萤光素酶偶合的NFAT促进剂)进行 研究，产生相同的结果(见第9A至9C图)。这些结果与先前 用本质上活化的PKG-14转染新生肌肉细胞的数据一致， 并且支持钙调神经酶本身的标靶上游。
实施例例6：PDE5A抑制作用藉由上游抑制作用使Akt 去活化
受压力超载刺激且其过活化是与心脏肥大和重塑有 关的另一个主要信号梯瀑是Akt/PI3K途径。有生理压力 时，Akt活化作用是以中等水平发生，但在以更高水平， 会触发病理性的重塑和心脏衰竭9，10，11。经TAC增进的 Akt活性同时由磷酸化/总Akt蛋白质表现的比率(图10A) 及活性分析试验(图10B)显示。在压力负载后阶段(9星 期)，此情况特别显着。在二时间点上，昔多芬皆抑制此 反应至接近基线值(见第10A和10B图)。Akt由磷肌醇甘 油酯-3-激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)11，12所活 化。特别是，高活性PI3Kα与肌肉细胞肥大13有关，但 是由于cAMP的抑制13，14，γ异型和收缩功能障碍有关。 假设TAC3星期时收缩功能持平(见第3图)且cAMP未改 变，然后评估PBKα活性。TAC增加PBKα活性。此增加受 到以昔多芬共同治疗的抑制(见第10C图)。
为了测试抑制PDE5是否干扰下游Akt信号，我们检 验肝醣合成激酶3β(GSK3β)15，该激酶是以Akt和其它激 酶予以磷酸化(例如，PKA17和PKC18)，此导致它原有的 抗肥大活性无法受抑制19。1星期时，TAC使磷酸化/总 GKS3β的表达增加二倍，尽管Akt活性因以昔多芬治疗 而降低，GSK3B活化作用依旧未改变(见第10D图)。然而， TAC9星期后，Akt和GSK3β的活化作用受到更多的刺激， 而此时PDE5A的抑制使Akt和GSK3β二者活性皆降低。这 些数据支持与Akt无关的GSK3β活化作用，特别是在早期 (非扩张)TAC未受cGMP/PKG-1/PDE5A影响的阶段，而与 Akt有关的GSK3β活化作用则受昔多芬影响而减小。
为了进一步测试是否昔多芬对Akt活化作用的抑制 是通过下游信号途径来进行，具有本质上已活化Akt (AktTG)的心脏标靶过度表达的转基因老鼠，用赋形药或 昔多芬予以长期治疗。 以赋形药治疗的动物(年龄4至5 个月)，AktTG心脏较大且心脏功能降低(见第10E图和表 3)。
表3：无基因转殖的控制组(NTG)与心脏标定Akt过度表现(AktTG)形转殖作用的血液动力学分析； 此资料为侵入性压力-容量分析。
NTG AktTG pt NTG AktTG p2 p3
Vehicle Sildenafil
HR 538.7±9.7 515.3±24.6 NS 511.6±31.4 569.5±47.4 NS NS
ESP 96.1±2.1 93.4±4.6 NS 96.7±4.7 90.1±0.9 NS NS
EDP 7.5±0.7 8.1±1.6 NS 4.9±1.2 8.9±1.1 NS NS
ESV 17.6±1.9 36.4±6.1 ＜0.05 19.4±3.0 39.6±4.5 ＜0.01 NS
EDV 45.9±5.8 55.0±6.3 0.33 44.5±4.9 57.6±5.4 0.05 NS
EF 61.4±0.9 34.7±5.5 ＜0.005 56.7±3.5 31.8±2.1 ＜0.001 NS
dPdtmax 9447±556 7188±354 ＜0.02 10133±791 6993±156 ＜0.005 NS
dPdtmin -9051±573 -6248±349 ＜0.006 -9267±417 -6241±289 ＜0.001 NS
PMXI 27.1±1.8 18.2±2.7 ＜0.05 25.9±2.2 17.8±1.9 ＜0.05 NS
Tau 6.8±0.2 10.5±1.4 ＜0.05 7.4±0.6 10.0±0.6 ＜0.02 NS
dP/dtmax/IP 173.1±6.6 144.5±9.2 ＜0.05 176.4±14.8 128.5±2.9 ＜0.02 NS
Eesn 46.7±5.5 22.7±4.1 ＜0.02 39.9±1.5 21.5±2.9 ＜0.001 NS
资料为平均值±标准差。承上所述，p1-NTG及AktTG经载剂处理而非经配对t测试的P值； p2-NTG及AktKG经昔多芬(sildenafil)100mg/kg/day处理而非经配对t测试的P值；p3-AktTG及昔 多芬(sildenafil)经载剂处理而非经配对t测试的P值。
在6星期的期间，由一连串超音波心动图和心脏重 量/胫骨长度比率显示，昔多芬并没有减弱心脏肥大的演 变(见第10E图)。即使有使用昔多芬治疗，AktTG动物 的心脏收缩和舒张功能依然降低(见表3)。这些结果说 明昔多芬作用在Akt活化作用的上游，和PI3K酵素活性 结果一致。
这些结果显示，当增强处于持续压力超载的心脏功 能时，抑制PDE5A所呈现的新奇和潜在功效抑制了心室、 细胞和分子重塑。当改善功能后，即使再持续增加负载， PDE5A的抑制亦逆转了已存在的肥大。以小分子方法抑 制(或逆转)肥大至本研究中所观察到的程度是不寻常的， 此说明与PDE5A/cGMP/PKG-1调控相关的基本机制是有 效力的，且可能会干扰几条途径。假设疗法简单、有宽 泛的临床经验和PDE5A抑制剂的安全纪录，则适合用在 实质上任何有形态上、细胞或分子肥大重塑特征的心脏 病症的治疗。
按照先前已认定抑制PDE5A对心脏只有微小影响的 想法19，20，这些发现特别有趣。早期的研究几乎完全集 中在对处于休息状态的正常心脏的急性效应及/或反应。 心脏的PDE5A表达浓度低1，21，抑制PDE5A对基本功能产 生的急性效应相当小1，19，21。最近对二个不同的种类进行 研究，发现PDE5A能有效地调节β-肾上腺素 (beta-adrenergic)心脏和心肌细胞刺激，而此效应与其在z 带结构的战略位置相结合1，21。当前的研究显示，即使长 期的PDE5A抑制对正常心脏有可忽视的效应，但这情况 在心脏处于长期负载压力下时，产生剧烈改变。此情形 一部分是因压力负载的心脏比控制组有较高的与PDE5A 有关的cGMP酯酶活性，而造成在抑制PDE5A后PKG-1活 化作用有更大的改变。当合成cGMP受到刺激时，cGMP 代谢酵素的反向调节类似物在血管系统(PDE1A随慢性硝 酸盐注入而增加，作为硝酸盐不耐性的机制22)及肾脏 (PDE5A随慢性容量负载而增加，作为肾脏对钠尿胜肽去 敏化的机制23)已有报告。当前的结果是第一个显示出在 心脏中这样的调节作用。
不希望由局限于任意特定理论，PDE5A的经增强的 活化作用和PDE5A在cGMP平衡稳定性(homeostasis)的角 色可由数种机转解释。PDE5A活性是藉由cGMP所增强- 藉由直接结合至GAF区域24，以及藉由PKG-1的活化两 者，上述PKG-1在调节区域(regulatory domain)将PDE5A 磷酸化以增强催化活性25。上述两事件都增强了酯酶活 性-作为反向回馈循环(negative feedback loop)以调控 cGMP浓度。此外，在心脏于压力之下，cGMP依赖的信 号一般会变得较有效力-就像汽车的制动器。例如，受 cGMP合成刺激的一氧化氮在基础收缩(basal contractility)上的效能微小，但在肾上腺素(adrenergic) 的或其它压力26，27之下是较有效力的。急性的PDE5A抑 制作用对基础功能(basal function)的效能也是微小的，但 在意识清楚的狗，能够抑制受β-肾上腺素(β-adrenergic) 刺激的心脏收缩1。
先前关于心脏肥大的cGMP/PKG-1抑制的研究主要 瞄准于钠利尿肽(natriuretic peptide)依赖的合成。心脏的 ANP接受器缺失28，29，3010，40，41恶化负载所引致的心脏肥 大，然而轻微的腔室肥大可藉由经构成地活化的 (constitutively activated)ANP受体鸟苷酸环化酶 (guanylate cyclase)区域31的肌细胞标的 (myocyte-targeted)的过度表达来预防。这些改变伴随心 肌的cGMP的减少或增加。然而，不同于ANP偶联的信号 (ANP-coupled signaling)，PDE5A的抑制产生有效力的抗 肥厚效能(anti-hypertrophic)，而总心肌cGMP没有明显的 增加-即使大量的增加PKG-1的活性。这表示，总心肌的 水平(total myocardial level)不必然反射cGMP-信号。 cGMP信号的改变存在于细胞内的局部次区域(localized sub-domain)内是有高度可能的。其它实验室最近研究支 持上述论点，尤其是特定的PDEs标的cGMP的降解此概 念，上述cGMP的降解是取决于负责它的合成的酵素。 cGMP结合至PKG-1变构位置(allosteric site)被认为是 cGMP从细胞质隔离的重要机制以及保护它免于受 PDE5A水解32的手段。
这能造成PKG-1活化作用的增强，但不使cGMP等 量的增加。信号的分区化(compartmentalized signaling) 进一步由以下事实所支持：靠近心肌细胞中的z带结构 的PDE5A的表达会增强，且当此定位(localization)改变 时会失去生理活性。因为受钠利尿肽引致的高水平，总 cGMP可能特别反射出所牵涉的合成途径。经昔多芬治疗 的心脏，脏壁压力和ANP/BNP的表达减少；因此，可预 期cGMP有一些的下降。
持续的压力负载活化了多种激酶和磷酸酶，且藉由 基因工程选择性地标的许多此类蛋白质，显示此类蛋白 质有力地参与心脏的肥厚反应。PDE5A抑制作用看来好 象反转(counter)几条途径，且所观察到的改变总是可能 次发于迄今仍未确认出来的初级效应体(primary effecter)，但由于以下原因，这似乎是不太可能的。首先， 如同PKA依赖的信号，一般了解cGMP/PKG-1的信号可影 响多种酵素梯瀑(multiple enzyme cascade)4，33，34，包括钙 调神经酶(calcineurin)。其次，在对持续的压力负载有反 应的ERK1/2，Akt，PI3Kγ，和钙调神经酶所观察到的变 化是各自分别在仿真心肌肥大和/或在各种基因模式中重 塑的范围中显示， 由单一原因所造成是较不可能的。再 者第三，根据基因工程模式的结果，所观察到的变化的 幅度(amplitude)和时程与单一效应体是不兼容的。例如， 虽然ERK1/2的活化作用增加了老鼠的钙调神经酶35，36 的过度表达，在9星期的TAC之后，尽管钙调神经酶持续 刺激，ERK1/2磷酸化作用仍是微不足道的。在TAC小鼠 的钙调神经酶的基因抑制作用并不逆转ERK1/2活化作用35 ，但是投予昔多芬者观察到两者皆下降。钙调神经酶 的过度表达亦触发Akt的活化作用36，但是比有TAC者所 观察到的水平来的低许多。这不能解释Akt和钙调神经酶 改变的暂时性差异。缺乏PI3K抑制剂PTEN的小鼠发展出 肌细胞肥大和心脏收缩性功能障碍，以及Akt和GSK3β活 化作用，但并未显示ERK1/2活化作用13。此外，基因增 强Akt或PBK的活性达近于在本研究中由TAC所达到的水 平，会导致心脏收缩性功能障碍13和心室扩张10，37，但 并不会与钙调神经酶共同刺激(co-stimulation)有关。整体 而言，上述的矛盾处表示PDE5A抑制作用标的多于一个 途径。
在1星期TAC后由昔多芬在Akt和GSK3β之间造成的 明显矛盾是值得讨论的。GSK3β是由TAC活化，且本身与 心脏肥大19以及心脏功能障碍39有关。然而，GSK3β亦可 能由PKA磷酸化(通透锚激酶AKAP22017)、由PKCγ18磷 酸化以及由其它激酶16来磷酸化。假定Akt的活化作用下 降，即使GSK3β磷酸化持续，似乎一个或更多Akt不依赖 (Akt-indenpent)途径牵涉其中-但不受PDE5A抑制作用所 调节。心脏肥大晚期的特征是持续性的重塑和更大的Akt 和GSK3β活化。在心脏肥大晚期昔多芬对两者的抑制作 用可产生持续的益处。
虽然心脏肥大性传统上被视为能适应负载压力的适 应反应，证据显示它可能不是必需的代偿作用37。当昔 多芬没有完全地逆转或阻止在TAC后数星期至数月上述 为特征的心脏肥大、腔室和分子重塑，尽管负载依然持 续，但心脏的功能改善了。本研究结果是临床兴趣的， 这样的临床兴趣是由于本发明对肥厚性心脏疾病和心脏 肥大的高度预防效果，而肥厚性心脏疾病和心脏肥大在 许多形式的心脏衰竭中扮演显着的角色。以口服PDE5A 抑制剂的延伸使用(expanding use)来治疗疾病(诸如肺动 脉高血压)，不只勃起功能障碍，是当作长期治疗来支持 其使用。
实施例7：PDE5a抑制剂使心肌细胞对异丙基肾上腺素 (isoproterenol)的反应钝化
异丙基肾上腺素，是刺激心肌细胞收缩的β-肾上腺 素受器促效剂(β-adrenergic receptor agonist)。PDE5a抑 制剂(昔多芬，100nM)藉由响应肾上腺素促效剂-异丙基 肾上腺素的刺激来将初代单离(primary isolated)的心脏 肌肉细胞的增强的收缩作用钝化。(图11A-11D)。如果可 溶解性的鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase)被ODQ抑制， ODQ是一种可溶解性的鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)抑制剂，上述的钝化作用将不会发生(图14A 和14β)。这表示，PDE5a抑制剂藉由调控cGMP来改造 心脏功能，该cGMP是由sGC产生。因此，PDE5a抑制 剂的作用机制可能是与ATP敏感的钾信道的活化作用机 制是不同，该钾信道可能改造后缺血功能 (post-ischemic)。这些资料最终显示，PDE5抑制剂的效 应并非取决于动脉血管扩张或实际上根本并非取决于任 何的动脉变化。
实施例8：PDE5A抑制作用刺激PKG-1和Cgmp
为了直接判定在成体肌肉细胞(adult myocyte) PDE5A抑制作用是否刺激了PKG-1(图15A)，PDE5A抑 制性质在蛋白激酶G1(PKG-1)的效能单独以昔多芬、单 独以异丙基肾上腺素、二者联合、单独以他达拉非，以 及他达拉非与异丙基肾上腺素联合测试。PDE5A抑制作 用在基础情况下(约10％，p＜0.05)仅轻微地增强了PKG-1 活性。当异丙基肾上腺素与任一PDE5a抑制剂联合，在 PKG活性有50％的显着增加。这与PDE5a抑制的预期望 效能是一致的，PDE5a抑制是预期会增加cGMP水平， 而cGMP水平接着会活化PKG。为了直接监测细胞内 cGMP的产生，对cGMP水平敏感的萤光共振能量转移探 针被用在新生老鼠的肌细胞(图15B和15C)。异丙基肾 上腺素、昔多芬和一氧化氮供体(NO donor)(DEA/NO)全 都增强了FRET信号，提供了在肌肉细胞PDE5 A抑制作 用增强cGMP的直接验证(图15A-15C)。
实施例9：PDE5A抑制作用阻断经β-肾上腺素 (β-adrenergic)刺激的收缩，且慢性地预防受肾上腺素刺 激的心脏肥大
心脏腔室收缩力的急骤增加是藉由异丙基肾上腺素 输液引入至控制组C57b16小鼠。在心脏收缩功能的增加 是藉由活体内压力-容量关系(pressure-volume relation) 评估(图11E)，且该心脏收缩功能的增加是以图中循环的 增宽和左上角向左偏移而反射出压力容量关系的变化。 昔多芬以产生30nM的自由血浆浓度(free plasma concentration)的剂量经静脉传输，导致此肾上腺素刺激 的反应有显着的抑制。这支持心肌的效能使其维持在未 受损伤的心脏的水平(intact heart level)。此外，如果用 植入式渗透微型泵浦(implanted osmotic mini-pump)慢慢 地输注异丙基肾上腺素，心脏是以心脏质量的增加(心脏 肥大)及一些扩张做为响应。上述现象是以一组控制组 C57b16小鼠对照显示(图12A和12B)。与PDE5a抑制剂 (EMD 360527)共同治疗显着地抑制了心脏肥大的发展。
重要的是，PDE5a抑制作用对β-肾上腺素刺激的阻 断效能对上述干扰是专一性的，且使心肌cGMP的增加 是不能由其它方法所复制。图13A显示由心房的钠利尿 胜肽(atrial natriuretic peptide)(ANP)输注在心肌 (myocardium)刺激cGMP对异丙基肾上腺素心脏反应 (isoproterenol cardiac response)的效能。不同于在图11F 所提供的使用PDE5a抑制剂的资料，ANP在未受损伤的 心脏对ISO反应并没有效能。图13B显示在控制组条件 下所量测到的cGMP水平，以及暴露至静脉内PDE5a抑 制作用(EM360527)或ANP的cGMP水平。后者导致心肌 cGMP显着地上升-但在交感神经刺激反应(sympathetic stimulatory response)则没有效能。另一方面，PDE5a抑 制剂在所量测到的总心肌cGMP效能几乎可以忽略，但 作为β-肾上腺素刺激的负向调节剂(negative regulator) 这是非常有效力的。在心脏所测得的cGMP没有上升先 前已用来支持在心脏中缺乏显着的生理角色此一理论。 然而，这些资料显示，该信号是高度分区化的，且精确 地正确的区域由PDE5a抑制作用所调控以对心脏收缩力 产生冲击，且这不是简单的借着由合成的手段(synthetic mean)来增加cGMP所仿真的。
实施例10：PDE5A的表达和在试管内(in vitro)的活性
在单离肌肉细胞中PDE5A mRNA的表达比在肺脏中 较低超过一百倍(图16B)。在单离的成体心肌细胞中观察 到有蛋白质的表达，但蛋白质水平同样远低于在肺脏中 (图16A)。SDS-PAGE凝胶显示在肺脏加载的量(load)有 1μg，相较而言，心脏的量是100倍以配合(match)在肺脏 的密度水平。先前的报告显示，PDE5A在肌细胞中是以 低水平表达，且这样的表达的低水平推导出PDE5A在心 肌细胞并非扮演功能显着角色的假定。相较于肺脏，蛋 白质和基因整个心脏的表达亦发现是减少的(图16C)。在 肺脏，它主要存在于血管平滑肌细胞。在此，SDS-PAGE 凝胶加载20μg心肌衍生的蛋白质或肺衍生出的蛋白质， 其相对表达差异(relative expression differences)是非常 明显的。上述现象由在这些组织之间mRNA表达的差异所 支持(图16A)。在心脏整体，在单离的肌细胞中观察到在 约95Kda处有主要的条带，此条带和在肺脏所观察到的 条带几乎是同样大小。在心脏如预期地观察到第二条在 约70kDa的条带，这反应了剪接片段(splice variant)或蛋 白质水解片段。使用不同的抗体仍观察到相似的发现41，42。
成体单离肌细胞和未受损伤的心脏心肌(intact heart myocardium)的总cGMP以及PDE5a依赖的cGMP酯酶活性 被判定出来(图16D和16E)。上述组织任一者与IBMX(是 一种广谱PDE抑制剂，a broad spectrum PDE inhibitor)共 培养，会将cGMP酯酶的活性降低大约90％。上述组织萃 取之任一者与昔多芬(是选择性的PDE5a抑制剂)共培养， 揭示仅cGMP的成分是由PDE5A正常代谢。在单离的肌细 胞和在整个心脏两者都是将近30％。藉由放射性酵素分 析试验(radio-enzyme assay)获得PDE5A依赖的cGMP酯酶 有相似的结果41(32±7.3％-NTG(n＝9))。
之前的研究报告在心肌层PDE5A的表达是低水平的 43，44，且在休息时的心脏功能PDE5A的抑制功能是微小 的41，45，46，47，上述的研究推导出PDE5A在心脏扮演微小 角色的错误结论。与先前的报告相反，本研究显示，上 述的低水平表达并不意味PDE5A缺乏生理功能。相反的， 本研究的结果指出，PDE5A在β-肾上腺素的刺激作用，以 及在心脏重塑、肥大，和对慢性压力的功能障碍扮演重 要角色。藉由抑制PDE5a来防止cGMP代谢的效能似乎实 质上大于较藉由钠利尿肽偶联的合成(natriuretic peptide-coupled synthesis)增加cGMP的合成48，49或经肾 上腺素刺激的收缩力改变。这支持了先前从未被认同或 辨识的一个非常新的机转，此机转是说标的的cGMP的操 弄(targeted cGMP manipulation)可直接影响心脏肌肉细 胞以及心脏本身。
实施例11：PDE5在肌细胞的位置(Myocyte localization of PDE5A)
在整个(throughout)心肌细胞都有PDE5A出现(第 17A至17F图)，且亦出现在z带条纹(z-band striation)(第 17A图(左区)，(右区)-α-肌动蛋白(actinin))。PDE5A免 疫染色被特定阻断肽所抑制(第17B图，左)，然而同样 的肽并未阻断PDE1C染色(第17C图，左)，支持了分析 试验的专一性。PDE5A出现在z带条纹(图17D和17F)， 且与一氧化氮合成酵素NOS3的位置是一样的 (colocalize)。
实施例12：基线分析和昔多芬效能
PDE5A在心肌是以低水平表达51-53，且因为昔多芬 或其它药剂仅轻微地降低动脉压力且对在休息状态下54，55 的或运动期间56，57心脏的射出分率或输出量并没有 明显的影响，由这些药物所造成的抑制作用并未被认为 是直接影响心脏功能。如前文所报导，尽管表达水平低， PDE5A可展现对肾上腺素刺激强力的局部性调节作用 (localized regulation)58，59，且其慢性抑制作用显着地限 制和逆转受到压力超载而刺激的心脏肥大和重塑。这些 结果支持了PDE5A抑制剂在治疗或预防心脏肥大和重素 的治疗用途。
为了判定在健康人类受试体，昔多芬预治疗 (pretreatment)是否抑制经β-肾上腺素刺激的心脏收缩， 利用巴酚丁胺(dobutamine)压力测试在口服投予昔多芬 或安慰剂之前与之后执行随机化的、双盲、安慰剂控制 组、非侵入性的血液动力学研究。
多巴酚丁胺是具有正向影响肌肉收缩效能(positive inotropic effect)且临床上用来作为对心脏组织药物刺激 及施压(pharmacologically stimulate(and stress))且增加 心脏磊血功能的肾上腺素β-1促效剂。昔多芬藉由抑制 磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase-5，PDE5A)来提高细胞 内的环形GMP的量并导致血管扩张。如本文所报导，昔 多芬亦有力地影响了经β-肾上腺素受器促效剂或压力超 载所刺激心脏。为了判定昔多芬在人类是否使经多巴酚 丁胺刺激的心脏功能钝化，三十五个健康志愿者接受随 机化的、双盲、安慰剂控制组研究，在此研究中心脏功 能是以在口服昔多芬(100mg，n＝19)或安慰剂(n＝16)之前 或之后对多巴酚丁胺的反应而评估。超音波多谱勒和非 侵入性的血压资料产生了与负载无关的收缩指数 (load-independent contractility index)(最大力量指数和 心脏收缩终期弹性量，maximal power index and end-systolic elastance)、射出分率，及扩张功能的测量值。 在活化治疗组(active treatment group)，血浆自由昔多芬 浓度是44±29nM，而昔多芬的代谢物-去甲基昔多芬 (desmethyl-sildenafil，预期占母药水平的50％)的浓度是 22±18nM21。在接受昔多芬的四个实验体中，在此研究 之时血浆浓度非常低(亦即，全都＜6nM，中值3.6nM，在 组平均的10倍以下)。此外，这些实验体中每一者亦都 具有低的代谢水平，与用来解释次治疗(subtherapeutic) 浓度的快速代谢作用不符。既然测试我们的假说需要建 立治疗性的昔多芬水平，这些实验体从分析中排除。另 外一个贝排除的实验体是因为他的血液样本遗失了。在 此研究中并无有害的事件。
在安慰剂组和昔多芬治疗组在关于年龄(安慰剂组 和昔多芬治疗组分别是30±6岁与30±8岁，p＝0.95)、 性别(50％女性与79％女性；p＝0.1)、身体重量指数(23.9± 3.5与22.9±2.5kg/m2；p＝0.45)，或心脏功能指数(表4) 并没有没有基线差异。
表4：第一次对第二次多巴酚丁胺研究的收缩和舒张数据的分析 Placebo(n＝16) Sildenafil(n＝19) P value 收缩变量 B1 Δ(B2-B1) B1 Δ(B2-B1) a b 收缩血压(mmHg) 106±13 -3±9 107±12 -6±3* 0.79 0.26 舒张血压(mmHg) 59±7 -2±6 62±6 -6±5* 0.18 0.05 心率(min-1) 61±9 -2±4 66±12 +0±3 0.24 0.44 搏出容积(mL) 77±17 +3±7 72±16 +5±6* 0.34 0.44 全身外围血管阻力(dyne*s/cm5) 1310±280 -55±130 1370±310 -170±60* 0.57 0.03 峰值力量指数(mmHg/sec) 297±42 +6±31 312±61 +21±13* 0.42 0.26 收缩终期弹性量(mmHg/mL) 2.3±0.8 +0.2±0.6 2.6±0.9 +0.4±0.2* 0.40 0.25 射出分率 61±5 +3±4 61±6 +6±2* 0.99 0.05 舒张变量 E速率(cm/see) 87±12 +0±12 92±19 -4±12 0.32 0.24 A速率(cm/sec) 59±8 +5±8 57±17 -3±8 0.59 0.63 E/A比率 1.5±0.2 +0.1±0.2 1.7±0.4 -0.1±0.4 0.06 0.18 E’速率(cm/sec) 19±6 -1±3 18±5 +0±3 0.68 0.66 E/E’速率 4.8±1.4 +0.2±0.8 5.2±1.4 -0.3±0.8 0.45 0.13 IVRT(msec) 84±22 -2±13 71±13 +8±12 0.06 0.05
表4说明：最初的基线及利用第一条基线及第二条基线区别二组不同的病患。B1：最初的基线； B2：在最初的多巴酚丁胺测试之后重新校正基线；Δ(B2-B1)-区别第一条基线与第二条基线的不同。 P値：a)在最初基线(B1)于二研究小组之间的非配对t测试；b)二种方式方差分析(RMANOVA)，基线 级数相互作用及研究药物(昔多芬(sildenafil)对于安慰剂)。*p＜0.005(于小组中，经配对t测试于第一和 第二基线之间)E-早期的舒张装塡波；A-心房装塡波；E’-早期装塡期间二尖瓣的环形组织速度； IVRT-等容松弛时间。
安慰剂组和昔多芬治疗组的第-基线和第二基线之 间的变化亦在表4中提供。在给昔多芬组的实验体伴随 着射出分率一前一后(tandem)的增加，动脉压和全身血管 阻力有轻微的降低。在昔多芬组收缩力也轻微的上升了， 在该组可能反射出对血管扩张、直接效能(direct effect) 或轻微的残余多巴酚丁胺效能的反射反应。重要的是， 组间(inter-group)分析发现药物治疗对基线收缩力或扩 张功能改变没有显着影响(B2-B1，重复测量的方差分析 (RMANOVA))，只对动脉阻力有影响，而对扩张动脉压及 EF有不明显的(borderline)影响。
实施例13：昔多芬(sildenafil)钝化经多巴酚丁胺刺激的 收缩力
图18A展示在接受作为本研究药物的昔多芬的实验 体在多巴酚丁胺刺激之前和之后，例示的多谱勒大动脉 血流资料及其对应的血压及计算出的峰值力量指数。大 动脉血流和收缩压随着第一次多巴酚丁胺测试而上升， 力量指数增加将近200％，然而上述反应在同一个患者在 接受口服昔多芬之后实质地钝化了(第18B图)。分组资 料显示在第19图和第20图。两组(昔多芬组对安慰剂组) 对第一次多巴酚丁胺的收缩反应都是一样的，且特征是 收缩力增强以及血压连同外围血管阻力的下降。在第二 基线的收缩力变化被大幅的逆转了。在接受研究药物之 后，在第二次多巴酚丁胺测试有显着的差异，且接受昔 多芬的实验体展现出收缩反应的下降(第20图)。该等改 变并非简单地由在昔多芬治疗组稍微较高的基线所造成 (亦即，降低净改变)，峰值反应(第二次测试对第一次测 试)本身是显着的被昔多芬所抑制而安慰剂并无(力量指 数为p＜0.015；射出分率为p＜0.01，及心脏收缩终期弹性 量为p＜0.002)。
第20图展示在投予该研究药物之前(第一次试验)和 之后(第二次试验)由多巴酚丁胺所造成的功能的绝对变 化。每个实验体的资料是经过配对的。峰值力量指数在 昔多芬治疗之前上升了+254±82mmHg/s(从约为300 mmHg/s的基线)，但在治疗之后上升了仅164±80 mmHg/s(p＝0.001)，而在安慰剂投予之前和之后该指数改 变是相似的(236±89对215±83mmHg/s，p＝0.31；群组 间比较是p＝0.04)。中值力量指数(p＝0.04)和心室收缩终 期弹性量也观察到相似的发现(2.52±1.5对 0.84±0.9mmHg/ml，昔多芬组是p＜0.001；1.8±1.1对1.4±1.1 mmHg/ml，p＝0.25；安慰剂组；组间是p＝0.008)。多巴酚丁 胺在昔多芬投予之前增加射出分率达15±3％(絶对变化)， 但在昔多芬投予之后仅增加4±5％(p＜0.001)，而在安慰剂 组，EF在两次试验中的上升是相似的(p＝0.12；组间是 p＝0.001)。在经多巴酚丁胺所诱导的搏出量(stroke volume)改变亦可观察到相似的差异。
重要的是，在心脏收缩反应的改变并非由血管负载 的改变所造成。在外围血管中由多巴酚丁胺所调节的阻 力下降并非由昔多芬所改变(modify)(p＝0.66，第3图)， 在本研究的各期在心脏的预负载(preload，舒张终期容积 (end-diastolic volume))两组之间并没有差异。舒张终期 的容积随着多巴酚丁胺的投予而减少，但相较于安慰剂 组，在昔多芬组的反应也是被钝化了。在第一次多巴酚 丁胺试验中，在两组中心律平均值仅轻微地上升(在安慰 剂组和昔多芬组分别是3.5±7.7bpm和6.7±2.2bpm，第20 图)，而在一些实验体甚至还下降了。后者似乎和所用的 低剂量有关，这样的低剂量产生收缩效能而非变时 (chronotropic)效能，但对血压和血流的上升引发反射反 应。在昔多芬投予之后，随着多巴酚丁胺(+14.5+-4.7， p＜0.01)的投予，心律增加的更多，但以RMANOVA与安 慰剂组比较，并未达统计显着的程度。
实施例14：收缩功能的效应
表5提供在投以研究性药物的前和后，藉由多巴酚 丁胺(dobutamine)得知在舒张功能上絶对的变化。
表5：于舒张的功能上探讨由多巴酚丁胺(dobutamine)诱导昔多芬(sildenafil)的影响 Placebo Sildenafil 变量 D1-B1 D2-B2 D1-B1 D2-B2 p value- RMANOVA E速率(cm/sec) 25±10 21±16 20±18 12±11 0.19 A速率(cm/s) 5±8 7±11 5±9 11±7 0.33 E/A比率 0.3±0.3 0.2±0.3 0.3±0.3 -0.1±0.3* 0.14 E’速率(cm/s) 3.9±2.3 2.9±3.1 4.1±3.4 1.5±2.4* 0.19 E/E’速率 -0.2±0.9 -0.3±1.0 +0.1±0.8 -0.2±0.7 0.21 IVRT -28±14 -24±15 -17±11 -20±13 0.30
表5：资料是最初(D1-B1)及第二次(D2-B2)多巴酚丁胺(dobutamine)测试结果，各个参数比较多巴酚丁胺(dobutamine) 刺激高于基线值的变化。*p＜0.01，p＜0.05，p＜0.06。P值是三种方式方差分析(RMANOVA)，测试对于三种方式相互作用 于多巴酚丁胺(dobutamine)测试次序之间(在接受研究药物前与后)，呈现或缺乏多巴酚丁胺(dobutamine)，及处理剂 (昔多芬(sildenafil)对于安慰剂)。简称是依照表1定义。
于第一次测试，早期的(E)和晚期的(A)舒张充填率在 二个群组上升幅度相似，并且E/A比率轻微地上升了。 昔多芬(Sildenafil)导致在E速度(p＝0.06)的边线下降，A 速度(p＝0.03)轻微地上升，和E/A比率的下降(p＝0.007)。 多巴酚丁胺(Dobutamine)刺激造成了在组织多谱勒仪的 上升。E′速度由昔多芬(sildenafil)钝化(p＝0.002)。多巴 酚丁胺(dobutamine)的效应在E/E比率，LV结束心脏舒 张压力，及等容松弛时间，由研究药物或在其它群组来 看是未改变的。重要的是，在群组之间分析显示于舒张 作用的任何参数(p值被显示为3种方式重复测量的方差 分析(RMANOVA)使用在心脏收缩的分析)，研究药物在多 巴酚丁胺dobutamine)变化并没有重大交互作用。
在最初的多巴酚丁胺(dobutamin)测试，心脏收缩和 舒张功能相似地改善了二个治疗小组(即；峰值强度指数 上升了80±28％-安慰剂，82±31％-昔多芬(sildenafil)小 组，p＝NS)。在实验体接受昔多芬(sildenafil)的处理，他 们的第二个多巴酚丁胺(dobutamin)反应发生显着的钝 化，以峰值强度，射出分数，及结束心脏收缩弹性量改 变，全部各自降低32±34％，66±64％，和56±63％。(各 p＜0.001对于最初的反应)。这相对于安慰剂群组，其展 示了相似的功能反应的二个多巴酚丁胺(dobutamine)测 试。当昔多芬(Sildenafil)与安慰剂处理结果比较，昔多 芬(Sildenafil)处理经由多巴酚丁胺(dobutamine)诱导并 没有显着地改变舒张变化。因而，PDE5A抑制性质藉由 昔多芬(sildenafil)使β-肾上腺素(beta-adrenergic)对于心 脏收缩的反应钝化。这支持PDE5A在人的心脏的活性和 它在调控刺激心脏功能的角色。
这项研究报导第一直接证据，昔多芬(sildenafil)影响 健康人类的心脏功能，当静止状态下具有最小的效应时， 抑制β-肾上腺素(beta-adrenergic)刺激心脏收缩的功能。 重要的是，这个抑制效应没有取决于后负荷或心脏预压 变化。这表示，PDE5A抑制性质可调控人体心脏的应力 反应。
PDE5A抑制剂在血管床和组织61，62具有有潜力的效 应。此外，昔多芬(Sildenafil)降低肺动脉阻抗，也许在 治疗肺高血压63，64是有效的。它亦改善内皮细胞的功能， 一氧化氮生物兼容性标志和整体血管健康，尤其是瘾君 子65和心脏衰竭的病人66。动物研究表示，昔多芬 (sildenafil)令人印象深刻的是藉由预先处理局部缺血效 应降低梗塞尺寸67，68。
一个早期报导告诉我们，PDE5A抑制剂也许可增加 心脏发病69的风险，几项研究试图定义心脏功能的药物。 在14人的研究中以冠状动脉疾病，Herrmann等人，报导 100mg口头昔多芬(sildenafil)轻微地降低静止系统和肺 压力，但在心跳速率并没有效应，左心室充填压力或心 脏输出54。在一项随后研究中，人已知或疑似罹患冠状 疾病接受了仰自行车运动测试，且昔多芬(sildenafil)再次 轻微地降低了血压，但没有改变基线或受运动而被刺激 的心跳速率，血压，运动期间，或功能性保存56。其它 调查发现了只有在运动的表现时适度的改善57或延长达 到局部缺血的ST段衰退70。
对心脏效应的直接分析在试管实验被获得，但这些 结果依然有限和互相冲突。PDE5A基因表现是存在于人 体心脏52，59，虽然蛋白质表现和酵素活性是已被解答 的51，53，71。最近证据发现当基因和蛋白质表现量低迷时， PDE5A在肌肉细胞之内部被分区，并且它的抑制功能是 能改变心脏和肌肉细胞功能。这在静止情况下无法被观 测，但只有当心脏被刺激，例如藉由β-肾上腺素 (beta-adrenergic)促效剂58，59或压力超载60。β-刺激共同 活化腺苷酸活化酶(adenylate cyclase)增加循环3′5′-腺苷 (adenosine)单磷酸盐(cAMP)以及鸟苷酸环化酶 (guanylate cyclase)产生cGMP72。之前活化蛋白激酶A， 该酵素由标靶钙处理和肌丝相互作用增强收缩性，但后 者作用是为″制动器″来反抗这个作用。这达到一部分由 活化双重受质PDEs来分解cAMP73，和蛋白激酶G，其酵 素在心脏细胞内抵制多种cAMP/蛋白激酶A(protein kinaseA)效应72，74，75。
结果报告在此文中提供第一叙述于PDE5a抑制性质 在人体抗肾上腺素(anti-adrenergic)的效益。心脏功能被 研究在静止期间和在肾上腺素的刺激期间，使用各种参 数专一性对心脏和与心脏负载较不相关的变化76，77。虽 然重新校正基线收缩性轻微地(但极大)高于在群组接受 昔多芬(sildenafil)的处理，这并不表示研究结果因为峰值 反应本身显着下降了。不刻意局限任一种特殊理论，这 些结果无法排除藉由(sildenafil)可能像接受器的角色降 低敏感度，虽然预先的证据支持细胞内cGMP/PKG信号59 的主要角色支持一个远程的机制。多巴酚丁胺 (dobutamine)应力测试而不是运动作为这被使用了由昔 多芬(sildenafil)提供对肾上腺素的调节作为一个更加专 一性的评估。的确，甚至健康的实验体没有投以阻断剂 (beta blocker)显示在整体运动压力测试表现或最大的心 脏输出量上并没有改变-尽管对肾上腺素刺激的收缩性 有清楚的作用。心脏浓度指数提供一个敏感负载无关的 收缩性51，64，72，74，76，77，79，84指数，系由动脉或静脉舒张76 的影响程度低。
不同于心脏收缩的改变，多巴酚丁胺(dobutamine)刺 激的舒张功能，经各群组之间的比较，由昔多芬 (sildenafil)处理并未显着钝化。在群组分析表示，接受昔 多芬(sildenafil)的实验体在早期的心室充填和松弛有微 小的上升(E和E′的速度)且在心房充填更多量的增加(A 速度)。当在舒张作用能反射轻微的降低时，它与降低的 收缩度和增加以多巴酚丁胺(dobutamine)注入以昔多芬 (sildenafil)处理后的结束心脏收缩容量是一致的。于净心 室排斥的下降能限制早期舒张反冲作用，其归因于对心 脏早期的迅速充填。这反之导致增加充填在静脉收缩期 间，特别因为结束心脏舒张容量在两个小组是相似的。 E/E′速度比率显示与左心室舒张压39有好的关联性。在 基线或与多巴酚丁胺(dobutamine)，E/E′比率在两个小组 是相似，并且重要的是没有证据显示左心室舒张压是随 昔多芬(sildenafil)增加而增加，即使使心脏收缩的增强钝 化。样本尺寸也许归因于舒张效应的缺乏，因为扩张非 侵入性的测量可能会有更加巨大的变化。
昔多芬(Sildenafil)被报导在增加交感神经活性于没 有改变心跳速率或血压的情况85，并且这可能扮演了一 个在基础收缩性轻微上升的角色在第二条基线在实验体 接受昔多芬(sildenafil)处理。这样的活性也许被期望由下 游调节肾上腺素的刺激，因此使多巴酚丁胺(dobutamine) 反应钝化。这变化是微小的，但与在血浆儿茶酚胺里随 着以昔多芬86(sildenafil)(约70pg/mL)的轻微增加是一 致的，和大约3至4个级数的强度更低于当初预期多巴 酚丁胺(dobutamine)的处理。此外，在群组之间的分析上 并没有统计学上的不同。昔多芬(Sildenafil)亦被报导降 低迷走神经在心跳速率87的抑制性质和单一剂量88研究 增加的心跳速率几乎10％。这也许可解释本研究中在昔 多芬(sildenafil)处理之后，对多巴酚丁胺(dobutamine)增 进心跳速率的反应。更高的心跳速率就其本身而言是期 望增加收缩性，由力量频率关系，但是在对昔多芬 (sildenafil)群组的分析中，反作用是真实的。
昔多芬(Sildenafil)在未受损伤的人类心脏可能有效 力地抑制由肾上腺素刺激的收缩性。早先研究表示，昔 多芬(sildenafil)和其它PDE5 A抑制剂在健康个体勃起功 能障碍的治疗是安全和有效的80，冠状动脉疾病患 者54，56，和心脏衰竭的病人57。相对于早先报导，PDE5A 抑制剂在人的心脏没有作用，结果在此文中报导表明， PDE5A抑制剂在儿茶酚胺刺激下是心脏功能的重要调节 者。肾上腺素的刺激钝化将可能证明增强神经激素刺激 等病状是有利的，譬如高血压，左心室肥大，及心脏衰 竭。
实施例15：PDE5A抑制心脏分子再成型
当心脏上形态的改变是剧烈的变化与心脏再成型有 关，这些形态上的变化增强早期基因转录和蛋白质活性 改变的反应(图21A-F)。PDE5 A抑制处理可预防eNOS (NOS3)解除和限制金属结合蛋白酶(metalloproteinases) 的活化作用。慢性大动脉带(TAC)导致NOS3内正常二聚 体(更高mw形式)的损失(图21B)。这导致反应的氧气种 类的活化作用在上图21C。这个图显示正向染色由超氧 化物阴离子萤光探针(dihydroethidium)侦测。这根据由对 钙相关NOS3活性的降低(图21C)，和由NOS3使增加相 当数量的超氧化物形成(图21D)。
此外，PDE5A抑制性质预防NOS二聚体形成损失- 支持一个重要新颖的机制，藉由该机制的PDE5a抑制性 质限制在肥大性的和心脏衰竭的氧化剂应力(图21E)。图 21F表示，昔多芬(sildenafil)抑制明胶酶(gelatinases)中 金属结合蛋白酶(metalloproteinase)的活性。标记的胶体 溶解与慢性TAC一起被被观测于图21E(3WTAC)。这活 性藉由和昔多芬(sildenafil)共同处理而大大的被抑制。因 为明胶酶(gelatinases)的活化作用结合于心室再成型和 扩张，这表明，PDE5a抑制性质可抑制金属结合蛋白酶 (metalloproteinase)在分子再成型的角色，而分子再成型 与心脏衰竭和肥大性有关连。
RhoA的增加和Rho激酶的表现和活性被观测在慢性 大动脉带(TAC)(图21A-21C)。昔多芬(sildenafil)抑制 RhoA，Rho激酶1(ROCK1)及Rho激酶2蛋白质表现和 活性(ROCK2)(图22A-22C)。在rhoA和rho激酶的增加 与分子再成型以及心脏肥大和扩张有关连。由这些分子 里抑制性质改变，昔多芬(sildenafil)于分子再成型的治疗 是有用的。
STAT3磷酸化的增加，其活化STAT3，与TAC(图 23A和B)有关连。昔多芬(sildenafil)抑制STAT3的活化 作用(图23A)。因此，昔多芬(sildenafil)抑制分子再成 型与改变在STAT3活性相关。
实施例16：昔多芬(sildenafil)改善心肌能学
昔多芬(sildenafil)的治疗改善心肌能学。老鼠暴露于 TAC三个星期。心脏于活体内利用核磁共振光谱仪(NMR spectroscopy)估算高能磷酸盐的代谢。一个标准图像和光 谱被显示在图24A和24B。磷酸肌酸(PCr)与总ATP的比 率被使用作为测量能量储备和平衡。当以昔多芬 (sildenafil)保存正常能量平衡治疗，TAC大大地降低这个 比率。这表明，PDE5A抑制性质改善心肌能学和增强在 应力之下心脏能量的储备。
结论报导此文中利用以下材料和方法。
动物模型
使用雄性C57BL/6老鼠(8-11个星期，Jackson实验 室)。压力超载由横向大动脉收缩导致。条带步骤的急性 和慢性死亡率＜5％。仿真控制老鼠进行了同样操作，但 没有大动脉收缩。以PDE5抑制剂口头治疗是由混合药物 注入半软的啮齿目动物(Bioserv；4-6g/day)，并且充分提 供的每日必须营养。控制组是以载剂和食物混合喂食。 雄性基因转殖老鼠与持续性地反应Akt的心脏过度表现 (16-20周)89，对照组(liter mate controls)用一样的方法 以载剂或PDE5抑制剂处理。
PDE5A抑制剂
昔多芬(sildenafil)柠檬酸盐(Viagra，Pfizer)，EMD 360527(MERCK KgA)及他达拉非(tadalafil)(Cialis，Eli Lilly)被使用于研究。活体内慢性研究，昔多芬(sildenafil) 100mg/kg/day被用来产生平均自由血浆浓度10.4± 2.3nM(IC50 5-10nM)。这与浓度上是可比较的，观察在 人体内1mg/kg/day，和反射昔多芬(sildenafil)将近一百 倍在老鼠的高代谢。1.5g/kg/day EMD 360527用来产生 EMD 360527血浆浓度4μM(IC50 1μM在体外血管圆环 里)。100nM或1μM的昔多芬(sildenafi10被使用在 cGMP-PDE活动分析和出生鼠心肌细胞研究。50nM他达 拉非(tadalafil)被使用在cGMP-PDE活动分析。
生理研究
经胸二维导向M型超音波心电图(Transthoracic two-dimensional guided M-mode echocardiography)在非 被麻醉的老鼠实验。测量完成后使用超音波心电图 (echocardiography)系统，SEQUOI C256 (Siemens，Munich，DE)与15MHz线性排列变换器。无损伤 的心脏血液动力学的分析执行由前所述90。这些研究使 用了四个电极压力容量导管(model SPR-839，Millar Instuments)放置经由左心室尖端在开放胸口的麻醉动物 和由阻抗安置于沿纵轴记录心室容量及由微量测压法 (micromanometry)测压力。
RNA点墨分析
RNA样品是根据制造商的实验方法从急速冷冻心脏 使用立即可用的试剂作为分离总RNA TRIZOL试剂(Life Technology，Gaithersburg，MD)而制备。RNA点墨分析 以一套寡核苷酸探针使用已公开实验方法而进行59。资 料显示经过对各别样品所测得的GAPDH标准化。
西方点墨法
蛋白质是从急速冷冻心脏组织使用如前所述的萃取 缓冲液而制备90。抗体包括钙调神经磷酸酶(calcineurin) (1∶2000稀释，BD转导实验室(San Diego，CA)，GSK3β， Ser9-phospho-GSK3β，Akt，Ser473-phospho-Akt，ERK， Thr202/Thr204-phospho-ERK(1∶1000稀释，Cell Signaling Technology，Beverly，MA)。初级抗体的结合 藉由经山葵过氧化酶共轭的二级抗体和增强化学发光来 显现(Pierce，Rockford，IL)。
环状核苷酸分析
心脏以冰冷的PBS洗涤，在6％三氯乙酸中均质化， 以水-饱和乙醚离心和萃取。移出水层，真空脱水，并将 颗粒状物重新悬浮在醋酸钠缓冲液，用于cAMP和cGMP 酵素免疫分析(Amersham Pharmacia Biotech， Buckinghamshire，UK)。
PDE5A、PI3Kα、Akt和PKG-1活性
低Km cGMP磷酸二酯酶总活性是在1μM/L受质于线 性条件下以有和没有PDE5A抑制剂(昔多芬(sildenafil) 0.1至1μM，或他达拉非(tadalafil)50nM)或IBMX(50μM) 使用萤光极化分析(Molecular Devices)来予以分析。PDE- 分析在1μM cGMP侦测到数个高亲合力cGMP-PDE (PDE5A、PDE9A)及双重专一性PDE(例如，PDE1C、 PDE3A、PDE10A和PDE11A)。PI3Kα活性是由Elisa分析 随后接着PI3K免疫沉淀(Seize X IP Kit，Pierce)利用p85α 单株抗体(Cell Signaling)，以萤光极化(Molecular Device，Perkin-Elmer Victor3 plate reader)测得的活性来 进行评估。Akt活性(以s473-pAkt抗体，GSK-3融合蛋白 受质免疫沉淀)使用商业上的套组(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)来进行。PKG-1活性是从整体 心脏溶解产物由比色分析，CycLex(Clinisciences， Montrouge，FR)来进行分析。
组织学
心脏以10％甲醛固定隔夜，然后埋置在石蜡里，切 成5μm厚度并以PAS-六亚甲四胺(PAS-methenamine)染 色。心肌细胞直径和间质胶原比率是在观测者不清楚组 织来源的情况下使用计算机辅助的图像分析测得(Adobe Photoshop 5.0，NIH Image J)。对至少4至5个不同心脏， 以五个不同领域的细胞(共计50至70个细胞于各个心脏) 进行定量以供细胞分析。
新生大鼠心肌细胞的研究
如上述将大鼠新生心肌细胞从1至2天大的史-道二 氏(Sprague-Dawley)大鼠分离出来50。在有或没有以 100nM或1μM昔多芬(sildenafil)共同培养之下，细胞培养 物藉由以脱羟肾上腺素(phenylephrine)(PE；1μM；Sigma Chemical(St.Louis，Missouri)或Bay K8644(1μM；Sigma) 培养四十八小时来加以刺激。为了估计NFAT活化作用， 使用先前叙述的方法将细胞以表现三个连接β-半乳糖苷 酶(β-galactosidase)的NFAT结合位置(p3xNFAT-GL)的腺 病毒转染72。另外的研究是利用另一种编码萤光素酶 (luciferase)的报导腺病毒(reporter adenovirus)来进行， 该报导腺病毒是由NFAT激活子所驱动。此步骤在PE、 BayK8644或活化的钙调神经磷酸酶的刺激之前二十四 个小时进行。后者藉由共同转染编码Ca2+非依赖型且持 续活化的截短型老鼠钙调神经磷酸酶A(calcineurin A) (AdCnA72)的复制缺陷型腺病毒而达成。转染是以100 PFU的MOI于2mL(6cm培养皿)DMEM在37℃潮湿且含 5％二氧化碳的培养器中进行二个小时，在此之后，将培 养液用包含1μM的昔多芬或是载剂的培养液替换。在另 外的48小时后，NFAT活化作用藉由β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)组织学/活性或萤光素酶活性来估计。将 肌肉细胞固定于2％聚甲醛和0.2％戊二醛在PBS10分钟， 于24℃培养在X-gal染剂(在PBS，20mmol/L K4Fe[CN]6 3H2O，20mmol/L K3Fe[CN]6，2mmol/L二氯化镁和1 mg/mL X-gal[Promega]在DMSO)二个小时，以PBS润洗， 并利用7％甲醛缓冲液后固定六个小时。β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)活性利用商业测试套组(Galacto-Light Plus，Applied Biosystems)由微盘式冷光仪(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)所测得的发光现象来分析。 萤光素酶活性由商业套组(Stratagene，La Jolla， California)分析并以盘式冷光仪读取。
[3H]-白胺酸的并入
在血清饥饿(serum starvation)起始后24小时，在昔 多芬(100nM或1μM)存在或不存在下，将新生心肌细胞培 养在一式三份的含有1μMPE的12孔培养盘里二十四个 小时，然后在含有1.0μCi/ml[3H]白胺酸的相同培养液中 培养另外的十二个小时。吸出培养液，并且将细胞利用 冰冷的PBS洗涤和利用冷的10％三氯乙酸(TCA)固定在冰 上30分钟。以5％的TCA洗涤两次并以水洗涤一次之后， 并入TCA可沉淀材料的放射线是在溶于0.25M氢氧化钠 之后藉由液体闪烁计数法测得。
统计学分析
资料是以平均值±测量标准误差表示。多个群组之间 的差异由变异数分析(ANOVA)并接着由Tukey的多重比 较测试来进行比较。二群组分析由t测试执行(适当地使 用配对或非配对测试)。一系列的研究由重复测量变异数 分析(repeated measures ANOVA)来检测。
专一性的血液动力学指数法：
所有血液动力学资料皆使用习知发展的软件记录， 数字化信号在2KHz。舒张末期容积和收缩末期容积分别 是在等容收缩和松弛期间测量的平均容积。ESP是在最大 心室弹性的压力(压力/容积比(P/V ratio))1。EDP是在压 力-容积循环的较低右手角落的舒张压。心输出量是从放 置在胸部主动脉附近的血管外围血流探针(Transonics， Ithica，NY)测得。Ea等于收缩末期压力除以心搏排血量的 比。将容积导管信号对增益(gain)和偏移(offset)进行校 准。增益是藉由设定导管导出的心输出量(等于压力-容积 循环宽度乘以心跳速率)至彼等由经校准的血流探针值 所得的心输出量。偏移是运用高张盐水的方法测得80。 心室强度等于压力乘以血流的瞬间乘积，且峰值强度除 以EDV获得强度指数PMXI79。由一组在暂时性下腔静脉 阻塞期间所测量的收缩末期压力-容积点(最大P/[V-Vo]) 获得Eesn。此相关性Ees的斜率由心脏重量标准化且表示 为每gm心脏重量。Msw是由心搏作功及EDV(其来自用于 导出Eesn的同一组交变载荷心脏循环)之间的线性关系 导出，，且该Msw是另一种非负载依赖型的心脏收缩功能 的评估4。Tau由下列模型获得：P＝Po+ae-t/□，代入在 等容松弛期间的资料。dP/dt是从数字过滤器(5个点算出 的斜率)而导出。PFR/EDV是从早期舒张期间的容积信号 中最大的第一衍生物除以EDV而导出。
动物研究为例子7-11
雄性野生型及NOS3-/-老鼠(C57BL6，Jackson Labs，6 至8星期)的研究。PDE5A在活体内以昔多芬(sildenafil) 处理被抑制了(100μg/kg/min；37±5.2nM自由血浆浓度)； 或EMD-360527/5(MERCK KgA，Germany，160-300 μg/kg/min)。两种化合物有IC50大约10nM纯化的PDE5A (PDE1或PDE3对于1-20μM)。体外研究使用了0.1至1 μM昔多芬(sildenafil)(SIL)，0.05μM他达拉非(tadalafil) (于IX PBS制备)，或0.1μM EMD-360527/5于1％丙二醇 缓冲液中。单独以载体于实验体内及实验体外已被证明 是毫无效应。
活体研究
异丙肾上腺素(Isoproterenol)(ISO：20ng/kg/minutes i.v.x 5分钟)有或没有PDE5A抑制剂给予未受损伤的老 鼠麻醉，和活体内心脏功能由压力容积相关评估23，以 固定的心房搏动速率约600至650min-1。资料在基线测 量，与ISO，重新良测基线，PDE5A抑制性质，及PDE5A 抑制性质+ISO。ISO只反应于高度可再生的。
隔绝肌肉细胞研究
被切除的心脏是由缓冲布满包含BDM(1mg/ml)及 牛磺酸(taurine)(0.628mg/ml)3分钟，0.9mg/ml胶原酶 (Worthington Biochemical Co.，Lakewood，NJ，type 2；299 U/mg)和0.05mg/ml蛋白酶(Sigma Chemical，St Louis， Missouri)6至7分钟。心室轻轻地削剪了，过滤(滤网 150μ)，分离(1分钟500转)，随着钙的增加以泰洛氏溶 液(Tyrode’s solution)清洗(Ca2+最终浓度为1.8mM)。细 胞与5μM Indo-1 AM(Molecular Probes)由领域刺激在一 个被倒置的萤光显微镜(Diaphot 200；Nikon，Inc)培养， 清洗，和在27℃研究，。肌小节长度(IonOptix，MA)并且 整体细胞钙瞬间被测量了。随着基线，细胞暴露于10nM 的ISO，然后ISO+SIL，或ISO+EMD-360527/5在pH7.45。 SIL在0.1％DMSO和EMD在0.001％丙二醇里被稀释了； 控制溶液包含了相似的载剂浓度。
基因和蛋白质表现
PDE5A基因表现由定量实时PCR量测。残余的染色体 组DNA藉由DNaseI的处理从mRNA移除，及cDNA的合 成随着SuperScript First-Strand Synthesis System为 RT-PCR(Invitrogen)。相对的量由SYBR Green I分析 (QuantiTect SYBR Green PCR，Qiagen)测得了PDE5A mRNA，利用以下激活子：PDE5A(Gen Bank： NM_153422.1)上部激活子1493 5′-TGAGCAGTTCCTGGAAGCCT-S′，低激活子15965′- ATGTCACCATCTGCTTGGCC-3′，产物104bp；GAPDH (NM_008084.1)上部激活子263 5′-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAC-S′，低激活子363 5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′，产物101bp；以 GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems)。PCR 样品跑了一式三份，并且GAPDH被使用于正规化不同的 样品PDE5A内容。反应(20μl)执行了与300nM专一性的 激活子对为40个循环的放大作用(变性作用在95℃、15 s，黏合于60℃、30s，及扩张在72℃、30s)。PCR产物 放大作用专一性由熔化的曲线分析证实了24。在最后的 PCR周期后，反应热变性超过35℃，温度梯度从60至 95℃以0.03℃/s加热。
蛋白质溶解产物从整体心肌层和被隔绝的心肌细胞 于透析缓冲液(# 9803，Cell Signaling Technology， Beverly，MA)中与小型蛋白酶抑制剂(#1-836-153，Roche， IN)以及5％氚核(Triton)萃取。以下12,000g离心法三十 分钟，蛋白质定量(#23235，Pierce，Rockford，IL)， NUPage LDS样品缓冲添加(#161-0737，Biorad， Hercules，CA)，并且溶解产物电泳在NuPAGE 4至12％ Bis-Tris聚丙烯醯胺(polyacrylamide)胶体(Invitrogen， San Diego，CA)。膜与兔子聚株抗体培养量的上升受到纯 化的牛肺PDE5 A 的压制(Cell Signaling，MA) [1∶5,000]，氨基终端PDE5A区域(从Mauro Giorgi赠送 而来)[1∶5,000]，或重组PDE5A[1∶10,000]。
萤光共振能量转移(FRET)影像
心室肌肉细胞从1至2天的史一道二氏(Sprague dawley)大鼠(CharlesRiver Lab，MA)制备及与载体携带 cGMP传感器cygnet-2.1做转染77，在该传感器EYFP以较 少pH敏感变异黄石英替换89，及成像的十八至二十四小 时在转染之后叙述90。图像(50-80ms曝光)在每10秒使 用订制软件和由Imagej(NIH，MD)处理取得。FRET是变 化在480nm/545nm辐射强度(ΔR)在430nm上激发91表示 在基础强度在(Ro)百分比的改变。细胞浸泡了在HEPES 缓冲的林格氏(Ringer’s)调控盐(1mmol/L氯化钙)，在室 温(20-22℃)。
PDE5A及PKG-1活性分析
低Km，cGMP磷酸二酯酶活性了在1μMol/L受质被检 验，藉由萤光极化(Molecular Device，CA)在线性情况下， 或2阶段放射性标志测定法18，有或没有添加的昔多芬 (sildenafil)(0.1-1μM)，他达拉非(tadalafil)(50nM)，或 IBMX(50μM)。PDE分析在1μM cGMP侦测出数个高亲合 性的GMP-PDEs(PDE5A，PDE9A)及双重专一性PDEs (即；PDE1C，PDE3A，PDE10A和PDE11A)。
PKG-1活性由比色分析(CycLex，Nagno，Japan)检验 了执行在整体肌肉细胞与有或没有添加ISO(10nM)做培 养，SIL(1□M)，他达拉非(tadalafil)(50nM)，或sGC抑 制剂ODQ(3□M，Sigma)。在10分钟以后，细胞被溶解 了且PKG-1活性测得了。
免疫萤光组织学
野生型心肌细胞被固定在50％甲醇/50％丙酮里，和 整页与序列专一性的PDE5A抗体(从K.Omori赠送而来) 培养，在1∶5,000稀释和不是老鼠单株α-actinin(1∶500 稀释；Chemicon Intern.C A)，或NOS3(1∶3000；转导实验 室，KY)。第二次培养使用了反兔子Alexa 488和反老 鼠Alexa 546(Molecular Probes，OR)(1小时，27℃)。 细胞是在一个Zeiss倒置的表面萤光显微镜 (epifluorescence microscope)以氩氪雷射共焦扫描系统 (Ultra VIEW，PerkinElmer Life Science，MA)成像。
人体研究
四十个健康志愿者从一般人口中以被张贴在周围的 社区所响应广告的人来补充。由病史，体格检查，和经 胸超音波心电图(transthoracic echocardiogram)筛选实验 体。个体以心脏病，动脉粥样硬化，高血压，糖尿病性 酮尿，肺高血压，肾脏或肝疾病，抽烟，怀孕，或在硝 酸盐治疗之下，肾上腺素阻隔药物，或医学上已知干涉 昔多芬(sildenafil)的药物动力学被排除了。研究设计如以 下一个随机化的，双盲，安慰剂控制流程，使用倾向昔 多芬(sildenafil)的3∶2分配比率。所有实验体均指示在研 究之前禁食大于6小时。一根静脉内导管安置在前臂， 并且15至20分钟之后，血压，心电图的最初的基线(B1) 测量，并且对评估心脏作用的超音波多谱勒仪在仰卧位 置获得。静脉内投以多巴酚丁胺(dobutamine)(5μg/kg/min) 5分钟达到一个稳定的反应，及重复测量(D1)。多巴酚丁 胺(dobutamine)被中断了，并且假使15分钟回归到基线 状态。实验体然后接受了不是100mg口头昔多芬 (sildenafil)就是安慰剂。在75分钟之后(平均时间峰值浓 度)82，血样被获得证实昔多芬(sildenafil)浓度。资料再 次记录了第二条基线(B2)，和在第二多八胺(dobutamine) 注入(D2)期间使用和第一次测试相同的流程。
心脏功能分析
心脏收缩功能由心脏专一性指数确定了压力，次元， 和流程的联合测量。动脉压力由一个腕式及臂式的示波 器(oscillometric arm cuff)(Dinemap，Critikon，Tampa， FIa)测得，及2维超音波多谱勒仪由Agilent Sonos 5500 (Philips，荷兰)使用一根3兆赫探针测得。所有超音波多 谱勒仪测量是数字化地需要光盘和由一位蒙蔽的调查员 离线分析。各次测量反射了平均至少3不同跳动。大动 脉流程与速度对时间的积分结果是相等的，此积分从脉 冲波多谱勒仪在左心室流出径乘以横截面直径。行程排 量，峰值，和平均流程从这信号波形测得。心脏输出量 是心跳速率和行程排量的产物。系统血管阻抗是平均动 脉压力(1/3脉压+舒张压)与心脏输出量的比率。
心脏收缩性由几个与装载无关的指数评估。主要结 果是峰值强度指数(最大的强度由结束心脏舒张容量划 分)的变量，其指数反射心脏可收缩的状态与后负荷和预 压无关，如同早先被证明的76，77，84。最大强度与峰值大 动脉流程和收缩压产物近似，其强度强烈地与压力和流 程最大的瞬间压力和流程产物(y＝1.08x+0.002，r2＝ 0.97，p＜0.0001；根据对报导侵略性资料从有心脏情况范 围较大病人的分析)有关联。与负载无关的第二次结果收 缩性参数是平均心室强度指数和结束心脏收缩的压力/容 量比率，略计为心室结束心脏收缩的弹性量。
其它第二次结果变量包括心脏收缩和舒张功能定期 测量。射出分数从结束心脏舒张和心脏收缩的容量藉由 Simpson’s方法利用顶端4和2心室观点测得。结束舒张 容量与行程排量是相等的(从多谱勒仪)由射出分数划分， 以收缩末期容量的相等区别前者和后者。脉冲波转二尖 瓣流入(transmitral flow)多谱勒仪光谱及横向二尖瓣环 状组织多谱勒仪成像速度已作为早先习惯使用估计舒张 的功能89。E/E’比率被确定了作为左心室充填压力的一 个代理标志如同之前确认的90。等容松弛时间由连续波 多谱勒仪测量，此时间为在大动脉流程停止和二尖瓣流 入起始之间。
血浆昔多芬(sildenafil)浓度
血浆昔多芬(sildenafil)及它的代谢产物：去甲基化昔 多芬(desmethylsildenafil)在各个实验体由液相层析仪和 质谱仪(SFBC Analytical Labs，North Wales，PA)测得。
统计学的分析
样本大小估计设定侦测出a＞20％在左心室以响应 多巴酚丁胺(dobutamine)造成峰值强度指数下降，与 α＝0.05和80％强度。在预先的动物研究中，随着PDE5A 抑制性质由多巴酚丁胺(dobutamine)刺激的强度降低约 50％，人体实验中，从大约300mmHg/sec基线来看76， 多巴酚丁胺(dobutamine)强度增加大于100％。侦测出在 这个反应(60mmHg/sec)与50mmHg/sec的标准偏差(从 预先的资料)降低20％，以15个安慰剂控制的样本尺寸 和23个昔多芬(sildenafil)处理的实验体估算。
所有统计分析执行使用Systat(R)软件。结果被表达作 为平均值±标准偏差。血液动力学的资料被分析于使用重 复三种方法测量变异数分析，用三个群组的因素是：1) 呈现或缺乏多巴酚丁胺(dobutamine)；2)安慰剂对于昔多 芬(sildenafil)；并且3)第一次对于第二次多巴酚丁胺 (dobutamine)挑战研究。主要测试是测试在小组分析之 间，是否昔多芬(sildenafil)(对于安慰剂)改变了在第一个 和第二个多巴酚丁胺(dobutamine)反应之间的差距，并且 由一个三种方法交互作用的项目测得，包括各个群组因 素。这个模型亦包括一个项目测试对于昔多芬(sildenafil) 的一个整体作用(对于安慰剂)，该测试与相对多巴酚丁胺 (dobutamine)反应完全没有关系。在群组分析亦执行使用 2尾型Student的配对t测试估计个体的多巴酚丁胺 (dobutamine)反应(即；D1-B1，D2-B2)，和双向变异数分 析测试是否研究药物改变了在各个小组的这个反应。某 范畴的变量可使用卡方试验比较。
本发明的实际应用，除非另外说明，分子生物学传 统技术(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生化和 免疫学，这些都已经是是在熟练的大师视界之内。这样 技术充分地被解释在文学，譬如：″Molecular Clonig：A Laboratory Manual″，second edition(Sambrook，1989)； ″Oligonucleotide Synthesis″(Gait 1984)；″Animal Cell Culture″(Freshney 1987)；″Methods in Enzymology″ ″Handbook of Experimental″(Weir，1996)；″Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells″(Miller and Calos，1987)； ″Current Protocols in Molecular Biology″(Ausubel， 1987)；″PCR：The Polymerase Train Reaction″，(Mullis， 1994)；″Current Protcols in Immunology″(Coligan， 1991)。这些技术可适用于对聚核苷酸的生产和多胜肽的 发明，以及也许考虑制作和实践发明。特殊具体化的有 用技术将被谈论在以下的部分。
DHE染色方法
新鲜冰冻的LV心肌层(8μm切片)与超氧化物阴离子 萤光探针(dihydroethidium)(DHE；Molecular Probes， Eugene，Ore；2μM)被培养在1小时37℃，该探针可评估 O2的形成(典型地核子局部化)。图像执行了在Zeiss倒置 的表面萤光显微镜(epifluorescence microscope)接触氩氪 雷射共焦扫描系统(Ultra VIEW，Perkin Elmer Life Science，Inc)。DHE的激发/辐射光谱各别是488和 610nM，以585nm侦测。
心脏明胶酶(gelatinase)分析
MMP-2和MMP-9分解体外明胶由酶谱分析 (zymography)评估。简要地，修饰过的Laemmli缓冲液没 有巯乙醇(mercaptoethanol)，此缓冲液被添加于分解的组 织样品且装在10％明胶(Invitrogen Corp.，San Diego，CA) 中。在电泳之后，胶体以复性(renaturing)的缓冲液在室 温清洗二次接着形成缓冲液(Invitrogen Corp.，San Diego， CA)，然后以一个商业上可利用的考马斯(Coomassie)染色 显现细胞溶解的带(SMPLYBLUe，Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
RhoA活性分析
RhoA活性分析由免疫沉淀(immunoprecipitation)使 用商业上可利用的被固定的抗体(SEIZE X IP，Pierce Biotechnology，IL)。抗体的使用是兔子聚株抗体培养的 上升受到RhoA的压制(Upstate，NY[1∶2500])并且随后 商业上的活性分析是根据制造商的规格(Upstate Biotechnology，NY)
西方分析
蛋白质分解从整体心肌层及隔绝的心肌细胞使用溶 解的缓冲液(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)与 微型蛋白酶抑制剂(Roche，IN)及5％氚核(Triton)(Sigma Chemical St.Louis，Missouri)获得。随后以12,000g离心 法30分钟，蛋白质定量(Pierce Rockford，IL)，添加 NUPage LDS样品缓冲液(Biorad，Hercules，California)， 且分解电泳在NuPAGE4至12％的Bis-Tris-聚丙烯醯胺 (polyacrylamide)胶体(Invitrogen，San Diego，CA)。膜与 兔子聚株抗体培养的上升受到ROCK1或ROCK2压制 (Cell Signaling，Beverly，MA)[1∶3,000]。
STAT3活化研究
心肌组织萃取物是在SDS新胶体中电泳，和探测酪 胺酸磷酸化(Tyr705)及整体Stat3。在另外的研究中，鼠 出生肌肉细胞被培养了，然后暴露在介白素-6(IL-6， Cell Signaling，100ng/ml)一个小时。在一些研究中，细 胞在IL-6之前以昔多芬(sildenafil)预处理(1μM)30分 钟，和然后再以IL-6同样步骤。在其它研究中，细胞与 混杂的多醣体沉默RNAs预转染(LipofectamineTM， Invitrogen)为STAT3(siRNA，SmarTTpool Stat3)。蛋白质 萃取物从肌肉细胞萃取物在1个小时潜伏期之后获得， 和探测Statl(Tyr701)及Stat3(Tyr705)(Cell Signaling Inc.)的磷酸化和总蛋白质浓度。siRNA转染入初生的肌 肉细胞。
其它
由前面的叙述，它将是明显的，变异和修饰也许对 此文中发明的描述采取它对各式各样的用法和情况。这 样具体的做法亦是在以下要求的范围之内。所有的专利 和出版物在这个规格由参考文献被提及并入此文中在同 样程度上，就好象各独立专利和出版物具体地和各自地 表明由参考文献合并。
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实施例1：抑制PDE5A使心脏肥大、重塑和纤维化钝化
成熟C57BL6老鼠进行1至3星期由横向主动脉收缩 (TAC)所引发的慢性压力超载收缩，或进行假手术，然后 同时用混合在固体食物中的PDE5A抑制剂-昔多芬(100 毫克/公斤/日)或赋形药治疗。TAC引发显着的心脏腔室 和细胞的肥大(3星期+100％)，9星期后演变成腔室扩张， 其心肌缩短分率减小。TAC的动物(见第1A和1B图)， 其肥大和腔室重塑皆受到PDE5A抑制剂-昔多芬的抑制， 但是昔多芬对假手术控制组没有影响。游离血浆中昔多 芬浓度平均约为10nM(见第2图)，恰巧落在适于PDE5A 的特定范围内，与使用标准临床剂量所达到的浓度相似。 TAC引发与时间有关的心肌纤维化及肌肉细胞肥大的加 遽，该二者皆受到PDE5A的抑制(见第1C图，例如，9 星期后心肌纤维化减少67％，p＜0.0001)。此效应是以药 理学上的适当剂量来达成(见第2图)。使用100毫克/公 斤/日的口服剂量，得到游离血浆中昔多芬浓度为10nM。 以可任择使用的高选择性PDE5A抑制剂(EMD 360527) 进行各别研究，得到支持药物级作用的相同结果(见第5A 图)。
实施例2：抑制PDE5A逆转了已形成的肥大
对于抑制PDE5A是否能逆转已存在的肥大的更多临 床上应用问题进行测试。老鼠处于TAC状态7至10天， 此使心脏重量增加63％(p＜0.005)而腔室未扩张(见第3A 图)。将实验动物分成二组，一组以昔多芬再治疗2星期， 而另一组(控制组)只使用赋形药。观察1星期TAC的肌 肉细胞肥大和间质纤维化，以昔多芬治疗后该二症状皆 向基线逆转(见第3B图)。以昔多芬治疗的动物，其一 连串超音波心动图显示，左心室重量和壁厚度逐渐减少， 而收缩射出持平(见第3C图)。
实施例3：尽管持续后负荷，心脏功能仍增强
以侵袭性压力-容积(PV)分析进行详细的心脏功能检 查。第4A图显示，在腔室前负荷瞬间减少前与瞬间减少 期间测定PV循环，以产生特定的收缩和舒张功能指数。 如实施例所示，TAC(3星期)的PV循环和对应的收缩与 舒张界限关系向右移动-此与腔室重塑相符合。以昔多芬 共同治疗，结果使心脏容积持平和使收缩功能提高(例 如，收缩末期压力和容积间关系的斜率，图中实线)。同 样治疗3星期的假手术控制组显示没有变化。在肥大形 成后投予昔多芬时，心脏功能亦获得改善。由此可见， 使用PDE5抑制剂治疗，预防或逆转了与心脏肥大相关的 心脏功能改变。
此分析的总结结果显示在第4B图。无视于治疗方式， TAC相等地提高心室后负荷(标示为Ea)，只有以赋形药治 疗的TAC动物显示出射出分率(EF)减小。昔多芬恢复或改 善了以与负载无关的参数(最大力量指数(PMXI)和前负 荷再充盈博功(Msw))所评估的控制组和只经TAC的心脏 收缩功能，而舒张功能(Tau及压力下降的峰速率-dP/dt 最小)也有类似的结果。其它的功能和超音波心动图数据显 示在表1和表2。
表1：昔多芬治疗对在有意识的老鼠的左心室结构和功能的连续 超音波心动图量测値的作用。
控制组 TAC-3周 TAC-6周 TAC-9周 以载剂治疗 n＝7 n＝12 n＝7 n＝8 脏壁厚度 mm 0.69±0.05 1.24±0.03 0.90±0.03 0.90±0.05 LV Dim(dia) mm 2.85±0.05 3.40±0.14 4.94±0.23 5.16±0.36 LV Dim(sys) mm 0.92±0.01 2.18±0.21 3.98±0.36 4.31±0.49 LV Mass mg 55.4±1.5 175.7±13.5 195.3±9.3 208.3±14.1 EF ％ 96.6±0.2 70.9±4.7 45.3±7.3 41.3±8.0 HR min-1 631±21 631±15 610±23 531±33 以昔多芬治疗 n＝9 n＝18 n＝7 n＝7 脏壁厚度 mm 0.71±0.02 0.82±0.02* 0.86±0.03 0.86±0.03 LV Dim(dia) mm 2.87±0.09 3.09±0.06* 3.67±0.24* 4.14±0.36* LV Dim(sys) mm 0.89±0.05 1.17±0.08* 2.24±0.37* 2.54±0.57* LV Mass mg 59.1±5.6 82.2±5.0* 115.6±14.2* 142.5±21.5* EF ％ 96.5±0.2 93.4±1.1* 74.9±7.1* 71.7±9.9* HR min-1 634±9 595±7 617±18 608±25
资料为平均值±标准差，LV Dim(LV短轴尺寸，short axis dimension)，dia-舒张；sys-收缩。LV Mass-根据截椭圆模式 (truncated ellipsoid model)所估计的LV质量；EF-射出比率；HR-心跳速率。*表对于载剂治疗达p＜0.05；表对于控制组达 p＜0.05；表对于TAC3周达p＜0.05。
表2：昔多芬治疗在有或没有TAC的情况下，对由血压-容积分析所获得的 心脏血液动力学的作用
控制组 n＝5 昔多芬3周 n＝5 3周TAC n＝6 3周TAC+昔多芬 n＝5 3星期TAC+延迟2星期后 加入昔多芬 n＝4 ANOVA HR ESP EDP Ea EDV ESV EF CO dP/dtmax dP/dtmx/IP PMXI Msw Eesn Tau dP/dtmin PFR/EDV MIN- mmHg mmHg mmHg/μL μL μL ％ mL/min mmHg/s sec-1 mmHg/s mmHg mmHg/μL/g Msec mmHg/s sec-1 522.6±13.7 102.0±2.0 5.4±1.0 5.5±0.4 29.0±2.0 10.2±1.0 65.1±2.1 9.9±0.7 13368±370 205.1±6.6 31.6±0.9 79.4±4.1 37.9±5.8 7.8±0.3 -10728±236 37.1±5.6 558.5±22.9 101.5±2.6 6.5±1.0 5.3±0.5 32.8±2.3 13.0±2.7 61.4±6.1 11.1±1.1 11843±681 183.7±6.9 32.7±3.5 84.0±5.7 47.6±5.8 7.6±0.4 -10689±399 34.1±1.9 520.0±12.9(a) 159.6±4.6(b) 7.1±1.4 10.4±0.5(b) 38.8±3.4(c) 23.3±3.3(d) 41.3±3.5(d) 8.0±0.3(e) 12602±620 192.2±6.9 41.5±1.9 120.8±12.6 70.2±13.4 9.7±0.5(d) -10508±500 24.4±1.4 598.8±23.8 163.6±5.6(b) 7.6±1.4 10.5±0.8(b) 22.2±1.5 6.4±1.7 72.6±5.7 9.4±0.5 18638±1379(f) 256.5±8.4(g) 63.0±6.7(h) 162.5±10.5(i) 133.0±25.1(i) 6.3±0.4 -16758±917(f) 43.1±4.9(k) 574.6±21.7 184.0±9.1(b) 7.5±0.6 9.9±0.6(b) 29.4±2.0 10.9±2.1 64.0±4.7 10.7±0.5 14879±898 209.4±11.1 58.6±7.1(i) 171.3±27.6(i) 111.0±31.4 7.5±0.3 -14325±445(j) 30.6±3.6 0.032 ＜0.0001 NS ＜0.0001 ＜0.001 ＜0.0005 0.001 0.026 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.0005 ＜0.0001 ＜0.005 ＜0.0001 ＜0.001 0.014
表2说明：数据为平均值±标准差。HR-心跳速率；ESP-LV收缩终期血压；EDP-LV 舒张终期血压；Ea-有效动脉弹性量-整体心室后负荷指数；EDV-LV舒张终期体积； ESV-LV收缩终期体积；EF-射出比率；CO-心脏输出。收缩舒张指数是：dP/dtmax-血 压上升的最快速率；
dP/dtmx/IP-dP/dtmax常态化至瞬时发展(instantaneous developed)的血压；PXMI-力量 指数：最大心室力量除以EDV2；
Msw-前负载再充盈搏功3；Eesn-收缩终期弹性量常态化至测量的心脏质量。后 四个指数是LV收缩功能的与负载无关(load-independent)的测量。舒张指数是：Tau- 压力松弛时间常数所衍生的函数，是使用代入一级指数并入非零压力渐近线4；
dP/dtmin-LV压力下降峰率；PFR/EDV-峰值心室舒张充血率对EDV常态化。后者反 映早期舒张性质，即在早期充血期间松弛和被动僵化(passive stiffness)。较高的值反 映心脏舒张功能的增进。所显示的p值是代表变异的单向分析。Tukey事后因果 (post-hoc)多重比较测试是用来鉴定组群间的特定差异(specific difference)：a)对于 3周TAC+Sil达p＝0.042；b)对于Con和昔多芬3周达p＜0.001；c)对于Con达p＜0.05， 对于3星期TAC+Sil达p＜0.001；d)对于所有其它小组达p＜0.05；e)对于昔多芬3星 期达p＝0.02；f)对于Con、昔多芬3周及3周TAC达p＜0.005；g)对于所有其它小组 达p＜0.01；h)对于Con、昔多芬3周及3周TA C达p＜0.05；i)对于Con和昔多芬达p＜ 0.05；j)对于Con、昔多芬3星期和3星期TAC达p＜0.01；k)对于3星期TAC达p＜0.01。
以EMD 360527抑制PDE5A产生几近相同的生理结 果(见第5B图)。这些研究进一步显示，抑制PDE5A逆转 了由TAC所引发的胎儿基因表达(例如，钠尿胜肽、α-骨骼 肌动蛋白)提高，并且降低受磷蛋白和肌浆网Ca2+腺苷三 磷酸酶表达(见第5C和5D图)。
实施例4：TAC的心脏有较高PDE5A活性和由昔多芬所 诱导的PKG-1活性
心肌中cGMP的主要下游作用激酶被认为是PKG-1， 且PKG-1的增加是直接(基因活化作用)或是通过钠尿胜 肽信号来阻止肥大反应。前提是测试慢性昔多芬增加 PKG-1活性(见第6A图)。在假手术控制组中，昔多芬对 活性没有作用-与它对静止时的心脏功能可忽略的作用 相符合。在TAC的心脏中，抑制PDE5A多于使PKG-1活性 加倍。此结果说明PDE5A活性是选择性地增加心肌层肥 大。所以测定归因于PDE5A的cGMP酯酶活性及活性成分 (见第6B图)。在假手术控制组中，PDE5A贡献总活性的 35至45％，与由狗1所获得的数据相似。在TAC的心脏中， 总cGMP酯酶活性增加20％超过控制组(p＜0.005)，而归 因于PDE5A的成分占该总活性60％(对控制组的 p＜0.001)。因此，TAC提高PDE5A活性，该现象恰巧解 释昔多芬对PKG-1活化作用的抑制性提高。
然而总心肌cGMP的浓度并没有反映抑制PDE5A对 依赖于cGMP的信号的冲击(见第6C图)。假手术控制组 的cGMP基线并没有随着以昔多芬治疗而改变。在TAC 的心脏中cGMP增加，但是当这些心脏以昔多芬共同治 疗时，cGMP减少。在使用可任择使用的PDE5A抑制剂 各别研究中，证实了相同的结果(见第5D图)。如钠尿胜 肽表达减少所说明的，这恰好反映伴随的cGMP合成变 化(即，与肥大和壁伸张相关的预防)(见第5C图)。抑 制PDE5A没有改变基本或TAC情况的心肌cAMP浓度。
实施例5：抑制PDE5A抑制了钙调神经酶/NFAT及 ERK1/2的活化作用
钙调神经磷酸酶的活化作用与NFAT(活化T细胞的 核因子)转录因子的核迁移偶合，因而造成心脏肥大和腔 室重塑2，3。这条途径能用PKG-1加以抑制，因为新生肌 肉细胞中已活化PKG-1的过度表达，抑制了钙调神经酶 /NFAT活化作用和细胞肥大4。因此，在TAC的心脏中， 以有或没有使用昔多芬治疗来检查钙调神经酶表达。TAC 1和9星期后，钙调神经酶蛋白质表达提高超过2倍，而 且在这二个时间点，钙调神经酶蛋白质表现因使用昔多 芬而显着降低(见第6D图)。
有丝分裂原活化激酶ERK1/2是由伸张及Gαq受体偶 合的信号5，6，以及钙调神经酶活化作用7所诱导，本身就 是肥大的贡献者8。TAC1星期后，ERK1/2受到活化(磷 酸化/总ERK1/2增加)，而此亦因使用昔多芬治疗而受到 抑制。然而，9星期后，ERK1/2活化作用回到基线值(尽 管钙调神经酶的量持续上升)，昔多芬并没有可显示的效 果(第6D图)。
为了阐明抑制PDE5A如何影响与钙调神经酶/NFAT 有关的肥大，因而对新出生老鼠肌肉细胞中的此信号进 行评估。当利用肌节组织(α辅肌动蛋白，见第7A图)及重 新蛋白质合成(混入[3H]-白氨酸，见第7B图)进行评估 时，与脱羟肾上腺素(PE)一起培养引发细胞肥大。通过 伴随的昔多芬治疗此肥大受到抑制。为了测试昔多芬是 否抑制NFAT活化作用，以表达NFAT促进剂(与β-半乳糖 苷酶偶合)的腺病毒转染肌肉细胞。转染效率一致地＞ 95％(见第8A至8F图)。肌肉细胞然后与PE、钙活化剂 BayK8644(BK)或本质上表达活化的鼠科动物钙调神经 酶A(AdCn)的腺病毒一起培养。三种触发剂皆增强NFAT 促进剂活性。昔多芬抑制了由PE或BK所刺激的活化作 用，但不抑制由AdCn所刺激的(见第7C图)。基于β-半乳 糖苷酶活性分析的总结结果显示在第7D图。使用可任择 使用的腺病毒(具有与萤光素酶偶合的NFAT促进剂)进行 研究，产生相同的结果(见第9A至9C图)。这些结果与先前 用本质上活化的PKG-14转染新生肌肉细胞的数据一致， 并且支持钙调神经酶本身的标靶上游。
实施例例6：PDE5A抑制作用藉由上游抑制作用使Akt 去活化
受压力超载刺激且其过活化是与心脏肥大和重塑有 关的另一个主要信号梯瀑是Akt/PI3K途径。有生理压力 时，Akt活化作用是以中等水平发生，但在以更高水平， 会触发病理性的重塑和心脏衰竭9，10，11。经TAC增进的 Akt活性同时由磷酸化/总Akt蛋白质表现的比率(图10A) 及活性分析试验(图10B)显示。在压力负载后阶段(9星 期)，此情况特别显着。在二时间点上，昔多芬皆抑制此 反应至接近基线值(见第10A和10B图)。Akt由磷肌醇甘 油酯-3-激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)11，12所活 化。特别是，高活性PI3Kα与肌肉细胞肥大13有关，但 是由于cAMP的抑制13，14，γ异型和收缩功能障碍有关。 假设TAC3星期时收缩功能持平(见第3图)且cAMP未改 变，然后评估PBKα活性。TAC增加PBKα活性。此增加受 到以昔多芬共同治疗的抑制(见第10C图)。
为了测试抑制PDE5是否干扰下游Akt信号，我们检 验肝醣合成激酶3β(GSK3β)15，该激酶是以Akt和其它激 酶予以磷酸化(例如，PKA17和PKC18)，此导致它原有的 抗肥大活性无法受抑制19。1星期时，TAC使磷酸化/总 GKS3β的表达增加二倍，尽管Akt活性因以昔多芬治疗 而降低，GSK3B活化作用依旧未改变(见第10D图)。然而， TAC9星期后，Akt和GSK3β的活化作用受到更多的刺激， 而此时PDE5A的抑制使Akt和GSK3β二者活性皆降低。这 些数据支持与Akt无关的GSK3β活化作用，特别是在早期 (非扩张)TAC未受cGMP/PKG-1/PDE5A影响的阶段，而与 Akt有关的GSK3β活化作用则受昔多芬影响而减小。
为了进一步测试是否昔多芬对Akt活化作用的抑制 是通过下游信号途径来进行，具有本质上已活化Akt (AktTG)的心脏标靶过度表达的转基因老鼠，用赋形药或 昔多芬予以长期治疗。 以赋形药治疗的动物(年龄4至5 个月)，AktTG心脏较大且心脏功能降低(见第10E图和表 3)。
表3：无基因转殖的控制组(NTG)与心脏标定Akt过度表现(AktTG)形转殖作用的血液动力学分析； 此资料为侵入性压力-容量分析。
NTG AktTG pt NTG AktTG p2 p3
Vehicle Sildenafil
HR 538.7±9.7 515.3±24.6 NS 511.6±31.4 569.5±47.4 NS NS
ESP 96.1±2.1 93.4±4.6 NS 96.7±4.7 90.1±0.9 NS NS
EDP 7.5±0.7 8.1±1.6 NS 4.9±1.2 8.9±1.1 NS NS
ESV 17.6±1.9 36.4±6.1 ＜0.05 19.4±3.0 39.6±4.5 ＜0.01 NS
EDV 45.9±5.8 55.0±6.3 0.33 44.5±4.9 57.6±5.4 0.05 NS
EF 61.4±0.9 34.7±5.5 ＜0.005 56.7±3.5 31.8±2.1 ＜0.001 NS
dPdtmax 9447±556 7188±354 ＜0.02 10133±791 6993±156 ＜0.005 NS
dPdtmin -9051±573 -6248±349 ＜0.006 -9267±417 -6241±289 ＜0.001 NS
PMXI 27.1±1.8 18.2±2.7 ＜0.05 25.9±2.2 17.8±1.9 ＜0.05 NS
Tau 6.8±0.2 10.5±1.4 ＜0.05 7.4±0.6 10.0±0.6 ＜0.02 NS
dP/dtmax/IP 173.1±6.6 144.5±9.2 ＜0.05 176.4±14.8 128.5±2.9 ＜0.02 NS
Eesn 46.7±5.5 22.7±4.1 ＜0.02 39.9±1.5 21.5±2.9 ＜0.001 NS
资料为平均值±标准差。承上所述，p1-NTG及AktTG经载剂处理而非经配对t测试的P值； p2-NTG及AktKG经昔多芬(sildenafil)100mg/kg/day处理而非经配对t测试的P值；p3-AktTG及昔 多芬(sildenafil)经载剂处理而非经配对t测试的P值。
在6星期的期间，由一连串超音波心动图和心脏重 量/胫骨长度比率显示，昔多芬并没有减弱心脏肥大的演 变(见第10E图)。即使有使用昔多芬治疗，AktTG动物 的心脏收缩和舒张功能依然降低(见表3)。这些结果说 明昔多芬作用在Akt活化作用的上游，和PI3K酵素活性 结果一致。
这些结果显示，当增强处于持续压力超载的心脏功 能时，抑制PDE5A所呈现的新奇和潜在功效抑制了心室、 细胞和分子重塑。当改善功能后，即使再持续增加负载， PDE5A的抑制亦逆转了已存在的肥大。以小分子方法抑 制(或逆转)肥大至本研究中所观察到的程度是不寻常的， 此说明与PDE5A/cGMP/PKG-1调控相关的基本机制是有 效力的，且可能会干扰几条途径。假设疗法简单、有宽 泛的临床经验和PDE5A抑制剂的安全纪录，则适合用在 实质上任何有形态上、细胞或分子肥大重塑特征的心脏 病症的治疗。
按照先前已认定抑制PDE5A对心脏只有微小影响的 想法19，20，这些发现特别有趣。早期的研究几乎完全集 中在对处于休息状态的正常心脏的急性效应及/或反应。 心脏的PDE5A表达浓度低1，21，抑制PDE5A对基本功能产 生的急性效应相当小1，19，21。最近对二个不同的种类进行 研究，发现PDE5A能有效地调节β-肾上腺素 (beta-adrenergic)心脏和心肌细胞刺激，而此效应与其在z 带结构的战略位置相结合1，21。当前的研究显示，即使长 期的PDE5A抑制对正常心脏有可忽视的效应，但这情况 在心脏处于长期负载压力下时，产生剧烈改变。此情形 一部分是因压力负载的心脏比控制组有较高的与PDE5A 有关的cGMP酯酶活性，而造成在抑制PDE5A后PKG-1活 化作用有更大的改变。当合成cGMP受到刺激时，cGMP 代谢酵素的反向调节类似物在血管系统(PDE1A随慢性硝 酸盐注入而增加，作为硝酸盐不耐性的机制22)及肾脏 (PDE5A随慢性容量负载而增加，作为肾脏对钠尿胜肽去 敏化的机制23)已有报告。当前的结果是第一个显示出在 心脏中这样的调节作用。
不希望由局限于任意特定理论，PDE5A的经增强的 活化作用和PDE5A在cGMP平衡稳定性(homeostasis)的角 色可由数种机转解释。PDE5A活性是藉由cGMP所增强- 藉由直接结合至GAF区域24，以及藉由PKG-1的活化两 者，上述PKG-1在调节区域(regulatory domain)将PDE5A 磷酸化以增强催化活性25。上述两事件都增强了酯酶活 性-作为反向回馈循环(negative feedback loop)以调控 cGMP浓度。此外，在心脏于压力之下，cGMP依赖的信 号一般会变得较有效力-就像汽车的制动器。例如，受 cGMP合成刺激的一氧化氮在基础收缩(basal contractility)上的效能微小，但在肾上腺素(adrenergic) 的或其它压力26，27之下是较有效力的。急性的PDE5A抑 制作用对基础功能(basal function)的效能也是微小的，但 在意识清楚的狗，能够抑制受β-肾上腺素(β-adrenergic) 刺激的心脏收缩1。
先前关于心脏肥大的cGMP/PKG-1抑制的研究主要 瞄准于钠利尿肽(natriuretic peptide)依赖的合成。心脏的 ANP接受器缺失28，29，3010，40，41恶化负载所引致的心脏肥 大，然而轻微的腔室肥大可藉由经构成地活化的 (constitutively activated)ANP受体鸟苷酸环化酶 (guanylate cyclase)区域31的肌细胞标的 (myocyte-targeted)的过度表达来预防。这些改变伴随心 肌的cGMP的减少或增加。然而，不同于ANP偶联的信号 (ANP-coupled signaling)，PDE5A的抑制产生有效力的抗 肥厚效能(anti-hypertrophic)，而总心肌cGMP没有明显的 增加-即使大量的增加PKG-1的活性。这表示，总心肌的 水平(total myocardial level)不必然反射cGMP-信号。 cGMP信号的改变存在于细胞内的局部次区域(localized sub-domain)内是有高度可能的。其它实验室最近研究支 持上述论点，尤其是特定的PDEs标的cGMP的降解此概 念，上述cGMP的降解是取决于负责它的合成的酵素。 cGMP结合至PKG-1变构位置(allosteric site)被认为是 cGMP从细胞质隔离的重要机制以及保护它免于受 PDE5A水解32的手段。
这能造成PKG-1活化作用的增强，但不使cGMP等 量的增加。信号的分区化(compartmentalized signaling) 进一步由以下事实所支持：靠近心肌细胞中的z带结构 的PDE5A的表达会增强，且当此定位(localization)改变 时会失去生理活性。因为受钠利尿肽引致的高水平，总 cGMP可能特别反射出所牵涉的合成途径。经昔多芬治疗 的心脏，脏壁压力和ANP/BNP的表达减少；因此，可预 期cGMP有一些的下降。
持续的压力负载活化了多种激酶和磷酸酶，且藉由 基因工程选择性地标的许多此类蛋白质，显示此类蛋白 质有力地参与心脏的肥厚反应。PDE5A抑制作用看来好 象反转(counter)几条途径，且所观察到的改变总是可能 次发于迄今仍未确认出来的初级效应体(primary effecter)，但由于以下原因，这似乎是不太可能的。首先， 如同PKA依赖的信号，一般了解cGMP/PKG-1的信号可影 响多种酵素梯瀑(multiple enzyme cascade)4，33，34，包括钙 调神经酶(calcineurin)。其次，在对持续的压力负载有反 应的ERK1/2，Akt，PI3Kγ，和钙调神经酶所观察到的变 化是各自分别在仿真心肌肥大和/或在各种基因模式中重 塑的范围中显示， 由单一原因所造成是较不可能的。再 者第三，根据基因工程模式的结果，所观察到的变化的 幅度(amplitude)和时程与单一效应体是不兼容的。例如， 虽然ERK1/2的活化作用增加了老鼠的钙调神经酶35，36 的过度表达，在9星期的TAC之后，尽管钙调神经酶持续 刺激，ERK1/2磷酸化作用仍是微不足道的。在TAC小鼠 的钙调神经酶的基因抑制作用并不逆转ERK1/2活化作用35 ，但是投予昔多芬者观察到两者皆下降。钙调神经酶 的过度表达亦触发Akt的活化作用36，但是比有TAC者所 观察到的水平来的低许多。这不能解释Akt和钙调神经酶 改变的暂时性差异。缺乏PI3K抑制剂PTEN的小鼠发展出 肌细胞肥大和心脏收缩性功能障碍，以及Akt和GSK3β活 化作用，但并未显示ERK1/2活化作用13。此外，基因增 强Akt或PBK的活性达近于在本研究中由TAC所达到的水 平，会导致心脏收缩性功能障碍13和心室扩张10，37，但 并不会与钙调神经酶共同刺激(co-stimulation)有关。整体 而言，上述的矛盾处表示PDE5A抑制作用标的多于一个 途径。
在1星期TAC后由昔多芬在Akt和GSK3β之间造成的 明显矛盾是值得讨论的。GSK3β是由TAC活化，且本身与 心脏肥大19以及心脏功能障碍39有关。然而，GSK3β亦可 能由PKA磷酸化(通透锚激酶AKAP22017)、由PKCγ18磷 酸化以及由其它激酶16来磷酸化。假定Akt的活化作用下 降，即使GSK3β磷酸化持续，似乎一个或更多Akt不依赖 (Akt-indenpent)途径牵涉其中-但不受PDE5A抑制作用所 调节。心脏肥大晚期的特征是持续性的重塑和更大的Akt 和GSK3β活化。在心脏肥大晚期昔多芬对两者的抑制作 用可产生持续的益处。
虽然心脏肥大性传统上被视为能适应负载压力的适 应反应，证据显示它可能不是必需的代偿作用37。当昔 多芬没有完全地逆转或阻止在TAC后数星期至数月上述 为特征的心脏肥大、腔室和分子重塑，尽管负载依然持 续，但心脏的功能改善了。本研究结果是临床兴趣的， 这样的临床兴趣是由于本发明对肥厚性心脏疾病和心脏 肥大的高度预防效果，而肥厚性心脏疾病和心脏肥大在 许多形式的心脏衰竭中扮演显着的角色。以口服PDE5A 抑制剂的延伸使用(expanding use)来治疗疾病(诸如肺动 脉高血压)，不只勃起功能障碍，是当作长期治疗来支持 其使用。
实施例7：PDE5a抑制剂使心肌细胞对异丙基肾上腺素 (isoproterenol)的反应钝化
异丙基肾上腺素，是刺激心肌细胞收缩的β-肾上腺 素受器促效剂(β-adrenergic receptor agonist)。PDE5a抑 制剂(昔多芬，100nM)藉由响应肾上腺素促效剂-异丙基 肾上腺素的刺激来将初代单离(primary isolated)的心脏 肌肉细胞的增强的收缩作用钝化。(图11A-11D)。如果可 溶解性的鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase)被ODQ抑制， ODQ是一种可溶解性的鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)抑制剂，上述的钝化作用将不会发生(图14A 和14β)。这表示，PDE5a抑制剂藉由调控cGMP来改造 心脏功能，该cGMP是由sGC产生。因此，PDE5a抑制 剂的作用机制可能是与ATP敏感的钾信道的活化作用机 制是不同，该钾信道可能改造后缺血功能 (post-ischemic)。这些资料最终显示，PDE5抑制剂的效 应并非取决于动脉血管扩张或实际上根本并非取决于任 何的动脉变化。
实施例8：PDE5A抑制作用刺激PKG-1和Cgmp
为了直接判定在成体肌肉细胞(adult myocyte) PDE5A抑制作用是否刺激了PKG-1(图15A)，PDE5A抑 制性质在蛋白激酶G1(PKG-1)的效能单独以昔多芬、单 独以异丙基肾上腺素、二者联合、单独以他达拉非，以 及他达拉非与异丙基肾上腺素联合测试。PDE5A抑制作 用在基础情况下(约10％，p＜0.05)仅轻微地增强了PKG-1 活性。当异丙基肾上腺素与任一PDE5a抑制剂联合，在 PKG活性有50％的显着增加。这与PDE5a抑制的预期望 效能是一致的，PDE5a抑制是预期会增加cGMP水平， 而cGMP水平接着会活化PKG。为了直接监测细胞内 cGMP的产生，对cGMP水平敏感的萤光共振能量转移探 针被用在新生老鼠的肌细胞(图15B和15C)。异丙基肾 上腺素、昔多芬和一氧化氮供体(NO donor)(DEA/NO)全 都增强了FRET信号，提供了在肌肉细胞PDE5 A抑制作 用增强cGMP的直接验证(图15A-15C)。
实施例9：PDE5A抑制作用阻断经β-肾上腺素 (β-adrenergic)刺激的收缩，且慢性地预防受肾上腺素刺 激的心脏肥大
心脏腔室收缩力的急骤增加是藉由异丙基肾上腺素 输液引入至控制组C57b16小鼠。在心脏收缩功能的增加 是藉由活体内压力-容量关系(pressure-volume relation) 评估(图11E)，且该心脏收缩功能的增加是以图中循环的 增宽和左上角向左偏移而反射出压力容量关系的变化。 昔多芬以产生30nM的自由血浆浓度(free plasma concentration)的剂量经静脉传输，导致此肾上腺素刺激 的反应有显着的抑制。这支持心肌的效能使其维持在未 受损伤的心脏的水平(intact heart level)。此外，如果用 植入式渗透微型泵浦(implanted osmotic mini-pump)慢慢 地输注异丙基肾上腺素，心脏是以心脏质量的增加(心脏 肥大)及一些扩张做为响应。上述现象是以一组控制组 C57b16小鼠对照显示(图12A和12B)。与PDE5a抑制剂 (EMD 360527)共同治疗显着地抑制了心脏肥大的发展。
重要的是，PDE5a抑制作用对β-肾上腺素刺激的阻 断效能对上述干扰是专一性的，且使心肌cGMP的增加 是不能由其它方法所复制。图13A显示由心房的钠利尿 胜肽(atrial natriuretic peptide)(ANP)输注在心肌 (myocardium)刺激cGMP对异丙基肾上腺素心脏反应 (isoproterenol cardiac response)的效能。不同于在图11F 所提供的使用PDE5a抑制剂的资料，ANP在未受损伤的 心脏对ISO反应并没有效能。图13B显示在控制组条件 下所量测到的cGMP水平，以及暴露至静脉内PDE5a抑 制作用(EM360527)或ANP的cGMP水平。后者导致心肌 cGMP显着地上升-但在交感神经刺激反应(sympathetic stimulatory response)则没有效能。另一方面，PDE5a抑 制剂在所量测到的总心肌cGMP效能几乎可以忽略，但 作为β-肾上腺素刺激的负向调节剂(negative regulator) 这是非常有效力的。在心脏所测得的cGMP没有上升先 前已用来支持在心脏中缺乏显着的生理角色此一理论。 然而，这些资料显示，该信号是高度分区化的，且精确 地正确的区域由PDE5a抑制作用所调控以对心脏收缩力 产生冲击，且这不是简单的借着由合成的手段(synthetic mean)来增加cGMP所仿真的。
实施例10：PDE5A的表达和在试管内(in vitro)的活性
在单离肌肉细胞中PDE5A mRNA的表达比在肺脏中 较低超过一百倍(图16B)。在单离的成体心肌细胞中观察 到有蛋白质的表达，但蛋白质水平同样远低于在肺脏中 (图16A)。SDS-PAGE凝胶显示在肺脏加载的量(load)有 1μg，相较而言，心脏的量是100倍以配合(match)在肺脏 的密度水平。先前的报告显示，PDE5A在肌细胞中是以 低水平表达，且这样的表达的低水平推导出PDE5A在心 肌细胞并非扮演功能显着角色的假定。相较于肺脏，蛋 白质和基因整个心脏的表达亦发现是减少的(图16C)。在 肺脏，它主要存在于血管平滑肌细胞。在此，SDS-PAGE 凝胶加载20μg心肌衍生的蛋白质或肺衍生出的蛋白质， 其相对表达差异(relative expression differences)是非常 明显的。上述现象由在这些组织之间mRNA表达的差异所 支持(图16A)。在心脏整体，在单离的肌细胞中观察到在 约95Kda处有主要的条带，此条带和在肺脏所观察到的 条带几乎是同样大小。在心脏如预期地观察到第二条在 约70kDa的条带，这反应了剪接片段(splice variant)或蛋 白质水解片段。使用不同的抗体仍观察到相似的发现41，42。
成体单离肌细胞和未受损伤的心脏心肌(intact heart myocardium)的总cGMP以及PDE5a依赖的cGMP酯酶活性 被判定出来(图16D和16E)。上述组织任一者与IBMX(是 一种广谱PDE抑制剂，a broad spectrum PDE inhibitor)共 培养，会将cGMP酯酶的活性降低大约90％。上述组织萃 取之任一者与昔多芬(是选择性的PDE5a抑制剂)共培养， 揭示仅cGMP的成分是由PDE5A正常代谢。在单离的肌细 胞和在整个心脏两者都是将近30％。藉由放射性酵素分 析试验(radio-enzyme assay)获得PDE5A依赖的cGMP酯酶 有相似的结果41(32±7.3％-NTG(n＝9))。
之前的研究报告在心肌层PDE5A的表达是低水平的 43，44，且在休息时的心脏功能PDE5A的抑制功能是微小 的41，45，46，47，上述的研究推导出PDE5A在心脏扮演微小 角色的错误结论。与先前的报告相反，本研究显示，上 述的低水平表达并不意味PDE5A缺乏生理功能。相反的， 本研究的结果指出，PDE5A在β-肾上腺素的刺激作用，以 及在心脏重塑、肥大，和对慢性压力的功能障碍扮演重 要角色。藉由抑制PDE5a来防止cGMP代谢的效能似乎实 质上大于较藉由钠利尿肽偶联的合成(natriuretic peptide-coupled synthesis)增加cGMP的合成48，49或经肾 上腺素刺激的收缩力改变。这支持了先前从未被认同或 辨识的一个非常新的机转，此机转是说标的的cGMP的操 弄(targeted cGMP manipulation)可直接影响心脏肌肉细 胞以及心脏本身。
实施例11：PDE5在肌细胞的位置(Myocyte localization of PDE5A)
在整个(throughout)心肌细胞都有PDE5A出现(第 17A至17F图)，且亦出现在z带条纹(z-band striation)(第 17A图(左区)，(右区)-α-肌动蛋白(actinin))。PDE5A免 疫染色被特定阻断肽所抑制(第17B图，左)，然而同样 的肽并未阻断PDE1C染色(第17C图，左)，支持了分析 试验的专一性。PDE5A出现在z带条纹(图17D和17F)， 且与一氧化氮合成酵素NOS3的位置是一样的 (colocalize)。
实施例12：基线分析和昔多芬效能
PDE5A在心肌是以低水平表达51-53，且因为昔多芬 或其它药剂仅轻微地降低动脉压力且对在休息状态下54，55 的或运动期间56，57心脏的射出分率或输出量并没有 明显的影响，由这些药物所造成的抑制作用并未被认为 是直接影响心脏功能。如前文所报导，尽管表达水平低， PDE5A可展现对肾上腺素刺激强力的局部性调节作用 (localized regulation)58，59，且其慢性抑制作用显着地限 制和逆转受到压力超载而刺激的心脏肥大和重塑。这些 结果支持了PDE5A抑制剂在治疗或预防心脏肥大和重素 的治疗用途。
为了判定在健康人类受试体，昔多芬预治疗 (pretreatment)是否抑制经β-肾上腺素刺激的心脏收缩， 利用巴酚丁胺(dobutamine)压力测试在口服投予昔多芬 或安慰剂之前与之后执行随机化的、双盲、安慰剂控制 组、非侵入性的血液动力学研究。
多巴酚丁胺是具有正向影响肌肉收缩效能(positive inotropic effect)且临床上用来作为对心脏组织药物刺激 及施压(pharmacologically stimulate(and stress))且增加 心脏磊血功能的肾上腺素β-1促效剂。昔多芬藉由抑制 磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase-5，PDE5A)来提高细胞 内的环形GMP的量并导致血管扩张。如本文所报导，昔 多芬亦有力地影响了经β-肾上腺素受器促效剂或压力超 载所刺激心脏。为了判定昔多芬在人类是否使经多巴酚 丁胺刺激的心脏功能钝化，三十五个健康志愿者接受随 机化的、双盲、安慰剂控制组研究，在此研究中心脏功 能是以在口服昔多芬(100mg，n＝19)或安慰剂(n＝16)之前 或之后对多巴酚丁胺的反应而评估。超音波多谱勒和非 侵入性的血压资料产生了与负载无关的收缩指数 (load-independent contractility index)(最大力量指数和 心脏收缩终期弹性量，maximal power index and end-systolic elastance)、射出分率，及扩张功能的测量值。 在活化治疗组(active treatment group)，血浆自由昔多芬 浓度是44±29nM，而昔多芬的代谢物-去甲基昔多芬 (desmethyl-sildenafil，预期占母药水平的50％)的浓度是 22±18nM21。在接受昔多芬的四个实验体中，在此研究 之时血浆浓度非常低(亦即，全都＜6nM，中值3.6nM，在 组平均的10倍以下)。此外，这些实验体中每一者亦都 具有低的代谢水平，与用来解释次治疗(subtherapeutic) 浓度的快速代谢作用不符。既然测试我们的假说需要建 立治疗性的昔多芬水平，这些实验体从分析中排除。另 外一个贝排除的实验体是因为他的血液样本遗失了。在 此研究中并无有害的事件。
在安慰剂组和昔多芬治疗组在关于年龄(安慰剂组 和昔多芬治疗组分别是30±6岁与30±8岁，p＝0.95)、 性别(50％女性与79％女性；p＝0.1)、身体重量指数(23.9± 3.5与22.9±2.5kg/m2；p＝0.45)，或心脏功能指数(表4) 并没有没有基线差异。
表4：第一次对第二次多巴酚丁胺研究的收缩和舒张数据的分析 Placebo(n＝16) Sildenafil(n＝19) P value 收缩变量 B1 Δ(B2-B1) B1 Δ(B2-B1) a b 收缩血压(mmHg) 106±13 -3±9 107±12 -6±3* 0.79 0.26 舒张血压(mmHg) 59±7 -2±6 62±6 -6±5* 0.18 0.05 心率(min-1) 61±9 -2±4 66±12 +0±3 0.24 0.44 搏出容积(mL) 77±17 +3±7 72±16 +5±6* 0.34 0.44 全身外围血管阻力(dyne*s/cm5) 1310±280 -55±130 1370±310 -170±60* 0.57 0.03 峰值力量指数(mmHg/sec) 297±42 +6±31 312±61 +21±13* 0.42 0.26 收缩终期弹性量(mmHg/mL) 2.3±0.8 +0.2±0.6 2.6±0.9 +0.4±0.2* 0.40 0.25 射出分率 61±5 +3±4 61±6 +6±2* 0.99 0.05 舒张变量 E速率(cm/see) 87±12 +0±12 92±19 -4±12 0.32 0.24 A速率(cm/sec) 59±8 +5±8 57±17 -3±8 0.59 0.63 E/A比率 1.5±0.2 +0.1±0.2 1.7±0.4 -0.1±0.4 0.06 0.18 E’速率(cm/sec) 19±6 -1±3 18±5 +0±3 0.68 0.66 E/E’速率 4.8±1.4 +0.2±0.8 5.2±1.4 -0.3±0.8 0.45 0.13 IVRT(msec) 84±22 -2±13 71±13 +8±12 0.06 0.05
表4说明：最初的基线及利用第一条基线及第二条基线区别二组不同的病患。B1：最初的基线； B2：在最初的多巴酚丁胺测试之后重新校正基线；Δ(B2-B1)-区别第一条基线与第二条基线的不同。 P値：a)在最初基线(B1)于二研究小组之间的非配对t测试；b)二种方式方差分析(RMANOVA)，基线 级数相互作用及研究药物(昔多芬(sildenafil)对于安慰剂)。*p＜0.005(于小组中，经配对t测试于第一和 第二基线之间)E-早期的舒张装塡波；A-心房装塡波；E’-早期装塡期间二尖瓣的环形组织速度； IVRT-等容松弛时间。
安慰剂组和昔多芬治疗组的第-基线和第二基线之 间的变化亦在表4中提供。在给昔多芬组的实验体伴随 着射出分率一前一后(tandem)的增加，动脉压和全身血管 阻力有轻微的降低。在昔多芬组收缩力也轻微的上升了， 在该组可能反射出对血管扩张、直接效能(direct effect) 或轻微的残余多巴酚丁胺效能的反射反应。重要的是， 组间(inter-group)分析发现药物治疗对基线收缩力或扩 张功能改变没有显着影响(B2-B1，重复测量的方差分析 (RMANOVA))，只对动脉阻力有影响，而对扩张动脉压及 EF有不明显的(borderline)影响。
实施例13：昔多芬(sildenafil)钝化经多巴酚丁胺刺激的 收缩力
图18A展示在接受作为本研究药物的昔多芬的实验 体在多巴酚丁胺刺激之前和之后，例示的多谱勒大动脉 血流资料及其对应的血压及计算出的峰值力量指数。大 动脉血流和收缩压随着第一次多巴酚丁胺测试而上升， 力量指数增加将近200％，然而上述反应在同一个患者在 接受口服昔多芬之后实质地钝化了(第18B图)。分组资 料显示在第19图和第20图。两组(昔多芬组对安慰剂组) 对第一次多巴酚丁胺的收缩反应都是一样的，且特征是 收缩力增强以及血压连同外围血管阻力的下降。在第二 基线的收缩力变化被大幅的逆转了。在接受研究药物之 后，在第二次多巴酚丁胺测试有显着的差异，且接受昔 多芬的实验体展现出收缩反应的下降(第20图)。该等改 变并非简单地由在昔多芬治疗组稍微较高的基线所造成 (亦即，降低净改变)，峰值反应(第二次测试对第一次测 试)本身是显着的被昔多芬所抑制而安慰剂并无(力量指 数为p＜0.015；射出分率为p＜0.01，及心脏收缩终期弹性 量为p＜0.002)。
第20图展示在投予该研究药物之前(第一次试验)和 之后(第二次试验)由多巴酚丁胺所造成的功能的绝对变 化。每个实验体的资料是经过配对的。峰值力量指数在 昔多芬治疗之前上升了+254±82mmHg/s(从约为300 mmHg/s的基线)，但在治疗之后上升了仅164±80 mmHg/s(p＝0.001)，而在安慰剂投予之前和之后该指数改 变是相似的(236±89对215±83mmHg/s，p＝0.31；群组 间比较是p＝0.04)。中值力量指数(p＝0.04)和心室收缩终 期弹性量也观察到相似的发现(2.52±1.5对 0.84±0.9mmHg/ml，昔多芬组是p＜0.001；1.8±1.1对1.4±1.1 mmHg/ml，p＝0.25；安慰剂组；组间是p＝0.008)。多巴酚丁 胺在昔多芬投予之前增加射出分率达15±3％(絶对变化)， 但在昔多芬投予之后仅增加4±5％(p＜0.001)，而在安慰剂 组，EF在两次试验中的上升是相似的(p＝0.12；组间是 p＝0.001)。在经多巴酚丁胺所诱导的搏出量(stroke volume)改变亦可观察到相似的差异。
重要的是，在心脏收缩反应的改变并非由血管负载 的改变所造成。在外围血管中由多巴酚丁胺所调节的阻 力下降并非由昔多芬所改变(modify)(p＝0.66，第3图)， 在本研究的各期在心脏的预负载(preload，舒张终期容积 (end-diastolic volume))两组之间并没有差异。舒张终期 的容积随着多巴酚丁胺的投予而减少，但相较于安慰剂 组，在昔多芬组的反应也是被钝化了。在第一次多巴酚 丁胺试验中，在两组中心律平均值仅轻微地上升(在安慰 剂组和昔多芬组分别是3.5±7.7bpm和6.7±2.2bpm，第20 图)，而在一些实验体甚至还下降了。后者似乎和所用的 低剂量有关，这样的低剂量产生收缩效能而非变时 (chronotropic)效能，但对血压和血流的上升引发反射反 应。在昔多芬投予之后，随着多巴酚丁胺(+14.5+-4.7， p＜0.01)的投予，心律增加的更多，但以RMANOVA与安 慰剂组比较，并未达统计显着的程度。
实施例14：收缩功能的效应
表5提供在投以研究性药物的前和后，藉由多巴酚 丁胺(dobutamine)得知在舒张功能上絶对的变化。
表5：于舒张的功能上探讨由多巴酚丁胺(dobutamine)诱导昔多芬(sildenafil)的影响 Placebo Sildenafil 变量 D1-B1 D2-B2 D1-B1 D2-B2 p value- RMANOVA E速率(cm/sec) 25±10 21±16 20±18 12±11 0.19 A速率(cm/s) 5±8 7±11 5±9 11±7 0.33 E/A比率 0.3±0.3 0.2±0.3 0.3±0.3 -0.1±0.3* 0.14 E’速率(cm/s) 3.9±2.3 2.9±3.1 4.1±3.4 1.5±2.4* 0.19 E/E’速率 -0.2±0.9 -0.3±1.0 +0.1±0.8 -0.2±0.7 0.21 IVRT -28±14 -24±15 -17±11 -20±13 0.30
表5：资料是最初(D1-B1)及第二次(D2-B2)多巴酚丁胺(dobutamine)测试结果，各个参数比较多巴酚丁胺(dobutamine) 刺激高于基线值的变化。*p＜0.01，p＜0.05，p＜0.06。P值是三种方式方差分析(RMANOVA)，测试对于三种方式相互作用 于多巴酚丁胺(dobutamine)测试次序之间(在接受研究药物前与后)，呈现或缺乏多巴酚丁胺(dobutamine)，及处理剂 (昔多芬(sildenafil)对于安慰剂)。简称是依照表1定义。
于第一次测试，早期的(E)和晚期的(A)舒张充填率在 二个群组上升幅度相似，并且E/A比率轻微地上升了。 昔多芬(Sildenafil)导致在E速度(p＝0.06)的边线下降，A 速度(p＝0.03)轻微地上升，和E/A比率的下降(p＝0.007)。 多巴酚丁胺(Dobutamine)刺激造成了在组织多谱勒仪的 上升。E′速度由昔多芬(sildenafil)钝化(p＝0.002)。多巴 酚丁胺(dobutamine)的效应在E/E比率，LV结束心脏舒 张压力，及等容松弛时间，由研究药物或在其它群组来 看是未改变的。重要的是，在群组之间分析显示于舒张 作用的任何参数(p值被显示为3种方式重复测量的方差 分析(RMANOVA)使用在心脏收缩的分析)，研究药物在多 巴酚丁胺dobutamine)变化并没有重大交互作用。
在最初的多巴酚丁胺(dobutamin)测试，心脏收缩和 舒张功能相似地改善了二个治疗小组(即；峰值强度指数 上升了80±28％-安慰剂，82±31％-昔多芬(sildenafil)小 组，p＝NS)。在实验体接受昔多芬(sildenafil)的处理，他 们的第二个多巴酚丁胺(dobutamin)反应发生显着的钝 化，以峰值强度，射出分数，及结束心脏收缩弹性量改 变，全部各自降低32±34％，66±64％，和56±63％。(各 p＜0.001对于最初的反应)。这相对于安慰剂群组，其展 示了相似的功能反应的二个多巴酚丁胺(dobutamine)测 试。当昔多芬(Sildenafil)与安慰剂处理结果比较，昔多 芬(Sildenafil)处理经由多巴酚丁胺(dobutamine)诱导并 没有显着地改变舒张变化。因而，PDE5A抑制性质藉由 昔多芬(sildenafil)使β-肾上腺素(beta-adrenergic)对于心 脏收缩的反应钝化。这支持PDE5A在人的心脏的活性和 它在调控刺激心脏功能的角色。
这项研究报导第一直接证据，昔多芬(sildenafil)影响 健康人类的心脏功能，当静止状态下具有最小的效应时， 抑制β-肾上腺素(beta-adrenergic)刺激心脏收缩的功能。 重要的是，这个抑制效应没有取决于后负荷或心脏预压 变化。这表示，PDE5A抑制性质可调控人体心脏的应力 反应。
PDE5A抑制剂在血管床和组织61，62具有有潜力的效 应。此外，昔多芬(Sildenafil)降低肺动脉阻抗，也许在 治疗肺高血压63，64是有效的。它亦改善内皮细胞的功能， 一氧化氮生物兼容性标志和整体血管健康，尤其是瘾君 子65和心脏衰竭的病人66。动物研究表示，昔多芬 (sildenafil)令人印象深刻的是藉由预先处理局部缺血效 应降低梗塞尺寸67，68。
一个早期报导告诉我们，PDE5A抑制剂也许可增加 心脏发病69的风险，几项研究试图定义心脏功能的药物。 在14人的研究中以冠状动脉疾病，Herrmann等人，报导 100mg口头昔多芬(sildenafil)轻微地降低静止系统和肺 压力，但在心跳速率并没有效应，左心室充填压力或心 脏输出54。在一项随后研究中，人已知或疑似罹患冠状 疾病接受了仰自行车运动测试，且昔多芬(sildenafil)再次 轻微地降低了血压，但没有改变基线或受运动而被刺激 的心跳速率，血压，运动期间，或功能性保存56。其它 调查发现了只有在运动的表现时适度的改善57或延长达 到局部缺血的ST段衰退70。
对心脏效应的直接分析在试管实验被获得，但这些 结果依然有限和互相冲突。PDE5A基因表现是存在于人 体心脏52，59，虽然蛋白质表现和酵素活性是已被解答 的51，53，71。最近证据发现当基因和蛋白质表现量低迷时， PDE5A在肌肉细胞之内部被分区，并且它的抑制功能是 能改变心脏和肌肉细胞功能。这在静止情况下无法被观 测，但只有当心脏被刺激，例如藉由β-肾上腺素 (beta-adrenergic)促效剂58，59或压力超载60。β-刺激共同 活化腺苷酸活化酶(adenylate cyclase)增加循环3′5′-腺苷 (adenosine)单磷酸盐(cAMP)以及鸟苷酸环化酶 (guanylate cyclase)产生cGMP72。之前活化蛋白激酶A， 该酵素由标靶钙处理和肌丝相互作用增强收缩性，但后 者作用是为″制动器″来反抗这个作用。这达到一部分由 活化双重受质PDEs来分解cAMP73，和蛋白激酶G，其酵 素在心脏细胞内抵制多种cAMP/蛋白激酶A(protein kinaseA)效应72，74，75。
结果报告在此文中提供第一叙述于PDE5a抑制性质 在人体抗肾上腺素(anti-adrenergic)的效益。心脏功能被 研究在静止期间和在肾上腺素的刺激期间，使用各种参 数专一性对心脏和与心脏负载较不相关的变化76，77。虽 然重新校正基线收缩性轻微地(但极大)高于在群组接受 昔多芬(sildenafil)的处理，这并不表示研究结果因为峰值 反应本身显着下降了。不刻意局限任一种特殊理论，这 些结果无法排除藉由(sildenafil)可能像接受器的角色降 低敏感度，虽然预先的证据支持细胞内cGMP/PKG信号59 的主要角色支持一个远程的机制。多巴酚丁胺 (dobutamine)应力测试而不是运动作为这被使用了由昔 多芬(sildenafil)提供对肾上腺素的调节作为一个更加专 一性的评估。的确，甚至健康的实验体没有投以阻断剂 (beta blocker)显示在整体运动压力测试表现或最大的心 脏输出量上并没有改变-尽管对肾上腺素刺激的收缩性 有清楚的作用。心脏浓度指数提供一个敏感负载无关的 收缩性51，64，72，74，76，77，79，84指数，系由动脉或静脉舒张76 的影响程度低。
不同于心脏收缩的改变，多巴酚丁胺(dobutamine)刺 激的舒张功能，经各群组之间的比较，由昔多芬 (sildenafil)处理并未显着钝化。在群组分析表示，接受昔 多芬(sildenafil)的实验体在早期的心室充填和松弛有微 小的上升(E和E′的速度)且在心房充填更多量的增加(A 速度)。当在舒张作用能反射轻微的降低时，它与降低的 收缩度和增加以多巴酚丁胺(dobutamine)注入以昔多芬 (sildenafil)处理后的结束心脏收缩容量是一致的。于净心 室排斥的下降能限制早期舒张反冲作用，其归因于对心 脏早期的迅速充填。这反之导致增加充填在静脉收缩期 间，特别因为结束心脏舒张容量在两个小组是相似的。 E/E′速度比率显示与左心室舒张压39有好的关联性。在 基线或与多巴酚丁胺(dobutamine)，E/E′比率在两个小组 是相似，并且重要的是没有证据显示左心室舒张压是随 昔多芬(sildenafil)增加而增加，即使使心脏收缩的增强钝 化。样本尺寸也许归因于舒张效应的缺乏，因为扩张非 侵入性的测量可能会有更加巨大的变化。
昔多芬(Sildenafil)被报导在增加交感神经活性于没 有改变心跳速率或血压的情况85，并且这可能扮演了一 个在基础收缩性轻微上升的角色在第二条基线在实验体 接受昔多芬(sildenafil)处理。这样的活性也许被期望由下 游调节肾上腺素的刺激，因此使多巴酚丁胺(dobutamine) 反应钝化。这变化是微小的，但与在血浆儿茶酚胺里随 着以昔多芬86(sildenafil)(约70pg/mL)的轻微增加是一 致的，和大约3至4个级数的强度更低于当初预期多巴 酚丁胺(dobutamine)的处理。此外，在群组之间的分析上 并没有统计学上的不同。昔多芬(Sildenafil)亦被报导降 低迷走神经在心跳速率87的抑制性质和单一剂量88研究 增加的心跳速率几乎10％。这也许可解释本研究中在昔 多芬(sildenafil)处理之后，对多巴酚丁胺(dobutamine)增 进心跳速率的反应。更高的心跳速率就其本身而言是期 望增加收缩性，由力量频率关系，但是在对昔多芬 (sildenafil)群组的分析中，反作用是真实的。
昔多芬(Sildenafil)在未受损伤的人类心脏可能有效 力地抑制由肾上腺素刺激的收缩性。早先研究表示，昔 多芬(sildenafil)和其它PDE5 A抑制剂在健康个体勃起功 能障碍的治疗是安全和有效的80，冠状动脉疾病患 者54，56，和心脏衰竭的病人57。相对于早先报导，PDE5A 抑制剂在人的心脏没有作用，结果在此文中报导表明， PDE5A抑制剂在儿茶酚胺刺激下是心脏功能的重要调节 者。肾上腺素的刺激钝化将可能证明增强神经激素刺激 等病状是有利的，譬如高血压，左心室肥大，及心脏衰 竭。
实施例15：PDE5A抑制心脏分子再成型
当心脏上形态的改变是剧烈的变化与心脏再成型有 关，这些形态上的变化增强早期基因转录和蛋白质活性 改变的反应(图21A-F)。PDE5 A抑制处理可预防eNOS (NOS3)解除和限制金属结合蛋白酶(metalloproteinases) 的活化作用。慢性大动脉带(TAC)导致NOS3内正常二聚 体(更高mw形式)的损失(图21B)。这导致反应的氧气种 类的活化作用在上图21C。这个图显示正向染色由超氧 化物阴离子萤光探针(dihydroethidium)侦测。这根据由对 钙相关NOS3活性的降低(图21C)，和由NOS3使增加相 当数量的超氧化物形成(图21D)。
此外，PDE5A抑制性质预防NOS二聚体形成损失- 支持一个重要新颖的机制，藉由该机制的PDE5a抑制性 质限制在肥大性的和心脏衰竭的氧化剂应力(图21E)。图 21F表示，昔多芬(sildenafil)抑制明胶酶(gelatinases)中 金属结合蛋白酶(metalloproteinase)的活性。标记的胶体 溶解与慢性TAC一起被被观测于图21E(3WTAC)。这活 性藉由和昔多芬(sildenafil)共同处理而大大的被抑制。因 为明胶酶(gelatinases)的活化作用结合于心室再成型和 扩张，这表明，PDE5a抑制性质可抑制金属结合蛋白酶 (metalloproteinase)在分子再成型的角色，而分子再成型 与心脏衰竭和肥大性有关连。
RhoA的增加和Rho激酶的表现和活性被观测在慢性 大动脉带(TAC)(图21A-21C)。昔多芬(sildenafil)抑制 RhoA，Rho激酶1(ROCK1)及Rho激酶2蛋白质表现和 活性(ROCK2)(图22A-22C)。在rhoA和rho激酶的增加 与分子再成型以及心脏肥大和扩张有关连。由这些分子 里抑制性质改变，昔多芬(sildenafil)于分子再成型的治疗 是有用的。
STAT3磷酸化的增加，其活化STAT3，与TAC(图 23A和B)有关连。昔多芬(sildenafil)抑制STAT3的活化 作用(图23A)。因此，昔多芬(sildenafil)抑制分子再成 型与改变在STAT3活性相关。
实施例16：昔多芬(sildenafil)改善心肌能学
昔多芬(sildenafil)的治疗改善心肌能学。老鼠暴露于 TAC三个星期。心脏于活体内利用核磁共振光谱仪(NMR spectroscopy)估算高能磷酸盐的代谢。一个标准图像和光 谱被显示在图24A和24B。磷酸肌酸(PCr)与总ATP的比 率被使用作为测量能量储备和平衡。当以昔多芬 (sildenafil)保存正常能量平衡治疗，TAC大大地降低这个 比率。这表明，PDE5A抑制性质改善心肌能学和增强在 应力之下心脏能量的储备。
结论报导此文中利用以下材料和方法。
动物模型
使用雄性C57BL/6老鼠(8-11个星期，Jackson实验 室)。压力超载由横向大动脉收缩导致。条带步骤的急性 和慢性死亡率＜5％。仿真控制老鼠进行了同样操作，但 没有大动脉收缩。以PDE5抑制剂口头治疗是由混合药物 注入半软的啮齿目动物(Bioserv；4-6g/day)，并且充分提 供的每日必须营养。控制组是以载剂和食物混合喂食。 雄性基因转殖老鼠与持续性地反应Akt的心脏过度表现 (16-20周)89，对照组(liter mate controls)用一样的方法 以载剂或PDE5抑制剂处理。
PDE5A抑制剂
昔多芬(sildenafil)柠檬酸盐(Viagra，Pfizer)，EMD 360527(MERCK KgA)及他达拉非(tadalafil)(Cialis，Eli Lilly)被使用于研究。活体内慢性研究，昔多芬(sildenafil) 100mg/kg/day被用来产生平均自由血浆浓度10.4± 2.3nM(IC50 5-10nM)。这与浓度上是可比较的，观察在 人体内1mg/kg/day，和反射昔多芬(sildenafil)将近一百 倍在老鼠的高代谢。1.5g/kg/day EMD 360527用来产生 EMD 360527血浆浓度4μM(IC50 1μM在体外血管圆环 里)。100nM或1μM的昔多芬(sildenafi10被使用在 cGMP-PDE活动分析和出生鼠心肌细胞研究。50nM他达 拉非(tadalafil)被使用在cGMP-PDE活动分析。
生理研究
经胸二维导向M型超音波心电图(Transthoracic two-dimensional guided M-mode echocardiography)在非 被麻醉的老鼠实验。测量完成后使用超音波心电图 (echocardiography)系统，SEQUOI C256 (Siemens，Munich，DE)与15MHz线性排列变换器。无损伤 的心脏血液动力学的分析执行由前所述90。这些研究使 用了四个电极压力容量导管(model SPR-839，Millar Instuments)放置经由左心室尖端在开放胸口的麻醉动物 和由阻抗安置于沿纵轴记录心室容量及由微量测压法 (micromanometry)测压力。
RNA点墨分析
RNA样品是根据制造商的实验方法从急速冷冻心脏 使用立即可用的试剂作为分离总RNA TRIZOL试剂(Life Technology，Gaithersburg，MD)而制备。RNA点墨分析 以一套寡核苷酸探针使用已公开实验方法而进行59。资 料显示经过对各别样品所测得的GAPDH标准化。
西方点墨法
蛋白质是从急速冷冻心脏组织使用如前所述的萃取 缓冲液而制备90。抗体包括钙调神经磷酸酶(calcineurin) (1∶2000稀释，BD转导实验室(San Diego，CA)，GSK3β， Ser9-phospho-GSK3β，Akt，Ser473-phospho-Akt，ERK， Thr202/Thr204-phospho-ERK(1∶1000稀释，Cell Signaling Technology，Beverly，MA)。初级抗体的结合 藉由经山葵过氧化酶共轭的二级抗体和增强化学发光来 显现(Pierce，Rockford，IL)。
环状核苷酸分析
心脏以冰冷的PBS洗涤，在6％三氯乙酸中均质化， 以水-饱和乙醚离心和萃取。移出水层，真空脱水，并将 颗粒状物重新悬浮在醋酸钠缓冲液，用于cAMP和cGMP 酵素免疫分析(Amersham Pharmacia Biotech， Buckinghamshire，UK)。
PDE5A、PI3Kα、Akt和PKG-1活性
低Km cGMP磷酸二酯酶总活性是在1μM/L受质于线 性条件下以有和没有PDE5A抑制剂(昔多芬(sildenafil) 0.1至1μM，或他达拉非(tadalafil)50nM)或IBMX(50μM) 使用萤光极化分析(Molecular Devices)来予以分析。PDE- 分析在1μM cGMP侦测到数个高亲合力cGMP-PDE (PDE5A、PDE9A)及双重专一性PDE(例如，PDE1C、 PDE3A、PDE10A和PDE11A)。PI3Kα活性是由Elisa分析 随后接着PI3K免疫沉淀(Seize X IP Kit，Pierce)利用p85α 单株抗体(Cell Signaling)，以萤光极化(Molecular Device，Perkin-Elmer Victor3 plate reader)测得的活性来 进行评估。Akt活性(以s473-pAkt抗体，GSK-3融合蛋白 受质免疫沉淀)使用商业上的套组(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)来进行。PKG-1活性是从整体 心脏溶解产物由比色分析，CycLex(Clinisciences， Montrouge，FR)来进行分析。
组织学
心脏以10％甲醛固定隔夜，然后埋置在石蜡里，切 成5μm厚度并以PAS-六亚甲四胺(PAS-methenamine)染 色。心肌细胞直径和间质胶原比率是在观测者不清楚组 织来源的情况下使用计算机辅助的图像分析测得(Adobe Photoshop 5.0，NIH Image J)。对至少4至5个不同心脏， 以五个不同领域的细胞(共计50至70个细胞于各个心脏) 进行定量以供细胞分析。
新生大鼠心肌细胞的研究
如上述将大鼠新生心肌细胞从1至2天大的史-道二 氏(Sprague-Dawley)大鼠分离出来50。在有或没有以 100nM或1μM昔多芬(sildenafil)共同培养之下，细胞培养 物藉由以脱羟肾上腺素(phenylephrine)(PE；1μM；Sigma Chemical(St.Louis，Missouri)或Bay K8644(1μM；Sigma) 培养四十八小时来加以刺激。为了估计NFAT活化作用， 使用先前叙述的方法将细胞以表现三个连接β-半乳糖苷 酶(β-galactosidase)的NFAT结合位置(p3xNFAT-GL)的腺 病毒转染72。另外的研究是利用另一种编码萤光素酶 (luciferase)的报导腺病毒(reporter adenovirus)来进行， 该报导腺病毒是由NFAT激活子所驱动。此步骤在PE、 BayK8644或活化的钙调神经磷酸酶的刺激之前二十四 个小时进行。后者藉由共同转染编码Ca2+非依赖型且持 续活化的截短型老鼠钙调神经磷酸酶A(calcineurin A) (AdCnA72)的复制缺陷型腺病毒而达成。转染是以100 PFU的MOI于2mL(6cm培养皿)DMEM在37℃潮湿且含 5％二氧化碳的培养器中进行二个小时，在此之后，将培 养液用包含1μM的昔多芬或是载剂的培养液替换。在另 外的48小时后，NFAT活化作用藉由β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)组织学/活性或萤光素酶活性来估计。将 肌肉细胞固定于2％聚甲醛和0.2％戊二醛在PBS10分钟， 于24℃培养在X-gal染剂(在PBS，20mmol/L K4Fe[CN]6 3H2O，20mmol/L K3Fe[CN]6，2mmol/L二氯化镁和1 mg/mL X-gal[Promega]在DMSO)二个小时，以PBS润洗， 并利用7％甲醛缓冲液后固定六个小时。β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)活性利用商业测试套组(Galacto-Light Plus，Applied Biosystems)由微盘式冷光仪(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)所测得的发光现象来分析。 萤光素酶活性由商业套组(Stratagene，La Jolla， California)分析并以盘式冷光仪读取。
[3H]-白胺酸的并入
在血清饥饿(serum starvation)起始后24小时，在昔 多芬(100nM或1μM)存在或不存在下，将新生心肌细胞培 养在一式三份的含有1μMPE的12孔培养盘里二十四个 小时，然后在含有1.0μCi/ml[3H]白胺酸的相同培养液中 培养另外的十二个小时。吸出培养液，并且将细胞利用 冰冷的PBS洗涤和利用冷的10％三氯乙酸(TCA)固定在冰 上30分钟。以5％的TCA洗涤两次并以水洗涤一次之后， 并入TCA可沉淀材料的放射线是在溶于0.25M氢氧化钠 之后藉由液体闪烁计数法测得。
统计学分析
资料是以平均值±测量标准误差表示。多个群组之间 的差异由变异数分析(ANOVA)并接着由Tukey的多重比 较测试来进行比较。二群组分析由t测试执行(适当地使 用配对或非配对测试)。一系列的研究由重复测量变异数 分析(repeated measures ANOVA)来检测。
专一性的血液动力学指数法：
所有血液动力学资料皆使用习知发展的软件记录， 数字化信号在2KHz。舒张末期容积和收缩末期容积分别 是在等容收缩和松弛期间测量的平均容积。ESP是在最大 心室弹性的压力(压力/容积比(P/V ratio))1。EDP是在压 力-容积循环的较低右手角落的舒张压。心输出量是从放 置在胸部主动脉附近的血管外围血流探针(Transonics， Ithica，NY)测得。Ea等于收缩末期压力除以心搏排血量的 比。将容积导管信号对增益(gain)和偏移(offset)进行校 准。增益是藉由设定导管导出的心输出量(等于压力-容积 循环宽度乘以心跳速率)至彼等由经校准的血流探针值 所得的心输出量。偏移是运用高张盐水的方法测得80。 心室强度等于压力乘以血流的瞬间乘积，且峰值强度除 以EDV获得强度指数PMXI79。由一组在暂时性下腔静脉 阻塞期间所测量的收缩末期压力-容积点(最大P/[V-Vo]) 获得Eesn。此相关性Ees的斜率由心脏重量标准化且表示 为每gm心脏重量。Msw是由心搏作功及EDV(其来自用于 导出Eesn的同一组交变载荷心脏循环)之间的线性关系 导出，，且该Msw是另一种非负载依赖型的心脏收缩功能 的评估4。Tau由下列模型获得：P＝Po+ae-t/□，代入在 等容松弛期间的资料。dP/dt是从数字过滤器(5个点算出 的斜率)而导出。PFR/EDV是从早期舒张期间的容积信号 中最大的第一衍生物除以EDV而导出。
动物研究为例子7-11
雄性野生型及NOS3-/-老鼠(C57BL6，Jackson Labs，6 至8星期)的研究。PDE5A在活体内以昔多芬(sildenafil) 处理被抑制了(100μg/kg/min；37±5.2nM自由血浆浓度)； 或EMD-360527/5(MERCK KgA，Germany，160-300 μg/kg/min)。两种化合物有IC50大约10nM纯化的PDE5A (PDE1或PDE3对于1-20μM)。体外研究使用了0.1至1 μM昔多芬(sildenafil)(SIL)，0.05μM他达拉非(tadalafil) (于IX PBS制备)，或0.1μM EMD-360527/5于1％丙二醇 缓冲液中。单独以载体于实验体内及实验体外已被证明 是毫无效应。
活体研究
异丙肾上腺素(Isoproterenol)(ISO：20ng/kg/minutes i.v.x 5分钟)有或没有PDE5A抑制剂给予未受损伤的老 鼠麻醉，和活体内心脏功能由压力容积相关评估23，以 固定的心房搏动速率约600至650min-1。资料在基线测 量，与ISO，重新良测基线，PDE5A抑制性质，及PDE5A 抑制性质+ISO。ISO只反应于高度可再生的。
隔绝肌肉细胞研究
被切除的心脏是由缓冲布满包含BDM(1mg/ml)及 牛磺酸(taurine)(0.628mg/ml)3分钟，0.9mg/ml胶原酶 (Worthington Biochemical Co.，Lakewood，NJ，type 2；299 U/mg)和0.05mg/ml蛋白酶(Sigma Chemical，St Louis， Missouri)6至7分钟。心室轻轻地削剪了，过滤(滤网 150μ)，分离(1分钟500转)，随着钙的增加以泰洛氏溶 液(Tyrode’s solution)清洗(Ca2+最终浓度为1.8mM)。细 胞与5μM Indo-1 AM(Molecular Probes)由领域刺激在一 个被倒置的萤光显微镜(Diaphot 200；Nikon，Inc)培养， 清洗，和在27℃研究，。肌小节长度(IonOptix，MA)并且 整体细胞钙瞬间被测量了。随着基线，细胞暴露于10nM 的ISO，然后ISO+SIL，或ISO+EMD-360527/5在pH7.45。 SIL在0.1％DMSO和EMD在0.001％丙二醇里被稀释了； 控制溶液包含了相似的载剂浓度。
基因和蛋白质表现
PDE5A基因表现由定量实时PCR量测。残余的染色体 组DNA藉由DNaseI的处理从mRNA移除，及cDNA的合 成随着SuperScript First-Strand Synthesis System为 RT-PCR(Invitrogen)。相对的量由SYBR Green I分析 (QuantiTect SYBR Green PCR，Qiagen)测得了PDE5A mRNA，利用以下激活子：PDE5A(Gen Bank： NM_153422.1)上部激活子1493 5′-TGAGCAGTTCCTGGAAGCCT-S′，低激活子15965′- ATGTCACCATCTGCTTGGCC-3′，产物104bp；GAPDH (NM_008084.1)上部激活子263 5′-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAC-S′，低激活子363 5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′，产物101bp；以 GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems)。PCR 样品跑了一式三份，并且GAPDH被使用于正规化不同的 样品PDE5A内容。反应(20μl)执行了与300nM专一性的 激活子对为40个循环的放大作用(变性作用在95℃、15 s，黏合于60℃、30s，及扩张在72℃、30s)。PCR产物 放大作用专一性由熔化的曲线分析证实了24。在最后的 PCR周期后，反应热变性超过35℃，温度梯度从60至 95℃以0.03℃/s加热。
蛋白质溶解产物从整体心肌层和被隔绝的心肌细胞 于透析缓冲液(# 9803，Cell Signaling Technology， Beverly，MA)中与小型蛋白酶抑制剂(#1-836-153，Roche， IN)以及5％氚核(Triton)萃取。以下12,000g离心法三十 分钟，蛋白质定量(#23235，Pierce，Rockford，IL)， NUPage LDS样品缓冲添加(#161-0737，Biorad， Hercules，CA)，并且溶解产物电泳在NuPAGE 4至12％ Bis-Tris聚丙烯醯胺(polyacrylamide)胶体(Invitrogen， San Diego，CA)。膜与兔子聚株抗体培养量的上升受到纯 化的牛肺PDE5 A 的压制(Cell Signaling，MA) [1∶5,000]，氨基终端PDE5A区域(从Mauro Giorgi赠送 而来)[1∶5,000]，或重组PDE5A[1∶10,000]。
萤光共振能量转移(FRET)影像
心室肌肉细胞从1至2天的史一道二氏(Sprague dawley)大鼠(CharlesRiver Lab，MA)制备及与载体携带 cGMP传感器cygnet-2.1做转染77，在该传感器EYFP以较 少pH敏感变异黄石英替换89，及成像的十八至二十四小 时在转染之后叙述90。图像(50-80ms曝光)在每10秒使 用订制软件和由Imagej(NIH，MD)处理取得。FRET是变 化在480nm/545nm辐射强度(ΔR)在430nm上激发91表示 在基础强度在(Ro)百分比的改变。细胞浸泡了在HEPES 缓冲的林格氏(Ringer’s)调控盐(1mmol/L氯化钙)，在室 温(20-22℃)。
PDE5A及PKG-1活性分析
低Km，cGMP磷酸二酯酶活性了在1μMol/L受质被检 验，藉由萤光极化(Molecular Device，CA)在线性情况下， 或2阶段放射性标志测定法18，有或没有添加的昔多芬 (sildenafil)(0.1-1μM)，他达拉非(tadalafil)(50nM)，或 IBMX(50μM)。PDE分析在1μM cGMP侦测出数个高亲合 性的GMP-PDEs(PDE5A，PDE9A)及双重专一性PDEs (即；PDE1C，PDE3A，PDE10A和PDE11A)。
PKG-1活性由比色分析(CycLex，Nagno，Japan)检验 了执行在整体肌肉细胞与有或没有添加ISO(10nM)做培 养，SIL(1□M)，他达拉非(tadalafil)(50nM)，或sGC抑 制剂ODQ(3□M，Sigma)。在10分钟以后，细胞被溶解 了且PKG-1活性测得了。
免疫萤光组织学
野生型心肌细胞被固定在50％甲醇/50％丙酮里，和 整页与序列专一性的PDE5A抗体(从K.Omori赠送而来) 培养，在1∶5,000稀释和不是老鼠单株α-actinin(1∶500 稀释；Chemicon Intern.C A)，或NOS3(1∶3000；转导实验 室，KY)。第二次培养使用了反兔子Alexa 488和反老 鼠Alexa 546(Molecular Probes，OR)(1小时，27℃)。 细胞是在一个Zeiss倒置的表面萤光显微镜 (epifluorescence microscope)以氩氪雷射共焦扫描系统 (Ultra VIEW，PerkinElmer Life Science，MA)成像。
人体研究
四十个健康志愿者从一般人口中以被张贴在周围的 社区所响应广告的人来补充。由病史，体格检查，和经 胸超音波心电图(transthoracic echocardiogram)筛选实验 体。个体以心脏病，动脉粥样硬化，高血压，糖尿病性 酮尿，肺高血压，肾脏或肝疾病，抽烟，怀孕，或在硝 酸盐治疗之下，肾上腺素阻隔药物，或医学上已知干涉 昔多芬(sildenafil)的药物动力学被排除了。研究设计如以 下一个随机化的，双盲，安慰剂控制流程，使用倾向昔 多芬(sildenafil)的3∶2分配比率。所有实验体均指示在研 究之前禁食大于6小时。一根静脉内导管安置在前臂， 并且15至20分钟之后，血压，心电图的最初的基线(B1) 测量，并且对评估心脏作用的超音波多谱勒仪在仰卧位 置获得。静脉内投以多巴酚丁胺(dobutamine)(5μg/kg/min) 5分钟达到一个稳定的反应，及重复测量(D1)。多巴酚丁 胺(dobutamine)被中断了，并且假使15分钟回归到基线 状态。实验体然后接受了不是100mg口头昔多芬 (sildenafil)就是安慰剂。在75分钟之后(平均时间峰值浓 度)82，血样被获得证实昔多芬(sildenafil)浓度。资料再 次记录了第二条基线(B2)，和在第二多八胺(dobutamine) 注入(D2)期间使用和第一次测试相同的流程。
心脏功能分析
心脏收缩功能由心脏专一性指数确定了压力，次元， 和流程的联合测量。动脉压力由一个腕式及臂式的示波 器(oscillometric arm cuff)(Dinemap，Critikon，Tampa， FIa)测得，及2维超音波多谱勒仪由Agilent Sonos 5500 (Philips，荷兰)使用一根3兆赫探针测得。所有超音波多 谱勒仪测量是数字化地需要光盘和由一位蒙蔽的调查员 离线分析。各次测量反射了平均至少3不同跳动。大动 脉流程与速度对时间的积分结果是相等的，此积分从脉 冲波多谱勒仪在左心室流出径乘以横截面直径。行程排 量，峰值，和平均流程从这信号波形测得。心脏输出量 是心跳速率和行程排量的产物。系统血管阻抗是平均动 脉压力(1/3脉压+舒张压)与心脏输出量的比率。
心脏收缩性由几个与装载无关的指数评估。主要结 果是峰值强度指数(最大的强度由结束心脏舒张容量划 分)的变量，其指数反射心脏可收缩的状态与后负荷和预 压无关，如同早先被证明的76，77，84。最大强度与峰值大 动脉流程和收缩压产物近似，其强度强烈地与压力和流 程最大的瞬间压力和流程产物(y＝1.08x+0.002，r2＝ 0.97，p＜0.0001；根据对报导侵略性资料从有心脏情况范 围较大病人的分析)有关联。与负载无关的第二次结果收 缩性参数是平均心室强度指数和结束心脏收缩的压力/容 量比率，略计为心室结束心脏收缩的弹性量。
其它第二次结果变量包括心脏收缩和舒张功能定期 测量。射出分数从结束心脏舒张和心脏收缩的容量藉由 Simpson’s方法利用顶端4和2心室观点测得。结束舒张 容量与行程排量是相等的(从多谱勒仪)由射出分数划分， 以收缩末期容量的相等区别前者和后者。脉冲波转二尖 瓣流入(transmitral flow)多谱勒仪光谱及横向二尖瓣环 状组织多谱勒仪成像速度已作为早先习惯使用估计舒张 的功能89。E/E’比率被确定了作为左心室充填压力的一 个代理标志如同之前确认的90。等容松弛时间由连续波 多谱勒仪测量，此时间为在大动脉流程停止和二尖瓣流 入起始之间。
血浆昔多芬(sildenafil)浓度
血浆昔多芬(sildenafil)及它的代谢产物：去甲基化昔 多芬(desmethylsildenafil)在各个实验体由液相层析仪和 质谱仪(SFBC Analytical Labs，North Wales，PA)测得。
统计学的分析
样本大小估计设定侦测出a＞20％在左心室以响应 多巴酚丁胺(dobutamine)造成峰值强度指数下降，与 α＝0.05和80％强度。在预先的动物研究中，随着PDE5A 抑制性质由多巴酚丁胺(dobutamine)刺激的强度降低约 50％，人体实验中，从大约300mmHg/sec基线来看76， 多巴酚丁胺(dobutamine)强度增加大于100％。侦测出在 这个反应(60mmHg/sec)与50mmHg/sec的标准偏差(从 预先的资料)降低20％，以15个安慰剂控制的样本尺寸 和23个昔多芬(sildenafil)处理的实验体估算。
所有统计分析执行使用Systat(R)软件。结果被表达作 为平均值±标准偏差。血液动力学的资料被分析于使用重 复三种方法测量变异数分析，用三个群组的因素是：1) 呈现或缺乏多巴酚丁胺(dobutamine)；2)安慰剂对于昔多 芬(sildenafil)；并且3)第一次对于第二次多巴酚丁胺 (dobutamine)挑战研究。主要测试是测试在小组分析之 间，是否昔多芬(sildenafil)(对于安慰剂)改变了在第一个 和第二个多巴酚丁胺(dobutamine)反应之间的差距，并且 由一个三种方法交互作用的项目测得，包括各个群组因 素。这个模型亦包括一个项目测试对于昔多芬(sildenafil) 的一个整体作用(对于安慰剂)，该测试与相对多巴酚丁胺 (dobutamine)反应完全没有关系。在群组分析亦执行使用 2尾型Student的配对t测试估计个体的多巴酚丁胺 (dobutamine)反应(即；D1-B1，D2-B2)，和双向变异数分 析测试是否研究药物改变了在各个小组的这个反应。某 范畴的变量可使用卡方试验比较。
本发明的实际应用，除非另外说明，分子生物学传 统技术(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生化和 免疫学，这些都已经是是在熟练的大师视界之内。这样 技术充分地被解释在文学，譬如：″Molecular Clonig：A Laboratory Manual″，second edition(Sambrook，1989)； ″Oligonucleotide Synthesis″(Gait 1984)；″Animal Cell Culture″(Freshney 1987)；″Methods in Enzymology″ ″Handbook of Experimental″(Weir，1996)；″Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells″(Miller and Calos，1987)； ″Current Protocols in Molecular Biology″(Ausubel， 1987)；″PCR：The Polymerase Train Reaction″，(Mullis， 1994)；″Current Protcols in Immunology″(Coligan， 1991)。这些技术可适用于对聚核苷酸的生产和多胜肽的 发明，以及也许考虑制作和实践发明。特殊具体化的有 用技术将被谈论在以下的部分。
DHE染色方法
新鲜冰冻的LV心肌层(8μm切片)与超氧化物阴离子 萤光探针(dihydroethidium)(DHE；Molecular Probes， Eugene，Ore；2μM)被培养在1小时37℃，该探针可评估 O2的形成(典型地核子局部化)。图像执行了在Zeiss倒置 的表面萤光显微镜(epifluorescence microscope)接触氩氪 雷射共焦扫描系统(Ultra VIEW，Perkin Elmer Life Science，Inc)。DHE的激发/辐射光谱各别是488和 610nM，以585nm侦测。
心脏明胶酶(gelatinase)分析
MMP-2和MMP-9分解体外明胶由酶谱分析 (zymography)评估。简要地，修饰过的Laemmli缓冲液没 有巯乙醇(mercaptoethanol)，此缓冲液被添加于分解的组 织样品且装在10％明胶(Invitrogen Corp.，San Diego，CA) 中。在电泳之后，胶体以复性(renaturing)的缓冲液在室 温清洗二次接着形成缓冲液(Invitrogen Corp.，San Diego， CA)，然后以一个商业上可利用的考马斯(Coomassie)染色 显现细胞溶解的带(SMPLYBLUe，Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
RhoA活性分析
RhoA活性分析由免疫沉淀(immunoprecipitation)使 用商业上可利用的被固定的抗体(SEIZE X IP，Pierce Biotechnology，IL)。抗体的使用是兔子聚株抗体培养的 上升受到RhoA的压制(Upstate，NY[1∶2500])并且随后 商业上的活性分析是根据制造商的规格(Upstate Biotechnology，NY)
西方分析
蛋白质分解从整体心肌层及隔绝的心肌细胞使用溶 解的缓冲液(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)与 微型蛋白酶抑制剂(Roche，IN)及5％氚核(Triton)(Sigma Chemical St.Louis，Missouri)获得。随后以12,000g离心 法30分钟，蛋白质定量(Pierce Rockford，IL)，添加 NUPage LDS样品缓冲液(Biorad，Hercules，California)， 且分解电泳在NuPAGE4至12％的Bis-Tris-聚丙烯醯胺 (polyacrylamide)胶体(Invitrogen，San Diego，CA)。膜与 兔子聚株抗体培养的上升受到ROCK1或ROCK2压制 (Cell Signaling，Beverly，MA)[1∶3,000]。
STAT3活化研究
心肌组织萃取物是在SDS新胶体中电泳，和探测酪 胺酸磷酸化(Tyr705)及整体Stat3。在另外的研究中，鼠 出生肌肉细胞被培养了，然后暴露在介白素-6(IL-6， Cell Signaling，100ng/ml)一个小时。在一些研究中，细 胞在IL-6之前以昔多芬(sildenafil)预处理(1μM)30分 钟，和然后再以IL-6同样步骤。在其它研究中，细胞与 混杂的多醣体沉默RNAs预转染(LipofectamineTM， Invitrogen)为STAT3(siRNA，SmarTTpool Stat3)。蛋白质 萃取物从肌肉细胞萃取物在1个小时潜伏期之后获得， 和探测Statl(Tyr701)及Stat3(Tyr705)(Cell Signaling Inc.)的磷酸化和总蛋白质浓度。siRNA转染入初生的肌 肉细胞。
其它
由前面的叙述，它将是明显的，变异和修饰也许对 此文中发明的描述采取它对各式各样的用法和情况。这 样具体的做法亦是在以下要求的范围之内。所有的专利 和出版物在这个规格由参考文献被提及并入此文中在同 样程度上，就好象各独立专利和出版物具体地和各自地 表明由参考文献合并。
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