用于微血管造影的造影剂
阅读：696发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于微血管造影的造影剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于离体微 血管造影 的 造影剂 ，所述造影剂用于对小鼠或大鼠或其他实验动物的血管系统以及对单个的动物器官和人的器官的血管系统进行数字成像，所述造影剂包含碘化的酯化油、聚 氨 酯和 固化 剂。本发明还涉及一种用于产生造影剂的方法；以及一种套件，其具有不同的容器，所述容器具有根据本发明的造影剂的待混合的组分；以及设计根据本发明的造影剂借助Micro-CT装置用于成像的一种优选的用途。，下面是用于微血管造影的造影剂专利的具体信息内容。
1.一种用于离体微血管造影的造影剂，优选用于借助Micro-CT装置对小鼠或大鼠或其他实验动物的血管系统或者单个的动物器官和人体器官的血管系统进行数字成像，所述造影剂包含：
-聚氨酯，和
-固化剂，
其特征在于，所述造影剂还包含：
-碘化的酯化油，和
-酮。
2.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述碘化的酯化油是碘化的酯化罂粟籽油或碘化的酯化亚麻籽油，其中所述碘化的酯化亚麻籽油优选是9,12,15-三碘代-十八碳三烯酸乙酯。
3.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，所述酮选自2-丁酮、丙酮或3-戊酮，其中所述酮优选为2-丁酮。
4.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，所述造影剂包含染料，其中所述染料优选是蓝色染料。
5.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，所述聚氨酯是多异氰酸酯预聚物，优选脂族异氰酸酯，特别优选4,4’-亚甲基-二(环己基-异氰酸酯)。
6.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，所述固化剂为经改性的芳族二胺，其中所述固化剂优选是二乙基甲基苯二胺，特别优选是二乙基甲基苯二胺的两种异构体的混合物，最优选是2,6-二氨基-3,5-二乙基甲苯与2,4-二氨基-3,6-二乙基甲苯的比例为7:3的异构体混合物。
7.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，
-在所述造影剂中包含20％至60％，优选22％至45％，特别优选24％至30％的所述碘化的酯化油；以及
-在所述造影剂中包含7％至30％，优选10％至25％，特别优选14％至22％的所述酮。
8.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，在具有所述碘化的酯化油和所述酮的造影溶液中，所述碘化的酯化油的体积与所述酮的体积的比为0.75至4，优选1至
1.5，特别是1.1至1.3。
9.根据上述权利要求之一所述的造影剂，其特征在于，在所述造影剂中包含25％至
60％，优选35％至55％，特别优选38％至50％，并且最优选43％至47％的所述聚氨酯；以及-所述造影剂中包含4％至10％，优选5％至9％，特别优选6％至8％的所述固化剂，-其中优选所述聚氨酯与所述固化剂的体积比位于100:10至100:25的范围内，特别优选位于100:16至100:19的范围内。
10.一种用于离体微血管造影的套件，其包含：
-第一容器，其装有碘化的酯化油，优选碘化的酯化亚麻籽油，特别优选9,12,15-三碘代十八碳三烯酸乙酯，并且装有酮，优选2-丁酮；
-第二容器，其装有聚氨酯，优选多异氰酸酯预聚物，特别优选4,4’-亚甲基-二(环己基-异氰酸酯)；和
-第三容器，其装有固化剂，优选经改性的芳族二胺，特别优选2,6-二氨基-3,5-二乙基甲苯。
11.根据权利要求10所述的套件，其中所述第一容器还装有染料，优选蓝色染料。
12.根据权利要求10至11之一所述的套件，其中：
-所述第一容器装有第一混合物,该第一混合物由2ml至4ml、优选2.5ml至2.8ml的所述碘化的酯化油和2ml至3ml、优选2.2ml至2.9ml的所述酮构成；并且其中
-所述第二容器装有4ml至7ml、优选4.5ml至5ml的所述聚氨酯；并且其中：
-所述第三容器装有0.5ml至1.5ml、优选0.8ml至1.2ml的所述固化剂。
13.根据权利要求10至12之一所述的套件，其还具有：
-第一注射器，所述第一注射器用于容纳所述第一容器和所述第二容器的内含物，优选是体积为12ml的注射器；
-第二注射器，所述第二注射器用于容纳所述第三容器的内含物，优选是体积为1ml的注射器；
-混合容器，所述混合容器用于使所述第一注射器和所述第二注射器的内含物掺和；
-优选地具有分配器，所述分配器用于控制所述第一注射器和所述第二注射器，其中所述分配器具有用于分别容纳所述第一注射器和所述第二注射器的第一端的装置；
-和优选地具有适配器元件，所述适配器元件用于分别容纳所述第一注射器和所述第二注射器的第二端并且用于容纳所述混合容器的第一端。
14.一种用于制备根据权利要求1至9之一所述的用于离体微血管造影的造影剂的方法，所述造影剂用于借助Micro-CT装置对小鼠或大鼠的血管系统进行数字成像，所述方法包括以下步骤：
f)在第一容器中提供碘化的酯化油与酮的第一混合物；
g)在第二容器中提供聚氨酯；
h)在第三容器中提供固化剂；
i)将所述第一容器的内含物与所述第二容器的内含物掺和并混合为第二混合物；
j)在注射到待检查的所述血管系统中之前，将所述第三容器的内含物与步骤i)的所述第二混合物在混合元件中掺和；其中优选使用混合体积比为100:16至100:19的所述聚氨酯与所述固化剂。
15.一种用于离体微血管造影的方法，所述方法用于借助Micro-CT装置对动物体或人体或动物器官或人体器官的血管系统进行数字成像，特别是小鼠或大鼠的血管系统进行数字成像，所述方法包括以下步骤：
k)优选根据权利要求14所述的方法提供根据权利要求1至9之一所述的造影剂；
l.)插入套管并冲洗待检查的动物体，优选借助于澄清溶液，特别是PBS，其中优选针对小鼠使用20ml至100ml的冲洗量，并且优选替选地针对大鼠使用20ml至200ml的冲洗量；
m)优选以恒定的流率将所述造影剂分别注射到身体或器官中，其中所述流率优选为至多3ml/分钟，特别优选至多1.5ml/分钟。
16.根据权利要求15所述的用于离体微血管造影的方法，其特征在于，在注射所述造影剂之后，等待所述造影剂在所述动物体内的固化结束，并随后借助Micro-CT装置对所述动物体进行扫描。
17.根据权利要求15或16所述的用于离体微血管造影的方法，其特征在于，步骤m)中的所述注射是手动进行的，优选借助分配器进行，或者步骤m)中的所述注射是借助注射泵进行的。
18.根据权利要求1至9之一所述的造影剂或根据权利要求10至13之一所述的套件用于死后的微血管造影的一种用途，其特征在于，所述造影剂被注射到人体或动物体中或者人的器官或动物的器官中。
用于微血管造影的造影剂
技术领域
[0001] 本发明涉及用于死后微血管造影的造影剂，即，借助基于X射线的成像方法，尤其是纳米或Micro-CT装置，用于对血管系统，特别是对小型动物(例如小鼠、大鼠或其他实验动物)的血管系统以及单个动物器官和人类器官的血管系统进行数字成像。
背景技术
[0002] 微血管造影的目的是以三维方式使最小的血管，即单个器官或全身的毛细血管可视化并且精确地再现以进行分析。然而，特别是对于药理研究，以及在法医学中，对完整无缺的血管进行分析是必要的。迄今为止，基本上有两种技术用于绘制微血管：一是所谓的铸型法，二是放射性造影剂绘制，特别是 方法。
[0003] 在过去的数年中，3D绘制方法如微型计算机断层扫描(Micro-CT)引起了越来越多的注意。血管系统的绘制需要用不透射线(radiopaque)的造影剂进行灌注以借助于通过Micro-CT进行可视化。在血管研究中，迄今为止，Micro-CT已经与不同的造影剂结合使用，以绘制不同器官(例如脑、心、肝、肾、肺以及后肢)还有肿瘤的血管系统。但是，这些研究始终在分辨率方面受到限制，或者由于填充不完全和灌注错误(还由于所用的造影剂的黏度相对较高)而受限(例如Perrien，D.S.，2016)。
[0004] 在血管腐蚀铸型法(英语是，vascular corrosion casting method)中，将铸型材料，例如基于聚氨酯的待聚合的药剂注射到血管中(例如Meyer等，2007&2008；Krucker等，2006)。随后，在其聚合之后，将周围的组织化学浸渍并吸收。随后通过扫描电子显微术(REM)或放射性地以三维方式评价由此产生血管的铸型。也存在创建三维血管模型的可行性。该方法的严重的主要缺点是组织的浸软，因为它排除了(随后)组织学检查并且与之相应地甚至也无法在组织内进行任何定位。当使用扫描电子显微术时，该方法的另一缺点是血管的可绘制性有限，因为虽然获得血管在血管铸型的外表面上的图像但无法获得血管在铸型的内部中的图像。
[0005] 方法尤其适用于绘制直径直至100μm的血管。由于该血管直径几乎无法推断出毛细血管区域，所以用户以不同的方式改变所述应用。这意味着用户根据需要通过稀释或其他改性来改变造影剂物质的组成，使得造影剂能够进入较小的血管。通常，因此能够达到并绘制直至10μm的毛细血管区域。然而，造影剂组成的稀释或改性的方式并非根据任何已知的标准实现，而是单独实现。所述应用通常手动地执行。尽管如此根据已公开的研究，由于黏度相对较高灌注仍可能是不足(Perrien，D.S.2016)。
[0006] 氧气和代谢物的交换主要在毛细血管床的水平上，即在血管直径约4μm至10μm时发生。临床前期研究通常限于绘制中等直径(约15μm)的微血管。同时，所述研究使用Micro-CT扫描仪或Micro-CT设备，它们能够绘制直径直至3μm至4μm的毛细血管，前提是这些毛细血管也能够通过合适的所添加的造影剂到达和填充。
[0007] 相应地，存在对如下造影剂的大的需求，所述造影剂能够足够远地渗透到最小的血管中并且能够通过Micro-CT实现微血管系统的尽可能无伪影的可视化或形态测量学的3D图像分析(另见Zagorchev等，2010)。
发明内容
[0008] 相应地，本发明实现如下目的：提供一种改进的造影剂，该造影剂可以进入到直径直至3μm至4μm的毛细血管中从而实现通过Micro-CT方法绘制血管。同样存在对改进的离体血管造影法的大的需求，其允许可再现地绘制血管系统。随着根据本发明的造影溶液的发展，现在存在如下改进的造影剂以及改进的血管造影法可供使用，所述造影剂克服了现有技术的缺点。
[0009] 在上文中所描述的目的分别通过根据权利要求1所述的造影剂或通过根据权利要求10所述的套件(kit-of-parts)来实现。优选地通过根据权利要求14所述的产生方法来提供改进的造影剂，并且根据权利要求15所述的离体微血管造影法实现根据本发明的造影剂的可再现从而优化的应用。
[0010] 离体使用根据本发明的造影剂，该造影剂实现：绘制直径直至3μm至4μm的毛细血管。用于离体微血管造影或死后微血管造影的根据本发明的造影剂优选用于借助Micro-CT设备对小鼠或大鼠或其他实验动物和人体器官的血管系统进行数字成像从而实现对其的检查。根据本发明的造影剂包含碘化的酯化油，优选碘化的酯化亚麻籽油或碘化的酯化罂粟籽油。另外，根据本发明的造影剂具有聚氨酯和固化剂，以及作为溶剂的酮。酮优选选自：丁酮(或2-丁酮或甲基乙基酮或C4H8O)、丙酮(或2-丙酮或二甲基酮或C3H6O)或3-戊酮(或二乙基酮或C5H10O)。在此，特别优选2-丁酮或丙酮作为溶剂，其中最优选2-丁酮。替选地，可能也能够将二氯甲烷用作为溶剂。出于本申请的目的，碘化的酯化油与酮的混合物被称为“造影溶液”。
[0011] 造影剂的一个特别优选的实施方案还包含染料，其中该染料优选是蓝色染料(例如VasQtec的BlueDye)。在添加染料的情况下，其也是出于本申请的目的被称为“造影溶液”的混合物的一部分。
[0012] 如上所述，一个优选的实施方案包含碘化的酯化亚麻籽油作为碘化的酯化油。因此，根据本发明的造影剂是含碘且优选还含染料的聚合物质，其优选基于碘化的酯化亚麻籽油。优选地，碘化的酯化亚麻籽油是9,12,15-三碘代-十八碳三烯酸乙酯或亚油酸乙酯。
[0013] 根据本发明的造影剂优选具有自发荧光特性并且引起：在初始的应用阶段中血管优选被染蓝，这简化了注射的光学控制。
[0014] 在应用或注射到待检查的身体或选择性地应用或注射到待检查的器官中之前，根据所限定的方案将造影溶液与所提及的聚氨酯(PU-)树脂和固化剂混合。
[0015] 用于制备根据本发明的造影剂的聚氨酯优选是多异氰酸酯预聚物。在此，其优选是脂族异氰酸酯。优选地，异氰酸酯具有芳族或优选脂族基团。为了使聚氨酯保持柔软，通常使用聚醚。尤其有利的是，聚氨酯包含聚酯，或者优选包含聚醚，所述聚醚由乙二醇残基和/或丙二醇残基形成。优选地，聚氨酯包含扩链剂，特别是二醇或优选基于二胺的扩链剂，尤其优选二乙基甲基苯二胺。特别适合于微血管造影的造影剂具有4,4’-亚甲基-二(环己基-异氰酸酯)(HDMI)或4,4’-二环己基甲烷-二异氰酸酯作为聚氨酯。
[0016] 在根据本发明的造影剂中使用的固化剂，优选是经改性的芳族二胺，特别优选二乙基甲基苯二胺，例如2,6-二氨基-3,5-二乙基甲苯，所述固化剂优选在注射到身体中或选择性地注射到器官中前一刻才被添加给由碘化的酯化油、丁酮与PU构成的混合物。特别有利于在根据本发明的造影剂中使用的固化剂具有二乙基甲基苯二胺的两种异构体的混合物，最优选2,6-二氨基-3,5-二乙基甲苯和2,4-二氨基-3,6-二乙基甲苯的比例为7:3的异构体混合物。
[0017] 有利地，在造影剂中包含20％至60％，优选22％至45％，特别优选24％至30％(分别为体积百分比)的碘化的酯化油。有利地，在造影剂中包含7％至30％，优选10％至25％，特别优选14％至22％的酮或优选2-丁酮(分别为体积百分比)。
[0018] 在造影剂中包含25％至60％，优选35％至50％，特别优选38％至50％，并且最优选43％至47％的聚氨酯(分别为体积百分比)。
[0019] 在造影剂中包含4％至10％，优选5％至9％，特别优选6％至8％的固化剂(分别为体积百分比)。
[0020] 本发明还涉及用于微血管造影的套件，其包含：
[0021] -第一容器，其分别装有上述碘化的酯化油和所述酮或优选2-丁酮；和[0022] -第二容器，其装有上述聚氨酯；和
[0023] -第三容器，其装有上述固化剂。
[0024] 第一容器在此优选分别装有由2ml至4ml，优选2.5ml至2.8ml的碘化的酯化油(优选碘化的酯化亚麻籽油)和2ml至3ml，优选2.2ml至2.9ml的酮或2-丁酮构成的第一混合物。也就是说，第一容器装有“造影溶液”。在此，第一容器优选附加地装有上述染料，优选蓝色染料，所述染料在其混入的情况下也属于“造影溶液”。添加一撮染料对于本申请而言就足够了，这对应于约0.2g的染料。第二容器优选装有4ml至7ml，特别优选4.5ml至5ml的聚氨酯，并且第三容器优选装有0.5ml至1.5ml，特别优选0.8ml至1.2ml的固化剂。优选地，在待注射的混合物中聚氨酯与固化剂的体积比位于100:10至100:25的范围内，特别优选位于
100:16至100:19的范围内。
100:16至100:19的范围内。
[0025] 优选地，套件还包含：
[0026] -用于吸取第一容器和第二容器的内含物的第一注射器，优选容积为12ml的注射器；
[0027] -用于吸取第三容器的内含物的第二注射器，优选容积为1ml的注射器；
[0028] -用于混合第一注射器和第二注射器的内含物的混合容器；
[0029] -用于控制第一注射器和第二注射器的分配器，其中分配器具有分别用于容纳第一和第二注射器的第一端部的设备；
[0030] -以及优选地适配器元件，其分别用于容纳第一和第二注射器的第二端部以及用于容纳混合室的第一端部。
[0031] 本发明还涉及一种用于制备微血管造影的上述造影剂的方法，所述方法通过Micro-CT(μCT)设备对小鼠或大鼠的血管系统进行数字成像，其中产生方法包括以下步骤：
[0032] a)在第一容器中提供碘化的酯化油优选碘化的酯化亚麻籽油与酮优选2-丁酮的第一混合物；
[0033] b)在第二容器中提供聚氨酯；
[0034] c)在第三容器中提供固化剂；
[0035] d)将第一容器的内含物与第二容器的内含物掺杂并混合成第二混合物；
[0036] e)在注射到小鼠或大鼠的血管系统中前一刻，将第三容器的内含物与步骤d)的第二混合物在混合元件中掺杂；其中优选使用混合比为100:16的聚氨酯与固化剂。
[0037] 本发明还涉及用于微血管造影的方法，所述方法借助Micro-CT设备对动物特别是小鼠或大鼠的血管系统进行数字成像，其包括以下步骤：
[0038] -优选根据上述方法提供上述造影剂；
[0039] -优选用澄清溶液，尤其PBS(磷酸盐缓冲盐溶液，英语是phosphate buffered saline)对待检查的动物体进行插管和冲洗或放血，其中优选针对小鼠使用20ml至100ml的冲洗量，并且替选地针对大鼠使用20ml至200ml的冲洗量；
[0040] -注射造影剂，优选以均等的流量并且优选在尽可能均等的压力下注射，其中流量优选为至多3ml/min，特别优选为至多1.5ml/min。
[0041] 造影剂的应用或注射要么能够手动地借助于分配器进行，要么替代地借助注射泵或借助于优选改型的或匹配于个体要求的灌注器进行，借助于其能够遵循每时间单位的特定量。
[0042] 对于小鼠，通常注射在1ml和12ml之间的造影剂，对于大鼠通常注射在1ml和30ml之间的造影剂，这取决于待检查的目标器官。
[0043] 将造影剂注射到小鼠或大鼠中优选在1至6分钟的时间范围内进行，其中对于小鼠或大鼠，优选使用0.5ml至12ml/min，特别优选1ml至3ml/min，最优选至多1.5ml/min的注射率。
[0044] 在注射造影剂之后，优选地，等待造影剂在动物体内固化。接下来，将相关的器官或身体部分切下来并进行化学固定，随后借助Micro-CT设备进行扫描。
[0045] 根据本发明的造影剂首先适合于实验目的，即在临床前期研究中适于灌注小动物身体，特别是小鼠和大鼠。然而，其例如也能够用于选择性灌注较大的实验动物例如兔、狗、鱼、羊、小型猪等的各个区域或器官。这些区域或器官例如在整形外科或牙科的研究(牙置换、骨置换等)中使用。出于该目的，将造影剂特定地注射到如下动脉中，所述动脉是其“末端区域”应被绘制的动脉。以这种方式，能够将造影剂选择性地注射到各个器官或身体部分中，例如注射到下颌等中，从而能够绘制相应的器官或身体部分。根据本发明的造影剂还适合于在法医学中应用，并且在此也适用于尸体的司法鉴定的检查。
[0046] 提供根据本发明的造影剂为生物医学研究的多个领域中的离体Micro-CT技术开辟了新的应用领域。在根据现有技术的PU吸收方法中，必须在CT扫描之后通过吸收掉周围组织，以便获得血管系统的3D模型，而根据本发明的无损方法一方面获得血管系统的高分辨率的图片并且另一方面能够紧接着将已扫描的样品另外用作为组织学或电子显微镜检查的基础，因为周围组织保持完好无损。同样地，能够将尤其令人感兴趣的器官部分切下并以更高的分辨率进行扫描。然后利用合适的量化软件进行图像分析。
[0047] 例如对于肾血管系统的形态测量而言，包括对小鼠肾小球在直至低于2.5微米的分辨率中(体素边尺寸(voxel side size))(Shokiche，CC等)(2016年)，以及在相关绘制小鼠后肢的血管系统和肌肉组织中(Schaad等，2017)，已证实了造影剂的有利使用。在用(Fluitec)对动物体进行灌注的情况下，即在目前为止标准的成像方法中，通常能够达到直至约50微米至100微米的分辨率。为了改进这种分辨率，血管造影技术人员对个体地进行稀释，这根据稀释度允许直至约12微米的分辨率。然而，由于多种因素，例如较高的黏度，对较小的血管和毛细血管进行灌注是有缺陷的(Perrien D.S:,2016)。
[0048] 然而，含有造影溶液的根据本发明的造影剂进入直径直至3微米至4微米的最小毛细血管中从而允许更详细地绘制血管系统。根据本发明的应用方法相对于还提供了可再现的低的黏度(与 方法的多种个体的修改相比)。
[0049] 根据本发明的造影剂的另一个优点是，聚合给予测试对象的附加的稳定性，这尤其在Micro-CT扫描期间是有利的，因为它提高了成像质量。同样地，基于造影溶液的新型造影剂具有高的X射线吸收度，所述X射线吸收度与骨骼组织的X射线吸收度接近。这简化了待绘制的血管基于阈值的分割及其可视化。
[0050] 因此，总的来说，根据本发明的造影剂的固化和自发荧光的特性允许相关的处理方法，即在对待进一步检查的组织切片进行Micro-CT成像和定义之后，能够附加地在相同的测试对象处通过组织学和透射电子显微镜执行形态学分析。根据本发明的造影剂保留在灌注的血管中并且是自发荧光的，这简化了在虚拟的Micor-CT切片堆叠内“定位”特定的组织切片的。
[0051] 关于肾形态测量，无论是迄今为止的高场MRI技术，还是最近描述的具有借助体内抗CD31标记的“光片显微术(lightsheet microscopy)”的方法，与基于Micro-CT的借助于根据本发明的造影剂的形态测量方法相比，都无法以同样的程度绘制肾的血管树。此外，该方法实现借助已经公开可用的软件进行器官血管系统3D骨架化和相应的分析。除了血管进行快速3D绘制之外，基于Micro-CT的形态测量方法还可以节省大量时间(少于24小时，而在基于组织学的经典或铸型法中则为1至2周)。
[0052] 出乎意料地，已经发现，根据本发明的造影剂也能够用于在脱钙作用(decalcification)之后进行骨血管的可视化。对于先前的脱钙作用而言，其是现有技术的一部分而不是本发明的主题，原则上能够使用三种主要类型的脱钙剂：第一，基于的强的矿物酸的脱钙剂，例如盐酸或硝酸；第二，基于较弱的有机酸的脱钙剂，例如甲酸(例如在简单的10％水溶液中，或与福尔马林或与缓冲液组合)或三氯乙酸；以及第三，由所谓的螯合剂构成的脱钙剂，例如10％EDTA溶液。针对使骨血管可见的目的，优选使用螯合剂。EDTA(乙二胺四乙酸)虽然作用较慢，但对组织的损害很小，并且几乎不影响传统的着色剂。基于EDTA的脱钙剂的可能的组成是由250g的EDTA二钠盐与1750ml的蒸馏水构成的混合物，其中优选通过添加约25g的氢氧化钠将溶液的调节为pH 7。
[0054] 迄今为止，根据本发明的造影剂例如在绘制小鼠后肢的血管系统(见图1)以及肾血管系统和肾小球(图2至5)时使用。
[0055] 下面参照附图分别描述本发明的优选的实施方式或本发明的应用的实例，附图仅用于进行阐述而不理解为是限制性的。在附图中：
[0056] 图1以通过Micro-CT可视化的方式示出小鼠的下后肢的血管系统；其中A)示出横向的3D视图，在所述横向的3D视图中体像素侧长为2.7μm；B)(在A中所示的水平下)示出血管系统的虚拟的横向截面，其中体像素侧长为0.8或0.66μm：胫骨(T)和腓骨(F)由于其高的X射线吸收而显得略带颜色；在C至F中示出单独的比目鱼肌(soleus muscle)(C、D)或跖肌(plantaris muscle)(E、F)的虚拟横向截面；在C’)-F’)中，以通过在C)-F)的矩形标记的方式更详细地示出了特定部分；其中，微血管系统在体绘制(volume-rendering)中以更高的放大倍数描绘，其具有不同的血管密度、迂曲度(tortuosity)和3D排列。
[0057] 图2示出肾血管系统和肾小球的不同可视化形态。其中在A)中，在聚焦于肾血管系统的情况下举例说明了Micro-CT数据集的重建的3D堆叠；在B中，通过数据集利用另一传递函数绘制虚拟的切片：可视化集中在肾组织上；C至C’示出了在聚焦于肾小球的可视化；图C示出如左下方的白框所示出的那样的虚拟的500μm的厚切片的体绘制；C中的白框示出图C’中的较大放大倍数下具有肾小球的部位。图D至D’示出了进阶的可视化选项：在分辨率更高的情况下的microangio-CT(体像素侧长＝0.59μm)。图D中的插入图示出D中所示的虚拟的切片水平；在D’中示出在D中标记的肾小球的微血管系统的3D体绘制。
[0058] 图3示出相关的显微镜术：利用Micro-CT数据和组织学方法将相应的部位可视化。在成像后，对固定的肾进行进一步的处理以进行组织学切片和检查；图a至c利用明场显微术(a&a’)和荧光显微术(b&b’)以及Micro-CT(c&c)示出同一肾的同一水平(切片)的可视化。b和b’中的绿色信号来自在血管中聚合的自发荧光的造影剂。该特性由于聚焦于较大的血管而简化了组织学和Micro-CT之间的配准。在图a’至c’中放大地示出在a至c中被标记的区域。肾小球用a’至c’中的圆圈绘制。
[0059] 图4基于(a)组织学和(b)Micro-CT数据示出用于立体估计肾小球数目的组合式分离器/析象器的原理的示意图。a)示出经典的组织学原理：在距离为15μm的情况下在切片对中详尽地对整个肾切片(析象器高度(英语是disector height)为约10个等距的水平(section sampling level，SSL)，约1mm)。切片厚度为5μm。对于所述析象器高度，使用每第三个切片；而对于SSL，将197个切片(200-3)丢弃，直到使用下一个相关的析象器对为止。在形成析象器的相应图像上，对肾小球进行计数，这些肾小球在一个区域中出现而在另一区域中不出现，并且位于计数框中，没有触及左下方的线(黑色的钩)。将所估计的数量乘以倒置的切片采样因子(SSF)和面积采样因子(ASF)，以便获得每个肾基于组织学的肾小球绝对数量(Nabs-histo(glom)，见正文)。
[0060] b)根据μaCT(microangio-CT)的原理：基于虚拟图片堆栈的micor-CT数据的几乎相同的原理。由于使用体素堆栈的相应切片编号(图的左侧)，实现了析象器高度(16μm或8体素高度)和切片图案水平(1mm或500体素高度)。切片/体素高度：2μm。根据析象器原理(复选标记)对总切片水平上的所有肾小球进行计数，因此无需计数框。将预计的肾小球数目仅乘以倒切片图案因子，因此不需要面积/面积比，从而得出每个肾的肾小球总数(Nabs-μaCT(glom))。
[0061] 图5示出在利用根据本发明的造影剂的条件下所提出的肾的微血管CT方法(根据图2至4)的示意图。
[0062] 图6示出借助MicroCT利用根据本发明的造影剂所绘制的小鼠的胫骨的血管系统。(6a)和(6b)均示出贯穿同一胫骨的虚拟的横截面，其中在(6a)中描绘用10％的EDTA进行脱钙作用之前的骨，而在(6b)中示出用10％的EDTA进行脱钙作用之后的骨。由于较高的X射线吸收，胫骨(T)在(6a)中显得较明亮，而在(6b)中由于较低的X射线吸收在脱钙作用之后显得透明。因此，在(6b)中可以更好地看到和发现横向穿过骨组织的位于骨膜血管和髓腔(KH)血管之间的小的连接血管(向上指向的箭头)。由于胫骨的脱钙的骨组织的X射线吸收较低，在(6b)中髓腔内的血管的可视性得到了改善。在胫骨的外缘处，可清楚地看到供血动脉(avn＝动脉和腔静脉)。
[0063] 图7示出借助于Micro-CT利用根据本发明的造影剂所绘制的小鼠的胫骨的血管系统。(7a)和(7b)均示出贯穿同一胫骨的虚拟的纵截面，其中在(7a)中示出用10％的EDTA进行脱钙作用之前的骨，而在(7b)中示出用10％的EDTA进行脱钙作用之后的骨。由于较高的X射线吸收，胫骨(T)在(7a)中显得较明亮，而在(7b)中由于X射线吸收较低在脱钙作用之后显得透明。因此，穿过骨组织的骨血管(avn＝动脉和腔静脉)在(7b)中更容易追踪，虽然它们在(7a)中也可见。在髓腔(KH)的中间，中央窦(ZS)及其连接处清晰可见。
具体实施方式
[0064] 1.各个组分的准备：
[0065] 提供3个容器。容器1装有由碘化的酯化油，优选碘化的酯化亚麻籽油和2-丁酮(C4H8O)及染料(VasQtec的BlueDye)构成的第一混合物。在本申请的上下文中，无论有无染料，该第一混合物都被称为“造影溶液”。容器2装有聚氨酯(PU)。容器3装有固化剂。
[0066] 2.从容器1中取出造影溶液：
[0067] 将12ml的一次性注射器(例如具有鲁尔锁c1086的Monoject注射器，Qosina)拧紧到容器1的鲁尔连接器(Needlefree Swabably Valve Female Luer to 20mm Vial Cap Polycarbonate,Value Plastic)上；将5ml空气注射到容器1中(直立压力)，使容器1旋转，将全部造影溶液抽吸到注射器中。
[0068] 3.制备由造影溶液和聚氨酯构成的第二混合物：
[0069] 将造影溶液注射到容器2(装有PU)中；取下注射器，并用鲁尔帽(Luer Cap)封闭鲁尔连接器。
[0070] 4.混合第二混合物：
[0071] 在涡旋装置上混合容器2中的第二混合物混合。用于迄今为止的实验的由造影溶液和PU构成的第二混合物(无固化剂)的粘性在20℃下为约100mPas.s。
[0072] 5.在注射器中抽吸第二混合物：
[0073] 取下鲁尔帽；将10ml空气注射到容器2中；将容器2翻转并且将第二混合物抽吸到12ml的一次性注射器中。
[0074] 6.固化剂的抽吸：
[0075] 将1ml的一次性注射器(具有鲁尔滑动c3302的1ml注射器，Qosina)拧紧到容器3上(或拧紧到固定在容器3上的鲁尔连接器上)；将0.5ml的空气注射到容器3中；抽吸全部的固化剂(1ml)。
[0076] 7.贮存/清除微气泡：
[0077] 为了使注射器中的内含物脱气，即为了除去微气泡，将注射器置于直立位置至少15分钟。
[0078] 8.小鼠/大鼠的准备：
[0079] 首先，对动物进行深度麻醉或安乐死并且随后插入套管。用2×5至50ml的澄清溶液，优选用等渗压溶液，例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液进行动物体的冲洗。优选地，将动物分成两半冲洗(然后每半也单独用造影剂填充)。
[0080] 8a.)为了插入套管并冲洗身体的下半部，将套管(例如BD Neoflon 0.6x19mm，Aichele Medica AG的26G)插入到主动脉中，随后顺行地灌注澄清溶液；即远离心脏。进入主动脉的穿刺点优选地位于主动脉的胸部区域中。身体的下半部填充的迹象是心脏的膨胀：如果心脏开始膨胀，那么在右心房中切开一个切口。然后，澄清溶液在那里流出，首先与动物的被冲洗出的血液混合。一旦离开心房切口的澄清溶液澄清地流出，就能够认为身体的下半部已完全冲洗。
[0081] 8b.)为了给身体的上半部插入套管，将套管在相同的切入位置引入，最多与在步骤8a中相比沿相反的方向引入相同的套管，其中在相同的血管中，即在主动脉中，用澄清溶液以逆行的方式，即朝向心脏，进行灌注。
[0082] 9.将注射器
[0083] 9a.)固定在(手动)分配器上：将12ml注射器和1ml注射器通过各相应的第一端分别插入到2注射器分配器中(两个组合的一次性注射器11:1，M-System，Medmix Systems AG)；将适配器(Adapter L-System，Medmix Systems AG)固定到这两个注射器的相应的第二端上；将适配器固定在混合容器(混合器，ML 3.2-16-LLM，DN3.2x16，Med.LuerLock，Medmix Systems AG)上；或
[0084] 9b.)固定在注射泵上：将这两个注射器固定在注射泵上；手动调整泵的正确位置；将适配器拧紧到这两个注射器的相应的第二端上；将适配器固定在混合容器上；设置泵(注射器泵LEGATO 100，220V/50Hz，CE，kdScientific)，选择参数(模式：仅注入；注射器：
Sherwood 12ml；流率：最大1.5ml/分钟；最大体积：约3ml/小鼠，约9至10ml/大鼠)。
Sherwood 12ml；流率：最大1.5ml/分钟；最大体积：约3ml/小鼠，约9至10ml/大鼠)。
[0085] 10.注射/灌注：
[0086] 10a.)小心且均匀地，并尽可能保持均匀的流量，或
[0087] 10b.)使泵运行，流率最大1.5ml/分钟。
[0088] 填充动物体的整个下半部和/或上半部：
[0089] 现在，将套管(例如BD Neoflon 0.6x19 mm，26G，Aichele Medica AG，必要时用于冲洗的套管)固定在手动分配器(变型a)或泵(变型b)上。
[0090] 为了灌注身体的下半部，如在冲洗时那样，将造影剂通过顺行灌注从相同的注射位置起沿远离心脏的方向注射到动物体中，所述注射位置已经用于对动物进行冲洗或放血。造影剂(优选是蓝色染料)的颜色使下肢变色，可作为填充身体的下半部的指示。
[0091] 为了用造影剂填充身体的整个上半部，如在上文所描述的插套管或冲洗中那样，现在将造影剂在相同的注入位置处注射到动物体的上半部中，即通过造影剂的逆行灌注。为了保证没有造影剂流入心脏中，即为了防止左心室扩张，用线将升主动脉(Aorta ascendens)扎紧。当动物上肢，即爪以及鼻呈现造影剂的颜色时，那么能够认为动物体的上半部已被完全充满。
[0092] 为了填充小鼠或大鼠的整个身体，需要直至约10ml或直至约35ml的造影剂。
[0093] 选择性填充动物体的一个或多个器官：
[0094] 能够如上所述通过用造影剂完全填充身体的下半部来填充属于身体的下半部的所有器官。能够通过用造影剂完全填充身体的上半部来填充大脑。
[0095] 然而，心脏和/或肺的填充必须选择性地进行：为此，将套管插入到降主动脉(aorta descendens)，其中将降主动脉的远端夹住，由此仅升主动脉和心脏冠状血管被填充。然后将澄清溶液(例如PBS)仅注射到该夹住的部分中。
[0096] 肺的血管系统经由肺静脉逆行填充，所述肺静脉通入心脏的左心房中。
[0097] 与完全地填充动物体的相比，为了填充选择性的器官，例如心脏和/或肺，仅需要约0.5至1.5ml的造影剂。
[0098] 11.固化：
[0099] 在注射后，造影剂从主动脉经由动脉移置到动物体的毛细血管网和静脉系统中，并在该处由于聚合作用而固化。造影剂应固化至少20至30分钟。随后，优选用2％的多聚甲醛溶液对具有固化的造影剂的动物体部分进行化学固定，然后可以在0至8℃下贮存数月。
[0100] 12.借助于Micro-CT扫描的图像分析：
[0101] 在固化状态下进行动物体的成像方法或借助Micro-CT装置的扫描。在扫描期间中，身体不允许主动/被动移动，因为这可能会导致对测绘的干扰。为了防止最小的移动，在扫描期间应将动物体机械固定。
[0102] 针对在附图中示出的图像利用“台式Micro-CT”装置(SkyScan 1172或1272，Bruker，MicroCT，Kontich，Belgium)对测试对象进行扫描。
[0103] 13.贮存：
[0104] 在实施CT扫描后，能够将动物体再次贮存在0至8℃下的2％的多聚甲醛溶液中。
[0105] 14.组织学：
[0106] 随后能够进行动物体部分或器官的组织学检查。为此，可以使用经典的石蜡包埋、经典的组织切片技术、染料以及免疫组织化学。
[0107] 在此，固化的造影剂保留在血管内并且清晰可见，即使在组织学切片之后也是如此。造影剂的自发荧光允许将组织学切片与Micro-CT数据集的相应虚拟切片直接进行比较。
[0108] 15.评估(Micro-CT数据集的定量和定性分析)：
[0109] Micro-CT投影可以在扫描后向后重建投影，例如利用NRecon软件(NReconServer64bit，Bruker，MicroCT，Kontich，Belgium)，借助CTVox软件(Bruker，MicroCT，Kontich，Belgium)进行“体绘制”，并且借助于CTAn软件(Bruker，MicroCT，Kontich，Belgium)三维可视化。组织和血管能够利用CTAn软件(Bruker，MicroCT，Kontich，Belgium)或其他公共可用软件，例如Matlab(The MathWorks,Inc.,Natick,MA,USA)或ImageJ(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health),Bethesda,Maryland,USA,http://imagej.nih.gov/ij/,1997-2016)分割和分析。
[0110] 混合测试：
[0111] 在寻找造影剂的最佳组成时，测试碘化的酯化亚麻籽油与2-丁酮和PU的不同比例。在此，使用优选PU与固化剂的为100重量％:16重量％的恒定比例。另外，分别使用粉末形式的0.2g(或一撮)的蓝色染料。
[0112] 混合测试如下进行：
[0113] 每种组分都是单独提供的。利用超声浴(ultrasound bath)在玻璃容器中将聚氨酯(PU)与丁酮、碘化的酯化亚麻籽油和染料混合。随后，添加固化剂，并同样在超声浴中混合约30秒。然后将装有混合物的玻璃容器放置在真空室中并等待直至在表面上形成小气泡(约40秒)。随后，用混合物填充注射器并将混合物注射到待检查的对象中(灌注)。
[0114] 为了确定黏度，将混合物进行“跌落测试(drop fall test)”。每分钟将0.1ml的混合物施加到一张纸上，所述纸保持在竖直位置中。混合物穿过纸。为了测量黏度，观察混合物在特定的时间点所经过的距离。将Venflon静脉导管安装在注射器上，以模拟对身体的灌注。在黏度测试后，将具有聚合的混合物的静脉导管从注射器中取出。在Micro-CT装置中检查所有的静脉导管的不同混合物的吸收。
[0115]
[0116]
[0117] 关于聚合，除了三种测试的组合物以外，其他均适合灌注。确定10分钟为最短灌注时间。样品1a至1c、2、6至9满足该前提条件。
[0118] 测试表明，应使用至少2ml 2-丁酮(对于5g的PU和0.8ml的固化剂)。低于该值，聚合发生得太快从而不允许进行完全灌注。
[0119] 碘化的酯化油的量也影响聚合时间。样品8和9示出比其他样品更快的聚合。因此，看起来似乎在PU、固化剂和2-丁酮的体积不变的情况下，8ml的油对应于最大合适的浓度。
[0120] 样品6至9示出在聚合完成后油和染料的沉淀，这可能导致造影剂扩散到周围组织中，并可能降低图像质量。
[0121] 样品8和9具有高浓度的碘化油从而也具有高的吸收(可能类似于骨组织)。为了减少伪影，这需要使用铝过滤器进行扫描，从而导致更长的扫描时间。但是，高的吸收也可能正面地影响毛细血管识别，然而，也可能导致毛细血管像素过饱和，这会减小部分体积效应并可能允许更大的像素尺寸(在实验中，分别使用0.8μm的各向同性的像素大小)。
[0122] 使用碘化的酯化罂粟籽油代替碘化的酯化亚麻籽油示出良好的灌注，但在血管造影中的对比度更差，这可能归因于碘份额较低。使用丙酮代替丁酮作为溶剂示出与丁酮相似的效果，该效果也可预期来自其他酮(例如如二乙基酮)。还可以考虑使用二氯甲烷作为替代溶剂。
[0123] 在下表中，以下测量值将浓度表达为重量百分比：3.5ml碘化的酯化亚麻籽油，重4.8g。0.8ml的固化剂，重0.8g。2ml的丁酮重1.5g。所使用的PU的密度为约1.05g/cm3：
[0124]
[0125]
[0126] 优化测试：
[0127] 在混合测试后，造影剂混合物继续被优化。在当前的上述用于将造影剂注射到待检查的身体或待检查的器官中的方法中，分固化剂或第三容器的内含物肯定仅在注射时或者仅在注射前一刻才与剩余的造影剂组分混合。为此，使用双注射器。这预先确定了固化剂和剩余(第二)混合物之间的体积比为1:11。由此总是存在固化剂过量，因此固化剂占总量的量不应限定。在混合测试中，尚未使用双注射器从而使用限定量的0.8ml的固化剂。
[0128] PU与固化剂的体积比的优选的范围是100:16至100:19。然而，这也可以变化的并且基本上不影响造影剂的质量。
[0129] 在优化测试时，在造影溶液中(在可选的染料由于其量少而被忽略时)发现碘化的酯化亚麻籽油与2-丁酮的体积比为54％/46％是最佳的(变型2、5、6)。然而，碘化的酯化亚麻籽油与2-丁酮的体积比为53％/47％(变型1)或56％/44％(变型3)，甚至是58％/42％(变型4)在灌注过程中也示出良好的结果，并且随后在成像中示出良好的对比度。因此，可以限定碘化的酯化油的体积与酮的体积之比的优选范围，即0.75至4，优选1至1.5，特别是1.1至1.3。
[0130] 碘化的酯化油影响对比度。丁酮用作为稀释剂。为了获得所需的更高的对比度，按比例更多地将碘化的酯化油添加到混合物中，相应地，为了获得更低的对比度，按比例更小地将碘化的酯化油添加到混合物中。在油量相对过大时会引起由于过饱和而使油离开溶液并且引起过高的黏度，这阻碍或阻止灌注。
[0131] 因为在多个容器清空时并且在组分混合时以及在造影剂的注射时，在容器中以及在混合管和注射器中，残留体积分别保留在壁上或容器底上，所以在碘化的酯化亚麻籽油与2-丁酮的最佳比例保持不变的情况下(变型2的54％/46％)，将优化测试中的组分的体积优化至容器的最大填充量(选项5、6)。因此，容器的实际填充量当然要根据待检查的对象分别调整为相应的容器体积或根据填充量进行调整。
[0132] 造影剂成分的变型：
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142] 黏度：
[0143]组分 黏度([mPa s/20℃]
碘化的酯化亚麻籽油 85
2-丁酮 0.4
PU 6500
固化剂 290
碘化的酯化亚麻籽油 85
2-丁酮 0.4
PU 6500
固化剂 290
[0144] 第二混合物(即由造影溶液和PU(或尚不具有固化剂的造影剂)构成的混合物)在20℃下的黏度为约100mPa·s。
[0145] 参考文献
[0146] Zagorchev,L.et al.,Micro computed tomography for vascular exploration,Journal of Angiogenesis Research 2010,2:7
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[0148] Krucker et al.,New Polyurethane-Based Material for Vascular Corrosion Casting with Improved Physical and Imaging Characteristics.Res.Tech.69:138-147(2006)
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[0152] Schaad,L.,et al.,Correlative Imaging of the Murine Hind Limb Vasculature and Muscle Tissue by MicroCT and Light Microscopy,Scientific Reports,7:41842(2017),doi:10.1038/srep4184
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