寡核苷酸探针及其用途
阅读：889发布：2021-10-01
专利汇可以提供寡核苷酸探针及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了鉴定结合目标靶标的寡核苷酸的方法和组合物。靶标包括组织、细胞、循环 生物 标志物如微囊泡，包括源自各种 疾病 的那些。寡核苷酸可以用于诊断和 治疗 应用中。，下面是寡核苷酸探针及其用途专利的具体信息内容。
1.一种寡核苷酸，其包含对应于以下的区域：a)如实施例19-31任一中所述的可变序
列；b)如表20-23、25、27、38-40或45任一中所述的可变序列；或c)SEQ ID NO.1-206506任一中所列的序列。
2.一种寡核苷酸，其包含对应于根据权利要求1的可变序列的区域且还含有具有序列
5’-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4)的5’区域、具有序列5’-CTGTCTCTTATACACATCTG
ACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5)的3’区域或者两者。
3.一种寡核苷酸，其包含与根据任何前述权利要求的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、
70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的核酸序列或其部分。
4.多个寡核苷酸，其包含根据权利要求3的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、
200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、
10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000个或至少100000个不同的寡核苷酸序列。
5.根据任何前述权利要求的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或多个寡核
苷酸包含DNA、RNA、2’-O-甲基或硫代磷酸酯骨架，或其任何组合。
6.根据任何前述权利要求的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或多个寡核
苷酸包含DNA、RNA、PNA、LNA、UNA及其任意组合中的至少一种。
7.根据任何前述权利要求的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或所述多个
寡核苷酸的至少一个成员包含选自DNA、RNA、生物素化、非天然存在的核苷酸、删除、插入、添加和化学修饰的至少一个功能性修饰。
8.根据权利要求7的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述化学修饰包括C18、聚乙二醇
(PEG)、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12和地高辛中的至少一种。
9.根据任何前述权利要求的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或多个寡核
苷酸是标记的。
10.根据任何前述权利要求的寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或多个寡
核苷酸连接于纳米颗粒、脂质体、金、磁性标记、荧光标记、发光颗粒或放射性标记。
11.一种富集包含多个寡核苷酸的寡核苷酸文库的方法，该方法包括：
(a)进行至少一轮正向选择，其中所述正向选择包括：
(i)使至少一个样品与所述多个寡核苷酸接触，其中所述至少一个样品包含组织；和
(ii)回收与所述至少一个样品相关的所述多个寡核苷酸的成员；
(b)任选地进行至少一轮负向选择，其中所述负向选择包括：
(i)使至少一个另外的样品与所述多个寡核苷酸接触，其中所述至少一个另外的样品
包含组织；
(ii)回收与所述至少一个另外的样品不相关的所述多个寡核苷酸的成员；和
(c)扩增在步骤(a)(ii)和步骤(b)(ii)的至少之一中回收的所述多个寡核苷酸的成
员，从而富集所述寡核苷酸文库。
12.根据权利要求11的方法，其中在步骤(a)(ii)中所述回收的多个寡核苷酸的成员用
作步骤(a)(i)的下一循环的输入。
13.根据权利要求11或12的方法，其中在步骤(b)(ii)中所述回收的多个寡核苷酸的成
员用作步骤(a)(i)的下一循环的输入。
14.根据权利要求11-13任一项的方法，其中未富集的寡核苷酸文库包含至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、
5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、
90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、
1015、1016、1017个或至少1018个不同的寡核苷酸序列。
15.根据权利要求11-14任一项的方法，其中未富集的寡核苷酸文库包含原始F-Trin文
库。
16.根据权利要求11-15任一项的方法，其中所述至少一个样品和/或所述至少一个另
外的样品包含固定的组织。
17.根据权利要求16的方法，其中所述固定的组织包含福尔马林固定的石蜡包埋的
(FFPE)组织。
18.根据权利要求17的方法，其中所述FFPE组织包含固定的组织、未染色的载玻片、骨
髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一
种。
19.根据权利要求18的方法，其中所述FFPE组织在基质上固定。
20.根据权利要求19的方法，其中所述基质是载玻片或膜。
21.根据权利要求19或20的方法，其中所述至少一个样品和/或所述至少一个另外的样
品在不同的基质上固定。
22.根据权利要求19或20的方法，其中所述至少一个样品和/或所述至少一个另外的样
品在单一基质上固定。
23.根据权利要求11-22任一项的方法，其中所述至少一个样品和/或所述至少一个另
外的样品被裂解、从基质刮除或进行显微解剖。
24.根据权利要求23的方法，其中所述裂解的样品排列在基质上，任选地其中所述基质
包含膜。
25.根据权利要求11-23任一项的方法，其中所述至少一个样品和所述至少一个另外的
样品在目标表型上不同。
26.根据权利要求25的方法，其中所述至少一个样品和所述至少一个另外的样品来自
相同基质的不同区段。
27.根据权利要求26的方法，其中所述至少一个样品和所述至少一个另外的样品从所
述相同的基质刮除或显微解剖。
28.根据权利要求25-27任一项的方法，其中所述表型包括组织、解剖起源、医学病症、
疾病、障碍或其任意组合。
29.根据权利要求28的方法，其中所述组织包括肌肉、上皮、结缔和神经组织，或其任意
组合。
30.根据权利要求28的方法，其中所述解剖起源包括胃、肝、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、鼻、支气管、肾、膀胱、尿道、垂体腺、松果腺、肾上腺、甲状腺、胰腺、甲状旁腺、前列腺、心脏、血管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、皮肤、舌、鼻子、眼、耳朵、牙齿、子宫、阴道、睾丸、阴茎、卵巢、乳房、乳腺、脑、脊髓、神经、骨、韧带、肌腱或其任意组合。
31.根据权利要求11-30任一项的方法，进一步包括确定所述寡核苷酸文库的富集成员
的靶标。
32.一种表征样品中的表型的方法，包括：
(a)使所述样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触；和
(b)鉴定在所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与所述样品之间形成的复合物的存
在或水平，其中所述存在或水平用于表征所述表型。
33.一种可视化样品的方法，包括：
(a)使所述样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触；
(b)除去不结合所述样品的所述至少一个寡核苷酸或所述多个寡核苷酸的成员；和
(c)可视化与所述样品结合的所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸，其中任选地所
述可视化用于表征表型。
34.根据权利要求32或33的方法，其中所述样品包含组织样品、体液、细胞、细胞培养
物、微囊泡或其任意组合。
35.根据权利要求34的方法，其中所述组织样品包含固定的组织。
36.根据权利要求35的方法，其中所述固定的组织包含福尔马林固定的石蜡包埋的
(FFPE)组织。
37.根据权利要求36的方法，其中所述FFPE组织包含固定的组织、未染色的载玻片、骨
髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一
种。
38.根据权利要求32或34-37任一项的方法，其中所述鉴定包括测序、扩增、杂交、凝胶
电泳、色谱或可视化。
39.根据权利要求38的方法，其中所述杂交包括使所述样品与配置为与至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸杂交的至少一个标记的探针接触。
40.根据权利要求39的方法，其中所述至少一个标记的探针直接或间接地连接于标记。
41.根据权利要求40的方法，其中所述标记包含荧光、放射性或磁性标记。
42.根据权利要求38的方法，其中所述测序包括所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷
酸的下一代测序、染料终止测序和/或焦磷酸测序。
43.根据权利要求33或38的方法，其中所述可视化包括与所述至少一个寡核苷酸或多
个寡核苷酸直接或间接地关联的信号的可视化。
44.根据权利要求43的方法，其中所述信号包括荧光信号或酶信号。
45.根据权利要求43的方法，其中所述酶信号通过荧光素酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧
光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶
(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶中的至少一种产生。
46.根据权利要求33、38或43-45任一项的方法，其中所述可视化包括使用光学显微术
或荧光显微术。
47.根据权利要求32-46任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中
至少之一的所述靶标是已知的。
48.根据权利要求32-46任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中
至少之一的所述靶标是未知的。
49.根据权利要求32-48任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸是
根据权利要求1-10任一项所述的。
50.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、
99或100％同源的序列或其部分的核酸。
51.根据权利要求50的方法，其中所述表型包括肺癌或前列腺癌。
52.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
53.根据权利要求52的方法，其中所述表型包括前列腺癌。
54.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
55.根据权利要求54的方法，其中所述表型包括HER2状态(+/-)。
56.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、
20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、
3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、
80000、90000、100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
57.根据权利要求56的方法，其中所述表型包括对于抗-HER2疗法的反应，其中任选地
所述抗-HER2疗法包含曲妥珠单抗。
58.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、
15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
59.根据权利要求58的方法，其中所述表型包括对于FOLFOX和贝伐单抗中的至少一种
的反应。
60.根据权利要求32-49任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
61.根据权利要求60的方法，其中所述表型包括组织起源，其中任选地所述组织包括乳
房、结肠、肾、肺或胰腺组织。
62.根据权利要求25-49任一项的方法，其中所述表型包括生物标志物状态。
63.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物选自表4。
64.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括HER2阳性、HER2阴性、EGFR
阳性、EGFR阴性、TUBB3阳性或TUBB3阴性中的至少一种。
65.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/
Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1(22c3)、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS和TUBB3的至少一种的表达、拷贝数、突变、插入、删除或其它改变。
66.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括EGFR vIII或MET外显子14
跳读的至少一种的存在或不存在。
67.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、
NTRK3、RET、ROS1和RSPO3的至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。
68.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括ABL2、ACSL3、ACSL6、AFF1、
AFF3、AFF4、AKAP9、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、APC、ARFRP1、ARHGAP26、ARHGEF12、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATR、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL10、BCL11A、BCL2L11、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、C11orf30(EMSY)、C2orf44、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASC5、CASP8、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274(PDL1)、CD74、CD79A、CDC73、CDH11、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDX2、CHEK1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CIITA、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBP、CNTRL、COPB1、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRKL、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CYLD、CYP2D6、DAXX、DDR2、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DOT1L、EBF1、ECT2L、EGFR、ELK4、ELL、EML4、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHB1、EPS15、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETV1、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCG、FANCL、FAS、FBXO11、FBXW7、FCRL4、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXO1、FOXP1、FUBP1、FUS、GAS7、GATA3、GID4(C17orf39)、GMPS、GNA13、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPHN、GPR124、GRIN2A、GSK3B、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HGF、HIP1、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HSP90AA1、HSP90AB1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、KDM5A、KDR(VEGFR2)、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLHL6、KMT2A(MLL)、KMT2C
(MLL3)、KMT2D(MLL2)、KRAS、KTN1、LCK、LCP1、LGR5、LHFP、LIFR、LPP、LRIG3、LRP1B、LYL1、MAF、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MDS2、MEF2B、MEN1、MET(cMET)、MITF、MLF1、MLH1(NGS)、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MNX1、MRE11A、MSH2(NGS)、MSH6(NGS)、MSI2、MTOR、MYB、MYC、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、NACA、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIA、NIN、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP214、NUP93、NUP98、NUTM1、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDCD1(PD1)、PDCD1LG2(PDL2)、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PER1、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PML、PMS2(NGS)、POLE、POT1、POU2AF1、PPARG、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRKAR1A、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN(NGS)、PTPN11、PTPRC、RABEP1、RAC1、RAD50、RAD51、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、REL、RET、RICTOR、RMI2、RNF43、ROS1、RPL22、RPL5、RPN1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SH3GL1、SLC34A2、SMAD2、SMAD4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SNX29、SOX10、SPECC1、SPEN、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、STAT3、STAT4、STAT5B、STIL、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TCF12、TCF3、TCF7L2、TET1、TET2、TFEB、TFG、TFRC、TGFBR2、TLX1、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF7、TRIM26、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VEGFA、VEGFB、VTI1A、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZMYM2、ZNF217、ZNF331、ZNF384、ZNF521和ZNF703的至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。
69.根据权利要求62的方法，其中所述生物标志物状态包括ABI1、ABL1、ACKR3、AKT1、
AMER1(FAM123B)、AR、ARAF、ATP2B3、ATRX、BCL11B、BCL2、BCL2L2、BCOR、BCORL1、BRD3、BRD4、BTG1、BTK、C15orf65、CBLC、CD79B、CDH1、CDK12、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHCHD7、CNOT3、COL1A1、COX6C、CRLF2、DDB2、DDIT3、DNM2、DNMT3A、EIF4A2、ELF4、ELN、ERCC1(NGS)、ETV4、FAM46C、FANCF、FEV、FOXL2、FOXO3、FOXO4、FSTL3、GATA1、GATA2、GNA11、GPC3、HEY1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLF、HMGN2P46、HNF1A、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IKBKE、INHBA、IRS2、JUN、KAT6A(MYST3)、KAT6B、KCNJ5、KDM5C、KDM6A、KDSR、KLF4、KLK2、LASP1、LMO1、LMO2、MAFB、MAX、MECOM、MED12、MKL1、MLLT11、MN1、MPL、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYCL(MYCL1)、NBN、NDRG1、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NRAS、NUMA1、NUTM2B、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PAK3、PATZ1、PAX8、PDE4DIP、PHF6、PHOX2B、PIK3CG、PLAG1、PMS1、POU5F1、PPP2R1A、PRF1、PRKDC、RAD21、RECQL4、RHOH、RNF213、RPL10、SEPT5、SEPT6、SFPQ、SLC45A3、SMARCA4、SOCS1、SOX2、SPOP、SRC、SSX1、STAG2、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TCEA1、TCL1A、TERT、TFE3、TFPT、THRAP3、TLX3、TMPRSS2、UBR5、VHL、WAS、ZBTB16和ZRSR2的至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。
70.根据权利要求32-69任一项的方法，其中所述表型包括疾病或障碍。
71.根据权利要求70的方法，其中所述表征包括所述疾病或障碍的诊断、预后和/或治
疗诊断。
72.根据权利要求71的方法，其中所述治疗诊断包括预测疗功效或治疗功效的缺乏，将
患者分类为治疗的响应者或非响应者，或者监测治疗功效。
73.根据权利要求72的方法，其中所述治疗包括化疗、免疫疗法、靶向癌症治疗、单克隆
抗体、抗-HER2抗体、曲妥珠单抗、抗-VEGF抗体、贝伐单抗和/或铂/紫杉烷疗法中的至少一
种。
74.根据权利要求72的方法，其中所述治疗包括阿法替尼、阿法替尼+西妥昔单抗、阿雷
替尼、阿司匹林、阿特珠单抗、比卡鲁胺、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、色瑞替尼、西妥昔单抗、顺铂、克里唑蒂尼、达拉菲尼、达卡巴嗪、多柔比星、恩杂鲁胺、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦+依维莫司、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、激素疗法、伊立替康、拉帕替尼、脂质体-多柔比星、matinib、丝裂霉素-c、nab-紫杉醇、纳武单抗、奥拉帕尼、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼联合疗法、紫杉醇、帕博西尼、帕尼单抗、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、舒尼替尼、T-DM1、替莫唑胺多西他赛、替西罗莫司、拓扑替康、曲美替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼和威罗菲尼的至少一种。
75.根据权利要求74的方法，其中所述激素疗法包括它莫西芬、托瑞米芬、氟维司群、来
曲唑、阿那曲唑、依西美坦、醋酸甲地孕酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、阿比特龙、恩杂鲁胺、曲普瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克的一种或多种。
76.根据权利要求32-75任一项的方法，其中所述表征包括将所述存在或水平或者目视
分析与基准相比较。
77.根据权利要求76的方法，其中所述基准包括在来自没有疾病或障碍的个体或者来
自具有不同的疾病或障碍状态的个体的样品中测定的存在或水平。
78.根据权利要求76或77的方法，其中与权利要求1-10任一项的至少一个寡核苷酸或
多个寡核苷酸的基准的所述比较指示所述样品包含癌症样品或非癌症/正常样品。
79.根据权利要求34的方法，其中所述体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液
(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
80.根据权利要求32-79任一项的方法，其中所述样品来自疑似患有医学病症、疾病或
障碍或者具有其倾向性的受试者。
81.根据权利要求28或70-80任一项的方法，其中所述医学病症、疾病或障碍包括癌症、
恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。
82.根据权利要求81的方法，其中所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白
血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚
胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口部癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿
瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球
蛋白血症或肾母细胞瘤。
83.根据权利要求81的方法，其中所述恶变前状况包括巴雷特食管。
84.根据权利要求81的方法，其中所述自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病
(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
85.根据权利要求81的方法，其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰
竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
86.根据权利要求81的方法，其中所述神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病
(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-
Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。
87.根据权利要求81的方法，其中所述疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围
神经病理性疼痛。
88.根据权利要求81的方法，其中所述传染病包括细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠
普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
89.一种试剂盒，包含用于实施如权利要求11-88任一项的方法的至少一种试剂。
90.用于实施如权利要求11-88任一项的方法的至少一种试剂的用途。
91.根据权利要求89的试剂盒或根据权利要求90的用途，其中至少一种试剂包括根据
权利要求1-10任一项的寡核苷酸或多个寡核苷酸。
92.一种对至少一个细胞或组织成像的方法，包括使所述至少一个细胞或组织与根据
权利要求1-10任一项的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触，和检测与至少一个细胞或
组织接触的所述至少一个寡核苷酸或所述多个寡核苷酸。
93.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、
20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
94.根据权利要求93的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含肺或前列腺细胞。
95.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
96.根据权利要求95的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含前列腺细胞。
97.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
98.根据权利要求97的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含乳腺细胞。
99.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、
30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、
4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、
80000、90000、100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
100.根据权利要求99的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含乳腺细胞。
101.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、
30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、
4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或
100％同源的序列或其部分的核酸。
102.根据权利要求101的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含结肠直肠细胞。
103.根据权利要求92的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包含具有与
SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
104.根据权利要求103的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含乳腺、结肠、肾、肺或
胰腺细胞。
105.根据权利要求92-104任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或所述多个寡核
苷酸是根据权利要求5的。
106.根据权利要求92-105任一项的方法，其中所述至少一个寡核苷酸或所述多个寡核
苷酸在所述检测前施用于受试者。
107.根据权利要求92-106任一项的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含赘生性细
胞、恶性细胞、肿瘤细胞、增生细胞或发育异常细胞。
108.根据权利要求92-107任一项的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含淋巴瘤、
白血病、肾癌、肉瘤、血管外皮细胞瘤、黑色素瘤、腹部癌症、胃癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌细胞中的至少一种。
109.根据权利要求92-107任一项的方法，其中所述至少一个细胞或组织包含医学病
症、疾病或障碍。
110.一种药物组合物，包含治疗有效量的含有根据权利要求1-10任一项的所述至少一
个寡核苷酸或所述多个寡核苷酸的构建体或其盐，及药学上可接受的载体、稀释剂或两者。
111.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与
表28中所列的一个或多个蛋白质相关。
112.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、
99或100％同源的序列或其部分的核酸。
113.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
114.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
115.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、
20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、
3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、
80000、90000、100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
116.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、
20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、
3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
117.根据权利要求110的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸包
含与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。
118.根据权利要求110-117任一项的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或所述
多个寡核苷酸连接于毒素或化疗剂。
119.根据权利要求110-117任一项的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或所述
多个寡核苷酸包含在多部分构建体内。
120.根据权利要求110-117任一项的药物组合物，其中所述至少一个寡核苷酸或所述
多个寡核苷酸连接于脂质体或纳米颗粒。
121.根据权利要求120的药物组合物，其中所述脂质体或纳米颗粒包含毒素或化疗剂。
122.一种治疗或改善需要的受试者中的医学病症、疾病或障碍的方法，包括向所述受
试者施用根据权利要求110-121任一项的药物组合物。
123.一种在受试者中诱导细胞毒性的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求110-
121任一项的药物组合物。
124.根据权利要求122或123的方法，其中所述施用包括皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、
皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、局部施用或其任意组合中的至少一种。
125.根据从属于权利要求111的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括肺癌或前列腺癌。
126.根据从属于权利要求113的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括前列腺癌。
127.根据从属于权利要求114的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括乳腺癌。
128.根据从属于权利要求115的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括乳腺癌。
129.根据从属于权利要求116的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括结肠直肠癌。
130.根据从属于权利要求117的权利要求122-124任一项的方法，其中所述疾病或障碍
包括癌症，其中任选地所述癌症包括乳腺、结肠、肾、肺或胰腺的癌症。
131.根据权利要求109或122的方法，其中所述医学病症、疾病或障碍包括癌症、恶变前
状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。
132.根据权利要求131的方法，其中所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性
白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明
癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞
瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口部癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细
胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。
133.根据权利要求131的方法，其中所述恶变前状况包括巴雷特食管。
134.根据权利要求131的方法，其中所述自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏
病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
135.根据权利要求131的方法，其中所述心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰
竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
136.根据权利要求131的方法，其中所述神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病
(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-
Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。
137.根据权利要求131的方法，其中所述疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周
围神经病理性疼痛。
138.根据权利要求131的方法，其中所述传染病包括细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、
惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
寡核苷酸探针及其用途
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2016年3月18日提交的U.S.临时专利申请No.62/310,665；2016年10月26日提交的U.S.临时专利申请No.62/413,361；2016年11月10日提交的U.S.临时专利申请
No.62/420,497；2016年12月9日提交的U.S.临时专利申请No.62/432,561；2017年2月10日
提交的U.S.临时专利申请No.62/457,691；和2017年3月17日提交的U.S.临时专利申请
No.62/472,953的利益，其全部通过引用全文并入本文中。
No.62/420,497；2016年12月9日提交的U.S.临时专利申请No.62/432,561；2017年2月10日
提交的U.S.临时专利申请No.62/457,691；和2017年3月17日提交的U.S.临时专利申请
No.62/472,953的利益，其全部通过引用全文并入本文中。
[0004] 按照MPEP§1730 II.B.2(a)批准和提示的，以下通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交的序列表的完整内容以其整体按引用并入本文中用于全部目的。序列表在如下确定的电
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背景技术
[0009] 寡核苷酸探针或适体是可以通过经典的Watson-Crick碱基配对以外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力的寡聚的核酸分子。除非另外指明，作为本文中使用的术语
“适体”可以指可以与靶标结合的核酸分子，无论靶标识别的方式。除非另外指明，术语“适体”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸探针”等等可以在本文中互换使用。
“适体”可以指可以与靶标结合的核酸分子，无论靶标识别的方式。除非另外指明，术语“适体”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸探针”等等可以在本文中互换使用。
[0010] 寡核苷酸探针，像通过噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体(“mAb”)一样，能够特异性地结合选定的靶标并调节靶标的活性，例如，通过结合，适体可以阻断其靶标发挥功能的
能力。通过体外选择方法从随机序列寡核苷酸集合产生的，已经产生了针对包括生长因子、
转录因子、酶、免疫球蛋白和受体的多种蛋白质的适体。典型的适体大小为10-15kDa(30-45
个核苷酸)，以亚纳摩尔的亲和力结合其靶标，并且区别密切相关的靶标(例如，适体可以设
计为不结合来自相同基因家族的其他蛋白质)。一系列的结构研究已经表明适体能够使用
驱动在抗体-抗原复合物中的亲和力和特异性的相同结合相互作用类型(例如，氢键键合、
静电互补、疏水性接触、空间排阻)。
能力。通过体外选择方法从随机序列寡核苷酸集合产生的，已经产生了针对包括生长因子、
转录因子、酶、免疫球蛋白和受体的多种蛋白质的适体。典型的适体大小为10-15kDa(30-45
个核苷酸)，以亚纳摩尔的亲和力结合其靶标，并且区别密切相关的靶标(例如，适体可以设
计为不结合来自相同基因家族的其他蛋白质)。一系列的结构研究已经表明适体能够使用
驱动在抗体-抗原复合物中的亲和力和特异性的相同结合相互作用类型(例如，氢键键合、
静电互补、疏水性接触、空间排阻)。
[0011] 我们之前已经鉴定了可用于检测体液样品中的微囊泡的寡核苷酸和寡核苷酸文库。微囊泡可以由患病细胞如癌细胞脱落到各种体液如血液中。因此提供了一种液体活检
的手段，包括但不限于基于血液的诊断。在一些情况中，组织样品是可用的。本发明提供针
对目标组织富集寡核苷酸文库的方法。本发明的应用包括但不限于治疗诊断(例如，预测药
物反应)和诊断(例如，检测癌症样品)。由于本发明的方法提供特异性地识别患病细胞的适
体，适体本身可以用于治疗应用中。
的手段，包括但不限于基于血液的诊断。在一些情况中，组织样品是可用的。本发明提供针
对目标组织富集寡核苷酸文库的方法。本发明的应用包括但不限于治疗诊断(例如，预测药
物反应)和诊断(例如，检测癌症样品)。由于本发明的方法提供特异性地识别患病细胞的适
体，适体本身可以用于治疗应用中。
[0012] 通过引用并入
发明内容
[0014] 本发明的组合物和方法提供识别具有目标表型的组织的寡核苷酸探针。在各种实施方式中，本发明的寡核苷酸探针用于诊断、预后或治疗诊断方法中以表征该样品的表型。
诊断可以涉及癌症。在其它实施方式中，本发明的寡核苷酸探针被化学修饰或包含在药物
组合物中用于治疗应用。
诊断可以涉及癌症。在其它实施方式中，本发明的寡核苷酸探针被化学修饰或包含在药物
组合物中用于治疗应用。
[0015] 在一个方面，本发明提供包含对应于以下的区域的寡核苷酸：a)如实施例19-31任一中所述的可变序列；b)如表20-23、25、27、38-40或45任一中所述的可变序列；或c)SEQ ID NO.1-206506任一中所列的序列。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含具有序列5’-
CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4)的5’区域、具有序列5’-CTGTCTCTTATACACATCTGACG
CTGCCGACGA(SEQ ID NO.5)的3’区域或者两者。本发明还提供包含与这样的寡核苷酸序列
至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供包含如上所述的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、
150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000个或至少100000个不同的寡核苷酸序列的多个寡核苷酸。
CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4)的5’区域、具有序列5’-CTGTCTCTTATACACATCTGACG
CTGCCGACGA(SEQ ID NO.5)的3’区域或者两者。本发明还提供包含与这样的寡核苷酸序列
至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供包含如上所述的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、
150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000个或至少100000个不同的寡核苷酸序列的多个寡核苷酸。
[0016] 在一个实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸包含DNA、RNA、2’-O-甲基或硫代磷酸酯骨架，或其任意组合。在一些实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸包含DNA、RNA、PNA、LNA、UNA及其任意组合中的至少一种。寡核苷酸或多个寡核苷酸的至少一个成员可以具有
选自DNA、RNA、生物素化、非天然存在的核苷酸、删除、插入、添加和化学修饰的至少一个功能性修饰。在一些实施方式中，化学修饰包括C18、聚乙二醇(PEG)、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12和地高辛中的至少一种。
选自DNA、RNA、生物素化、非天然存在的核苷酸、删除、插入、添加和化学修饰的至少一个功能性修饰。在一些实施方式中，化学修饰包括C18、聚乙二醇(PEG)、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12和地高辛中的至少一种。
[0018] 在一个方面，本发明提供一种使用多轮正向选择和负向选择富集寡核苷酸文库的方法。富集多个寡核苷酸的方法可以包括：a)进行至少一轮正向选择，其中所述正向选择包
括：i)使至少一个样品与多个寡核苷酸接触，其中所述至少一个样品包含组织；和ii)回收
与该至少一个样品相关的多个寡核苷酸的成员；b)任选地进行至少一轮负向选择，其中所
述负向选择包括：i)使至少一个另外的样品与多个寡核苷酸接触，其中至少一个另外的样
品包含组织；ii)回收与至少一个另外的样品不相关的多个寡核苷酸的成员；和c)扩增在步
骤(a)(ii)和步骤(b)(ii)的至少之一中回收的多个寡核苷酸的成员，从而富集寡核苷酸文
库。在一个实施方式中，在步骤(a)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下
一循环的输入。在一个实施方式中，在步骤(b)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤
(a)(i)的下一循环的输入。未富集的寡核苷酸文库可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、
150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、
200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017或至少1018个不同的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，未富集的寡核苷酸文库包含如本文
所述的原始F-Trin文库。
括：i)使至少一个样品与多个寡核苷酸接触，其中所述至少一个样品包含组织；和ii)回收
与该至少一个样品相关的多个寡核苷酸的成员；b)任选地进行至少一轮负向选择，其中所
述负向选择包括：i)使至少一个另外的样品与多个寡核苷酸接触，其中至少一个另外的样
品包含组织；ii)回收与至少一个另外的样品不相关的多个寡核苷酸的成员；和c)扩增在步
骤(a)(ii)和步骤(b)(ii)的至少之一中回收的多个寡核苷酸的成员，从而富集寡核苷酸文
库。在一个实施方式中，在步骤(a)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下
一循环的输入。在一个实施方式中，在步骤(b)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤
(a)(i)的下一循环的输入。未富集的寡核苷酸文库可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、
150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、
200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017或至少1018个不同的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，未富集的寡核苷酸文库包含如本文
所述的原始F-Trin文库。
[0019] 在本发明的富集方法的一些实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品包含固定的组织。固定的组织可以包含福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在实施
方式中，FFPE组织包含固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。FFPE组织可以在基质上固定。例
如，基质可以是载玻片或膜。
方式中，FFPE组织包含固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。FFPE组织可以在基质上固定。例
如，基质可以是载玻片或膜。
[0020] 在一些实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在不同的基质上固定。或者，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在单一基质上固定。在一些实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品被裂解、从基质刮除或进行显微解剖。裂解的样品
可以排列在基质上。在一些实施方式中，基质包含膜。例如，膜可以是硝酸纤维素膜。
可以排列在基质上。在一些实施方式中，基质包含膜。例如，膜可以是硝酸纤维素膜。
[0021] 在本发明的富集方法的各种实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在目标表型上不同。至少一个样品和/或至少一个另外的样品可以来自同一基质的不同
区段。作为非限制性的实例，样品可以包含来自固定的组织样品的癌症组织或正常邻近组
织。在这样的情况中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品可以从相同的基质刮除或显
微解剖以帮助富集。
区段。作为非限制性的实例，样品可以包含来自固定的组织样品的癌症组织或正常邻近组
织。在这样的情况中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品可以从相同的基质刮除或显
微解剖以帮助富集。
[0022] 寡核苷酸文库可以富集用于分析任何所需的表型。在实施方式中，表型包括组织、解剖学起源、医学病症、疾病、障碍或其任意组合。例如，组织可以是肌肉、上皮、结缔和神经组织或其任意组合。例如，解剖学起源可以是胃、肝、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、鼻、支气管、肾、膀胱、尿道、垂体腺、松果腺、肾上腺、甲状腺、胰腺、甲状旁腺、前列腺、心脏、血管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、皮肤、舌、鼻子、眼、耳朵、牙齿、子宫、阴道、睾丸、阴茎、卵巢、乳房、乳腺、脑、脊髓、神经、骨、韧带、肌腱或其任意组合。
[0023] 在本发明的富集方法的各种实施方式中，方法进一步包括确定寡核苷酸文库的富集成员的靶标。本文提供了用于这种确定的技术。
[0024] 在一个方面，本发明提供一种表征样品中的表型的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触；和b)鉴定在至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品之
间形成的复合物的存在或水平，其中所述存在或水平用于表征所述表型。在相关的方面，本
发明提供一种可视化样品的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接
触；b)除去不结合样品的该至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的成员；和c)可视化与样品
结合的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。可视化可以用于表征表型。
间形成的复合物的存在或水平，其中所述存在或水平用于表征所述表型。在相关的方面，本
发明提供一种可视化样品的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接
触；b)除去不结合样品的该至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的成员；和c)可视化与样品
结合的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。可视化可以用于表征表型。
[0025] 待表征的样品可以是任何有用的样品，包括但不限于组织样品、体液、细胞、细胞培养物、微囊泡或其任意组合。在一些实施方式中，组织样品包含固定的组织。固定的组织
可以是，例如，福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在各种实施方式中，FFPE样品包含
固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
可以是，例如，福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在各种实施方式中，FFPE样品包含
固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
[0026] 鉴定存在或水平可以包括任何有用的技术，包括但不限于核酸测序、扩增、杂交、凝胶电泳、色谱或可视化。在一些实施方式中，通过杂交的鉴定包括使样品与配置为与至少
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸杂交的至少一个标记的探针接触。至少一个标记的探针可以
直接或间接地连接于标记。标记可以是，例如，荧光、放射性或磁性标记。间接标记可以是，例如，生物素。在一些实施方式中，测序包括至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的下一代测
序、染料终止测序和/或焦磷酸测序。可视化可以是与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸直
接或间接地关联的信号的可视化。信号可以是任何有用的信号，例如，荧光信号或酶信号。
在一些实施方式中，酶信号通过荧光素酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶中的至少一种产生。可视化可以
包括使用光学显微术或荧光显微术。
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸杂交的至少一个标记的探针接触。至少一个标记的探针可以
直接或间接地连接于标记。标记可以是，例如，荧光、放射性或磁性标记。间接标记可以是，例如，生物素。在一些实施方式中，测序包括至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的下一代测
序、染料终止测序和/或焦磷酸测序。可视化可以是与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸直
接或间接地关联的信号的可视化。信号可以是任何有用的信号，例如，荧光信号或酶信号。
在一些实施方式中，酶信号通过荧光素酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶中的至少一种产生。可视化可以
包括使用光学显微术或荧光显微术。
[0027] 在涉及表征或可视化样品的本发明方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标可以是已知的。例如，寡核苷酸可以结合已知的蛋白质靶标。在一些实施方
式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标是未知的。例如，至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸本身可以提供生物印记或其它有用的结果，其不是必然需要了解被一
些或所有寡核苷酸结合的抗原。
式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标是未知的。例如，至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸本身可以提供生物印记或其它有用的结果，其不是必然需要了解被一
些或所有寡核苷酸结合的抗原。
[0028] 在表征或可视化样品的方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以如上提供。至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以使用本文提供的本发明的富集方法确定。
[0029] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含可具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，肺癌或前列腺癌。
[0030] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，前列腺癌。
[0031] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，HER2状态(+/-)。
[0032] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对抗-HER2疗法的反应，其中任选地抗-HER2疗法包含曲妥珠单抗(traztuzamab)。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对抗-HER2疗法的反应，其中任选地抗-HER2疗法包含曲妥珠单抗(traztuzamab)。
[0033] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对FOLFOX和贝伐单抗中的至少
一种的反应。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对FOLFOX和贝伐单抗中的至少
一种的反应。
[0034] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，组织性质，包括但不限于是否组织包括乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，组织性质，包括但不限于是否组织包括乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。
[0035] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明的方法中，表型可以是生物标志物状态。在一些实施方式中，生物标志物选自表4。在一些实施方式中，生物标志物状态包括HER2阳性、HER2阴性、EGFR阳性、EGFR阴性、TUBB3阳性或TUBB3阴性中的至少一
种。在一些实施方式中，生物标志物状态包括ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1(22c3)、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS和TUBB3中至少一种的表达、拷贝数、突变、插入、删除或其它改变。在各种实施方式中，生物标志物状态包括EGFR vIII或MET外显子14跳读中至少一种的存在或不存
在。在实施方式中，生物标志物状态包括ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1和RSPO3中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。在实施方式中，生物标志物状态包括ABL2、ACSL3、ACSL6、AFF1、AFF3、AFF4、AKAP9、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、APC、ARFRP1、ARHGAP26、ARHGEF12、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATR、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL10、BCL11A、BCL2L11、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、C11orf30(EMSY)、C2orf44、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASC5、CASP8、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274(PDL1)、CD74、CD79A、CDC73、CDH11、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDX2、CHEK1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CIITA、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBP、CNTRL、COPB1、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRKL、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CYLD、CYP2D6、DAXX、DDR2、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DOT1L、EBF1、ECT2L、EGFR、ELK4、ELL、EML4、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHB1、EPS15、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETV1、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCG、FANCL、FAS、FBXO11、FBXW7、FCRL4、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXO1、FOXP1、FUBP1、FUS、GAS7、GATA3、GID4(C17orf39)、GMPS、GNA13、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPHN、GPR124、GRIN2A、GSK3B、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HGF、HIP1、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HSP90AA1、HSP90AB1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、KDM5A、KDR(VEGFR2)、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLHL6、KMT2A(MLL)、KMT2C(MLL3)、KMT2D(MLL2)、KRAS、KTN1、LCK、LCP1、LGR5、LHFP、LIFR、LPP、LRIG3、LRP1B、LYL1、MAF、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MDS2、MEF2B、MEN1、MET(cMET)、MITF、MLF1、MLH1(NGS)、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MNX1、MRE11A、MSH2(NGS)、MSH6(NGS)、MSI2、MTOR、MYB、MYC、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、NACA、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIA、NIN、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP214、NUP93、NUP98、NUTM1、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDCD1(PD1)、PDCD1LG2(PDL2)、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PER1、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PML、PMS2(NGS)、POLE、POT1、POU2AF1、PPARG、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRKAR1A、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN(NGS)、PTPN11、PTPRC、RABEP1、RAC1、RAD50、RAD51、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、REL、RET、RICTOR、RMI2、RNF43、ROS1、RPL22、RPL5、RPN1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SH3GL1、SLC34A2、SMAD2、SMAD4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SNX29、SOX10、SPECC1、SPEN、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、STAT3、STAT4、STAT5B、STIL、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TCF12、TCF3、TCF7L2、TET1、TET2、TFEB、TFG、TFRC、TGFBR2、TLX1、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF7、TRIM26、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VEGFA、VEGFB、VTI1A、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZMYM2、ZNF217、ZNF331、ZNF384、ZNF521和ZNF703中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物状态可以包括ABI1、ABL1、ACKR3、AKT1、AMER1(FAM123B)、AR、ARAF、ATP2B3、ATRX、BCL11B、BCL2、BCL2L2、BCOR、BCORL1、BRD3、BRD4、BTG1、BTK、C15orf65、CBLC、CD79B、CDH1、CDK12、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHCHD7、CNOT3、COL1A1、COX6C、CRLF2、DDB2、DDIT3、DNM2、DNMT3A、EIF4A2、ELF4、ELN、ERCC1(NGS)、ETV4、FAM46C、FANCF、FEV、FOXL2、FOXO3、FOXO4、FSTL3、GATA1、GATA2、GNA11、GPC3、HEY1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLF、HMGN2P46、HNF1A、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IKBKE、INHBA、IRS2、JUN、KAT6A(MYST3)、KAT6B、KCNJ5、KDM5C、KDM6A、KDSR、KLF4、KLK2、LASP1、LMO1、LMO2、MAFB、MAX、MECOM、MED12、MKL1、MLLT11、MN1、MPL、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYCL(MYCL1)、NBN、NDRG1、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NRAS、NUMA1、NUTM2B、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PAK3、PATZ1、PAX8、PDE4DIP、PHF6、PHOX2B、PIK3CG、PLAG1、PMS1、POU5F1、PPP2R1A、PRF1、PRKDC、RAD21、RECQL4、RHOH、RNF213、RPL10、SEPT5、SEPT6、SFPQ、SLC45A3、SMARCA4、SOCS1、SOX2、SPOP、SRC、SSX1、STAG2、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TCEA1、TCL1A、TERT、TFE3、TFPT、THRAP3、TLX3、TMPRSS2、UBR5、VHL、WAS、ZBTB16和ZRSR2中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。
种。在一些实施方式中，生物标志物状态包括ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1(22c3)、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS和TUBB3中至少一种的表达、拷贝数、突变、插入、删除或其它改变。在各种实施方式中，生物标志物状态包括EGFR vIII或MET外显子14跳读中至少一种的存在或不存
在。在实施方式中，生物标志物状态包括ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1和RSPO3中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。在实施方式中，生物标志物状态包括ABL2、ACSL3、ACSL6、AFF1、AFF3、AFF4、AKAP9、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、APC、ARFRP1、ARHGAP26、ARHGEF12、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATR、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL10、BCL11A、BCL2L11、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、C11orf30(EMSY)、C2orf44、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASC5、CASP8、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274(PDL1)、CD74、CD79A、CDC73、CDH11、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDX2、CHEK1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CIITA、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBP、CNTRL、COPB1、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRKL、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CYLD、CYP2D6、DAXX、DDR2、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DOT1L、EBF1、ECT2L、EGFR、ELK4、ELL、EML4、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHB1、EPS15、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETV1、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCG、FANCL、FAS、FBXO11、FBXW7、FCRL4、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXO1、FOXP1、FUBP1、FUS、GAS7、GATA3、GID4(C17orf39)、GMPS、GNA13、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPHN、GPR124、GRIN2A、GSK3B、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HGF、HIP1、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HSP90AA1、HSP90AB1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、KDM5A、KDR(VEGFR2)、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLHL6、KMT2A(MLL)、KMT2C(MLL3)、KMT2D(MLL2)、KRAS、KTN1、LCK、LCP1、LGR5、LHFP、LIFR、LPP、LRIG3、LRP1B、LYL1、MAF、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MDS2、MEF2B、MEN1、MET(cMET)、MITF、MLF1、MLH1(NGS)、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MNX1、MRE11A、MSH2(NGS)、MSH6(NGS)、MSI2、MTOR、MYB、MYC、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、NACA、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIA、NIN、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP214、NUP93、NUP98、NUTM1、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDCD1(PD1)、PDCD1LG2(PDL2)、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PER1、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PML、PMS2(NGS)、POLE、POT1、POU2AF1、PPARG、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRKAR1A、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN(NGS)、PTPN11、PTPRC、RABEP1、RAC1、RAD50、RAD51、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、REL、RET、RICTOR、RMI2、RNF43、ROS1、RPL22、RPL5、RPN1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SH3GL1、SLC34A2、SMAD2、SMAD4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SNX29、SOX10、SPECC1、SPEN、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、STAT3、STAT4、STAT5B、STIL、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TCF12、TCF3、TCF7L2、TET1、TET2、TFEB、TFG、TFRC、TGFBR2、TLX1、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF7、TRIM26、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VEGFA、VEGFB、VTI1A、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZMYM2、ZNF217、ZNF331、ZNF384、ZNF521和ZNF703中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物状态可以包括ABI1、ABL1、ACKR3、AKT1、AMER1(FAM123B)、AR、ARAF、ATP2B3、ATRX、BCL11B、BCL2、BCL2L2、BCOR、BCORL1、BRD3、BRD4、BTG1、BTK、C15orf65、CBLC、CD79B、CDH1、CDK12、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHCHD7、CNOT3、COL1A1、COX6C、CRLF2、DDB2、DDIT3、DNM2、DNMT3A、EIF4A2、ELF4、ELN、ERCC1(NGS)、ETV4、FAM46C、FANCF、FEV、FOXL2、FOXO3、FOXO4、FSTL3、GATA1、GATA2、GNA11、GPC3、HEY1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLF、HMGN2P46、HNF1A、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IKBKE、INHBA、IRS2、JUN、KAT6A(MYST3)、KAT6B、KCNJ5、KDM5C、KDM6A、KDSR、KLF4、KLK2、LASP1、LMO1、LMO2、MAFB、MAX、MECOM、MED12、MKL1、MLLT11、MN1、MPL、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYCL(MYCL1)、NBN、NDRG1、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NRAS、NUMA1、NUTM2B、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PAK3、PATZ1、PAX8、PDE4DIP、PHF6、PHOX2B、PIK3CG、PLAG1、PMS1、POU5F1、PPP2R1A、PRF1、PRKDC、RAD21、RECQL4、RHOH、RNF213、RPL10、SEPT5、SEPT6、SFPQ、SLC45A3、SMARCA4、SOCS1、SOX2、SPOP、SRC、SSX1、STAG2、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TCEA1、TCL1A、TERT、TFE3、TFPT、THRAP3、TLX3、TMPRSS2、UBR5、VHL、WAS、ZBTB16和ZRSR2中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。
[0036] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明的方法中，表型可以是包括疾病或障碍的表型。该方法可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。例如，富集可以使用样品进行使得富集的文库可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预
后和/或治疗诊断。类似地，表征可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。可视化也可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊断。在一些实施方式
中，治疗诊断包括预测治疗效果或治疗效果的缺乏，将患者分类为治疗的响应者或非响应
者，或者监测治疗效果。治疗诊断可以针对任何适宜的治疗，例如，治疗可以包括化疗、免疫疗法、靶向癌症治疗、单克隆抗体、抗-HER2抗体、曲妥珠单抗、抗-VEGF抗体、贝伐单抗和/或铂/紫杉烷疗法中的至少一种。在一些实施方式中，治疗包括阿法替尼、阿法替尼+西妥昔单
抗、阿雷替尼、阿司匹林、阿特珠单抗、比卡鲁胺、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、色瑞替尼、西妥昔单抗、顺铂、克里唑蒂尼、达拉菲尼、达卡巴嗪、多柔比星、恩杂鲁胺、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦+依维莫司、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、激素疗法、伊立替康、拉帕替尼、脂质体-多柔比星、matinib、丝裂霉素-c、nab-紫杉醇、纳武单抗、奥拉帕尼、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼联合疗法、紫杉醇、帕博西尼、帕尼单抗、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、舒尼替尼、T-DM1、替莫唑胺多西他赛、替西罗莫司、拓扑替康、曲美替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼和威罗菲尼的至少一种。激素疗法可以是它莫西芬、托瑞米芬、氟维
司群、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、醋酸甲地孕酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、阿比特龙、恩杂鲁胺、曲普瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克中的一种或多种。
断。例如，富集可以使用样品进行使得富集的文库可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预
后和/或治疗诊断。类似地，表征可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。可视化也可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊断。在一些实施方式
中，治疗诊断包括预测治疗效果或治疗效果的缺乏，将患者分类为治疗的响应者或非响应
者，或者监测治疗效果。治疗诊断可以针对任何适宜的治疗，例如，治疗可以包括化疗、免疫疗法、靶向癌症治疗、单克隆抗体、抗-HER2抗体、曲妥珠单抗、抗-VEGF抗体、贝伐单抗和/或铂/紫杉烷疗法中的至少一种。在一些实施方式中，治疗包括阿法替尼、阿法替尼+西妥昔单
抗、阿雷替尼、阿司匹林、阿特珠单抗、比卡鲁胺、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、色瑞替尼、西妥昔单抗、顺铂、克里唑蒂尼、达拉菲尼、达卡巴嗪、多柔比星、恩杂鲁胺、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦+依维莫司、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、激素疗法、伊立替康、拉帕替尼、脂质体-多柔比星、matinib、丝裂霉素-c、nab-紫杉醇、纳武单抗、奥拉帕尼、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼联合疗法、紫杉醇、帕博西尼、帕尼单抗、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、舒尼替尼、T-DM1、替莫唑胺多西他赛、替西罗莫司、拓扑替康、曲美替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼和威罗菲尼的至少一种。激素疗法可以是它莫西芬、托瑞米芬、氟维
司群、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、醋酸甲地孕酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、阿比特龙、恩杂鲁胺、曲普瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克中的一种或多种。
[0037] 在涉及表征样品的本发明的方法中，表征可以包括将所述存在或水平与基准相比较。在一些实施方式中，基准包括在来自没有疾病或障碍的个体或者来自具有不同的疾病
或障碍状态的个体的样品中测定的存在或水平。存在或水平可以是通过可视化确定的视觉
水平的存在或水平，如IHC评分。作为非限制性的实例，与通过本发明提供的至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸的基准的比较指示样品包含癌症样品或非癌症/正常样品。
或障碍状态的个体的样品中测定的存在或水平。存在或水平可以是通过可视化确定的视觉
水平的存在或水平，如IHC评分。作为非限制性的实例，与通过本发明提供的至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸的基准的比较指示样品包含癌症样品或非癌症/正常样品。
[0038] 在本发明的方法的一些实施方式中，一个或多个样品包含体液。体液可以是任何有用的体液，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
[0039] 在包括表征样品或可视化样品的本发明的方法中，样品可以来自疑似患有医学病症、疾病或障碍或者具有其倾向性的受试者。
[0040] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明的方法中，医学病症、疾病或障碍可以是癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。在一些实施方式中，癌症包括急性淋巴母细胞
性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星
形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合
征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠
癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在一些实施方式中，恶变前状况包括
巴雷特食管。在一些实施方式中，自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。在一些实施方式中，心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损
斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。在一些实施方式中，神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障
碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬
化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损
伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。在一些实施方式中，疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛。在一些实施方式中，传染病包括细菌感
染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星
形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合
征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠
癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在一些实施方式中，恶变前状况包括
巴雷特食管。在一些实施方式中，自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。在一些实施方式中，心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损
斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。在一些实施方式中，神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障
碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬
化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损
伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。在一些实施方式中，疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛。在一些实施方式中，传染病包括细菌感
染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
[0041] 在一个方面，本发明提供包含用于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至少一种试剂的试剂盒。在相关的方面，本发明提供用
于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至少一
种试剂的用途。在一些实施方式中，至少一种试剂包括本文提供的寡核苷酸或多个寡核苷
酸。本文还提供另外的有用的试剂。参见，例如，实施例中提供的实验方案。
于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至少一
种试剂的用途。在一些实施方式中，至少一种试剂包括本文提供的寡核苷酸或多个寡核苷
酸。本文还提供另外的有用的试剂。参见，例如，实施例中提供的实验方案。
[0042] 在一个方面，本发明提供一种对至少一个细胞或组织成像的方法，包括使至少一个细胞或组织与本文提供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触，和检测与至少一个细
胞或组织接触的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。
胞或组织接触的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。
[0043] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含可具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对肺或前列腺组织。
[0044] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，前列腺癌。
[0045] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。
[0046] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。
[0047] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对结肠直肠细胞或组织。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对结肠直肠细胞或组织。
[0048] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对组织，包括但不限于乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对组织，包括但不限于乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。
[0049] 在本发明提供的成像方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以带有各种有用的化学结构或修饰，如本文所述的。
[0050] 在本发明提供的成像方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以在检测前施用于受试者。这种方法可以允许对受试者中的至少一个细胞或组织成像。在一些实施方式
中，至少一个细胞或组织包含赘生性细胞、恶性细胞、肿瘤细胞、增生细胞或发育异常细胞。
在一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含淋巴瘤、白血病、肾癌、肉瘤、血管外皮细胞
瘤、黑色素瘤、腹部癌症、胃癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌细胞中的至少一种。在一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含医学病症、疾病或障碍。
中，至少一个细胞或组织包含赘生性细胞、恶性细胞、肿瘤细胞、增生细胞或发育异常细胞。
在一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含淋巴瘤、白血病、肾癌、肉瘤、血管外皮细胞
瘤、黑色素瘤、腹部癌症、胃癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌细胞中的至少一种。在一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含医学病症、疾病或障碍。
[0051] 在一个方面，本发明提供包含含有治疗有效量的如本文提供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的构建体或其盐，及药学上可接受的载体、稀释剂或两者的药物组合物。在
一些实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与本文的表28中所列的至少一个蛋白
质相关。
一些实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与本文的表28中所列的至少一个蛋白
质相关。
[0052] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括肺癌或前
列腺癌。
列腺癌。
[0053] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括前列腺癌。
[0054] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺癌。
[0055] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗
法，其中任选地癌症包括乳腺癌。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗
法，其中任选地癌症包括乳腺癌。
[0056] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症
包括结肠直肠癌。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症
包括结肠直肠癌。
[0057] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺、结肠、肾、肺或前列
腺的癌症。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺、结肠、肾、肺或前列
腺的癌症。
[0058] 药物组合物内的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以具有任何有用的所需化学修饰。在一个实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸连接于毒素或化疗剂。至少
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含在多部分构建体(multipartite construct)内。至
少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以连接于脂质体或纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质
体或纳米颗粒包含毒素或化疗剂。
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含在多部分构建体(multipartite construct)内。至
少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以连接于脂质体或纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质
体或纳米颗粒包含毒素或化疗剂。
[0059] 在相关的方面，本发明提供一种治疗或改善需要的受试者中的疾病或障碍的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。在另一相关的方面中，本发明提供一种在受试
者中诱导细胞毒性的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。可以使用任何有用的
施用方式，包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、局部施用或其任意组合中的至少一种。
附图说明
者中诱导细胞毒性的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。可以使用任何有用的
施用方式，包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、局部施用或其任意组合中的至少一种。
附图说明
[0060] 图1A-1B说明了评估生物标志物(如，细胞或微囊泡表面抗原)的方法。图1A是涂覆了捕获剂如适体或抗体的平面基质的示意图，所述捕获剂捕获表达捕获剂的靶抗原的细胞
或微囊泡。捕获剂可以结合在患病细胞或囊泡的表面上表达的蛋白质。检测剂(其也可以是
适体或抗体)携带可检测标记，在此是荧光信号。检测剂结合捕获的细胞或微囊泡并且通过
其荧光标记提供可检测信号。检测剂可以检测通常与细胞来源或疾病(例如，癌症)相关的
抗原。图1B是与捕获剂偶联的颗粒珠的示意图，其捕获了表达捕获剂的靶抗原的细胞或微
囊泡。捕获剂可以结合在患病细胞或囊泡的表面上表达的蛋白质。检测剂(其也可以是适体
或抗体)携带可检测标记，在此是荧光信号。检测剂结合捕获的细胞或微囊泡并且通过其荧
光标记提供可检测信号。检测剂可以检测通常与细胞来源或疾病(例如，癌症)相关的抗原。
或微囊泡。捕获剂可以结合在患病细胞或囊泡的表面上表达的蛋白质。检测剂(其也可以是
适体或抗体)携带可检测标记，在此是荧光信号。检测剂结合捕获的细胞或微囊泡并且通过
其荧光标记提供可检测信号。检测剂可以检测通常与细胞来源或疾病(例如，癌症)相关的
抗原。图1B是与捕获剂偶联的颗粒珠的示意图，其捕获了表达捕获剂的靶抗原的细胞或微
囊泡。捕获剂可以结合在患病细胞或囊泡的表面上表达的蛋白质。检测剂(其也可以是适体
或抗体)携带可检测标记，在此是荧光信号。检测剂结合捕获的细胞或微囊泡并且通过其荧
光标记提供可检测信号。检测剂可以检测通常与细胞来源或疾病(例如，癌症)相关的抗原。
[0061] 图2A-B说明适体核苷酸序列及其二级结构的非限制性实例。图2A说明了32-聚体的寡核苷酸(适体4，具有序列5’-CCCCCCGAATCACATGACTTGGGCGGGGGTCG(SEQ ID NO.1))的
二级结构。在图中，显示了具有添加至末端的6个胸腺嘧啶核苷酸(其可以作为间隔区以连
接生物素分子)的序列。这种特定的寡聚物对靶标EpCAM具有高结合亲和力。通过将测序的
寡聚物的整个数据库对这种寡聚物的二级结构建模来鉴别另外的候选EpCAM结合剂。图2B
说明了具有序列5’-ACCGGATAGCGGTTGGAGGCGTGCTCCACTCG(SEQ ID NO.2)的另一种32-聚体
寡聚物，其具有不同于图2A中的适体的二级结构。这种适体也显示了具有6-胸腺嘧啶尾。
二级结构。在图中，显示了具有添加至末端的6个胸腺嘧啶核苷酸(其可以作为间隔区以连
接生物素分子)的序列。这种特定的寡聚物对靶标EpCAM具有高结合亲和力。通过将测序的
寡聚物的整个数据库对这种寡聚物的二级结构建模来鉴别另外的候选EpCAM结合剂。图2B
说明了具有序列5’-ACCGGATAGCGGTTGGAGGCGTGCTCCACTCG(SEQ ID NO.2)的另一种32-聚体
寡聚物，其具有不同于图2A中的适体的二级结构。这种适体也显示了具有6-胸腺嘧啶尾。
[0062] 图3说明了使用细胞减损法(cell subtraction method)产生靶特异性适体集的方法，其中靶标是与特定疾病相关的生物标志物。在步骤1中，将寡核苷酸的随机集合与来
自正常患者的生物样品接触。在步骤2中，将步骤1中没有结合的寡聚物加入从患病患者分
离的生物样品中。然后来自这一步骤的结合的寡聚物洗脱，通过其生物素连接捕获，和然后
与正常生物样品再次组合。然后将未结合的寡聚物再次加入疾病来源的生物样品中并分
离。可以反复重复这一过程。针对患者样品测试最终洗脱的适体以测量该集的灵敏度和特
异性。生物样品可以包括血液，包括血浆或血清，或者循环系统的其他组分，如微囊泡。
自正常患者的生物样品接触。在步骤2中，将步骤1中没有结合的寡聚物加入从患病患者分
离的生物样品中。然后来自这一步骤的结合的寡聚物洗脱，通过其生物素连接捕获，和然后
与正常生物样品再次组合。然后将未结合的寡聚物再次加入疾病来源的生物样品中并分
离。可以反复重复这一过程。针对患者样品测试最终洗脱的适体以测量该集的灵敏度和特
异性。生物样品可以包括血液，包括血浆或血清，或者循环系统的其他组分，如微囊泡。
[0063] 图4包括用于鉴别所选择的适体(如通过本发明的方法选择的适体)的靶标的示意图。该图显示了系着于基质401的结合剂402(为了说明的目的，在此是适体)。结合剂402可
以共价连接于基质401。结合剂402还可以是非共价连接的。例如，结合剂402可以包含可吸
引到基质的标记，如生物素基团，其可以与共价连接于基质的抗生物素蛋白/链霉亲和素分
子形成复合物。结合剂402结合微囊泡404的表面抗原403。在箭头(i)表示的步骤中，破坏微
囊泡而保持结合剂402与表面抗原403之间的复合物完整。在箭头(ii)表示的步骤中，除去
破坏的微囊泡405，例如，通过洗涤或缓冲剂交换。在箭头(iii)表示的步骤中，表面抗原403从结合剂402释放。可以分析表面抗原403以确定其性质。
以共价连接于基质401。结合剂402还可以是非共价连接的。例如，结合剂402可以包含可吸
引到基质的标记，如生物素基团，其可以与共价连接于基质的抗生物素蛋白/链霉亲和素分
子形成复合物。结合剂402结合微囊泡404的表面抗原403。在箭头(i)表示的步骤中，破坏微
囊泡而保持结合剂402与表面抗原403之间的复合物完整。在箭头(ii)表示的步骤中，除去
破坏的微囊泡405，例如，通过洗涤或缓冲剂交换。在箭头(iii)表示的步骤中，表面抗原403从结合剂402释放。可以分析表面抗原403以确定其性质。
[0064] 图5A-5G说明使用寡核苷酸探针文库以区分癌症和非癌症样品。
[0065] 图6显示在银染SDS-PAGE凝胶上运行的寡核苷酸探针的蛋白质靶标。
[0066] 图7A-B说明了使用来自一轮交叉验证的训练集(图7A)和测试集(图7B)产生的模型。对于该测试集的AUC是0.803。另一示例轮的交叉验证显示于图7C-D中，具有训练集(图
7C)和测试集(图7D)。对于该测试集的AUC是0.678。
7C)和测试集(图7D)。对于该测试集的AUC是0.678。
[0067] 图8说明了多部分寡核苷酸构建体。
[0068] 图18A-C说明了SUPRA(SsDNA by Unequal length PRimer Asymmetric PCR)，一种用于单链DNA(ssDNA)寡核苷酸文库制备的实验方案。
[0069] 图10A-C说明了适体在表征表型的方法中的用途。图10A是显示了可以用于检测和/或定量目标靶标的分析配置的示意图1000。在图中，捕获适体1002连接于基质1001。目
标靶标1003通过捕获适体1002结合。检测适体1004也结合于目标靶标1003。检测适体1004
携带标记1005，其可以进行检测来鉴别通过捕获适体1002捕获至基质1001的靶标。图10B是
显示了使用适体集合来表征表型的示意图1010。提供了目标靶标的适体集合1011。将集合
接触待表征的测试样品1012。洗涤混合物来除去未结合的适体。保留的适体解离并收集
1013。鉴别收集的适体1014并将保留适体的性质用于表征表型1015。图10C是显示了图10B
中方法的执行的示意图1020。提供鉴别为结合微囊泡群体的适体集合1019。输入样品包含
从测试样品分离的微囊泡1020。将该集合接触待表征的分离的微囊泡1023。洗涤混合物以
除去未结合的适体，并解离和收集剩余的适体1025。鉴别收集的适体并将保留的适体的性
质用于表征表型1026。
标靶标1003通过捕获适体1002结合。检测适体1004也结合于目标靶标1003。检测适体1004
携带标记1005，其可以进行检测来鉴别通过捕获适体1002捕获至基质1001的靶标。图10B是
显示了使用适体集合来表征表型的示意图1010。提供了目标靶标的适体集合1011。将集合
接触待表征的测试样品1012。洗涤混合物来除去未结合的适体。保留的适体解离并收集
1013。鉴别收集的适体1014并将保留适体的性质用于表征表型1015。图10C是显示了图10B
中方法的执行的示意图1020。提供鉴别为结合微囊泡群体的适体集合1019。输入样品包含
从测试样品分离的微囊泡1020。将该集合接触待表征的分离的微囊泡1023。洗涤混合物以
除去未结合的适体，并解离和收集剩余的适体1025。鉴别收集的适体并将保留的适体的性
质用于表征表型1026。
[0070] 图11A-I说明了寡核苷酸探针文库的开发和使用以区分生物样品类型的用途。
[0071] 图12A-C说明了富集具有对于区分乳腺癌和源自血浆样品的非癌症微囊泡的寡核苷酸的平衡设计的原始寡核苷酸文库。
[0072] 图13显示针对细胞系富集寡核苷酸文库的示意图。
[0073] 图14A-C显示识别由前列腺癌细胞系脱落的微囊泡(外来体)的寡核苷酸探针。
[0074] 图15A-E显示识别HER2+癌症样品的寡核苷酸探针的鉴别。
[0075] 图16A-F显示区分曲妥珠单抗响应者乳腺癌样品的寡核苷酸探针。
[0076] 图17A-P显示区分曲妥珠单抗响应者乳腺癌组织样品的寡核苷酸探针。
[0077] 图18A-G显示在诊断患有结肠直肠癌的个体中预测对FOLFOX/贝伐单抗的联合疗法的响应的寡核苷酸探针的开发。
[0078] 图19A-K显示固定的组织样品的寡核苷酸探针染色的背景优化。
[0079] 图20A-D显示区分微管蛋白3(TUBB3)阳性和阴性胰腺癌组织样品的寡核苷酸探针。
[0080] 图21A-B显示在诊断患有卵巢癌的个体中预测对铂/紫杉烷疗法的响应的寡核苷酸探针的开发。
[0081] 图22A-B显示寡核苷酸探针文库针对肾组织抗-地高辛(DIG)抗体检测的富集和染色。
[0082] 图23A-D说明使用来自固定的组织样品的裂解产物的寡核苷酸探针文库富集。
[0083] 图24A-B说明使用来自固定的组织样品的癌症和非癌症区域的刮除组织的寡核苷酸探针文库富集。
[0084] 图25A-B说明使用固定的组织样品的显微解剖的寡核苷酸探针文库富集。
[0085] 图26A-B说明其治疗癌症的益处或益处的缺乏可能取决于生物标志物状态的治疗剂。
具体实施方式
[0086] 本发明的一个或多个实施方式的详细内容列于以下所附的描述中。尽管与本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，但现在将描述
优选的方法和材料。从描述中将清楚本发明的其他特征、目的和优势。在说明书中，单数形
式也包括复数形式，除非文中另外明确地指出。除非另外定义，否则本发明中使用的所有技
术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含意。在矛盾的情况
中，以本发明的说明书为准。
优选的方法和材料。从描述中将清楚本发明的其他特征、目的和优势。在说明书中，单数形
式也包括复数形式，除非文中另外明确地指出。除非另外定义，否则本发明中使用的所有技
术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含意。在矛盾的情况
中，以本发明的说明书为准。
[0087] 本文公开了可以用于表征表型或评价生物样品的组合物和方法。本发明的组合物和方法包括使用结合目标生物实体(包括但不限于组织、细胞、微囊泡或其片段)的寡核苷
酸探针(适体)。寡核苷酸适体所识别的抗原可以包括蛋白质或多肽或任何其它有用的生物
组分如核酸、脂质和/或碳水化合物。一般地，所公开的寡核苷酸是合成的核酸分子，包括
DNA和RNA，及其变型。除非另外指明，寡核苷酸探针可以按照需要以DNA或RNA形式或作为杂
合分子合成。本文公开的方法包括诊断、预后和治疗诊断过程及使用本发明的一种或多种
适体的技术。或者，本发明的寡核苷酸探针也可以用作结合剂以捕获、分离或富集细胞、细
胞片段、微囊泡或包含抗原或其功能性片段的任何其它片段或复合物。
酸探针(适体)。寡核苷酸适体所识别的抗原可以包括蛋白质或多肽或任何其它有用的生物
组分如核酸、脂质和/或碳水化合物。一般地，所公开的寡核苷酸是合成的核酸分子，包括
DNA和RNA，及其变型。除非另外指明，寡核苷酸探针可以按照需要以DNA或RNA形式或作为杂
合分子合成。本文公开的方法包括诊断、预后和治疗诊断过程及使用本发明的一种或多种
适体的技术。或者，本发明的寡核苷酸探针也可以用作结合剂以捕获、分离或富集细胞、细
胞片段、微囊泡或包含抗原或其功能性片段的任何其它片段或复合物。
[0088] 本发明的组合物和方法也包含可用于评价生物样品的单个寡核苷酸。本发明还公开了可用于检测样品中的生物印记的寡核苷酸集合的组合物和方法。
[0089] 本发明的组合物和方法中公开的寡核苷酸探针和序列可以在本文中以DNA或RNA的形式鉴定。除非另外指明，本领域技术人员会理解，寡核苷酸一般可以作为任一核酸形式
合成并携带各种化学修饰和保留在本发明的范围内。术语适体在本领域中可以用于指通过
沃森-克里克碱基配对之外的机制特异性地结合目标靶标的单一寡核苷酸，类似于单克隆
抗体与特定抗原的结合。在本公开的范围内和除非明确阐明或在上下文中另外暗示，术语
适体、寡核苷酸和寡核苷酸探针及其变型可以互换地用于指能够区分目标生物实体(例如，
组织、细胞、微囊泡、生物标志物)的寡核苷酸，无论具体实体是否已经被鉴定或者精确的结合模式是否已经被确定。
合成并携带各种化学修饰和保留在本发明的范围内。术语适体在本领域中可以用于指通过
沃森-克里克碱基配对之外的机制特异性地结合目标靶标的单一寡核苷酸，类似于单克隆
抗体与特定抗原的结合。在本公开的范围内和除非明确阐明或在上下文中另外暗示，术语
适体、寡核苷酸和寡核苷酸探针及其变型可以互换地用于指能够区分目标生物实体(例如，
组织、细胞、微囊泡、生物标志物)的寡核苷酸，无论具体实体是否已经被鉴定或者精确的结合模式是否已经被确定。
[0090] 本发明的寡核苷酸探针或多个这样的探针也可以用于提供体外或体内检测或成像及提供诊断结果，包括用于诊断、预后或治疗诊断目的。
[0091] 分别地，本发明的寡核苷酸探针也可以用于治疗或用作特异性地靶向细胞、组织、器官等等的治疗剂。因为本发明提供鉴定结合特定组织、细胞、微囊泡或其它目标生物实体
的寡核苷酸探针的方法，本发明的寡核苷酸探针靶向这样的实体并且固有地是药物候选
物、可以用于靶向的药物递送的试剂或者两者。
的寡核苷酸探针的方法，本发明的寡核苷酸探针靶向这样的实体并且固有地是药物候选
物、可以用于靶向的药物递送的试剂或者两者。
[0092] 表型
[0093] 本文公开了使用本发明的方法和组合物表征表型的产物和过程。如本文所述的术语“表型”可以意指可部分地或总体地使用本发明的组合物和/或方法鉴定的任何性状或特
征。例如，表型可以是基于对从受试者获得的样品鉴定的生物标志物谱的诊断、预后或治疗
诊断确定。表型可以是任何可观察的特征或性状，如疾病或病症、疾病或病症的阶段、疾病
或病症的易感性、疾病阶段或病症的预后、生理状态或对治疗的响应/潜在响应。表型可以
由受试者的遗传构成及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起，以及由对核酸序
列的表观遗传修饰引起。
征。例如，表型可以是基于对从受试者获得的样品鉴定的生物标志物谱的诊断、预后或治疗
诊断确定。表型可以是任何可观察的特征或性状，如疾病或病症、疾病或病症的阶段、疾病
或病症的易感性、疾病阶段或病症的预后、生理状态或对治疗的响应/潜在响应。表型可以
由受试者的遗传构成及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起，以及由对核酸序
列的表观遗传修饰引起。
[0094] 受试者中的表型可以通过从受试者获得样品和使用本发明的方法和/或组合物分析样品来表征。例如，表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或病症(包括症状前的早
期阶段检测)，确定疾病或病症的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或病症的阶段或进
程。表征表型可以包括鉴定针对特定疾病、病症、疾病阶段或病症阶段的适当治疗或治疗效
力、疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病重现、转移扩散或疾病复发。表型还可以为
病症或疾病(例如癌症或肿瘤)的临床上不同的类型或亚型。表型确定还可以为生理状况的
确定、器官危境或器官排斥(如移植后)的评估。本文所述的组合物和方法允许在个体的基
础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
期阶段检测)，确定疾病或病症的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或病症的阶段或进
程。表征表型可以包括鉴定针对特定疾病、病症、疾病阶段或病症阶段的适当治疗或治疗效
力、疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病重现、转移扩散或疾病复发。表型还可以为
病症或疾病(例如癌症或肿瘤)的临床上不同的类型或亚型。表型确定还可以为生理状况的
确定、器官危境或器官排斥(如移植后)的评估。本文所述的组合物和方法允许在个体的基
础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
[0095] 在一个方面，本发明涉及组织、微囊泡和循环生物标志物的分析以提供疾病或病症的诊断、预后和/或治疗诊断。治疗诊断包括提供影响疾病或疾病状态的治疗或处理的能
力的诊断测试。治疗诊断测试以诊断或预后测试分别提供诊断或预后的相似方式提供治疗
诊断。如本文中所用的，治疗诊断包括任何所需形式的治疗相关测试，包括预测性医疗、个
性化医疗、精准医疗、综合医疗、药效诊断和Dx/Rx配对。治疗相关测试可以用于预测和评估个体受试者中的药物反应，即提供个性化医疗。预测药物反应可以确定受试者是否是对候
选治疗剂的可能响应者或可能的非响应者，例如，在受试者暴露于治疗或另外用治疗处理
之前。评估药物反应可以监测对药物的响应，例如，监测治疗开始后的一段时间内受试者的
改善或改善的缺乏。治疗相关测试可用于选择特别可能得益于治疗的治疗受试者或在个体
受试者中提供治疗功效的早期和客观的指示。因此，使用本发明的组合物和方法的分析可
以指示出应当改变治疗来选择一种更有希望的治疗，由此避免延误有益治疗的巨大代价和
避免施用无效药物的经济和病状成本。
力的诊断测试。治疗诊断测试以诊断或预后测试分别提供诊断或预后的相似方式提供治疗
诊断。如本文中所用的，治疗诊断包括任何所需形式的治疗相关测试，包括预测性医疗、个
性化医疗、精准医疗、综合医疗、药效诊断和Dx/Rx配对。治疗相关测试可以用于预测和评估个体受试者中的药物反应，即提供个性化医疗。预测药物反应可以确定受试者是否是对候
选治疗剂的可能响应者或可能的非响应者，例如，在受试者暴露于治疗或另外用治疗处理
之前。评估药物反应可以监测对药物的响应，例如，监测治疗开始后的一段时间内受试者的
改善或改善的缺乏。治疗相关测试可用于选择特别可能得益于治疗的治疗受试者或在个体
受试者中提供治疗功效的早期和客观的指示。因此，使用本发明的组合物和方法的分析可
以指示出应当改变治疗来选择一种更有希望的治疗，由此避免延误有益治疗的巨大代价和
避免施用无效药物的经济和病状成本。
[0096] 在评价表型中，生物印记可以在受试者中分析并针对已知对治疗有反应或没有反应的之前受试者的生物印记进行比较。生物印记可以包含某些生物标志物或可以包含某些
检测剂，如本文提供的寡核苷酸探针。如果受试者中的生物印记更密切地与已经对治疗有
反应的之前受试者的生物印记匹配，则受试者可以表征或预测为对治疗的响应者。类似地，
如果受试者中的生物标志物谱更密切地与对治疗没有反应的之前受试者的生物标志物谱
匹配，则受试者可以表征或预测为对治疗的非响应者。治疗可以是对于任何合适的疾病、障
碍或其它病症，包括但不限于本文中公开的那些。
检测剂，如本文提供的寡核苷酸探针。如果受试者中的生物印记更密切地与已经对治疗有
反应的之前受试者的生物印记匹配，则受试者可以表征或预测为对治疗的响应者。类似地，
如果受试者中的生物标志物谱更密切地与对治疗没有反应的之前受试者的生物标志物谱
匹配，则受试者可以表征或预测为对治疗的非响应者。治疗可以是对于任何合适的疾病、障
碍或其它病症，包括但不限于本文中公开的那些。
[0097] 在一些实施方式中，表型包括医学病症，包括但不限于表1中所列的疾病或障碍。例如，表型可以包括检测肿瘤、赘生物或癌症的存在或者其发生可能性，或者表征肿瘤、赘
生物或癌症(例如，阶段、分级、侵袭性、转移或复发的可能性，等)。可以通过本文所述的方法或组合物检测或评价的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(low grade
dysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌
(RCC)或胃癌。结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或Dukes C-D。血液恶性肿瘤可以为B细胞慢
性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴
瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
生物或癌症(例如，阶段、分级、侵袭性、转移或复发的可能性，等)。可以通过本文所述的方法或组合物检测或评价的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(low grade
dysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌
(RCC)或胃癌。结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或Dukes C-D。血液恶性肿瘤可以为B细胞慢
性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴
瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
[0098] 表型可以是恶变前状况，如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维症、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成为恶性肿瘤的其它异常组织生长或病变。诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评价的表型。
[0099] 通过本发明的组合物和方法表征的癌症可包括，但不限于癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤或其它癌症。癌瘤包括，但不限于上皮肿瘤、鳞状细胞肿瘤鳞状细胞癌、基底细胞肿瘤基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺体)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰岛瘤(linitis plastica insulinoma)、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤
(oncocytoma)、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤
(grawitz tumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤(warthin′s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒层细胞瘤、男胚瘤(arrhenoblastoma)、支持细胞间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣和黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端雀斑
性黑色素瘤。肉瘤包括，但不限于Askin’s肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤包括：腺泡状软组织肉
瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括，但不限于慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞
性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic
lymphoma)(如 巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、
单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性
边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血
病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成
人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋
巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤
CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、
血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定的间变性大细胞淋巴瘤、典型霍
奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋
巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括，但不限于生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原
细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括，但不限于肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其
它癌症包括，但不限于唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系统癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
(oncocytoma)、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤
(grawitz tumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤(warthin′s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒层细胞瘤、男胚瘤(arrhenoblastoma)、支持细胞间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣和黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端雀斑
性黑色素瘤。肉瘤包括，但不限于Askin’s肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤包括：腺泡状软组织肉
瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括，但不限于慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞
性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic
lymphoma)(如 巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、
单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性
边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血
病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成
人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋
巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤
CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、
血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定的间变性大细胞淋巴瘤、典型霍
奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋
巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括，但不限于生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原
细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括，但不限于肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其
它癌症包括，但不限于唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系统癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞瘤、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
[0100] 在进一步的实施方式中，进行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠
癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰的癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰的癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
[0101] 在实施方式中，癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和
成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠
癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌、肝癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口部癌症、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这
些和其它的癌症。因此，表征表型可以提供本文公开的癌症之一的诊断、预后或治疗诊断。
成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠
癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌、肝癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口部癌症、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这
些和其它的癌症。因此，表征表型可以提供本文公开的癌症之一的诊断、预后或治疗诊断。
[0102] 在一些实施方式中，癌症包括急性骨髓性白血病(AML)、乳腺癌、胆管细胞癌、结肠直肠腺癌、肝外胆管腺癌、女性生殖道恶性肿瘤、胃腺癌、胃食管腺癌、胃肠基质肿瘤
(GIST)、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、白血病、肝脏肝细胞癌、低级神经胶质瘤、肺细支气管肺泡癌(BAC)、肺非小细胞肺癌(NSCLC)、肺小细胞癌(SCLC)、淋巴瘤、男性生殖道恶性
肿瘤、胸膜的恶性孤立性纤维性肿瘤(MSFT)、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、结节弥漫性大B-细胞淋巴瘤、非表皮卵巢癌(非-EOC)、卵巢表面表皮癌、胰腺腺癌、垂体癌、少突神经胶质瘤、前列腺腺癌、腹膜后或腹膜癌、腹膜后或腹膜肉瘤、小肠恶性肿瘤、软组织肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌或葡萄膜黑色素瘤。本发明的方法可用于表征这些和其它的癌症。因
此，表征表型可以提供本文公开的癌症之一的诊断、预后或治疗诊断。
(GIST)、成胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、白血病、肝脏肝细胞癌、低级神经胶质瘤、肺细支气管肺泡癌(BAC)、肺非小细胞肺癌(NSCLC)、肺小细胞癌(SCLC)、淋巴瘤、男性生殖道恶性
肿瘤、胸膜的恶性孤立性纤维性肿瘤(MSFT)、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、结节弥漫性大B-细胞淋巴瘤、非表皮卵巢癌(非-EOC)、卵巢表面表皮癌、胰腺腺癌、垂体癌、少突神经胶质瘤、前列腺腺癌、腹膜后或腹膜癌、腹膜后或腹膜肉瘤、小肠恶性肿瘤、软组织肿瘤、胸腺癌、甲状腺癌或葡萄膜黑色素瘤。本发明的方法可用于表征这些和其它的癌症。因
此，表征表型可以提供本文公开的癌症之一的诊断、预后或治疗诊断。
[0103] 表型也可以是炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，疾病可以是炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
[0104] 表型也可以包括心血管疾病，如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风或局部缺血。心血管疾病或病症可以是高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。
[0105] 表型也可以包括神经疾病，如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮
(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。表型也可以是如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的病症。
(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。表型也可以是如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的病症。
[0106] 表型也可以包括传染病，如细菌感染、病毒感染或酵母菌感染。例如，疾病或病症可以是惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质(如HIV或HCV样颗粒)以
表征病毒病症。
表征病毒病症。
[0107] 表型也可以包括围产期或妊娠相关病症(例如，先兆性子痫或早产)、代谢疾病或病症(例如，与铁代谢有关的代谢疾病或病症)。例如，可以分析在囊泡中的铁调素
(hepcidin)以表征铁缺乏。代谢疾病或病症还可以为糖尿病、炎症或围产期病症。
(hepcidin)以表征铁缺乏。代谢疾病或病症还可以为糖尿病、炎症或围产期病症。
[0108] 本发明的组合物和方法可用于表征这些或其它疾病和障碍。因此，表型表征可提供对医学病症、疾病或障碍(包括但不限于本文公开的疾病和障碍之一)的诊断、预后或治
疗诊断。
疗诊断。
[0109] 受试者
[0110] 可通过分析从受试者获得的生物样品来确定受试者的一种或多种表型。受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物如牛科、鸟类、犬科、马科、猫科、羊科、猪科或灵长动物(包括人及非人灵长动物)。受试者还可以包括：由于濒危而变得重要的哺乳动物，例如西伯利
亚虎；或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物)，或对人类而言具有社
会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于：
食肉动物，例如猫和狗；猪类，包括畜养猪、食用猪和野猪；反刍动物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，和更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内，例如与农业、水
产业和其它活动有关的那些动物，所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全而常规
实施疾病监测、诊断和疗法的选择。
亚虎；或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物)，或对人类而言具有社
会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于：
食肉动物，例如猫和狗；猪类，包括畜养猪、食用猪和野猪；反刍动物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，和更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内，例如与农业、水
产业和其它活动有关的那些动物，所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全而常规
实施疾病监测、诊断和疗法的选择。
[0111] 受试者可以患有先前存在的疾病或病症，包括但不限于癌症。或者，受试者可以并未患任何已知的先前存在的病症。受试者还可以对现有或过去的治疗是非响应的，例如对
癌症的治疗。
癌症的治疗。
[0112] 样品
[0113] 通过本发明的组合物和方法使用和/或评估的样品包括可用于表型目标表型的任何相关生物样品，包括但不限于组织的切片，如在外科手术或其他程序过程中取出的活检
样本或组织、体液、尸检样品、为组织学目的获取的冷冻切片和细胞培养物。这样的样品包
括血液和血液部分或制品(例如，血清、血沉棕黄层、血浆、血小板、红细胞等)、痰液、恶性渗出液、颊细胞组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿液、其他生物流体或体液(例如，前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊髓液等)等等。样品可以包含作为新鲜冷冻&福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)块、福尔马林固定的石蜡包埋的，或在RNA
防腐剂+福尔马林固定剂中的生物材料。对于每名患者，可以使用超过一种类型的超过一个
样品。
样本或组织、体液、尸检样品、为组织学目的获取的冷冻切片和细胞培养物。这样的样品包
括血液和血液部分或制品(例如，血清、血沉棕黄层、血浆、血小板、红细胞等)、痰液、恶性渗出液、颊细胞组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿液、其他生物流体或体液(例如，前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊髓液等)等等。样品可以包含作为新鲜冷冻&福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)块、福尔马林固定的石蜡包埋的，或在RNA
防腐剂+福尔马林固定剂中的生物材料。对于每名患者，可以使用超过一种类型的超过一个
样品。
[0114] 本文所述方法中使用的样品可以是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)样品。FFPE样品可以是固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、针芯活检、恶性流体和细针抽吸
(FNA)中的一种或多种。在一个实施方式中，固定的组织包括含有来自外科手术或活检的福
尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)块的肿瘤。在另一个实施方式中，未染色的载玻片包含来
自石蜡块的未染色的、带电的、未烘烤过的载玻片。在另一个实施方式中，骨髓芯或块包含
脱钙的芯。福尔马林固定的芯和/或块可以是石蜡包埋的。再在另一个实施方式中，芯针活
检包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如，3-4个，石蜡包埋的活检样品。可以使用18号针活检。恶性流体可以包括足够体积的新鲜腹膜液/腹水，以产生5x5x2mm细胞沉淀。流体可
以在石蜡块中福尔马林固定。在一个实施方式中，芯针活检包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如，4-6个，石蜡包埋的抽吸物。
(FNA)中的一种或多种。在一个实施方式中，固定的组织包括含有来自外科手术或活检的福
尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)块的肿瘤。在另一个实施方式中，未染色的载玻片包含来
自石蜡块的未染色的、带电的、未烘烤过的载玻片。在另一个实施方式中，骨髓芯或块包含
脱钙的芯。福尔马林固定的芯和/或块可以是石蜡包埋的。再在另一个实施方式中，芯针活
检包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如，3-4个，石蜡包埋的活检样品。可以使用18号针活检。恶性流体可以包括足够体积的新鲜腹膜液/腹水，以产生5x5x2mm细胞沉淀。流体可
以在石蜡块中福尔马林固定。在一个实施方式中，芯针活检包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，例如，4-6个，石蜡包埋的抽吸物。
[0115] 可以根据本领域技术人员了解的技术来处理样品。样品可以是但不限于新鲜的、冷冻的或固定的细胞或组织。在一些实施方式中，样品包括福尔马林固定的石蜡包埋的
(FFPE)组织、新鲜组织或新鲜冷冻(FF)组织。样品可以包括培养的细胞，包括源自受试者样
品的原代或永生化细胞系。样品还可以指来自受试者样品的提取物。例如，样品可以包含从
组织或体液提取的DNA、RNA或蛋白质。许多技术和商业试剂盒可以用于这样的目的。可以用
试剂处理来自个体的新鲜样品以在进一步处理(例如，细胞裂解和提取)之前保存RNA。样品
可以包括为了其他目的收集的冷冻样品。样品可以与相关信息相关联，如受试者的年龄、性
别和存在的临床症状；样品的来源；以及样品的收集和储存方法。样品通常获自受试者，例
如，人类受试者。
(FFPE)组织、新鲜组织或新鲜冷冻(FF)组织。样品可以包括培养的细胞，包括源自受试者样
品的原代或永生化细胞系。样品还可以指来自受试者样品的提取物。例如，样品可以包含从
组织或体液提取的DNA、RNA或蛋白质。许多技术和商业试剂盒可以用于这样的目的。可以用
试剂处理来自个体的新鲜样品以在进一步处理(例如，细胞裂解和提取)之前保存RNA。样品
可以包括为了其他目的收集的冷冻样品。样品可以与相关信息相关联，如受试者的年龄、性
别和存在的临床症状；样品的来源；以及样品的收集和储存方法。样品通常获自受试者，例
如，人类受试者。
[0116] 活检包括为了诊断或预后评价取出组织样品的过程，并且指组织样本自身。本领域已知的任何活检技术可以应用于本发明的分子谱测定方法。所应用的活检技术可以特别
地取决于待评估的组织类型(例如，结肠、前列腺、肾脏、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、血液细胞、肺、乳房等)、肿瘤的大小和类型(例如，实体的或悬浮的，血液或腹水)。代表性活检技术包括，但不限于切除活检、切口活检、针活检、外科手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指取出整个肿瘤团块，带有围绕其的少量正常组织切缘。“切口活检”是指取出包括肿瘤横截面
直径的组织楔形块。本发明可以利用肿瘤块的“芯针活检”或“细针抽吸活检”，其通常获得肿瘤块内细胞的悬浮液。例如，在Harrison′s Principles of Internal Medicine，Kasper等编辑，第16版，2005，第70章，以及整个V部分中讨论了活检技术。
地取决于待评估的组织类型(例如，结肠、前列腺、肾脏、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、血液细胞、肺、乳房等)、肿瘤的大小和类型(例如，实体的或悬浮的，血液或腹水)。代表性活检技术包括，但不限于切除活检、切口活检、针活检、外科手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指取出整个肿瘤团块，带有围绕其的少量正常组织切缘。“切口活检”是指取出包括肿瘤横截面
直径的组织楔形块。本发明可以利用肿瘤块的“芯针活检”或“细针抽吸活检”，其通常获得肿瘤块内细胞的悬浮液。例如，在Harrison′s Principles of Internal Medicine，Kasper等编辑，第16版，2005，第70章，以及整个V部分中讨论了活检技术。
[0117] 本领域已知的并且没有特意描述的标准分子生物学技术通常遵循Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)，以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley
and Sons，Baltimore，Md.(1989)和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，
John Wiley&Sons，New York(1988)，以及Watson等，Recombinant DNA，Scientific
American Books，New York以及Birren等(编辑)Genome Analysis：A Laboratory Manual
Series，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)中以及美国
专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所列的方法，并按引
用并入本文中。通常可以按照PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，
Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中的来进行聚合酶链式反应(PCR)。
and Sons，Baltimore，Md.(1989)和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，
John Wiley&Sons，New York(1988)，以及Watson等，Recombinant DNA，Scientific
American Books，New York以及Birren等(编辑)Genome Analysis：A Laboratory Manual
Series，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)中以及美国
专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所列的方法，并按引
用并入本文中。通常可以按照PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，
Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中的来进行聚合酶链式反应(PCR)。
[0118] 使用本发明的组合物和方法评估的生物样品可以是任何有用的体液或生物流体，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液、细胞、细胞培养物或细胞培养物上清液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐
带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。生物样品还可以是细胞培养物、组
织样品或活检组织，从中可获得微囊泡、循环肿瘤细胞(CTCs)和其它循环生物标志物。例
如，可以培养目标细胞并从培养物分离微囊泡。在各种实施方式中，可使用各种方法由这些
生物样品直接评估本文公开的生物标志物或更特别地生物印记(如，对核酸或者多肽生物
标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定)，诸如从血液、血浆、血清或任意前述生物样
品提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物，以及本领
域中已知用于鉴定和评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组学技术。此外，可以首先分离或富集此类样品中存在的一种或多种组分，并且进一步处理来评价选定的生
物标志物的存在或水平，以评价给定的生物印记(例如，在蛋白质和/或核酸生物标志物谱
分析之前分离的微囊泡)。
带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。生物样品还可以是细胞培养物、组
织样品或活检组织，从中可获得微囊泡、循环肿瘤细胞(CTCs)和其它循环生物标志物。例
如，可以培养目标细胞并从培养物分离微囊泡。在各种实施方式中，可使用各种方法由这些
生物样品直接评估本文公开的生物标志物或更特别地生物印记(如，对核酸或者多肽生物
标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定)，诸如从血液、血浆、血清或任意前述生物样
品提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物，以及本领
域中已知用于鉴定和评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组学技术。此外，可以首先分离或富集此类样品中存在的一种或多种组分，并且进一步处理来评价选定的生
物标志物的存在或水平，以评价给定的生物印记(例如，在蛋白质和/或核酸生物标志物谱
分析之前分离的微囊泡)。
[0119] 表1列出了疾病、病症或生物学状态以及可以用于根据本发明的方法分析的相应生物样品的非限制性列表。
[0120] 表1：针对各种疾病、病症或生物学状态的生物样品的实例
[0121]
[0122]
[0123]
[0124] 本发明的方法可用于使用血液样品或血液衍生物来表征表型。血液衍生物包括血浆和血清。血浆是全血的液体组分，并且约占总血液体积的55％。其主要由水及溶液中的少
量矿物质、盐类、离子、营养物质和蛋白质组成。在全血中，红细胞、白细胞和血小板悬浮于血浆中。血清指的是不含纤维蛋白原或其它凝血因子的血浆(即，全血减去细胞和凝血因
子)。
量矿物质、盐类、离子、营养物质和蛋白质组成。在全血中，红细胞、白细胞和血小板悬浮于血浆中。血清指的是不含纤维蛋白原或其它凝血因子的血浆(即，全血减去细胞和凝血因
子)。
[0125] 生物样品可通过第三方获得，诸如不进行生物标志物的分析的一方。例如，样品可以通过样品所来源的受试者的临床医生、医师或其它保健管理人员获得。或者，生物样品可
以由分析样品的同一方获得。此外，进行分析的生物样品在防腐条件下归档(如，冷冻)或者
另外储存。
以由分析样品的同一方获得。此外，进行分析的生物样品在防腐条件下归档(如，冷冻)或者
另外储存。
[0126] 在各种实施方式中，生物样品包含源自细胞来源的和在受试者的生物流体或细胞外环境中胞外可得的微囊泡或细胞膜片段。本发明的方法可以包括评估这样的微囊泡的一
种或多种，其包括评估微囊泡群体。如本文所使用的，微囊泡是从细胞上脱落的膜囊泡。囊
泡或膜囊泡包括但不限于：循环微囊泡(cMV)、微囊泡、外来体、纳米囊泡、树状细胞胞外体(dexosome)、水泡、水疱、前列腺小体、微粒、管腔内囊泡、膜片段、管腔内核内体囊泡、核内体样囊泡、胞吐媒介、核内体囊泡、核内体的囊泡、凋亡小体、多囊泡体、分泌囊泡、磷脂囊泡、脂质体囊泡、argosome、texasome、secresome、耐体(tolerosome)、黑色素体、癌小体(oncosome)或胞吐的媒介。此外，尽管囊泡可通过不同的细胞过程产生，本发明的方法并不
限于或依赖于任何一种机制，只要这些囊泡存在于生物样品中并且能够通过本文公开的方
法进行表征即可。除非另外指明，否则使用某一种类的囊泡的方法可应用于其它类型的囊
泡。囊泡包含球状结构，其具有环绕内腔的类似于细胞膜的脂质双层，所述内腔可包含有时
被称为有效负载的可溶性组分。在一些实施方式中，本发明的方法使用了外来体，其为直径
约40-100nm的小的分泌囊泡。对于膜囊泡(包括类型和特征)的综述参见Thery等，Nat Rev
Immunol.2009年8月；9(8)：581-93。不同类型囊泡的一些性质包括表2中的那些：
种或多种，其包括评估微囊泡群体。如本文所使用的，微囊泡是从细胞上脱落的膜囊泡。囊
泡或膜囊泡包括但不限于：循环微囊泡(cMV)、微囊泡、外来体、纳米囊泡、树状细胞胞外体(dexosome)、水泡、水疱、前列腺小体、微粒、管腔内囊泡、膜片段、管腔内核内体囊泡、核内体样囊泡、胞吐媒介、核内体囊泡、核内体的囊泡、凋亡小体、多囊泡体、分泌囊泡、磷脂囊泡、脂质体囊泡、argosome、texasome、secresome、耐体(tolerosome)、黑色素体、癌小体(oncosome)或胞吐的媒介。此外，尽管囊泡可通过不同的细胞过程产生，本发明的方法并不
限于或依赖于任何一种机制，只要这些囊泡存在于生物样品中并且能够通过本文公开的方
法进行表征即可。除非另外指明，否则使用某一种类的囊泡的方法可应用于其它类型的囊
泡。囊泡包含球状结构，其具有环绕内腔的类似于细胞膜的脂质双层，所述内腔可包含有时
被称为有效负载的可溶性组分。在一些实施方式中，本发明的方法使用了外来体，其为直径
约40-100nm的小的分泌囊泡。对于膜囊泡(包括类型和特征)的综述参见Thery等，Nat Rev
Immunol.2009年8月；9(8)：581-93。不同类型囊泡的一些性质包括表2中的那些：
[0127] 表2：囊泡性质
[0128]
[0129] 缩写：磷脂酰丝氨酸(PPS)；电子显微术(EM)
[0130] 囊泡包括脱落的膜结合颗粒，或“微粒”，其源自于质膜或内膜。囊泡可以从细胞释放进入细胞外环境中。释放囊泡的细胞包括但不限于源自或衍生自外胚层、内胚层或中胚层的细胞。细胞可发生遗传的、环境的和/或任意的其它变异或变化。例如，细胞可为肿瘤细胞。囊泡可反映来源细胞中的任何变化，并且由此反映起源细胞(如，具有各种遗传突变的
细胞)中的变化。在一种机制中，当细胞膜的片段自发地内陷并最终被胞吐时，囊泡在细胞
内生成(参见例如，Keller等，Immunol.Lett.107(2)：102-8(2006))。囊泡还包括脂质双层
膜所结合的细胞源的结构，其由质膜部分的突出外翻(起泡)分离和封闭产生或者由包含各
种肿瘤来源的膜结合蛋白质的任何细胞内膜结合囊泡结构的输出而生成，其中所述膜结合
蛋白质包括选择性地结合肿瘤源蛋白质以及包含在囊泡内腔中的分子的源自宿主循环的
表面结合分子，其包括但不限于肿瘤源的微RNA或细胞内蛋白质。水泡和起泡在Charras等，
Nature Reviews Molecular and Cell Biology，第9卷第11章，p.730-736(2008)中有进一
步的描述。从肿瘤细胞上脱落进入循环或体液中的囊泡可称作为“循环肿瘤源的囊泡”。当
这种囊泡是外来体时，其可被称为循环肿瘤源的外来体(CTE)。在一些情况下，囊泡可源自
特定细胞源。CTE，如细胞源特异性囊泡一样，通常具有一种或多种独特的生物标志物，其允许CTE或细胞源特异性囊泡例如从体液中分离且某些时候以特异性方式分离。例如，使用细
胞或组织特异性标志物以鉴定细胞源。本文公开了这些细胞或组织特异性标志物的实例并
且其可进一步见于组织特异性基因表达和调控(TiGER)数据库(Tissue-specific Gene
Expression and Regulation Database)(其可获自bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/)；
Liu等(2008)TiGER：a database for tissue-specific gene expression and
regulation.BMC Bioinformatics.9：271；组织分布数据库(TissueDistributionDB)，其可
获自genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.html。
细胞)中的变化。在一种机制中，当细胞膜的片段自发地内陷并最终被胞吐时，囊泡在细胞
内生成(参见例如，Keller等，Immunol.Lett.107(2)：102-8(2006))。囊泡还包括脂质双层
膜所结合的细胞源的结构，其由质膜部分的突出外翻(起泡)分离和封闭产生或者由包含各
种肿瘤来源的膜结合蛋白质的任何细胞内膜结合囊泡结构的输出而生成，其中所述膜结合
蛋白质包括选择性地结合肿瘤源蛋白质以及包含在囊泡内腔中的分子的源自宿主循环的
表面结合分子，其包括但不限于肿瘤源的微RNA或细胞内蛋白质。水泡和起泡在Charras等，
Nature Reviews Molecular and Cell Biology，第9卷第11章，p.730-736(2008)中有进一
步的描述。从肿瘤细胞上脱落进入循环或体液中的囊泡可称作为“循环肿瘤源的囊泡”。当
这种囊泡是外来体时，其可被称为循环肿瘤源的外来体(CTE)。在一些情况下，囊泡可源自
特定细胞源。CTE，如细胞源特异性囊泡一样，通常具有一种或多种独特的生物标志物，其允许CTE或细胞源特异性囊泡例如从体液中分离且某些时候以特异性方式分离。例如，使用细
胞或组织特异性标志物以鉴定细胞源。本文公开了这些细胞或组织特异性标志物的实例并
且其可进一步见于组织特异性基因表达和调控(TiGER)数据库(Tissue-specific Gene
Expression and Regulation Database)(其可获自bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/)；
Liu等(2008)TiGER：a database for tissue-specific gene expression and
regulation.BMC Bioinformatics.9：271；组织分布数据库(TissueDistributionDB)，其可
获自genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.html。
[0131] 囊泡可具有超过约10nm、20nm或30nm的直径。囊泡可具有超过40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1500nm、2000nm或超过10,000nm的直径。囊泡可具有约20-2000nm、约
20-1500nm、约30-1000nm、约30-800nm、约30-200nm或约30-100nm的直径。在一些实施方式
中，所述囊泡具有低于10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、
50nm、40nm、30nm、20nm或低于10nm的直径。本文在提及数值时所使用的术语“约”意指高于或低于所述数值10％的变化属于所指明数值的范围内。各种类型的囊泡的典型大小在表2
中示出。可评估囊泡以测量单一囊泡或多种囊泡的直径。例如，可测定囊泡群体的直径范围
或囊泡群体的平均直径。囊泡直径可使用本领域中已知的方法评估，如，诸如电子显微术这
样的成像技术。在一个实施方式中，使用光学粒子检测(optical particle detection)测
定一种或多种囊泡的直径。例如，参见2010年7月6日授权的名称为“Optical Detection
and Analysis of Particles”的美国专利7,751,053；以及2010年7月15日授权的名称为
“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7,399,600。
20-1500nm、约30-1000nm、约30-800nm、约30-200nm或约30-100nm的直径。在一些实施方式
中，所述囊泡具有低于10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、
50nm、40nm、30nm、20nm或低于10nm的直径。本文在提及数值时所使用的术语“约”意指高于或低于所述数值10％的变化属于所指明数值的范围内。各种类型的囊泡的典型大小在表2
中示出。可评估囊泡以测量单一囊泡或多种囊泡的直径。例如，可测定囊泡群体的直径范围
或囊泡群体的平均直径。囊泡直径可使用本领域中已知的方法评估，如，诸如电子显微术这
样的成像技术。在一个实施方式中，使用光学粒子检测(optical particle detection)测
定一种或多种囊泡的直径。例如，参见2010年7月6日授权的名称为“Optical Detection
and Analysis of Particles”的美国专利7,751,053；以及2010年7月15日授权的名称为
“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7,399,600。
[0132] 在一些实施方式中，本发明的方法包括在没有生物样品的先行分离、纯化或浓缩的情况下直接评估囊泡，如在生物样品中。例如，样品中的囊泡量本身可提供生物印记，其
提供诊断、预后或治疗诊断的确定。或者，可在分析前从样品中分离、捕获、纯化或浓缩样品中的囊泡。如所说明的，本文所使用的分离、捕获或纯化包括与样品中的其它组分分开的部
分分离、部分捕获或部分纯化。囊泡分离可使用本文所述的各种技术实施，如，色谱、过滤、离心、流式细胞术、亲和捕获(如，捕获到平表面或珠)和/或使用微流体技术。图10B-C呈现
了使用适体集合评估微囊泡的本发明方法的概览。
提供诊断、预后或治疗诊断的确定。或者，可在分析前从样品中分离、捕获、纯化或浓缩样品中的囊泡。如所说明的，本文所使用的分离、捕获或纯化包括与样品中的其它组分分开的部
分分离、部分捕获或部分纯化。囊泡分离可使用本文所述的各种技术实施，如，色谱、过滤、离心、流式细胞术、亲和捕获(如，捕获到平表面或珠)和/或使用微流体技术。图10B-C呈现
了使用适体集合评估微囊泡的本发明方法的概览。
[0133] 可以通过将囊泡特征与参照进行比较而评估囊泡如外来体以提供表型表征。在一些实施方式中，评估了囊泡上的表面抗原。所述表面抗原可提供囊泡的解剖学起源和/或细
胞学的指示，以及其它表型信息，如肿瘤状态。例如，其中针对指示结肠直肠来源和癌症存
在的表面抗原评估患者样品(如，体液，诸如血液、血清或血浆)中发现的囊泡。所述表面抗
原可包含可在囊泡膜表面上检测到的任何信息性生物实体，其包括但不限于表面蛋白质、
脂质、碳水化合物和其它膜组分。例如，对表达肿瘤抗原的结肠来源的囊泡的阳性检测可表
示所述患者患有结肠直肠癌。据此，本发明的方法可用于表征与解剖学或细胞起源相关的
任意疾病或病症，其例如通过评估获自受试者的一种或多种囊泡的疾病特异性和细胞特异
性生物标志物而完成。
胞学的指示，以及其它表型信息，如肿瘤状态。例如，其中针对指示结肠直肠来源和癌症存
在的表面抗原评估患者样品(如，体液，诸如血液、血清或血浆)中发现的囊泡。所述表面抗
原可包含可在囊泡膜表面上检测到的任何信息性生物实体，其包括但不限于表面蛋白质、
脂质、碳水化合物和其它膜组分。例如，对表达肿瘤抗原的结肠来源的囊泡的阳性检测可表
示所述患者患有结肠直肠癌。据此，本发明的方法可用于表征与解剖学或细胞起源相关的
任意疾病或病症，其例如通过评估获自受试者的一种或多种囊泡的疾病特异性和细胞特异
性生物标志物而完成。
[0134] 在另一个实施方式中，本发明的方法包括对一种或多种囊泡有效负载进行评估以提供表型表征。囊泡的有效负载包含在包封于所述囊泡内的情况下可检测的任何信息性生
物实体，其包括但不限于蛋白质和核酸，如，基因组的核酸或cDNA、mRNA或其功能性片段，以及微RNA(miR)。此外，本发明的方法涉及检测囊泡表面抗原(在囊泡有效负载以外或专门对
于囊泡有效负载进行)以提供表型表征。例如，可通过使用对于囊泡表面抗原特异性的结合
剂(如抗体或适体)来表征囊泡，并且可进一步评估结合的囊泡以鉴定其中揭示的一种或多
种有效负载组分。根据本文所述，具有目标表面抗原或具有目标有效负载的囊泡的水平可
与参照进行比较以表征表型。例如，与参照对比，样品中癌症相关表面抗原或囊泡有效负载
(如肿瘤相关mRNA或微RNA)的过表达可指示所述样品中癌症的存在。根据所需目标样品的
选择以及目标样品与所希望的参照样品的比较，所评估的生物标志物可存在或不存在、提
高或降低。目标样品的非限制实例包括：疾病；治疗/未治疗；不同时间点，如在纵向研究中；
并且参照样品的非限制实例：非疾病；正常；不同时间点；以及对候选治疗的敏感或抗性。
物实体，其包括但不限于蛋白质和核酸，如，基因组的核酸或cDNA、mRNA或其功能性片段，以及微RNA(miR)。此外，本发明的方法涉及检测囊泡表面抗原(在囊泡有效负载以外或专门对
于囊泡有效负载进行)以提供表型表征。例如，可通过使用对于囊泡表面抗原特异性的结合
剂(如抗体或适体)来表征囊泡，并且可进一步评估结合的囊泡以鉴定其中揭示的一种或多
种有效负载组分。根据本文所述，具有目标表面抗原或具有目标有效负载的囊泡的水平可
与参照进行比较以表征表型。例如，与参照对比，样品中癌症相关表面抗原或囊泡有效负载
(如肿瘤相关mRNA或微RNA)的过表达可指示所述样品中癌症的存在。根据所需目标样品的
选择以及目标样品与所希望的参照样品的比较，所评估的生物标志物可存在或不存在、提
高或降低。目标样品的非限制实例包括：疾病；治疗/未治疗；不同时间点，如在纵向研究中；
并且参照样品的非限制实例：非疾病；正常；不同时间点；以及对候选治疗的敏感或抗性。
[0135] 诊断方法
[0136] 本发明的适体可用于各种方法中以评价生物样品中生物标志物的存在或水平，例如，目标生物实体，如蛋白质、核酸或微囊泡。生物实体可以是大实体如复合物、细胞或组织的部分，或者可以在体液中循环。适体可以用于评价一种或多种靶分子的存在或水平。因
此，在涉及诊断、预后或治疗诊断的本发明的各种实施方式中，本发明的一种或多种适体在
基于配体-靶的试验中配置，其中将本发明的一种或多种适体接触选定的生物样品，其中一
种或多种适体与其靶分子关联或结合。基于评价的生物样品和检测的生物标志物，本发明
的适体用于鉴别候选生物印记。在一些实施方式中，适体或寡核苷酸探针或者其文库自身
可以提供针对特定病症或疾病的生物印记。生物印记是指生物样品的生物标志物谱，包括
一种或多种目标生物标志物的存在、水平或可以评价的其他特征(包括但不限于序列、突
变、重排、易位、删除、表遗传修饰、甲基化、翻译后修饰、等位基因、活性、复合伴体、稳定性、半衰期等)。生物印记可以用于评估诊断和/或预后标准，如疾病的存在、疾病分级、疾病监
测、疾病分层或检测监视、疾病的转移或复发或进展。例如，使用针对微囊泡表面抗原的适
体的本发明方法可用于将包括微囊泡抗原的生物印记与选定的病症或疾病关联。作为一个
实例，使用针对组织的适体的本发明方法可用于将包括组织抗原的生物印记与选定的病症
或疾病关联。生物印记在临床上还可以用于作出关于治疗形式的决策，包括治疗干预。生物
印记在临床上可以进一步用于作出治疗决策，包括是否进行外科手术或应当连同外科手术
一起(例如，手术前或手术后)使用哪种治疗标准。作为说明性的实例，循环生物标志物或固
定组织上显示的生物标志物的生物印记可以指示癌症的侵袭形式且可以要求更激进的外
科手术程序和/或更激进的治疗方案来治疗患者。
此，在涉及诊断、预后或治疗诊断的本发明的各种实施方式中，本发明的一种或多种适体在
基于配体-靶的试验中配置，其中将本发明的一种或多种适体接触选定的生物样品，其中一
种或多种适体与其靶分子关联或结合。基于评价的生物样品和检测的生物标志物，本发明
的适体用于鉴别候选生物印记。在一些实施方式中，适体或寡核苷酸探针或者其文库自身
可以提供针对特定病症或疾病的生物印记。生物印记是指生物样品的生物标志物谱，包括
一种或多种目标生物标志物的存在、水平或可以评价的其他特征(包括但不限于序列、突
变、重排、易位、删除、表遗传修饰、甲基化、翻译后修饰、等位基因、活性、复合伴体、稳定性、半衰期等)。生物印记可以用于评估诊断和/或预后标准，如疾病的存在、疾病分级、疾病监
测、疾病分层或检测监视、疾病的转移或复发或进展。例如，使用针对微囊泡表面抗原的适
体的本发明方法可用于将包括微囊泡抗原的生物印记与选定的病症或疾病关联。作为一个
实例，使用针对组织的适体的本发明方法可用于将包括组织抗原的生物印记与选定的病症
或疾病关联。生物印记在临床上还可以用于作出关于治疗形式的决策，包括治疗干预。生物
印记在临床上可以进一步用于作出治疗决策，包括是否进行外科手术或应当连同外科手术
一起(例如，手术前或手术后)使用哪种治疗标准。作为说明性的实例，循环生物标志物或固
定组织上显示的生物标志物的生物印记可以指示癌症的侵袭形式且可以要求更激进的外
科手术程序和/或更激进的治疗方案来治疗患者。
[0137] 表征表型，如提供诊断、预后或治疗诊断，可以包括将生物印记与基准比较。例如，疾病状态中生物标志物的水平可以与没有疾病或具有不同疾病状态的基准比较升高或降低。根据本发明的寡核苷酸探针文库可以工程设计为检测特定表型而非另一表型。作为非
限制性的实例，寡核苷酸探针文库可以使用免疫分析染色特定组织但不染色非癌症参照组
织。或者，寡核苷酸探针文库可以使用免疫分析以比非癌症参照组织高的可检测水平染色
特定组织。本领域技术人员理解，可能对寡核苷酸探针文库工程化以使用免疫分析来以比
癌症组织高的可检测水平染色非癌症组织。
限制性的实例，寡核苷酸探针文库可以使用免疫分析染色特定组织但不染色非癌症参照组
织。或者，寡核苷酸探针文库可以使用免疫分析以比非癌症参照组织高的可检测水平染色
特定组织。本领域技术人员理解，可能对寡核苷酸探针文库工程化以使用免疫分析来以比
癌症组织高的可检测水平染色非癌症组织。
[0138] 生物印记可以用于本文中公开的任一方法中，例如，用于评价受试者是否患有疾病，是否存在产生疾病的风险或用于评价疾病的阶段或进展。例如，生物印记可以用于评价
受试者是否患有前列腺癌、结肠癌或本文中所述的其他癌症。参见，例如，标记为“表型”的章节。此外，生物印记可以用于确定疾病或病症(如，癌症)的阶段。
受试者是否患有前列腺癌、结肠癌或本文中所述的其他癌症。参见，例如，标记为“表型”的章节。此外，生物印记可以用于确定疾病或病症(如，癌症)的阶段。
[0139] 包括微囊泡的生物印记/生物标志物谱可以包括微囊泡内有效负载的评价。例如，本发明的一种或多种适体可以用于捕获微囊泡群体，由此提供微囊泡抗原的读出信息，并
且随后可以评价捕获的微囊泡内的有效负载内容物，由此提供有效负载内容物的进一步生
物标志物读出信息。
且随后可以评价捕获的微囊泡内的有效负载内容物，由此提供有效负载内容物的进一步生
物标志物读出信息。
[0140] 用于表征表型的生物印记可以包含许多有用的标准。本文中使用的术语“表型”可以指归因于生物印记/生物标志物谱的任何性状或特征。可以部分地或总体地使用本发明
的方法和/或组合物来检测或鉴别表型。在一些实施方式中，将至少一个标准用于每个生物
标志物。在一些实施方式中，使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、
90或至少100个标准。例如，当受试者诊断为癌症时，为了癌症的表征，可以使用多种不同的标准：1)是否来自受试者的样品中生物标志物的量高于参照值；2)是否特定细胞类型或特
定微囊泡(即，源自特定组织或器官的微囊泡)内的生物标志物的量高于参照值；或3)是否
带有一种或多种癌症特异性生物标志物的细胞、组织或微囊泡内生物标志物的量高于参照
值。如果生物标志物的量低于参照或与参照相同，可以应用相似的规则。该方法可以进一步
包括质量控制措施，使得如果样品满足质量控制措施，将结果提供给受试者。在一些实施方
式中，如果满足标准但质量控制有问题，则重新评价受试者。
的方法和/或组合物来检测或鉴别表型。在一些实施方式中，将至少一个标准用于每个生物
标志物。在一些实施方式中，使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、
90或至少100个标准。例如，当受试者诊断为癌症时，为了癌症的表征，可以使用多种不同的标准：1)是否来自受试者的样品中生物标志物的量高于参照值；2)是否特定细胞类型或特
定微囊泡(即，源自特定组织或器官的微囊泡)内的生物标志物的量高于参照值；或3)是否
带有一种或多种癌症特异性生物标志物的细胞、组织或微囊泡内生物标志物的量高于参照
值。如果生物标志物的量低于参照或与参照相同，可以应用相似的规则。该方法可以进一步
包括质量控制措施，使得如果样品满足质量控制措施，将结果提供给受试者。在一些实施方
式中，如果满足标准但质量控制有问题，则重新评价受试者。
[0141] 生物印记可以用于治疗相关的诊断中以提供可用于诊断疾病或选择正确的治疗方案的测试，如提供治疗诊断。治疗诊断包括提供影响疾病状态的疗法或治疗的能力的诊
断测试。治疗诊断测试以诊断或预后测试分别提供诊断或预后的相似方式提供诊断治疗。
如本文中使用的，治疗诊断包括任何所需形式的治疗相关测试，包括预测性医疗、个性化医
疗、综合医疗、药效诊断和Dx/Rx配对。治疗相关测试可以用于预测和评价个体受试者中的
药物反应，即，提供个性化医疗。预测药物反应可以确定受试者是否是候选治疗剂的可能响
应者或可能非响应者，例如，在受试者暴露于治疗或另外用治疗处理之前。评价药物反应可
以监测对药物的反应，例如，治疗开始后的一段时间内监测受试者的改善或改善的缺乏。治
疗相关的测试可用于选择特别可能得益于治疗的治疗受试者或提供个体受试者中治疗功
效的早期和客观的指示。因此，如本文中公开的生物印记可以指示应当改变治疗来选择更
有希望的治疗，由此避免延误有益治疗的巨大花费和避免施用无效药物的经济和病态成
本。
断测试。治疗诊断测试以诊断或预后测试分别提供诊断或预后的相似方式提供诊断治疗。
如本文中使用的，治疗诊断包括任何所需形式的治疗相关测试，包括预测性医疗、个性化医
疗、综合医疗、药效诊断和Dx/Rx配对。治疗相关测试可以用于预测和评价个体受试者中的
药物反应，即，提供个性化医疗。预测药物反应可以确定受试者是否是候选治疗剂的可能响
应者或可能非响应者，例如，在受试者暴露于治疗或另外用治疗处理之前。评价药物反应可
以监测对药物的反应，例如，治疗开始后的一段时间内监测受试者的改善或改善的缺乏。治
疗相关的测试可用于选择特别可能得益于治疗的治疗受试者或提供个体受试者中治疗功
效的早期和客观的指示。因此，如本文中公开的生物印记可以指示应当改变治疗来选择更
有希望的治疗，由此避免延误有益治疗的巨大花费和避免施用无效药物的经济和病态成
本。
[0142] 本发明的组合物和方法可用于鉴别或检测与多种疾病或障碍相关的生物印记，所述疾病或障碍包括但不限于心血管疾病、癌症、传染病、脓毒症、神经疾病、中枢神经系统相关疾病、血管内相关疾病和自身免疫相关疾病。治疗相关的诊断也有助于药物毒性、药物抗
性或药物反应的预测。治疗相关测试可以以任何合适的诊断测试形式来开发，所述形式包
括，但不限于例如，免疫组织化学测试、临床化学、免疫试验、基于细胞的技术、核酸测试或身体成像方法。治疗相关测试可以进一步包括，但不限于有助于确定治疗的测试、监控治疗
毒性或对治疗测试的反应的测试。因此，生物印记可以用于预测或监控受试者对治疗的反
应。可以在开始、停止或改变特定治疗后的不同时间点针对受试者测定生物印记。
性或药物反应的预测。治疗相关测试可以以任何合适的诊断测试形式来开发，所述形式包
括，但不限于例如，免疫组织化学测试、临床化学、免疫试验、基于细胞的技术、核酸测试或身体成像方法。治疗相关测试可以进一步包括，但不限于有助于确定治疗的测试、监控治疗
毒性或对治疗测试的反应的测试。因此，生物印记可以用于预测或监控受试者对治疗的反
应。可以在开始、停止或改变特定治疗后的不同时间点针对受试者测定生物印记。
[0143] 在一些实施方式中，本发明的组合物和方法提供用于基于生物印记的一种或多种组分(例如，目标生物标志物)的量的变化、特定生物印记的一种或多种组分的量或针对所
述组分检测的生物印记来进行关于受试者是否对治疗反应的确定或预测。在另一个实施方
式中，通过确定不同时间点的生物印记来监测受试者的病症。确定病症的进展、消退或复
发。可以在一段时间过程中测量对治疗的反应。因此，本发明提供了一种监测受试者的疾病
状态或其他医学病症的方法，包括分离或检测来自受试者的生物样品的生物印记，检测特
定生物印记的组分的总体量或检测一种或多种组分的生物印记(如，生物标志物的存在、不
存在或表达水平)。生物印记用于监测疾病或病症的状态。
述组分检测的生物印记来进行关于受试者是否对治疗反应的确定或预测。在另一个实施方
式中，通过确定不同时间点的生物印记来监测受试者的病症。确定病症的进展、消退或复
发。可以在一段时间过程中测量对治疗的反应。因此，本发明提供了一种监测受试者的疾病
状态或其他医学病症的方法，包括分离或检测来自受试者的生物样品的生物印记，检测特
定生物印记的组分的总体量或检测一种或多种组分的生物印记(如，生物标志物的存在、不
存在或表达水平)。生物印记用于监测疾病或病症的状态。
[0144] 还可以通过本发明的方法鉴别一个或多个新的生物印记。例如，可以从对药物治疗或治疗方案反应的受试者分离一种或多种囊泡并与参照(如，没有对药物治疗或治疗方
案反应的另一名受试者)进行比较。可以确定生物印记之间的差异并用于鉴别其他受试者
为对特定药物或治疗方案的响应者或非响应者。
案反应的另一名受试者)进行比较。可以确定生物印记之间的差异并用于鉴别其他受试者
为对特定药物或治疗方案的响应者或非响应者。
[0145] 在一些实施方式中，生物印记用于确定特定的疾病或病症对药物是否是抗性的，在这种情况中，医师不需要用这种药物治疗浪费有价值的时间。为了获得药物选择或治疗
方案的早期验证，针对获自受试者的样品测定生物印记。使用生物印记来评价特定受试者
的疾病是否具有与药物抗性相关的生物标志物。这样的测定能够使医生专注于关键的时间
以及患者的金融资源于有效治疗。
方案的早期验证，针对获自受试者的样品测定生物印记。使用生物印记来评价特定受试者
的疾病是否具有与药物抗性相关的生物标志物。这样的测定能够使医生专注于关键的时间
以及患者的金融资源于有效治疗。
[0146] 生物印记可以用于疾病如癌症的治疗诊断中，例如，鉴别患有疾病的受试者是否是对特定治疗的可能响应者或非响应者。所述方法可以用于治疗诊断癌症，包括本文中所
列的那些，例如，在以上的“表型”章节中。这些包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺
癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃的癌、黑色素瘤、骨癌、胃癌、乳腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其他实体肿瘤。
列的那些，例如，在以上的“表型”章节中。这些包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、混合小细胞/大细胞癌和复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺
癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃的癌、黑色素瘤、骨癌、胃癌、乳腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其他实体肿瘤。
[0147] 来自患有癌症的受试者的样品中循环生物标志物(包括与生物样品中存在的组分(例如，细胞、细胞碎片、细胞衍生的微囊泡)相关的标志物)的生物印记可以用于选择该受
试者的候选治疗。可以根据本文中提供的本发明的方法来确定生物印记。在一些实施方式
中，候选治疗包括用于癌症的标准治疗。治疗可以是癌症治疗，如放疗、外科手术、化疗或其组合。癌症治疗可以是治疗剂，如抗癌剂和化疗方案。用于本发明实施方式中的更多药物相
关性和规则在2007年5月18日提交的PCT/US2007/69286；2009年10月14日提交的PCT/
US2009/60630；2010年2月11日提交的PCT/2010/000407；2012年6月7日提交的PCT/US12/
41393；2013年12月4日提交的PCT/US2013/073184；2010年10月27日提交的PCT/US2010/
54366；2011年12月28日提交的PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的PCT/US15/13618和
2016年3月3日提交的PCT/US16/20657中找到；将所有申请各自全部按引用并入本文中。
试者的候选治疗。可以根据本文中提供的本发明的方法来确定生物印记。在一些实施方式
中，候选治疗包括用于癌症的标准治疗。治疗可以是癌症治疗，如放疗、外科手术、化疗或其组合。癌症治疗可以是治疗剂，如抗癌剂和化疗方案。用于本发明实施方式中的更多药物相
关性和规则在2007年5月18日提交的PCT/US2007/69286；2009年10月14日提交的PCT/
US2009/60630；2010年2月11日提交的PCT/2010/000407；2012年6月7日提交的PCT/US12/
41393；2013年12月4日提交的PCT/US2013/073184；2010年10月27日提交的PCT/US2010/
54366；2011年12月28日提交的PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的PCT/US15/13618和
2016年3月3日提交的PCT/US16/20657中找到；将所有申请各自全部按引用并入本文中。
[0148] 生物标志物
[0149] 本发明的方法和组合物可以用于试验中以检测一种或多种目标生物标志物的存在或水平。考虑到本发明的可适应性质，生物标志物可以是任何有用的生物标志物，包括本
文中或文献中公开的或待发现的那些。在一个实施方式中，生物标志物包括蛋白质或多肽。
如本文中使用的，“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用，除非另外指出。生物标志物可以是核酸，包括DNA、RNA和本文中公开的或本领域已知的其任一种的各种亚类。生物标志物可以
包含脂质。生物标志物可以包含碳水化合物。生物标志物还可以是复合物，例如，包含蛋白
质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一些实施方式中，生物标志物包含微囊泡。在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中在不知道适体集合的每个成员靶向的精确
微囊泡抗原的情况下将适体集合用于评价目标微囊泡群体的存在和/或水平。参见，例如，
图10B-C。在其他情况中，根据本发明的方法来评价与微囊泡相关的生物标志物。参见，例
如，图10A。本发明的寡核苷酸集合也可以用于评价细胞和组织，无论单个寡核苷酸适体的
靶生物标志物是否是已知的。本发明还包括确定这种寡核苷酸适体集合及其成员的靶标。
参见实施例19-31。
文中或文献中公开的或待发现的那些。在一个实施方式中，生物标志物包括蛋白质或多肽。
如本文中使用的，“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用，除非另外指出。生物标志物可以是核酸，包括DNA、RNA和本文中公开的或本领域已知的其任一种的各种亚类。生物标志物可以
包含脂质。生物标志物可以包含碳水化合物。生物标志物还可以是复合物，例如，包含蛋白
质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一些实施方式中，生物标志物包含微囊泡。在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中在不知道适体集合的每个成员靶向的精确
微囊泡抗原的情况下将适体集合用于评价目标微囊泡群体的存在和/或水平。参见，例如，
图10B-C。在其他情况中，根据本发明的方法来评价与微囊泡相关的生物标志物。参见，例
如，图10A。本发明的寡核苷酸集合也可以用于评价细胞和组织，无论单个寡核苷酸适体的
靶生物标志物是否是已知的。本发明还包括确定这种寡核苷酸适体集合及其成员的靶标。
参见实施例19-31。
[0150] 生物印记可以包含一种类型的生物标志物或多种类型的生物标志物。作为非限制性实例，生物印记可以包含多种蛋白质、多种核酸、多种脂质、多种碳水化合物、多种生物标志物复合物、多种微囊泡或其任意的组合。例如，生物印记可以包含一种或多种微囊泡、一
种或多种蛋白质和一种或多种微RNA，其中在合适的情况下，一种或多种蛋白质和/或一种
或多种微RNA任选与作为表面抗原和/或有效负载的微囊泡相关。作为另一实例，生物印记
可以是寡核苷酸集合印记，且寡核苷酸集合的成员可以与各种生物标志物或多种类型的生
物标志物相关。
种或多种蛋白质和一种或多种微RNA，其中在合适的情况下，一种或多种蛋白质和/或一种
或多种微RNA任选与作为表面抗原和/或有效负载的微囊泡相关。作为另一实例，生物印记
可以是寡核苷酸集合印记，且寡核苷酸集合的成员可以与各种生物标志物或多种类型的生
物标志物相关。
[0151] 在一些实施方式中，微囊泡使用囊泡表面抗原来检测。通常表达的囊泡表面抗原可以称为“管家蛋白”或一般囊泡生物标志物。生物标志物可以为CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜联蛋白V或MFG-E8。四跨膜蛋白，具有四个跨膜结构域的膜蛋白家族，可用作一般囊泡生物标志物。四跨膜蛋白包括CD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9和CD63。哺乳动物中已经鉴定了超过30种四跨膜蛋白，其包括TSPAN1(TSP-1)、TSPAN2(TSP-2)、TSPAN3
(TSP-3)、TSPAN4(TSP-4、NAG-2)、TSPAN5(TSP-5)、TSPAN6(TSP-6)、TSPAN7(CD231、TALLA-1、A15)、TSPAN8(CO-029)、TSPAN9(NET-5)、TSPAN10(视素蛋白(Oculospanin))、TSPAN11
(CD151-样)、TSPAN12(NET-2)、TSPAN13(NET-6)、TSPAN14、TSPAN15(NET-7)、TSPAN16(TM4-B)、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20(UP1b、UPK1B)、TSPAN21(UP1a、UPK1A)、TSPAN22(RDS、PRPH2)、TSPAN23(ROM1)、TSPAN24(CD151)、TSPAN25(CD53)、TSPAN26(CD37)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28(CD81)、TSPAN29(CD9)、TSPAN30(CD63)、TSPAN31(SAS)、TSPAN32(TSSC6)、TSPAN33和TSPAN34。其它通常观察到的囊泡标志物包括表3中列出的那些。这些蛋白质中的
一种或多种可以是使用所述方法和组合物来表征表型的有用的生物标志物。
(TSP-3)、TSPAN4(TSP-4、NAG-2)、TSPAN5(TSP-5)、TSPAN6(TSP-6)、TSPAN7(CD231、TALLA-1、A15)、TSPAN8(CO-029)、TSPAN9(NET-5)、TSPAN10(视素蛋白(Oculospanin))、TSPAN11
(CD151-样)、TSPAN12(NET-2)、TSPAN13(NET-6)、TSPAN14、TSPAN15(NET-7)、TSPAN16(TM4-B)、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20(UP1b、UPK1B)、TSPAN21(UP1a、UPK1A)、TSPAN22(RDS、PRPH2)、TSPAN23(ROM1)、TSPAN24(CD151)、TSPAN25(CD53)、TSPAN26(CD37)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28(CD81)、TSPAN29(CD9)、TSPAN30(CD63)、TSPAN31(SAS)、TSPAN32(TSSC6)、TSPAN33和TSPAN34。其它通常观察到的囊泡标志物包括表3中列出的那些。这些蛋白质中的
一种或多种可以是使用所述方法和组合物来表征表型的有用的生物标志物。
[0152] 表3：来自多种细胞类型的囊泡中观察到的蛋白质
[0153]
[0154]
[0155] 可以通过所述的方法和组合物来使用和/或评价本文中所述的任一种类型的生物标志物。示例性生物标志物包括但不限于表4中的那些。标志物可以按照需要作为蛋白质、
RNA或DNA来检测，其可以自由循环或处于与其他生物分子的复合物中。在需要时，表4中的
标志物也可以用于检测肿瘤组织或者用于捕获和/或检测囊泡以用于表征如本文中公开的
表型。在一些情况中，使用多种捕获剂和/或检测剂来增强表征。可以作为囊泡表面抗原和/
或囊泡有效负载来检测标志物。“说明性类别”表明标志物是已知标志物的指示。本领域技
术人员将认识到，在特定的情况中，标志物也可以用于替代的设置中。例如，可用于表征一
种类型疾病的标志物也可以适当地用于表征另一种疾病。考虑了可以用作针对来自不同世
系的肿瘤的生物标志物的肿瘤标志物的非限制性实例。表3和4或整个说明书中提及的生物
标志物是本领域常用的那些。基因别名和描述可使用多种在线数据库找到，其包括
(www.genecards.org)、HUGO Gene Nomenclature(www.genenames.org)、
Entrez Gene(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene)、UniProtKB/Swiss-
Prot(www.uniprot.org)、UniProtKB/TrEMBL(www.uniprot.org)、OMIM
(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)、GeneLoc
(genecards.weizmann.ac.il/geneloc/)以及Ensembl(www.ensembl.org)。一般地，下文的
基因代号和名称对应于HUGU所核准的代号和名称，并且蛋白质名称是由UniProtKB/Swiss-
Prot推荐的名称。还提供了常用代称。在蛋白质名称指示前体的情况中，也暗示成熟蛋白
质。在本申请的全文中，基因和蛋白质代号可互换地使用并且其含义在必要时可从上下文
推知。
RNA或DNA来检测，其可以自由循环或处于与其他生物分子的复合物中。在需要时，表4中的
标志物也可以用于检测肿瘤组织或者用于捕获和/或检测囊泡以用于表征如本文中公开的
表型。在一些情况中，使用多种捕获剂和/或检测剂来增强表征。可以作为囊泡表面抗原和/
或囊泡有效负载来检测标志物。“说明性类别”表明标志物是已知标志物的指示。本领域技
术人员将认识到，在特定的情况中，标志物也可以用于替代的设置中。例如，可用于表征一
种类型疾病的标志物也可以适当地用于表征另一种疾病。考虑了可以用作针对来自不同世
系的肿瘤的生物标志物的肿瘤标志物的非限制性实例。表3和4或整个说明书中提及的生物
标志物是本领域常用的那些。基因别名和描述可使用多种在线数据库找到，其包括
(www.genecards.org)、HUGO Gene Nomenclature(www.genenames.org)、
Entrez Gene(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝gene)、UniProtKB/Swiss-
Prot(www.uniprot.org)、UniProtKB/TrEMBL(www.uniprot.org)、OMIM
(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝OMIM)、GeneLoc
(genecards.weizmann.ac.il/geneloc/)以及Ensembl(www.ensembl.org)。一般地，下文的
基因代号和名称对应于HUGU所核准的代号和名称，并且蛋白质名称是由UniProtKB/Swiss-
Prot推荐的名称。还提供了常用代称。在蛋白质名称指示前体的情况中，也暗示成熟蛋白
质。在本申请的全文中，基因和蛋白质代号可互换地使用并且其含义在必要时可从上下文
推知。
[0156] 表4.说明性生物标志物
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169] 可以结合至本发明的方法和组合物中的另外的生物标志物的实例包括但不限于2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年12月12日提交的PCT/
US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/
US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中公开的那些；该申请各自通过引用
全文并入。
US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/
US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中公开的那些；该申请各自通过引用
全文并入。
[0170] 在本发明的各种实施方式中，用于检测或评价本文中公开的任何病症或疾病的生物标志物或生物印记可以包括几种不同标志物类别之一的一种或多种生物标志物，其中所
述类别包括但不限于以下的一种或多种：1)疾病特异性生物标志物；2)细胞-或组织-特异
性生物标志物；3)囊泡-特异性标志物(例如，一般囊泡生物标志物)；4)血管生成特异性生
物标志物；和5)免疫调节生物标志物。所有这样的标志物的实例在本文中公开了并且是本
领域普通技术人员已知的。此外，本领域中已知的表征为在特定的疾病或病症中具有作用
的生物标志物可适应于用作本发明的组合物和方法中的靶标。在进一步的实施方式中，这
类目标生物标志物可以是细胞或囊泡表面标志物，或者表面标志物和可溶性或有效负载标
志物(即，由微囊泡包裹的分子)的组合。所评价的生物标志物可以来自组合来源。例如，可
以通过评价蛋白质、核酸、囊泡、循环生物标志物、来自组织样品的生物标志物等的组合来
检测或表征疾病或障碍。此外，如本文中所述的，评价的生物样品可以是任何生物流体，或
可以包含此类生物流体内存在的单个组分(例如，囊泡、核酸、蛋白质或其复合物)。
述类别包括但不限于以下的一种或多种：1)疾病特异性生物标志物；2)细胞-或组织-特异
性生物标志物；3)囊泡-特异性标志物(例如，一般囊泡生物标志物)；4)血管生成特异性生
物标志物；和5)免疫调节生物标志物。所有这样的标志物的实例在本文中公开了并且是本
领域普通技术人员已知的。此外，本领域中已知的表征为在特定的疾病或病症中具有作用
的生物标志物可适应于用作本发明的组合物和方法中的靶标。在进一步的实施方式中，这
类目标生物标志物可以是细胞或囊泡表面标志物，或者表面标志物和可溶性或有效负载标
志物(即，由微囊泡包裹的分子)的组合。所评价的生物标志物可以来自组合来源。例如，可
以通过评价蛋白质、核酸、囊泡、循环生物标志物、来自组织样品的生物标志物等的组合来
检测或表征疾病或障碍。此外，如本文中所述的，评价的生物样品可以是任何生物流体，或
可以包含此类生物流体内存在的单个组分(例如，囊泡、核酸、蛋白质或其复合物)。
[0171] 生物标志物检测
[0172] 本发明的组合物和方法可用于测定生物样品中任何有用的生物标志物以用于表征与样品相关的表型。这样的生物标志物包括所有种类的生物实体如蛋白质、核酸、脂质、
碳水化合物、其任意的复合物以及微囊泡。
碳水化合物、其任意的复合物以及微囊泡。
[0173] 本发明的适体可用于提供组织或体液中的生物印记，例如，通过评价其中的各种生物标志物。参见，例如，图10B-C。本发明的适体还可以用于评价它们的特异性靶标分子的水平或存在。参见，例如，图10A。此外，本发明的适体用于捕获或分离在具有适体的靶标分子存在的生物样品中存在的组分。例如，如果给定的表面抗原存在于细胞、细胞片段或细胞
衍生的胞外囊泡上，生物标志物的结合剂，包括但不限于本发明提供的适体，可以用于捕获
或分离细胞、细胞片段或细胞衍生的胞外囊泡。参见，例如，图1A-1B，10A。此类捕获的或分离的实体可以进一步表征来评价另外的表面抗原或内部“有效负载”分子，例如，核酸分子、脂质、糖类、多肽或其功能性片段，或另外存在于细胞环境中的可以用作生物标志物的任何
物质。因此，本发明的适体不仅用于评价一种或多种目标表面抗原，而且也用于分离生物样
品中存在的组分，其中组分本身可以包含在生物印记内。
衍生的胞外囊泡上，生物标志物的结合剂，包括但不限于本发明提供的适体，可以用于捕获
或分离细胞、细胞片段或细胞衍生的胞外囊泡。参见，例如，图1A-1B，10A。此类捕获的或分离的实体可以进一步表征来评价另外的表面抗原或内部“有效负载”分子，例如，核酸分子、脂质、糖类、多肽或其功能性片段，或另外存在于细胞环境中的可以用作生物标志物的任何
物质。因此，本发明的适体不仅用于评价一种或多种目标表面抗原，而且也用于分离生物样
品中存在的组分，其中组分本身可以包含在生物印记内。
[0174] 本发明的方法可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同生物标志物的多重分析。寡核苷酸集合可以包含多种可以靶向不同生物标志物的单个适体。作为另
一实例，分析可以用多种差异标记的颗粒来进行。可以存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种差异标记的颗粒。颗粒可以是外部标记的，如使用标签，或它们可以是内在标记的。各种差异标记的颗粒可以与捕获剂(如抗体或
适体)偶联，或可用于捕获其靶标。可以选择多种捕获剂来表征目标表型，包括针对一般囊
泡生物标志物、细胞来源特异性标志物和疾病标志物的捕获剂。一种或多种捕获的生物标
志物可以通过多种结合剂来检测。结合剂可以直接标记来帮助检测。或者，结合剂通过第二
试剂来标记。例如，结合剂可以是针对生物标志物的抗体或适体，其中结合剂与生物素连
接。第二试剂包含连接于受体的链霉亲和素，并且可以加入以检测生物标志物。在一些实施
方式中，针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同生物标志物来分析捕获的囊泡。例如，多种检测剂，即捕获的囊泡或囊泡群体的多种
生物标志物的检测，可以提高所获得的信号，允许提高的灵敏度、特异性或两者，并且允许
使用较少量的样品。检测可以使用超过一种生物标志物，包括但不限于如表3-4和表10-17
中的超过一种囊泡标志物。
一实例，分析可以用多种差异标记的颗粒来进行。可以存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种差异标记的颗粒。颗粒可以是外部标记的，如使用标签，或它们可以是内在标记的。各种差异标记的颗粒可以与捕获剂(如抗体或
适体)偶联，或可用于捕获其靶标。可以选择多种捕获剂来表征目标表型，包括针对一般囊
泡生物标志物、细胞来源特异性标志物和疾病标志物的捕获剂。一种或多种捕获的生物标
志物可以通过多种结合剂来检测。结合剂可以直接标记来帮助检测。或者，结合剂通过第二
试剂来标记。例如，结合剂可以是针对生物标志物的抗体或适体，其中结合剂与生物素连
接。第二试剂包含连接于受体的链霉亲和素，并且可以加入以检测生物标志物。在一些实施
方式中，针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同生物标志物来分析捕获的囊泡。例如，多种检测剂，即捕获的囊泡或囊泡群体的多种
生物标志物的检测，可以提高所获得的信号，允许提高的灵敏度、特异性或两者，并且允许
使用较少量的样品。检测可以使用超过一种生物标志物，包括但不限于如表3-4和表10-17
中的超过一种囊泡标志物。
[0175] 基于免疫分析的方法(例如，夹心分析)可以用于目标生物标志物。实例包括ELISA。结合剂可以结合于孔。例如，结合剂(如目标生物标志物的适体或抗体)可以连接于
孔。可以基于本文中所述的方法来检测捕获的生物标志物。图1A显示了用于夹心类型的免
疫分析的说明性示意图。捕获剂可以是针对细胞或囊泡抗原。在图中，使用针对目标抗原的
荧光标记结合剂(检测剂)来检测捕获的实体。可以使用多种捕获结合剂，例如，在阵列上的
可区分地址或免疫分析平板的不同孔中。检测结合剂可以是针对与捕获结合剂相同的抗
原，或可以针对其他标志物。捕获结合剂可以是任何有用的结合剂，例如，栓系的适体、抗体或凝集素，和/或检测抗体可以相似地用例如可检测的(例如，标记的)适体、抗体、凝集素或其他结合蛋白或实体来取代。
孔。可以基于本文中所述的方法来检测捕获的生物标志物。图1A显示了用于夹心类型的免
疫分析的说明性示意图。捕获剂可以是针对细胞或囊泡抗原。在图中，使用针对目标抗原的
荧光标记结合剂(检测剂)来检测捕获的实体。可以使用多种捕获结合剂，例如，在阵列上的
可区分地址或免疫分析平板的不同孔中。检测结合剂可以是针对与捕获结合剂相同的抗
原，或可以针对其他标志物。捕获结合剂可以是任何有用的结合剂，例如，栓系的适体、抗体或凝集素，和/或检测抗体可以相似地用例如可检测的(例如，标记的)适体、抗体、凝集素或其他结合蛋白或实体来取代。
[0176] 在一个实施方式中，对于一般囊泡生物标志物、细胞来源标志物和/或疾病标志物的一种或多种捕获剂连同针对一般囊泡生物标志物(如四跨膜蛋白分子，包括但不限于
CD9、CD63和CD81中的一个或多个，或本文的表3中的其他标志物)的检测剂一起使用。微囊
泡表面抗原的实例在本文中公开，例如，在表3-4和10-17中。进一步的生物标志物和检测技
术公开于2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年11月12日提
交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的
PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年6月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；2015年11月23日提交
的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632；该申请各自通过引入全文并入本文。
CD9、CD63和CD81中的一个或多个，或本文的表3中的其他标志物)的检测剂一起使用。微囊
泡表面抗原的实例在本文中公开，例如，在表3-4和10-17中。进一步的生物标志物和检测技
术公开于2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年11月12日提
交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的
PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年6月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；2015年11月23日提交
的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632；该申请各自通过引入全文并入本文。
[0177] 使用本发明的适体检测生物标志物或捕获样品组分的技术包括使用平面基质如阵列(例如，生物芯片或微阵列)，使得固定于基质上分子作为促进特定生物印记的检测的
捕获剂。阵列可以作为用于分析一种或多种生物标志物的试剂盒的部分来提供。本发明的
适体可以包括在用于疾病(包括症状前疾病)检测和诊断的阵列中。在一些实施方式中，阵
列包括包含选择来特异性鉴别目标生物标志物的生物分子的定制阵列。定制的阵列可以进
行修饰以检测提高统计学性能的生物标志物，例如，导致多变量预测模型(例如，逻辑回归、判别分析或回归树模型)中提高的交叉验证误差率的鉴别生物印记的额外生物分子。在一
些实施方式中，构建定制阵列来研究疾病、病症或症状的生物学和对限定的生理状态中的
生物印记分型。可以基于统计学标准来选择用于包括在定制阵列上的标志物，例如，在表型
或生理状态之间的区分中具有所需的统计学显著性水平。在一些实施方式中，选择p-值＝
0.05的标准显著性以排除或包括在微阵列上的生物分子。可以针对多重比较来校正p-值。
作为说明性实例，从来自患病或未患病受试者的样品提取的核酸可以与结合数千基因序列
的高密度微阵列杂交。可以选择患病或未患病样品之间水平显著不同的核酸作为生物标志
物来区分患病或非患病的样品。可以构建定制阵列来检测选定的生物标志物。在一些实施
方式中，定制阵列包括低密度微阵列，其是指具有较少数量的可寻址结合剂的阵列，例如，
数十或数百而不是数千。可以在基质上形成低密度阵列。在一些实施方式中，定制的低密度
阵列在平板孔中使用PCR扩增，例如， 基因表达分析(Applied Biosystems by
Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)。
捕获剂。阵列可以作为用于分析一种或多种生物标志物的试剂盒的部分来提供。本发明的
适体可以包括在用于疾病(包括症状前疾病)检测和诊断的阵列中。在一些实施方式中，阵
列包括包含选择来特异性鉴别目标生物标志物的生物分子的定制阵列。定制的阵列可以进
行修饰以检测提高统计学性能的生物标志物，例如，导致多变量预测模型(例如，逻辑回归、判别分析或回归树模型)中提高的交叉验证误差率的鉴别生物印记的额外生物分子。在一
些实施方式中，构建定制阵列来研究疾病、病症或症状的生物学和对限定的生理状态中的
生物印记分型。可以基于统计学标准来选择用于包括在定制阵列上的标志物，例如，在表型
或生理状态之间的区分中具有所需的统计学显著性水平。在一些实施方式中，选择p-值＝
0.05的标准显著性以排除或包括在微阵列上的生物分子。可以针对多重比较来校正p-值。
作为说明性实例，从来自患病或未患病受试者的样品提取的核酸可以与结合数千基因序列
的高密度微阵列杂交。可以选择患病或未患病样品之间水平显著不同的核酸作为生物标志
物来区分患病或非患病的样品。可以构建定制阵列来检测选定的生物标志物。在一些实施
方式中，定制阵列包括低密度微阵列，其是指具有较少数量的可寻址结合剂的阵列，例如，
数十或数百而不是数千。可以在基质上形成低密度阵列。在一些实施方式中，定制的低密度
阵列在平板孔中使用PCR扩增，例如， 基因表达分析(Applied Biosystems by
Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)。
[0178] 本发明的适体或其他有用的结合剂可以直接或间接连接于固体表面或基质。固体表面或基质可以是结合剂可以直接或间接地与其连接的任何物理上可分离的固体，包括但
不限于，微阵列和孔所提供的表面、颗粒如珠子、柱、光纤、拭子、玻璃和改性或功能化的玻璃、石英、云母、重氮化的膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、涂敷的珠或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒；塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆材料等)、多糖、尼龙或硝基纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚的聚合物)；微结构或纳米结构化的表面，如核酸铺盖的阵列、纳米管、纳米线或者纳米颗粒装饰的表面；或者多孔表
面或凝胶，如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维状或链状聚合物。此外，如本领域中已知的，可以使用具有多种材质(包括聚合物如右旋糖苷、丙烯酰
胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化的涂层来涂敷基底。这些涂层可以有助于将阵列用
于生物样品。
不限于，微阵列和孔所提供的表面、颗粒如珠子、柱、光纤、拭子、玻璃和改性或功能化的玻璃、石英、云母、重氮化的膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、涂敷的珠或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒；塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆材料等)、多糖、尼龙或硝基纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚的聚合物)；微结构或纳米结构化的表面，如核酸铺盖的阵列、纳米管、纳米线或者纳米颗粒装饰的表面；或者多孔表
面或凝胶，如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维状或链状聚合物。此外，如本领域中已知的，可以使用具有多种材质(包括聚合物如右旋糖苷、丙烯酰
胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化的涂层来涂敷基底。这些涂层可以有助于将阵列用
于生物样品。
[0179] 适体或其它有用的结合剂可以与可检测实体或标记偶联。合适的标记包括但不限于磁性标记、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶体颗粒、聚合染料颗粒、色素分子、色素颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其他纳米颗粒(包括量子点或金颗
粒)、荧光团、量子点或放射性标记。蛋白质标记包括绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)；和发光蛋白，如荧光素酶，如下所述。放射性标记包括但不限于放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、
124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。荧光标记包括但不限于稀土螯合物(例如，铕螯合物)，罗丹明；荧光素类，包括但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括但不限于TAMRA；丹酰；丽丝胺(Lissamine)；花青素；藻红蛋白；德克萨斯红；Cy3、Cy5、
dapoxyl、NBD、Cadcade黄、丹酰、PyMPO、芘、7-二乙基氨基香豆素3-羧酸和其他香豆素衍生物、Marina BlueTM、Pacific BlueTM、Cascade BlueTM、2-蒽磺酰、PyMPO、3，4，9，10-二萘嵌苯-四羧酸、2，7-二氟荧光素(Oregon GreenTM 488-X)、5-羧基荧光素、Texas RedTM-X、
Alexa Fluor 430、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、
BODIPY FL、bimane和Alexa Fluor 350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、
633、647、660、680、700和750，及其衍生物，以及其它。参见，例如，“The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies”，第10版，可在互联网
probes.invitrogen.com/handbook上获得。荧光标记物可以是FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、
dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540和LIZ中的一种或多种。
粒)、荧光团、量子点或放射性标记。蛋白质标记包括绿色荧光蛋白(GFP)及其变体(例如，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白)；和发光蛋白，如荧光素酶，如下所述。放射性标记包括但不限于放射性同位素(放射性核素)，如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、
124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。荧光标记包括但不限于稀土螯合物(例如，铕螯合物)，罗丹明；荧光素类，包括但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括但不限于TAMRA；丹酰；丽丝胺(Lissamine)；花青素；藻红蛋白；德克萨斯红；Cy3、Cy5、
dapoxyl、NBD、Cadcade黄、丹酰、PyMPO、芘、7-二乙基氨基香豆素3-羧酸和其他香豆素衍生物、Marina BlueTM、Pacific BlueTM、Cascade BlueTM、2-蒽磺酰、PyMPO、3，4，9，10-二萘嵌苯-四羧酸、2，7-二氟荧光素(Oregon GreenTM 488-X)、5-羧基荧光素、Texas RedTM-X、
Alexa Fluor 430、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA)、
BODIPY FL、bimane和Alexa Fluor 350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、
633、647、660、680、700和750，及其衍生物，以及其它。参见，例如，“The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies”，第10版，可在互联网
probes.invitrogen.com/handbook上获得。荧光标记物可以是FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、
dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540和LIZ中的一种或多种。
[0180] 使用常规技术，适体可以直接或间接标记。在非限制性实例中，标记通过生物素-链霉亲和素/抗生物素蛋白化学连接于适体。(例如，合成的生物素化适体，其然后能够结合
本身与可检测标记偶联的链霉亲和素分子；非限制性实例是藻红蛋白偶联的链霉亲和素
(SAPE))。使用多步骤程序的化学偶联方法包括生物素化、使用例如这些化合物的琥珀酰亚
胺酯三硝基苯酚(TNP)或地高辛的偶联。例如，可以通过使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚
胺来完成生物素化。琥珀酰亚胺基团在高于7的pH值下与氨基有效地反应，并且优选在约pH
8.0和约pH 8.5之间。标记可以包括第二标记系统。作为非限制性的实例，适体可以与生物
素或地高辛偶联。靶标结合的适体可以分别使用链霉亲和素/抗生物素蛋白或抗-地高辛抗
体检测。
本身与可检测标记偶联的链霉亲和素分子；非限制性实例是藻红蛋白偶联的链霉亲和素
(SAPE))。使用多步骤程序的化学偶联方法包括生物素化、使用例如这些化合物的琥珀酰亚
胺酯三硝基苯酚(TNP)或地高辛的偶联。例如，可以通过使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚
胺来完成生物素化。琥珀酰亚胺基团在高于7的pH值下与氨基有效地反应，并且优选在约pH
8.0和约pH 8.5之间。标记可以包括第二标记系统。作为非限制性的实例，适体可以与生物
素或地高辛偶联。靶标结合的适体可以分别使用链霉亲和素/抗生物素蛋白或抗-地高辛抗
体检测。
[0181] 各种酶-底物标记也可以结合本发明的组合物或方法来使用。这样的酶-底物标记可商业获得(例如，美国专利No.4,275,149)。酶通常催化发色底物的化学改变，其可以使用
各种技术来测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以通过分光光度法来测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和
细菌荧光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌
酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶
(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的实例包括，但不限于使用过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前
体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；使用对硝基苯基磷酸酯作为发色底物的碱性磷酸酶(AP)；以及使用发色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)
或发荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
各种技术来测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以通过分光光度法来测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和
细菌荧光素酶；美国专利No.4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌
酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶
(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的实例包括，但不限于使用过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRP)，其中过氧化氢酶氧化染料前
体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；使用对硝基苯基磷酸酯作为发色底物的碱性磷酸酶(AP)；以及使用发色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)
或发荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
[0182] 适体可以连接于基质，如平面基质。平面阵列通常含有阵列形式的生物分子的可寻址位置(例如，小块(pads)、地址或微-位置)。阵列的大小将取决于阵列的组成和最终用
途。可以制得含有2个不同分子至数千分子的阵列。通常，阵列包含两个至多如100,000个或
更多个分子，这取决于阵列的最终用途和制造方法。与本发明一起使用的微阵列包括至少
一个鉴别或捕获目标生物印记中存在的生物标志物的生物分子，例如，构成生物印记的细
胞、微RNA或其他生物分子或囊泡。在一些阵列中，使用多个基质，其具有不同或相同的组
成。因此，平面阵列可以包含多个较小的基质。
途。可以制得含有2个不同分子至数千分子的阵列。通常，阵列包含两个至多如100,000个或
更多个分子，这取决于阵列的最终用途和制造方法。与本发明一起使用的微阵列包括至少
一个鉴别或捕获目标生物印记中存在的生物标志物的生物分子，例如，构成生物印记的细
胞、微RNA或其他生物分子或囊泡。在一些阵列中，使用多个基质，其具有不同或相同的组
成。因此，平面阵列可以包含多个较小的基质。
[0183] 本发明可以利用许多类型的阵列用于检测生物标志物，例如，与目标生物印记相关的生物标志物。有用的阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列，如cDNA微阵列、寡核苷酸
微阵列和SNP微阵列、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(也称为转染微阵列)、化学化合物微阵列和碳水化合物阵列(糖阵列)。以上更详细地描述了这
些阵列。在一些实施方式中，微阵列包含提供高密度固定化识别分子(例如，适体或抗体)阵
列的生物芯片，其中间接地(例如，通过荧光)监测生物标志物的结合。
微阵列和SNP微阵列、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(也称为转染微阵列)、化学化合物微阵列和碳水化合物阵列(糖阵列)。以上更详细地描述了这
些阵列。在一些实施方式中，微阵列包含提供高密度固定化识别分子(例如，适体或抗体)阵
列的生物芯片，其中间接地(例如，通过荧光)监测生物标志物的结合。
[0184] 可以根据美国专利No.6,329,209；6,365,418；6,406,921；6,475,808；和6,475,809以及美国专利申请系列No.10/884,269中所述的方法来制得可以用于检测生物印记的
包含一种或多种本发明的适体的阵列或微阵列，其各自全部按引用并入本文中。可以使用
这些专利中所述的方法来制得检测特定选择的定制阵列。商业可购得的微阵列也可以用于
进行本发明的方法，包括但不限于来自Affymetrix(Santa Clara，CA)、Illumina(San
Diego，CA)、Agilent(Santa Clara，CA)、Exiqon(Denmark)或Invitrogen(Carlsbad，CA)的那些。如本文中所述的，定制和/或商业阵列包括用于检测蛋白质、核酸及其他生物分子和
实体(例如，细胞、囊泡、virii)的阵列。
包含一种或多种本发明的适体的阵列或微阵列，其各自全部按引用并入本文中。可以使用
这些专利中所述的方法来制得检测特定选择的定制阵列。商业可购得的微阵列也可以用于
进行本发明的方法，包括但不限于来自Affymetrix(Santa Clara，CA)、Illumina(San
Diego，CA)、Agilent(Santa Clara，CA)、Exiqon(Denmark)或Invitrogen(Carlsbad，CA)的那些。如本文中所述的，定制和/或商业阵列包括用于检测蛋白质、核酸及其他生物分子和
实体(例如，细胞、囊泡、virii)的阵列。
[0185] 在一些实施方式中，将多个捕获分子布置在阵列上，例如，蛋白质、肽或另外的核酸分子。在特定的实施方式中，蛋白质使用最小化蛋白质变性、最小化蛋白质活性改变或最
小化蛋白质与其固定的表面之间的相互作用的方法和材料来固定。捕获分子可以包含本发
明的一种或多种适体。在一个实施方式中，构建阵列用于适体集合的杂交。然后阵列可以用
于鉴别结合样品的集合成员，由此促进表型的表征。更多细节参见图10B-10C以及相关公开
内容。
小化蛋白质与其固定的表面之间的相互作用的方法和材料来固定。捕获分子可以包含本发
明的一种或多种适体。在一个实施方式中，构建阵列用于适体集合的杂交。然后阵列可以用
于鉴别结合样品的集合成员，由此促进表型的表征。更多细节参见图10B-10C以及相关公开
内容。
[0186] 有用的阵列表面可以是任何所需的性状、形式或大小。表面的非限制性实例包括芯片、连续表面、曲面、柔性表面、薄膜、平板、薄层或管。表面可以具有大约一平方微米至大
2
约500cm范围的面积。表面的面积、长度和宽度可以根据待进行的分析的要求而改变。考虑
的因素可以包括，例如，操作简易性、形成表面的材料的限制、检测系统的要求、沉积系统
(例如，点样仪(arrayer))的要求等。
2
约500cm范围的面积。表面的面积、长度和宽度可以根据待进行的分析的要求而改变。考虑
的因素可以包括，例如，操作简易性、形成表面的材料的限制、检测系统的要求、沉积系统
(例如，点样仪(arrayer))的要求等。
[0187] 在某些实施方式中，希望使用物理方式来分离结合岛或固定生物分子的组或阵列：这样的物理分离有助于将不同的组或阵列暴露于不同的目标溶液。因此，在某些实施方
式中，将阵列安置在具有许多孔的微孔平板中。在这样的实施方式中，孔的底部可以作为用
于形成阵列的表面，或可以在其他表面上形成阵列和然后放入孔中。在某些实施方式中，如
使用没有孔的表面的情况中，可以形成结合岛或可以将分子固定于具有空间排列孔的表面
和衬垫上，使得它们对应于岛，或者生物分子可以置于表面上。这样的衬垫优选是液体不能
透过的。衬垫可以在制备阵列的过程中的任何时间放置在表面上，并且如果不再需要组或
阵列的分离，可以将其除去。
式中，将阵列安置在具有许多孔的微孔平板中。在这样的实施方式中，孔的底部可以作为用
于形成阵列的表面，或可以在其他表面上形成阵列和然后放入孔中。在某些实施方式中，如
使用没有孔的表面的情况中，可以形成结合岛或可以将分子固定于具有空间排列孔的表面
和衬垫上，使得它们对应于岛，或者生物分子可以置于表面上。这样的衬垫优选是液体不能
透过的。衬垫可以在制备阵列的过程中的任何时间放置在表面上，并且如果不再需要组或
阵列的分离，可以将其除去。
[0188] 在一些实施方式中，固定的分子可以结合接触固定分子的生物样品中存在的一种或多种生物标志物。接触样品通常包括将样品覆盖在阵列上。
[0189] 可以使用本领域已知的检测技术来检测溶液中的或阵列上固定的分子的修饰或结合。这样的技术的实例包括免疫技术，如竞争性结合分析和夹心分析；使用如共焦扫描
仪、共焦显微镜或基于CCD的系统的仪器以及如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移
(FRET)、全内反射荧光(TIRE)、荧光相关频谱(FCS)的技术的荧光检测；比色/分光测定技
术；表面等离子体共振(通过其测量表面处吸附的材料的质量变化)；使用放射性同位素的
技术，包括常规的放射性同位素结合和闪烁迫近分析(SPA)；质谱，如基质辅助激光解吸/电
离质谱(MALDI)和MALDI-飞行时间(TOF)质谱；椭圆光度法，其是测量蛋白质膜厚度的光学
方法；石英晶体微量天秤(QCM)，一种非常灵敏的用于测量吸附于表面的物质质量的方法；
扫描探针显微术，如原子力显微术(AFM)、扫描力显微术(SFM)或扫描电子显微术(SEM)；以
及如电化学、阻抗、声学、微波和IR/Raman检测的技术。参见，例如，Mere L等，″
Miniaturized FRET assays and microfluidics：key components for ultra-high-
throughput screening，″Drug Discovery Today 4(8)：363-369(1999)，以及其中的参考
文献；Lakowicz J R，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2版，Plenum Press
(1999)，或Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body
Fluids.In：Thongboonkerd V编辑，ed.Proteomics of Human Body Fluids：Principles，
Methods and Applications.Volume 1：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，将每一篇全部按引用并入本文中。
仪、共焦显微镜或基于CCD的系统的仪器以及如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移
(FRET)、全内反射荧光(TIRE)、荧光相关频谱(FCS)的技术的荧光检测；比色/分光测定技
术；表面等离子体共振(通过其测量表面处吸附的材料的质量变化)；使用放射性同位素的
技术，包括常规的放射性同位素结合和闪烁迫近分析(SPA)；质谱，如基质辅助激光解吸/电
离质谱(MALDI)和MALDI-飞行时间(TOF)质谱；椭圆光度法，其是测量蛋白质膜厚度的光学
方法；石英晶体微量天秤(QCM)，一种非常灵敏的用于测量吸附于表面的物质质量的方法；
扫描探针显微术，如原子力显微术(AFM)、扫描力显微术(SFM)或扫描电子显微术(SEM)；以
及如电化学、阻抗、声学、微波和IR/Raman检测的技术。参见，例如，Mere L等，″
Miniaturized FRET assays and microfluidics：key components for ultra-high-
throughput screening，″Drug Discovery Today 4(8)：363-369(1999)，以及其中的参考
文献；Lakowicz J R，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第2版，Plenum Press
(1999)，或Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body
Fluids.In：Thongboonkerd V编辑，ed.Proteomics of Human Body Fluids：Principles，
Methods and Applications.Volume 1：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，将每一篇全部按引用并入本文中。
[0190] 微阵列技术可以结合质谱(MS)分析和其他工具。与质谱仪的电喷雾接口可以与微流体装置中的毛细管集成。例如，一种可商业购得的系统含有eTag报告体，其是具有独特的
并且充分限定的电泳淌度的荧光标记；每个标记通过可切割的连接与生物或化学探针偶
联。每种eTag报告体截然不同的迁移率地址允许通过毛细管电泳将这些标签的混合物快速
地去卷积并定量。这种系统允许来自相同样品的同时基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能
分析。Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body Fluids.见：
Thongboonkerd V编辑，ed.Proteomics of Human Body Fluids：Principles，Methods and Applications.Volume 1：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，将其全部按引用并入本文中。
并且充分限定的电泳淌度的荧光标记；每个标记通过可切割的连接与生物或化学探针偶
联。每种eTag报告体截然不同的迁移率地址允许通过毛细管电泳将这些标签的混合物快速
地去卷积并定量。这种系统允许来自相同样品的同时基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能
分析。Jain KK：Integrative Omics，Pharmacoproteomics，and Human Body Fluids.见：
Thongboonkerd V编辑，ed.Proteomics of Human Body Fluids：Principles，Methods and Applications.Volume 1：Totowa，N.J.：Humana Press，2007，将其全部按引用并入本文中。
[0191] 生物芯片可以包括用于微流体或纳米流体分析的组成部分。微流体装置可以用于分离或分离生物标志物，如测定生物印记。微流体系统允许用于检测生物印记的一个或多
个过程和其他过程的微型化和区室化。微流体装置可以在系统的至少一个方面中使用一种
或多种检测试剂，并且这样的检测试剂可以用于检测一种或多种生物标志物。各种探针、抗
体、蛋白质或其他结合剂可以用于检测微流体系统内的生物标志物。检测剂，例如，本发明
的寡核苷酸探针，可以固定于微流体装置的不同区室中或可以通过装置的各种不同通道进
入杂交或检测反应中。
个过程和其他过程的微型化和区室化。微流体装置可以在系统的至少一个方面中使用一种
或多种检测试剂，并且这样的检测试剂可以用于检测一种或多种生物标志物。各种探针、抗
体、蛋白质或其他结合剂可以用于检测微流体系统内的生物标志物。检测剂，例如，本发明
的寡核苷酸探针，可以固定于微流体装置的不同区室中或可以通过装置的各种不同通道进
入杂交或检测反应中。
[0192] 纳米制造技术打开了生物传感应用的可能性，该生物传感应用依赖于高密度、精密阵列的制造，例如，基于核苷酸的芯片和蛋白质阵列，另外也称为异质纳米阵列。纳米流
体器件允许将微芯片中流体分析物的量进一步降至纳升水平，并且将在此使用的芯片称为
纳米芯片。参见，例如，Unger M等，Biotechniques 1999；27(5)：1008-14，Kartalov EP等，Biotechniques 2006；40(1)：85-90，将每一篇全部按引用并入本文中。可商业购得的纳米
芯片目前提供了简单的一步分析，如可以通过混合样品和试剂、混合和监测反应来运行的
总胆固醇、总蛋白或葡萄糖分析。基于液相色谱(LC)和纳米LC分离的无凝胶分析方法
(Cutillas等，Proteomics，2005；5：101-112和Cutillas等，Mol Cell Proteomics 2005；4：
1038-1051，将每一篇全部按引用并入本文中)可以结合纳米芯片来使用。
体器件允许将微芯片中流体分析物的量进一步降至纳升水平，并且将在此使用的芯片称为
纳米芯片。参见，例如，Unger M等，Biotechniques 1999；27(5)：1008-14，Kartalov EP等，Biotechniques 2006；40(1)：85-90，将每一篇全部按引用并入本文中。可商业购得的纳米
芯片目前提供了简单的一步分析，如可以通过混合样品和试剂、混合和监测反应来运行的
总胆固醇、总蛋白或葡萄糖分析。基于液相色谱(LC)和纳米LC分离的无凝胶分析方法
(Cutillas等，Proteomics，2005；5：101-112和Cutillas等，Mol Cell Proteomics 2005；4：
1038-1051，将每一篇全部按引用并入本文中)可以结合纳米芯片来使用。
[0193] 适用于鉴别疾病、病症、症状或生理状态的阵列可以包括在试剂盒中。试剂盒可以包括本发明的适体，包括作为非限制性实例，一种或多种可用于制备用于固定于结合岛或
阵列区域上的分子的试剂、可用于检测生物标志物与固定分子(例如，适体)的结合的试剂
以及使用说明书。
阵列区域上的分子的试剂、可用于检测生物标志物与固定分子(例如，适体)的结合的试剂
以及使用说明书。
[0194] 本文中进一步提供了有助于生物样品中特定生物印记的检测的快速检测装置。该装置可以在芯片上将生物样品制备与聚合酶链式反应(PCR)整合。该装置可有助于生物样
品中囊泡的特定生物印记的检测，并且如Pipper等，Angewandte Chemie，47(21)，p.3900-
3904(2008)中所述的提供了实例，将其全部按引用并入本文中。生物印记可以使用微-/纳
米-电化学系统(MEMS/NEMS)传感器和用于诊断应用的口腔流体来并入，如Li等，Adv Dent
Res 18(1)：3-5(2005)中所述的，将其全部按引用并入本文中。
品中囊泡的特定生物印记的检测，并且如Pipper等，Angewandte Chemie，47(21)，p.3900-
3904(2008)中所述的提供了实例，将其全部按引用并入本文中。生物印记可以使用微-/纳
米-电化学系统(MEMS/NEMS)传感器和用于诊断应用的口腔流体来并入，如Li等，Adv Dent
Res 18(1)：3-5(2005)中所述的，将其全部按引用并入本文中。
[0195] 作为平面阵列的替代方案，使用颗粒的分析(如基于珠的分析)也能够与本发明的适体一起使用。适体容易地与商业可购得的珠子偶联。参见，例如，Srinivas等，
Anal.Chem.2011年10月21日，Aptamer functionalized Microgel Particles for
Protein Detection；关于适体作为治疗和诊断剂的综述还参见Brody和Gold，
Rev.Mol.Biotech.2000，74：5-13。
Anal.Chem.2011年10月21日，Aptamer functionalized Microgel Particles for
Protein Detection；关于适体作为治疗和诊断剂的综述还参见Brody和Gold，
Rev.Mol.Biotech.2000，74：5-13。
[0196] 可以使用多参数分析或利用了具有同源配体和具有与高灵敏自动化技术一致的特定活性的报告分子的其他高通量检测分析。在基于珠子的分析系统中，结合剂，如抗体或
适体，可以固定于可寻址微球上。针对各单个结合试验的各结合剂可以与不同类型的微球
(即，微珠)偶联并且分析反应在微球表面上进行，如图1B中所描绘的。在非限制性实例中，
用于细胞或微囊泡的结合剂可以是与珠子偶联的抗体或适体。具有离散荧光强度的染色微
球与其合适的结合剂或捕获探针分开加载。可以按照需要合并携带不同结合剂的不同珠子
组以产生定制的珠阵列。珠阵列然后在单一反应容器中与样品孵育来进行分析。
适体，可以固定于可寻址微球上。针对各单个结合试验的各结合剂可以与不同类型的微球
(即，微珠)偶联并且分析反应在微球表面上进行，如图1B中所描绘的。在非限制性实例中，
用于细胞或微囊泡的结合剂可以是与珠子偶联的抗体或适体。具有离散荧光强度的染色微
球与其合适的结合剂或捕获探针分开加载。可以按照需要合并携带不同结合剂的不同珠子
组以产生定制的珠阵列。珠阵列然后在单一反应容器中与样品孵育来进行分析。
[0197] 基于珠子的分析可以与本发明的一种或多种适体一起使用。珠基质可以提供用于连接一种或多种结合剂(包括适体)的平台。对于多重分析，多个不同珠子组(例如，
Illumina、Luminex)可以具有不同的结合剂(对不同靶标分子特异性的)。例如，珠子可以与
用于检测目标抗原的存在(定量地或定性地)的本发明的适体偶联，或它也可以用于分离选
定的生物样品中存在的组分(例如，包含适体配置来与其结合或关联的靶标分子的细胞、细
胞片段或囊泡)。通过使用商业购得的试剂盒，任何有机起源的分子可以成功地与聚苯乙烯
珠偶联。
Illumina、Luminex)可以具有不同的结合剂(对不同靶标分子特异性的)。例如，珠子可以与
用于检测目标抗原的存在(定量地或定性地)的本发明的适体偶联，或它也可以用于分离选
定的生物样品中存在的组分(例如，包含适体配置来与其结合或关联的靶标分子的细胞、细
胞片段或囊泡)。通过使用商业购得的试剂盒，任何有机起源的分子可以成功地与聚苯乙烯
珠偶联。
[0198] 本发明的一种或多种适体可以与任何基于珠子的基质一起使用，包括但不限于磁性捕获方法、荧光激活细胞分选(FACS)或激光细胞计数。磁性捕获方法可以包括，但不限于
使用磁性活化的细胞分选(MACS)微珠或磁柱。可以改进以使用本发明适体的基于珠子或颗
粒的方法的实例包括描述于美国专利No.4,551,435、4,795,698、4,925,788、5,108,933、5,
186,827、5,200,084或5,158,871；7,399,632；8,124,015；8,008,019；7,955,802；7,445,
844；7,274,316；6,773,812；6,623,526；6,599,331；6,057,107；5,736,330；国际专利公开No.WO/2012/174282；WO/1993/022684中的方法和珠系统。
使用磁性活化的细胞分选(MACS)微珠或磁柱。可以改进以使用本发明适体的基于珠子或颗
粒的方法的实例包括描述于美国专利No.4,551,435、4,795,698、4,925,788、5,108,933、5,
186,827、5,200,084或5,158,871；7,399,632；8,124,015；8,008,019；7,955,802；7,445,
844；7,274,316；6,773,812；6,623,526；6,599,331；6,057,107；5,736,330；国际专利公开No.WO/2012/174282；WO/1993/022684中的方法和珠系统。
[0199] 还可以在流式细胞方法中使用本发明的适体来实现来自生物样品的循环生物标志物(例如，蛋白质抗原)或包含生物标志物的细胞、细胞片段或囊泡的分离或检测。作为非
限制性实例，本发明的适体可以用于包括使用颗粒(如，珠子或微球)的分析中。本发明提供
了作为结合剂的适体，其可以与颗粒偶联。可以使用流式细胞术来分选悬浮于流体流中的
微观颗粒。当颗粒通过时，它们可以选择性地带电并在它们离开时可以偏转到单独的流路
中。因此，有可能以高精确度和速度分离来自原始混合物(例如生物样品)的群体。流式细胞
术允许对流过光学/电子检测装置的单细胞的物理和/或化学特征同时进行多参数分析。单
频率(颜色)的光束(通常为激光)指向在流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准流体
流经光束的点；一个与该光束重合(正向散射或FSC)并且几个垂直于该光束(侧向散射或
SSC)，以及一个或多个荧光检测器。
限制性实例，本发明的适体可以用于包括使用颗粒(如，珠子或微球)的分析中。本发明提供
了作为结合剂的适体，其可以与颗粒偶联。可以使用流式细胞术来分选悬浮于流体流中的
微观颗粒。当颗粒通过时，它们可以选择性地带电并在它们离开时可以偏转到单独的流路
中。因此，有可能以高精确度和速度分离来自原始混合物(例如生物样品)的群体。流式细胞
术允许对流过光学/电子检测装置的单细胞的物理和/或化学特征同时进行多参数分析。单
频率(颜色)的光束(通常为激光)指向在流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准流体
流经光束的点；一个与该光束重合(正向散射或FSC)并且几个垂直于该光束(侧向散射或
SSC)，以及一个或多个荧光检测器。
[0200] 通过光束的各悬浮颗粒以某种方式散射光线，并且颗粒中的荧光化学物质可以被激发以发射频率低于光源的光。散射光与荧光的这种组合被检测器所拾取，并通过分析各
检测器(每个荧光发射峰一个检测器)处亮度的波动，有可能推断关于各单个颗粒的物理和
化学结构的各种因素。FSC与细胞尺寸相关，而SSC取决于颗粒的内部复杂性，例如细胞核的
形状、细胞质颗粒物的量和类型或者膜的粗糙度。一些流式细胞仪无需荧光而仅使用光散
射来进行测量。
检测器(每个荧光发射峰一个检测器)处亮度的波动，有可能推断关于各单个颗粒的物理和
化学结构的各种因素。FSC与细胞尺寸相关，而SSC取决于颗粒的内部复杂性，例如细胞核的
形状、细胞质颗粒物的量和类型或者膜的粗糙度。一些流式细胞仪无需荧光而仅使用光散
射来进行测量。
[0201] 流式细胞仪可以以“实时”的方式每秒分析几千个颗粒，并且可以主动地分开并分离具有指定性质的颗粒。它们提供了在各分析阶段中对于大量单一细胞的设定参数的高通
量自动化定量和分离。流式细胞仪可以具有多个激光和荧光检测器，从而允许使用多种标
记物以按照目标群体的表型更精确地对其加以指定。因此，流式细胞仪(诸如多色流式细胞
仪)可用于检测具有多种荧光标记或颜色的目标靶标。在一些实施方式中，流式细胞仪还可
分选或分离不同目标靶标，如根据大小或根据不同的标志物。
量自动化定量和分离。流式细胞仪可以具有多个激光和荧光检测器，从而允许使用多种标
记物以按照目标群体的表型更精确地对其加以指定。因此，流式细胞仪(诸如多色流式细胞
仪)可用于检测具有多种荧光标记或颜色的目标靶标。在一些实施方式中，流式细胞仪还可
分选或分离不同目标靶标，如根据大小或根据不同的标志物。
[0202] 流式细胞仪可具有一种或多种激光，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种激光。在一些实施方式中，流式细胞仪可检测多于一种颜色或荧光标记，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同颜色或荧光标记。例如，流式细胞仪可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个荧光检测器。
[0203] 商购可得的流式细胞仪的实例包括，但不限于MoFloTM XDP Cell Sorter(Beckman TM
Coulter，Brea，CA)、MoFlo Legacy Cell Sorter(Beckman Coulter，Brea，CA)、BD
FACSAriaTM Cell Sorter(BD Biosciences，San Jose，CA)、BDTMLSRII(BD Biosciences，
San Jose，CA)以及BD FACSCaliburTM(BD Biosciences，San Jose，CA)。多色或多荧光细胞计数仪的使用可用于多重分析。在一些实施方式中，流式细胞仪可分选，并且因此根据一种
或多种特征收集或分选超过一种囊泡、微囊泡或颗粒的群体。例如，两种群体在大小上不
同，使得群体具有相似的大小范围并且可被差异地检测或分选。在另一个实施方式中，两种
不同的群体进行差异标记。
Coulter，Brea，CA)、MoFlo Legacy Cell Sorter(Beckman Coulter，Brea，CA)、BD
FACSAriaTM Cell Sorter(BD Biosciences，San Jose，CA)、BDTMLSRII(BD Biosciences，
San Jose，CA)以及BD FACSCaliburTM(BD Biosciences，San Jose，CA)。多色或多荧光细胞计数仪的使用可用于多重分析。在一些实施方式中，流式细胞仪可分选，并且因此根据一种
或多种特征收集或分选超过一种囊泡、微囊泡或颗粒的群体。例如，两种群体在大小上不
同，使得群体具有相似的大小范围并且可被差异地检测或分选。在另一个实施方式中，两种
不同的群体进行差异标记。
[0204] 可将得自流式细胞仪的数据以1维的方式作图从而得到柱状图，或者使用较新的软件以2维的方式如点状图或以3维方式来观察。这些图上的区域可以通过一系列亚集提取
(其称为门控)来顺序分离。存在用于诊断和临床目的的特定的门控方案，特别是涉及血液
学。这些图通常以对数标度完成。因为不同荧光染料的发射光谱重叠，所以在检测器处的信
号必须通过电学以及计算方式来补偿。用于标记生物标志物的荧光团可包括Ormerod，Flow
Cytometry第2版，Springer-Verlag，New York(1999)和Nida等，Gynecologic Oncology
2005；4 889-894中所描述的那些，其以引用的方式并入本文。在多重分析(包括但不限于流
式细胞分析)中，可以使用本发明的适体评估一种或多种不同的靶标分子。
(其称为门控)来顺序分离。存在用于诊断和临床目的的特定的门控方案，特别是涉及血液
学。这些图通常以对数标度完成。因为不同荧光染料的发射光谱重叠，所以在检测器处的信
号必须通过电学以及计算方式来补偿。用于标记生物标志物的荧光团可包括Ormerod，Flow
Cytometry第2版，Springer-Verlag，New York(1999)和Nida等，Gynecologic Oncology
2005；4 889-894中所描述的那些，其以引用的方式并入本文。在多重分析(包括但不限于流
式细胞分析)中，可以使用本发明的适体评估一种或多种不同的靶标分子。
[0205] 一种或多种本发明的适体可以布置在任何有用的平面或珠基质上。在本发明的一个方面中，将一种或多种本发明的适体布置在微流体装置上，由此促进评估、表征或分离包
含目标多肽抗原或其功能性片段的生物样品的组分。例如，可以使用一种或多种本发明的
适体(或者连同另外的结合剂一起)来评价循环抗原或包含该抗原的细胞、细胞片段或细胞
衍生的微囊泡。亦可称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件
集成系统的微流体装置可用于分离和分析这样的实体。这类系统使得允许生物印记检测以
及其它过程的方法微型化和区室化。
含目标多肽抗原或其功能性片段的生物样品的组分。例如，可以使用一种或多种本发明的
适体(或者连同另外的结合剂一起)来评价循环抗原或包含该抗原的细胞、细胞片段或细胞
衍生的微囊泡。亦可称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件
集成系统的微流体装置可用于分离和分析这样的实体。这类系统使得允许生物印记检测以
及其它过程的方法微型化和区室化。
[0206] 微流体装置还可以用于通过大小差异或亲和选择来分离细胞、细胞片段或细胞衍生的微囊泡。例如，微流体装置可以根据大小或者通过使用一种或多种结合剂而使用一个
或多个通道从生物样品分离实体。可以将生物样品引入到一个或多个微流体通道中，其选
择性地允许实体通过。可以根据性质(例如大小、形状、可变形性或生物印记)来进行选择。
或多个通道从生物样品分离实体。可以将生物样品引入到一个或多个微流体通道中，其选
择性地允许实体通过。可以根据性质(例如大小、形状、可变形性或生物印记)来进行选择。
[0207] 在一个实施方式中，可以将细胞、细胞片段、微囊泡或其它生物标志物(例如，蛋白质复合物)的异质群体引入到微流体装置中，并可以得到一种或多种不同的这类实体的同
质群体。例如，不同的通道可以具有不同的大小选择或结合剂以选择这类实体的不同群体。
因此，微流体装置可以分离多种实体，其中该多种实体的至少一个亚组包含不同于所述多
种实体的另一个亚组的生物印记。例如，微流体装置可以分离至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、
15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的亚组，其中各亚组包含不同的生物印记。
质群体。例如，不同的通道可以具有不同的大小选择或结合剂以选择这类实体的不同群体。
因此，微流体装置可以分离多种实体，其中该多种实体的至少一个亚组包含不同于所述多
种实体的另一个亚组的生物印记。例如，微流体装置可以分离至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、
15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的亚组，其中各亚组包含不同的生物印记。
[0208] 在一些实施方式中，微流体装置可以包含允许目标靶标的进一步富集或选择的一个或多个通道。在通过第一通道后已经富集的群体可以被引入到第二通道中，其允许所需
群体的通过而进一步富集，例如通过存在于第二通道中的一种或多种结合剂。
群体的通过而进一步富集，例如通过存在于第二通道中的一种或多种结合剂。
[0209] 可以与微流体装置一起使用基于阵列的分析和基于珠的分析。例如，结合剂如寡核苷酸探针可以与珠偶联，并且可以在微流体装置中进行珠与结合剂的靶标之间的结合反
应。还可以使用微流体装置进行多重分析。不同的区室可以包含针对不同的靶标群体的不
同结合剂。在一个实施方式中，各群体具有不同的生物印记。可以在微流体装置中进行微球
与靶标之间的杂交反应，并且反应混合物可以被输递到检测装置中。检测装置(如双重或多
重激光检测系统)可以为微流体系统的部分，并且可以通过珠或微球的色彩编码使用激光
来鉴定各珠或微球，而另一激光可以检测与各珠相关的杂交信号。
应。还可以使用微流体装置进行多重分析。不同的区室可以包含针对不同的靶标群体的不
同结合剂。在一个实施方式中，各群体具有不同的生物印记。可以在微流体装置中进行微球
与靶标之间的杂交反应，并且反应混合物可以被输递到检测装置中。检测装置(如双重或多
重激光检测系统)可以为微流体系统的部分，并且可以通过珠或微球的色彩编码使用激光
来鉴定各珠或微球，而另一激光可以检测与各珠相关的杂交信号。
[0210] 任何合适的微流体装置可以用于本发明的方法中。可使用的微流体装置的实例包括但不限于描述于美国专利No.7,591,936、7,581,429、7,579,136、7,575,722、7,568,399、
7,552,741、7,544,506、7,541,578、7,518,726、7,488,596、7,485,214、7,467,928、7,452,
713、7,452,509、7,449,096、7,431,887、7,422,725、7,422,669、7,419,822、7,419,639、7,
413,709、7,411,184、7,402,229、7,390,463、7,381,471、7,357,864、7,351,592、7,351,
380、7,338,637、7,329,391、7,323,140、7,261,824、7,258,837、7,253,003、7,238,324、7,
238,255、7,233,865、7,229,538、7,201,881、7,195,986、7,189,581、7,189,580、7,189,
368、7,141,978、7,138,062、7,135,147、7,125,711、7,118,910、7,118,661、7,640,947、7,
666,361、7,704,735；以及国际专利公开号WO 2010/072410中的那些装置；各专利或申请全
文以引用的方式并入本文。用于本发明所公开方法的另一实例描述于Chen等，
“Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles，”Lab on
a Chip，2009年12月8日DOI：10.1039/b916199f中。
7,552,741、7,544,506、7,541,578、7,518,726、7,488,596、7,485,214、7,467,928、7,452,
713、7,452,509、7,449,096、7,431,887、7,422,725、7,422,669、7,419,822、7,419,639、7,
413,709、7,411,184、7,402,229、7,390,463、7,381,471、7,357,864、7,351,592、7,351,
380、7,338,637、7,329,391、7,323,140、7,261,824、7,258,837、7,253,003、7,238,324、7,
238,255、7,233,865、7,229,538、7,201,881、7,195,986、7,189,581、7,189,580、7,189,
368、7,141,978、7,138,062、7,135,147、7,125,711、7,118,910、7,118,661、7,640,947、7,
666,361、7,704,735；以及国际专利公开号WO 2010/072410中的那些装置；各专利或申请全
文以引用的方式并入本文。用于本发明所公开方法的另一实例描述于Chen等，
“Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles，”Lab on
a Chip，2009年12月8日DOI：10.1039/b916199f中。
[0211] 用于本发明中的其它微流体装置包括含有弹性体层、阀和泵的装置，包括但不限于U.S.专利No.5,376,252、6,408,878、6,645,432、6,719,868、6,793,753、6,899,137、6,
929,030、7,040,338、7,118,910、7,144,616、7,216,671、7,250,128、7,494,555、7,501,
245、7,601,270、7,691,333、7,754,010、7,837,946；U.S.专利申请No.2003/0061687、2005/
0084421、2005/0112882、2005/0129581、2005/0145496、2005/0201901、2005/0214173、
2005/0252773、2006/0006067；和EP专利No.0527905和1065378中公开的那些；将每篇申请
按引用并入本文中作为参考。
929,030、7,040,338、7,118,910、7,144,616、7,216,671、7,250,128、7,494,555、7,501,
245、7,601,270、7,691,333、7,754,010、7,837,946；U.S.专利申请No.2003/0061687、2005/
0084421、2005/0112882、2005/0129581、2005/0145496、2005/0201901、2005/0214173、
2005/0252773、2006/0006067；和EP专利No.0527905和1065378中公开的那些；将每篇申请
按引用并入本文中作为参考。
[0212] 微流体装置可以具有连接于通道中表面的或存在于通道中的一种或多种结合剂。通道表面还可以按照需要接触封闭适体。在一个实施方式中，微通道表面用抗生物素蛋白/
链霉亲和素和生物素化的捕获剂如抗体或适体处理，并且可向通道中注入以结合抗生物素
蛋白。在其他实施方式中，捕获剂存在于微流体装置的室或其他部件中。捕获剂还可以连接
于可以进行操纵的珠子以移动通过微流体通道。在一个实施方式中，捕获剂连接于磁珠。该
珠可以使用磁体操纵。
链霉亲和素和生物素化的捕获剂如抗体或适体处理，并且可向通道中注入以结合抗生物素
蛋白。在其他实施方式中，捕获剂存在于微流体装置的室或其他部件中。捕获剂还可以连接
于可以进行操纵的珠子以移动通过微流体通道。在一个实施方式中，捕获剂连接于磁珠。该
珠可以使用磁体操纵。
[0213] 可将生物样品流入所述微流体装置或微通道中，其流速为如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50μl每分钟，如介于约1-
50、5-40、5-30、3-20或5-15μl每分钟之间。微流体装置中可捕获和直接检测一种或多种目标靶标。或者，所捕获的靶标可在分析前释放并且离开微流体装置。在另一个实施方式中，
在微通道中裂解一种或多种被捕获的细胞或微囊泡并可以分析裂解物。可使裂解缓冲液流
过通道。可收集并分析裂解物，如进行RT-PCR、PCR、质谱、蛋白质印迹或其它分析以检测细胞或微囊泡的一种或多种生物标志物。
50、5-40、5-30、3-20或5-15μl每分钟之间。微流体装置中可捕获和直接检测一种或多种目标靶标。或者，所捕获的靶标可在分析前释放并且离开微流体装置。在另一个实施方式中，
在微通道中裂解一种或多种被捕获的细胞或微囊泡并可以分析裂解物。可使裂解缓冲液流
过通道。可收集并分析裂解物，如进行RT-PCR、PCR、质谱、蛋白质印迹或其它分析以检测细胞或微囊泡的一种或多种生物标志物。
[0214] 微囊泡和相关生物标志物可以使用本发明的寡核苷酸探针进行分析。微囊泡分离可以使用各种技术进行，包括但不限于尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超
滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、免疫分析、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术、聚合物分离(例如，使用聚乙二醇(PEG))或其组合。用于微囊泡和囊泡有效负载分离和分析的
方法和技术公开于2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年12
月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日
提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的
PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中；该申请各自通过引用全文并入。
滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、亲和捕获、免疫分析、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术、聚合物分离(例如，使用聚乙二醇(PEG))或其组合。用于微囊泡和囊泡有效负载分离和分析的
方法和技术公开于2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年12
月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日
提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的
PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中；该申请各自通过引用全文并入。
[0215] 本发明的组合物和方法可以以各种免疫分析形式使用并与各种免疫分析形式一起使用。免疫亲和分析可以基于与目标蛋白质或其它生物标志物选择性地免疫反应的抗体
和适体。这些技术包括但不限于免疫沉淀、蛋白质印迹分析、分子结合分析、酶联免疫吸附
分析(ELISA)、酶联免疫过滤分析(ELIFA)、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学(IHC)
等。例如，任选的检测样品中生物标志物的表达的方法包括使样品与针对生物标志物或其
免疫反应性片段或者包含针对生物标志物的抗原结合区域的重组蛋白质的抗体或适体接
触；和然后检测样品中生物标志物的结合。用于产生抗体和适体的各种方法是本领域中已
知的。这样的结合剂可用于从溶液样品免疫沉淀特定的蛋白质或免疫印迹通过，例如，聚丙
烯酰胺凝胶分离的蛋白质。免疫细胞化学方法也可以用于检测组织或细胞中的特定蛋白质
多态性。也可以使用其它公知的免疫分析技术，包括例如，ELISA、放射免疫分析(RIA)、放射免疫测定分析(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括夹心分析。参见，例如，U.S.专利No.4,376,
110和4,486,530，这两者通过引用并入本文。
和适体。这些技术包括但不限于免疫沉淀、蛋白质印迹分析、分子结合分析、酶联免疫吸附
分析(ELISA)、酶联免疫过滤分析(ELIFA)、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学(IHC)
等。例如，任选的检测样品中生物标志物的表达的方法包括使样品与针对生物标志物或其
免疫反应性片段或者包含针对生物标志物的抗原结合区域的重组蛋白质的抗体或适体接
触；和然后检测样品中生物标志物的结合。用于产生抗体和适体的各种方法是本领域中已
知的。这样的结合剂可用于从溶液样品免疫沉淀特定的蛋白质或免疫印迹通过，例如，聚丙
烯酰胺凝胶分离的蛋白质。免疫细胞化学方法也可以用于检测组织或细胞中的特定蛋白质
多态性。也可以使用其它公知的免疫分析技术，包括例如，ELISA、放射免疫分析(RIA)、放射免疫测定分析(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括夹心分析。参见，例如，U.S.专利No.4,376,
110和4,486,530，这两者通过引用并入本文。
[0216] 在替代的方法中，样品可以在足以使复合物形成的条件下与对于生物标志物特异性的抗体或适体接触，和然后检测这种复合物。生物标志物的存在可以以用于测定多种多
样的组织和样品(包括体液如血浆或血清)的方式检测，如通过蛋白质印迹和ELISA过程。使
用这种分析形式的广泛的免疫分析技术是可得的，参见，例如，U.S.专利No.4,016,043，4,
424,279和4,018,653。这些包括非竞争类型的单位点和双位点或“夹心”分析，以及在传统
竞争结合分析。这些分析也包括标记的抗体或适体与靶生物标志物的直接结合。
样的组织和样品(包括体液如血浆或血清)的方式检测，如通过蛋白质印迹和ELISA过程。使
用这种分析形式的广泛的免疫分析技术是可得的，参见，例如，U.S.专利No.4,016,043，4,
424,279和4,018,653。这些包括非竞争类型的单位点和双位点或“夹心”分析，以及在传统
竞争结合分析。这些分析也包括标记的抗体或适体与靶生物标志物的直接结合。
[0217] 存在多种夹心分析技术的变型，其可以包括在本发明内。在典型的前述分析中，未标记的结合剂，例如，抗体或适体，固定在固体基质上，且待测试的样品与结合的分子接触。
在足以允许形成复合物的合适时间段后，然后用能够产生可检测信号的报告分子标记的对
于抗原特异性的第二结合剂并孵育，从而允许足以形成包含标记的结合剂的另一复合物的
时间。任何未反应的材料洗掉，且抗原的存在通过观察由报告分子产生的信号来确定。结果
可以通过可视信号的简单观察而是定性的，或者可以通过与包含已知量的生物标志物的对
照样品比较而是定量的。
在足以允许形成复合物的合适时间段后，然后用能够产生可检测信号的报告分子标记的对
于抗原特异性的第二结合剂并孵育，从而允许足以形成包含标记的结合剂的另一复合物的
时间。任何未反应的材料洗掉，且抗原的存在通过观察由报告分子产生的信号来确定。结果
可以通过可视信号的简单观察而是定性的，或者可以通过与包含已知量的生物标志物的对
照样品比较而是定量的。
[0218] 以上分析的变型包括同时分析，其中样品和未标记的结合剂两者同时添加到系着的结合剂。在典型的前述夹心分析中，对于组织/细胞/生物标志物或者这种目标靶标有特
异性的第一结合剂(例如，抗体或适体)共价或被动地结合于固体表面。固体表面通常是玻
璃或聚合物，最常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙
烯。固体支持物可以是管、珠、微板的圆盘或适合进行免疫分析的任何其它表面。结合方法
一般由交联、共价结合或物理吸附聚合物-抗体复合物到支持物上组成，支持物然后在测试
样品的制备物中洗涤。等份的待测试样品然后添加到固相复合物并在合适的条件(例如，从
室温至40℃，如25℃-32℃，包括在内)下孵育足够的时间(例如，2-40分钟或过夜)以允许靶
标与支持物的结合。在孵育期后，支持物被洗涤并与对于生物标志物的一部分特异性的第
二结合剂一起孵育。第二结合剂连接于报告分子，其用于指示第二结合剂与分子标志物的
结合。
异性的第一结合剂(例如，抗体或适体)共价或被动地结合于固体表面。固体表面通常是玻
璃或聚合物，最常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙
烯。固体支持物可以是管、珠、微板的圆盘或适合进行免疫分析的任何其它表面。结合方法
一般由交联、共价结合或物理吸附聚合物-抗体复合物到支持物上组成，支持物然后在测试
样品的制备物中洗涤。等份的待测试样品然后添加到固相复合物并在合适的条件(例如，从
室温至40℃，如25℃-32℃，包括在内)下孵育足够的时间(例如，2-40分钟或过夜)以允许靶
标与支持物的结合。在孵育期后，支持物被洗涤并与对于生物标志物的一部分特异性的第
二结合剂一起孵育。第二结合剂连接于报告分子，其用于指示第二结合剂与分子标志物的
结合。
[0219] 替代的方法涉及固定样品中的靶标生物标志物和然后将固定的靶标暴露于特定结合剂，例如，抗体或适体，其可以用或不用报告分子标记。取决于靶标的量和报告分子信
号的强度，结合的靶标可以通过用结合剂的直接标记可检测。或者，对于第一结合剂特异性
的第二标记结合剂暴露于第一靶标复合物以形成三元复合物。复合物通过由报告分子发射
的信号检测。“报告分子”包括通过其化学特性提供分析上可鉴别的信号的分子，该信号允
许检测抗原结合的复合物。在这一类型的分析中一些通常使用的报告分子包括酶、荧光团
或含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。这些可检测标记的实例在本
文中公开。
号的强度，结合的靶标可以通过用结合剂的直接标记可检测。或者，对于第一结合剂特异性
的第二标记结合剂暴露于第一靶标复合物以形成三元复合物。复合物通过由报告分子发射
的信号检测。“报告分子”包括通过其化学特性提供分析上可鉴别的信号的分子，该信号允
许检测抗原结合的复合物。在这一类型的分析中一些通常使用的报告分子包括酶、荧光团
或含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。这些可检测标记的实例在本
文中公开。
[0220] 在酶免疫分析的情况中，酶与第二结合剂偶联。常用的酶尤其包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。待用于特定的酶的底物一般选择用于在通过相应的酶水解时产生可检测的颜色变化。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物
酶。也可能采用荧光底物(其产生荧光产物)而不是以上提及的发色底物。在所有情况中，酶
标记的结合剂添加到允许结合的第一结合分子标志物复合物，和然后洗掉过量的试剂。包
含适宜底物的溶液然后添加到包含第一结合剂、抗原和第二结合剂的四元复合物。底物与
连接于第二结合剂的酶反应，从而给出定性的视觉信号，其可以进一步定量，通常使用分光
光度法，以给出存在于样品中的抗原量的指示。或者，荧光化合物，如荧光素和罗丹明，可以与第二结合剂化学偶联而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射而激活时，荧光
染料标记的第二结合剂吸收光能量，诱导分子的激发状态，接着以用光学显微镜可视觉检
测的特征色发射光，如在EIA中，荧光染料标记的第二结合剂允许结合抗原复合物。在洗掉
未结合的试剂后，剩余的四元复合物然后暴露于适宜波长的光。观察到的荧光指示目标分
子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中均是非常完善的。但是，也可以使用其它
报告分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。
酶。也可能采用荧光底物(其产生荧光产物)而不是以上提及的发色底物。在所有情况中，酶
标记的结合剂添加到允许结合的第一结合分子标志物复合物，和然后洗掉过量的试剂。包
含适宜底物的溶液然后添加到包含第一结合剂、抗原和第二结合剂的四元复合物。底物与
连接于第二结合剂的酶反应，从而给出定性的视觉信号，其可以进一步定量，通常使用分光
光度法，以给出存在于样品中的抗原量的指示。或者，荧光化合物，如荧光素和罗丹明，可以与第二结合剂化学偶联而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射而激活时，荧光
染料标记的第二结合剂吸收光能量，诱导分子的激发状态，接着以用光学显微镜可视觉检
测的特征色发射光，如在EIA中，荧光染料标记的第二结合剂允许结合抗原复合物。在洗掉
未结合的试剂后，剩余的四元复合物然后暴露于适宜波长的光。观察到的荧光指示目标分
子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中均是非常完善的。但是，也可以使用其它
报告分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。
[0221] 免疫组织化学(IHC)是使用特别地对于组织中的抗原的结合剂(例如，抗体或适体)将抗原(例如，蛋白质)定位在组织的细胞中的方法。抗原结合的结合剂可以与允许例如
通过可视化检测的标签偶联或融合。在一些实施方式中，标签是可以催化产色反应的酶，如
碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。酶可以与结合剂融合或者例如使用生物素-抗生物素蛋白/
链霉亲和素系统非共价地结合。或者，结合剂可以用荧光团如荧光素、罗丹明、DyLight
Fluor或Alexa Fluor标记。结合剂可以直接标记或者它本身可以被携带标准的第二检测结
合剂(抗体或抗原)识别。使用IHC，可以检测一种或多种蛋白质。与对照水平相比，基因产物的表达可以与其染色强度相关。在一些实施方式中，如果样品中其染色相对于对照变化至
少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9或10-倍，则基因产物被认为差异地表达。
通过可视化检测的标签偶联或融合。在一些实施方式中，标签是可以催化产色反应的酶，如
碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。酶可以与结合剂融合或者例如使用生物素-抗生物素蛋白/
链霉亲和素系统非共价地结合。或者，结合剂可以用荧光团如荧光素、罗丹明、DyLight
Fluor或Alexa Fluor标记。结合剂可以直接标记或者它本身可以被携带标准的第二检测结
合剂(抗体或抗原)识别。使用IHC，可以检测一种或多种蛋白质。与对照水平相比，基因产物的表达可以与其染色强度相关。在一些实施方式中，如果样品中其染色相对于对照变化至
少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9或10-倍，则基因产物被认为差异地表达。
[0222] IHC包括这类免疫分析形式应用于组织化学技术。在说明性的实例中，组织切片装载到载玻片上并与结合剂孵育。结合剂通常是多克隆或单克隆抗体，且可以是对于抗原特
异性的适体如本发明的寡核苷酸探针。主反应包括使组织切片与这种第一结合剂接触，形
成主复合物。抗原-抗体信号然后使用与复合物偶联的可以提供可视信号的第二结合剂如
酶放大，包括但不限于过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶
(ABC)或抗生物素蛋白-生物素碱性磷酸酶。在底物和发色团的存在下，酶在主复合物的位
点形成有色沉积。免疫荧光是可视化抗原的替代方式。在这一技术中，主要信号使用与荧光
染料偶联的第二结合剂放大。在UV光吸收上，荧光染料以较长波长发射其自身的光(荧光)，
因此允许主复合物的定位。
异性的适体如本发明的寡核苷酸探针。主反应包括使组织切片与这种第一结合剂接触，形
成主复合物。抗原-抗体信号然后使用与复合物偶联的可以提供可视信号的第二结合剂如
酶放大，包括但不限于过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶
(ABC)或抗生物素蛋白-生物素碱性磷酸酶。在底物和发色团的存在下，酶在主复合物的位
点形成有色沉积。免疫荧光是可视化抗原的替代方式。在这一技术中，主要信号使用与荧光
染料偶联的第二结合剂放大。在UV光吸收上，荧光染料以较长波长发射其自身的光(荧光)，
因此允许主复合物的定位。
[0223] 本发明提供使用寡核苷酸探针文库进行IHC分析的方法。这可以称为多配体组织化学分析(PHC)。作为这一方式的实例，组织切片与富集的寡核苷酸探针文库接触。文库的
成员可以按照需要用例如生物素分子、地高辛或其它标记进行标记。结合的文库成员使用
第二标记系统可视化，例如，链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)或抗-地高辛辣根过氧
化物酶。所得的载玻片可以被阅读和评分，如在典型的抗体基IHC方法中，参见本文中的实
施例19-31。
成员可以按照需要用例如生物素分子、地高辛或其它标记进行标记。结合的文库成员使用
第二标记系统可视化，例如，链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)或抗-地高辛辣根过氧
化物酶。所得的载玻片可以被阅读和评分，如在典型的抗体基IHC方法中，参见本文中的实
施例19-31。
[0224] 寡核苷酸探针/适体
[0225] 适体对于用作治疗剂和诊断剂具有多种理想的特征，包括高特异性和亲和力、生物学效力和卓越的药物代谢动力学特性。此外，它们给予优于抗体和其他蛋白质生物制剂
的特定优势。例如，适体完全地通过体外的过程来产生，从而允许快速合成。体外选择允许
紧密地控制适体的特异性和亲和力。另外，适体作为一类已经证明了很低或没有毒性或免
疫原性。尽管许多单克隆抗体的功效可能受到对抗体自身的免疫反应的严重限制，但非常
难以引发针对适体的抗体，最可能是因为适体不能经由MHC通过T-细胞来呈递，并且免疫反
应一般经训练以不识别核酸片段。尽管大部分目前批准的抗体治疗剂通过静脉内输注(通
常经2-4小时)来施用，但适体可以通过皮下注射来施用。这种差异主要是由于对于大部分
治疗性mAb具有相当低的溶解性并且因此需要大的体积引起的。具有良好的溶解性(＞
150mg/mL)和相当低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，适体的每周剂量可以通过在低于0.5mL的体积内注射来递送。此外，适体的小尺寸允许其渗透至不允许抗体或抗体片段
渗透的构象约束区域中，呈现出基于适体的治疗或预防的再另一个优势。
的特定优势。例如，适体完全地通过体外的过程来产生，从而允许快速合成。体外选择允许
紧密地控制适体的特异性和亲和力。另外，适体作为一类已经证明了很低或没有毒性或免
疫原性。尽管许多单克隆抗体的功效可能受到对抗体自身的免疫反应的严重限制，但非常
难以引发针对适体的抗体，最可能是因为适体不能经由MHC通过T-细胞来呈递，并且免疫反
应一般经训练以不识别核酸片段。尽管大部分目前批准的抗体治疗剂通过静脉内输注(通
常经2-4小时)来施用，但适体可以通过皮下注射来施用。这种差异主要是由于对于大部分
治疗性mAb具有相当低的溶解性并且因此需要大的体积引起的。具有良好的溶解性(＞
150mg/mL)和相当低的分子量(适体：10-50kDa；抗体：150kDa)，适体的每周剂量可以通过在低于0.5mL的体积内注射来递送。此外，适体的小尺寸允许其渗透至不允许抗体或抗体片段
渗透的构象约束区域中，呈现出基于适体的治疗或预防的再另一个优势。
[0226] 适体是化学合成的，并且很容易按照需要放大以满足用于诊断或治疗应用的生产需求。另外，适体在化学上是稳定的。它们可以适应于在暴露于如热和变性剂的因素后再次
获得活性，并且可以在室温下作为冻干粉长期(＞1年)储存。
获得活性，并且可以在室温下作为冻干粉长期(＞1年)储存。
[0227] SELEX
[0228] 用于产生适体的经典方法是使用标题为“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment”(“SELEX”)的方法，总体地描述于例如1990年6月11日提交的现
在被放弃的美国专利申请系列No.07/536,428、名称为“核酸配体”的美国专利No.5,475,
096和名称为“核酸配体”的美国专利No.5,270,163(也参见WO 91/19813)中。每个SELEX鉴
别的核酸配体，即每个适体(或寡核苷酸探针)，是给定靶标化合物或分子的特异性配体。
SELEX方法是基于以下认识：核酸具有形成多种二维和三维结构的足够能力并且在其单体
内具有可用作实际上多种多样化学化合物(不管是单体或是聚合的)的配体(即，形成特异
性的结合对)的足够化学多能性。任何大小或组成的分子可以用作靶标。
在被放弃的美国专利申请系列No.07/536,428、名称为“核酸配体”的美国专利No.5,475,
096和名称为“核酸配体”的美国专利No.5,270,163(也参见WO 91/19813)中。每个SELEX鉴
别的核酸配体，即每个适体(或寡核苷酸探针)，是给定靶标化合物或分子的特异性配体。
SELEX方法是基于以下认识：核酸具有形成多种二维和三维结构的足够能力并且在其单体
内具有可用作实际上多种多样化学化合物(不管是单体或是聚合的)的配体(即，形成特异
性的结合对)的足够化学多能性。任何大小或组成的分子可以用作靶标。
[0229] SELEX作为起始点依赖于包含随机化序列的单链寡核苷酸的大文库或集合。寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在一些实例中，集合包含100％随
机或部分随机的寡核苷酸。在其他实例中，集合包含在随机化序列内合并至少一个固定和/
或保守序列的随机或部分随机寡核苷酸。在其他实例中，集合包含在其5’和/或3’端含有至少一个固定和/或保守序列的随机或部分随机寡核苷酸，所述固定和/或保守序列包含寡核
苷酸集合的所有分子共有的序列。固定的序列是如如下的序列：用于PCR引物的杂交位点、
用于RNA聚合酶(例如，T3、T4、T7和SP6)的启动子序列、限制性位点或同型聚合序列(如，聚A或聚T区域)、催化核心、用于选择性结合亲和性柱的位点和其它有利于目标寡核苷酸克隆
和/或测序的序列。保守序列是除了前述固定序列以外的由结合相同靶标的适体成员共有
的序列。
机或部分随机的寡核苷酸。在其他实例中，集合包含在随机化序列内合并至少一个固定和/
或保守序列的随机或部分随机寡核苷酸。在其他实例中，集合包含在其5’和/或3’端含有至少一个固定和/或保守序列的随机或部分随机寡核苷酸，所述固定和/或保守序列包含寡核
苷酸集合的所有分子共有的序列。固定的序列是如如下的序列：用于PCR引物的杂交位点、
用于RNA聚合酶(例如，T3、T4、T7和SP6)的启动子序列、限制性位点或同型聚合序列(如，聚A或聚T区域)、催化核心、用于选择性结合亲和性柱的位点和其它有利于目标寡核苷酸克隆
和/或测序的序列。保守序列是除了前述固定序列以外的由结合相同靶标的适体成员共有
的序列。
[0230] 集合的寡核苷酸优选包括随机化的序列部分以及有效扩增需要的固定序列。通常，起始集合的寡核苷酸含有固定的5’和3’末端序列，其在30-50个随机核苷酸的内部区域的侧翼。随机化的核苷酸可以以多种方式来产生，包括化学合成和从随机切割的细胞核酸
的大小选择。还可以在选择/扩增重复之前或过程中通过诱变来引入或提高测试核酸中的
序列变异。
的大小选择。还可以在选择/扩增重复之前或过程中通过诱变来引入或提高测试核酸中的
序列变异。
[0231] 寡核苷酸的随机序列部分可以是具有任何适宜的长度并且可以包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并且可以包括修饰的或非天然的核苷酸或核苷酸类似物。参见，例
如，美国专利No.5,958,691；美国专利No.5,660,985；美国专利No.5,958,691；美国专利
No.5,698,687；美国专利No.5,817,635；美国专利No.5,672,695和PCT公开WO 92/07065。可
以使用本领域公知的固相寡核苷酸合成技术从磷酸二酯连接的核苷酸来合成随机寡核苷
酸。参见，例如，Froehler等，Nucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，
Tet.Lett.27：5575-5578(1986)。也可以使用溶液相方法如三酯合成方法来合成随机寡核
苷酸。参见，例如，Sood等，Nucl.Acid Res.4：2557(1977)和Hirose等，Tet.Lett.，28：2449(1978)。在自动化的DNA合成设备上进行的典型合成产生1014-1016个单独分子，这是对于大
部分SELEX实验足够的数量。序列设计中足够大的随机序列区域增加了每个合成的分子可
能代表独特序列的可能性。
如，美国专利No.5,958,691；美国专利No.5,660,985；美国专利No.5,958,691；美国专利
No.5,698,687；美国专利No.5,817,635；美国专利No.5,672,695和PCT公开WO 92/07065。可
以使用本领域公知的固相寡核苷酸合成技术从磷酸二酯连接的核苷酸来合成随机寡核苷
酸。参见，例如，Froehler等，Nucl.Acid Res.14：5399-5467(1986)和Froehler等，
Tet.Lett.27：5575-5578(1986)。也可以使用溶液相方法如三酯合成方法来合成随机寡核
苷酸。参见，例如，Sood等，Nucl.Acid Res.4：2557(1977)和Hirose等，Tet.Lett.，28：2449(1978)。在自动化的DNA合成设备上进行的典型合成产生1014-1016个单独分子，这是对于大
部分SELEX实验足够的数量。序列设计中足够大的随机序列区域增加了每个合成的分子可
能代表独特序列的可能性。
[0232] 可以通过DNA合成仪上的自动化化学合成来产生寡核苷酸的起始文库。为了合成随机化的序列，在合成方法的过程中每个核苷酸添加步骤添加全部四种核苷酸的混合物，
从而允许核苷酸的随机并入。如上所述，在一个实施方式中，随机寡核苷酸包含完全随机的
序列；然而，在其他实施方式中，随机寡核苷酸可以包含非随机或部分随机序列的延伸链。
可以通过在每个添加步骤添加不同摩尔比的四种核苷酸来形成部分随机序列。
从而允许核苷酸的随机并入。如上所述，在一个实施方式中，随机寡核苷酸包含完全随机的
序列；然而，在其他实施方式中，随机寡核苷酸可以包含非随机或部分随机序列的延伸链。
可以通过在每个添加步骤添加不同摩尔比的四种核苷酸来形成部分随机序列。
[0233] 寡核苷酸的起始文库可以是例如RNA、DNA或RNA/DNA杂合体。起始RNA文库可以通过使用T7RNA聚合酶或修饰的T7RNA聚合酶在体外转录DNA文库并纯化来产生。然后将文库
在有利于结合的条件下与靶标混合，并经历结合、分配和扩增的逐步重复，从而使用相同的
一般选择方案，以实现实际上结合亲和性和选择性的任何所需标准。更具体地，从含有起始
核酸集合的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：(a)在有利于结合的条件下将混合物接
触靶标；(b)将未结合的核酸与已经特异性地结合靶标分子的那些核酸分离；(c)解离核酸-
靶标复合物；(d)扩增从核酸-靶标复合物解离的核酸以产生核酸的配体富集混合物；和(e)
重复结合、分配、解离和扩增的步骤所需量的循环以产生靶标分子的高度特异性的、高亲和
力的核酸配体。在其中选择RNA适体的那些情况中，SELEX方法进一步包括以下步骤：(i)在
步骤(d)中的扩增之前，逆转录从核酸-靶标复合物解离的核酸；和(ii)重新开始该过程之
前转录来自步骤(d)的扩增的核酸。
在有利于结合的条件下与靶标混合，并经历结合、分配和扩增的逐步重复，从而使用相同的
一般选择方案，以实现实际上结合亲和性和选择性的任何所需标准。更具体地，从含有起始
核酸集合的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：(a)在有利于结合的条件下将混合物接
触靶标；(b)将未结合的核酸与已经特异性地结合靶标分子的那些核酸分离；(c)解离核酸-
靶标复合物；(d)扩增从核酸-靶标复合物解离的核酸以产生核酸的配体富集混合物；和(e)
重复结合、分配、解离和扩增的步骤所需量的循环以产生靶标分子的高度特异性的、高亲和
力的核酸配体。在其中选择RNA适体的那些情况中，SELEX方法进一步包括以下步骤：(i)在
步骤(d)中的扩增之前，逆转录从核酸-靶标复合物解离的核酸；和(ii)重新开始该过程之
前转录来自步骤(d)的扩增的核酸。
[0234] 在含有大量可能的序列和结构的核酸混合物内，对于给定的靶标存在广泛的结合亲和力。包含例如20个核苷酸随机化片段的核酸混合物可以具有420个候选可能性。对靶标
具有较高亲和力常数的那些很可能结合靶标。在分配、解离和扩增后，产生了第二核酸混合
物，针对较高结合亲和力候选物进行富集。另外的选择轮逐渐地偏向更佳的配体，直至所获
得的核酸混合物主要由仅一个或几个序列组成。然后可以将这些作为纯配体或适体来克
隆、测序和单独地测试结合亲和力。
具有较高亲和力常数的那些很可能结合靶标。在分配、解离和扩增后，产生了第二核酸混合
物，针对较高结合亲和力候选物进行富集。另外的选择轮逐渐地偏向更佳的配体，直至所获
得的核酸混合物主要由仅一个或几个序列组成。然后可以将这些作为纯配体或适体来克
隆、测序和单独地测试结合亲和力。
[0235] 重复选择和扩增的循环直至实现所需的目的。在最一般的情况中，持续选择/扩增直至循环的重复上没有获得结合强度的明显提高。该方法通常用于取样大约1014个不同的
核酸物质，但也可以用于取样多如约1018个不同的核酸物质。一般地，在5至20个循环的程序中选择核酸适体分子。在一个实施方式中，异质性只在最初选择阶段引入，并且在整个重复
过程中不出现。
核酸物质，但也可以用于取样多如约1018个不同的核酸物质。一般地，在5至20个循环的程序中选择核酸适体分子。在一个实施方式中，异质性只在最初选择阶段引入，并且在整个重复
过程中不出现。
[0236] 在SELEX的一个实施方式中，选择过程在分离最强烈地结合选定靶标的那些核酸配体上非常有效，使得只需要一个选择和扩增循环。这样的有效选择可以发生在例如色谱
型方法中，其中核酸与柱上结合的靶标缔合的能力以这样的方式运行以使得柱子能够充分
允许最高亲和力核酸配体的分开和分离。
型方法中，其中核酸与柱上结合的靶标缔合的能力以这样的方式运行以使得柱子能够充分
允许最高亲和力核酸配体的分开和分离。
[0237] 在许多情况中，不必定需要进行SELEX的重复步骤直至鉴别出单一核酸配体。靶标特异性核酸配体溶液可以包括核酸结构或基序的家族，其具有多种保守序列和多种可以置
换或添加但不显著影响核酸配体对靶标的亲和力的序列。通过在完成前终止SELEX过程，有
可能确定核酸配体溶液家族的多个成员的序列。本发明提供了适体集合的鉴别及其用途，
其可以共同地用于表征测试样品。例如，可以通过正向和负向选择轮来鉴别适体集合，以鉴
别表示疾病或病症的细胞、组织或微囊泡。本发明进一步提供了这样的适体集合用于染色、
检测和/或定量样品中的此类细胞、组织或微囊泡的用途，由此允许提供诊断、预后或治疗
诊断。
换或添加但不显著影响核酸配体对靶标的亲和力的序列。通过在完成前终止SELEX过程，有
可能确定核酸配体溶液家族的多个成员的序列。本发明提供了适体集合的鉴别及其用途，
其可以共同地用于表征测试样品。例如，可以通过正向和负向选择轮来鉴别适体集合，以鉴
别表示疾病或病症的细胞、组织或微囊泡。本发明进一步提供了这样的适体集合用于染色、
检测和/或定量样品中的此类细胞、组织或微囊泡的用途，由此允许提供诊断、预后或治疗
诊断。
[0238] 已知存在多种核酸一级、二级和三级结构。已经显示出最常涉及非-沃森-克里克型相互作用的结构或基序称为发夹环、对称和不对称的凸环、假结及其无数组合。此类基序
通常可以在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成。为此，常常优选用含有约20至约50个核
苷酸并且在一些实施方式中约30至约40个核苷酸的随机化区段的核酸序列开始使用连续
随机化区段的SELEX程序。在一个实例中，5’-固定：随机：3’-固定序列包含约30至约50个核苷酸的随机序列。随机区域在本文中可以称为可变区。
通常可以在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成。为此，常常优选用含有约20至约50个核
苷酸并且在一些实施方式中约30至约40个核苷酸的随机化区段的核酸序列开始使用连续
随机化区段的SELEX程序。在一个实例中，5’-固定：随机：3’-固定序列包含约30至约50个核苷酸的随机序列。随机区域在本文中可以称为可变区。
[0239] 已经改进了核心SELEX方法来实现多种特定目标。例如，美国专利No.5,707,796描述了结合凝胶电泳使用SELEX以选择具有特定结构特征的核酸分子，如弯曲DNA。美国专利
No.5,763,177描述了用于选择含有能够结合和/或光致交联和/或光灭活靶分子的光反应
性基团的核酸配体的基于SELEX的方法。美国专利No.5,567,588和美国专利No.5,861,254
描述了基于SELEX的方法，其实现了对靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸之间的
高效分配。美国专利No.5,496,938描述了在进行SELEX方法后获得改进的核酸配体的方法。
美国专利No.5,705,337描述了用于将配体与其靶标共价连接的方法。
No.5,763,177描述了用于选择含有能够结合和/或光致交联和/或光灭活靶分子的光反应
性基团的核酸配体的基于SELEX的方法。美国专利No.5,567,588和美国专利No.5,861,254
描述了基于SELEX的方法，其实现了对靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸之间的
高效分配。美国专利No.5,496,938描述了在进行SELEX方法后获得改进的核酸配体的方法。
美国专利No.5,705,337描述了用于将配体与其靶标共价连接的方法。
[0240] SELEX也可以用于获得结合靶分子上超过一个位点的核酸配体，并且用于获得包括结合靶标上特定位点的非核酸物质的核酸配体。SELEX提供了用于分离和鉴别核酸配体
的方式，所述核酸配体结合任何可预想的(envisionable)靶标，包括大的和小的生物分子，
如核酸-结合蛋白和不知道结合作为其生物功能的部分的核酸的蛋白质，以及脂质、辅因子
和其他小分子。例如，美国专利No.5,580,737公开了通过SELEX鉴别的核酸序列，其能够以
高亲和力结合咖啡因及密切相关的类似物，茶碱。
的方式，所述核酸配体结合任何可预想的(envisionable)靶标，包括大的和小的生物分子，
如核酸-结合蛋白和不知道结合作为其生物功能的部分的核酸的蛋白质，以及脂质、辅因子
和其他小分子。例如，美国专利No.5,580,737公开了通过SELEX鉴别的核酸序列，其能够以
高亲和力结合咖啡因及密切相关的类似物，茶碱。
[0241] 反-SELEX是通过消除具有与一种或多种非靶标分子的交叉反应性的核酸配体序列来提高核酸配体对靶分子的特异性的方法。反-SELEX由以下步骤组成：(a)制备核酸的候
选混合物；(b)将候选混合物接触靶标，其中可以从剩余的候选混合物分离出相对于候选混
合物对靶标具有提高的亲和力的核酸；(c)从候选混合物剩余部分分离出亲和力提高的核
酸；(d)从靶标解离亲和力提高的核酸；(e)将亲和力提高的核酸与一种或多种非靶分子接
触，使得除去对非靶分子具有特异性亲和力的核酸配体；和(f)将只对靶标分子具有特异性
亲和力的核酸扩增，以产生针对具有结合靶分子的相对较高亲和力和特异性的核酸序列富
集的核酸混合物。如以上针对SELEX所述的，重复选择和扩增的循环直至实现所需目标。
选混合物；(b)将候选混合物接触靶标，其中可以从剩余的候选混合物分离出相对于候选混
合物对靶标具有提高的亲和力的核酸；(c)从候选混合物剩余部分分离出亲和力提高的核
酸；(d)从靶标解离亲和力提高的核酸；(e)将亲和力提高的核酸与一种或多种非靶分子接
触，使得除去对非靶分子具有特异性亲和力的核酸配体；和(f)将只对靶标分子具有特异性
亲和力的核酸扩增，以产生针对具有结合靶分子的相对较高亲和力和特异性的核酸序列富
集的核酸混合物。如以上针对SELEX所述的，重复选择和扩增的循环直至实现所需目标。
[0242] 核酸作为治疗剂和疫苗使用中遇到的潜在问题是磷酸二酯形式的寡核苷酸可能在呈现所需效果前在体液中通过胞内和胞外酶(如，内切核酸酶和外切核酸酶)快速降解。
因此，SELEX方法包括鉴别高亲和力核酸配体，其含有赋予配体改善的特征的修饰核苷酸，
如提高的体内稳定性或性状的递送特征。此类修饰的实例包括核糖和/或磷酸酯和/或碱基
位置的化学取代。含有修饰核苷酸的SELEX鉴别的核酸配体描述于例如美国专利No.5,660,
985(其描述了在核糖2’位、嘧啶5位和嘌呤8位化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸)、美国
专利No.5,756,703(其描述了含有各种2’-修饰嘧啶的寡核苷酸)和美国专利No.5,580,737
(其描述了含有一个或多个由2’-氨基(2′-NH2)、2’-氟(2′-F)和/或2’-O-甲基(2′-OMe)取代基修饰的核苷酸的高特异性核酸配体)中。
因此，SELEX方法包括鉴别高亲和力核酸配体，其含有赋予配体改善的特征的修饰核苷酸，
如提高的体内稳定性或性状的递送特征。此类修饰的实例包括核糖和/或磷酸酯和/或碱基
位置的化学取代。含有修饰核苷酸的SELEX鉴别的核酸配体描述于例如美国专利No.5,660,
985(其描述了在核糖2’位、嘧啶5位和嘌呤8位化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸)、美国
专利No.5,756,703(其描述了含有各种2’-修饰嘧啶的寡核苷酸)和美国专利No.5,580,737
(其描述了含有一个或多个由2’-氨基(2′-NH2)、2’-氟(2′-F)和/或2’-O-甲基(2′-OMe)取代基修饰的核苷酸的高特异性核酸配体)中。
[0243] 本发明中设想的核酸配体的修饰包括，但不限于对核酸配体碱基或对整体的核酸配体提供加入额外电荷、极化性、疏水性、氢键结合、静电相互作用和流变性的化学基团的
那些。产生对核酸酶具有抗性的寡核苷酸群体的修饰还可以包括一个或多个取代的核苷酸
间连接、改变的糖、改变的碱基或其组合。这样的修饰包括，但不限于2’-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；
主链修饰、硫代磷酸酯或烯丙基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基-配对组合，如异碱基
(isobases)异胞苷和异鸟嘌呤核苷。修饰还可以包括3’和5’修饰，如加帽。
那些。产生对核酸酶具有抗性的寡核苷酸群体的修饰还可以包括一个或多个取代的核苷酸
间连接、改变的糖、改变的碱基或其组合。这样的修饰包括，但不限于2’-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；
主链修饰、硫代磷酸酯或烯丙基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基-配对组合，如异碱基
(isobases)异胞苷和异鸟嘌呤核苷。修饰还可以包括3’和5’修饰，如加帽。
[0244] 在一个实施方式中，提供了其中P(O)O基团由P(O)S(“硫酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫酯(dithioate)”)、P(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)替代的寡核苷酸，其中R或R′各自独立地是H或者取代或未取代的烷基。连接基团可以通过-O-、-N-或-S-连接与邻近的寡核苷酸连接。不需要
寡核苷酸中的所有键都相同。如本文中使用的，术语硫代磷酸酯包括磷酸二酯键中的一个
或多个非桥接氧原子被一个或多个硫原子取代。
寡核苷酸中的所有键都相同。如本文中使用的，术语硫代磷酸酯包括磷酸二酯键中的一个
或多个非桥接氧原子被一个或多个硫原子取代。
[0245] 在进一步的实施方式中，寡核苷酸包括修饰的糖基，例如，一个或多个羟基被卤素、脂肪族基团替代，或功能化成醚或胺。在一个实施方式中，呋喃糖残基的2’-位被O-甲
基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤素基团中的任一个取代。2’-修饰糖的合成方法描述于例如Sproat等，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Cotten等，Nucl.Acid
Res.19：2629-2635(1991)；和Hobbs等，Biochemistry 12：5138-5145(1973)中。其他修饰是本领域普通技术人员已知的。这样的修饰可以是SELEX过程前的修饰或SELEX过程后的修饰
(之前鉴别的未修饰配体的修饰)或可以通过结合至SELEX过程中来进行。
基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤素基团中的任一个取代。2’-修饰糖的合成方法描述于例如Sproat等，Nucl.Acid Res.19：733-738(1991)；Cotten等，Nucl.Acid
Res.19：2629-2635(1991)；和Hobbs等，Biochemistry 12：5138-5145(1973)中。其他修饰是本领域普通技术人员已知的。这样的修饰可以是SELEX过程前的修饰或SELEX过程后的修饰
(之前鉴别的未修饰配体的修饰)或可以通过结合至SELEX过程中来进行。
[0246] SELEX过程前的修饰或通过结合至SELEX过程中形成的那些修饰产生了具有对其SELEX靶标的特异性和提高的稳定性(例如，体内稳定性)的核酸配体。对核酸配体形成的
SELEX过程后修饰可以导致提高的稳定性，例如，体内稳定性，而没有不利地影响核酸配体
的结合能力。
SELEX过程后修饰可以导致提高的稳定性，例如，体内稳定性，而没有不利地影响核酸配体
的结合能力。
[0247] SELEX方法包括将选定的寡核苷酸与其他选定的寡核苷酸和非-寡核苷酸功能性单元组合，如描述于美国专利No.5,637,539和美国专利No.5,683,867中。SELEX方法进一步
包括将选定的核酸配体与诊断或治疗复合物中的亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物
组合，如描述于例如美国专利No.6,011,020、美国专利No.6,051,698和PCT公开No.WO98/
18480中。这些专利和申请教导了广泛的形状和其他特性的组合，具有寡核苷酸的有效扩增
和复制特性，并具有所需的其他分子的特性。
包括将选定的核酸配体与诊断或治疗复合物中的亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物
组合，如描述于例如美国专利No.6,011,020、美国专利No.6,051,698和PCT公开No.WO98/
18480中。这些专利和申请教导了广泛的形状和其他特性的组合，具有寡核苷酸的有效扩增
和复制特性，并具有所需的其他分子的特性。
[0248] 已经研究了通过SELEX方法鉴别小的柔性肽的核酸配体。美国专利No.5,648,214鉴别了11个氨基酸的高亲和性RNA核酸配体。
[0249] 可以通过本文中所述的SELEX N方法来选择对本发明的目标靶标具有所需特异性和结合亲和力的适体/寡核苷酸探针。作为SELEX过程的部分，然后任选将选择以结合靶标
的序列最小化以确定具有所需结合亲和力的最小序列。任选通过进行序列的随机或定向诱
变来提高结合亲和力或可选地确定序列中的哪个位置对于结合活性是重要的，从而优化选
定的序列和/或最小化的序列。另外，可以使用结合了修饰的核苷酸的序列来进行选择以对
抗体内降解而稳定适体分子。
的序列最小化以确定具有所需结合亲和力的最小序列。任选通过进行序列的随机或定向诱
变来提高结合亲和力或可选地确定序列中的哪个位置对于结合活性是重要的，从而优化选
定的序列和/或最小化的序列。另外，可以使用结合了修饰的核苷酸的序列来进行选择以对
抗体内降解而稳定适体分子。
[0250] 为使适体适合用作治疗剂，其优选经济地合成、是安全且体内稳定的。由于对核酸酶降解的易感性，野生型RNA和DNA适体在体内通常不稳定。通过在2’-位结合修饰的基团，
可以很大程度上提高对核酸酶降解的抗性。
可以很大程度上提高对核酸酶降解的抗性。
[0251] 氟和氨基基团已经成功地结合至寡核苷酸集合中，随后从所述集合选择适体。然而，这些修饰明显提高了所得到适体的合成成本，并且在一些情况中，由于修饰的核苷酸可
以通过修饰寡核苷酸的降解和随后作为用于DNA合成底物的核苷酸的使用再循环至宿主
DNA中的可能性，可能引起安全性问题。
以通过修饰寡核苷酸的降解和随后作为用于DNA合成底物的核苷酸的使用再循环至宿主
DNA中的可能性，可能引起安全性问题。
[0252] 如本文中提供的，含有2’-O-甲基(“2’-OMe”)核苷酸的适体可以克服一种或多种潜在的缺陷。含有2’-OMe核苷酸的寡核苷酸是核酸酶抗性的并且可以经济地合成。尽管2’-OMe核苷酸在生物系统是普遍存在的，但在生理条件下天然聚合酶不接受2’-OMe NTP作为
底物，因此不存在2’-OMe核苷酸再循环至宿主DNA中的安全性问题。用于产生2’-修饰适体
的SELEX方法描述于例如2002年12月3日提交的美国临时专利申请系列No.60/430,761，
2003年7月15日提交的美国临时专利申请系列No.60/487,474，2003年11月4日提交的美国
临时专利申请系列No.60/517,039，2003年12月3日提交的美国专利申请系列No.10/729,
581和2004年6月21日提交的发明名称为“Methods for in vitro Selection of 2’-O-
methyl substituted Nucleic Acids”的美国专利申请系列No.10/873,856，将其每一篇全
部按引用并入本文中。
底物，因此不存在2’-OMe核苷酸再循环至宿主DNA中的安全性问题。用于产生2’-修饰适体
的SELEX方法描述于例如2002年12月3日提交的美国临时专利申请系列No.60/430,761，
2003年7月15日提交的美国临时专利申请系列No.60/487,474，2003年11月4日提交的美国
临时专利申请系列No.60/517,039，2003年12月3日提交的美国专利申请系列No.10/729,
581和2004年6月21日提交的发明名称为“Methods for in vitro Selection of 2’-O-
methyl substituted Nucleic Acids”的美国专利申请系列No.10/873,856，将其每一篇全
部按引用并入本文中。
[0253] 治疗剂
[0254] 如本文中使用的“治疗有效量”是指减轻(在一定程度上，由熟练的开业医生来判断)受试者中医学病症如疾病或障碍的一种或多种症状的组合物量。另外，组合物的“治疗
有效量”指部分或完全恢复至与疾病或病症相关的或引起疾病或病症的正常生理或生化参
数的量。本领域熟练的临床医师可以确定在施用(如，静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入)时治疗或预防特定疾病病症或障碍的组合物的治疗有效量。除了许多患者特定的考虑
以外，治疗有效所需的组合物的精确量将取决于多种因素，例如，如活性剂的特定活性、使
用的递送装置、药剂的物理特征、施用目的。但在获知本文中所述的公开内容的基础上，治
疗有效量的确定在普通熟练临床医师的能力范围之内。
有效量”指部分或完全恢复至与疾病或病症相关的或引起疾病或病症的正常生理或生化参
数的量。本领域熟练的临床医师可以确定在施用(如，静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入)时治疗或预防特定疾病病症或障碍的组合物的治疗有效量。除了许多患者特定的考虑
以外，治疗有效所需的组合物的精确量将取决于多种因素，例如，如活性剂的特定活性、使
用的递送装置、药剂的物理特征、施用目的。但在获知本文中所述的公开内容的基础上，治
疗有效量的确定在普通熟练临床医师的能力范围之内。
[0255] 如本文中使用的术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”是指治愈性治疗、预防性治疗或防止性治疗。“防止性治疗”的实例是防止或减少所针对的疾病(例如，癌症或其他增殖性疾病)或与其相关的病症的机会。需要治疗的那些包括已经带有疾病或病症的那些以及倾向于患有待防止的疾病或病症的那些。如本文中所用的术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”还描述为了对抗疾病或相关病症目的的哺乳动物的管理和护理，并且
包括施用组合物来减轻症状、副作用或疾病、病症的其他并发症。用于癌症的治疗性处理包
括，但不限于外科手术、化疗、放疗、基因疗法和免疫疗法。
包括施用组合物来减轻症状、副作用或疾病、病症的其他并发症。用于癌症的治疗性处理包
括，但不限于外科手术、化疗、放疗、基因疗法和免疫疗法。
[0256] 如本文中所用的，术语“药剂”或“药物”或“治疗剂”是指怀疑具有治疗性质的化学化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制得的提取物，所述生物材料如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织。药剂或药物可以是纯化的、基本上纯化的
或部分纯化的。根据本发明的“药剂”还包括放疗剂或“化疗剂”。
或部分纯化的。根据本发明的“药剂”还包括放疗剂或“化疗剂”。
[0257] 如本文中所用的，术语“诊断剂”是指患病组织(如，例如，肿瘤)成像中所用的任何化学制品。
[0258] 如本文中所用的，术语“化疗剂”是指具有对抗癌症、赘生物和/或增殖性疾病的活性的药剂，或具有直接杀灭癌细胞能力的药剂。
[0259] 如本文中所用的，“药物制剂”包括用于人和兽医使用的不具有明显不利毒理学效应的制剂。如本文中所用的“药学上可接受的制剂”是指允许本发明的核酸分子在最适于所
需活性的身体位置中有效分布的组合物或制剂。
需活性的身体位置中有效分布的组合物或制剂。
[0260] 如本文中所用的，术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种用于药物活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除非其与活性化合物不相容，任何常规介质或试
剂在组合物中的使用是可预期的。
剂在组合物中的使用是可预期的。
[0261] 作为癌症治疗剂的适体-毒素偶联物
[0262] 之前的工作已经发展出抗体-毒素偶联物(“免疫偶联物”)作为用于广泛适应症的潜在治疗的概念，大部分针对具有血液肿瘤的原发病灶的癌症的治疗。已经在临床前和临
床研究中测试了用于靶向递送的各种不同的有效负载，包括蛋白质毒素、高效能小分子细
胞毒素、放射性同位素和脂质体包裹的药物。尽管这些努力已经成功地产生了几种FDA-批
准的用于血液肿瘤的治疗，但作为一类的免疫偶联物(尤其是用于实体肿瘤)面临可归因于
多种不同的抗体性质的挑战，包括对非人源化抗体产生中和抗体反应的倾向、实体肿瘤中
有限的渗透、作为毒素偶联结果的靶标结合亲和力的丢失以及限制整体治疗指数的抗体半
衰期与毒素偶联物半衰期之间的不平衡(由Reff和Heard，Critical Reviews in
Oncology/Hematology，40(2001)：25-35综述)。
床研究中测试了用于靶向递送的各种不同的有效负载，包括蛋白质毒素、高效能小分子细
胞毒素、放射性同位素和脂质体包裹的药物。尽管这些努力已经成功地产生了几种FDA-批
准的用于血液肿瘤的治疗，但作为一类的免疫偶联物(尤其是用于实体肿瘤)面临可归因于
多种不同的抗体性质的挑战，包括对非人源化抗体产生中和抗体反应的倾向、实体肿瘤中
有限的渗透、作为毒素偶联结果的靶标结合亲和力的丢失以及限制整体治疗指数的抗体半
衰期与毒素偶联物半衰期之间的不平衡(由Reff和Heard，Critical Reviews in
Oncology/Hematology，40(2001)：25-35综述)。
[0263] 适体在靶标识别方面与抗体功能上相似，虽然它们的吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)性质内在地不同，并且它们通常缺乏许多一般与抗体相关的免疫效应子功能(例
如，抗体-依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性)。在比较之前描述的适体和抗体的许多性
质中，几种因素表明通过适体的毒素递送产生了优于使用抗体递送的几种具体的优势，最
终给它们提供了作为治疗剂更好的潜能。通过适体的毒素递送优于抗体的优势的几个实例
如下：
如，抗体-依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性)。在比较之前描述的适体和抗体的许多性
质中，几种因素表明通过适体的毒素递送产生了优于使用抗体递送的几种具体的优势，最
终给它们提供了作为治疗剂更好的潜能。通过适体的毒素递送优于抗体的优势的几个实例
如下：
[0264] 1)适体-毒素偶联物是完全化学合成的。化学合成提供了对偶联物性质的更多控制。例如，可以精确地限定化学计量(每适体的毒素比例)和连接位点。可以容易地测试不同
的接头化学性质。适体折叠的可逆性表示偶联过程中不太可能活性损失并且在调整偶联条
件中提供了更多的灵活性以最大化产量。
的接头化学性质。适体折叠的可逆性表示偶联过程中不太可能活性损失并且在调整偶联条
件中提供了更多的灵活性以最大化产量。
[0265] 2)较小的尺寸允许更好的肿瘤渗透。抗体进入实体肿瘤的不良渗透常常被称为是限制偶联方法效力的因素。参见Colcher，D.，Goel，A.，Pavlinkova，G.，Beresford，G.，Booth，B.，Batra，S.K.(1999)“Effects of genetic engineering on the
pharmacokinetics of antibodies，”Q.J.Nucl.Med.，43：132-139。比较未PEG化的抗-腱生蛋白C适体与相应抗体的性质的研究证明了有效摄取至肿瘤中(如通过肿瘤：血液比限定
的)以及适体定位于肿瘤的证据出乎预料地是长期的(t1/2＞12小时)(Hicke，B.J.，
Stephens，A.W.，″Escort aptamers：a delivery service for diagnosis and therapy″，J.Clin.Invest.，106：923-928(2000))。
pharmacokinetics of antibodies，”Q.J.Nucl.Med.，43：132-139。比较未PEG化的抗-腱生蛋白C适体与相应抗体的性质的研究证明了有效摄取至肿瘤中(如通过肿瘤：血液比限定
的)以及适体定位于肿瘤的证据出乎预料地是长期的(t1/2＞12小时)(Hicke，B.J.，
Stephens，A.W.，″Escort aptamers：a delivery service for diagnosis and therapy″，J.Clin.Invest.，106：923-928(2000))。
[0266] 3)可调PK。适体半衰期/代谢可以更容易地调整以匹配有效负载的性质，从而优化递送毒素至肿瘤而同时最小化全身性暴露的能力。适体主链的适当修饰以及添加高分子量
PEG应当使得可能将适体的半衰期匹配偶联的毒素/接头的固有半衰期，从而最小化对带有
非功能性毒素的代谢物的系统性暴露(在t1/2(适体)＜＜t1/2(毒素)的情况下预期的)并且
降低持久性未偶联适体将功能性阻断偶联适体摄取的可能性(在t1/2(适体)＞＞t1/2(毒素)
的情况下预期的)。
PEG应当使得可能将适体的半衰期匹配偶联的毒素/接头的固有半衰期，从而最小化对带有
非功能性毒素的代谢物的系统性暴露(在t1/2(适体)＜＜t1/2(毒素)的情况下预期的)并且
降低持久性未偶联适体将功能性阻断偶联适体摄取的可能性(在t1/2(适体)＞＞t1/2(毒素)
的情况下预期的)。
[0267] 4)相对低的材料需求。可能的是给药水平将受到细胞毒性有效负载固有的毒性的限制。因此，单一治疗过程将可能需要相对少量(＜100mg)的适体，降低了寡核苷酸合成的
成本将是基于适体疗法的障碍的可能性。
成本将是基于适体疗法的障碍的可能性。
[0268] 5)对于这种适应症优选非肠道施用。不存在开发可替代的制剂以驱动患者/医师接受度的特殊需求。
[0269] 本发明提供了包含治疗有效量的由本发明提供的适体或其盐及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。本发明还提供了包含治疗有效量的适体或其盐及药学上可接
受的载体或稀释剂药物组合物。相关地，本发明提供了一种治疗或缓解疾病或障碍的方法，
包括将药物组合物施用于需要的受试者。将治疗有效量的组合物施用于受试者可以导致：
(a)相对于单独活性剂的递送，活性剂至患病部位的递送增强；或(b)微囊泡清除的增强，导
致适体所靶向的微囊泡的血液水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或
90％的降低；或(c)适体所靶向的微囊泡的生物活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％或90％。在一个实施方式中，微囊泡的生物活性包括免疫抑制或遗传信息
的转移。疾病或障碍可以包括但不限于本文中公开的那些。例如，疾病或障碍包括肿瘤性、
增殖性或炎性、代谢性、心血管或神经疾病或障碍调。参见“表型”章节。
受的载体或稀释剂药物组合物。相关地，本发明提供了一种治疗或缓解疾病或障碍的方法，
包括将药物组合物施用于需要的受试者。将治疗有效量的组合物施用于受试者可以导致：
(a)相对于单独活性剂的递送，活性剂至患病部位的递送增强；或(b)微囊泡清除的增强，导
致适体所靶向的微囊泡的血液水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或
90％的降低；或(c)适体所靶向的微囊泡的生物活性降低至少10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％或90％。在一个实施方式中，微囊泡的生物活性包括免疫抑制或遗传信息
的转移。疾病或障碍可以包括但不限于本文中公开的那些。例如，疾病或障碍包括肿瘤性、
增殖性或炎性、代谢性、心血管或神经疾病或障碍调。参见“表型”章节。
[0270] 抗-靶标和多价寡核苷酸
[0271] 如本文所述的，可以鉴别寡核苷酸探针的靶标。例如，当靶标包含蛋白质或蛋白质复合物(例如，核蛋白或脂蛋白)时，鉴定靶标可以包括使用质谱(MS)、肽质量指纹(PMF；蛋
白质指纹)、测序、N-末端氨基酸分析、C-末端氨基酸分析、Edman降解、色谱、电泳、2维凝胶电泳(2D凝胶)、抗体阵列或免疫分析。这样的方式可以应用于鉴定通过寡核苷酸探针文库
识别的多种靶标。例如，寡核苷酸探针文库可以与目标样品一起孵育，捕获结合的文库成
员，并鉴定与捕获的成员结合的靶标。使用质谱的这种靶标鉴定的实例参见本文中的实施
例9。
白质指纹)、测序、N-末端氨基酸分析、C-末端氨基酸分析、Edman降解、色谱、电泳、2维凝胶电泳(2D凝胶)、抗体阵列或免疫分析。这样的方式可以应用于鉴定通过寡核苷酸探针文库
识别的多种靶标。例如，寡核苷酸探针文库可以与目标样品一起孵育，捕获结合的文库成
员，并鉴定与捕获的成员结合的靶标。使用质谱的这种靶标鉴定的实例参见本文中的实施
例9。
[0272] 对于各种靶标的寡核苷酸适体可以用于多种目标。在一些实施方式中，适体用作治疗剂。使用识别外源/错误折叠的抗原的抗体(例如，抗-CD20、抗-CD30、抗-CD33、抗-
CD52、抗-EGFR、抗-核仁蛋白、抗-核仁磷酸蛋白等)的免疫治疗方法可以经由连接的治疗剂
或通过细胞介导的细胞毒性的激活来刺激免疫细胞而选择性地杀死靶细胞。适体或寡核苷
酸由于各种理由如低成本、小尺寸、合成简易性和速度、稳定性和低免疫原性成为有吸引力
的免疫治疗剂的替代。在一个实施方式中，免疫治疗剂与疾病特异性的靶寡核苷酸或抗体
(Ab)偶联而用于通过补体蛋白质的募集和下游膜攻击复合物的靶向细胞杀灭。参见，例如，
Zhou和Rossi，Cell-type-specific，Aptamer-functionalized Agents for Targeted
Disease Therapy，Mol Ther Nucleic Acids.2014 Jun 17；3：e169.doi：10.1038/
mtna.2014.21；Pei等，Clinical applications of nucleic acid aptamer in cancer，
Mol Clin Oncol.2014May；2(3)：341-348.Epub 2014 Feb 10。这一方式可应用于靶向患病
宿主细胞如癌细胞、格兰氏阴性细菌、病毒和/或寄生虫，等等。
CD52、抗-EGFR、抗-核仁蛋白、抗-核仁磷酸蛋白等)的免疫治疗方法可以经由连接的治疗剂
或通过细胞介导的细胞毒性的激活来刺激免疫细胞而选择性地杀死靶细胞。适体或寡核苷
酸由于各种理由如低成本、小尺寸、合成简易性和速度、稳定性和低免疫原性成为有吸引力
的免疫治疗剂的替代。在一个实施方式中，免疫治疗剂与疾病特异性的靶寡核苷酸或抗体
(Ab)偶联而用于通过补体蛋白质的募集和下游膜攻击复合物的靶向细胞杀灭。参见，例如，
Zhou和Rossi，Cell-type-specific，Aptamer-functionalized Agents for Targeted
Disease Therapy，Mol Ther Nucleic Acids.2014 Jun 17；3：e169.doi：10.1038/
mtna.2014.21；Pei等，Clinical applications of nucleic acid aptamer in cancer，
Mol Clin Oncol.2014May；2(3)：341-348.Epub 2014 Feb 10。这一方式可应用于靶向患病
宿主细胞如癌细胞、格兰氏阴性细菌、病毒和/或寄生虫，等等。
[0273] 在一些实施方式中，本发明提供包含对于生物靶标特异性的结合剂及对于免疫调节实体特异性的另一结合剂的多部分构建体。这类构建体的实例显示于图8中。在该图中的
设计1中，横线指示寡核苷酸构建体，该构建体包含5’引物801(引物1)、可以是目标靶标的
适体的可变区802、3’引物803(引物2)和免疫调节结构域区域(“IMD”)804。完整的设计1构建体可用于使目标靶标接近免疫调节剂。引物可以设计用于任何所需的目的，例如，扩增、
捕获、修饰、直接或间接标记等。在一些实施方式中，可变区的靶标是疾病靶标，且因此构建体靶向疾病组织、细胞或微囊泡。免疫调节结构域区域可以作为免疫刺激剂或抑制剂发挥
作用。可以使用任何适宜的刺激剂或抑制剂，例如，小分子、抗体或适体。因此，构建体可以调节目标靶标处的免疫反应，例如，在携带靶标的细胞或微囊泡处。基本构建体可以按照需
要修饰。例如，图8中的设计2显示了携带引物2 803和IMD 804之间的接头805的构建体。这
样的接头在下面进一步解释且可以按照需要插入在构建体的任何组分之间。接头可以在构
建体的区域之间提供所需的空间且可以被操纵以影响其它性质如稳定性。图8中的设计3显
示了另一实例，其中IMD 804是寡核苷酸且可变区802和IMD 804位于引物801和803之间。本
领域技术人员会理解，一个或多个接头，如设计2的805，也可以插入设计3中，例如，在可变区802和IMD 804之间。本领域技术人员还理解，寡核苷酸区段从5’至3’的排序可以改变，例如，反转。
设计1中，横线指示寡核苷酸构建体，该构建体包含5’引物801(引物1)、可以是目标靶标的
适体的可变区802、3’引物803(引物2)和免疫调节结构域区域(“IMD”)804。完整的设计1构建体可用于使目标靶标接近免疫调节剂。引物可以设计用于任何所需的目的，例如，扩增、
捕获、修饰、直接或间接标记等。在一些实施方式中，可变区的靶标是疾病靶标，且因此构建体靶向疾病组织、细胞或微囊泡。免疫调节结构域区域可以作为免疫刺激剂或抑制剂发挥
作用。可以使用任何适宜的刺激剂或抑制剂，例如，小分子、抗体或适体。因此，构建体可以调节目标靶标处的免疫反应，例如，在携带靶标的细胞或微囊泡处。基本构建体可以按照需
要修饰。例如，图8中的设计2显示了携带引物2 803和IMD 804之间的接头805的构建体。这
样的接头在下面进一步解释且可以按照需要插入在构建体的任何组分之间。接头可以在构
建体的区域之间提供所需的空间且可以被操纵以影响其它性质如稳定性。图8中的设计3显
示了另一实例，其中IMD 804是寡核苷酸且可变区802和IMD 804位于引物801和803之间。本
领域技术人员会理解，一个或多个接头，如设计2的805，也可以插入设计3中，例如，在可变区802和IMD 804之间。本领域技术人员还理解，寡核苷酸区段从5’至3’的排序可以改变，例如，反转。
[0274] 如所指出的，多部分构建体可以如所需的合成和/或修饰。在本发明的一些实施方式中，多部分寡核苷酸构建体在具有或不具有寡核苷酸节段之间的接头的情况下直接合
成。参见，例如，图8设计3，其可以通过引物1 801和引物2 803的扩增直接产生。一个或多个接头可以作为间隔区发挥作用以产生可变区区段802的靶标和IMD区段804的靶标之间所需
的间隔。该间隔可以通过计算机建模或由于立体位阻或其它考虑通过实验确定。
成。参见，例如，图8设计3，其可以通过引物1 801和引物2 803的扩增直接产生。一个或多个接头可以作为间隔区发挥作用以产生可变区区段802的靶标和IMD区段804的靶标之间所需
的间隔。该间隔可以通过计算机建模或由于立体位阻或其它考虑通过实验确定。
[0275] 多部分构建体可以针对任何适宜的靶标产生。靶标可以包括但不限于肿瘤或患病组织、细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞(CTCs)、免疫细胞(例如，B-细胞、T-细胞、巨噬细胞、树突细)、微囊泡、细菌、病毒或其它寄生虫。靶标可以是大的生物复合物，例如，蛋白质复合物、核糖核蛋白复合物、脂质复合物或其组合。应理解，多部分构建体的特定靶标可以是前述大
分子靶标的特定成员。例如，考虑到多部分构建体的所需靶标是细胞或微囊泡。在这样的情
况中，多部分构建体可以针对细胞或微囊泡的特定生物标志物，例如，表面抗原。作为非限
制性的实例，目标靶标可以是B-细胞且多部分构建体的可变区的特定靶标可以是CD20。
CD20是被单克隆抗体(mAb)利妥昔单抗、obinutuzumab、奥法木单抗、替伊莫单抗和托西莫
单抗靶向的B-细胞的细胞标志物，该单克隆抗体用作B-细胞淋巴瘤和白血病治疗的药剂。
作为另一非限制性实例，目标靶标可以是癌细胞且多部分构建体可变区的特定靶标可以是
c-MET。MET是对于胚胎发育和伤口愈合必要的膜受体。癌症中的异常MET激活与不良的预后
相关，其中异常活性的MET触发肿瘤生长、新血管的形成(血管生成)和癌症扩散到其它器官
(转移)。观察到MET在许多类型的人恶性肿瘤中失调，包括肾、肝、胃、乳腺和脑的癌症。其它生物标志物可以按照需要用作特异性靶标。例如，生物标志物可以选自本文中表3-4或10-
17中的任一个，或者2016年6月29日提交的国际专利申请PCT/US2016/040157的表4。
分子靶标的特定成员。例如，考虑到多部分构建体的所需靶标是细胞或微囊泡。在这样的情
况中，多部分构建体可以针对细胞或微囊泡的特定生物标志物，例如，表面抗原。作为非限
制性的实例，目标靶标可以是B-细胞且多部分构建体的可变区的特定靶标可以是CD20。
CD20是被单克隆抗体(mAb)利妥昔单抗、obinutuzumab、奥法木单抗、替伊莫单抗和托西莫
单抗靶向的B-细胞的细胞标志物，该单克隆抗体用作B-细胞淋巴瘤和白血病治疗的药剂。
作为另一非限制性实例，目标靶标可以是癌细胞且多部分构建体可变区的特定靶标可以是
c-MET。MET是对于胚胎发育和伤口愈合必要的膜受体。癌症中的异常MET激活与不良的预后
相关，其中异常活性的MET触发肿瘤生长、新血管的形成(血管生成)和癌症扩散到其它器官
(转移)。观察到MET在许多类型的人恶性肿瘤中失调，包括肾、肝、胃、乳腺和脑的癌症。其它生物标志物可以按照需要用作特异性靶标。例如，生物标志物可以选自本文中表3-4或10-
17中的任一个，或者2016年6月29日提交的国际专利申请PCT/US2016/040157的表4。
[0276] 如上所述，IDM结构域可以构建为诱发补体介导的免疫反应，其可以诱导细胞凋亡。这种IDM可以包括但不限于C1q、C1r、C1s、C1、C3a、C3b、C3d、C5a、C2、C4和细胞因子。IDM区可以包含寡核苷酸序列，包括但不限于Toll-样受体(TLR)激动剂如CpG序列，其是免疫刺
激性的，和/或聚G序列，其可以是抗-增殖的或促凋亡的。该部分可以是刺激免疫反应的疫
苗样部分或抗原。在一个实施方式中，免疫刺激部分包含超抗原。在一些实施方式中，超抗
原可以选自葡萄球菌肠毒素(SEs)、酿脓链球菌外毒素(SPE)、金黄色葡萄球菌毒性休克综
合征毒素(TSST-1)、链球菌致丝裂原外毒素(SME)、链球菌超抗原(SSA)、肝炎表面抗原或其
组合。可以用于本发明的其它细菌抗原包含细胞抗原如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、单
磷酰-脂质A/海藻糖dicorynomycolate(Ribi’s佐剂)、BCG(Calmette-Guerin Bacillus；牛
结核分枝杆菌)和短小棒状杆菌。免疫刺激部分还可以是非特异性免疫刺激剂，如佐剂或其
它非特异性免疫刺激剂。有用的佐剂包括但不限于铝盐、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、角鲨烯、油、MF59和AS03(“佐剂系统03”)。佐剂可以选自阳离子脂质体-DNA复合物JVRS-100、氢氧化铝疫苗佐剂、磷酸铝疫苗佐剂、硫酸铝钾佐剂、Alhydrogel、ISCOM(s)TM、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG DNA疫苗佐剂、霍乱毒素、霍乱毒素B亚基、Liposomes、皂苷(Saponin)疫苗佐剂、DDA佐剂、基于角鲨烯的佐剂、Etx B亚基佐剂、IL-12疫苗佐剂、LTK63疫苗突变体佐
剂、TiterMax Gold佐剂、Ribi疫苗佐剂、Montanide ISA 720佐剂、棒状杆菌源P40疫苗佐
剂、MPLTM佐剂、AS04、AS02、脂多糖疫苗佐剂、胞壁酰二肽佐剂、CRL1005、灭活的短小棒状杆菌疫苗佐剂、Montanide ISA 51、百日咳杆菌组分疫苗佐剂、阳离子脂质体疫苗佐剂、金刚
烷酰胺二肽疫苗佐剂、Arlacel A、VSA-3佐剂、铝疫苗佐剂、Polygen疫苗佐剂、AdjumerTM、Algal Glucan、Bay R1005、 硬脂基酪氨酸(Stearyl Tyrosine)、Specol、
Algammulin、 磷酸钙凝胶、CTA1-DD基因融合蛋白、DOC/明矾复合物、γ菊粉
(Gamma Inulin)、Gerbu佐剂、GM-CSF、GMDP、重组hIFN-γ/干扰素-g、白介素-1β、白介素-2、白介素-7、Sclavo肽、Rehydragel LV、Rehydragel HPA、洛索立宾(Loxoribine)、MF59、MTP-PE脂质体、Murametide、Murapalmitine、D-Murapalmitine、NAGO、非离子表面活性剂囊泡、PMMA、蛋白质螺旋体(Protein Cochleates)、QS-21、SPT(抗原制剂)、纳米乳液疫苗佐剂、
AS03、Quil-A疫苗佐剂、RC529疫苗佐剂、LTR192G疫苗佐剂、大肠杆菌热不稳定毒素、LT、无定形羟基磷酸铝硫酸盐佐剂、磷酸钙疫苗佐剂、Montanide不完全Seppic佐剂、咪喹莫特、瑞喹莫德、AF03、鞭毛蛋白、聚(I：C)、 Abisco-100疫苗佐剂、白蛋白-肝素
微粒疫苗佐剂、AS-2疫苗佐剂、B7-2疫苗佐剂、DHEA疫苗佐剂、含共刺激分子的抗体的免疫
脂质体、SAF-1、Sendai脂蛋白体、含Sendai脂质基质、苏氨酰基胞壁酰二肽(TMDP)、Ty颗粒疫苗佐剂、布比卡因疫苗佐剂、DL-PGL(聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯))疫苗佐剂、IL-15疫
苗佐剂、LTK72疫苗佐剂、MPL-SE疫苗佐剂、霍乱毒素的非毒性突变体E112K mCT-E112K和
Matrix-S。可以用于本发明的多部分构建体的另外的佐剂可以使用Vaxjo数据库确定。参见
Sayers S，Ulysse G，Xiang Z和He Y.Vaxjo：a web-based vaccine adjuvant database
and its application for analysis of vaccine adjuvants and their uses in
vaccine development.Journal of Biomedicine and Biotechnology.2012；2012：
831486.Epub 2012 Mar 13.PMID：22505817；www.violinet.org/vaxjo/。其它有用的非特
异性免疫调节剂包括组织胺、干扰素、转移因子、促吞噬肽、白介素-1、雌性性激素、催乳激素、生长激素维生素D、脱氧胆酸(DCA)、tetrachlorodecaoxide(TCDO)和咪喹莫特或瑞喹莫
德，其是通过toll-样受体7激活免疫细胞的药物。可以产生包含超过一个免疫调节部分的
多部分构建体，例如，使用跨越CpG序列的区段，该序列对于可以刺激细胞凋亡的补体指导
区段是免疫刺激性的。
激性的，和/或聚G序列，其可以是抗-增殖的或促凋亡的。该部分可以是刺激免疫反应的疫
苗样部分或抗原。在一个实施方式中，免疫刺激部分包含超抗原。在一些实施方式中，超抗
原可以选自葡萄球菌肠毒素(SEs)、酿脓链球菌外毒素(SPE)、金黄色葡萄球菌毒性休克综
合征毒素(TSST-1)、链球菌致丝裂原外毒素(SME)、链球菌超抗原(SSA)、肝炎表面抗原或其
组合。可以用于本发明的其它细菌抗原包含细胞抗原如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、单
磷酰-脂质A/海藻糖dicorynomycolate(Ribi’s佐剂)、BCG(Calmette-Guerin Bacillus；牛
结核分枝杆菌)和短小棒状杆菌。免疫刺激部分还可以是非特异性免疫刺激剂，如佐剂或其
它非特异性免疫刺激剂。有用的佐剂包括但不限于铝盐、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、角鲨烯、油、MF59和AS03(“佐剂系统03”)。佐剂可以选自阳离子脂质体-DNA复合物JVRS-100、氢氧化铝疫苗佐剂、磷酸铝疫苗佐剂、硫酸铝钾佐剂、Alhydrogel、ISCOM(s)TM、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG DNA疫苗佐剂、霍乱毒素、霍乱毒素B亚基、Liposomes、皂苷(Saponin)疫苗佐剂、DDA佐剂、基于角鲨烯的佐剂、Etx B亚基佐剂、IL-12疫苗佐剂、LTK63疫苗突变体佐
剂、TiterMax Gold佐剂、Ribi疫苗佐剂、Montanide ISA 720佐剂、棒状杆菌源P40疫苗佐
剂、MPLTM佐剂、AS04、AS02、脂多糖疫苗佐剂、胞壁酰二肽佐剂、CRL1005、灭活的短小棒状杆菌疫苗佐剂、Montanide ISA 51、百日咳杆菌组分疫苗佐剂、阳离子脂质体疫苗佐剂、金刚
烷酰胺二肽疫苗佐剂、Arlacel A、VSA-3佐剂、铝疫苗佐剂、Polygen疫苗佐剂、AdjumerTM、Algal Glucan、Bay R1005、 硬脂基酪氨酸(Stearyl Tyrosine)、Specol、
Algammulin、 磷酸钙凝胶、CTA1-DD基因融合蛋白、DOC/明矾复合物、γ菊粉
(Gamma Inulin)、Gerbu佐剂、GM-CSF、GMDP、重组hIFN-γ/干扰素-g、白介素-1β、白介素-2、白介素-7、Sclavo肽、Rehydragel LV、Rehydragel HPA、洛索立宾(Loxoribine)、MF59、MTP-PE脂质体、Murametide、Murapalmitine、D-Murapalmitine、NAGO、非离子表面活性剂囊泡、PMMA、蛋白质螺旋体(Protein Cochleates)、QS-21、SPT(抗原制剂)、纳米乳液疫苗佐剂、
AS03、Quil-A疫苗佐剂、RC529疫苗佐剂、LTR192G疫苗佐剂、大肠杆菌热不稳定毒素、LT、无定形羟基磷酸铝硫酸盐佐剂、磷酸钙疫苗佐剂、Montanide不完全Seppic佐剂、咪喹莫特、瑞喹莫德、AF03、鞭毛蛋白、聚(I：C)、 Abisco-100疫苗佐剂、白蛋白-肝素
微粒疫苗佐剂、AS-2疫苗佐剂、B7-2疫苗佐剂、DHEA疫苗佐剂、含共刺激分子的抗体的免疫
脂质体、SAF-1、Sendai脂蛋白体、含Sendai脂质基质、苏氨酰基胞壁酰二肽(TMDP)、Ty颗粒疫苗佐剂、布比卡因疫苗佐剂、DL-PGL(聚酯聚(DL-丙交酯-共-乙交酯))疫苗佐剂、IL-15疫
苗佐剂、LTK72疫苗佐剂、MPL-SE疫苗佐剂、霍乱毒素的非毒性突变体E112K mCT-E112K和
Matrix-S。可以用于本发明的多部分构建体的另外的佐剂可以使用Vaxjo数据库确定。参见
Sayers S，Ulysse G，Xiang Z和He Y.Vaxjo：a web-based vaccine adjuvant database
and its application for analysis of vaccine adjuvants and their uses in
vaccine development.Journal of Biomedicine and Biotechnology.2012；2012：
831486.Epub 2012 Mar 13.PMID：22505817；www.violinet.org/vaxjo/。其它有用的非特
异性免疫调节剂包括组织胺、干扰素、转移因子、促吞噬肽、白介素-1、雌性性激素、催乳激素、生长激素维生素D、脱氧胆酸(DCA)、tetrachlorodecaoxide(TCDO)和咪喹莫特或瑞喹莫
德，其是通过toll-样受体7激活免疫细胞的药物。可以产生包含超过一个免疫调节部分的
多部分构建体，例如，使用跨越CpG序列的区段，该序列对于可以刺激细胞凋亡的补体指导
区段是免疫刺激性的。
[0277] 修饰
[0278] 可以对一个或多个本发明的寡核苷酸进行修饰以改变所需的特性，包括但不限于体内稳定性、特异性、亲和力、亲合力或核酸酶易感性。半衰期的改变可以改善体内稳定性
或可以降低稳定性以限制体内毒性。这样的改变可以包括突变、截短或延伸。多部分寡核苷
酸构建体的5’和/或3’末端也可以保护或脱保护以调节稳定性。提高体内稳定性、特异性、亲和力、亲合力或核酸酶敏感性或改变半衰期以影响体内毒性的修饰可以是在5’或3’末端
且包括但不限于以下：锁核酸(LNA)掺入、解锁核酸(UNA)掺入、取代磷酸二酯骨架的硫代磷
酸酯骨架、氨基修饰剂(即C6-dT)、染料偶联物(Cy染料(dues)、荧光团等)、生物素化、PEG接头、点击化学接头、二脱氧核苷酸末端阻断剂、反转末端碱基、胆固醇TEG或其它脂质基标
记。
或可以降低稳定性以限制体内毒性。这样的改变可以包括突变、截短或延伸。多部分寡核苷
酸构建体的5’和/或3’末端也可以保护或脱保护以调节稳定性。提高体内稳定性、特异性、亲和力、亲合力或核酸酶敏感性或改变半衰期以影响体内毒性的修饰可以是在5’或3’末端
且包括但不限于以下：锁核酸(LNA)掺入、解锁核酸(UNA)掺入、取代磷酸二酯骨架的硫代磷
酸酯骨架、氨基修饰剂(即C6-dT)、染料偶联物(Cy染料(dues)、荧光团等)、生物素化、PEG接头、点击化学接头、二脱氧核苷酸末端阻断剂、反转末端碱基、胆固醇TEG或其它脂质基标
记。
[0279] 本发明的寡核苷酸的区段的连接选择可以是在寡核苷酸的5’或3’末端上或者抗体的伯胺、巯基或羧基基团，且包括但不限于以下：生物素-靶寡核苷酸/Ab、链霉亲和素-补体寡核苷酸或相反、氨基修饰的靶Ab/寡核苷酸、硫醇/羧基-补体寡核苷酸或相反、点击化
学-靶Ab/寡核苷酸、相应的点击化学伴体-补体寡核苷酸或相反。连接可以是共价的或非共
价的，且可以包括但不限于对于DNA支架(即DNA折纸结构)、药物/化疗剂、纳米结构、微粒或者胶束或脂质体的单价、多价(即，二、三或四价的)组装。
学-靶Ab/寡核苷酸、相应的点击化学伴体-补体寡核苷酸或相反。连接可以是共价的或非共
价的，且可以包括但不限于对于DNA支架(即DNA折纸结构)、药物/化疗剂、纳米结构、微粒或者胶束或脂质体的单价、多价(即，二、三或四价的)组装。
[0280] 接头可以包含具有同型-或多功能反应性基团的间隔区，其可以在长度和类型上变化。这些包括但不限于以下：间隔区C18、PEG4、PEG6、PEG8和PEG12。
[0281] 本发明的多部分寡核苷酸可进一步包含另外的元件以增加所需的生物学效应。例如，本发明的寡核苷酸可以包含膜破坏性部分。本发明的寡核苷酸也可以与提供这些效果
的一个或多个化学部分偶联。例如，本发明的寡核苷酸可以与清洁剂样部分偶联以破坏靶
细胞或微囊泡的膜。可用的离子型清洁剂包括十二烷基硫酸钠(SDS，月桂基硫酸钠(SLS))、
月桂醇聚醚硫酸钠(SLS，月桂基醚硫酸钠(SLES))、月桂基硫酸铵(ALS)、西曲溴铵、西曲氯
铵、十六烷基三甲铵硬脂酸盐等。有用的非离子(两性离子)清洁剂包括聚乙二醇、聚山梨醇
酯20(也称为Tween 20)、其它聚山梨醇酯(例如，40、60、65、80等)、Triton-X(例如，X100、X114)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、CHAPSO、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、NP-40、糖苷、辛基-硫代-葡萄糖苷、麦芽糖苷等。本领域技术人员将理解，功能性片段，如膜破坏性部分，可以共价或非共价连接于本发明的寡核苷酸。
的一个或多个化学部分偶联。例如，本发明的寡核苷酸可以与清洁剂样部分偶联以破坏靶
细胞或微囊泡的膜。可用的离子型清洁剂包括十二烷基硫酸钠(SDS，月桂基硫酸钠(SLS))、
月桂醇聚醚硫酸钠(SLS，月桂基醚硫酸钠(SLES))、月桂基硫酸铵(ALS)、西曲溴铵、西曲氯
铵、十六烷基三甲铵硬脂酸盐等。有用的非离子(两性离子)清洁剂包括聚乙二醇、聚山梨醇
酯20(也称为Tween 20)、其它聚山梨醇酯(例如，40、60、65、80等)、Triton-X(例如，X100、X114)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、CHAPSO、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、NP-40、糖苷、辛基-硫代-葡萄糖苷、麦芽糖苷等。本领域技术人员将理解，功能性片段，如膜破坏性部分，可以共价或非共价连接于本发明的寡核苷酸。
[0282] 寡核苷酸区段(包括多部分构建体的那些)可以包括本领域技术人员中已知的任何所需的碱基修饰。在某些实施方式中，寡核苷酸区段长度是10-50个核苷酸。本领域技术
人员将理解，这体现为长度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或者其内的任何可得范围的核苷酸的寡核苷酸。
人员将理解，这体现为长度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或者其内的任何可得范围的核苷酸的寡核苷酸。
[0283] 在某些实施方式中，多部分构建体包含含有两个或更多个化学上不同的区域的嵌合寡核苷酸，各个区域由至少一个核苷酸构成。这样的嵌合体可以使用如多部分、多价等的
术语指称。寡核苷酸部分可以包含至少一个赋予一种或多种有益性质的修饰核苷酸区域，
例如，提高的核酸酶抗性、生物利用度、对于靶标的提高的结合亲和力。本发明的嵌合核酸
可以形成为两个或更多个寡核苷酸、两个或更多个类型的寡核苷酸(例如，DNA和RNA节段两
者)、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构形成。这样的化合物在本
领域中也称为杂合体。教导这样的杂合体结构的制备的代表性美国专利包括，但不限于US
专利No：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；
5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自通过引用全文并入本文。
术语指称。寡核苷酸部分可以包含至少一个赋予一种或多种有益性质的修饰核苷酸区域，
例如，提高的核酸酶抗性、生物利用度、对于靶标的提高的结合亲和力。本发明的嵌合核酸
可以形成为两个或更多个寡核苷酸、两个或更多个类型的寡核苷酸(例如，DNA和RNA节段两
者)、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构形成。这样的化合物在本
领域中也称为杂合体。教导这样的杂合体结构的制备的代表性美国专利包括，但不限于US
专利No：5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；
5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自通过引用全文并入本文。
[0284] 在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个在糖的2’位修饰的核苷酸，包括但不限于2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟-修饰的核苷酸。在其它实施方式中，RNA修饰包括嘧啶的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’-O-甲基修饰，RNA的3’末端的基础残基(basic residue)或反转的碱基。这样的修饰常规地并入寡核苷酸中且这些寡核苷酸已经
显示在一些情况中针对给定靶标具有比2’-脱氧寡核苷酸更高的靶标结合亲和力。
显示在一些情况中针对给定靶标具有比2’-脱氧寡核苷酸更高的靶标结合亲和力。
[0285] 多种核苷酸和核苷修饰已经显示为使得寡核苷酸对核酸酶消化具有更高抗性，从而延长体内半衰期。修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含含有例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、
甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖基间连接或短链杂原子或杂环糖基间连接的骨架的那
些。本发明的构建体可以包含具有硫代磷酸酯骨架和/或杂原子骨架的寡核苷酸，例如，
CH2-NH-O-CH2、CH-N(CH3)-O-CH2(称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架)、CH2-O-N(CH3)-CH2、
CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中原始磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH；
酰胺骨架(De Mesmaeker等，1995)；吗啉代骨架结构(Summerton和Weller，U.S.专利No.5,
034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架替代，使得核苷
酸直接或间接结合于聚酰胺骨架的氮杂氮原子)(Nielsen等，1991)，其各自通过引用全文
并入本文。含磷连接包括，但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三
酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其它烷基膦酸酯、亚膦酸酯、包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯类、硫羰基氨基磷酸
酯、硫羰基烷基氨基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常的3′-5′连接的硼代磷酸酯，这些的2’-5’连接的类似物以及具有反转的极性的那些，其中相邻的核苷单元对为3*-5*连
接至5*-3*或2*-5*至5*-2*。参见U.S.专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,
243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,
399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,
821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，其各自通过引用全文并入本文。基于吗啉代的寡聚化合物是本领域中已知的，其描述于Braasch&
Corey，Biochemistry vol.41，no.14，2002，4503-4510页；Genesis vol.30，2001，第3页；
Heasman，J.Dev.Biol.vol.243，2002，209-214页；Nasevicius等Nat.Genet.vol.26，2000，
216-220页；Lacerra等Proc.Natl.Acad.Sci.vol.97，2000，9591-9596页和1991年7月23日
授权的U.S.专利No.5,034,506中，其各自通过引用全文并入本文。环乙烯基核酸寡核苷酸
模拟物描述于Wang等，J.Am.Chem.Soc.Vol.122，2000，8595-8602页，其内容整体并入本文
中。本发明的寡核苷酸可以按照需要包含至少这样的修饰。
甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖基间连接或短链杂原子或杂环糖基间连接的骨架的那
些。本发明的构建体可以包含具有硫代磷酸酯骨架和/或杂原子骨架的寡核苷酸，例如，
CH2-NH-O-CH2、CH-N(CH3)-O-CH2(称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架)、CH2-O-N(CH3)-CH2、
CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中原始磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH；
酰胺骨架(De Mesmaeker等，1995)；吗啉代骨架结构(Summerton和Weller，U.S.专利No.5,
034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架替代，使得核苷
酸直接或间接结合于聚酰胺骨架的氮杂氮原子)(Nielsen等，1991)，其各自通过引用全文
并入本文。含磷连接包括，但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三
酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3’亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其它烷基膦酸酯、亚膦酸酯、包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯类、硫羰基氨基磷酸
酯、硫羰基烷基氨基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常的3′-5′连接的硼代磷酸酯，这些的2’-5’连接的类似物以及具有反转的极性的那些，其中相邻的核苷单元对为3*-5*连
接至5*-3*或2*-5*至5*-2*。参见U.S.专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,
243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,
399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,
821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，其各自通过引用全文并入本文。基于吗啉代的寡聚化合物是本领域中已知的，其描述于Braasch&
Corey，Biochemistry vol.41，no.14，2002，4503-4510页；Genesis vol.30，2001，第3页；
Heasman，J.Dev.Biol.vol.243，2002，209-214页；Nasevicius等Nat.Genet.vol.26，2000，
216-220页；Lacerra等Proc.Natl.Acad.Sci.vol.97，2000，9591-9596页和1991年7月23日
授权的U.S.专利No.5,034,506中，其各自通过引用全文并入本文。环乙烯基核酸寡核苷酸
模拟物描述于Wang等，J.Am.Chem.Soc.Vol.122，2000，8595-8602页，其内容整体并入本文
中。本发明的寡核苷酸可以按照需要包含至少这样的修饰。
[0286] 在其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有可以通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间
键形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨
架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚
甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼
基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的那些；
参见U.S.专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,
264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,
307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,
618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自通过引用全文并入本文。本发明的寡核苷酸可以按照需要包含至少这样的修饰。
键形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨
架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚
甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼
基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2组成部分的那些；
参见U.S.专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,
264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,
307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,
618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自通过引用全文并入本文。本发明的寡核苷酸可以按照需要包含至少这样的修饰。
[0287] 在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含在2’位的一个或多个取代的糖部分，例如，以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n是1-约10；C1-C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；
CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告体基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药代动力学/药效
学性质的基团和具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2’-甲氧基乙氧基[2’-O-
CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)]。其它优选的修饰包括2*-甲氧基(2*-O-CH3)、
2*-丙氧基(2*-OCH2CH2CH3)和2*-氟(2*-F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置进
行，例如，3’末端核苷酸的糖的3’位和5’末端核苷酸的5’位。寡核苷酸也可以具有糖模拟物如替代戊呋喃糖基(pentofuranosyl)的环丁基类。
CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告体基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药代动力学/药效
学性质的基团和具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2’-甲氧基乙氧基[2’-O-
CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)]。其它优选的修饰包括2*-甲氧基(2*-O-CH3)、
2*-丙氧基(2*-OCH2CH2CH3)和2*-氟(2*-F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置进
行，例如，3’末端核苷酸的糖的3’位和5’末端核苷酸的5’位。寡核苷酸也可以具有糖模拟物如替代戊呋喃糖基(pentofuranosyl)的环丁基类。
[0288] 在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个碱基修饰和/或置换。如本文使用的，“未修饰的”或“天然”碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的碱基包括，但不限于仅在天然核酸中很少或瞬时发现的碱基，例如，次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶类，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’-脱氧胞嘧啶
且本领域中通常称为5-Me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合
成的碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤(Komberg，1980；Gebeyehu等，1987)。也可以包括本领域中已知的“通用”碱基，例如，肌苷。
也可以包括5-Me-C置换。这些显示为提高核酸双链体稳定性0.6-1.20C。参见，例如，
Sanghvi等，‘Antisense Research&Applications’，1993，CRC PRESS 276-278页。其它的合适修饰碱基描述于U.S.专利No.3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,
273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,
552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692，和5,681,941中，其各自通过引用并入本文。
且本领域中通常称为5-Me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合
成的碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤(Komberg，1980；Gebeyehu等，1987)。也可以包括本领域中已知的“通用”碱基，例如，肌苷。
也可以包括5-Me-C置换。这些显示为提高核酸双链体稳定性0.6-1.20C。参见，例如，
Sanghvi等，‘Antisense Research&Applications’，1993，CRC PRESS 276-278页。其它的合适修饰碱基描述于U.S.专利No.3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,
273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,
552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692，和5,681,941中，其各自通过引用并入本文。
[0289] 不必要给定寡核苷酸中的所有位置被均匀地修饰，且事实上上述修饰中超过一种可以并入单一寡核苷酸中或甚至在单一寡核苷酸内的单一核苷处。
[0290] 在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸内一个或多个核苷酸单元的糖基和核苷间键两者(即，骨架)被新基团替代。碱基可以保持与适宜的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡
聚化合物(已经证明保持杂交性质的寡核苷酸模拟物)称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，
寡核苷酸的糖-骨架用含酰胺的骨架替代，例如，氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被保留且直
接或间接结合于骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物制备的代表性专利包括，但不
限于U.S.专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等Science vol.254，1991，第1497页中发现，其通过引用并
入本文。
聚化合物(已经证明保持杂交性质的寡核苷酸模拟物)称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，
寡核苷酸的糖-骨架用含酰胺的骨架替代，例如，氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被保留且直
接或间接结合于骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物制备的代表性专利包括，但不
限于U.S.专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过引用并入本文。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等Science vol.254，1991，第1497页中发现，其通过引用并
入本文。
[0291] 在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸连接(共价或非共价)于一个或多个部分或偶联物，其增强活性、细胞分布或定位。这样的部分包括，但不限于脂质部分如胆固醇部分
(Letsinger等Proc.Natl.Acad.Sci.Usa.vol.86，1989，6553-6556页)、胆酸(Manoharan等
Bioorg.Med.Chem.Let.vol.4，1994，1053-1060页)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇
(Manoharan等Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol.660，1992，306-309页；Manoharan等
Bioorg.Med.Chem.Let.vol.3，1993，2765-2770页)、巯基胆固醇(Oberhauser等Nucl.Acids Res.vol.20，1992，533-538等)、脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov等Febs Lett.vol.259，1990，327-330页；Svinarchuk等Biochimie.vol.75，1993，49-54页)、磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯
(Manoharan等Tetrahedron Lett.vol.36，1995，3651-3654页；Shea等Nucl.Acids
Res.vol.18，1990，3777-3783页)、聚胺或聚乙二醇链(Mancharan等Nucleosides&
Nucleotides vol.14，1995，969-973页)或金刚烷乙酸(Manoharan等Tetrahedron
Lett.vol.36，1995，3651-3654页)、棕榈基部分(Mishra等Biochim.Biophys.Acta
vol.1264，1995，229-237页)或者十八烷基胺或己基胺-羰基-t羟胆固醇部分(Crooke等
J.Pharmacol.Exp.Ther.vol.277，1996，923-937页)，其各自通过引用全文并入本文。也参
见U.S.专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,
552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,
045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,
667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,
013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,
254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,
723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,
574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,
941，其各自通过引用全文并入本文。
(Letsinger等Proc.Natl.Acad.Sci.Usa.vol.86，1989，6553-6556页)、胆酸(Manoharan等
Bioorg.Med.Chem.Let.vol.4，1994，1053-1060页)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇
(Manoharan等Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol.660，1992，306-309页；Manoharan等
Bioorg.Med.Chem.Let.vol.3，1993，2765-2770页)、巯基胆固醇(Oberhauser等Nucl.Acids Res.vol.20，1992，533-538等)、脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov等Febs Lett.vol.259，1990，327-330页；Svinarchuk等Biochimie.vol.75，1993，49-54页)、磷脂，例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯
(Manoharan等Tetrahedron Lett.vol.36，1995，3651-3654页；Shea等Nucl.Acids
Res.vol.18，1990，3777-3783页)、聚胺或聚乙二醇链(Mancharan等Nucleosides&
Nucleotides vol.14，1995，969-973页)或金刚烷乙酸(Manoharan等Tetrahedron
Lett.vol.36，1995，3651-3654页)、棕榈基部分(Mishra等Biochim.Biophys.Acta
vol.1264，1995，229-237页)或者十八烷基胺或己基胺-羰基-t羟胆固醇部分(Crooke等
J.Pharmacol.Exp.Ther.vol.277，1996，923-937页)，其各自通过引用全文并入本文。也参
见U.S.专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,
552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,
045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,
667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,
013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,
254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,
723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,
574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,
941，其各自通过引用全文并入本文。
[0292] 本发明的寡核苷酸可以修饰以按照需要加入广泛的修饰核苷酸。例如，构建体可以完全由修饰的核苷酸或用修饰的核苷酸的亚集合成。修饰可以是相同的或不同的。一些
或所有核苷酸可以是修饰的，且被修饰的那些可以包含相同的修饰。例如，包含相同碱基的
所有核苷酸可以具有一种类型的修饰，尽管包含其它碱基的核苷酸可以具有不同类型的修
饰。所有嘌呤核苷酸可以具有一种类型的修饰(或是未修饰的)，而所有嘧啶核苷酸具有另
一种不同类型的修饰(或是未修饰的)。因此，构建体可以包含所需修饰的任何组合，包括例
如核糖核苷酸(2’-OH)、脱氧核糖核苷酸(2’-脱氧)、2’-氨基核苷酸(2’-NH2)、2’-氟代核苷酸(2’-F)和2’-O-甲基(2’-OMe)核苷酸。
或所有核苷酸可以是修饰的，且被修饰的那些可以包含相同的修饰。例如，包含相同碱基的
所有核苷酸可以具有一种类型的修饰，尽管包含其它碱基的核苷酸可以具有不同类型的修
饰。所有嘌呤核苷酸可以具有一种类型的修饰(或是未修饰的)，而所有嘧啶核苷酸具有另
一种不同类型的修饰(或是未修饰的)。因此，构建体可以包含所需修饰的任何组合，包括例
如核糖核苷酸(2’-OH)、脱氧核糖核苷酸(2’-脱氧)、2’-氨基核苷酸(2’-NH2)、2’-氟代核苷酸(2’-F)和2’-O-甲基(2’-OMe)核苷酸。
[0293] 在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸使用包含修饰的核苷酸的转录混合物合成以产生修饰的构建体。例如，转录混合物可以仅包含三磷酸2’-OMe A、G、C和U和/或T(2’-OMe ATP、2’-OMe UTP和/或2*-OMe TTP、2*-OMe CTP和2*-OMe GTP)，称为MNA或mRmY混合
物。由此产生的寡核苷酸称为MNA寡核苷酸或mRmY寡核苷酸且仅包含2’-O-甲基核苷酸。包
含所有2’-OH核苷酸的转录混合物称为“rN”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“rN”、
“rRrY”或RNA寡核苷酸。包含所有脱氧核苷酸的转录混合物称为“dN”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“dN”、“dRdY”或DNA寡核苷酸。或者，核苷酸的亚组(例如，C、U和/或T)可以包含第一修饰核苷酸(例如，2’-OMe)且其余(例如，A和G)包含第二修饰核苷酸(例如，2’-OH或
2’-F)。例如，包含2’-F U及2’-OMe A、G和C的转录混合物称为“fUmV”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fUmV”寡核苷酸。包含2’-F A和G及2’-OMe C和U和/或T的转录混合物称为
“fRmY”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fRmY”寡核苷酸。包含2’-F A及2’-OMe C、G和U和/或T的转录混合物称为“fAmB”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fAmB”寡核苷酸。
物。由此产生的寡核苷酸称为MNA寡核苷酸或mRmY寡核苷酸且仅包含2’-O-甲基核苷酸。包
含所有2’-OH核苷酸的转录混合物称为“rN”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“rN”、
“rRrY”或RNA寡核苷酸。包含所有脱氧核苷酸的转录混合物称为“dN”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“dN”、“dRdY”或DNA寡核苷酸。或者，核苷酸的亚组(例如，C、U和/或T)可以包含第一修饰核苷酸(例如，2’-OMe)且其余(例如，A和G)包含第二修饰核苷酸(例如，2’-OH或
2’-F)。例如，包含2’-F U及2’-OMe A、G和C的转录混合物称为“fUmV”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fUmV”寡核苷酸。包含2’-F A和G及2’-OMe C和U和/或T的转录混合物称为
“fRmY”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fRmY”寡核苷酸。包含2’-F A及2’-OMe C、G和U和/或T的转录混合物称为“fAmB”混合物，且由此产生的寡核苷酸称为“fAmB”寡核苷酸。
[0294] 本领域技术人员可以使用各种加工修饰来改善鉴定前适体区段(例如，包含可变区或对于生物标志物靶标或其它实体的适体的免疫调节区域)。这样的加工修饰的实例包
括，但不限于截短、删除、置换或者糖或碱基或核苷间键的修饰、加帽和PEG化。另外，适体的序列要求可以通过掺杂的再选择或适体药物化学进行研究。掺杂的再选择使用已经基于目
标适体设计的合成的简并池进行。间并性水平通常在目标适体的约70-85％之间变化。一般
地，具有中性突变的序列通过掺杂再选择过程鉴定。适体药物化学是适体改进技术，其中变
体适体的集合被化学合成。这些变体然后彼此比较和与亲本适体比较。适体药物化学用于
探索局部而非全局的取代基引入。例如，可以引入以下修饰：在糖、碱基和/或核苷酸间链的修饰，如2’-脱氧、2’-核糖或2’-O-甲基嘌呤或嘧啶、硫代磷酸酯键可以引入到核苷酸之间，帽可以引入适体的5’或3’末端(如3’反转dT帽)以阻断通过核酸外切酶的降解，或者聚乙二醇(PEG)元件可以添加到适体以增加适体在受试者中的半衰期。
括，但不限于截短、删除、置换或者糖或碱基或核苷间键的修饰、加帽和PEG化。另外，适体的序列要求可以通过掺杂的再选择或适体药物化学进行研究。掺杂的再选择使用已经基于目
标适体设计的合成的简并池进行。间并性水平通常在目标适体的约70-85％之间变化。一般
地，具有中性突变的序列通过掺杂再选择过程鉴定。适体药物化学是适体改进技术，其中变
体适体的集合被化学合成。这些变体然后彼此比较和与亲本适体比较。适体药物化学用于
探索局部而非全局的取代基引入。例如，可以引入以下修饰：在糖、碱基和/或核苷酸间链的修饰，如2’-脱氧、2’-核糖或2’-O-甲基嘌呤或嘧啶、硫代磷酸酯键可以引入到核苷酸之间，帽可以引入适体的5’或3’末端(如3’反转dT帽)以阻断通过核酸外切酶的降解，或者聚乙二醇(PEG)元件可以添加到适体以增加适体在受试者中的半衰期。
[0295] 包含本发明的寡核苷酸的另外的组合物及其用途进一步描述如下。因为本发明提供了鉴定结合特定组织、细胞、微囊泡或其它目标生物实体的寡核苷酸探针的方法，本发明
的寡核苷酸探针靶向这样的实体且固有地是药物候选物、可以用于靶向药物递送的试剂或
两者。
的寡核苷酸探针靶向这样的实体且固有地是药物候选物、可以用于靶向药物递送的试剂或
两者。
[0296] 药物组合物
[0297] 在一个方面，本发明提供药物组合物，其包含一种或多种本发明的寡核苷酸，例如，作为单独的药物、作为药物递送剂、作为如上所述的多部分构建体或其任意组合。本发
明还提供施用这样的组合物的方法。
明还提供施用这样的组合物的方法。
[0298] 如本文所用的术语“病症”意思是身体功能、系统或器官的中断、停止或障碍。代表性的病症包括，但不限于疾病如癌症、炎症、糖尿病和器官衰竭。
[0299] 短语“治疗”、“处理”等包括指定病症的改善或停止。
[0300] 短语“防止”、“预防”等包括避免病症的发作。
[0301] 如本文所用的术语“盐”意思是未共价结合而是通过离子相互作用化学结合的两种化合物。
[0302] 如本文所用的术语“药学上可接受的”在指药物组合物的组分时意思是在施用于动物时该组分不具有与合理的利益/风险比相称的过度的副作用如过度毒性、刺激或变态
反应。因此，如本文所用的术语“药学上可接受的有机溶剂”意思是在施用于动物时不具有
与合理的利益/风险比相称的过度的副作用如过度毒性、刺激或变态反应的有机溶剂。优选
地，药学上可接受的有机溶剂是一般地被美国药物食品监督局(“FDA”)一般认可为安全
(“GRAS”)的溶剂。类似地，如本文所用的术语“药学上可接受的有机碱”意思是在施用于动物时不具有与合理的利益/风险比相称的过度副作用如过度毒性、刺激或变态反应的有机
碱。
反应。因此，如本文所用的术语“药学上可接受的有机溶剂”意思是在施用于动物时不具有
与合理的利益/风险比相称的过度的副作用如过度毒性、刺激或变态反应的有机溶剂。优选
地，药学上可接受的有机溶剂是一般地被美国药物食品监督局(“FDA”)一般认可为安全
(“GRAS”)的溶剂。类似地，如本文所用的术语“药学上可接受的有机碱”意思是在施用于动物时不具有与合理的利益/风险比相称的过度副作用如过度毒性、刺激或变态反应的有机
碱。
[0303] 如本文所用的短语“注射剂”或“可注射组合物”意思是可以抽吸到注射器中并皮下、腹膜内或肌肉内注射到动物中而不引起由于组合物中固体物质的存在导致的副作用的
组合物。固体物质包括，但不限于晶体、胶粘团块和凝胶。通常，当制剂在98°F下通过0.22μm过滤器过滤而不超过约15％，优选不超过约10％，更优选不超过约5％，甚至更优选不超过
约2％和最优选不超过约1％的制剂保留在过滤器上时，制剂或组合物被认为是可注射的。
但是，本发明的一些组合物(其为凝胶)可以容易地从注射器分配，但保留在0.22μm过滤器
上。在一个实施方式中，如本文所用的术语“可注射的”包括这些凝胶组合物。在一个实施方式中，如本文所用的术语“可注射的”还包括在升温到最多约40℃和然后通过0.22μm过滤器过滤时，不超过约15％，优选不超过约10％，更优选不超过约5％，甚至更优选不超过约2％
和最优选不超过约1％的制剂保留在过滤器上的组合物。在一个实施方式中，可注射药物组
合物的实例是在药学上可接受的溶剂中的药物活性化合物(例如，一种或多种本发明的寡
核苷酸，例如，如上所述的多部分构建体、抗-C1Q寡核苷酸、10.36寡核苷酸或其任意组合)
的溶液。本领域技术人员理解，可注射溶液具有固有的性质，例如，无菌性、药学上可接受的赋形剂和不含有害量度的热原或类似污染物。
组合物。固体物质包括，但不限于晶体、胶粘团块和凝胶。通常，当制剂在98°F下通过0.22μm过滤器过滤而不超过约15％，优选不超过约10％，更优选不超过约5％，甚至更优选不超过
约2％和最优选不超过约1％的制剂保留在过滤器上时，制剂或组合物被认为是可注射的。
但是，本发明的一些组合物(其为凝胶)可以容易地从注射器分配，但保留在0.22μm过滤器
上。在一个实施方式中，如本文所用的术语“可注射的”包括这些凝胶组合物。在一个实施方式中，如本文所用的术语“可注射的”还包括在升温到最多约40℃和然后通过0.22μm过滤器过滤时，不超过约15％，优选不超过约10％，更优选不超过约5％，甚至更优选不超过约2％
和最优选不超过约1％的制剂保留在过滤器上的组合物。在一个实施方式中，可注射药物组
合物的实例是在药学上可接受的溶剂中的药物活性化合物(例如，一种或多种本发明的寡
核苷酸，例如，如上所述的多部分构建体、抗-C1Q寡核苷酸、10.36寡核苷酸或其任意组合)
的溶液。本领域技术人员理解，可注射溶液具有固有的性质，例如，无菌性、药学上可接受的赋形剂和不含有害量度的热原或类似污染物。
[0304] 如本文所用的术语“溶液”意思是一种或多种物质(溶质)以分子或离子水平在一种或多种其它物质(溶剂)(通常液体)中的均匀分散的混合物。
[0305] 如本文所用的术语“悬浮液”意思是均匀分散在溶剂(其可以是水性或非水性的)中的固体颗粒。
[0306] 如本文所用的术语“动物”包括，但不限于人、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、羊科动物、猪科动物、两栖动物、爬行动物和鸟类。代表性的动物包括，但不限于奶牛、马、绵羊、猪、有蹄动物、黑猩猩、猴、狒狒、鸡、火鸡、小鼠、兔、大鼠、豚鼠、狗、猫和人。在一个实施方式中，动物是哺乳动物。在一个实施方式中，动物是人。在一个实施方式中，动物是非人类。在一个实施方式中，动物是犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、羊科动物或猪科动物。
[0307] 如本文所用的短语“药物储库”意思是在治疗的动物体内形成的沉着物，其包括一种或多种本发明的寡核苷酸，例如，如上所述的多部分构建体、抗-C1Q寡核苷酸、10.36寡核苷酸或其任意组合，其随时间释放寡核苷酸以提供药物有效量的寡核苷酸。
[0308] 如本文所用的短语“基本上不含”意思是少于约2重量％。例如，短语“药物组合物基本上不含水”意思是药物组合物中水的量少于药物组合物的约2重量％。
[0309] 如本文所用的术语“有效量”意思是足以治疗或预防动物中的病症的量。
[0310] 构成本发明的寡核苷酸的核苷酸可以进行修饰以，例如，提高其稳定性，即增加其体内半衰期，和/或在施用于动物时降低其排泄率。术语“修饰的”包括具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰的核苷酸包括具有共价连接于3′位的羟基基团之外和5′位的磷酸酯基团之外的低分子量有机基团的糖的核苷酸。修饰的核苷酸还包括2′取代的糖如
2′-O-甲基-、2′-O-烷基、′-O-烯丙基、2′-S-烷基、2′-S-烯丙基、2′-氟-、2′-卤代或2′-叠氮基-核糖；碳环糖类似物；α-异头糖；和差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。
2′-O-甲基-、2′-O-烷基、′-O-烯丙基、2′-S-烷基、2′-S-烯丙基、2′-氟-、2′-卤代或2′-叠氮基-核糖；碳环糖类似物；α-异头糖；和差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。
[0311] 修饰的核苷酸是本领域中已知的且包括，但不限于烷基化嘌呤和/或嘧啶；酰基化嘌呤和/或嘧啶；或者其它杂环化合物。这些嘧啶和嘌呤的类别是本领域中已知的且包括假
异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、N4，N4-ethanocytosine、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰
胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5-甲氧基羰甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、假尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、Q核苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤和1-甲基胞嘌呤。
异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、N4，N4-ethanocytosine、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰
胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(mannosylqueosine)、5-甲氧基羰甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、假尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、Q核苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤和1-甲基胞嘌呤。
[0312] 本发明的寡核苷酸也可以通过用可选的连接基团替代一个或多个磷酸二酯连接来修饰。可选的连接基团包括，但不限于其中P(O)O被P(O)S、P(S)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2替代的实施方式，其中各R或R′独立地为H或者取代或未取代的C1-C20烷基。对于P(O)NR2基团的优选的R取代组是氢和甲氧基乙基。连接基团通常通过-O-键连接于各相
邻的核苷酸，但可以被修饰以包括-N-或-S-键。不是寡聚体中的所有连接需要相同。
邻的核苷酸，但可以被修饰以包括-N-或-S-键。不是寡聚体中的所有连接需要相同。
[0313] 本发明的寡核苷酸也可以通过与聚合物的偶联来修饰，例如，以降低在施用于动物时的排泄率。例如，寡核苷酸可以“PEG化”，即与聚乙二醇(“PEG”)偶联。在一个实施方式中，PEG具有约20kD-80kD范围的平均分子量。将寡核苷酸与聚合物如PEG偶联的方法是本领
域技术人员已知的(参见，例如，Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1966)。
域技术人员已知的(参见，例如，Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1966)。
[0314] 如上所述的本发明的寡核苷酸，例如，多部分构建体、抗-C1Q寡核苷酸、10.36寡核苷酸，或其任意组合可以用于本文公开的或本领域中已知的药物组合物中。
[0315] 在一个实施方式中，药物组合物还包含溶剂。
[0316] 在一个实施方式中，溶剂包含水。
[0317] 在一个实施方式中，溶剂包含药学上可接受的有机溶剂。任何有用的和药学上可接受的有机溶剂可以用于本发明的组合物中。
[0318] 在一个实施方式中，药物组合物是药学上可接受的有机溶剂中的盐溶液。
[0319] 在一个实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的有机溶剂且还包含磷脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱。不希望局限于理论，据信在药物组合物注入水中时磷脂、鞘磷脂或磷脂
酰胆碱促进沉淀的形成，且也可以促进寡核苷酸从所得沉淀的受控释放。通常，磷脂、鞘磷
脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的不大于0-10重量％范围的量存在。在一个实施方式中，磷
脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约0.1-10重量％范围的量存在。在一个实施方式
中，磷脂/鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约1-7.5重量％范围的量存在。在一个实施
方式中，磷脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约1.5-5重量％范围的量存在。在一个
实施方式中，磷脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约2-4重量％范围的量存在。
酰胆碱促进沉淀的形成，且也可以促进寡核苷酸从所得沉淀的受控释放。通常，磷脂、鞘磷
脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的不大于0-10重量％范围的量存在。在一个实施方式中，磷
脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约0.1-10重量％范围的量存在。在一个实施方式
中，磷脂/鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约1-7.5重量％范围的量存在。在一个实施
方式中，磷脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约1.5-5重量％范围的量存在。在一个
实施方式中，磷脂、鞘磷脂或磷脂酰胆碱以药物组合物的约2-4重量％范围的量存在。
[0320] 药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的赋形剂或添加剂以提供适合施用于动物的剂型。当施用于动物时，包含寡核苷酸的药物组合物通常作为包含药学上可接受
的载体或赋形剂的组合物的组分施用以提供适合施用于动物的形式。合适的药物赋形剂描
述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro ed.，19th
ed.1995)中，其通过引用并入本文。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、含流体的胶囊、粉末剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂的形式或用于使用的任何其它形式。
的载体或赋形剂的组合物的组分施用以提供适合施用于动物的形式。合适的药物赋形剂描
述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro ed.，19th
ed.1995)中，其通过引用并入本文。药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、含流体的胶囊、粉末剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂的形式或用于使用的任何其它形式。
[0321] 在一个实施方式中，药物组合物配制用于静脉内或肠胃外施用。典型地，用于静脉内或肠胃外施用的组合物包含合适的无菌溶剂，其可以是等渗水性缓冲液或药学上可接受
的有机溶剂。在必要时，组合物也可以包括增溶剂。用于静脉内施用的组合物可以任选地包
括局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。一般地，成分单独地或到一起混合在单
位剂型中供应，例如，作为在气密的容器如指明活性剂的量的安瓿或扁囊中的冻干粉末或
无水浓缩物。在含寡核苷酸的药物组合物通过输注施用的情况中，例如，它们可以用包含例
如无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在药物组合物通过注射施用的情况中，可以提供无
菌注射水、盐水或其它溶剂如药学上可接受的有机溶剂的安瓿，使得成分可以在施用前混
合。
的有机溶剂。在必要时，组合物也可以包括增溶剂。用于静脉内施用的组合物可以任选地包
括局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。一般地，成分单独地或到一起混合在单
位剂型中供应，例如，作为在气密的容器如指明活性剂的量的安瓿或扁囊中的冻干粉末或
无水浓缩物。在含寡核苷酸的药物组合物通过输注施用的情况中，例如，它们可以用包含例
如无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在药物组合物通过注射施用的情况中，可以提供无
菌注射水、盐水或其它溶剂如药学上可接受的有机溶剂的安瓿，使得成分可以在施用前混
合。
[0322] 在另一实施方式中，药物组合物按照常规过程配制为适应于口服施用的组合物。例如，用于口服递送的组合物可以是片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、颗粒、粉末、乳液、胶囊、糖浆或酏剂。口服组合物可以包括标准赋形剂如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。通常，赋形剂为药物级的。口服施用的组合物也可以包含一种或多种试
剂，例如，甜味剂如果糖、阿斯巴甜或糖精；调味剂如薄荷、冬青油或樱桃；着色剂；和防腐剂，以提供药物上适口的制剂。而且，当为片剂或丸剂的形式时，组合物可以包衣以延迟在
胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在延长的时间段内的持续作用。包围渗透活性驱动化合
物的选择性渗透膜也适合于口服施用的组合物。也可以使用延时材料如单硬脂酸甘油或硬
脂酸甘油。
剂，例如，甜味剂如果糖、阿斯巴甜或糖精；调味剂如薄荷、冬青油或樱桃；着色剂；和防腐剂，以提供药物上适口的制剂。而且，当为片剂或丸剂的形式时，组合物可以包衣以延迟在
胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在延长的时间段内的持续作用。包围渗透活性驱动化合
物的选择性渗透膜也适合于口服施用的组合物。也可以使用延时材料如单硬脂酸甘油或硬
脂酸甘油。
[0323] 还包含溶剂的药物组合物可以任选地包含合适量的药学上可接受的防腐剂(如果需要)，以提供另外的针对微生物生长的保护。可用于本发明的药物组合物的防腐剂的实例
包括，但不限于山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、其它对羟基苯甲酸的酯如对羟基苯甲酸丁酯、醇类如乙醇或苯甲醇、酚化合物如苯酚或者季铵化合
物如杀藻胺(例如，苄索氯铵)。
包括，但不限于山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、其它对羟基苯甲酸的酯如对羟基苯甲酸丁酯、醇类如乙醇或苯甲醇、酚化合物如苯酚或者季铵化合
物如杀藻胺(例如，苄索氯铵)。
[0324] 在一个实施方式中，本发明的药物组合物任选地包含合适量的药学上可接受的聚合物。聚合物可以提高药物组合物的粘度。用于本发明的组合物和方法的合适聚合物包括，
但不限于羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、壳聚糖、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。
但不限于羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、壳聚糖、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸。
[0325] 典型地，聚合物以药物组合物的大于0-10重量％范围的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组合物的约0.1-10重量％的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组
合物的约1-7.5重量％的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组合物的约1.5-5重
量％的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组合物的约2-4重量％的量存在。在一个
实施方式中，本发明的药物组合物本项目不含聚合物。
合物的约1-7.5重量％的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组合物的约1.5-5重
量％的量存在。在一个实施方式中，聚合物以药物组合物的约2-4重量％的量存在。在一个
实施方式中，本发明的药物组合物本项目不含聚合物。
[0326] 在一个实施方式中，添加到本发明的药物组合物的任何另外的组分通过FDA指定为用于动物使用或消耗为GRAS。在一个实施方式中，添加到本发明的药物组合物的任何另
外的组分通过FDA指定为用于人使用或消耗为GRAS。
外的组分通过FDA指定为用于人使用或消耗为GRAS。
[0327] 药物组合物的组分(溶剂和任何其它任选的组分)优选是生物相容的和非毒性的，且随时间被身体直接吸收和/或代谢。
[0328] 如上所述，本发明的药物组合物还可以包含溶剂。
[0329] 在一个实施方式中，溶剂包含水。
[0330] 在一个实施方式中，溶剂包含药学上可接受的有机溶剂。
[0331] 在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸，例如，如上所述的多部分构建体、抗-C1Q寡核苷酸、10.36寡核苷酸或其任意组合可作为金属阳离子的盐得到，例如，作为钾或钠盐。
但是，这些盐在水性和/或有机溶剂中可以具有低溶解度，通常低于约25mg/mL。但是，包含
(i)氨基酸酯或氨基酸酰胺和(ii)质子化寡核苷酸的本发明的药物组合物水性和/或有机
溶剂中可以具有显著更高的溶解性。不希望局限于理论，据信氨基酸酯或氨基酸酰胺和质
子化寡核苷酸形成盐，如以上说明的，且盐在水性和/或有机溶剂中可溶。
但是，这些盐在水性和/或有机溶剂中可以具有低溶解度，通常低于约25mg/mL。但是，包含
(i)氨基酸酯或氨基酸酰胺和(ii)质子化寡核苷酸的本发明的药物组合物水性和/或有机
溶剂中可以具有显著更高的溶解性。不希望局限于理论，据信氨基酸酯或氨基酸酰胺和质
子化寡核苷酸形成盐，如以上说明的，且盐在水性和/或有机溶剂中可溶。
[0332] 类似地，不希望局限于理论，据信包含(i)本发明的寡核苷酸、(ii)二价金属阳离子和(iii)任选地羧酸盐、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂的药物组合物形成盐，如以上阐明的，且该盐可溶于水性和/或有机溶剂中。
[0333] 在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约2重量％。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约5重
量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约7.5重量％。在一
个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约10重量％。在一个实施方式
中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约12重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸
在溶剂中的浓度大于药物组合物的约15重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的
浓度范围为药物组合物的约2重量％-5重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-7.5重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-10重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-12重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-15重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-20重量％。
量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约7.5重量％。在一
个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约10重量％。在一个实施方式
中，寡核苷酸在溶剂中的浓度大于药物组合物的约12重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸
在溶剂中的浓度大于药物组合物的约15重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的
浓度范围为药物组合物的约2重量％-5重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-7.5重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-10重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-12重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-15重量％。在一个实施方式中，寡核苷酸在溶剂中的浓
度范围为药物组合物的约2重量％-20重量％。
[0334] 任何药学上可接受的有机溶剂可以用于本发明的药物组合物中。代表性的药学上可接受的有机溶剂包括，但不限于吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、聚乙二醇、丙二醇(即，1，
3-丙二醇)、甘油缩甲醛、异山梨酯二甲醚、乙醇、二甲亚砜、四甘醇、四氢糠醇、三醋精、碳酸丙烯酯、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及其组合。
3-丙二醇)、甘油缩甲醛、异山梨酯二甲醚、乙醇、二甲亚砜、四甘醇、四氢糠醇、三醋精、碳酸丙烯酯、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜及其组合。
[0335] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是水溶性溶剂。代表性的药学上可接受的水溶性有机溶剂是三醋精。
[0336] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是水混溶性溶剂。代表性的药学上可接受的水混溶有机溶剂包括，但不限于甘油缩甲醛、聚乙二醇和丙二醇。
[0337] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含吡咯烷酮。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的吡咯烷酮。
[0338] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含N-甲基-2-吡咯烷酮。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的N-甲基-2-吡咯烷酮。
[0339] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含聚乙二醇。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的聚乙二醇。
[0340] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含丙二醇。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的丙二醇。
[0341] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含甘油缩甲醛。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的甘油缩甲醛。
[0342] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含异山梨酯二甲醚。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的异山梨酯二甲醚。
[0343] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含乙醇。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的乙醇。
[0344] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含二甲亚砜。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的二甲亚砜。
[0345] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含四甘醇。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的四甘醇。
[0346] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含四氢糠醇。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的四氢糠醇。
[0347] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含三醋精。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的三醋精。
[0348] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含碳酸丙烯酯。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的碳酸丙烯酯。
[0349] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含二甲基乙酰胺。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的二甲基乙酰胺。
[0350] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含二甲基甲酰胺。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是基本上不含另一有机溶剂的二甲基甲酰胺。
[0351] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含至少两种药学上可接受的有机溶剂。
[0352] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含N-甲基-2-吡咯烷酮和甘油缩甲醛。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮和甘油缩甲醛。
在一个实施方式中，N-甲基-2-吡咯烷酮与甘油缩甲醛的比率在约90∶10-10∶90的范围内。
在一个实施方式中，N-甲基-2-吡咯烷酮与甘油缩甲醛的比率在约90∶10-10∶90的范围内。
[0353] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含丙二醇和甘油缩甲醛。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是丙二醇和甘油缩甲醛。在一个实施方式中，丙二醇
与甘油缩甲醛的比率在约90∶10-10∶90的范围内。
与甘油缩甲醛的比率在约90∶10-10∶90的范围内。
[0354] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是由FDA认可为对于动物施用或消耗是GRAS的溶剂。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是由FDA认可为对于人施用
或消耗是GRAS的溶剂。
或消耗是GRAS的溶剂。
[0355] 在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂基本上不含水。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含少于约1重量％的水。在一个实施方式中，药学上可接受的有
机溶剂包含少于约0.5重量％的水。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含少于
约0.2重量％的水。基本上不含水的药学上可接受的有机溶剂是有利的，因为它们不适合于
细菌生长。因此，通常不必要在药物组合物中包括基本上不含水的防腐剂。使用药学上可接
受的有机溶剂(优选基本上不含水)作为溶剂的药物组合物的另一优势是寡核苷酸的水解
最小化。通常溶剂中存在的水越多，寡核苷酸可能越容易被水解。因此，包含在使用药学上
可接受的有机溶剂作为溶剂的药物组合物中的寡核苷酸可以比包含在使用水作为溶剂的
药物组合物中的寡核苷酸更稳定。
机溶剂包含少于约0.5重量％的水。在一个实施方式中，药学上可接受的有机溶剂包含少于
约0.2重量％的水。基本上不含水的药学上可接受的有机溶剂是有利的，因为它们不适合于
细菌生长。因此，通常不必要在药物组合物中包括基本上不含水的防腐剂。使用药学上可接
受的有机溶剂(优选基本上不含水)作为溶剂的药物组合物的另一优势是寡核苷酸的水解
最小化。通常溶剂中存在的水越多，寡核苷酸可能越容易被水解。因此，包含在使用药学上
可接受的有机溶剂作为溶剂的药物组合物中的寡核苷酸可以比包含在使用水作为溶剂的
药物组合物中的寡核苷酸更稳定。
[0356] 在包含药学上可接受的有机溶剂的一个实施方式中，药物组合物是可注射的。
[0357] 在一个实施方式中，可注射药物组合物具有充分低的粘度，其可以容易地抽吸到20号针头中和然后容易地从20号针头排出。通常，可注射药物组合物的粘度低于约1,
200cps。在一个实施方式中，可注射药物组合物的粘度低于约1,000cps。在一个实施方式
中，可注射药物组合物的粘度低于约800cps。在一个实施方式中，可注射药物组合物的粘度
低于约500cps。粘度高于约1,200cps和甚至高于约2,000cps的可注射药物组合物(例如凝
胶)也在本发明的范围内，只要组合物可以通过18-24号针头排出。
200cps。在一个实施方式中，可注射药物组合物的粘度低于约1,000cps。在一个实施方式
中，可注射药物组合物的粘度低于约800cps。在一个实施方式中，可注射药物组合物的粘度
低于约500cps。粘度高于约1,200cps和甚至高于约2,000cps的可注射药物组合物(例如凝
胶)也在本发明的范围内，只要组合物可以通过18-24号针头排出。
[0358] 在包含药学上可接受的有机溶剂的一个实施方式中，药物组合物是可注射的且在注入水中时不形成沉淀。
[0359] 在包含药学上可接受的有机溶剂的一个实施方式中，药物组合物是可注射的且在注入水中时形成沉淀。不希望局限于理论，对于包含质子化寡核苷酸和氨基酸酯或酰胺的
药物组合物，据信氨基酸酯或氨基酸酰胺的α-氨基通过寡核苷酸质子化以形成盐，如以上
说明的，其可溶于药学上可接受的有机溶剂中但不溶于水。类似地，当药物组合物包含(i)
寡核苷酸；(ii)二价金属阳离子；和(iii)任选地羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂时，据信组合物的该组分形成盐，如以上说明的，其可溶于药学上可接受的有机溶剂但不溶于水。
因此，当药物组合物注射到动物中时，至少一部分药物组合物在注射部位沉积以提供药物
储库。不希望局限于理论，据信当药物组合物注射到动物中时，药学上可接受的有机溶剂扩
散离开注射部位且水性体液朝向注射部位扩散，导致注射部位处水的浓度提高，其引起至
少一部分组合物沉淀和形成药物储库。沉淀可以采取固体、晶体、胶粘团块或凝胶的形式。
但是，沉淀在注射部位处提供寡核苷酸的储库，其随时间释放寡核苷酸。药物组合物的组
分，即氨基酸酯或氨基酸酰胺、药学上可接受的有机溶剂和任何其它组分，是生物相容的和
非毒性的，且随时间被身体直接地吸收和/或被代谢。
药物组合物，据信氨基酸酯或氨基酸酰胺的α-氨基通过寡核苷酸质子化以形成盐，如以上
说明的，其可溶于药学上可接受的有机溶剂中但不溶于水。类似地，当药物组合物包含(i)
寡核苷酸；(ii)二价金属阳离子；和(iii)任选地羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂时，据信组合物的该组分形成盐，如以上说明的，其可溶于药学上可接受的有机溶剂但不溶于水。
因此，当药物组合物注射到动物中时，至少一部分药物组合物在注射部位沉积以提供药物
储库。不希望局限于理论，据信当药物组合物注射到动物中时，药学上可接受的有机溶剂扩
散离开注射部位且水性体液朝向注射部位扩散，导致注射部位处水的浓度提高，其引起至
少一部分组合物沉淀和形成药物储库。沉淀可以采取固体、晶体、胶粘团块或凝胶的形式。
但是，沉淀在注射部位处提供寡核苷酸的储库，其随时间释放寡核苷酸。药物组合物的组
分，即氨基酸酯或氨基酸酰胺、药学上可接受的有机溶剂和任何其它组分，是生物相容的和
非毒性的，且随时间被身体直接地吸收和/或被代谢。
[0360] 在包含药学上可接受的有机溶剂的一个实施方式中，药物组合物在注入水中(通常约500μL注入约4mL水中)时，其是可注射的并形成脂质体或胶束结构。脂质体或胶束结构
的形成最可能在药物组合物包括磷脂时形成。不希望局限于理论，据信盐形式的寡核苷酸
(其可以是与氨基酸酯或酰胺形成的盐或者可以是与二价金属阳离子和任选地羧酸酯、磷
脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂形成的盐)捕集在脂质体或胶束结构内。不希望局限于理论，据信
当这些药物组合物注射到动物中时，脂质体或胶束结构随时间释放寡核苷酸。
的形成最可能在药物组合物包括磷脂时形成。不希望局限于理论，据信盐形式的寡核苷酸
(其可以是与氨基酸酯或酰胺形成的盐或者可以是与二价金属阳离子和任选地羧酸酯、磷
脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂形成的盐)捕集在脂质体或胶束结构内。不希望局限于理论，据信
当这些药物组合物注射到动物中时，脂质体或胶束结构随时间释放寡核苷酸。
[0361] 在一个实施方式中，还包含药学上可接受的有机溶剂的药物组合物是药学上可接受的有机溶剂中固体颗粒的悬浮液。不希望局限于理论，据信固体颗粒包含在氨基酸酯或
氨基酸酰胺与质子化寡核苷酸之间形成的盐，其中寡核苷酸的酸性磷酸酯基团使氨基酸酯
或氨基酸酰胺的氨基基团质子化，如以上说明的，或包含在寡核苷酸、二价金属离子和任选
的羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱之间形成的盐，如以上说明的。作为悬浮液的药物组合物在注
射到动物中时也形成药物储库。
氨基酸酰胺与质子化寡核苷酸之间形成的盐，其中寡核苷酸的酸性磷酸酯基团使氨基酸酯
或氨基酸酰胺的氨基基团质子化，如以上说明的，或包含在寡核苷酸、二价金属离子和任选
的羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱之间形成的盐，如以上说明的。作为悬浮液的药物组合物在注
射到动物中时也形成药物储库。
[0362] 通过改变氨基酸酯或氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量，有可能改变包括这些组分且还包含有机溶剂的药物组合物的性质。氨基酸酯或氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量
可以通过改变用于形成氨基酸酯(或氨基酸酰胺)的氨基酸和/或醇而变化。例如，氨基酸酯
的亲脂性和/或分子量可以通过改变氨基酸酯R1烃基团而变化。通常，提高R1的分子量增加
氨基酸酯的亲脂性。类似地，氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量可以通过改变氨基酸酰胺的
R3或R4基团而变化。
可以通过改变用于形成氨基酸酯(或氨基酸酰胺)的氨基酸和/或醇而变化。例如，氨基酸酯
的亲脂性和/或分子量可以通过改变氨基酸酯R1烃基团而变化。通常，提高R1的分子量增加
氨基酸酯的亲脂性。类似地，氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量可以通过改变氨基酸酰胺的
R3或R4基团而变化。
[0363] 例如，通过改变氨基酸酯或氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量，有可能改变本发明的寡核苷酸在水中的溶解性，改变寡核苷酸在有机溶剂中的溶解性，改变包含溶剂的药物
组合物的粘度和改变药物组合物可以抽吸到20号针头中和然后从20号针头排出的简易性。
组合物的粘度和改变药物组合物可以抽吸到20号针头中和然后从20号针头排出的简易性。
[0364] 此外，通过改变氨基酸酯或氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量(即，通过改变氨基酸酯的R1或者氨基酸酰胺的R3和R4)，有可能控制还包含有机溶剂的药物组合物在注入水
中时是否形成沉淀。虽然不同的寡核苷酸表现出不同的溶解度和性能，一般地氨基酸酯或
氨基酸酰胺的分子量较高，更有可能质子化寡核苷酸的盐和酰胺的氨基酸酯在注入到水中
时形成沉淀。通常，当氨基酸酯的R1是约C16或更高的烃基时，药物组合物在注入水中时形
成沉淀，且当氨基酸酯的R1是约C12或更低的烃基时，药物组合物在注入到水中时不形成沉
淀。事实上，对于其中是约C12或更低的烃基的氨基酸酯，质子化寡核苷酸和氨基酸酯的盐
在许多情况中可溶于水。类似地，对于氨基酸酰胺，如果R3和R4中碳的总数是16或更大，则
药物组合物在注入到水中时通常形成沉淀，和如果R3和R4中碳的总数是12或更小，则药药
物组合物在注入到水中时不形成沉淀。进一步包含药学上可接受的有机溶剂的药物组合物
是否在注入到水中时形成沉淀可以容易地通过在约98°F下将约0.05mL的药物组合物注入
到约4mL的水中并测定多少物质在组合物与水混合和过滤后保留在0.22μm过滤器上来确
定。通常，在不超过10％的制剂保留在过滤器上时，制剂和组合物被认为是可注射的。在一
个实施方式中，不超过5％的制剂保留在过滤器上。在一个实施方式中，不超过2％的制剂保
留在过滤器上。在一个实施方式中，不超过1％的制剂保留在过滤器上。
中时是否形成沉淀。虽然不同的寡核苷酸表现出不同的溶解度和性能，一般地氨基酸酯或
氨基酸酰胺的分子量较高，更有可能质子化寡核苷酸的盐和酰胺的氨基酸酯在注入到水中
时形成沉淀。通常，当氨基酸酯的R1是约C16或更高的烃基时，药物组合物在注入水中时形
成沉淀，且当氨基酸酯的R1是约C12或更低的烃基时，药物组合物在注入到水中时不形成沉
淀。事实上，对于其中是约C12或更低的烃基的氨基酸酯，质子化寡核苷酸和氨基酸酯的盐
在许多情况中可溶于水。类似地，对于氨基酸酰胺，如果R3和R4中碳的总数是16或更大，则
药物组合物在注入到水中时通常形成沉淀，和如果R3和R4中碳的总数是12或更小，则药药
物组合物在注入到水中时不形成沉淀。进一步包含药学上可接受的有机溶剂的药物组合物
是否在注入到水中时形成沉淀可以容易地通过在约98°F下将约0.05mL的药物组合物注入
到约4mL的水中并测定多少物质在组合物与水混合和过滤后保留在0.22μm过滤器上来确
定。通常，在不超过10％的制剂保留在过滤器上时，制剂和组合物被认为是可注射的。在一
个实施方式中，不超过5％的制剂保留在过滤器上。在一个实施方式中，不超过2％的制剂保
留在过滤器上。在一个实施方式中，不超过1％的制剂保留在过滤器上。
[0365] 类似地，在包含质子化寡核苷酸和天冬氨酸或谷氨酸的二酯或二胺的药物组合物中，有可能通过改变天冬氨酸或谷氨酸的二酯或二胺的量和/或亲脂性和/或分子量来改变
药物组合物的性质。类似地，在包含寡核苷酸、二价金属阳离子和羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂的药物组合物中，有可能通过改变羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂的量和/或
亲脂性和/或分子量来改变药物组合物的性质。
药物组合物的性质。类似地，在包含寡核苷酸、二价金属阳离子和羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂的药物组合物中，有可能通过改变羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂的量和/或
亲脂性和/或分子量来改变药物组合物的性质。
[0366] 此外，当进一步包含有机溶剂的药物组合物在施用于动物时形成储库时，也可能通过氨基酸酯或氨基酸酰胺的亲脂性和/或分子量来改变寡核苷酸从药物储库释放的速
率。一般地，氨基酸酯或氨基酸酰胺越亲脂，寡核苷酸从储库释放越慢。类似地，当进一步包含有机溶剂以及还进一步包含羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂或者天冬氨酸或谷氨酸
的二酯或二胺且在施用于动物时形成储库的药物组合物时，有可能通过改变羧酸酯、磷脂、
磷脂酰胆碱或鞘磷脂或者天冬氨酸或谷氨酸的二酯或二胺的量和/或亲脂性和/或分子量
来改变寡核苷酸从药物储库释放的速率。
率。一般地，氨基酸酯或氨基酸酰胺越亲脂，寡核苷酸从储库释放越慢。类似地，当进一步包含有机溶剂以及还进一步包含羧酸酯、磷脂、磷脂酰胆碱或鞘磷脂或者天冬氨酸或谷氨酸
的二酯或二胺且在施用于动物时形成储库的药物组合物时，有可能通过改变羧酸酯、磷脂、
磷脂酰胆碱或鞘磷脂或者天冬氨酸或谷氨酸的二酯或二胺的量和/或亲脂性和/或分子量
来改变寡核苷酸从药物储库释放的速率。
[0367] 从沉淀释放的速率可以通过注射约50μL的药物组合物到离心管中的约4mL的去离子水中来测量。药物组合物注射到水中的时间记录为T＝0。在指定的时间量T后，样品冷却
到约-9℃并在离心机上以约13,000rpm旋转约20min。所得上清液然后通过HPLC分析以测定
水性溶液中存在的寡核苷酸的量。由离心得到的沉淀物中寡核苷酸的量也可以通过收集沉
淀、将沉淀溶解在约10μL的甲醇中和通过HPLC分析甲醇溶液以测定沉淀中寡核苷酸的量来
测定。水性溶液中寡核苷酸的量和沉淀中寡核苷酸的量通过将对应于寡核苷酸的HPLC峰的
峰面积与寡核苷酸峰面积针对寡核苷酸浓度的标准曲线比较来确定。合适的HPLC条件可以
容易地通过本领域普通技术人员确定。
到约-9℃并在离心机上以约13,000rpm旋转约20min。所得上清液然后通过HPLC分析以测定
水性溶液中存在的寡核苷酸的量。由离心得到的沉淀物中寡核苷酸的量也可以通过收集沉
淀、将沉淀溶解在约10μL的甲醇中和通过HPLC分析甲醇溶液以测定沉淀中寡核苷酸的量来
测定。水性溶液中寡核苷酸的量和沉淀中寡核苷酸的量通过将对应于寡核苷酸的HPLC峰的
峰面积与寡核苷酸峰面积针对寡核苷酸浓度的标准曲线比较来确定。合适的HPLC条件可以
容易地通过本领域普通技术人员确定。
[0368] 治疗方法
[0370] 在一个实施方式中，本发明涉及治疗动物中的病症的方法，包括向需要的动物施用有效量的本发明的药物组合物。
[0371] 在一个实施方式中，本发明涉及预防动物的病症的方法，包括向需要的动物施用有效量的本发明的药物组合物。
[0372] 施用方法包括，但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入或局部。施用模式由实施者的判断决定。在一些实施方式中，施用导致本发明的寡核苷酸(例如，适体、药物靶向适体、多部分构建体或其任意组合)释放到血流中。
[0373] 在一个实施方式中，治疗或预防动物的病症的方法包括通过肠胃外施用本发明的药物组合物向需要的动物施用有效量的寡核苷酸。在一个实施方式中，药物组合物通过输
注或快速浓注施用。在一个实施方式中，药物组合物皮下施用。
注或快速浓注施用。在一个实施方式中，药物组合物皮下施用。
[0374] 在一个实施方式中，治疗或预防动物的病症的方法包括通过口服施用本发明的药物组合物向需要的动物施用有效量的寡核苷酸。在一个实施方式中，组合物是胶囊或片剂
的形式。
的形式。
[0375] 药物组合物也可以通过任何其它试剂盒的途径施用，例如，局部、通过经由上皮或粘膜内衬的吸收(例如，口腔、直肠和肠粘膜等)。
[0376] 药物组合物可以全身或局部施用。
[0377] 药物组合物可以与另一生物活性剂一起施用。
[0378] 在一个实施方式中，动物是哺乳动物。
[0379] 在一个实施方式中，动物是人。
[0380] 在一个实施方式中，动物是非人动物。
[0381] 在一个实施方式中，动物是犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、羊科动物或猪科动物。
[0382] 施用于动物的有效量取决于多种因素，包括但不限于治疗的动物的类型、治疗的病症、病症的严重性和施用的特定多部分构建体。治疗医生可以确定药物组合物的有效量
以治疗动物的病症。
以治疗动物的病症。
[0383] 在一个实施方式中，多部分构建体可以抑制血管生成。在一个实施方式中，多部分构建体可以抑制血管生成且治疗的疾病是癌症。在一个实施方式中，适体可以抑制血管生
成且治疗的疾病是实体肿瘤。
成且治疗的疾病是实体肿瘤。
[0384] 多部分构建体可以是抑制肿瘤生长或癌症的多部分构建体。在实施方式中，癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS
相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中
枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺
癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞
肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的组
合物和方法可用于治疗这些和其它癌症。
相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中
枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺
癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞
肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的组
合物和方法可用于治疗这些和其它癌症。
[0385] 寡核苷酸探针方法
[0386] 核酸序列折叠成其核苷酸序列特定的二级和三级基序。这些基序使正电荷和负电荷定位在核酸序列上使序列能够与靶分子(包括但不限于蛋白质和其他氨基酸序列)上的
特定位置结合的位置中。这些结合序列在本领域称为适体。由于在即使相对短的核苷酸延
伸链中(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)也存在上万亿可能的独特核苷酸序列，因此可以产生大量各种各样的基序，形成用于几乎任何所需的蛋白质或其他靶标的适体。
特定位置结合的位置中。这些结合序列在本领域称为适体。由于在即使相对短的核苷酸延
伸链中(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)也存在上万亿可能的独特核苷酸序列，因此可以产生大量各种各样的基序，形成用于几乎任何所需的蛋白质或其他靶标的适体。
[0387] 如上所述，适体可以通过随机产生特定长度的寡核苷酸来形成，通常为20-80个碱基对长，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个碱基对。然后这些随机的寡核苷酸与目标靶标(例如，组织。细胞、微囊泡、蛋白质等)一起孵育。几个洗涤步骤后，收集并扩增结合靶标的寡核苷酸。扩增的适体反复地加入靶标中，并重复该过程，常常重复15-20次。这种方法的常见形式作为SELEX方法而为本领域技术人员所知。
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个碱基对。然后这些随机的寡核苷酸与目标靶标(例如，组织。细胞、微囊泡、蛋白质等)一起孵育。几个洗涤步骤后，收集并扩增结合靶标的寡核苷酸。扩增的适体反复地加入靶标中，并重复该过程，常常重复15-20次。这种方法的常见形式作为SELEX方法而为本领域技术人员所知。
[0388] 最终结果包括一个或多个具有对靶标的高亲和力的寡核苷酸探针/适体。本发明提供了可以用于提供所需特征的这样得到的适体的进一步处理：1)竞争性结合试验以鉴别
针对所需表位的适体；2)基序分析以通过电脑(in silico)鉴别高亲和力结合配体；和3)适
体选择分析以鉴别可以用于检测特定疾病的适体。在以下及进一步在实施例中更详细地描
述本方法。
针对所需表位的适体；2)基序分析以通过电脑(in silico)鉴别高亲和力结合配体；和3)适
体选择分析以鉴别可以用于检测特定疾病的适体。在以下及进一步在实施例中更详细地描
述本方法。
[0389] 本发明还设想与通过本发明的方法发现的序列高度同源的适体序列。“高同源性”通常是指在多核苷酸序列和参照序列之间40％或更高的同源性，优选60％或更高，70％或
更高，更优选80％或更高，甚至更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高。在一个实施方式中，参照序列包括本文中提供的一种或多种适体的序
列。通常在两个最佳比对序列之间完成百分比同源性(也称为百分比同一性)。用于比较的
序列比对方法是本领域公知的。可以例如使用″Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci
USA 80：726-30(1983)″中的算法来进行序列的最佳比对和比较。也可以使用BLAST来进行
同源性计算，BLAST可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器上找到(Altschul
S F等，Nucleic Acids Res.1997；25(17)：3389-402；Altschul S F等，J Mol.Biol.1990；
215(3)：403-10)。在分离的多核苷酸长于或长度等于参照序列(例如，通过本文中的方法鉴
别的序列)的情况中，可以用全长的参照序列来进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列
的情况中，例如，短于通过本文中的方法鉴别的序列，与相同长度的参照序列的区段进行比
较(排除同源性计算需要的任何环)。
更高，更优选80％或更高，甚至更优选85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高。在一个实施方式中，参照序列包括本文中提供的一种或多种适体的序
列。通常在两个最佳比对序列之间完成百分比同源性(也称为百分比同一性)。用于比较的
序列比对方法是本领域公知的。可以例如使用″Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci
USA 80：726-30(1983)″中的算法来进行序列的最佳比对和比较。也可以使用BLAST来进行
同源性计算，BLAST可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的NCBI服务器上找到(Altschul
S F等，Nucleic Acids Res.1997；25(17)：3389-402；Altschul S F等，J Mol.Biol.1990；
215(3)：403-10)。在分离的多核苷酸长于或长度等于参照序列(例如，通过本文中的方法鉴
别的序列)的情况中，可以用全长的参照序列来进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列
的情况中，例如，短于通过本文中的方法鉴别的序列，与相同长度的参照序列的区段进行比
较(排除同源性计算需要的任何环)。
[0390] 本发明还设想作为通过本发明的方法发现的序列的功能性片段的适体序列。在适体序列的情况中，适体序列的“功能性片段”可以包括结合与全长序列相同的靶标的子序
列。在一些情况中，候选适体序列来自含有5’前导序列和/或3’尾序列的文库的成员。这样的前导序列或尾序列可以用于促进引物结合而用于扩增或捕获等。在这些实施方式中，全
长序列的功能性片段可以包括不存在前导和/或尾序列的候选适体序列的子序列。
列。在一些情况中，候选适体序列来自含有5’前导序列和/或3’尾序列的文库的成员。这样的前导序列或尾序列可以用于促进引物结合而用于扩增或捕获等。在这些实施方式中，全
长序列的功能性片段可以包括不存在前导和/或尾序列的候选适体序列的子序列。
[0391] 竞争性抗体添加
[0392] 已知的适体生产方法可以涉及从靶标序列洗脱所有结合的适体。在一些情况中，这可能不容易鉴别所需的适体序列。例如，在分析中尝试替代抗体时，可能希望的是只收集
结合待替代抗体的特定表位的适体。本发明提供了一种方法，其包括将待替代的抗体加入
适体/靶标反应中以允许选择性地收集结合抗体表位的适体。在一个实施方式中，该方法包
括用目标靶标孵育包含随机产生的寡核苷酸的反应混合物，从不结合靶标的反应混合物除
去未结合的适体，将抗体加入结合该目标表位的反应混合物中，并收集被抗体置换的适体。
靶标可以是生物实体如本文公开的，例如，蛋白质。
结合待替代抗体的特定表位的适体。本发明提供了一种方法，其包括将待替代的抗体加入
适体/靶标反应中以允许选择性地收集结合抗体表位的适体。在一个实施方式中，该方法包
括用目标靶标孵育包含随机产生的寡核苷酸的反应混合物，从不结合靶标的反应混合物除
去未结合的适体，将抗体加入结合该目标表位的反应混合物中，并收集被抗体置换的适体。
靶标可以是生物实体如本文公开的，例如，蛋白质。
[0393] 基序分析
[0394] 在适体实验中，可以鉴别结合给定靶标的多个适体序列。这些适体将具有各种结合亲和力。产生足以评估各自的亲和力的这许多适体的量可能是费时费力的。为了鉴别大
量具有最高亲和力的适体而无需物理上筛选大的子集，本发明提供了一种方法，其包括分
析目标靶标的一种或多种高亲和力适体的二维结构。在一个实施方式中，该方法包括针对
具有相似二维结构或基序但不必定具有相似的一级序列的适体来筛选数据库。在一个实施
方式中，该方法包括使用如本文中公开的或本领域已知的传统方法(例如，表面等离子体共
振结合试验)来鉴别高亲和力适体，模拟高亲和力适体的二维结构，并从预测与高亲和力适
体具有相似二维结构的序列集合中鉴别适体。该方法由此提供了也结合目标靶标的候选物
的集合。可以使用本领域中已知的方法，例如，通过使用商业购得的软件程序(如，Vienna或mFold)进行的自由能(ΔG)计算来预测寡聚物的二维结构，例如，描述于Mathews，D.，
Sabina，J.，Zucker，M.&Turner，H中。热力学参数的扩展序列相关性提供了RNA二级结构的有力预测。J.Mol.Biol.288，911-940(1999)；Hofacker等，Monatshefte f.Chemie 125：
167-188(1994)；和Hofacker，I.L.Vienna RNA secondary structure server.Nucleic
Acids Res.31，3429-3431(2003)，将其内容全部按引用并入。参见图2A-2B。序列的集合可
以使用高通量测序平台(如，来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)的Ion Torrent
平台或来自Illumina，Inc(San Diego，CA)的HiSeq/NextSeq/MiSeq平台)将来自随机产生
的适体候选物集合进行测序。从预测与高亲和力适体具有相似二维结构的序列集合鉴别适
体可以包括将所得到的序列装载至选择的软件程序中以鉴别与高亲和力适体具有相似二
维结构的序列集合的成员。然后可以原位测定序列集合的亲和力，例如，表面等离子体共振
结合分析等。
量具有最高亲和力的适体而无需物理上筛选大的子集，本发明提供了一种方法，其包括分
析目标靶标的一种或多种高亲和力适体的二维结构。在一个实施方式中，该方法包括针对
具有相似二维结构或基序但不必定具有相似的一级序列的适体来筛选数据库。在一个实施
方式中，该方法包括使用如本文中公开的或本领域已知的传统方法(例如，表面等离子体共
振结合试验)来鉴别高亲和力适体，模拟高亲和力适体的二维结构，并从预测与高亲和力适
体具有相似二维结构的序列集合中鉴别适体。该方法由此提供了也结合目标靶标的候选物
的集合。可以使用本领域中已知的方法，例如，通过使用商业购得的软件程序(如，Vienna或mFold)进行的自由能(ΔG)计算来预测寡聚物的二维结构，例如，描述于Mathews，D.，
Sabina，J.，Zucker，M.&Turner，H中。热力学参数的扩展序列相关性提供了RNA二级结构的有力预测。J.Mol.Biol.288，911-940(1999)；Hofacker等，Monatshefte f.Chemie 125：
167-188(1994)；和Hofacker，I.L.Vienna RNA secondary structure server.Nucleic
Acids Res.31，3429-3431(2003)，将其内容全部按引用并入。参见图2A-2B。序列的集合可
以使用高通量测序平台(如，来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)的Ion Torrent
平台或来自Illumina，Inc(San Diego，CA)的HiSeq/NextSeq/MiSeq平台)将来自随机产生
的适体候选物集合进行测序。从预测与高亲和力适体具有相似二维结构的序列集合鉴别适
体可以包括将所得到的序列装载至选择的软件程序中以鉴别与高亲和力适体具有相似二
维结构的序列集合的成员。然后可以原位测定序列集合的亲和力，例如，表面等离子体共振
结合分析等。
[0395] 适体减量方法
[0396] 为了研发检测疾病(例如，癌症)的分析法，通常筛选来自正常和患病患者的已知生物标志物的大群体以鉴别与疾病相关的标志物。这种方法只在其中区别标志物已经有过
描述时有效。为了解决这个问题，本发明提供了一种方法，其包括最初与非靶标组织、微囊
泡、细胞或其它目标靶标一起孵育从大的适体集合减去非区别适体。非靶实体可以是来自
正常/健康/非疾病样品。不结合正常非靶标实体的适体然后与疾病实体一起孵育。结合疾
病实体但不结合正常实体的适体则可能是用于检测疾病的分析的候选物。这种方法不依赖
于知道疾病样品中特定标志物的存在。
描述时有效。为了解决这个问题，本发明提供了一种方法，其包括最初与非靶标组织、微囊
泡、细胞或其它目标靶标一起孵育从大的适体集合减去非区别适体。非靶实体可以是来自
正常/健康/非疾病样品。不结合正常非靶标实体的适体然后与疾病实体一起孵育。结合疾
病实体但不结合正常实体的适体则可能是用于检测疾病的分析的候选物。这种方法不依赖
于知道疾病样品中特定标志物的存在。
[0397] 减量方法可以用于鉴别优先识别所需靶标群体的适体。在一个实施方式中，减量方法用于鉴别先于对照(例如，正常或非疾病的)群体优先识别来自疾病靶标群体的靶标的
适体。疾病靶标群体可以是来自一个或多个患病的个体的组织或者细胞或微囊泡群体，而
对照群体包括来自一个或多个非患病的个体的组织、细胞或微囊泡。疾病可以是癌症或本
文中公开的或本领域已知的其他疾病。因此，该方法提供了相对对照靶标优先鉴别疾病靶
标的适体。
适体。疾病靶标群体可以是来自一个或多个患病的个体的组织或者细胞或微囊泡群体，而
对照群体包括来自一个或多个非患病的个体的组织、细胞或微囊泡。疾病可以是癌症或本
文中公开的或本领域已知的其他疾病。因此，该方法提供了相对对照靶标优先鉴别疾病靶
标的适体。
[0398] 循环微囊泡可以从对照样品分离，例如，来自不存在目标疾病的“正常”个体的血浆，如不存在癌症。使用本文中公开的或本领域已知的方法分离血浆中的囊泡。例如，可以
通过以下方法中的一种从血浆分离囊泡：过滤、超滤、纳米膜超滤、ExoQuick试剂(System
Biosciences，Inc.，Mountain View，CA)、离心、超速离心、使用分子拥挤试剂(例如，TEXIS from Life Technologies)、聚合物沉淀(例如，聚乙二醇(PEG))、亲和性分离、亲和性选择、免疫沉淀、色谱、尺寸排阻或这些方法的任意组合。每种情况中分离的微囊泡将是多个囊泡
类型的混合物，并且将是各种大小的，虽然超滤方法可以具有产生外来体大小的囊泡的更
高倾向。随机产生的寡核苷酸文库(例如，如以下实施例1中所述产生的)与分离的正常囊泡
孵育。分离不结合这些囊泡的适体，例如，通过沉淀囊泡(例如，用PEG)并且收集含有非结合适体的上清液。然后将这些非结合适体接触从患病患者分离的囊泡(例如，使用如上所述的
相同方法)以允许适体识别疾病囊泡。接着，收集结合疾病囊泡的适体。在一个实施方式中，分离囊泡，然后使用离液剂(例如，SDS或相似的去污剂)裂解，且然后通过在亲和柱上运行
裂解混合物来捕获。在生物素偶联的适体集合的情况中，亲和柱可以包括链霉亲和素珠。将
分离的适体扩增。然后可以重复该过程，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19或20次或更多次，以获得具有所需的对于靶标的选择性的适体。
通过以下方法中的一种从血浆分离囊泡：过滤、超滤、纳米膜超滤、ExoQuick试剂(System
Biosciences，Inc.，Mountain View，CA)、离心、超速离心、使用分子拥挤试剂(例如，TEXIS from Life Technologies)、聚合物沉淀(例如，聚乙二醇(PEG))、亲和性分离、亲和性选择、免疫沉淀、色谱、尺寸排阻或这些方法的任意组合。每种情况中分离的微囊泡将是多个囊泡
类型的混合物，并且将是各种大小的，虽然超滤方法可以具有产生外来体大小的囊泡的更
高倾向。随机产生的寡核苷酸文库(例如，如以下实施例1中所述产生的)与分离的正常囊泡
孵育。分离不结合这些囊泡的适体，例如，通过沉淀囊泡(例如，用PEG)并且收集含有非结合适体的上清液。然后将这些非结合适体接触从患病患者分离的囊泡(例如，使用如上所述的
相同方法)以允许适体识别疾病囊泡。接着，收集结合疾病囊泡的适体。在一个实施方式中，分离囊泡，然后使用离液剂(例如，SDS或相似的去污剂)裂解，且然后通过在亲和柱上运行
裂解混合物来捕获。在生物素偶联的适体集合的情况中，亲和柱可以包括链霉亲和素珠。将
分离的适体扩增。然后可以重复该过程，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19或20次或更多次，以获得具有所需的对于靶标的选择性的适体。
[0399] 在本发明的一个方面，鉴定可用于表征目标生物样品的适体谱。在一个实施方式中，将随机产生的寡核苷酸的集合，例如，至少10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、
1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或至少1020个寡核苷酸，接触来自对照群体的生物组分或目标靶标。分离不结合来自对照群体的生物组分或目标靶标的寡核苷酸，然后
接触来自测试群体的生物组分或目标靶标。保留结合来自测试群体的生物组分或目标靶标
的寡核苷酸。保留的寡核苷酸可以用于通过将保留的寡核苷酸接触来自对照群体的生物组
分或目标靶标，分离不结合来自对照群体的生物组分或目标靶标的保留寡核苷酸并且再次
将这些分离的寡核苷酸接触来自测试群体的目标生物组分或靶标并分离结合寡核苷酸而
重复该过程。“组分”或“靶标”可以是样品中存在的寡核苷酸能够结合的任何物质(例如，组织、细胞、微囊泡、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、脂质等)。然后可以重复该过程任何多次所需的反复，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或者更多次。所得到的寡核苷酸包含可以差异地相对于对照检测测试群体的适体。这些适体提供适
体谱，其包括使用一种或多种适体测定的生物印记，例如，包括使用一种或多种适体检测的
组分或靶标的存在或水平的生物印记。
1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或至少1020个寡核苷酸，接触来自对照群体的生物组分或目标靶标。分离不结合来自对照群体的生物组分或目标靶标的寡核苷酸，然后
接触来自测试群体的生物组分或目标靶标。保留结合来自测试群体的生物组分或目标靶标
的寡核苷酸。保留的寡核苷酸可以用于通过将保留的寡核苷酸接触来自对照群体的生物组
分或目标靶标，分离不结合来自对照群体的生物组分或目标靶标的保留寡核苷酸并且再次
将这些分离的寡核苷酸接触来自测试群体的目标生物组分或靶标并分离结合寡核苷酸而
重复该过程。“组分”或“靶标”可以是样品中存在的寡核苷酸能够结合的任何物质(例如，组织、细胞、微囊泡、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、脂质等)。然后可以重复该过程任何多次所需的反复，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或者更多次。所得到的寡核苷酸包含可以差异地相对于对照检测测试群体的适体。这些适体提供适
体谱，其包括使用一种或多种适体测定的生物印记，例如，包括使用一种或多种适体检测的
组分或靶标的存在或水平的生物印记。
[0400] 图3中说明了示例性过程，其表明了使用来自作为对照的正常(非癌症)个体的外来体鉴别优先识别癌症外来体的适体的方法。在该图中，将外来体作为示例，但本领域技术
人员将认识到其他微囊泡可以以相同方式来使用。所得到的适体可以提供可以与正常外来
体差异地检测癌症外来体的谱。本领域技术人员将认识到相同的步骤可以用于得到适体谱
以表征任何目标疾病或病症。该方法也可以应用于组织、细胞或其它目标靶标。
人员将认识到其他微囊泡可以以相同方式来使用。所得到的适体可以提供可以与正常外来
体差异地检测癌症外来体的谱。本领域技术人员将认识到相同的步骤可以用于得到适体谱
以表征任何目标疾病或病症。该方法也可以应用于组织、细胞或其它目标靶标。
[0401] 在一个实施方式中，本发明提供了通过以上方法鉴别的编码多肽或其片段的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了具有与通过以上方法鉴别的核苷酸序列至少60％同一的
核苷酸序列的分离的多核苷酸。更优选地，分离的核酸分子与通过以上方法鉴别的核苷酸
序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高同一。在长度长于或等于参照序列(例如，通过以上方法鉴别的序列)的分
离的多核苷酸的情况中，与全长参照序列进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列的情
况中，例如，短于通过以上方法鉴别的序列，与相同长度的参照序列的区段进行比较(排除
同源性计算需要的任何环)。
核苷酸序列的分离的多核苷酸。更优选地，分离的核酸分子与通过以上方法鉴别的核苷酸
序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高同一。在长度长于或等于参照序列(例如，通过以上方法鉴别的序列)的分
离的多核苷酸的情况中，与全长参照序列进行比较。在分离的多核苷酸短于参照序列的情
况中，例如，短于通过以上方法鉴别的序列，与相同长度的参照序列的区段进行比较(排除
同源性计算需要的任何环)。
[0402] 在相关的方面，本发明提供使用适体谱表征生物表型的方法。可以使用以上的方法来确定适体谱。可以针对测试样品确定适体谱并与对照适体谱进行比较。表型可以是疾
病或失调，如癌症。表征表型可以包括但不限于提供诊断、预后或治疗诊断。因此，适体谱可以对从其获得测试样品的受试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
病或失调，如癌症。表征表型可以包括但不限于提供诊断、预后或治疗诊断。因此，适体谱可以对从其获得测试样品的受试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
[0403] 在另一实施方式中，通过将适体分子的集合接触测试样品，将相同的适体集合接触对照样品和鉴别一种或多种差异地结合测试样品中而非对照样品中(或反之亦然)的组
分或靶标的适体分子来对于测试样品确定适体谱。在生物测试样品或对照样品情况中使用
的“组分”或“靶标”可以是样品中存在的适体能够与其结合的任何物质(例如，组织、细胞、微囊泡、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、脂质等)。例如，如果样品是血浆或血清样品，适体分子可以结合与未患病受试者相比只在疾病状态中表达或差异表达(过表达或表达不足)
的多肽生物标志物。测试样品与对照样品相比的适体谱比较可以是基于适体结合的定性和
定量测量(例如，结合vs.未结合，或测试样品中的结合水平vs参照对照样品中的不同结合
水平)。
分或靶标的适体分子来对于测试样品确定适体谱。在生物测试样品或对照样品情况中使用
的“组分”或“靶标”可以是样品中存在的适体能够与其结合的任何物质(例如，组织、细胞、微囊泡、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、脂质等)。例如，如果样品是血浆或血清样品，适体分子可以结合与未患病受试者相比只在疾病状态中表达或差异表达(过表达或表达不足)
的多肽生物标志物。测试样品与对照样品相比的适体谱比较可以是基于适体结合的定性和
定量测量(例如，结合vs.未结合，或测试样品中的结合水平vs参照对照样品中的不同结合
水平)。
[0404] 在一个方面，本发明提供了一种鉴别靶标-特异性适体谱的方法，包括将生物测试样品接触适体分子的集合，将所述集合接触对照生物样品，鉴别一种或多种结合所述测试
样品而非对照样品中的组分的适体，由此鉴别所述生物测试样品的适体谱。在一个实施方
式中，针对疾病样品来选择适体的集合并与参照相比相比较，结合疾病样品而非参照样品
中的组分的子集中的适体可以使用常规测序技术进行测序以鉴别该结合的子集，由此鉴别
特定疾病样品的适体谱。以这种方式，适体谱提供了用于检测筛选的其他样品中的疾病的
个性化平台。此外，通过选择合适的参照或对照样品，适体谱可以对从其获得测试样品的受
试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
样品而非对照样品中的组分的适体，由此鉴别所述生物测试样品的适体谱。在一个实施方
式中，针对疾病样品来选择适体的集合并与参照相比相比较，结合疾病样品而非参照样品
中的组分的子集中的适体可以使用常规测序技术进行测序以鉴别该结合的子集，由此鉴别
特定疾病样品的适体谱。以这种方式，适体谱提供了用于检测筛选的其他样品中的疾病的
个性化平台。此外，通过选择合适的参照或对照样品，适体谱可以对从其获得测试样品的受
试者提供诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
[0405] 在相关的方面，本发明提供选择适体集合的方法，包括：(a)使生物对照样品与寡核苷酸集合接触；(b)分离不结合生物对照样品的寡核苷酸集合的第一亚集；(c)使生物测
试样品与寡核苷酸集合的第一亚集接触；和(d)分离结合生物测试样品的寡核苷酸集合的
第二亚集，从而选择适体集合。寡核苷酸的集合可以包含任何数量的所需序列，例如，至少
10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或
20
至少10 个寡核苷酸可以存在于起始集合中。可以重复步骤(a)-(d)以进一步精炼(hone)适
体的集合。在一个实施方式中，将这些步骤重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19或至少20次。
试样品与寡核苷酸集合的第一亚集接触；和(d)分离结合生物测试样品的寡核苷酸集合的
第二亚集，从而选择适体集合。寡核苷酸的集合可以包含任何数量的所需序列，例如，至少
10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或
20
至少10 个寡核苷酸可以存在于起始集合中。可以重复步骤(a)-(d)以进一步精炼(hone)适
体的集合。在一个实施方式中，将这些步骤重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19或至少20次。
[0406] 如本文所述的，生物测试样品和生物对照样品可以包含组织、细胞、微囊泡或目标生物标志物。在一个实施方式中，生物测试样品和任选的生物对照样品包含体液。体液可以
包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液、腹水液、恶性流体、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物测试样品和任选的生物对照还可以包括肿瘤样品，例如，来
自肿瘤或肿瘤组织的细胞。在其他实施方式中，生物测试样品和任选的生物对照样品包括
细胞培养基。在实施方式中，生物测试样品包括患病样品，而生物对照样品包括未患病样
品。因此，适体的集合可以用于提供疾病的诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液、腹水液、恶性流体、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物测试样品和任选的生物对照还可以包括肿瘤样品，例如，来
自肿瘤或肿瘤组织的细胞。在其他实施方式中，生物测试样品和任选的生物对照样品包括
细胞培养基。在实施方式中，生物测试样品包括患病样品，而生物对照样品包括未患病样
品。因此，适体的集合可以用于提供疾病的诊断、预后和/或治疗诊断读出结果。
[0407] 如所述的，本发明可用于评价微囊泡。微囊泡是强有力的生物标志物，因为囊泡提供包含多个信息块的一种生物实体。例如，如所述的，囊泡可以具有多种表面抗原，其各自
提供补充的信息。考虑了癌症标志物和组织特异性标志物。如果两种标志物单独存在于样
品中，例如，两者是循环蛋白质或核酸，则不可能确定癌症标志物和组织特异性标志物是否
源自相同的解剖部位。然而，如果癌症标志物和组织特异性标志物两者是单一微囊泡上的
表面抗原，囊泡自身将两种标志物关联并且提供疾病(通过癌症标志物)和疾病的起源(通
过组织特异性标志物)的指示。此外，囊泡可以具有许多可以评价的表面抗原以及有效负
载。因此，本发明提供了一种用于鉴别结合剂的方法，包括将多个细胞外微囊泡接触随机产
生的结合剂文库，鉴别对细胞外微囊泡的一种或多种组分具有亲和力的结合剂文库的亚
集。结合剂可以包括适体、抗体和/或本文中公开的或本领域已知的任何其他有用的结合剂
类型。
提供补充的信息。考虑了癌症标志物和组织特异性标志物。如果两种标志物单独存在于样
品中，例如，两者是循环蛋白质或核酸，则不可能确定癌症标志物和组织特异性标志物是否
源自相同的解剖部位。然而，如果癌症标志物和组织特异性标志物两者是单一微囊泡上的
表面抗原，囊泡自身将两种标志物关联并且提供疾病(通过癌症标志物)和疾病的起源(通
过组织特异性标志物)的指示。此外，囊泡可以具有许多可以评价的表面抗原以及有效负
载。因此，本发明提供了一种用于鉴别结合剂的方法，包括将多个细胞外微囊泡接触随机产
生的结合剂文库，鉴别对细胞外微囊泡的一种或多种组分具有亲和力的结合剂文库的亚
集。结合剂可以包括适体、抗体和/或本文中公开的或本领域已知的任何其他有用的结合剂
类型。
[0408] 在相关的方面，本发明提供用于鉴定多种靶配体的方法，包括(a)使参照微囊泡群体与能够结合一种或多种微囊泡表面标志物的多种配体接触；(b)分离多种参照配体，其中
该多种参照配体包括不具有对于参照微囊泡群体的亲和力的多种配体的亚集；(c)使一种
或多种测试微囊泡与多种参照配体接触；和(d)鉴定来自多种参照配体的与一种或多种测
试微囊泡上的表面标志物形成复合物的配体的亚集，从而鉴定多种靶配体。术语“配体”可
以指结合另一化学实体以形成较大复合物的分子或分子基团。因此，结合剂包括配体。多个
配体可以包括适体、抗体和/或本文中所述的或本领域已知的其他有用结合剂。该过程也可
适用于组织样品。参见，例如，本文中的实施例19-31。
该多种参照配体包括不具有对于参照微囊泡群体的亲和力的多种配体的亚集；(c)使一种
或多种测试微囊泡与多种参照配体接触；和(d)鉴定来自多种参照配体的与一种或多种测
试微囊泡上的表面标志物形成复合物的配体的亚集，从而鉴定多种靶配体。术语“配体”可
以指结合另一化学实体以形成较大复合物的分子或分子基团。因此，结合剂包括配体。多个
配体可以包括适体、抗体和/或本文中所述的或本领域已知的其他有用结合剂。该过程也可
适用于组织样品。参见，例如，本文中的实施例19-31。
[0409] 本发明还提供包含一种或多种实施上述方法的试剂的试剂盒。在一个实施方式中，一种或多种试剂包括包含一种或多种适体、抗体和本文中所述的或本领域已知的其他
有用结合剂的潜在结合剂的文库。
有用结合剂的潜在结合剂的文库。
[0410] 负向和正向适体选择
[0411] 适体可以用于各种生物分析试验中，包括多种类型的依赖于结合剂的分析。例如，适体可以在各种免疫分析中替代抗体来使用或与其一起使用，如夹心分析、流式细胞术和
IHC。本发明提供了适体筛选方法，其鉴别在整个分析步骤中不结合任何表面(基质、管、滤
器、珠子、其他抗原等)但特异性地结合目标抗原的适体。该分析依赖于负向选择来除去结
合最终分析的非靶标抗原组分的适体。负向选择后是正向选择来鉴别结合所需抗原的适
体。
IHC。本发明提供了适体筛选方法，其鉴别在整个分析步骤中不结合任何表面(基质、管、滤
器、珠子、其他抗原等)但特异性地结合目标抗原的适体。该分析依赖于负向选择来除去结
合最终分析的非靶标抗原组分的适体。负向选择后是正向选择来鉴别结合所需抗原的适
体。
[0412] 在一个方面，本发明提供了鉴别对于目标靶标特异性的适体的方法，包括(a)将候选适体的集合接触一种或多种分析组分，其中分析组分不包含目标靶标；(b)回收(a)中不
结合一种或多种分析组分的候选适体集合的成员；(c)将(b)中回收的候选适体集合的成员
在一种或多种混杂靶标的存在下接触目标靶标；和(d)回收步骤(c)中结合目标靶标的候选
适体，由此鉴别对于目标靶标特异性的适体。在该方法中，步骤(a)和(b)提供了负向选择来
除去结合非靶标实体的适体。相反地，步骤(c)和(d)通过鉴别结合目标靶标但不结合其他
混杂靶标(例如，可能存在于包含目标靶标的生物样品中的其他抗原)的适体提供正向选
择。候选适体的集合可以包含至少10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、
1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或至少1020个核酸序列。
结合一种或多种分析组分的候选适体集合的成员；(c)将(b)中回收的候选适体集合的成员
在一种或多种混杂靶标的存在下接触目标靶标；和(d)回收步骤(c)中结合目标靶标的候选
适体，由此鉴别对于目标靶标特异性的适体。在该方法中，步骤(a)和(b)提供了负向选择来
除去结合非靶标实体的适体。相反地，步骤(c)和(d)通过鉴别结合目标靶标但不结合其他
混杂靶标(例如，可能存在于包含目标靶标的生物样品中的其他抗原)的适体提供正向选
择。候选适体的集合可以包含至少10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、
1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019或至少1020个核酸序列。
[0413] 在一些实施方式中，步骤(a)-(b)是任选的。在其它实施方式中，在进行步骤(c)中的正向选择之前，将步骤(a)-(b)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19或至少20次。正向选择也可以进行多轮。在鉴别对于目标靶标特异性的适体之前，可以将步骤(c)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20次。多轮可以提供提高的选择严格性。
17、18、19或至少20次。正向选择也可以进行多轮。在鉴别对于目标靶标特异性的适体之前，可以将步骤(c)-(d)重复至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至少20次。多轮可以提供提高的选择严格性。
[0414] 在一些实施方式中，在负向选择过程中与适体集合接触的一种或多种分析组分包括基质、珠子、平面阵列、柱、管、孔或滤器中的一种或多种。本领域技术人员将认识到分析组分可以包括可以是所需生物分析的部分的任何物质。
[0415] 目标靶标可以是在被适体识别时可以检测的任何适宜的实体。在一个实施方式中，目标靶标包括蛋白质或多肽。如本文中所用的，“蛋白质”、“多肽”和“肽”可以互换使用，除非另外指出。目标靶标可以是核酸，包括DNA、RNA和本文中公开的或本领域已知的其任何
一种的各种亚类。目标靶标可以包括脂质。目标靶标可以包括碳水化合物。目标靶标也可以
是复合物，例如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一些实施方式中，目标靶标包括组织、细胞或微囊泡。在这样的情况中，适体可以是表面抗原或疾病抗原的结合
剂。
一种的各种亚类。目标靶标可以包括脂质。目标靶标可以包括碳水化合物。目标靶标也可以
是复合物，例如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物。在一些实施方式中，目标靶标包括组织、细胞或微囊泡。在这样的情况中，适体可以是表面抗原或疾病抗原的结合
剂。
[0416] 表面抗原可以是疾病或障碍的生物标志物。在这样的情况中，适体可以用于提供疾病或障碍的诊断、预后或治疗诊断。例如，一种或多种蛋白质可以包括PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2和SSX4中的一种或多种。可以使用这些标志物来检测前列腺癌。本文表3-4中提供了另外的表面抗原和
疾病抗原。
疾病抗原。
[0417] 一种或多种混杂靶标可以是目标靶标以外的抗原。例如，混杂靶标可以是可存在于待分析样品中的另一种实体。作为非限制性实例，考虑待评估样品是来自个体的血浆样
品。目标靶标可以是蛋白质，例如，表面抗原，其存在于样品中。在这种情况中，混杂靶标可以选自很可能存在于样品中的任何其他抗原。因此，正向选择应当提供识别目标靶标但与
混杂靶标具有最小(如果有的话)相互作用的候选适体。在一些实施方式中，目标靶标和一
种或多种混杂靶标包括相同类型的生物实体，例如，所有蛋白质、所有核酸、所有碳水化合
物或所有脂质。作为非限制性实例，目标靶标可以是选自SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF和
EpCAM的蛋白质，并且一种或多种混杂靶标包括该组的其他成员。在其他实施方式中，目标
靶标和一种或多种混杂靶标包括不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核酸、碳水化合物和
脂质的任意组合。一种或多种混杂靶标还可以包括不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核
酸、碳水化合物和脂质的任意组合。
品。目标靶标可以是蛋白质，例如，表面抗原，其存在于样品中。在这种情况中，混杂靶标可以选自很可能存在于样品中的任何其他抗原。因此，正向选择应当提供识别目标靶标但与
混杂靶标具有最小(如果有的话)相互作用的候选适体。在一些实施方式中，目标靶标和一
种或多种混杂靶标包括相同类型的生物实体，例如，所有蛋白质、所有核酸、所有碳水化合
物或所有脂质。作为非限制性实例，目标靶标可以是选自SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF和
EpCAM的蛋白质，并且一种或多种混杂靶标包括该组的其他成员。在其他实施方式中，目标
靶标和一种或多种混杂靶标包括不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核酸、碳水化合物和
脂质的任意组合。一种或多种混杂靶标还可以包括不同类型的生物实体，例如，蛋白质、核
酸、碳水化合物和脂质的任意组合。
[0418] 在一个实施方式中，本发明提供了通过以上方法鉴别的分离的多核苷酸或其片段。本发明进一步提供了具有与通过以上方法鉴别的核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序
列的分离的多核苷酸。分离的多核苷酸也称为适体或寡核苷酸探针。更优选地，分离的核酸
分子与通过以上方法鉴别的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一。在分离的多核苷酸长度长于或等于参照序列(例如，通过以上方法鉴别的序列)的情况中，可以用全长的参照序列来进行
比较。在分离的多核苷酸短于参照序列(例如，短于通过以上方法鉴别的序列)的情况中，与
相同长度的参照序列的区段进行比较(排除同源性计算需要的任何环)。
列的分离的多核苷酸。分离的多核苷酸也称为适体或寡核苷酸探针。更优选地，分离的核酸
分子与通过以上方法鉴别的核苷酸序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一。在分离的多核苷酸长度长于或等于参照序列(例如，通过以上方法鉴别的序列)的情况中，可以用全长的参照序列来进行
比较。在分离的多核苷酸短于参照序列(例如，短于通过以上方法鉴别的序列)的情况中，与
相同长度的参照序列的区段进行比较(排除同源性计算需要的任何环)。
[0419] 在相关的方面，本发明提供了一种选择适体组的方法，包括：(a)将适体的集合接触来自第一样品的微囊泡群体接触；(b)富集对来自第一样品的微囊泡群体显示出亲和力
的适体子集合；(c)将子集合接触来自第二样品的第二微囊泡群体；和(d)耗尽对来自第二
样品的第二微囊泡群体显示出亲和力的第二适体子集合，由此选择对来自第一样品的微囊
泡群体具有优先亲和力的适体组。第一样品和/或第二样品可以包含如本文中公开的生物
流体。例如，生物流体可以包括但不限于血液、血液衍生物、血浆、血清或尿液。第一样品和/或第二样品也可以源自细胞培养物。
的适体子集合；(c)将子集合接触来自第二样品的第二微囊泡群体；和(d)耗尽对来自第二
样品的第二微囊泡群体显示出亲和力的第二适体子集合，由此选择对来自第一样品的微囊
泡群体具有优先亲和力的适体组。第一样品和/或第二样品可以包含如本文中公开的生物
流体。例如，生物流体可以包括但不限于血液、血液衍生物、血浆、血清或尿液。第一样品和/或第二样品也可以源自细胞培养物。
[0420] 在另一相关方面中，本发明提供了一种选择适体组的方法，包括：(a)将适体的集合接触来自第一样品的组织；(b)富集对来自第一样品的组织显示出亲和力的适体子集合；
(c)将子集合接触来自第二样品的第二组织；和(d)耗尽对来自第二样品的第二组织显示出
亲和力的第二适体子集合，由此选择与第二样品相比对来自第一样品的组织具有优先亲和
力的适体组。第一样品和/或第二样品可以包含如本文中公开的固定的组织。例如，固定的
组织可以包括FFPE组织。第一样品和/或第二样品可以包括肿瘤样品。
(c)将子集合接触来自第二样品的第二组织；和(d)耗尽对来自第二样品的第二组织显示出
亲和力的第二适体子集合，由此选择与第二样品相比对来自第一样品的组织具有优先亲和
力的适体组。第一样品和/或第二样品可以包含如本文中公开的固定的组织。例如，固定的
组织可以包括FFPE组织。第一样品和/或第二样品可以包括肿瘤样品。
[0421] 在一个实施方式中，第一样品包括癌症样品，而第二样品包括对照样品，如非癌症样品。第一样品和/或第二样品可以各自包括汇合的样品。例如，第一样品和/或第二样品可
以包括来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、
80、90或100或者超过100个个体的体液。在这样的情况中，可以选择集合的成员来代表所需
的表型。在非限制性实例中，第一样品集合的成员可以来自患有癌症的患者，而第二样品集
合的成员可以来自非癌对照。对于组织样品，第一样品可以包括来自不同个体的组织，例
如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、
90或100或者超过100个个体。作为非限制性的实例，第一样品可以包括来自每个个体的固
定的组织。
以包括来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、
80、90或100或者超过100个个体的体液。在这样的情况中，可以选择集合的成员来代表所需
的表型。在非限制性实例中，第一样品集合的成员可以来自患有癌症的患者，而第二样品集
合的成员可以来自非癌对照。对于组织样品，第一样品可以包括来自不同个体的组织，例
如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、
90或100或者超过100个个体。作为非限制性的实例，第一样品可以包括来自每个个体的固
定的组织。
[0422] 步骤(a)-(d)可以重复所需的次数以进一步富集适体中对来自第一样品的靶标具有优先亲和力的集合。例如，步骤(a)-(d)可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20次或超过20次。来自步骤(d)的输出可以用作重复的步骤(a)的输入。在实施方式中，在重复步骤(a)-(d)之前，用不同的样品替代第一样品和/或第二样品。在非限
制性实例中，第一样品集合的成员可以来自患有癌症的患者，而第二样品集合的成员可以
来自非癌对照。在随后的步骤(a)-(d)的重复中，第一样品集合可以包括来自不同于之前轮
的癌症患者的样品。相似地，第二样品集合可以包括来自不同于之前轮的对照的样品。
15、16、17、18、19、20次或超过20次。来自步骤(d)的输出可以用作重复的步骤(a)的输入。在实施方式中，在重复步骤(a)-(d)之前，用不同的样品替代第一样品和/或第二样品。在非限
制性实例中，第一样品集合的成员可以来自患有癌症的患者，而第二样品集合的成员可以
来自非癌对照。在随后的步骤(a)-(d)的重复中，第一样品集合可以包括来自不同于之前轮
的癌症患者的样品。相似地，第二样品集合可以包括来自不同于之前轮的对照的样品。
[0423] 在再另一相关方面中，本发明提供了富集多个寡核苷酸的方法，包括：(a)将第一样品接触多个寡核苷酸；(b)分级分离在步骤(a)中接触的第一样品并回收用第一样品分级
分离的多个寡核苷酸的成员；(c)将来自步骤(b)的回收的多个寡核苷酸的成员接触第二样
品；(d)分级分离在步骤(c)中接触的第二样品并回收未用第二样品分级分离的多个寡核苷
酸的成员；(e)将来自步骤(d)的回收的多个寡核苷酸的成员接触第三样品；和(f)分级分离
在步骤(a)中接触的第三样品并回收用第三样品分级分离的多个寡核苷酸的成员，由此富
集多个寡核苷酸。样品可以是如本文所述的任何适宜形式，例如，组织、细胞、微囊泡等。第一样品和第三样品可以具有第一表型，而第二样品可以具有第二表型。因此，例如，固定的
组织可以包括FFPE组织。第一样品和/或第二样品可以包括肿瘤样品。正向选择对于与第一
表型相关的样品进行，且负向选择对于与第二表型相关的样品进行。在这样的选择方案的
一个非限制性实例中，第一表型包括活检阳性乳腺癌，和第二表型包括非-乳腺癌(活检阴
性的或健康的)。
分离的多个寡核苷酸的成员；(c)将来自步骤(b)的回收的多个寡核苷酸的成员接触第二样
品；(d)分级分离在步骤(c)中接触的第二样品并回收未用第二样品分级分离的多个寡核苷
酸的成员；(e)将来自步骤(d)的回收的多个寡核苷酸的成员接触第三样品；和(f)分级分离
在步骤(a)中接触的第三样品并回收用第三样品分级分离的多个寡核苷酸的成员，由此富
集多个寡核苷酸。样品可以是如本文所述的任何适宜形式，例如，组织、细胞、微囊泡等。第一样品和第三样品可以具有第一表型，而第二样品可以具有第二表型。因此，例如，固定的
组织可以包括FFPE组织。第一样品和/或第二样品可以包括肿瘤样品。正向选择对于与第一
表型相关的样品进行，且负向选择对于与第二表型相关的样品进行。在这样的选择方案的
一个非限制性实例中，第一表型包括活检阳性乳腺癌，和第二表型包括非-乳腺癌(活检阴
性的或健康的)。
[0424] 在一些实施方式中，第一表型包括医学病症、疾病或障碍，和第二表型包括健康状态或者医学病症、疾病或障碍的不同状态。第一表型可以是健康状态，和第二表型包括医学
病症、疾病或障碍。医学病症、疾病或障碍可以是任何可检测的医学病症、疾病或障碍，包括但不限于癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障
碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。这种类型的这些病症公开于本文中。参见，例如，本文中的“表型”章节。
病症、疾病或障碍。医学病症、疾病或障碍可以是任何可检测的医学病症、疾病或障碍，包括但不限于癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障
碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。这种类型的这些病症公开于本文中。参见，例如，本文中的“表型”章节。
[0425] 分离微囊泡的任何有用的方法总体或部分地可以按照需要用于分级分离样品。几种可用的技术描述于本文中。在一个实施方式中，分级分离包括步骤(b)中的超离心及步骤
(d)和(f)中的聚合物沉淀。在其它实施方式中，聚合物沉淀用于所有步骤中。聚合物可以是
聚乙二醇(PEG)。可以使用PEG的任何适宜形式。例如，PEG可以是PEG8000。PEG可以以任何适宜的浓度使用。例如，PEG可以以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、
12％、13％、14％或15％的浓度使用以分离微囊泡。在一些实施方式中，PEG以6％的浓度使
用。
(d)和(f)中的聚合物沉淀。在其它实施方式中，聚合物沉淀用于所有步骤中。聚合物可以是
聚乙二醇(PEG)。可以使用PEG的任何适宜形式。例如，PEG可以是PEG8000。PEG可以以任何适宜的浓度使用。例如，PEG可以以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、
12％、13％、14％或15％的浓度使用以分离微囊泡。在一些实施方式中，PEG以6％的浓度使
用。
[0426] 当样品包含FFPE组织样品时，样品可以在富集过程之前进行表位修复(epitope retrival)，也称为抗原修复(antigen retrival)。虽然组织固定可用于保持组织形态，但
这一过程对免疫检测方法也具有负面影响。例如，固定可能改变蛋白质生物化学以使得目
标表位被屏蔽且可能不再结合第一抗体。表位的屏蔽可以通过表位内氨基酸的交联、交联
表位处或附近的不相关肽、改变表位的构象或改变抗原的静电电荷而引起。表位修复是指
其中表位的屏蔽被逆转且表位识别被恢复的任何技术。用于表位修复的技术是本领域中已
知的。例如，酶(包括蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶)已经成功地用于恢复表位结合。非束缚于理论，作用机制可以是可能屏蔽表位的肽的切割。加热样品也可以逆转一些交联并允许
恢复表位的二级或三级结构。pH或阳离子浓度的改变也可以影响表位可用性。
这一过程对免疫检测方法也具有负面影响。例如，固定可能改变蛋白质生物化学以使得目
标表位被屏蔽且可能不再结合第一抗体。表位的屏蔽可以通过表位内氨基酸的交联、交联
表位处或附近的不相关肽、改变表位的构象或改变抗原的静电电荷而引起。表位修复是指
其中表位的屏蔽被逆转且表位识别被恢复的任何技术。用于表位修复的技术是本领域中已
知的。例如，酶(包括蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶)已经成功地用于恢复表位结合。非束缚于理论，作用机制可以是可能屏蔽表位的肽的切割。加热样品也可以逆转一些交联并允许
恢复表位的二级或三级结构。pH或阳离子浓度的改变也可以影响表位可用性。
[0427] 接触可以在竞争剂的存在下进行，该竞争剂可以减少非特异性结合事件。可以使用任何有用的竞争剂。在一个实施方式中，竞争剂包括鲑精DNA、tRNA、硫酸葡聚糖和羧甲基葡聚糖中至少一种。按照需要，可以在不同的接触步骤使用不同的竞争剂或竞争剂浓度。
[0428] 该方法可以重复以实现所需的富集。在一个实施方式中，步骤(a)-(f)重复至少一次。这些步骤可以按照需要重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或多于20次。同时，各个重复步骤可以按照需要重复。在一些实施方式中，该方法进一步
包括：(i)在步骤(c)之前重复步骤(a)-(b)至少一次，其中在步骤(b)中用第一样品分级分
离的多个寡核苷酸的回收成员用作步骤(a)的重复的多个寡核苷酸输入；(ii)在步骤(e)之
前重复步骤(c)-(d)至少一次，其中在步骤(d)中未用第二样品分级分离的多个寡核苷酸的
回收成员用作步骤(c)的重复的多个寡核苷酸输入；和/或(iii)重复步骤(e)-(f)至少一
次，其中在步骤(f)中用第三样品分级分离的多个寡核苷酸的回收成员用作步骤(e)的重复
的多个寡核苷酸输入。重复(i)-(iii)可以重复任何所需的次数，例如，(i)-(iii)可以重复
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或超过20次。在一个实施方式中，(i)-(iii)各包括三个重复。
包括：(i)在步骤(c)之前重复步骤(a)-(b)至少一次，其中在步骤(b)中用第一样品分级分
离的多个寡核苷酸的回收成员用作步骤(a)的重复的多个寡核苷酸输入；(ii)在步骤(e)之
前重复步骤(c)-(d)至少一次，其中在步骤(d)中未用第二样品分级分离的多个寡核苷酸的
回收成员用作步骤(c)的重复的多个寡核苷酸输入；和/或(iii)重复步骤(e)-(f)至少一
次，其中在步骤(f)中用第三样品分级分离的多个寡核苷酸的回收成员用作步骤(e)的重复
的多个寡核苷酸输入。重复(i)-(iii)可以重复任何所需的次数，例如，(i)-(iii)可以重复
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或超过20次。在一个实施方式中，(i)-(iii)各包括三个重复。
[0429] 该方法可以进一步包括鉴定所选择的适体或寡核苷酸组的成员，例如，通过DNA测序。测序可以按照需要通过下一代测序及在方法中的任何所需步骤之后或之前进行。
[0430] 该方法也可以包括鉴定所选择的适体/寡核苷酸组的靶标。鉴定这样的靶标的有用方法公开于本文中。在非限制性实例中，富集的寡核苷酸文库与适宜的样品(例如，第一
或第三样品)接触，文库与样品交联，且文库被回收。与回收的文库交联的蛋白质例如通过
质谱鉴定。
或第三样品)接触，文库与样品交联，且文库被回收。与回收的文库交联的蛋白质例如通过
质谱鉴定。
[0431] 寡核苷酸探针靶标鉴定
[0432] 以上的方法和试剂盒可以用于鉴别区分两个靶标群体的结合剂。本发明进一步提供了鉴别这样的结合剂的靶标的方法。例如，该方法可以进一步包括鉴别由结合剂识别的
细胞或靶微囊泡的表面标志物。
细胞或靶微囊泡的表面标志物。
[0433] 在一个实施方式中，本发明提供鉴别结合剂的靶标的方法，包括：(a)将结合剂接触靶标以使靶标与结合剂结合，其中靶标包括细胞或微囊泡的表面抗原；(b)在不破坏靶标
与结合剂结合的条件下破坏细胞或微囊泡；(c)分离靶标和结合剂之间的复合物；和(d)鉴
别结合剂结合的靶标。结合剂可以是由以上方法鉴别的结合剂，例如，寡核苷酸探针、配体、抗体或可以区分两个靶标群体的其它有用的结合剂，例如，区分其生物标志物。
与结合剂结合的条件下破坏细胞或微囊泡；(c)分离靶标和结合剂之间的复合物；和(d)鉴
别结合剂结合的靶标。结合剂可以是由以上方法鉴别的结合剂，例如，寡核苷酸探针、配体、抗体或可以区分两个靶标群体的其它有用的结合剂，例如，区分其生物标志物。
[0434] 用于进行该方法的说明性方案显示于图4中。该图显示了系着于基质401的结合剂402，为了说明的目的在此为寡核苷酸探针或适体。结合剂402可以与基质401共价连接。结
合剂402还可以是非共价连接的。例如，结合剂402可以包括可以吸引于基质的标记，如生物
素基团，其可以与共价连接基质的抗生物素蛋白/链霉亲和素分子形成复合物。这可以允许
适体和微囊泡之间形成复合物(尽管在溶液中)，接着使用生物素标记捕获适体。结合剂402
结合细胞或微囊泡404的表面抗原403。在箭头(i)指示的步骤中，破坏细胞或微囊泡405而
同时保留结合剂402和表面抗原403之间的复合物完整。在箭头(ii)指示的步骤中，除去破
坏的细胞或微囊泡405，例如，通过洗涤或缓冲剂交换。在箭头(iii)指示的步骤中，从结合
剂402释放表面抗原403。可以使用本文中公开的和/或本领域已知的方法来分析表面抗原
403以确定其性质。该方法的靶标可以是与细胞或微囊泡相关的任何有用的生物实体。例
如，靶标可以包括蛋白质、核酸、脂质或碳水化合物，或本文中公开的或本领域已知的其它
生物实体。
合剂402还可以是非共价连接的。例如，结合剂402可以包括可以吸引于基质的标记，如生物
素基团，其可以与共价连接基质的抗生物素蛋白/链霉亲和素分子形成复合物。这可以允许
适体和微囊泡之间形成复合物(尽管在溶液中)，接着使用生物素标记捕获适体。结合剂402
结合细胞或微囊泡404的表面抗原403。在箭头(i)指示的步骤中，破坏细胞或微囊泡405而
同时保留结合剂402和表面抗原403之间的复合物完整。在箭头(ii)指示的步骤中，除去破
坏的细胞或微囊泡405，例如，通过洗涤或缓冲剂交换。在箭头(iii)指示的步骤中，从结合
剂402释放表面抗原403。可以使用本文中公开的和/或本领域已知的方法来分析表面抗原
403以确定其性质。该方法的靶标可以是与细胞或微囊泡相关的任何有用的生物实体。例
如，靶标可以包括蛋白质、核酸、脂质或碳水化合物，或本文中公开的或本领域已知的其它
生物实体。
[0435] 在该方法的一些实施方式中，在破坏细胞或微囊泡之前，靶标与结合剂交联。不希望受到理论的束缚，这个步骤可有助于在破坏过程中维持结合剂和靶标之间的复合物。可
以使用本文中公开的或本领域已知的任何有用的交联方法。在实施方式中，交联包括光致
交联、酰亚胺酯交联剂、辛二亚氨酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂、二磺基琥珀酰亚
胺辛二酸酯(BS3)、醛、丙烯醛、巴豆醛、甲醛、碳二亚胺交联剂、N，N′-二环己基碳二亚胺(DDC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐
(EDC或EDAC)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代琥珀酰
亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺
基-2-(6-[生物素酰胺]-2-(p-叠氮苯甲酰胺)-己酰胺)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(硫代-
SBED)、2-[N2-(4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酰基)-N6-(6-生物素-酰胺己酰基)-L-赖氨
酰]乙基甲烷硫代磺酸酯(Mts-Atf-生物素；可获自Thermo Fisher Scientific Inc，
Rockford IL.)、2-{N2-[N6-(4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酰基-6-氨基-己酰基)-N6-(6-
生物素酰胺己酰基)-L-赖氨酰酰胺]}乙基甲烷硫代磺酸酯(Mts-Atf-LC-生物素；可获自
Thermo Fisher Scientific Inc)、光反应性氨基酸(例如，L-光反应-赖氨酸和L-光反应-
甲硫氨酸，参见，例如，Suchanek，M.等(2005).Photo-leucine and photo-methionine
allow identification of protein-protein interactions.Nat.Methods 2：261-267)、
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂、NHS-叠氮试剂(例如，NHS-叠氮化物、NHS-PEG4-叠氮化物、NHS-PEG12-叠氮化物；各自可获自Thermo Fisher Scientific Inc)、NHS-膦试剂(例如，
NHS-膦、硫代-NHS-膦；各自可获自Thermo Fisher Scientific Inc)或其任意组合或修饰。
以使用本文中公开的或本领域已知的任何有用的交联方法。在实施方式中，交联包括光致
交联、酰亚胺酯交联剂、辛二亚氨酸二甲酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂、二磺基琥珀酰亚
胺辛二酸酯(BS3)、醛、丙烯醛、巴豆醛、甲醛、碳二亚胺交联剂、N，N′-二环己基碳二亚胺(DDC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐
(EDC或EDAC)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代琥珀酰
亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺
基-2-(6-[生物素酰胺]-2-(p-叠氮苯甲酰胺)-己酰胺)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯(硫代-
SBED)、2-[N2-(4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酰基)-N6-(6-生物素-酰胺己酰基)-L-赖氨
酰]乙基甲烷硫代磺酸酯(Mts-Atf-生物素；可获自Thermo Fisher Scientific Inc，
Rockford IL.)、2-{N2-[N6-(4-叠氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酰基-6-氨基-己酰基)-N6-(6-
生物素酰胺己酰基)-L-赖氨酰酰胺]}乙基甲烷硫代磺酸酯(Mts-Atf-LC-生物素；可获自
Thermo Fisher Scientific Inc)、光反应性氨基酸(例如，L-光反应-赖氨酸和L-光反应-
甲硫氨酸，参见，例如，Suchanek，M.等(2005).Photo-leucine and photo-methionine
allow identification of protein-protein interactions.Nat.Methods 2：261-267)、
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂、NHS-叠氮试剂(例如，NHS-叠氮化物、NHS-PEG4-叠氮化物、NHS-PEG12-叠氮化物；各自可获自Thermo Fisher Scientific Inc)、NHS-膦试剂(例如，
NHS-膦、硫代-NHS-膦；各自可获自Thermo Fisher Scientific Inc)或其任意组合或修饰。
[0436] 多种方法可以用于破坏细胞或微囊泡。例如，可以使用机械力、化学试剂或其组合来破坏囊泡膜。在实施方式中，破坏细胞或微囊泡包括使用去污剂、表面活性剂、溶剂、酶或其有用的任意组合中的一种或多种。酶可以包括溶菌酶、溶葡萄球菌素、消解酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶和甘露聚糖酶中的一种或多种。去污剂或表面活性剂可以包括辛
基硫代葡糖苷(OTG)、辛基β-葡糖苷(OG)、非离子型去污剂、Triton X、Tween 20、脂肪醇、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、油醇、聚氧乙二醇烷基醚(Brij)、八(乙二醇)单十二烷基醚、五(乙二醇)单十二烷基醚、聚氧丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷、聚氧乙二醇辛基苯酚醚、聚氧乙二醇烷基酚醚、壬苯聚醇-9、甘油烷基酯、甘油月桂酸酯、聚氧乙二醇山梨聚糖烷基酯、聚山梨酸酯、山梨聚糖烷基酯、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、十二烷基二甲基氧化胺、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物、泊洛沙姆、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、两性离子去污剂、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、
线性烷基苯磺酸盐(LAS)、烷基苯酚乙氧基化物(APE)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、甜菜
碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、卵磷脂、离子去污剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、西曲溴铵(CTAB)、鲸蜡基三甲基氯化铵(CTAC)、二盐酸奥替尼啶、氯化十六烷基吡啶(CPC)、杀藻胺(BAC)、苄索
氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷、二甲基二-十八烷基氯化铵、二-十八烷基二甲基溴
化铵(DODAB)、脱氧胆酸钠、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(Tergitol-型NP-40；NP-40)、月桂基
硫酸铵、月桂醇聚醚硫酸钠(月桂基醚硫酸钠(SLES))、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、烷基羧酸盐、
硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、基于羧酸酯的含氟表面活性剂、全氟壬酸酯、全氟辛酸酯(PFOA或PFO)和生物表面活性剂中的一种或多种。可以使用的机械破坏方法包括但不限于机械剪
切、珠磨、均质化、微流体化、超声处理、弗式压滤、撞击、胶体磨、减压、渗透压冲击、热解、冻-融、干燥或其任意组合。
基硫代葡糖苷(OTG)、辛基β-葡糖苷(OG)、非离子型去污剂、Triton X、Tween 20、脂肪醇、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、油醇、聚氧乙二醇烷基醚(Brij)、八(乙二醇)单十二烷基醚、五(乙二醇)单十二烷基醚、聚氧丙二醇烷基醚、葡糖苷烷基醚、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷、聚氧乙二醇辛基苯酚醚、聚氧乙二醇烷基酚醚、壬苯聚醇-9、甘油烷基酯、甘油月桂酸酯、聚氧乙二醇山梨聚糖烷基酯、聚山梨酸酯、山梨聚糖烷基酯、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、十二烷基二甲基氧化胺、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物、泊洛沙姆、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、两性离子去污剂、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、
线性烷基苯磺酸盐(LAS)、烷基苯酚乙氧基化物(APE)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、甜菜
碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、卵磷脂、离子去污剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、西曲溴铵(CTAB)、鲸蜡基三甲基氯化铵(CTAC)、二盐酸奥替尼啶、氯化十六烷基吡啶(CPC)、杀藻胺(BAC)、苄索
氯铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷、二甲基二-十八烷基氯化铵、二-十八烷基二甲基溴
化铵(DODAB)、脱氧胆酸钠、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(Tergitol-型NP-40；NP-40)、月桂基
硫酸铵、月桂醇聚醚硫酸钠(月桂基醚硫酸钠(SLES))、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、烷基羧酸盐、
硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、基于羧酸酯的含氟表面活性剂、全氟壬酸酯、全氟辛酸酯(PFOA或PFO)和生物表面活性剂中的一种或多种。可以使用的机械破坏方法包括但不限于机械剪
切、珠磨、均质化、微流体化、超声处理、弗式压滤、撞击、胶体磨、减压、渗透压冲击、热解、冻-融、干燥或其任意组合。
[0437] 如图4中所示，可以将结合剂系着于基质。结合剂可以在结合剂与靶标之间的复合物形成之前或之后进行系着。基质可以是任何有用的基质，如本文中公开的或本领域已知
的。在一个实施方式中，基质包括微球。在另一个实施方式中，基质包括平面基质。在另一实施方式中，基质包括柱材料。结合剂也可以是标记的。分离靶标与结合剂之间的复合物可以
包括通过标记捕获结合剂。作为非限制性的实例，标记可以是生物素标记。在这样的情况
中，结合剂可以通过生物素-抗生物素蛋白/链霉亲和素结合事件连接于基质。
的。在一个实施方式中，基质包括微球。在另一个实施方式中，基质包括平面基质。在另一实施方式中，基质包括柱材料。结合剂也可以是标记的。分离靶标与结合剂之间的复合物可以
包括通过标记捕获结合剂。作为非限制性的实例，标记可以是生物素标记。在这样的情况
中，结合剂可以通过生物素-抗生物素蛋白/链霉亲和素结合事件连接于基质。
[0438] 鉴别从结合剂释放后的靶标的方法将取决于目标靶标的类型。例如，当靶标包括蛋白质时，鉴别靶标可以包括使用质谱(MS)、肽质量指纹谱(PMF；蛋白质指纹谱)、测序、N-末端氨基酸分析、C-末端氨基酸分析、Edman降解、色谱、电泳、二维凝胶电泳(2D凝胶)、抗体阵列和免疫分析。核酸可以通过扩增、杂交或测序来鉴别。
[0439] 本领域技术人员将认识到该方法可以用于鉴别任何合适的靶标，包括与膜不相关的那些。例如，参照图4，除了箭头(i)指示的步骤(即，破坏细胞或微囊泡405)以外的所有步骤可以针对组织裂解产物或循环靶标如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或其组合来进行。
靶标可以是任何有用的靶标，包括但不限于组织、细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊泡、病毒、膜片段、小分子、重金属、毒素、药物、核酸、mRNA、微RNA、蛋白质-核酸复合物及任何这些的各种组合、片段和/或复合物。
靶标可以是任何有用的靶标，包括但不限于组织、细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊泡、病毒、膜片段、小分子、重金属、毒素、药物、核酸、mRNA、微RNA、蛋白质-核酸复合物及任何这些的各种组合、片段和/或复合物。
[0440] 在一个方面，本发明提供了鉴别与生物样品中的至少一个细胞或微囊泡相关的至少一种蛋白质的方法，包括：a)使至少一个细胞或微囊泡与寡核苷酸探针文库接触；b)分离
至少一种在步骤a)中被寡核苷酸探针文库的至少一个成员结合的蛋白质；和c)鉴别在步骤
b)中分离的至少一种蛋白质。分离可以使用任何有用的方法如本文中公开的进行，例如，通
过免疫沉淀或捕获到基质。类似地，鉴别可以使用任何有用的方法如本文中公开的进行，包
括但不限于使用质谱、2-D凝胶电泳或抗体阵列。这样的方法的实例在本文的实施例9-11中
给出。
至少一种在步骤a)中被寡核苷酸探针文库的至少一个成员结合的蛋白质；和c)鉴别在步骤
b)中分离的至少一种蛋白质。分离可以使用任何有用的方法如本文中公开的进行，例如，通
过免疫沉淀或捕获到基质。类似地，鉴别可以使用任何有用的方法如本文中公开的进行，包
括但不限于使用质谱、2-D凝胶电泳或抗体阵列。这样的方法的实例在本文的实施例9-11中
给出。
[0441] 本发明的方法鉴定的靶标可以按照需要对于各种目的例如使用本发明的寡核苷酸探针检测。例如，鉴定的表面抗原可用于展示这种抗原的细胞或微囊泡。在一个方面，本
发明提供了检测生物样品中的至少一个细胞或微囊泡的方法，包括使生物样品与至少一种
表面抗原的至少一种结合剂接触并检测至少一种蛋白质的结合剂识别的至少一个细胞或
微囊泡。在一个实施方式中，至少一种表面抗原选自本文的表3-4。至少一种表面抗原可以
选择2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年11月12日提交的
PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/
US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中公开的那些；该申请各自通过引用
全文并入。至少一种表面抗原可以是本文中表10-17任一中的蛋白质。参见实施例9。至少一
种结合剂可以包括任何有用的结合剂，包括但不限于核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、树状分子、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。在一些实施方式中，至少一种结合剂包括至少一种寡核苷酸，如本文提
供的寡核苷酸探针。细胞可以是组织的部分。
发明提供了检测生物样品中的至少一个细胞或微囊泡的方法，包括使生物样品与至少一种
表面抗原的至少一种结合剂接触并检测至少一种蛋白质的结合剂识别的至少一个细胞或
微囊泡。在一个实施方式中，至少一种表面抗原选自本文的表3-4。至少一种表面抗原可以
选择2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/US2009/62880；2009年11月12日提交的
PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/
US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/
US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/
US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012年2月17日提交的PCT/
US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日提交的PCT/US12/
42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/US12/49615；2012
年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/072019；2013年5月
28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/003092；2013年12月
19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；和2015年11月23日提
交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年7月28日提交的PCT/
US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中公开的那些；该申请各自通过引用
全文并入。至少一种表面抗原可以是本文中表10-17任一中的蛋白质。参见实施例9。至少一
种结合剂可以包括任何有用的结合剂，包括但不限于核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、肽、树状分子、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。在一些实施方式中，至少一种结合剂包括至少一种寡核苷酸，如本文提
供的寡核苷酸探针。细胞可以是组织的部分。
[0442] 至少一种结合剂可用于捕获和/或检测至少一个细胞或微囊泡，其可以是循环细胞或微囊泡，包括但不限于脱落到体液中的微囊泡。本文提供了使用结合剂检测可溶性生
物标志物和循环细胞或微囊泡的方法。参见，例如，图2A-B，该图描述了夹心分析形式。在一些实施方式中，用于捕获至少一个细胞或微囊泡的至少一种结合剂结合于基质。可以使用
任何有用的基质，包括但不限于平面阵列、柱基质或微珠。参见，例如，图2A-B。在一些实施方式中，用于检测至少一个细胞或微囊泡的至少一种结合剂被标记。各种有用的标记在本
文中提供或是本领域中已知的，包括但不限于磁性标记、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶体颗粒、聚合染料颗粒、色素分子、色素颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体、纳米颗粒、量子点、金颗粒、荧光团或放射性标记。
物标志物和循环细胞或微囊泡的方法。参见，例如，图2A-B，该图描述了夹心分析形式。在一些实施方式中，用于捕获至少一个细胞或微囊泡的至少一种结合剂结合于基质。可以使用
任何有用的基质，包括但不限于平面阵列、柱基质或微珠。参见，例如，图2A-B。在一些实施方式中，用于检测至少一个细胞或微囊泡的至少一种结合剂被标记。各种有用的标记在本
文中提供或是本领域中已知的，包括但不限于磁性标记、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶体颗粒、聚合染料颗粒、色素分子、色素颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体、纳米颗粒、量子点、金颗粒、荧光团或放射性标记。
[0443] 在一个实施方式中，检测用于表征表型。表型可以是任何适宜的目标表型。在一些实施方式中，表型是疾病或障碍。表征可以包括提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断信息。表征可以通过将至少一个细胞或微囊泡的存在或水平与参照相比较来进行。参照
可以按照待进行的表征来选择。例如，当表型包括疾病或障碍时，参照可以包括来自没有疾
病或障碍的个体或个体组的样品中至少一个微囊泡的存在或水平。比较可以确定细胞或微
囊泡的存在或水平是否与参照的存在或水平不同。在一些实施方式中，检测的细胞或微囊
泡在健康样品中与疾病样品相比以较高水平发现。在另一实施方式中，检测的细胞或微囊
泡在疾病样品中与健康样品相比以较高水平发现。当进行多重分析时，例如，使用对于不同
生物标志物的多种结合剂，一些抗原可以在生物样品中与参照相比以较高水平观察到，而
其它抗原可以在生物样品中与参照相比以较低水平观察到。
断信息。表征可以通过将至少一个细胞或微囊泡的存在或水平与参照相比较来进行。参照
可以按照待进行的表征来选择。例如，当表型包括疾病或障碍时，参照可以包括来自没有疾
病或障碍的个体或个体组的样品中至少一个微囊泡的存在或水平。比较可以确定细胞或微
囊泡的存在或水平是否与参照的存在或水平不同。在一些实施方式中，检测的细胞或微囊
泡在健康样品中与疾病样品相比以较高水平发现。在另一实施方式中，检测的细胞或微囊
泡在疾病样品中与健康样品相比以较高水平发现。当进行多重分析时，例如，使用对于不同
生物标志物的多种结合剂，一些抗原可以在生物样品中与参照相比以较高水平观察到，而
其它抗原可以在生物样品中与参照相比以较低水平观察到。
[0444] 该方法可用于检测任何适宜生物样品中的至少一个细胞或微囊泡。例如，生物样品可以包含体液、组织样品或细胞培养物。体液或组织样品可以来自患有或疑似患有医学
病症、疾病或障碍的受试者。因此，该方法可用于提供对于受试者的诊断、预后或治疗诊断
结果。可以使用任何适宜的体液，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液
(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
病症、疾病或障碍的受试者。因此，该方法可用于提供对于受试者的诊断、预后或治疗诊断
结果。可以使用任何适宜的体液，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液
(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
[0445] 本发明的方法可用于表征任何适宜的目标疾病或障碍，包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱的移行细胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑肿瘤、结肠直肠腺
癌、慢性阻塞性肺病(COPD)、子宫颈的鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克
罗恩氏病、II型糖尿病、食管癌、喉的鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、银屑病、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃的腺癌、甲状腺的癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
癌、慢性阻塞性肺病(COPD)、子宫颈的鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克
罗恩氏病、II型糖尿病、食管癌、喉的鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、银屑病、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃的腺癌、甲状腺的癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
[0446] 在一些实施方式中，疾病或障碍包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。癌症可以包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关
淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神
经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细
胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤之一。恶变前
状况可以包括但不限于巴雷特食管。自身免疫疾病可以包括但不限于炎性肠病(IBD)、克罗
恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症之一。心血管疾病可以包括但不限于动脉粥样硬化、充血
性心力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件之一。神经疾病可以包括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂
症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊
髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血
再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征之一。疼痛可以包括但不
限于纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛之一。传染病可以包括但不限
于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒之一。本领域技术人员将理解本发明的寡核苷酸探针或多个寡核苷酸或方法可用于评价多种这些或其它相关疾病
和障碍。
淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神
经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细
胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤之一。恶变前
状况可以包括但不限于巴雷特食管。自身免疫疾病可以包括但不限于炎性肠病(IBD)、克罗
恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症之一。心血管疾病可以包括但不限于动脉粥样硬化、充血
性心力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件之一。神经疾病可以包括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂
症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊
髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血
再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征之一。疼痛可以包括但不
限于纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛之一。传染病可以包括但不限
于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒之一。本领域技术人员将理解本发明的寡核苷酸探针或多个寡核苷酸或方法可用于评价多种这些或其它相关疾病
和障碍。
[0447] 在相关的方面，本发明提供包含用于实施本文中的方法的试剂的试剂盒。在再另一相关方面，本发明提供用于实施该方法的试剂的用途。试剂可以包括对于至少一种蛋白
质的至少一种结合剂。结合剂可以是如本文提供的寡核苷酸探针。
质的至少一种结合剂。结合剂可以是如本文提供的寡核苷酸探针。
[0448] 样品表征
[0449] 本发明的寡核苷酸探针/适体可用于表征生物样品。例如，寡核苷酸探针或寡核苷酸探针文库可用于提供样品的生物印记。生物印记可以指示样品的特征，如与样品相关的
疾病或障碍的诊断、预后或治疗诊断。在一些实施方式中，生物印记包括样品中存在的一种
或多种生物标志物的存在或水平。在一些实施方式中，生物印记包括与样品相关的寡核苷
酸探针或寡核苷酸探针文库的成员的存在或水平(例如，通过形成与样品的复合物)。
疾病或障碍的诊断、预后或治疗诊断。在一些实施方式中，生物印记包括样品中存在的一种
或多种生物标志物的存在或水平。在一些实施方式中，生物印记包括与样品相关的寡核苷
酸探针或寡核苷酸探针文库的成员的存在或水平(例如，通过形成与样品的复合物)。
[0450] 在一个方面，本发明提供包含与SEQ ID NO.1-206506任一至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的核酸序列或者任何前述序列的功能性变型或片段的适体。功能性变型或片段包括包含修饰的序列，其仍然能够结合靶分子，其中修
饰包括但不限于删除、插入、点突变、截短或化学修饰的至少一种。在相关的方面，本发明提供了一种表征疾病或障碍的方法，包括：(a)将生物测试样品接触本发明的一种或多种适
体，例如，该段落中的那些的任何适体或其修饰；(b)检测步骤(a)中形成的一种或多种适体
与生物测试样品中一种或多种适体结合的靶标之间的复合物的存在或水平；(c)将生物对
照样品接触一种或多种适体；(d)检测步骤(c)中形成的一种或多种适体与生物对照样品中
一种或多种适体结合的靶标之间的复合物的存在或水平；和(e)比较步骤(b)和(d)中检测
的存在或水平，由此表征疾病或失调。
饰包括但不限于删除、插入、点突变、截短或化学修饰的至少一种。在相关的方面，本发明提供了一种表征疾病或障碍的方法，包括：(a)将生物测试样品接触本发明的一种或多种适
体，例如，该段落中的那些的任何适体或其修饰；(b)检测步骤(a)中形成的一种或多种适体
与生物测试样品中一种或多种适体结合的靶标之间的复合物的存在或水平；(c)将生物对
照样品接触一种或多种适体；(d)检测步骤(c)中形成的一种或多种适体与生物对照样品中
一种或多种适体结合的靶标之间的复合物的存在或水平；和(e)比较步骤(b)和(d)中检测
的存在或水平，由此表征疾病或失调。
[0451] 生物测试样品和生物对照样品可以各自包含组织样品、细胞培养物或生物流体。在一些实施方式中，生物测试样品和生物对照样品包括相同的样品类型，例如，测试样品和
对照样品两者都是组织样品或两者都是流体样品。在其他实施方式中，不同样品类型可以
用于测试和对照样品。例如，对照样品可以包含工程化的或另外的人工样品。在一些实施方
式中，组织样品包括固定的样品。
对照样品两者都是组织样品或两者都是流体样品。在其他实施方式中，不同样品类型可以
用于测试和对照样品。例如，对照样品可以包含工程化的或另外的人工样品。在一些实施方
式中，组织样品包括固定的样品。
[0452] 生物流体可以包括体液。体液可以包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血中的一种或多种。在一些实施方式中，体液包括血液、血清或血浆。
[0453] 生物流体可以包含微囊泡。例如，生物流体可以是组织、细胞培养物或体液，其包含从样品中的细胞释放的微囊泡。微囊泡可以是循环微囊泡。生物流体可以包含细胞。例
如，生物流体可以是组织、细胞培养物或体液，其包含在样品中循环的细胞。
如，生物流体可以是组织、细胞培养物或体液，其包含在样品中循环的细胞。
[0454] 一种或多种适体可以结合靶标生物标志物，例如，在表征样品中有用的生物标志物。生物标志物可以包括多肽或其片段，或本文中所述的或本领域已知的其它有用的生物
标志物(脂质、碳水化合物、复合物、核酸等)。在实施方式中，多肽或其片段是可溶的或膜结合的。膜结合的多肽可以包括细胞表面抗原或微囊泡表面抗原。生物标志物可以是选自表3
或表4的生物标志物。生物标志物可以选自2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/
US2009/62880；2009年12月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/
US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/
48327；2008年7月25日提交的PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；
2011年1月13日提交的PCT/US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012
年2月17日提交的PCT/US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日
提交的PCT/US12/42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3日提交的PCT/
US12/49615；2012年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/
072019；2013年5月28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/
003092；2013年12月19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；
和2015年11月23日提交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年
7月28日提交的PCT/US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632之一；该申请各自
通过引用全文并入。
标志物(脂质、碳水化合物、复合物、核酸等)。在实施方式中，多肽或其片段是可溶的或膜结合的。膜结合的多肽可以包括细胞表面抗原或微囊泡表面抗原。生物标志物可以是选自表3
或表4的生物标志物。生物标志物可以选自2009年10月30日提交的国际专利申请No.PCT/
US2009/62880；2009年12月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提交的PCT/
US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的PCT/US11/
48327；2008年7月25日提交的PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/US10/58461；
2011年1月13日提交的PCT/US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/030302；2012
年2月17日提交的PCT/US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；2012年6月14日
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US12/49615；2012年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的PCT/US2013/
072019；2013年5月28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的PCT/IB2013/
003092；2013年12月19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/US14/53306；
和2015年11月23日提交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/40157；2016年
7月28日提交的PCT/US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632之一；该申请各自
通过引用全文并入。
[0455] 表征可以包括疾病或障碍的诊断、预后或治疗诊断。可以使用本发明的组合物和方法来表征各种疾病和障碍，包括但不限于癌症、恶变前病症、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病和/或疼痛。对于更多详细内容，参见本文中的“表型”章节。在实施方式中，疾病或障碍包括增殖性或赘生性疾病或障
碍。例如，疾病或障碍可以是癌症。在一些实施方式中，癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌，肾癌或脑癌。
碍。例如，疾病或障碍可以是癌症。在一些实施方式中，癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、胰腺癌，肾癌或脑癌。
[0456] 图10A是显示了可用于使用本发明的一种或多种寡核苷酸探针检测和/或定量目标靶标的分析配置的示意图1000。捕获适体1002连接于基质1001。基质可以是平面基质、
孔、微珠或本文中公开的或本领域已知的其他有用基质。目标靶标1003被捕获适体1002结
合。目标靶标可以是被适体或其它结合剂识别时可以检测的任何合适的实体。目标靶标可
以包括蛋白质或多肽、核酸(包括DNA、RNA及其各种亚类)、脂质、碳水化合物、复合物(例如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物)。在一些实施方式中，目标靶标包括组
织、细胞或微囊泡。目标靶标可以是细胞表面抗原或微囊泡表面抗原。目标靶标可以是例如
如本文中公开的生物标志物。可以使用如本文中所述的各种技术，例如，色谱、过滤、离心、流式细胞术、亲和性捕获(例如，至平面表面、柱或珠子)和/或使用微流体装置，从样品分离目标靶标。检测适体1004也结合于目标靶标1003。检测适体1004携带可以被检测的标记
1005以通过捕获适体1002来鉴别捕获至基质1001的靶标。标记可以是荧光标记、放射性标
记、酶或本文中公开的其他可检测标记。捕获适体1002或检测适体1004可以用另一结合剂
(例如，抗体)来替代。例如，可以用抗体来捕获靶标，并用适体来检测，或反之亦然。当目标靶标包含复合物时，捕获剂和检测剂(适体、抗体等)可以识别相同或不同的靶标。例如，当
靶标是细胞或微囊泡时，捕获剂可以识别一种表面抗原，而检测剂识别微囊泡表面抗原。或
者，捕获剂和检测剂可以识别相同的表面抗原。
孔、微珠或本文中公开的或本领域已知的其他有用基质。目标靶标1003被捕获适体1002结
合。目标靶标可以是被适体或其它结合剂识别时可以检测的任何合适的实体。目标靶标可
以包括蛋白质或多肽、核酸(包括DNA、RNA及其各种亚类)、脂质、碳水化合物、复合物(例如，包含蛋白质、核酸、脂质和/或碳水化合物的复合物)。在一些实施方式中，目标靶标包括组
织、细胞或微囊泡。目标靶标可以是细胞表面抗原或微囊泡表面抗原。目标靶标可以是例如
如本文中公开的生物标志物。可以使用如本文中所述的各种技术，例如，色谱、过滤、离心、流式细胞术、亲和性捕获(例如，至平面表面、柱或珠子)和/或使用微流体装置，从样品分离目标靶标。检测适体1004也结合于目标靶标1003。检测适体1004携带可以被检测的标记
1005以通过捕获适体1002来鉴别捕获至基质1001的靶标。标记可以是荧光标记、放射性标
记、酶或本文中公开的其他可检测标记。捕获适体1002或检测适体1004可以用另一结合剂
(例如，抗体)来替代。例如，可以用抗体来捕获靶标，并用适体来检测，或反之亦然。当目标靶标包含复合物时，捕获剂和检测剂(适体、抗体等)可以识别相同或不同的靶标。例如，当
靶标是细胞或微囊泡时，捕获剂可以识别一种表面抗原，而检测剂识别微囊泡表面抗原。或
者，捕获剂和检测剂可以识别相同的表面抗原。
[0457] 本发明的适体在可以DNA或RNA形式鉴别和/或用于各种目的。除非另外指出，本领域技术人员将认识到适体可以通常以各种核酸形式来合成。适体还可以携带各种化学修饰
并且仍然保留在本发明的范围内。
并且仍然保留在本发明的范围内。
[0458] 在一些实施方式中，本发明的适体经修饰以包含至少一个化学修饰。修饰可以包括但不限于糖位置的化学取代；磷酸位置的化学取代；和核酸碱基位置的化学取代。在一些
实施方式中，修饰选自：生物素化、荧光标记的掺入、修饰的核苷酸的掺入、2’-修饰的嘧啶、
3’加帽、与胺连接物的偶联、与高分子量非免疫原性化合物的偶联、与亲脂性化合物的偶
联、与药物的偶联、与细胞毒性部分的偶联以及用放射性同位标记，或本文中公开的其它修
饰。修饰的位置可以按照需要改变。例如，生物素化、荧光标记或细胞毒性部分可以与适体
的5’端偶联。生物素化、荧光标记或细胞毒性部分也可以与适体的3’端偶联。
实施方式中，修饰选自：生物素化、荧光标记的掺入、修饰的核苷酸的掺入、2’-修饰的嘧啶、
3’加帽、与胺连接物的偶联、与高分子量非免疫原性化合物的偶联、与亲脂性化合物的偶
联、与药物的偶联、与细胞毒性部分的偶联以及用放射性同位标记，或本文中公开的其它修
饰。修饰的位置可以按照需要改变。例如，生物素化、荧光标记或细胞毒性部分可以与适体
的5’端偶联。生物素化、荧光标记或细胞毒性部分也可以与适体的3’端偶联。
[0459] 在一些实施方式中，细胞毒性部分包封在纳米颗粒中。纳米颗粒可以选自：脂质体、树状聚合物和梳型聚合物。在其它实施方式中，细胞毒性部分包含小分子细胞毒性部
分。小分子细胞毒性部分可以包括但不限于酰肼长春花碱(vinblastine hydrazide)、卡奇
霉素、长春花属生物碱、cryptophycin、tubulysin、多拉斯他汀-10、多拉斯他汀-15、阿里他汀E、根霉素、埃博霉素B、埃博霉素D、紫杉烷类、美登素类(maytansinoids)及其任意变体和衍生物。在再其它的实施方式中，细胞毒性部分包括蛋白质毒素。例如，蛋白质毒素可以选
自白喉毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白树毒素和假单胞菌内毒素A。与本发明一起使用的非免疫原性的、高分子量化合物包括聚烷撑二醇，例如聚乙二醇。合适的放射性同位素包括
钇-90、铟-111、碘-131、镥-177、铜-67、铼-186、铼-188、铋-212、铋-213、砹-211和锕-225。
适体可以用γ-发射的放射性同位素标记。
分。小分子细胞毒性部分可以包括但不限于酰肼长春花碱(vinblastine hydrazide)、卡奇
霉素、长春花属生物碱、cryptophycin、tubulysin、多拉斯他汀-10、多拉斯他汀-15、阿里他汀E、根霉素、埃博霉素B、埃博霉素D、紫杉烷类、美登素类(maytansinoids)及其任意变体和衍生物。在再其它的实施方式中，细胞毒性部分包括蛋白质毒素。例如，蛋白质毒素可以选
自白喉毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白树毒素和假单胞菌内毒素A。与本发明一起使用的非免疫原性的、高分子量化合物包括聚烷撑二醇，例如聚乙二醇。合适的放射性同位素包括
钇-90、铟-111、碘-131、镥-177、铜-67、铼-186、铼-188、铋-212、铋-213、砹-211和锕-225。
适体可以用γ-发射的放射性同位素标记。
[0460] 在本发明的一些实施方式中，将活性剂与适体偶联。例如，活性剂可以是治疗剂或诊断剂。治疗剂可以选自酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、安沙霉素抗生素、天门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡氮芥、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、氮烯唑胺、更生霉素、道诺霉素、右雷佐生、多西他赛、亚德里亚霉素、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯基嘌呤、美法仑、氨甲喋呤、雷帕霉素(西罗莫司)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、光神霉素、甲基苄肼、利妥昔单抗、链脲霉素、替尼泊甙、硫鸟嘌呤、噻替派、紫杉烷、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉酚、考布他丁、圆皮海绵内酯(discodermolide)、transplatinum、抗-血管内皮生长因子受体化合物(“抗-VEGF”)、抗表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFR”)、
5-氟尿嘧啶和衍生物、放射性核素、多肽毒素、凋亡诱导剂、治疗敏化剂、酶或其活性片段，及其组合。
5-氟尿嘧啶和衍生物、放射性核素、多肽毒素、凋亡诱导剂、治疗敏化剂、酶或其活性片段，及其组合。
[0461] 表征样品的寡核苷酸集合
[0462] 生物学上存在的复杂性和异质性对生物系统和疾病的理解提出了挑战。多样性存在于各种水平，例如，在细胞、组织、个体和疾病状态内和之间。参见，例如，图11A。图11B综述了可以评价以表征这样的样品的各种生物实体。如图11B中所示，随着从评价DNA前进到
RNA、到蛋白质和最终到蛋白质复合物，多样性和复杂性的水平急剧提高。可以使用本发明
的寡核苷酸探针文库方法表征复合物生物来源，例如，组织样品、细胞、循环肿瘤细胞、微囊泡和复合物如蛋白质和蛋白脂质复合物。
RNA、到蛋白质和最终到蛋白质复合物，多样性和复杂性的水平急剧提高。可以使用本发明
的寡核苷酸探针文库方法表征复合物生物来源，例如，组织样品、细胞、循环肿瘤细胞、微囊泡和复合物如蛋白质和蛋白脂质复合物。
[0463] 表征生物样品的当前方法可以不足以解决这种复杂性和多样性。如图11C中所示，这样的当前方法通常具有测量多样性和复杂性之间的折衷。作为实例，考虑高通量测序技
术。下一代方法可以在单一分析中查询数千个分子靶标。但是，这样的方法仅探测单个DNA
和/或RNA分子，且因此错过蛋白质和生物复合物的巨大多样性。另一方面，流式细胞术可以
探测少量的预定义的配体。例如，单一分析可以探测少量的对于预定义的靶标的差异标记
的抗体。
术。下一代方法可以在单一分析中查询数千个分子靶标。但是，这样的方法仅探测单个DNA
和/或RNA分子，且因此错过蛋白质和生物复合物的巨大多样性。另一方面，流式细胞术可以
探测少量的预定义的配体。例如，单一分析可以探测少量的对于预定义的靶标的差异标记
的抗体。
[0464] 本发明的寡核苷酸探针文库解决以上挑战。开始文库的大小可以调整以测量与文库成员一样多的不同实体。例如，初始的未训练寡核苷酸文库具有测量1012或更多生物学特
征的潜能。更大的和/或不同的文库可以按照需要构建。该技术适应于在没有关于哪些“应
该不同”的假设的情况下发现样品之间的差异。例如，探针文库可以基于单个蛋白质、蛋白
质修饰、蛋白质复合物、脂质、核酸、不同折叠或构象或者无论区分目标样品的什么进行区
分。因此，该方法提供无偏的方式以鉴定可用于鉴别不同目标群体的生物样品差异。
征的潜能。更大的和/或不同的文库可以按照需要构建。该技术适应于在没有关于哪些“应
该不同”的假设的情况下发现样品之间的差异。例如，探针文库可以基于单个蛋白质、蛋白
质修饰、蛋白质复合物、脂质、核酸、不同折叠或构象或者无论区分目标样品的什么进行区
分。因此，该方法提供无偏的方式以鉴定可用于鉴别不同目标群体的生物样品差异。
[0465] 在本文的情况中，寡核苷酸文库探针用于评价样品可以称为自适应动态人工多配体靶向(Adaptive Dynamic Artificial Poly-ligand Targeting)或ADAPTTM(或者称为
Topological Oligonucleotide Profiling：TOPTM)。虽然如上所述，术语适体和寡核苷酸通常在本文中互换使用，“经典的”单个适体和ADAPT探针之间的一些差异如下。单个适体可以包括选择为以抗体-样“锁-钥”结合模式结合已知的特定靶标的单个寡核苷酸。它们可以基
于对预期靶标的特异性和结合特异性单独地评估。但是，ADAPT探针可以包括意图产生多探
针印记的寡核苷酸的文库。ADAPT探针包括多种潜在的结合模式(静电、疏水性、Watson-
Crick、多寡聚物复合物等)。ADAPT探针印记具有鉴别异质患者子群体的潜能。例如，单一
ADAPT文库可以组合以区别多个生物学状态。与经典的单一适体不同，结合靶标可以分离或
鉴别或者不分离或鉴别。应理解，鉴定单个适体，例如，SELEX，的筛选方法也可以用于富集原始寡核苷酸文库以鉴定ADAPT探针文库。
Topological Oligonucleotide Profiling：TOPTM)。虽然如上所述，术语适体和寡核苷酸通常在本文中互换使用，“经典的”单个适体和ADAPT探针之间的一些差异如下。单个适体可以包括选择为以抗体-样“锁-钥”结合模式结合已知的特定靶标的单个寡核苷酸。它们可以基
于对预期靶标的特异性和结合特异性单独地评估。但是，ADAPT探针可以包括意图产生多探
针印记的寡核苷酸的文库。ADAPT探针包括多种潜在的结合模式(静电、疏水性、Watson-
Crick、多寡聚物复合物等)。ADAPT探针印记具有鉴别异质患者子群体的潜能。例如，单一
ADAPT文库可以组合以区别多个生物学状态。与经典的单一适体不同，结合靶标可以分离或
鉴别或者不分离或鉴别。应理解，鉴定单个适体，例如，SELEX，的筛选方法也可以用于富集原始寡核苷酸文库以鉴定ADAPT探针文库。
[0466] 本发明的一般方法概述于图11D中。该方法的一个输入包括具有测量1012或更多的生物学特征的潜能的随机化寡核苷酸文库。如图中概述的，该方法鉴定在两个输入样品类
型之间不同的所需数量(例如，～105-106)。随机化寡核苷酸文库接触第一和第二样品类型，且鉴定结合各样品的寡核苷酸。比较结合的寡核苷酸群体且对于寡核苷酸探针文库保留特
异性地结合一种或另一种生物学输入样品的寡核苷酸，而结合两种生物学输入样品的寡核
苷酸被丢弃。这种保留的寡核苷酸探针文库然后可以与新的测试样品接触，并确定结合测
试样品的寡核苷酸的性质。测试样品基于所结合的寡核苷酸谱表征。参见，例如，图11H。
型之间不同的所需数量(例如，～105-106)。随机化寡核苷酸文库接触第一和第二样品类型，且鉴定结合各样品的寡核苷酸。比较结合的寡核苷酸群体且对于寡核苷酸探针文库保留特
异性地结合一种或另一种生物学输入样品的寡核苷酸，而结合两种生物学输入样品的寡核
苷酸被丢弃。这种保留的寡核苷酸探针文库然后可以与新的测试样品接触，并确定结合测
试样品的寡核苷酸的性质。测试样品基于所结合的寡核苷酸谱表征。参见，例如，图11H。
[0467] 细胞外囊泡提供有吸引力的媒介以剖析通过许多相互关联的来源驱动的生物学复杂性和多样性。在患者与患者的微囊泡群体之间中甚至在不同条件下(例如，应激、饮食、锻炼、休息、疾病等)来自单一患者的微囊泡群体中可能存在巨大的异质性。在各种疾病状
态中微囊泡群体内的分子表型的多样性，甚至在微囊泡分离和通过囊泡生物标志物分选
后，可能提出鉴定表面结合配体的挑战。这种情况通过囊泡表面-膜蛋白质复合物进一步复
杂化。寡核苷酸探针文库可用于解决这样的挑战并允许生物学表型的表征。该途径组合了
多样的寡核苷酸文库和高通量(下一代)测序技术的能力以探测细胞外微囊泡的复杂性。参
见图11E。
态中微囊泡群体内的分子表型的多样性，甚至在微囊泡分离和通过囊泡生物标志物分选
后，可能提出鉴定表面结合配体的挑战。这种情况通过囊泡表面-膜蛋白质复合物进一步复
杂化。寡核苷酸探针文库可用于解决这样的挑战并允许生物学表型的表征。该途径组合了
多样的寡核苷酸文库和高通量(下一代)测序技术的能力以探测细胞外微囊泡的复杂性。参
见图11E。
[0468] 除了样品中各种生物标志物的存在/不存在的检测外，ADAPTTM谱分析(profiling)可以提供动态事件的定量测量。例如，结合探针可以检测蛋白质复合物或其它翻译后修饰，
从而允许具有相同的蛋白质但处于不同的生物学配置中的样品的区分。这样的配置阐明于
图11F-G中。图11F，具有各种表面标志物的微囊泡从示例微囊泡样品群体显示：样品群体A。
所示的结合探测寡核苷酸1101以给定的特殊关系与两个表面标志物1102和1103接触。此
处，对于这些功能性复合物和空间关系独特的探针可以保留。与此相反，在微囊泡中，显示
于图11F的样品群体B，两个表面标志物1102和1103发现处于独立的空间关系中。此处，探针
1101由于相互作用的组分1102和1103的空间关系的不存在而不结合。
从而允许具有相同的蛋白质但处于不同的生物学配置中的样品的区分。这样的配置阐明于
图11F-G中。图11F，具有各种表面标志物的微囊泡从示例微囊泡样品群体显示：样品群体A。
所示的结合探测寡核苷酸1101以给定的特殊关系与两个表面标志物1102和1103接触。此
处，对于这些功能性复合物和空间关系独特的探针可以保留。与此相反，在微囊泡中，显示
于图11F的样品群体B，两个表面标志物1102和1103发现处于独立的空间关系中。此处，探针
1101由于相互作用的组分1102和1103的空间关系的不存在而不结合。
[0469] 使用ADAPT谱分析评价样品的说明性方法1110显示于图11H中。探测文库1111与样品1112混合。样品可以是如本文所述的，例如，来自患有或疑似患有疾病的受试者的体液。
探针允许结合样品1120，且微囊泡被沉淀1115。包含未结合的寡核苷酸的上清液1114被丢
弃。结合沉淀1115的寡核苷酸探针被洗脱1116和测序1117。通过结合寡核苷酸探针(如通过
测序1117测定的)产生的谱型1118用于表征样品1112。例如，谱型1118可以与参照比较，例
如，以确定是否该谱型与指示疾病或健康状态或者其它目标表型表征的参照谱型相似或不
同。该比较可以表明疾病的存在，提供诊断、预后或治疗诊断，或另外地表征与样品1112相
关的表型。图11I阐明了使用ADAPT谱分析表征表型的另一示意图。收集本文公开的患者样
品如体液1121。样品接触ADAPT文库集合1122。微囊泡(MVs)从接触的样品分离1123，例如，
使用超离心、过滤、聚合物沉淀或其它适宜的技术或者本文公开的技术的组合。收集与分离
的微囊泡结合的寡核苷酸并确定性质1124。结合的寡核苷酸的性质可以通过任何有用的技
术如测序、高通量测序(例如，NGS)、扩增(包括但不限于qPCR)或杂交(如杂交到平面或颗粒
基阵列)确定。结合的寡核苷酸的性质用于表征样品，例如，为包含疾病相关微囊泡。
探针允许结合样品1120，且微囊泡被沉淀1115。包含未结合的寡核苷酸的上清液1114被丢
弃。结合沉淀1115的寡核苷酸探针被洗脱1116和测序1117。通过结合寡核苷酸探针(如通过
测序1117测定的)产生的谱型1118用于表征样品1112。例如，谱型1118可以与参照比较，例
如，以确定是否该谱型与指示疾病或健康状态或者其它目标表型表征的参照谱型相似或不
同。该比较可以表明疾病的存在，提供诊断、预后或治疗诊断，或另外地表征与样品1112相
关的表型。图11I阐明了使用ADAPT谱分析表征表型的另一示意图。收集本文公开的患者样
品如体液1121。样品接触ADAPT文库集合1122。微囊泡(MVs)从接触的样品分离1123，例如，
使用超离心、过滤、聚合物沉淀或其它适宜的技术或者本文公开的技术的组合。收集与分离
的微囊泡结合的寡核苷酸并确定性质1124。结合的寡核苷酸的性质可以通过任何有用的技
术如测序、高通量测序(例如，NGS)、扩增(包括但不限于qPCR)或杂交(如杂交到平面或颗粒
基阵列)确定。结合的寡核苷酸的性质用于表征样品，例如，为包含疾病相关微囊泡。
[0470] 图11中概述的途径可以适应于任何所需的样品类型，例如，组织、细胞、微囊泡、循环生物标志物和这些中任一种的成分。
[0471] 在一个方面，本发明提供了一种表征样品的方法，其是通过将样品接触不同寡核苷酸的集合(其可以称为适体集合或寡核苷酸探针文库)，并测定集合中的各种寡核苷酸结
合样品的频率。例如，鉴别与非癌患者相比优先结合来自癌症患者的组织、细胞或微囊泡的
寡核苷酸集合。收集例如来自怀疑患有癌症的患者的测试样品并接触寡核苷酸集合。从测
试样品洗脱结合测试样品的寡核苷酸，收集并鉴别，并且将结合的寡核苷酸的组成与已知
结合癌症样品的那些进行比较。各种测序、扩增和杂交技术可以用于鉴别洗脱的适体。例
如，当使用大的寡核苷酸集合时，可以通过高通量方法如下一代测序或通过杂交来进行寡
核苷酸鉴别。如果测试样品以与对于来自癌症患者的样品相似的方法被寡核苷酸集合结合
(例如，如通过生物信息学分类方法确定的)，那么测试样品也指示癌症。使用这种方法，可
以将结合一种或多种抗原的寡核苷酸集合用于表征样品而不必需知道寡核苷酸集合的每
个成员的准确靶标。因此，寡核苷酸集合提供生物印记。本文中的实施例5-7和9-31及其它
说明了本发明的实施方式。
合样品的频率。例如，鉴别与非癌患者相比优先结合来自癌症患者的组织、细胞或微囊泡的
寡核苷酸集合。收集例如来自怀疑患有癌症的患者的测试样品并接触寡核苷酸集合。从测
试样品洗脱结合测试样品的寡核苷酸，收集并鉴别，并且将结合的寡核苷酸的组成与已知
结合癌症样品的那些进行比较。各种测序、扩增和杂交技术可以用于鉴别洗脱的适体。例
如，当使用大的寡核苷酸集合时，可以通过高通量方法如下一代测序或通过杂交来进行寡
核苷酸鉴别。如果测试样品以与对于来自癌症患者的样品相似的方法被寡核苷酸集合结合
(例如，如通过生物信息学分类方法确定的)，那么测试样品也指示癌症。使用这种方法，可
以将结合一种或多种抗原的寡核苷酸集合用于表征样品而不必需知道寡核苷酸集合的每
个成员的准确靶标。因此，寡核苷酸集合提供生物印记。本文中的实施例5-7和9-31及其它
说明了本发明的实施方式。
[0472] 在一个方面，本发明提供了一种针对测试样品表征病症的方法，包括：将样品接触能够结合样品中存在的一种或多种靶标的多种寡核苷酸，鉴别与样品形成复合物的一组寡
核苷酸，其中该组预定为针对样品表征病症，由此针对样品表征病症。样品可以是任何有用
的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
核苷酸，其中该组预定为针对样品表征病症，由此针对样品表征病症。样品可以是任何有用
的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
[0473] 在相关方面中，本发明提供了一种鉴别与测试样品相关的一组寡核苷酸的方法，包括：(a)将样品接触多个寡核苷酸，分离与样品形成复合物的一组寡核苷酸，(b)测定每个
寡核苷酸的序列和/或拷贝数，由此鉴别与测试样品相关的一组寡核苷酸。样品可以是任何
有用的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
寡核苷酸的序列和/或拷贝数，由此鉴别与测试样品相关的一组寡核苷酸。样品可以是任何
有用的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
[0474] 在再另一相关方面中，本发明提供了一种将样品诊断为癌性的或易患癌的方法，包括将样品接触预定与非癌症样品相比优先与癌症样品形成复合物的多种寡核苷酸。样品
可以是任何有用的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
可以是任何有用的样品，如本文公开的，例如，组织、细胞、微囊泡或生物标志物样品，或者其任何有用的组合。
[0475] 可以通过测序，例如，通过染料终止(Sanger)测序或高通量方法，来鉴别寡核苷酸。高通量方法可以包括快速测序大量核酸的技术，包括下一代技术，如大规模平行签名测
序(MPSS)；Polony测序；454焦磷酸测序；Illumina(Solexa；MiSeq/HiSeq/NextSeq/等)测
序；SOLiD测序；Ion Torrent半导体测序；DNA纳米球测序；Heliscope单分子测序；单分子实时(SMRT)测序或其他方法，如Nanopore DNA测序；隧道电流(Tunnelling currents)DNA测
序；通过杂交的测序；使用质谱的测序；微流体Sanger测序；基于显微术的技术；RNAP测序；
体外病毒高通量测序。还可以通过杂交技术来鉴别寡核苷酸。例如，可以使用具有可寻址位
置以杂交并且由此检测集合的各个成员的微阵列。或者，检测可以基于与寡核苷酸集合的
各个成员杂交的一个或多个差异标记的寡核苷酸。标记的可检测信号可以与核酸分子相
关，该核酸分子与各种寡核苷酸中存在的核酸延伸链杂交。延伸链可以与文库中的一个或
多个寡核苷酸相同或不同。可检测信号可以包括荧光染料，包括如U.S.专利申请公开
No.20140371088，2013017837和20120258870中已知的颜色编码的条码。可以按照需要使用
其它可检测的标记(金属、放射性同位素等)。
序(MPSS)；Polony测序；454焦磷酸测序；Illumina(Solexa；MiSeq/HiSeq/NextSeq/等)测
序；SOLiD测序；Ion Torrent半导体测序；DNA纳米球测序；Heliscope单分子测序；单分子实时(SMRT)测序或其他方法，如Nanopore DNA测序；隧道电流(Tunnelling currents)DNA测
序；通过杂交的测序；使用质谱的测序；微流体Sanger测序；基于显微术的技术；RNAP测序；
体外病毒高通量测序。还可以通过杂交技术来鉴别寡核苷酸。例如，可以使用具有可寻址位
置以杂交并且由此检测集合的各个成员的微阵列。或者，检测可以基于与寡核苷酸集合的
各个成员杂交的一个或多个差异标记的寡核苷酸。标记的可检测信号可以与核酸分子相
关，该核酸分子与各种寡核苷酸中存在的核酸延伸链杂交。延伸链可以与文库中的一个或
多个寡核苷酸相同或不同。可检测信号可以包括荧光染料，包括如U.S.专利申请公开
No.20140371088，2013017837和20120258870中已知的颜色编码的条码。可以按照需要使用
其它可检测的标记(金属、放射性同位素等)。
[0476] 多种寡核苷酸或寡核苷酸集合可以包括任何所需数量的寡核苷酸以允许样品的表征。在各种实施方式中，该集合包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或至少1000个不同的寡核苷酸成员。
18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或至少1000个不同的寡核苷酸成员。
[0477] 可以通过正向或负向选择的一个或多个步骤来预先选择多个寡核苷酸，其中正向选择包括针对与测试样品相比具有基本上相似的特征的样品来选择寡核苷酸，并且其中负
向选择包括针对与测试样品相比具有实质性不同特征的样品选择寡核苷酸。基本上相似的
特征意思是用于正向选择的样品在一个或多个目标特征上是测试样品典型的。例如，用于
正向选择的样品可以来自癌症患者或细胞系，而测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症
的患者的样品。实质性不同的特征意思是用于负向选择的样品在一个或多个表型/目标特
征上不同于测试样品。例如，用于负向选择的样品可以来自未患癌症的个体或细胞系(例
如，“正常”、“健康”或另外的“对照”样品)，而测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症的样品。癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、脑癌、胰腺癌、肾癌或其他癌症，如本文中公开的。
向选择包括针对与测试样品相比具有实质性不同特征的样品选择寡核苷酸。基本上相似的
特征意思是用于正向选择的样品在一个或多个目标特征上是测试样品典型的。例如，用于
正向选择的样品可以来自癌症患者或细胞系，而测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症
的患者的样品。实质性不同的特征意思是用于负向选择的样品在一个或多个表型/目标特
征上不同于测试样品。例如，用于负向选择的样品可以来自未患癌症的个体或细胞系(例
如，“正常”、“健康”或另外的“对照”样品)，而测试样品可以是来自患有或怀疑患有癌症的样品。癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、脑癌、胰腺癌、肾癌或其他癌症，如本文中公开的。
[0478] 通过选择所需表型代表性的样品来检测和/或区分，表征可以包括针对许多疾病或障碍的诊断、预后或治疗诊断。可以使用本发明的组合物和方法来表征各种疾病和障碍，
包括但不限于癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病和/或疼痛。对于更多详细内容，参见例如，本文中的“表型”章节。在实施方式中，疾病或障碍包括增殖性或赘生性疾病或障碍。例如，疾病或障碍可以是癌症。
包括但不限于癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫性疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病和/或疼痛。对于更多详细内容，参见例如，本文中的“表型”章节。在实施方式中，疾病或障碍包括增殖性或赘生性疾病或障碍。例如，疾病或障碍可以是癌症。
[0479] 图10B是显示了使用寡核苷酸集合来表征样品的表型的示意图1010，所述样品如以上所列那些。提供针对目标靶标的寡核苷酸集合1011。例如，可以富集寡核苷酸的集合来
靶向组织、细胞、微囊泡生物标志物或其任意组合。集合的成员可以结合不同的靶标(例如，不同的蛋白质)或相同靶标的不同表位(例如，单一蛋白质的不同表位)。将集合接触待表征
的测试样品1012。例如，测试样品可以是来自患有或怀疑患有给定疾病或障碍的个体的生
物样品。洗涤混合物来除去未结合的寡核苷酸。从样品洗脱或另外解离剩余的寡核苷酸并
收集1013。例如通过测序或杂交鉴别收集的适体1014。将所鉴别的存在和/或拷贝数用于表
征表型1014。
靶向组织、细胞、微囊泡生物标志物或其任意组合。集合的成员可以结合不同的靶标(例如，不同的蛋白质)或相同靶标的不同表位(例如，单一蛋白质的不同表位)。将集合接触待表征
的测试样品1012。例如，测试样品可以是来自患有或怀疑患有给定疾病或障碍的个体的生
物样品。洗涤混合物来除去未结合的寡核苷酸。从样品洗脱或另外解离剩余的寡核苷酸并
收集1013。例如通过测序或杂交鉴别收集的适体1014。将所鉴别的存在和/或拷贝数用于表
征表型1014。
[0480] 图10C是显示了图10B中方法的实施的示意图1020。提供了鉴别为结合微囊泡群体的寡核苷酸集合1019。输入样品包括包含微囊泡的测试样品1022。例如，测试样品可以是来
自患有或疑似患有给定疾病或障碍的个体的生物样品。集体与待表征的分离的微囊泡接触
1023。可以在接触1023之前或之后使用如本文中所述的各种技术，例如，色谱、过滤、超滤、离心、超离心、流式细胞术、亲和性捕获(例如，捕获至平面、柱或珠子)、聚合物沉淀和/或使用微流体技术，从样品分离微囊泡群体。洗涤混合物来除去未结合的寡核苷酸，并从样品洗
脱或另外解离剩余的寡核苷酸和收集1024。如上所述，鉴别收集的寡核苷酸1025，并将保留
的寡核苷酸的存在和/或拷贝数用于表征表型1026。
自患有或疑似患有给定疾病或障碍的个体的生物样品。集体与待表征的分离的微囊泡接触
1023。可以在接触1023之前或之后使用如本文中所述的各种技术，例如，色谱、过滤、超滤、离心、超离心、流式细胞术、亲和性捕获(例如，捕获至平面、柱或珠子)、聚合物沉淀和/或使用微流体技术，从样品分离微囊泡群体。洗涤混合物来除去未结合的寡核苷酸，并从样品洗
脱或另外解离剩余的寡核苷酸和收集1024。如上所述，鉴别收集的寡核苷酸1025，并将保留
的寡核苷酸的存在和/或拷贝数用于表征表型1026。
[0481] 如上所述，在图10C的实施方式中，将寡核苷酸集合1019直接接触包含或预期包含微囊泡的生物样品。之后从样品分离微囊泡，并洗涤混合物来除去未结合的寡核苷酸，且解
离和收集剩余的寡核苷酸1024。后续步骤如上所述进行。作为这个替代配置的实例，将生物
样品，例如，血液、血清或血浆样品，直接接触寡核苷酸集合。然后通过本文中公开的各种技术，包括但不限于超离心、超滤、流式细胞术、亲和性分离、聚合物沉淀、色谱、其各种组合等，来分离微囊泡。然后例如通过测序、杂交或扩增来鉴别剩余的寡核苷酸。
离和收集剩余的寡核苷酸1024。后续步骤如上所述进行。作为这个替代配置的实例，将生物
样品，例如，血液、血清或血浆样品，直接接触寡核苷酸集合。然后通过本文中公开的各种技术，包括但不限于超离心、超滤、流式细胞术、亲和性分离、聚合物沉淀、色谱、其各种组合等，来分离微囊泡。然后例如通过测序、杂交或扩增来鉴别剩余的寡核苷酸。
[0482] 在其它实施方式中，富集的寡核苷酸探针文库用于评价组织样品。在一些实施方式中，集合用于以与IHC相似的方式染色样品。这种方法在本文中可以称为PHC或多配体组
织化学。图10D提供这种方法的概述1030。提供了针对目标组织富集的适体集合1031。集合
与组织样品接触1032。组织样品可以是如本文中所述的形式。作为非限制性的实例，组织样
品可以是固定的肿瘤样品。样品可以是固定到载玻片或膜上的FFPE样品。洗涤样品以除去
未结合的适体集合的成员，且剩余的适体可视化1033。可以使用任何合适的可视化适体的
方法。在一个实例中，适体集合生物素化且结合的适体使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶
(SA-HRP)可视化。如本文所述的，其它有用的可视化方法是本领域中已知的，包括标记。可
视化的样品进行评分以确定染色的量1034。例如，病理学家可以如在IHC中对载玻片评分。
该评分可用于表征样品1035，如本文中所述。例如，+1或更高的评分可以指示样品是癌症样
品，或者是表达给定生物标志物的癌症样品。参见本文中的实施例19-31。
织化学。图10D提供这种方法的概述1030。提供了针对目标组织富集的适体集合1031。集合
与组织样品接触1032。组织样品可以是如本文中所述的形式。作为非限制性的实例，组织样
品可以是固定的肿瘤样品。样品可以是固定到载玻片或膜上的FFPE样品。洗涤样品以除去
未结合的适体集合的成员，且剩余的适体可视化1033。可以使用任何合适的可视化适体的
方法。在一个实例中，适体集合生物素化且结合的适体使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶
(SA-HRP)可视化。如本文所述的，其它有用的可视化方法是本领域中已知的，包括标记。可
视化的样品进行评分以确定染色的量1034。例如，病理学家可以如在IHC中对载玻片评分。
该评分可用于表征样品1035，如本文中所述。例如，+1或更高的评分可以指示样品是癌症样
品，或者是表达给定生物标志物的癌症样品。参见本文中的实施例19-31。
[0483] 在相关的方面，本发明提供了可用于实施该方法的包含多个寡核苷酸的物质组合，包括使用寡核苷酸集合以表征表型。多个寡核苷酸可以包括本文所述那些的任一种。
[0484] 在一个方面，本发明提供一种用于鉴别对于测试样品特异性的寡核苷酸的方法。该方法包括：(a)针对样品富集多种寡核苷酸以提供一组预定与靶样品形成复合物的寡核
苷酸；(b)将(a)中的多个接触测试样品以允许形成寡核苷酸与测试样品的复合物；(c)回收
(b)中形成复合物的寡核苷酸以提供回收的寡核苷酸亚集；和(d)通过高通量测序、扩增或
杂交对回收的寡核苷酸亚集进行谱分析，由此鉴别对于测试样品特异性的寡核苷酸。测试
样品可以包含组织、细胞、微囊泡、生物标志物或其它目标生物实体。寡核苷酸可以包括
RNA、DNA或两者。在一些实施方式中，该方法进一步包括进行信息学分析以鉴别包括与预定
与靶标样品形成复合物的寡核苷酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的寡核苷酸亚集。
苷酸；(b)将(a)中的多个接触测试样品以允许形成寡核苷酸与测试样品的复合物；(c)回收
(b)中形成复合物的寡核苷酸以提供回收的寡核苷酸亚集；和(d)通过高通量测序、扩增或
杂交对回收的寡核苷酸亚集进行谱分析，由此鉴别对于测试样品特异性的寡核苷酸。测试
样品可以包含组织、细胞、微囊泡、生物标志物或其它目标生物实体。寡核苷酸可以包括
RNA、DNA或两者。在一些实施方式中，该方法进一步包括进行信息学分析以鉴别包括与预定
与靶标样品形成复合物的寡核苷酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列同一性的寡核苷酸亚集。
[0485] 本领域技术人员理解，该方法可用于鉴定任何适宜的靶标。靶标可以是任何有用的靶标，包括但不限于细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊泡、病毒、膜片段、小分子、重金属、毒素、药物、核酸(包括但不限于微RNA(miR)和信使RNA(mRNA))、蛋白质-核酸复合物及任何这些的各种组合、片段和/或复合物。靶标可以例如包含这样的生物
实体的混合物。
实体的混合物。
[0486] 在一个方面，本发明还提供包括使寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品接触并检测寡核苷酸或多个寡核苷酸与样品中的靶标的结合的存在或水平的方法，其中寡核苷酸或多个
寡核苷酸可以是以上本发明提供的那些。样品可以包括生物样品、有机样品、组织、细胞培
养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物或其任何组合、部分和/或变型。靶标可以包括细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
寡核苷酸可以是以上本发明提供的那些。样品可以包括生物样品、有机样品、组织、细胞培
养物、体液、血液、血清、细胞、微囊泡、蛋白质复合物、脂质复合物、碳水化合物或其任何组合、部分和/或变型。靶标可以包括细胞、细胞器、蛋白质复合物、脂蛋白、碳水化合物、微囊泡、膜片段、小分子、重金属、毒素或药物。
[0487] 在另一方面中，本发明提供包括以下的方法：a)使样品与包含至少106、107、108、9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
10、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 或至少10 个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触以在溶液中形成混合物，其中寡核苷酸能够结合样品中的多个实体
以形成复合物，其中任选地寡核苷酸探针文库包含如以上本发明提供的寡核苷酸或多个寡
核苷酸；b)从混合物分配在步骤(a)中形成的复合物；和c)回收在步骤(b)中分离的复合物
中存在的寡核苷酸以鉴定样品的寡核苷酸谱。
10、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 或至少10 个不同寡核苷酸序列的寡核苷酸的寡核苷酸探针文库接触以在溶液中形成混合物，其中寡核苷酸能够结合样品中的多个实体
以形成复合物，其中任选地寡核苷酸探针文库包含如以上本发明提供的寡核苷酸或多个寡
核苷酸；b)从混合物分配在步骤(a)中形成的复合物；和c)回收在步骤(b)中分离的复合物
中存在的寡核苷酸以鉴定样品的寡核苷酸谱。
[0488] 在再另一方面中，本发明提供用于产生富集的寡核苷酸探针文库的方法，包括：a)使第一寡核苷酸文库与生物测试样品和生物对照样品接触，其中复合物在生物样品中存在
的实体和第一寡核苷酸文库中存在的多个寡核苷酸之间形成；b)分配在步骤(a)中形成的
复合物并分离复合物中的寡核苷酸以对于各生物测试样品和生物对照样品生成寡核苷酸
的亚集；c)使(b)中的寡核苷酸亚集接触生物测试样品和生物对照样品，其中复合物在生物
样品中存在的实体和寡核苷酸亚集中存在的多个第二寡核苷酸之间形成以生成寡核苷酸
的第二亚集；和d)任选地重复步骤b)-c)一次、两次、三次或更多次以产生相应的第三、第
四、第五或更多的寡核苷酸亚集，从而产生富集的寡核苷酸探针文库。在相关的方面，本发
明提供包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、
50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000个不同寡核苷酸序列的多个寡核苷酸，其中所述多个由这段落中的方法得到，其中该文库能够区分第一
表型与第二表型。在一些实施方式中，第一表型包括疾病或障碍且第二表型包括健康状态；
或其中第一表型包括疾病或障碍且第二表型包括不同的疾病或障碍；或其中第一表型包括
疾病或障碍的阶段或进展且第二表型包括疾病或障碍的不同阶段或进展；或其中第一表型
包括对疗法的阳性反应且第二表型包括对相同疗法的阴性反应。
的实体和第一寡核苷酸文库中存在的多个寡核苷酸之间形成；b)分配在步骤(a)中形成的
复合物并分离复合物中的寡核苷酸以对于各生物测试样品和生物对照样品生成寡核苷酸
的亚集；c)使(b)中的寡核苷酸亚集接触生物测试样品和生物对照样品，其中复合物在生物
样品中存在的实体和寡核苷酸亚集中存在的多个第二寡核苷酸之间形成以生成寡核苷酸
的第二亚集；和d)任选地重复步骤b)-c)一次、两次、三次或更多次以产生相应的第三、第
四、第五或更多的寡核苷酸亚集，从而产生富集的寡核苷酸探针文库。在相关的方面，本发
明提供包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、
50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000或500000个不同寡核苷酸序列的多个寡核苷酸，其中所述多个由这段落中的方法得到，其中该文库能够区分第一
表型与第二表型。在一些实施方式中，第一表型包括疾病或障碍且第二表型包括健康状态；
或其中第一表型包括疾病或障碍且第二表型包括不同的疾病或障碍；或其中第一表型包括
疾病或障碍的阶段或进展且第二表型包括疾病或障碍的不同阶段或进展；或其中第一表型
包括对疗法的阳性反应且第二表型包括对相同疗法的阴性反应。
[0489] 在又另一方面中，本发明提供表征疾病或障碍的方法，包括：a)使生物测试样品与本发明提供的寡核苷酸或多个寡核苷酸接触；b)检测步骤(a)中在本发明提供的寡核苷酸
或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标形成的复合物的存在或水平；和c)将步骤(a)中
检测的存在或水平与来自生物对照样品的参照水平比较，从而表征疾病或障碍。检测的步
骤可以包括进行复合物中所有或一些寡核苷酸的测序、复合物中所有或一些寡核苷酸的扩
增和/或复合物中所有或一些寡核苷酸的杂交到陈列上。测序可以是高通量或下一代测序。
在一些实施方式中，检测的步骤包括可视化与生物测试样品相关的寡核苷酸或多个寡核苷
酸。例如，可以使用如通过本发明提供的多配体组织化学(PHC)。
或多个寡核苷酸与生物测试样品中的靶标形成的复合物的存在或水平；和c)将步骤(a)中
检测的存在或水平与来自生物对照样品的参照水平比较，从而表征疾病或障碍。检测的步
骤可以包括进行复合物中所有或一些寡核苷酸的测序、复合物中所有或一些寡核苷酸的扩
增和/或复合物中所有或一些寡核苷酸的杂交到陈列上。测序可以是高通量或下一代测序。
在一些实施方式中，检测的步骤包括可视化与生物测试样品相关的寡核苷酸或多个寡核苷
酸。例如，可以使用如通过本发明提供的多配体组织化学(PHC)。
[0490] 在本发明的方法中，生物测试样品和生物对照样品各自可以包括组织样品、细胞培养物或生物流体。在一些实施方式中，生物流体包括体液。在本发明方法内的有用的体液
包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。在一些优选的实施方式中，体液包括血液、血清或血浆。生物流体可以包括微囊
泡。在这种情况中，复合物可以在寡核苷酸或多个寡核苷酸与微囊泡中的至少一个之间形
成。
包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。在一些优选的实施方式中，体液包括血液、血清或血浆。生物流体可以包括微囊
泡。在这种情况中，复合物可以在寡核苷酸或多个寡核苷酸与微囊泡中的至少一个之间形
成。
[0491] 生物测试样品和生物对照样品可以进一步包含分离的微囊泡，其中任选地微囊泡使用色谱、过滤、超滤、离心、超离心、流式细胞术、亲和捕获(如，捕获到平表面、柱或珠)、聚合物沉淀和使用微流体技术的至少一种分离。囊泡也可以在与寡核苷酸或多个寡核苷酸接
触后分离。
触后分离。
[0492] 生物测试样品和生物对照样品可以包含组织。组织可以是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在一些实施方式中，FFPE组织包括固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯
或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
FFPE组织可以固定在基质上固定。例如，载玻片或膜。
或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
FFPE组织可以固定在基质上固定。例如，载玻片或膜。
[0493] 在本发明的方法的各种实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸结合多肽或其片段。多肽或其片段可以是可溶的或膜结合的，其中任选地膜包括细胞或微囊泡膜。膜也可以
来自细胞片段、细胞器或微囊泡。在一些实施方式中，多肽或其片段包含表3、表4或表10-17的任一中的生物标志物。例如，多肽或其片段可以是一般囊泡标志物，如在表3中的，或者组织-相关或疾病-相关标志物，如在表4中的，或者表10-17任一中提供的与生物标志物相关
的囊泡。寡核苷酸或多个寡核苷酸可以结合生物样品中的微囊泡表面抗原。例如，寡核苷酸
或多个寡核苷酸可以针对微囊泡从原始文库富集。
来自细胞片段、细胞器或微囊泡。在一些实施方式中，多肽或其片段包含表3、表4或表10-17的任一中的生物标志物。例如，多肽或其片段可以是一般囊泡标志物，如在表3中的，或者组织-相关或疾病-相关标志物，如在表4中的，或者表10-17任一中提供的与生物标志物相关
的囊泡。寡核苷酸或多个寡核苷酸可以结合生物样品中的微囊泡表面抗原。例如，寡核苷酸
或多个寡核苷酸可以针对微囊泡从原始文库富集。
[0494] 如上所述，微囊泡可以使用聚合物沉淀全部或部分地分离。在一个实施方式中，聚合物包括聚乙二醇(PEG)。可以使用PEG的任何适宜形式。例如，PEG可以是PEG 8000。PEG可
以以任何适宜的浓度使用。例如，PEG可以以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、11％、12％、13％、14％或15％的浓度使用以分离微囊泡。在一些实施方式中，PEG以
6％的浓度使用。
以以任何适宜的浓度使用。例如，PEG可以以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、11％、12％、13％、14％或15％的浓度使用以分离微囊泡。在一些实施方式中，PEG以
6％的浓度使用。
[0495] 通过本文提供的寡核苷酸、多个寡核苷酸或方法检测的疾病或障碍可以包括任何适宜的目标疾病或障碍，包括但不限于乳腺癌、阿尔茨海默病、支气管哮喘、膀胱的移行细
胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑肿瘤、结肠直肠腺癌、慢性阻塞性肺病(COPD)、子宫颈的鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩氏病、II型糖尿病、食管癌、喉的鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、银屑病、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃的腺癌、甲状腺的癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
胞癌、巨细胞破成骨细胞瘤、脑肿瘤、结肠直肠腺癌、慢性阻塞性肺病(COPD)、子宫颈的鳞状细胞癌、急性心肌梗死(AMI)/急性心力衰竭、克罗恩氏病、II型糖尿病、食管癌、喉的鳞状细胞癌、骨髓的急性和慢性白血病、肺癌、恶性淋巴瘤、多发性硬化、卵巢癌、帕金森病、前列腺腺癌、银屑病、类风湿性关节炎、肾细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃的腺癌、甲状腺的癌、睾丸癌、溃疡性结肠炎或子宫腺癌。
[0496] 在一些实施方式中，疾病或障碍包括癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。癌症可以包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关
淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神
经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细
胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤之一。恶变前
状况可以包括但不限于巴雷特食管。自身免疫疾病可以包括但不限于炎性肠病(IBD)、克罗
恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症之一。心血管疾病可以包括但不限于动脉粥样硬化、充血
性心力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件之一。神经疾病可以包括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂
症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊
髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血
再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征之一。疼痛可以包括但不
限于纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛之一。传染病可以包括但不限
于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒之一。本领域技术人员理解本发明的寡核苷酸或多个寡核苷酸或方法可用于评价多种这些或其它相关疾病和障碍。
淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神
经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell
histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细
胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤之一。恶变前
状况可以包括但不限于巴雷特食管。自身免疫疾病可以包括但不限于炎性肠病(IBD)、克罗
恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症之一。心血管疾病可以包括但不限于动脉粥样硬化、充血
性心力衰竭、易损斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件之一。神经疾病可以包括但不限于多发性硬化(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂
症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊
髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血
再灌注损伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征之一。疼痛可以包括但不
限于纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛之一。传染病可以包括但不限
于细菌感染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒之一。本领域技术人员理解本发明的寡核苷酸或多个寡核苷酸或方法可用于评价多种这些或其它相关疾病和障碍。
[0497] 在本发明的一些实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸及其使用方法可用于表征某些疾病或疾病状态。如所述的，可用于表征各种疾病的寡核苷酸集合组合在一起以产生
可用于表征各种疾病的探针的主集合。本领域技术人员也理解，可用于表征特定疾病或障
碍的寡核苷酸集合也可以建立。本文提供的序列也可以按照需要修饰，只要功能性方面仍
然维持(例如，结合各种靶标或者表征表型的能力)。例如，寡核苷酸可以包括DNA或RNA，包
含各种非天然核苷酸，包含其它化学修饰，或包含各种删除或插入。这样的修饰可以有利于
合成、稳定性、递送、标记等，或者实际上可以具有很少或没有影响。在一些情况中，寡核苷酸中的一些核苷酸可以被置换而同时维持寡核苷酸的功能性方面。类似地，5’和3’侧翼区
可以被替代。在再其它情况中，可以针对其功能性确定仅一部分寡核苷酸，使得其它部分可
以被删除或替代。合成和修饰核苷酸和多核苷酸的多种技术公开于本文中或是本领域中已
知的。
可用于表征各种疾病的探针的主集合。本领域技术人员也理解，可用于表征特定疾病或障
碍的寡核苷酸集合也可以建立。本文提供的序列也可以按照需要修饰，只要功能性方面仍
然维持(例如，结合各种靶标或者表征表型的能力)。例如，寡核苷酸可以包括DNA或RNA，包
含各种非天然核苷酸，包含其它化学修饰，或包含各种删除或插入。这样的修饰可以有利于
合成、稳定性、递送、标记等，或者实际上可以具有很少或没有影响。在一些情况中，寡核苷酸中的一些核苷酸可以被置换而同时维持寡核苷酸的功能性方面。类似地，5’和3’侧翼区
可以被替代。在再其它情况中，可以针对其功能性确定仅一部分寡核苷酸，使得其它部分可
以被删除或替代。合成和修饰核苷酸和多核苷酸的多种技术公开于本文中或是本领域中已
知的。
[0498] 在一个方面，本发明提供提供包含用于实施本文中提供的本发明方法的试剂的试剂盒。在相似的方面中，本发明包括用于实施本文中提供的本发明方法的试剂的用途。在实
施方式中，试剂包括寡核苷酸或多个寡核苷酸。寡核苷酸或多个寡核苷酸是本文提供的那
些。试剂可以包括各种其它有用的组分，包括但不限于微RNA(miR)和信使RNA(mRNA))、蛋白
质-核酸复合物及任何这些的各种组合、片段和/或复合物。一种或多种试剂可以是以下的
一种或多种：a)配置为分离微囊泡的试剂，任选地其中配置为分离微囊泡的至少一种试剂
包括对于微囊泡抗原的结合剂、柱、基质、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠；b)配置为作为引物或探针发挥作用以扩增、测序、杂交或检测寡核苷酸或多个寡
核苷酸的至少一个寡核苷酸；c)配置为从样品除去一种或多种丰富的蛋白质的试剂，其中
任选地一种或多种丰富的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至
少一种；d)用于表位修复的试剂；和e)用于PHC可视化的试剂。
施方式中，试剂包括寡核苷酸或多个寡核苷酸。寡核苷酸或多个寡核苷酸是本文提供的那
些。试剂可以包括各种其它有用的组分，包括但不限于微RNA(miR)和信使RNA(mRNA))、蛋白
质-核酸复合物及任何这些的各种组合、片段和/或复合物。一种或多种试剂可以是以下的
一种或多种：a)配置为分离微囊泡的试剂，任选地其中配置为分离微囊泡的至少一种试剂
包括对于微囊泡抗原的结合剂、柱、基质、过滤单元、聚合物、聚乙二醇、PEG4000、PEG8000、颗粒或珠；b)配置为作为引物或探针发挥作用以扩增、测序、杂交或检测寡核苷酸或多个寡
核苷酸的至少一个寡核苷酸；c)配置为从样品除去一种或多种丰富的蛋白质的试剂，其中
任选地一种或多种丰富的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白中的至
少一种；d)用于表位修复的试剂；和e)用于PHC可视化的试剂。
[0499] 用寡核苷酸探针检测沃森-格里格碱基配对
[0500] 本发明提供的寡核苷酸探针可以通过非-Watson Crick碱基配对结合。但是，在一些情况中，本发明提供的寡核苷酸探针可以通过Watson Crick碱基配对结合。本发明的寡
核苷酸探针文库，例如，如上所述，可以同时查询两种类型的结合事件。例如，一些寡核苷酸探针可以以经典适体的形式结合蛋白质抗原，而其它寡核苷酸探针可以通过与这样的靶标
相关的核酸结合组织、细胞、微囊泡或其它靶标，例如，在靶标表面上的核酸(包括但不限于微RNA和mRNA)。这样的表面结合核酸可能与蛋白质相关。例如，它们可以包括Argonaute-微
RNA复合物。Argonaute蛋白质可以是Ago1、Ago2、Ago3和/或Ago4。
核苷酸探针文库，例如，如上所述，可以同时查询两种类型的结合事件。例如，一些寡核苷酸探针可以以经典适体的形式结合蛋白质抗原，而其它寡核苷酸探针可以通过与这样的靶标
相关的核酸结合组织、细胞、微囊泡或其它靶标，例如，在靶标表面上的核酸(包括但不限于微RNA和mRNA)。这样的表面结合核酸可能与蛋白质相关。例如，它们可以包括Argonaute-微
RNA复合物。Argonaute蛋白质可以是Ago1、Ago2、Ago3和/或Ago4。
[0501] 除了本文所述的寡核苷酸探针文库方法(其依赖于确定寡核苷酸的序列(例如，通过测序、杂交或扩增))，测定法也可以设计为检测Watson Crick碱基配对。在一些实施方式
中，这些方法依赖于Ago2-介导的切割，其中Ago2-微RNA复合物可使用寡核苷酸探针检测。
对于进一步的详细信息，参见2015年11月23日提交的PCT/US15/62184，该申请通过引用全
文并入本文。
中，这些方法依赖于Ago2-介导的切割，其中Ago2-微RNA复合物可使用寡核苷酸探针检测。
对于进一步的详细信息，参见2015年11月23日提交的PCT/US15/62184，该申请通过引用全
文并入本文。
[0502] 组织ADAPT
[0503] 如本文中所述的，本发明提供了针对各种生物样品(包括组织样品)富集寡核苷酸文库的方法。组织样品可以是固定的。固定可以用于制备组织学切片，生物学组织通过其保
持而免于衰变，从而防止自身溶解或腐败。细胞内的主要大分子是蛋白质和核酸。固定终止
任何正在进行的生物化学反应，且也可以提高处理的组织的机械强度或稳定性。因此，组织
固定可用于保持细胞和组织组分并且这以允许制备薄的染色切片的方式进行。这样的样品
可供用于多种生物学样本，例如，肿瘤样品。因此，固定的组织提供用于本发明的寡核苷酸
探针文库的各种应用的所需样品来源。这一过程可以称为“组织ADAPT”。
持而免于衰变，从而防止自身溶解或腐败。细胞内的主要大分子是蛋白质和核酸。固定终止
任何正在进行的生物化学反应，且也可以提高处理的组织的机械强度或稳定性。因此，组织
固定可用于保持细胞和组织组分并且这以允许制备薄的染色切片的方式进行。这样的样品
可供用于多种生物学样本，例如，肿瘤样品。因此，固定的组织提供用于本发明的寡核苷酸
探针文库的各种应用的所需样品来源。这一过程可以称为“组织ADAPT”。
[0504] 根据本发明的组织ADAPT已经用于提供各种寡核苷酸探针。在一个方面，本发明提供包含对应于以下的区域的寡核苷酸：a)如实施例19-31任一中所描述的可变序列；b)如表
20-23、25、27、38-40或45任一中所描述的可变序列；或c)SEQ ID NO.1-206506任一中所列
的序列。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含具有序列5’-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID
NO.4)的5’区、具有序列5’-CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5)的3’区或两者。本发明还提供包含与这样的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
96、97、98、99或100％同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供包含如上所述的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、
50000、60000、70000、80000、90000或至少100000个不同的寡核苷酸序列的多个寡核苷酸。
20-23、25、27、38-40或45任一中所描述的可变序列；或c)SEQ ID NO.1-206506任一中所列
的序列。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含具有序列5’-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID
NO.4)的5’区、具有序列5’-CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5)的3’区或两者。本发明还提供包含与这样的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
96、97、98、99或100％同源的核酸序列或其部分的寡核苷酸。在相关的方面，本发明提供包含如上所述的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、
50000、60000、70000、80000、90000或至少100000个不同的寡核苷酸序列的多个寡核苷酸。
[0505] 如本文所述的，可以对核酸分子进行许多有用的修饰。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸或多个寡核苷酸包含DNA、RNA、2’-O-甲基或硫代磷酸酯骨架或者其任意组合。
在一些实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸包含DNA、RNA、PNA、LNA、UNA及其任意组合中的至少一种。寡核苷酸或多个寡核苷酸的至少一个成员可以具有选自DNA、RNA、生物素化、
非天然存在的核苷酸、删除、插入、添加和化学修饰的至少一个功能性修饰。在一些实施方
式中，化学修饰包括C18、聚乙二醇(PEG)、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12和地高辛中的至少一种。
在一些实施方式中，寡核苷酸或多个寡核苷酸包含DNA、RNA、PNA、LNA、UNA及其任意组合中的至少一种。寡核苷酸或多个寡核苷酸的至少一个成员可以具有选自DNA、RNA、生物素化、
非天然存在的核苷酸、删除、插入、添加和化学修饰的至少一个功能性修饰。在一些实施方
式中，化学修饰包括C18、聚乙二醇(PEG)、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12和地高辛中的至少一种。
[0506] 本发明的寡核苷酸或多个寡核苷酸可以使用如本文所述的任何有用的标记进行标记。例如，寡核苷酸或多个寡核苷酸可以连接于纳米颗粒、脂质体、金、磁性标记、荧光标记、发光颗粒、生物素部分或放射性标记。
[0507] 组织ADAPT提供用于针对目标样品富集寡核苷酸文库。在一个方面，本发明提供一种使用多轮正向选择和负向选择富集寡核苷酸文库的方法。富集多个寡核苷酸的方法可以
包括：a)进行至少一轮正向选择，其中所述正向选择包括：i)使至少一个样品与多个寡核苷
酸接触，其中所述至少一个样品包含组织；和ii)回收与至少一个样品相关的多个寡核苷酸
的成员；b)任选地进行至少一轮负向选择，其中所述负向选择包括：i)使至少一个另外的样
品与多个寡核苷酸接触，其中至少一个另外的样品包含组织；ii)回收与至少一个另外的样
品不相关的多个寡核苷酸的成员；和c)扩增在步骤(a)(ii)和步骤(b)(ii)的至少之一中回
收的多个寡核苷酸的成员，从而富集寡核苷酸文库。这些过程的各种替代方式是可用的且
在本文中描述，如改变富集轮和改变正向选择和负向选择步骤的执行。在一个实施方式中，
在步骤(a)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下一循环的输入。在一个
实施方式中，在步骤(b)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下一循环的
输入。未富集的寡核苷酸文库可以具有极大的多样性。例如，未富集的寡核苷酸文库可以包
含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、
70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、
1012、1013、1014、1015、1016、1017或至少1018个不同的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，未富集的寡核苷酸文库包含如本文所述的原始F-Trin文库。
包括：a)进行至少一轮正向选择，其中所述正向选择包括：i)使至少一个样品与多个寡核苷
酸接触，其中所述至少一个样品包含组织；和ii)回收与至少一个样品相关的多个寡核苷酸
的成员；b)任选地进行至少一轮负向选择，其中所述负向选择包括：i)使至少一个另外的样
品与多个寡核苷酸接触，其中至少一个另外的样品包含组织；ii)回收与至少一个另外的样
品不相关的多个寡核苷酸的成员；和c)扩增在步骤(a)(ii)和步骤(b)(ii)的至少之一中回
收的多个寡核苷酸的成员，从而富集寡核苷酸文库。这些过程的各种替代方式是可用的且
在本文中描述，如改变富集轮和改变正向选择和负向选择步骤的执行。在一个实施方式中，
在步骤(a)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下一循环的输入。在一个
实施方式中，在步骤(b)(ii)中回收的多个寡核苷酸的成员用作步骤(a)(i)的下一循环的
输入。未富集的寡核苷酸文库可以具有极大的多样性。例如，未富集的寡核苷酸文库可以包
含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、
70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、
1012、1013、1014、1015、1016、1017或至少1018个不同的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，未富集的寡核苷酸文库包含如本文所述的原始F-Trin文库。
[0508] 在本发明的富集方法的实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品包含组织。按照需要，这样的组织可以使用本文中所述的或本领域中已知的方法固定。固定的
组织可以归档。固定的组织可以包括福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在实施方式
中，FFPE组织包括固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。FFPE组织可以在基质上固定。例如，基质可以是载玻片、膜或任何其它有用的材料。
组织可以归档。固定的组织可以包括福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在实施方式
中，FFPE组织包括固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。FFPE组织可以在基质上固定。例如，基质可以是载玻片、膜或任何其它有用的材料。
[0509] 在一些实施方式中，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在不同的基质上固定。作为非限制性的实例，至少一个样品固定在一个载玻片上而至少一个另外的样品固定
在不同的载玻片上。按照需要，这样的玻片可以来自不同的患者、不同的肿瘤、在不同时间
点的相同肿瘤、相同肿瘤的多个切片，等等。或者，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在单一基质上固定。作为非限制性的实例，至少一个样品和至少一个另外的样品固定在相
同的载玻片上，如肿瘤样品和肿瘤的正常邻近组织。在一些实施方式中，至少一个样品和/
或至少一个另外的样品被裂解(参见，例如，实施例29)、从基质刮除(参见，例如，实施例30)或进行显微解剖(参见，例如，实施例31)。裂解的样品可以排列在基质上。本发明包括任何
有用的基质。在一些实施方式中，基质包含膜。例如，膜可以是硝酸纤维素膜。
在不同的载玻片上。按照需要，这样的玻片可以来自不同的患者、不同的肿瘤、在不同时间
点的相同肿瘤、相同肿瘤的多个切片，等等。或者，至少一个样品和/或至少一个另外的样品在单一基质上固定。作为非限制性的实例，至少一个样品和至少一个另外的样品固定在相
同的载玻片上，如肿瘤样品和肿瘤的正常邻近组织。在一些实施方式中，至少一个样品和/
或至少一个另外的样品被裂解(参见，例如，实施例29)、从基质刮除(参见，例如，实施例30)或进行显微解剖(参见，例如，实施例31)。裂解的样品可以排列在基质上。本发明包括任何
有用的基质。在一些实施方式中，基质包含膜。例如，膜可以是硝酸纤维素膜。
[0510] 在本发明的富集方法的各种实施方式中，该至少一个样品和至少一个另外的样品在目标表型上不同。该至少一个样品和至少一个另外的样品可以来自相同基质的不同区
段。作为非限制性的实例，样品可以包含来自固定的组织样品的癌症组织和正常相邻组织。
在这样的情况中，至少一个样品和至少一个另外的样品可以从相同的基质刮除或显微解剖
以帮助富集。
段。作为非限制性的实例，样品可以包含来自固定的组织样品的癌症组织和正常相邻组织。
在这样的情况中，至少一个样品和至少一个另外的样品可以从相同的基质刮除或显微解剖
以帮助富集。
[0511] 寡核苷酸文库可以富集用于任何所需表型的分析。在实施方式中，表型包括组织、解剖学起源、医学病症、疾病、障碍或其任意组合。例如，组织可以是肌肉、上皮、结缔和神经组织或其任意组合。例如，解剖学起源可以是胃、肝、小肠、大肠、直肠、肛门、肺、鼻、支气管、肾、膀胱、尿道、垂体腺、松果体腺、肾上腺、甲状腺、胰腺、甲状旁腺、前列腺、心脏、血管、淋巴结、骨髓、胸腺、脾脏、皮肤、舌、鼻子、眼睛、耳、牙、子宫、阴道、睾丸、阴茎、卵巢、乳房、乳腺、脑、脊髓、神经、骨骼、韧带、肌腱或其任意组合。如以下进一步描述的，表型可以与诊断、预后、治疗诊断、医学病症、疾病或障碍的至少一种相关。
[0512] 在本发明的富集方法的各种实施方式中，该方法还包括确定寡核苷酸文库的富集成员的靶标。用于这种确定的技术在本文中提供。参见，例如，实施例9-10、17和19。
[0513] 组织ADAPT还包括生物样品的分析。在一个方面，本发明提供表征样品中的表型的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触；和b)鉴定在该至少一个寡
核苷酸或多个寡核苷酸与样品之间形成的复合物的存在或水平，其中该存在或水平用于表
征表型。在相关的方面，本发明提供可视化样品的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷
酸或多个寡核苷酸接触；b)除去不结合样品的该至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的成
员；和c)可视化与样品结合的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。可视化可用于表征表型。
核苷酸或多个寡核苷酸与样品之间形成的复合物的存在或水平，其中该存在或水平用于表
征表型。在相关的方面，本发明提供可视化样品的方法，包括：a)使样品与至少一个寡核苷
酸或多个寡核苷酸接触；b)除去不结合样品的该至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的成
员；和c)可视化与样品结合的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。可视化可用于表征表型。
[0514] 待表征的样品可以是任何有用的样品，包括但不限于组织样品、体液、细胞、细胞培养物、微囊泡或其任意组合。在一些实施方式中，组织样品包含固定的组织。组织可以使
用本领域中已知的任何有用的固定技术固定。固定方法的实例包括热固定、浸渍、灌注、化
学固定、交联(例如，用醛如甲醛或戊二醛)、沉淀(例如，使用醇如甲醇、乙醇和丙酮及乙
酸)、氧化(例如，使用四氧公锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾)、汞化物(mercurials)、苦味酸盐、Bouin溶液、hepes-谷氨酸缓冲剂介导的有机溶剂保护效应(HOPE)和冷冻。在优选的实
施方式中，固定的组织是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在各种实施方式中，FFPE
样品包含固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
用本领域中已知的任何有用的固定技术固定。固定方法的实例包括热固定、浸渍、灌注、化
学固定、交联(例如，用醛如甲醛或戊二醛)、沉淀(例如，使用醇如甲醇、乙醇和丙酮及乙
酸)、氧化(例如，使用四氧公锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾)、汞化物(mercurials)、苦味酸盐、Bouin溶液、hepes-谷氨酸缓冲剂介导的有机溶剂保护效应(HOPE)和冷冻。在优选的实
施方式中，固定的组织是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在各种实施方式中，FFPE
样品包含固定的组织、未染色的载玻片、骨髓芯或块、活检样品、手术样品、芯针活检样品、恶性流体和细针抽吸物(FNA)中的至少一种。
[0515] 用于鉴定存在或水平的任何有用的技术可以用于组织ADAPT的应用，包括但不限于核酸测序、扩增、杂交、凝胶电泳、色谱或可视化。在一些实施方式中，杂交包括使样品与配置为与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸杂交的至少一个标记的探针接触。至少一个标
记的探针可以直接或间接地连接于标记。标记可以是，例如，荧光、放射性或磁性标记。间接标记可以是，例如，生物素或地高辛。参见，例如，实施例28。在一些实施方式中，测序包括至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的下一代测序、染料终止测序和/或焦磷酸测序。可视化可
以是与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸直接或间接地关联的信号的可视化。信号可以是
任何有用的信号，例如，荧光信号或酶信号。在一些实施方式中，酶信号通过荧光素酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶
(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶中的至少一种产生。可视化可以包括使用光学显微术或荧光显微术。使用多
配体组织化学(PHC)的可视化的各种实例在本文中提供。参见实施例19-31。
记的探针可以直接或间接地连接于标记。标记可以是，例如，荧光、放射性或磁性标记。间接标记可以是，例如，生物素或地高辛。参见，例如，实施例28。在一些实施方式中，测序包括至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的下一代测序、染料终止测序和/或焦磷酸测序。可视化可
以是与至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸直接或间接地关联的信号的可视化。信号可以是
任何有用的信号，例如，荧光信号或酶信号。在一些实施方式中，酶信号通过荧光素酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶
(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶和微过氧化物酶中的至少一种产生。可视化可以包括使用光学显微术或荧光显微术。使用多
配体组织化学(PHC)的可视化的各种实例在本文中提供。参见实施例19-31。
[0516] 在涉及表征或可视化样品的本发明方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标是已知的。例如，寡核苷酸可以结合已知的蛋白质靶标。在一些实施方式
中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标是未知的。例如，至少一个寡核苷
酸或多个寡核苷酸可以本身可以提供不必然需要了解通过一些或所有寡核苷酸结合的抗
原的生物印记或其它有用的结果。在一些实施方式中，一部分寡核苷酸的靶标是已知的而
另一部分寡核苷酸的靶标未被鉴定。
中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸中至少之一的靶标是未知的。例如，至少一个寡核苷
酸或多个寡核苷酸可以本身可以提供不必然需要了解通过一些或所有寡核苷酸结合的抗
原的生物印记或其它有用的结果。在一些实施方式中，一部分寡核苷酸的靶标是已知的而
另一部分寡核苷酸的靶标未被鉴定。
[0517] 在表征或可视化样品的方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以如本文中提供。至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以使用本文提供的本发明的富集方法确定，例
如，通过组织ADAPT富集。例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.1-206506的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或
100％同源的序列或其部分的核酸。
如，通过组织ADAPT富集。例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.1-206506的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或
100％同源的序列或其部分的核酸。
[0518] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含可以与按照SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，肺癌或前列腺癌。参见实施例14。
[0519] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与按照SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，前列腺癌。参见实施例17。
[0520] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与按照SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，HER2状态(+/-)。参见实施例19。
[0521] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000种或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对抗-HER2疗法的反应，其中任选地抗-HER2疗法包含曲妥珠单抗。参见实施例20-22。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000种或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对抗-HER2疗法的反应，其中任选地抗-HER2疗法包含曲妥珠单抗。参见实施例20-22。
[0522] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000种或所有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对FOLFOX和贝伐单抗中的至少一种的反应。参见实施例24。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000种或所有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，对FOLFOX和贝伐单抗中的至少一种的反应。参见实施例24。
[0523] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15种或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，组织性质，包括但不限于是否组织包括乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。参见实施例29。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，组织性质，包括但不限于是否组织包括乳腺、结肠、肾、肺或胰腺组织。参见实施例29。
[0524] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明的方法中，表型可以是生物标志物状态。在一些实施方式中，生物标志物选自表4或图26A-B。在一些实施方式
中，生物标志物状态包括HER2阳性、HER2阴性、EGFR阳性、EGFR阴性、TUBB3阳性或TUBB3阴性中的至少一种。参见，例如，实施例19-23、24、26。在一些实施方式中，生物标志物包括ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1(22c3)、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS和TUBB3中至少一种的表达、拷贝数、突变、插入、删除或其它改变。在各种实施方式中，生物标志物包括EGFR vIII或MET外显子14跳读中
至少一种的存在或不存在。在实施方式中，生物标志物包括ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1和RSPO3中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。在实施方式中，生物标志物状态包括ABL2、ACSL3、ACSL6、AFF1、AFF3、AFF4、AKAP9、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、APC、ARFRP1、ARHGAP26、ARHGEF12、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATR、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL10、BCL11A、BCL2L11、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、C11orf30(EMSY)、C2orf44、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASC5、CASP8、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274(PDL1)、CD74、CD79A、CDC73、CDH11、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDX2、CHEK1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CIITA、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBP、CNTRL、COPB1、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRKL、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CYLD、CYP2D6、DAXX、DDR2、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DOT1L、EBF1、ECT2L、EGFR、ELK4、ELL、EML4、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHB1、EPS15、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETV1、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCG、FANCL、FAS、FBXO11、FBXW7、FCRL4、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXO1、FOXP1、FUBP1、FUS、GAS7、GATA3、GID4(C17orf39)、GMPS、GNA13、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPHN、GPR124、GRIN2A、GSK3B、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HGF、HIP1、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HSP90AA1、HSP90AB1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、KDM5A、KDR(VEGFR2)、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLHL6、KMT2A(MLL)、KMT2C(MLL3)、KMT2D(MLL2)、KRAS、KTN1、LCK、LCP1、LGR5、LHFP、LIFR、LPP、LRIG3、LRP1B、LYL1、MAF、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MDS2、MEF2B、MEN1、MET(cMET)、MITF、MLF1、MLH1(NGS)、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MNX1、MRE11A、MSH2(NGS)、MSH6(NGS)、MSI2、MTOR、MYB、MYC、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、NACA、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIA、NIN、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP214、NUP93、NUP98、NUTM1、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDCD1(PD1)、PDCD1LG2(PDL2)、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PER1、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PML、PMS2(NGS)、POLE、POT1、POU2AF1、PPARG、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRKAR1A、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN(NGS)、PTPN11、PTPRC、RABEP1、RAC1、RAD50、RAD51、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、REL、RET、RICTOR、RMI2、RNF43、ROS1、RPL22、RPL5、RPN1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SH3GL1、SLC34A2、SMAD2、SMAD4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SNX29、SOX10、SPECC1、SPEN、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、STAT3、STAT4、STAT5B、STIL、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TCF12、TCF3、TCF7L2、TET1、TET2、TFEB、TFG、TFRC、TGFBR2、TLX1、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF7、TRIM26、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VEGFA、VEGFB、VTI1A、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZMYM2、ZNF217、ZNF331、ZNF384、ZNF521和ZNF703中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物可以包括ABI1、ABL1、ACKR3、AKT1、AMER1(FAM123B)、AR、ARAF、ATP2B3、ATRX、BCL11B、BCL2、BCL2L2、BCOR、BCORL1、BRD3、BRD4、BTG1、BTK、C15orf65、CBLC、CD79B、CDH1、CDK12、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHCHD7、CNOT3、COL1A1、COX6C、CRLF2、DDB2、DDIT3、DNM2、DNMT3A、EIF4A2、ELF4、ELN、ERCC1(NGS)、ETV4、FAM46C、FANCF、FEV、FOXL2、FOXO3、FOXO4、FSTL3、GATA1、GATA2、GNA11、GPC3、HEY1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLF、HMGN2P46、HNF1A、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IKBKE、INHBA、IRS2、JUN、KAT6A(MYST3)、KAT6B、KCNJ5、KDM5C、KDM6A、KDSR、KLF4、KLK2、LASP1、LMO1、LMO2、MAFB、MAX、MECOM、MED12、MKL1、MLLT11、MN1、MPL、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYCL(MYCL1)、NBN、NDRG1、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NRAS、NUMA1、NUTM2B、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PAK3、PATZ1、PAX8、PDE4DIP、PHF6、PHOX2B、PIK3CG、PLAG1、PMS1、POU5F1、PPP2R1A、PRF1、PRKDC、RAD21、RECQL4、RHOH、RNF213、RPL10、SEPT5、SEPT6、SFPQ、SLC45A3、SMARCA4、SOCS1、SOX2、SPOP、SRC、SSX1、STAG2、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TCEA1、TCL1A、TERT、TFE3、TFPT、THRAP3、TLX3、TMPRSS2、UBR5、VHL、WAS、ZBTB16和ZRSR2中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物状态可以是对于2007年5月
18日提交的PCT/US2007/69286；2009年10月14日提交的PCT/US2009/60630；2010年2月11日
提交的PCT/2010/000407；2012年6月7日提交的PCT/US12/41393；2013年12月4日提交的
PCT/US2013/073184；2010年10月27日提交的PCT/US2010/54366；2011年12月28日提交的
PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的PCT/US15/13618和2016年3月3日提交的PCT/US16/
20657任一中的生物标志物；将该申请各自全部按引用并入本文中。可以整合到本发明的方
法和组合物中的另外的生物标志物的实例包括但不限于2009年10月30日提交的国际专利
申请No.PCT/US2009/62880；2009年12月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提
交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的
PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/
US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/
030302；2012年2月17日提交的PCT/US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；
2012年6月14日提交的PCT/US12/42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3
日提交的PCT/US12/49615；2012年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的
PCT/US2013/072019；2013年5月28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的
PCT/IB2013/003092；2013年12月19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/
US14/53306；和2015年11月23日提交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/
40157；2016年7月28日提交的PCT/US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中
公开的那些；该申请各自通过引用全文并入。本发明的方法可用于富集寡核苷酸文库和分
析给定的适宜的样品可得的任何所需生物标志物状态的样品。
中，生物标志物状态包括HER2阳性、HER2阴性、EGFR阳性、EGFR阴性、TUBB3阳性或TUBB3阴性中的至少一种。参见，例如，实施例19-23、24、26。在一些实施方式中，生物标志物包括ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1(22c3)、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS和TUBB3中至少一种的表达、拷贝数、突变、插入、删除或其它改变。在各种实施方式中，生物标志物包括EGFR vIII或MET外显子14跳读中
至少一种的存在或不存在。在实施方式中，生物标志物包括ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1和RSPO3中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。在实施方式中，生物标志物状态包括ABL2、ACSL3、ACSL6、AFF1、AFF3、AFF4、AKAP9、AKT2、AKT3、ALDH2、ALK、APC、ARFRP1、ARHGAP26、ARHGEF12、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATP1A1、ATR、AURKA、AURKB、AXIN1、AXL、BAP1、BARD1、BCL10、BCL11A、BCL2L11、BCL3、BCL6、BCL7A、BCL9、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1、BUB1B、C11orf30(EMSY)、C2orf44、CACNA1D、CALR、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CASC5、CASP8、CBFA2T3、CBFB、CBL、CBLB、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274(PDL1)、CD74、CD79A、CDC73、CDH11、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1B、CDKN2A、CDX2、CHEK1、CHEK2、CHIC2、CHN1、CIC、CIITA、CLP1、CLTC、CLTCL1、CNBP、CNTRL、COPB1、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRKL、CRTC1、CRTC3、CSF1R、CSF3R、CTCF、CTLA4、CTNNA1、CTNNB1、CYLD、CYP2D6、DAXX、DDR2、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、DICER1、DOT1L、EBF1、ECT2L、EGFR、ELK4、ELL、EML4、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHB1、EPS15、ERBB2(HER2)、ERBB3(HER3)、ERBB4(HER4)、ERC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ESR1、ETV1、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、EZR、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCG、FANCL、FAS、FBXO11、FBXW7、FCRL4、FGF10、FGF14、FGF19、FGF23、FGF3、FGF4、FGF6、FGFR1、FGFR1OP、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FHIT、FIP1L1、FLCN、FLI1、FLT1、FLT3、FLT4、FNBP1、FOXA1、FOXO1、FOXP1、FUBP1、FUS、GAS7、GATA3、GID4(C17orf39)、GMPS、GNA13、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPHN、GPR124、GRIN2A、GSK3B、H3F3A、H3F3B、HERPUD1、HGF、HIP1、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2B1、HOOK3、HSP90AA1、HSP90AB1、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IL2、IL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、KDM5A、KDR(VEGFR2)、KEAP1、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLHL6、KMT2A(MLL)、KMT2C(MLL3)、KMT2D(MLL2)、KRAS、KTN1、LCK、LCP1、LGR5、LHFP、LIFR、LPP、LRIG3、LRP1B、LYL1、MAF、MALT1、MAML2、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MCL1、MDM2、MDM4、MDS2、MEF2B、MEN1、MET(cMET)、MITF、MLF1、MLH1(NGS)、MLLT1、MLLT10、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MNX1、MRE11A、MSH2(NGS)、MSH6(NGS)、MSI2、MTOR、MYB、MYC、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、NACA、NCKIPSD、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NFKBIA、NIN、NOTCH2、NPM1、NR4A3、NSD1、NT5C2、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NUP214、NUP93、NUP98、NUTM1、PALB2、PAX3、PAX5、PAX7、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDCD1(PD1)、PDCD1LG2(PDL2)、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PER1、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PIM1、PML、PMS2(NGS)、POLE、POT1、POU2AF1、PPARG、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRKAR1A、PRRX1、PSIP1、PTCH1、PTEN(NGS)、PTPN11、PTPRC、RABEP1、RAC1、RAD50、RAD51、RAD51B、RAF1、RALGDS、RANBP17、RAP1GDS1、RARA、RB1、RBM15、REL、RET、RICTOR、RMI2、RNF43、ROS1、RPL22、RPL5、RPN1、RPTOR、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SH3GL1、SLC34A2、SMAD2、SMAD4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SNX29、SOX10、SPECC1、SPEN、SRGAP3、SRSF2、SRSF3、SS18、SS18L1、STAT3、STAT4、STAT5B、STIL、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TAF15、TCF12、TCF3、TCF7L2、TET1、TET2、TFEB、TFG、TFRC、TGFBR2、TLX1、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TOP1、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF7、TRIM26、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TRRAP、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VEGFA、VEGFB、VTI1A、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WISP3、WRN、WT1、WWTR1、XPA、XPC、XPO1、YWHAE、ZMYM2、ZNF217、ZNF331、ZNF384、ZNF521和ZNF703中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物可以包括ABI1、ABL1、ACKR3、AKT1、AMER1(FAM123B)、AR、ARAF、ATP2B3、ATRX、BCL11B、BCL2、BCL2L2、BCOR、BCORL1、BRD3、BRD4、BTG1、BTK、C15orf65、CBLC、CD79B、CDH1、CDK12、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHCHD7、CNOT3、COL1A1、COX6C、CRLF2、DDB2、DDIT3、DNM2、DNMT3A、EIF4A2、ELF4、ELN、ERCC1(NGS)、ETV4、FAM46C、FANCF、FEV、FOXL2、FOXO3、FOXO4、FSTL3、GATA1、GATA2、GNA11、GPC3、HEY1、HIST1H3B、HIST1H4I、HLF、HMGN2P46、HNF1A、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IKBKE、INHBA、IRS2、JUN、KAT6A(MYST3)、KAT6B、KCNJ5、KDM5C、KDM6A、KDSR、KLF4、KLK2、LASP1、LMO1、LMO2、MAFB、MAX、MECOM、MED12、MKL1、MLLT11、MN1、MPL、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYCL(MYCL1)、NBN、NDRG1、NKX2-1、NONO、NOTCH1、NRAS、NUMA1、NUTM2B、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PAK3、PATZ1、PAX8、PDE4DIP、PHF6、PHOX2B、PIK3CG、PLAG1、PMS1、POU5F1、PPP2R1A、PRF1、PRKDC、RAD21、RECQL4、RHOH、RNF213、RPL10、SEPT5、SEPT6、SFPQ、SLC45A3、SMARCA4、SOCS1、SOX2、SPOP、SRC、SSX1、STAG2、TAL1、TAL2、TBL1XR1、TCEA1、TCL1A、TERT、TFE3、TFPT、THRAP3、TLX3、TMPRSS2、UBR5、VHL、WAS、ZBTB16和ZRSR2中至少一种的表达、拷贝数、融合、突变、插入、删除或其它改变。生物标志物状态可以是对于2007年5月
18日提交的PCT/US2007/69286；2009年10月14日提交的PCT/US2009/60630；2010年2月11日
提交的PCT/2010/000407；2012年6月7日提交的PCT/US12/41393；2013年12月4日提交的
PCT/US2013/073184；2010年10月27日提交的PCT/US2010/54366；2011年12月28日提交的
PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的PCT/US15/13618和2016年3月3日提交的PCT/US16/
20657任一中的生物标志物；将该申请各自全部按引用并入本文中。可以整合到本发明的方
法和组合物中的另外的生物标志物的实例包括但不限于2009年10月30日提交的国际专利
申请No.PCT/US2009/62880；2009年12月12日提交的PCT/US2009/006095；2011年3月1日提
交的PCT/US2011/26750；2011年4月6日提交的PCT/US2011/031479；2011年8月18日提交的
PCT/US11/48327；2008年7月25日提交的PCT/US2008/71235；2010年11月30日提交的PCT/
US10/58461；2011年1月13日提交的PCT/US2011/21160；2013年3月11日提交的PCT/US2013/
030302；2012年2月17日提交的PCT/US12/25741；2008年9月12日提交的PCT/2008/76109；
2012年6月14日提交的PCT/US12/42519；2012年8月8日提交的PCT/US12/50030；2012年8月3
日提交的PCT/US12/49615；2012年7月7日提交的PCT/US12/41387；2013年11月26日提交的
PCT/US2013/072019；2013年5月28日提交的PCT/US2014/039858；2013年10月23日提交的
PCT/IB2013/003092；2013年12月19日提交的PCT/US13/76611；2014年8月28日提交的PCT/
US14/53306；和2015年11月23日提交的PCT/US15/62184；2016年6月29日提交的PCT/US16/
40157；2016年7月28日提交的PCT/US16/44595；和2016年3月9日提交的PCT/US16/21632中
公开的那些；该申请各自通过引用全文并入。本发明的方法可用于富集寡核苷酸文库和分
析给定的适宜的样品可得的任何所需生物标志物状态的样品。
[0525] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明方法中，表型可以是包括疾病或障碍的表型。该方法可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。例如，富集可以使用样品进行使得富集的文库可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预
后和/或治疗诊断。类似地，表征可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。可视化也可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊断。在一些实施方式
中，治疗诊断包括预测治疗效果或治疗效果的缺乏，将患者分类为治疗的响应者或非响应
者，或者监测治疗效果。治疗诊断可以针对任何适宜的治疗，例如，治疗可以包括化疗、免疫疗法、靶向癌症治疗、单克隆抗体、抗-HER2抗体、曲妥珠单抗、抗-VEGF抗体、贝伐单抗和/或铂/紫杉烷疗法中的至少一种。在一些实施方式中，治疗包括阿法替尼、阿法替尼+西妥昔单
抗、阿雷替尼、阿司匹林、阿特珠单抗、比卡鲁胺、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、色瑞替尼、西妥昔单抗、顺铂、克里唑蒂尼、达拉菲尼、达卡巴嗪、多柔比星、恩杂鲁胺、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦+依维莫司、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、激素疗法、伊立替康、拉帕替尼、脂质体-多柔比星、matinib、丝裂霉素-c、nab-紫杉醇、纳武单抗、奥拉帕尼、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼联合疗法、紫杉醇、帕博西尼、帕尼单抗、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、舒尼替尼、T-DM1、替莫唑胺多西他赛、替西罗莫司、拓扑替康、曲美替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼和威罗菲尼的至少一种。激素疗法可以是它莫西芬、托瑞米芬、氟维
司群、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、醋酸甲地孕酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、阿比特龙、恩杂鲁胺、曲普瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克中的至少一种。
断。例如，富集可以使用样品进行使得富集的文库可以用于帮助提供疾病或障碍的诊断、预
后和/或治疗诊断。类似地，表征可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊
断。可视化也可以包括帮助提供疾病或障碍的诊断、预后和/或治疗诊断。在一些实施方式
中，治疗诊断包括预测治疗效果或治疗效果的缺乏，将患者分类为治疗的响应者或非响应
者，或者监测治疗效果。治疗诊断可以针对任何适宜的治疗，例如，治疗可以包括化疗、免疫疗法、靶向癌症治疗、单克隆抗体、抗-HER2抗体、曲妥珠单抗、抗-VEGF抗体、贝伐单抗和/或铂/紫杉烷疗法中的至少一种。在一些实施方式中，治疗包括阿法替尼、阿法替尼+西妥昔单
抗、阿雷替尼、阿司匹林、阿特珠单抗、比卡鲁胺、卡博替尼、卡培他滨、卡铂、色瑞替尼、西妥昔单抗、顺铂、克里唑蒂尼、达拉菲尼、达卡巴嗪、多柔比星、恩杂鲁胺、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦+依维莫司、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、激素疗法、伊立替康、拉帕替尼、脂质体-多柔比星、matinib、丝裂霉素-c、nab-紫杉醇、纳武单抗、奥拉帕尼、奥希替尼、奥沙利铂、帕博西尼联合疗法、紫杉醇、帕博西尼、帕尼单抗、派姆单抗、培美曲塞、帕妥珠单抗、舒尼替尼、T-DM1、替莫唑胺多西他赛、替西罗莫司、拓扑替康、曲美替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼和威罗菲尼的至少一种。激素疗法可以是它莫西芬、托瑞米芬、氟维
司群、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、醋酸甲地孕酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、阿比特龙、恩杂鲁胺、曲普瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克中的至少一种。
[0526] 治疗诊断可以用于图26A-B中或2007年5月18日提交的PCT/US2007/69286；2009年10月14日提交的PCT/US2009/60630；2010年2月11日提交的PCT/2010/000407；2012年6月7
日提交的PCT/US12/41393；2013年12月4日提交的PCT/US2013/073184；2010年10月27日提
交的PCT/US2010/54366；2011年12月28日提交的PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的
PCT/US15/13618和2016年3月3日提交的PCT/US16/20657中所列的疗法；将所有申请各自全
部按引用并入本文中。这些疗法用于治疗各种癌症的益处的可能性或益处的缺乏可能与生
物标志物状态相关。例如，抗-HER2治疗对于其肿瘤表达HER2的患者可能是最有利的，反之
亦然。使用用于富集的适宜样品(例如，已知的响应者或非响应者)，组织ADAPT可以用于提
供与常规伴随诊断相比改善的治疗诊断。参见，例如，实施例20-22；也参见实施例24、27。
日提交的PCT/US12/41393；2013年12月4日提交的PCT/US2013/073184；2010年10月27日提
交的PCT/US2010/54366；2011年12月28日提交的PCT/US11/67527；2015年1月29日提交的
PCT/US15/13618和2016年3月3日提交的PCT/US16/20657中所列的疗法；将所有申请各自全
部按引用并入本文中。这些疗法用于治疗各种癌症的益处的可能性或益处的缺乏可能与生
物标志物状态相关。例如，抗-HER2治疗对于其肿瘤表达HER2的患者可能是最有利的，反之
亦然。使用用于富集的适宜样品(例如，已知的响应者或非响应者)，组织ADAPT可以用于提
供与常规伴随诊断相比改善的治疗诊断。参见，例如，实施例20-22；也参见实施例24、27。
[0527] 在涉及表征样品的本发明的方法中，表征可以包括将所述存在或水平与基准相比较。在一些实施方式中，基准包括在来自没有疾病或障碍的个体或者来自具有不同的疾病
或障碍状态的个体的样品中测定的存在或水平。存在或水平可以是通过可视化确定的视觉
水平的存在或水平，如IHC评分。作为非限制性的实例，与通过本发明提供的至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸的基准的比较指示样品包含癌症样品或非癌症/正常样品。
或障碍状态的个体的样品中测定的存在或水平。存在或水平可以是通过可视化确定的视觉
水平的存在或水平，如IHC评分。作为非限制性的实例，与通过本发明提供的至少一个寡核
苷酸或多个寡核苷酸的基准的比较指示样品包含癌症样品或非癌症/正常样品。
[0528] 在本发明的方法的一些实施方式中，一个或多个样品包含体液。体液可以是任何有用的体液，包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、头油、泪液、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
[0529] 在包括表征样品或可视化样品的本发明的方法中，样品可以来自疑似患有医学病症、疾病或障碍或者具有其倾向性的受试者。
[0530] 在包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品的本发明的方法中，医学病症、疾病或障碍可以是癌症、恶变前状况、炎性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病或障碍、心血管疾病或障碍、神经疾病或障碍、传染病或疼痛。在一些实施方式中，癌症包括急性淋巴母细胞
性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星
形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合
征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠
癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在一些实施方式中，恶变前状况包括
巴雷特食管。在一些实施方式中，自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。在一些实施方式中，心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损
斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。在一些实施方式中，神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障
碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬
化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损
伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。在一些实施方式中，疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛。在一些实施方式中，传染病包括细菌感
染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星
形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、原发部位不明癌、类癌瘤、原发部位不明癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、宫颈癌、儿童期癌症、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增殖障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃的(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维性组织细胞瘤骨癌、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤；隐匿原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合
征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、其它脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰癌、乳头状瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中度分化的松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺的母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠
癌、肾癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞泽里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃的)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、 巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在一些实施方式中，恶变前状况包括
巴雷特食管。在一些实施方式中，自身免疫疾病包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎舍格伦病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。在一些实施方式中，心血管疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损
斑块、中风、局部缺血、高血压、狭窄、血管阻塞或血栓形成事件。在一些实施方式中，神经疾病包括多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障
碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬
化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损
伤(例如，中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。在一些实施方式中，疼痛包括纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛。在一些实施方式中，传染病包括细菌感
染、病毒感染、酵母菌感染、惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病、流行性感冒。
[0531] 在一个方面，本发明提供包含用于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至少一种试剂的试剂盒。在相关的方面，本发明提供提
供用于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至
少一种试剂的用途。在一些实施方式中，至少一种试剂包括本文提供的寡核苷酸或多个寡
核苷酸。本文还提供另外的有用的试剂。参见，例如，实施例中提供的实验方案。
供用于实施通过本发明提供的方法(包括富集寡核苷酸文库、表征样品或可视化样品)的至
少一种试剂的用途。在一些实施方式中，至少一种试剂包括本文提供的寡核苷酸或多个寡
核苷酸。本文还提供另外的有用的试剂。参见，例如，实施例中提供的实验方案。
[0532] 组织ADAPT提供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可用于各种目的。如上所述，这样的寡核苷酸可用于表征和/或可视化样品。由于寡核苷酸选择为与目标组织相关，这种
相关性也可以用于其它目的。在一个方面，本发明提供一种对至少一个细胞或组织成像的
方法，包括使至少一个细胞或组织与本文提供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触，
和检测与至少一个细胞或组织接触的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。在非限制性的实
例中，这种方法可以用于患者中肿瘤或组织的医学成像。
相关性也可以用于其它目的。在一个方面，本发明提供一种对至少一个细胞或组织成像的
方法，包括使至少一个细胞或组织与本文提供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸接触，
和检测与至少一个细胞或组织接触的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸。在非限制性的实
例中，这种方法可以用于患者中肿瘤或组织的医学成像。
[0533] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对肺或前列腺组织。参见实施例14。
[0534] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，表型可以是，例如，前列腺癌。参见实施例17。
[0535] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。参见实施例19。
[0536] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。参见实施例20-22。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对细胞或组织的HER2状态。参见实施例20-22。
[0537] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对结肠直肠细胞或组织。参见实施例24。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对结肠直肠细胞或组织。参见实施例24。
[0538] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对组织，包括但不限于乳腺、结肠、肾、肺或胰腺细胞。参见实施例29。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。在这样的情况中，成像可以，例如，针对组织，包括但不限于乳腺、结肠、肾、肺或胰腺细胞。参见实施例29。
[0539] 在本发明提供的成像方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以带有各种有用的化学结构或修饰，如本文所述的。这样的修饰可以进行以增强结合、稳定性，允许检测
或用于其它有用的目的。
或用于其它有用的目的。
[0540] 在本发明提供的成像方法中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以在检测前施用于受试者。这种方法可以允许成像受试者中的至少一个细胞或组织。在一些实施方式中，
至少一个细胞或组织包含赘生性细胞、恶性细胞、肿瘤细胞、增生细胞或发育异常细胞。在
一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含淋巴瘤、白血病、肾癌、肉瘤、血管外皮细胞瘤、黑色素瘤、腹部癌症、胃癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌细胞中的至少一种。至少一个细胞或组织可以来自任何所需的组织或者与任何所需的医学病
症、疾病或障碍相关，如本文所述的。
至少一个细胞或组织包含赘生性细胞、恶性细胞、肿瘤细胞、增生细胞或发育异常细胞。在
一些实施方式中，至少一个细胞或组织包含淋巴瘤、白血病、肾癌、肉瘤、血管外皮细胞瘤、黑色素瘤、腹部癌症、胃癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌或非小细胞肺癌细胞中的至少一种。至少一个细胞或组织可以来自任何所需的组织或者与任何所需的医学病
症、疾病或障碍相关，如本文所述的。
[0541] 由于通过组织ADAPT提供的寡核苷酸选择为与目标组织相关，这类相关性也可以用于治疗应用如靶向药物递送中。寡核苷酸可以单独地或通过提供免疫调节剂、药物等的
靶向药物递送而提供治疗益处。在一个方面，本发明提供包含治疗有效量的含有如本文提
供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的构建体或其盐，及药学上可接受的载体、稀释剂
或两者的药物组合物。在一些实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与本文的表
28中所列的一个或多个蛋白质相关。
靶向药物递送而提供治疗益处。在一个方面，本发明提供包含治疗有效量的含有如本文提
供的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸的构建体或其盐，及药学上可接受的载体、稀释剂
或两者的药物组合物。在一些实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸与本文的表
28中所列的一个或多个蛋白质相关。
[0542] 例如，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2922-2926、2929-2947和2950-2952的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括肺癌或前
列腺癌。参见实施例14。
列腺癌。参见实施例14。
[0543] 在另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与根据SEQ ID NO.2953-2961和2971-2979的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括前列腺癌。参
见实施例17。
见实施例17。
[0544] 在又另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3039-3061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺癌。
参见实施例19。
参见实施例19。
[0545] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.3062-103061和103062-203061的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗
法，其中任选地癌症包括乳腺癌。参见实施例20-22。
50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、
6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、
100000、150,000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、
98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗
法，其中任选地癌症包括乳腺癌。参见实施例20-22。
[0546] 在一个实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.203064-203067和203076-206478的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症
包括结肠直肠癌。参见实施例24。
40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000个或所有的寡核苷酸序列至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症
包括结肠直肠癌。参见实施例24。
[0547] 在再另一实例中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含具有与SEQ ID NO.206491-206506的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15个或所有的寡核苷酸序列至少50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺、结肠、肾、肺或前列
腺的癌症。参见实施例29。
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％同源的序列或其部分的核酸。这样的药物组合物可能可用于与癌症相关的疗法，其中任选地癌症包括乳腺、结肠、肾、肺或前列
腺的癌症。参见实施例29。
[0548] 药物组合物内的至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以具有任何有用的所需化学修饰。在一个实施方式中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸连接于毒素或化疗剂。至少
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含在多部分构建体内。至少一个寡核苷酸或多个寡核
苷酸可以连接于脂质体或纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质体或纳米颗粒包含毒素或化
疗剂。在这样的情况中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可用于将治疗剂靶向于所需的
细胞、组织、器官等。
一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可以包含在多部分构建体内。至少一个寡核苷酸或多个寡核
苷酸可以连接于脂质体或纳米颗粒。在一些实施方式中，脂质体或纳米颗粒包含毒素或化
疗剂。在这样的情况中，至少一个寡核苷酸或多个寡核苷酸可用于将治疗剂靶向于所需的
细胞、组织、器官等。
[0549] 在相关的方面，本发明提供一种治疗或改善需要的受试者中的疾病或障碍的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。在另一相关的方面中，本发明提供一种在受试
者中诱导细胞毒性的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。可以使用任何有用的
施用方式，包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、局部施用或其任意组合中的至少一种。
者中诱导细胞毒性的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。可以使用任何有用的
施用方式，包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、局部施用或其任意组合中的至少一种。
[0550] 通过组织ADAPT提供的寡核苷酸或多个寡核苷酸可以用于任何所需医学病症、疾病或障碍的成像或治疗应用，如本文所述的那些(参见以上)。作为非限制性的实例，寡核苷
酸或多个寡核苷酸可以用于来自各种不同解剖位置的肿瘤的成像或用于治疗源自各种组
织的癌症。
酸或多个寡核苷酸可以用于来自各种不同解剖位置的肿瘤的成像或用于治疗源自各种组
织的癌症。
[0551] 试剂盒
[0552] 本发明还提供了包含实施本发明方法的一种或多种试剂的试剂盒。例如，一种或多种试剂可以是一种或多种适体、缓冲剂、封闭剂、酶或其组合。一种或多种试剂可以包括
用于进行所述方法的任何有用的试剂，包括但不限于适体文库、基质(如，微珠或平面阵列
或孔)、用于生物标志物和/或微囊泡分离(例如，通过色谱、过滤、超滤、离心、超离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，至平面表面、柱或珠)、聚合物沉淀和/或使用微流体装置)的试剂、针对特定靶标的适体、促进组织/细胞/微囊泡/生物标志物群体检测的适体集合、试剂(如
用于核酸测序或扩增的引物)、用于核酸杂交的阵列、可检测标记、溶剂或缓冲剂等、各种连接物、各种分析组分、封闭剂等等。一种或多种试剂还可以包括本发明提供的各种组合物。
在一个实施方式中，一种或多种试剂包括一种或多种本发明的适体。一种或多种试剂可以
包括基质，如平面基质、柱或珠子。试剂盒可以包含使用所述一种或多种试剂进行各种分析
的说明书。一种或多种试剂可以包括用于进行PHC分析的试剂，包括酶检测系统的组分及可
用于染色组织样品的其底物。
用于进行所述方法的任何有用的试剂，包括但不限于适体文库、基质(如，微珠或平面阵列
或孔)、用于生物标志物和/或微囊泡分离(例如，通过色谱、过滤、超滤、离心、超离心、流式细胞术、亲和捕获(例如，至平面表面、柱或珠)、聚合物沉淀和/或使用微流体装置)的试剂、针对特定靶标的适体、促进组织/细胞/微囊泡/生物标志物群体检测的适体集合、试剂(如
用于核酸测序或扩增的引物)、用于核酸杂交的阵列、可检测标记、溶剂或缓冲剂等、各种连接物、各种分析组分、封闭剂等等。一种或多种试剂还可以包括本发明提供的各种组合物。
在一个实施方式中，一种或多种试剂包括一种或多种本发明的适体。一种或多种试剂可以
包括基质，如平面基质、柱或珠子。试剂盒可以包含使用所述一种或多种试剂进行各种分析
的说明书。一种或多种试剂可以包括用于进行PHC分析的试剂，包括酶检测系统的组分及可
用于染色组织样品的其底物。
[0553] 在一个实施方式中，试剂盒包含本文中提供的寡核苷酸探针或组合物。试剂盒可以配置成进行本文中提供的方法。例如，试剂盒可以包括本发明的适体、基质或本发明的适
体和基质两者。
体和基质两者。
[0554] 在一个实施方式中，试剂盒配置成进行分析。例如，试剂盒可以含有一种或多种试剂和用于检测生物样品中生物实体的存在或水平的说明书。在这样的情况中，试剂盒可以
包括目标生物实体的一种或多种结合剂。一种或多种结合剂可以结合于基质。一种或多种
结合剂可以进行修饰以允许捕获、检测或可视化。例如，一种或多种结合剂可以生物素化或
与地高辛偶联。
包括目标生物实体的一种或多种结合剂。一种或多种结合剂可以结合于基质。一种或多种
结合剂可以进行修饰以允许捕获、检测或可视化。例如，一种或多种结合剂可以生物素化或
与地高辛偶联。
[0555] 在一个实施方式中，试剂盒包括提供对于生物样品的特定寡核苷酸谱的一组寡核苷酸。寡核苷酸谱可以包括，但不限于，可以用于表征特定疾病或障碍的谱。例如，疾病或障碍可以是增殖性疾病或障碍，包括但不限于癌症。在一些实施方式中，癌症包括乳腺癌。
[0556] 实施例
[0557] 实施例1：适体靶标鉴定
[0558] 在这个实施例中，将偶联于微球体的适体用于辅助测定由如上所述文库筛选方法鉴别的两个适体的靶标。一般方法显示于图9中。该方法用于验证CAR003(通过文库筛选鉴
别为识别EpCAM的适体)的靶标。CAR003是使用以上方法鉴定的适体候选者。作为RNA适体，
具有可选的尾序列的CAR003具有以下RNA序列(SEQ ID NO.3)：
别为识别EpCAM的适体)的靶标。CAR003是使用以上方法鉴定的适体候选者。作为RNA适体，
具有可选的尾序列的CAR003具有以下RNA序列(SEQ ID NO.3)：
[0559] 5’-auccagagug acgcagcagu cuuuucugau ggacacgugg uggucuagua ucacuaagcc accgugucca-3’
[0560] 在这种方法中，在连接到微球之前，CAR003的序列随机重排。将微球用作对照来结合与预期的靶标分子相似但不相同的靶标。
[0561] 所用的实验方案如下：
[0562] 1)合成具有修饰的候选适体(在此，CAR003)和阴性对照适体(在此，随机排列的CAR003)以允许捕获(在此，适体生物素化)和交联(在此，使用Sulfo-SBED生物素标记转移
试剂和试剂盒，目录号33073，来自Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，以允许光致交联)。
试剂和试剂盒，目录号33073，来自Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL，以允许光致交联)。
[0563] 2)将各适体单独地与具有目标靶标的微囊泡(在此，BrCa细胞系微囊泡)混合。
[0564] 3)在孵育以允许适体结合靶标后，将紫外光施加于混合物以引发适体与微囊泡靶标的交联。
[0565] 4)裂解微囊泡，由此将交联的适体-靶标复合物释放至溶液中。
[0566] 5)使用链霉亲和素涂覆的基质从溶液捕获交联的适体-靶标复合物。
[0567] 6)在SDS-PAGE凝胶电泳上针对各适体单独地运行交联的适体-靶标复合物。用考马斯蓝染色来可视化捕获的蛋白质靶标。
[0568] 7)交联和结合步骤可以是混杂的以使得在各个凝胶上显现包括预期的靶标但也包括随机蛋白质的多个条带。采用候选适体(在此，CAR003)但非相关的阴性对照适体(在
此，随机排列的CAR003)在凝胶上出现的条带中发现预期的靶标。从凝胶切除对应于靶标的
条带。
此，随机排列的CAR003)在凝胶上出现的条带中发现预期的靶标。从凝胶切除对应于靶标的
条带。
[0569] 8)质谱(MS)用于从切除的条带来鉴别适体靶标。
[0570] 实施例2：疾病诊断
[0571] 这个实施例说明了使用本发明的寡核苷酸探针来诊断增殖性疾病。
[0572] 通过本领域已知的化学方式来合成合适量的结合BrCa-来源的微囊泡群体的寡核苷酸或寡核苷酸集合，如在实施例12或以下各个实施例中鉴定的。使用本领域已知的偶联
方法，将寡核苷酸偶联于适合于检测的诊断剂，如荧光部分。
方法，将寡核苷酸偶联于适合于检测的诊断剂，如荧光部分。
[0573] 将组合物应用于从患有与微囊泡的超表达相关的增殖性疾病(例如，乳腺癌)的测试患者群组获取的血液样品分离的微囊泡。将组合物同样应用于从未患增殖性疾病的阴性
对照群组获取的血液样品分离的微囊泡。
对照群组获取的血液样品分离的微囊泡。
[0574] 对测试群组样品使用合适的检测技术(例如，微珠分析或流式细胞术)指示疾病的存在，而应用于对照群组样品的相同技术指示疾病的不存在。
[0575] 结果显示了本发明的寡核苷酸在诊断增殖性疾病中是有用的。
[0576] 实施例3：治疗诊断
[0577] 这个实施例说明了使用本发明的寡核苷酸探针来提供对于用于治疗增殖性疾病的药物的治疗诊断。
[0578] 通过本领域已知的化学方式来合成合适量的结合乳腺癌组织的寡核苷酸或寡核苷酸集合，如在实施例19-21或以下各个实施例中鉴定的。探针偶联于适合于检测的试剂，
如生物素部分，其然后可以利用组织免疫化学技术(IHC)使用链霉亲和素构建体如链霉亲
和素-辣根过氧化物酶来检测。寡核苷酸探针或寡核苷酸探针的组在合适的组合物内，如缓
冲的溶液。
如生物素部分，其然后可以利用组织免疫化学技术(IHC)使用链霉亲和素构建体如链霉亲
和素-辣根过氧化物酶来检测。寡核苷酸探针或寡核苷酸探针的组在合适的组合物内，如缓
冲的溶液。
[0579] 治疗选择。探针应用于从对特定治疗(例如，曲妥珠单抗)有反应的患有增殖性疾病(例如，乳腺癌)的测试患者群组获取的肿瘤组织样品。探针同样应用于从对治疗没有反
应的患有相同增殖性疾病的患者组成的对照群组获取的肿瘤组织。对测试群组样品使用合
适的检测技术(例如，IHC)指示结合样品的探针可用于鉴别会对治疗有反应的患者，而应用
于对照群组样品的相同的技术鉴定可用于鉴别不对治疗有反应的患者。
应的患有相同增殖性疾病的患者组成的对照群组获取的肿瘤组织。对测试群组样品使用合
适的检测技术(例如，IHC)指示结合样品的探针可用于鉴别会对治疗有反应的患者，而应用
于对照群组样品的相同的技术鉴定可用于鉴别不对治疗有反应的患者。
[0580] 治疗监测。在另一情况中，探针在治疗过程如外科手术、放疗和/或化疗之前或期间应用于来自患有增殖性疾病(例如，乳腺癌)的测试患者群组的肿瘤组织样品。探针然后
在一段时间内应用于来自该患者的肿瘤组织样品。对测试群组样品使用合适的检测技术
(例如，IHC)指示是否检测的疾病相关细胞群体在治疗过程中随时间在浓度上增加、减少或
保持稳定。治疗后疾病相关细胞群体的增加可以指示治疗是不太有效的，而治疗后疾病相
关细胞群体的减少可以指示治疗具有有益效果。
在一段时间内应用于来自该患者的肿瘤组织样品。对测试群组样品使用合适的检测技术
(例如，IHC)指示是否检测的疾病相关细胞群体在治疗过程中随时间在浓度上增加、减少或
保持稳定。治疗后疾病相关细胞群体的增加可以指示治疗是不太有效的，而治疗后疾病相
关细胞群体的减少可以指示治疗具有有益效果。
[0581] 结果显示本发明的寡核苷酸探针可用于治疗诊断增殖性疾病。
[0582] 实施例4：治疗性寡核苷酸探针
[0583] 这个实施例说明了使用本发明的寡核苷酸探针来治疗增殖性疾病。
[0584] 通过本领域已知的化学方式来合成结合乳腺癌肿瘤组织的合适量的寡核苷酸或寡核苷酸集合，如实施例19-21或以下各个实施例中鉴定的。使用本领域已知的偶联方法，
将寡核苷酸与化疗剂如Doxil偶联。将偶联物配制于水性组合物中。
将寡核苷酸与化疗剂如Doxil偶联。将偶联物配制于水性组合物中。
[0585] 将组合物以一个或多个剂量静脉内施用于患有乳腺癌的测试受试者群组。根据相应剂量方案，未患乳腺癌的对照群组静脉内施用安慰剂。
[0586] 肿瘤样品的病理分析和/或存活率表明测试群组中的死亡率和/或发病率比对照群组有改善。
[0587] 结果显示出本发明的寡核苷酸在治疗增殖性疾病中是有用的。
[0588] 实施例5：寡核苷酸-测序检测方法
[0589] 这个实施例说明了使用寡核苷酸集合来检测指示目标表型的微囊泡。该方法利用已经针对指示目标表型的目标靶标富集的寡核苷酸集合。这个实施例中的方法允许有效利
用寡核苷酸文库来优先识别靶标实体。
用寡核苷酸文库来优先识别靶标实体。
[0590] 为了说明的目的，这个实施例中描述了使用来自体液样品的微囊泡靶标的方法。本领域技术人员理解，通过针对所需输入样品富集适体文库，该方法可以延伸至其他类型
的靶标实体(例如，细胞、蛋白质、各种其他生物复合物)、样品(例如，组织、细胞培养物、活检样品、其他体液)和其他表型(其他癌症、其他疾病等)。
的靶标实体(例如，细胞、蛋白质、各种其他生物复合物)、样品(例如，组织、细胞培养物、活检样品、其他体液)和其他表型(其他癌症、其他疾病等)。
[0591] 一般工作流程：
[0592] 1)获得具有未知医学语源(medical etymology)且因此预先治疗的患者的样品(血浆、血清、尿液或任何其他生物样品)以确保目标靶标的可获得性(参见下文)。在目标靶
标是微囊泡群体的情况中，可以分离微囊泡，并任选系着于固体支持物如微珠。
标是微囊泡群体的情况中，可以分离微囊泡，并任选系着于固体支持物如微珠。
[0593] 2)将预处理样品暴露于携带针对目标靶标的特定特异性的寡核苷酸集合。如本文中所述的，可以使用各种选择方案，例如，如上所述使用用于负向选择的非癌微囊泡和用于
正向选择的癌症微囊泡，来富集携带针对目标靶标的特定特异性的寡核苷酸集合。可以按
照需要使用DNA或RNA寡核苷酸。
正向选择的癌症微囊泡，来富集携带针对目标靶标的特定特异性的寡核苷酸集合。可以按
照需要使用DNA或RNA寡核苷酸。
[0594] 3)使寡核苷酸文库接触样品。
[0595] 4)洗脱结合靶标的任何寡核苷酸。
[0596] 5)将洗脱的寡核苷酸测序。可以使用下一代测序方法。
[0597] 6)从测序分析寡核苷酸谱。已知结合目标靶标的寡核苷酸的谱指示输入样品内靶标的存在。所述谱可以用于将样品表征为例如癌症或非癌症。
[0598] 实验方案变化：
[0599] 可以执行各种分析配置。目前存在四个示例性实验方案用于寡核苷酸测序分析的目的。样品可以是任何适宜的生物样品。实验方案可以按照需要改进。例如，微囊泡可以使
用替代超滤或者超滤之外的可选技术分离。这样的技术可以在本文中公开，例如，聚合物沉
淀(例如，PEG)、柱色谱和/或亲和分离。
用替代超滤或者超滤之外的可选技术分离。这样的技术可以在本文中公开，例如，聚合物沉
淀(例如，PEG)、柱色谱和/或亲和分离。
[0600] 实验方案1：
[0601] 1-5ml体液样品(例如，血浆/血清/尿液)超离心(120K×g，无蔗糖)，沉淀物洗涤两次以分离微囊泡。
[0602] 测量回收的含有分离的微囊泡的样品的总蛋白浓度。
[0603] 将分离的微囊泡与磁珠(例如，MagPlex珠(Luminex Corp.Austin TX))偶联。
[0604] 用目标寡核苷酸集合孵育偶联的微囊泡。
[0605] 通过使用磁体保留珠子来洗涤未结合的寡核苷酸。
[0606] 洗脱结合于微囊泡的寡核苷酸。
[0607] 扩增和纯化洗脱的寡核苷酸。
[0608] 寡核苷酸测序(例如，下一代方法；Ion Torrent：融合PCR，乳液PCR，测序)。
[0609] 评价寡核苷酸谱。
[0610] 实验方案2：
[0611] 这个替代实验方案不包括微囊泡分离步骤，微囊泡与珠子偶联或单独的分配(partitioning)步骤。这可以呈现出寡核苷酸针对输入样品的非特异性结合。
[0612] 从体液样品除去细胞/碎片，并用含有MgCl2(2mM)的PBS稀释样品。
[0613] 将以上制得的样品与寡核苷酸文库预混合。
[0614] 寡核苷酸/样品混合物超离心(120K×g，无蔗糖)。洗涤沉淀的微囊泡。
[0615] 回收沉淀物并洗脱结合微囊泡的寡核苷酸。
[0616] 扩增并纯化洗脱的寡核苷酸。
[0617] 寡核苷酸测序(例如，下一代方法；Ion Torrent：融合PCR，乳液PCR，测序)。
[0618] 评价寡核苷酸谱。
[0619] 实验方案3：
[0620] 这个实验方案使用过滤替代超离心，并且应当需要较短的时间和较少的样品体积。
[0621] 从体液样品除去细胞/碎片，并用含有MgCl2(2mM)的PBS稀释样品。
[0622] 将以上制得的样品与寡核苷酸文库预混合。
[0623] 将样品加载于滤器中(即，150K或300K MWCO滤器或任何其它可以消除未结合或不想要的寡核苷酸的滤器)。将样品离心以浓缩。浓缩的样品应当含有微囊泡。
[0624] 洗涤浓缩物。变型1：用以上指定的缓冲液将浓缩物稀释至原始体积并重复离心。变型2：用以上指定的缓冲液将浓缩物稀释至原始体积并将浓缩物转移至新的过滤装置并
离心。重复两次。
离心。重复两次。
[0625] 回收浓缩物并洗脱结合微囊泡的寡核苷酸。
[0626] 扩增并纯化洗脱的寡核苷酸。
[0627] 寡核苷酸测序(例如，下一代方法；Ion Torrent：融合PCR，乳液PCR，测序)。
[0628] 评价寡核苷酸谱。
[0629] 实验方案4：
[0630] 1-5ml体液样品超离心(120K×g，无蔗糖)，沉淀物洗涤2次以分离微囊泡。
[0631] 将微囊泡与寡核苷酸集合预混合。
[0632] 将样品加载于300K MWCO滤器装置中并且离心(2000×g)。浓缩率为～3×。
[0633] 洗涤浓缩物。变型1：用以上指定的缓冲液将浓缩物稀释至原始体积并离心。重复两次。变型2：用以上指定的缓冲液将浓缩物稀释至原始体积并将浓缩物转移至新的过滤装
置并离心。重复两次。
置并离心。重复两次。
[0634] 回收浓缩物并洗脱结合微囊泡的寡核苷酸。
[0635] 扩增并纯化洗脱的寡核苷酸。
[0636] 寡核苷酸测序(例如，下一代方法；Ion Torrent：融合PCR，乳液PCR，测序)。
[0637] 评价寡核苷酸谱。
[0638] 在以上实验方案的替代方案中，聚合物沉淀用于从患者样品分离微囊泡。例如，寡核苷酸添加到样品和然后4％或8％浓度的PEG4000或PEG8000用于沉淀且由此分离微囊泡。
如上所述继续洗脱、回收和序列分析。
如上所述继续洗脱、回收和序列分析。
[0639] 实施例6：用寡核苷酸探针文库的血浆/血清探测
[0640] 以下实验方案用于使用寡核苷酸探针文库探测血浆或血清样品。
[0641] 输入寡核苷酸文库：
[0642] 使用每样品2ng寡核苷酸文库输入。
[0643] 输入寡核苷酸文库是两个文库(癌症和非癌症富集的)的混合物，浓度是16.3ng/ul。
[0644] 使用适体缓冲液(1X PBS中的3mM MgCl2)稀释到0.2ng/ul工作原液。
[0645] 从工作原液添加10ul(等于2ng文库)到各指封管。
[0646] 材料：
[0647] PBS，Hyclone SH30256.01，LN：AYG165629，瓶#8237，exp.7/2015
[0648] 圆底离心管，Beckman 326820，LN：P91207
[0649] 指封离心管和插塞，polyallomer Konical，Beckman 361621，批号Z10804SCA
[0651] 超离心转子：50.4TI，Beckman Caris ID#0478
[0652] 实验方案：
[0653] 1在4℃下预冷台式离心机、超速离心机、桶和转子。
[0654] 2解冻血浆或血清样品。
[0655] 3用适体缓冲液(1X PBS中的3mM MgCl2)以1∶2稀释1ml的样品。
[0656] 4以2000xg，30min，4℃旋转以除去碎片(台式离心机)。
[0657] 5转移所有样品的上清液到圆底锥形管。
[0658] 6在超速离心机中以12,000xg，45min，4℃旋转以除去另外的碎片。
[0659] 7转移所有样品的约1.8ml的上清液到新的OptiSeal钟形顶管(bell top tube)(唯一标记的)。
[0660] 8添加2ng(在10ul中)的DNA探测文库到各指封管。
[0661] 9用适体缓冲液QS到4.5ml。
[0662] 10固定封盖到OptiSeal钟形顶管上。
[0664] 12在室温下伴随旋转孵育血浆和寡核苷酸探针文库1小时。
[0665] 13除去封口膜(而非封盖)。
[0666] 14将适当的垫片置于各栓塞的管的顶部上。
[0667] 15在管上标记沉淀区域，确保这一标记从中心面向外。
[0668] 16以120,000xg，2hr，4℃(内排，33,400rpm)旋转管以沉淀微囊泡。
[0669] 17检查标记仍然从中心指向外。
[0670] 18通过从沉淀标记的相对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针头从沉淀完全除去上清液。
[0671] 19丢弃上清液到适宜的生物有害废物容器中。
[0672] 20添加1ml用1X PBS稀释的3mM MgCl2。
[0673] 21温和涡旋，1600rpm 5sec并在RT下孵育5min。
[0674] 22使用以1X PBS稀释的3mM MgCl2QS到～4.5mL。
[0675] 23固定封盖到OptiSeal钟形顶管上。
[0676] 24将适当的垫片置于各栓塞的管的顶部上。
[0677] 25在管上标记沉淀区域，确保这一标记从中心面向外。
[0678] 26以120,000xg，70min，4℃(内排，33,400rpm)旋转管以沉淀微囊泡。
[0679] 27检查标记仍然从中心指向外。
[0680] 28通过从沉淀标记的相对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针头从沉淀完全除去上清液。
[0681] 29丢弃上清液到适宜的生物有害废物容器中。
[0682] 30添加1ml用1X PBS稀释的3mM MgCl2。
[0683] 31温和涡旋，1600rpm 5 sec并在RT下孵育5min。
[0684] 32用1X PBS稀释的3mM MgCl2QS到～4.5mL。
[0685] 33固定封盖到OptiSeal钟形顶管上。
[0686] 34将适当的垫片置于各栓塞的管的顶部上。
[0687] 35在管上标记沉淀区域，确保这一标记从中心面向外。
[0688] 36以120,000xg，70min，4℃(内排，33,400rpm)旋转管以沉淀微囊泡
[0689] 37检查标记仍然从中心指向外。
[0690] 38保存等分的上清液(100ul到1.5ml管中)。
[0691] 39通过从沉淀标记的相对侧收集液体并使用10ml注射器筒和21G2针头从沉淀完全除去上清液。
[0692] 40添加50ul的无RNA酶水到沉淀的该侧。
[0693] 41在台子上保持15min孵育。
[0694] 42使用清洁剪刀切除管顶部。
[0695] 43重悬沉淀，在沉淀侧上下吸打。
[0696] 44测量体积，对体积进行标记以将所有样品标准化。
[0697] 45将测量的重悬洗脱微囊泡与结合的寡核苷酸转移到无RNA酶的1.5ml Eppendorf管。
[0698] 46将所有样品标准化到100ul以在所有样品上和实验之间将其保持均匀。
[0699] 下一代测序样品制备：
[0700] I)使用来自以上的50ul样品，重悬在100ul且包含微囊泡/寡聚物复合物的H2O中作为在Transposon PCR中的模板，14个循环。
[0701] II)AMPure transposon PCR产物，使用索引PCR的全部回收，10个循环。
[0702] III)在凝胶上检查索引PCR产物，如果条带可见则继续AMPure。如果条带不可见则增加3个循环，在凝胶上检查。在纯化后，用QuBit量化产物并继续变性和脱盐(dilting)用
于加载在HiSeq流动池(Illumina Inc.，San Diego，CA)上。
于加载在HiSeq流动池(Illumina Inc.，San Diego，CA)上。
[0703] IV)每一个流动池将5个样品多路复用。每HiSeq 10个样品。
[0704] 实施例7：寡核苷酸探针文库
[0705] 这一实施例呈现寡核苷酸探针文库的开发以检测生物实体。在这一实施例中，采取步骤以在探测患者样品时减少可疑的双链寡核苷酸(dsDNA)的存在。也产生了比较用于
沉淀来自患者样品的微囊泡(和潜在地其它生物实体)的8％和6％PEG的效应的数据。
沉淀来自患者样品的微囊泡(和潜在地其它生物实体)的8％和6％PEG的效应的数据。
[0706] 实验方案：
[0707] 1)在4℃下预冷台式离心机。
[0708] 2)蛋白酶抑制：溶解2片“cOmplete ULTRA MINI EDTA-free EASYpack”蛋白酶抑制剂在1100ul的H2O中(蛋白酶抑制剂的20x原液)。
[0709] 3)添加50ul的蛋白酶抑制剂到样品(在冷冻血浆的顶部上)并开始解冻：1ml总ea。
[0710] 4)为除去细胞/碎片，以10,000xg，20min，4℃旋转样品。收集1ml上清液(SN)。
[0711] 5)混合来自步骤4的1ml上清液与1ml的2x PBS 6mM MgCl3，收集400ul到3个管中(重复A，B，C)并在步骤6中使用。
[0712] 6)按照表5添加竞争剂：在1x PBS，3mM MgCl2中进行稀释，充分混合，倒入水槽中。使用多通道吸液。
[0713] 表5：竞争剂
[0714]
[0715]
[0716] 7)孵育10min，RT，端对端旋转。
[0717] 准备6-3S和8-3S寡核苷酸探测文库的集合备用：2.76ng/ul(～185ng)。保存汇合原液并稀释。新的汇合可以通过混合171.2ul(500ng)的文库6-3S(2.92ng/ul)与190.8ul
(500ng)的文库8-3S(2.62ng/ul)制备。等分汇合的文库成30ul并在-80C下储存。
(500ng)的文库8-3S(2.62ng/ul)制备。等分汇合的文库成30ul并在-80C下储存。
[0718] 添加ssDNA寡核苷酸探测文库到终浓度2.5pg/ul用于结合。在1x PBS，3mM MgCl2中进行稀释。
[0719] 表6：探针文库计算
[0720]
[0721] 8)结合：在RT下伴随旋转孵育1h。
[0722] 9)制备聚合物溶液：1x PBS 3mM MgCl2中的20％PEG8000(用具有6mM MgCl2的2xPBS稀释40％PEG8000)。添加20％PEG8000到样品达到终浓度6％。倒转几次以混合，在4C
下孵育15min。
下孵育15min。
[0723] 表7：PEG计算
[0724]
[0725]
[0726] 10)以10,000xg旋转5min，RT。
[0727] 11)除去SN，添加1ml 1xPBS，3mM MgCl2并通过温和反转用1ml适体缓冲液洗涤沉淀。
[0728] 12)除去缓冲液，重悬沉淀在100ul H2O中：在混匀仪900rpm上RT下孵育10min以重悬。
[0729] 13)确保各样品在步骤13后通过吸液重悬。对难以重悬的样品进行备注。
[0730] 14)50ul的重悬样品到索引PCR-＞下一代测序(NGS)。
[0731] 15)保持残余物在4C下。
[0732] 技术验证：
[0733] 当前实验方案相对于使用8％PEG8000沉淀微囊泡的实验方案进行测试。当前实验方案还包括消减寡核苷酸探测文库中的dsDNA的步骤。
[0734] 图5A显示结合重复之间的样品内变异(黑色)和样品间变异(灰色)。黑色是在灰色的顶部上，因此任何可观察的灰色寡聚体提供了关于两个患者样品的生物学中的差异的信
息。变异来源的这种评估显示技术变异显著小于生物学变异。
息。变异来源的这种评估显示技术变异显著小于生物学变异。
[0735] 图5B显示使用较高比例的单链DNA和PEG 6％分离(白色条)与在存在较高量的双链DNA和8％PEG时(灰色)相比的影响。这一数据表明这一实施例中的实验方案改善患者之
间的生物学分离。
间的生物学分离。
[0736] 图5C中的曲线图显示较早实验方案(具有增加的dsDNA的PEG8％)和该实施例的改良的实验方案(PEG 6％，无dsDNA)之间的差异。黑色是重复(独立结合事件)之间的散点而
灰色是患者之间的差异。这一数据显示使用较新的实验方案，信噪比显著提高。
灰色是患者之间的差异。这一数据显示使用较新的实验方案，信噪比显著提高。
[0737] 患者测试：
[0738] 以上实验方案用于测试具有以下特征的患者样品：
[0739] 表8：患者特征
[0740]
[0741]
[0742] 微囊泡(及潜在地其它生物实体)使用如上所示具有PEG的聚合物沉淀在来自以上患者的血液(血浆)样品中沉淀。实验方案用于使用寡核苷酸探针文库探测样品。结合PEG沉
淀的样品的序列使用下一代测序(NGS)鉴定。
淀的样品的序列使用下一代测序(NGS)鉴定。
[0743] 图5D显示来自测试40名之前列出的患者的结果的选择的散点图。数据的扩散表明检测到在样品之间不同的大量寡聚体。发现的重大寡聚体的数目远大于如表9中显示的随
机预期的。表格显示通过检测的拷贝数和p-值分选的寡核苷酸的数目。d-#表示对于行中的
数据观察到的序列的拷贝数。
机预期的。表格显示通过检测的拷贝数和p-值分选的寡核苷酸的数目。d-#表示对于行中的
数据观察到的序列的拷贝数。
[0744] 表9：预期的vs观察的序列
[0745] 总数 P-0.1 P-0.05 P-0.01 P-0.005
d-50 83,632 47,020 30,843 5,934 2,471
d-100 52,647 29,106 19,446 3,893 1,615
d-200 28,753 14,681 9,880 2,189 914
d-500 10,155 4,342 2,927 725 315
d-50 83,632 47,020 30,843 5,934 2,471
d-100 52,647 29,106 19,446 3,893 1,615
d-200 28,753 14,681 9,880 2,189 914
d-500 10,155 4,342 2,927 725 315
[0746]
[0747]
[0748] 作为对照，癌症和非癌症样品随机分成两组。样品的这种随机化显著减少所发现的区分样品组的寡聚体的数目。事实上，存在着癌症/非癌症分组相对随机分组之间的信息
性寡聚体的50-倍增加。图5E显示如表9中的数据且指示在所示的样品组之间观察到的信息
性寡聚体的数目。
性寡聚体的50-倍增加。图5E显示如表9中的数据且指示在所示的样品组之间观察到的信息
性寡聚体的数目。
[0749] 图5F显示区分癌症和非癌症样品的不同寡聚体组。该图显示用选择的寡聚体(其具有超过500个拷贝和低于0.005的p-值)测试的40个样品的热图。在顶部具有出现不同非
癌症群组的明显亚群体。非癌症样品在左轴上具有围绕其的框。图5G是相似的且显示具有
另外20个癌症和20个非癌症样品的结果。如显示的，具有80个样品的分析提供更不同的和
更大群集的出现。
癌症群组的明显亚群体。非癌症样品在左轴上具有围绕其的框。图5G是相似的且显示具有
另外20个癌症和20个非癌症样品的结果。如显示的，具有80个样品的分析提供更不同的和
更大群集的出现。
[0750] 另外80个样品的数据也用于在不同筛选实验中比较鉴定的信息性寡聚体的一致性。在使用40名患者的第一集合鉴定的315个信息性寡聚体中，其86％在40名患者的独立集
合上测试时以一致的方式显示倍数变化。
合上测试时以一致的方式显示倍数变化。
[0751] 实施例8：使用平衡文库设计的寡核苷酸探针的富集
[0752] 在这一实施例中，筛选原始ADAPT寡核苷酸文库以富集鉴定在乳腺癌患者的血液中循环的微囊泡和在健康的对照个体(即，没有乳腺癌)的血液中循环的微囊泡的寡核苷
酸。输入文库是原始F-TRin-35n-B 8-3s文库，其包含5’区(5′CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))，接着35个核苷酸的随机原始适体序列和3’区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCT
GCCGACGA(SEQ ID NO.5))。“平衡的”设计描述于国际专利公开WO/2015/031694(2014年8月
28日提交的申请No.PCT/US2014/053306)的实施例23中，其通过引用全文并入本文中。工作
13
文库包含大约2 x 10 个合成寡核苷酸序列。原始文库在本文中可以称为“L0文库”。
酸。输入文库是原始F-TRin-35n-B 8-3s文库，其包含5’区(5′CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))，接着35个核苷酸的随机原始适体序列和3’区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCT
GCCGACGA(SEQ ID NO.5))。“平衡的”设计描述于国际专利公开WO/2015/031694(2014年8月
28日提交的申请No.PCT/US2014/053306)的实施例23中，其通过引用全文并入本文中。工作
13
文库包含大约2 x 10 个合成寡核苷酸序列。原始文库在本文中可以称为“L0文库”。
[0753] L0文库使用图12A中显示的实验方案针对来自乳腺癌患者和来自健康(非乳腺癌)对照的分级分离的血浆样品进行富集。在步骤1中，PCR-扩增的L0的等份的大约1011个序列
与来自59名具有阳性活检的乳腺癌患者的汇合血液-血浆(图12A中通过“源A”代表)一起孵
育。平行地，另一等份的1011个序列与来自30名具有疑似乳腺癌的患者(其活检证明阴性)和
30名自己声称健康的女性的汇合血液-血浆(图12A中通过“源B”代表)一起孵育。在步骤2
中，微囊泡(细胞外囊泡，“EV”)使用超离心(UC)从两种L0-样品沉淀。EV-相关寡脱氧核苷酸(ODNs)从相应的沉淀回收。在步骤3中，反选择步骤(步骤3)通过各富集文库与来自不同群
组的血浆的孵育进行以驱动选择压力朝向与各样品群组特异性相关的ODNs的富集。在这一
步骤中，EV沉淀中包含的序列被丢弃。在步骤4中，进行第二正向选择。在这一步骤中，来自步骤3的相应上清液(sn)中包含的序列与来自另一等份的各阳性对照样品-群体的血浆混
合，且EVs再次分离。回收EV-相关ODNs，代表两个单轮文库，其对于癌症(阳性活检)患者的
阳性富集称为文库L1和对于针对对照患者的阳性富集称为文库L2。在最终步骤中，L1和L2
通过PCR扩增，回复为单链DNA(ssDNA)和混合以产生文库L3。
与来自59名具有阳性活检的乳腺癌患者的汇合血液-血浆(图12A中通过“源A”代表)一起孵
育。平行地，另一等份的1011个序列与来自30名具有疑似乳腺癌的患者(其活检证明阴性)和
30名自己声称健康的女性的汇合血液-血浆(图12A中通过“源B”代表)一起孵育。在步骤2
中，微囊泡(细胞外囊泡，“EV”)使用超离心(UC)从两种L0-样品沉淀。EV-相关寡脱氧核苷酸(ODNs)从相应的沉淀回收。在步骤3中，反选择步骤(步骤3)通过各富集文库与来自不同群
组的血浆的孵育进行以驱动选择压力朝向与各样品群组特异性相关的ODNs的富集。在这一
步骤中，EV沉淀中包含的序列被丢弃。在步骤4中，进行第二正向选择。在这一步骤中，来自步骤3的相应上清液(sn)中包含的序列与来自另一等份的各阳性对照样品-群体的血浆混
合，且EVs再次分离。回收EV-相关ODNs，代表两个单轮文库，其对于癌症(阳性活检)患者的
阳性富集称为文库L1和对于针对对照患者的阳性富集称为文库L2。在最终步骤中，L1和L2
通过PCR扩增，回复为单链DNA(ssDNA)和混合以产生文库L3。
[0754] 这一富集方案使用L3作为输入再重复两次以进一步降低谱分析文库的复杂性到大约106个不同序列。在步骤2中，UC用于微囊泡的分配，其可以提高对于EV部分的特异性。
在步骤3和4中，分配使用PEG-沉淀进行。这一过程富集对于各生物来源特异性的ODNs。文库
L3包含与对于来自两个来源的EV-群体特征性的靶标相关的那些ODNs，即作为结合在各来
源中优先表达的分子的适体发挥作用的ODNs。活检阳性(n＝59)、活检阴性(n＝30)和自己
声称正常(n＝30)全部用于第一轮的L3富集，而仅癌症和非癌症样品用于后续轮。
在步骤3和4中，分配使用PEG-沉淀进行。这一过程富集对于各生物来源特异性的ODNs。文库
L3包含与对于来自两个来源的EV-群体特征性的靶标相关的那些ODNs，即作为结合在各来
源中优先表达的分子的适体发挥作用的ODNs。活检阳性(n＝59)、活检阴性(n＝30)和自己
声称正常(n＝30)全部用于第一轮的L3富集，而仅癌症和非癌症样品用于后续轮。
[0755] 富集的文库使用下一代测序(NGS)表征以测量各谱分析文库中包含的序列的拷贝数。L0的NGS显示绝大多数的序列以低拷贝数存在，而文库L1和L2显示显著更高的每序列平
均计数(图12B)和降低量的不同序列，及未改变的总有效读数(图12C)，与富集过程一致。
均计数(图12B)和降低量的不同序列，及未改变的总有效读数(图12C)，与富集过程一致。
[0756] 实施例9：ADAPT-鉴定的生物标志物的分析
[0757] 如本文所述的，例如，在名为“适体靶标鉴定”的章节中，可以鉴定被适体识别的未知靶标。在这一实施例中，寡核苷酸探针文库(也称为Adaptive Dynamic Artificial Poly-ligand Targeting(ADAPT)文库或Topographical寡核苷酸探针“TOP”文库)如此处所
述开发并确定所筛选的寡核苷酸的靶标。这一实施例使用通过富集从乳腺癌患者和正常对
照(即，非癌症个体)的血液收集的微囊泡产生的ADAPT文库。富集实验方案在本文中描述于
实施例8中。
述开发并确定所筛选的寡核苷酸的靶标。这一实施例使用通过富集从乳腺癌患者和正常对
照(即，非癌症个体)的血液收集的微囊泡产生的ADAPT文库。富集实验方案在本文中描述于
实施例8中。
[0758] 材料&方法
[0759] SBED文库偶联
[0760] 原始F-TRin-35n-B 8-3s文库针对来自正常女性血浆的微囊泡富集。原始的未富集文库包含5’区(5′CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))，接着35个核苷酸的随机原始
适体序列和3’区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5))。原始文库在本
文中可以称为“L0文库”且富集的文库称为“L2文库”。参见实施例8。筛选的文库用C6-胺有义引物(C6胺-5′CTAGCATGACTGCAGTACGT 3′(SEQ ID NO.4))和5’磷酸化反义引物(5′Phos TCGTCGGCAGCGTCA(SEQ ID NO.6))PCR扩增，纯化的产物被链分离并按照Vinkenborg等
(Angew Chem Int Ed Engl.2012，51：9176-80)与sulfo-SBED(Thermo Scientific)偶联，
具有以下改进：反应缩小到在25mM HEPES-KOH，0.1M NaCl，pH 8.3中的5μg C6-胺DNA文库
(8.6μM)并在室温下黑暗中与21μL体积中的100-倍摩尔过量的sulfo-SBED或DMSO孵育
30min。SBED-偶联的文库通过注射到Waters X-BridgeTM OST C-18柱(4.6mm x 50mm)上并
通过HPLC(Agilent 1260 Infinity)在65℃下以0.2ml/min用线性梯度缓冲液A：100mM
TEAA，pH 7.0，0％ACN至100mM TEAA，pH 7.0，25％ACN分级分离而立即与未偶联的文库和游离sulfo-SBED分离。这些SBED-偶联的级分用Glen Gel-PakTM Cartridges脱盐到水中并通
过真空离心机(speed-vac)浓缩。SBED偶联通过LC-MS和/或具有链霉亲和素-HRP检测的斑
点印迹确认。
适体序列和3’区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5))。原始文库在本
文中可以称为“L0文库”且富集的文库称为“L2文库”。参见实施例8。筛选的文库用C6-胺有义引物(C6胺-5′CTAGCATGACTGCAGTACGT 3′(SEQ ID NO.4))和5’磷酸化反义引物(5′Phos TCGTCGGCAGCGTCA(SEQ ID NO.6))PCR扩增，纯化的产物被链分离并按照Vinkenborg等
(Angew Chem Int Ed Engl.2012，51：9176-80)与sulfo-SBED(Thermo Scientific)偶联，
具有以下改进：反应缩小到在25mM HEPES-KOH，0.1M NaCl，pH 8.3中的5μg C6-胺DNA文库
(8.6μM)并在室温下黑暗中与21μL体积中的100-倍摩尔过量的sulfo-SBED或DMSO孵育
30min。SBED-偶联的文库通过注射到Waters X-BridgeTM OST C-18柱(4.6mm x 50mm)上并
通过HPLC(Agilent 1260 Infinity)在65℃下以0.2ml/min用线性梯度缓冲液A：100mM
TEAA，pH 7.0，0％ACN至100mM TEAA，pH 7.0，25％ACN分级分离而立即与未偶联的文库和游离sulfo-SBED分离。这些SBED-偶联的级分用Glen Gel-PakTM Cartridges脱盐到水中并通
过真空离心机(speed-vac)浓缩。SBED偶联通过LC-MS和/或具有链霉亲和素-HRP检测的斑
点印迹确认。
[0761] 结合反应和交联
[0762] SBED文库功能化通过用SBED vs DMSO模拟偶联对照C6-胺文库进行ADAPT分析来测试，并在HiSeq 2500TM(Illumina Corp.)上测序。适体沉淀用在室温下伴随端对端旋转
孵育1hr的四十八个ADAPT反应进行，具有等同于～240ng文库和9.6ml血浆的1X PBS，3mM
MgCl2，0.01mM硫酸葡聚糖，40ng/μl鲑精DNA和40ng/μl酵母转移RNA及cOmplete ULTRA
Mini EDTA-free TM蛋白酶抑制剂(Roche)中的每200μL血浆(在4℃下以10,000xg预旋转
20min以除去细胞碎片)的5ng SBED偶联文库的输入。48个反应的重复集用DMSO对照C6-胺
文库制备。适体文库-蛋白质复合物用4℃下6％PEG8000中孵育15min沉淀，然后以10,000xg
离心5min。沉淀通过温和反转用1ml 1x PBS，3mM MgCl2洗涤以除去未结合的适体。洗涤的
沉淀重悬在100μL水中并在冰上在365nm下用手持3UV(254NM/302NM/365NM)灯，115伏
(Thermo Scientific)进行光交联10min，96-孔板和灯之间1-2cm。
孵育1hr的四十八个ADAPT反应进行，具有等同于～240ng文库和9.6ml血浆的1X PBS，3mM
MgCl2，0.01mM硫酸葡聚糖，40ng/μl鲑精DNA和40ng/μl酵母转移RNA及cOmplete ULTRA
Mini EDTA-free TM蛋白酶抑制剂(Roche)中的每200μL血浆(在4℃下以10,000xg预旋转
20min以除去细胞碎片)的5ng SBED偶联文库的输入。48个反应的重复集用DMSO对照C6-胺
文库制备。适体文库-蛋白质复合物用4℃下6％PEG8000中孵育15min沉淀，然后以10,000xg
离心5min。沉淀通过温和反转用1ml 1x PBS，3mM MgCl2洗涤以除去未结合的适体。洗涤的
沉淀重悬在100μL水中并在冰上在365nm下用手持3UV(254NM/302NM/365NM)灯，115伏
(Thermo Scientific)进行光交联10min，96-孔板和灯之间1-2cm。
[0763] 寡核苷酸沉淀
[0764] 交联的反应随后按照文库(～4.8ml)或4.8ml的1X PBS(仅AP珠对照)汇合并与在室温下振摇1hr的10μL的Prepared MyOneTM链霉亲和素C1(10mg/ml)(Life
Technologies)(用1X PBS，0.01％ Triton X-100预洗涤)孵育。珠转移到eppendorf管并用
裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，200mM NaCl，0.5％Triton X-100，5％甘油，pH
7.5)在冰上裂解20min，用洗涤缓冲液1(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，1％Triton X-
100)洗涤3次，接着用洗涤缓冲液2(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，0.01％ Triton X-
100)洗涤2次，如Vinkenborg等(Angew Chem Int Ed Engl.2012，51：9176-80)所述。交联的蛋白质通过在添加还原剂的1X LDS样品缓冲液(Life Technologies)中煮沸15min洗脱，并
加载到4-12％SDS-PAGE梯度凝胶(Life Technology)上。蛋白质和DNA采用按照制造商的说
明书使用的Imperial Blue Protein Stain(Thermo Scientific)接着Prot-SIL2 TM银染
试剂盒(Sigma)的双重染色来检测，以增强灵敏度和降低背景。
Technologies)(用1X PBS，0.01％ Triton X-100预洗涤)孵育。珠转移到eppendorf管并用
裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，200mM NaCl，0.5％Triton X-100，5％甘油，pH
7.5)在冰上裂解20min，用洗涤缓冲液1(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，1％Triton X-
100)洗涤3次，接着用洗涤缓冲液2(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，0.01％ Triton X-
100)洗涤2次，如Vinkenborg等(Angew Chem Int Ed Engl.2012，51：9176-80)所述。交联的蛋白质通过在添加还原剂的1X LDS样品缓冲液(Life Technologies)中煮沸15min洗脱，并
加载到4-12％SDS-PAGE梯度凝胶(Life Technology)上。蛋白质和DNA采用按照制造商的说
明书使用的Imperial Blue Protein Stain(Thermo Scientific)接着Prot-SIL2 TM银染
试剂盒(Sigma)的双重染色来检测，以增强灵敏度和降低背景。
[0765] 蛋白质鉴定
[0766] 表现为在癌症和正常之间不同的蛋白质条带从梯度凝胶切除并进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。
[0767] 结果
[0768] ADAPT蛋白质靶标由从银染SDS-PAGE凝胶切除的条带鉴定(图6)。适体-SBED蛋白质复合物(泳道3)或适体-DMSO蛋白质复合物(对照-泳道4)用6％PEG8000沉淀，进行UV光交
联，并使用链霉亲和素包被的珠拉下。洗脱物在还原条件下通过SDS-PAGE和银染分析。单独
的适体文库(5ng)(泳道1)作为用于文库迁移(第二至底部箭头)的对照加载且来自仅珠样
品(泳道4)的等体积的洗脱物作为用于链霉亲和素对照加载以在严苛洗脱条件下控制链霉
亲和素单体(底部箭头)的潜在浸出。上部箭头(“靶标”)指示用SBED-偶联的文库vs.模拟
DMSO处理对照C6-胺文库鉴定的特异性或更主要的条带。指示的靶标蛋白质条带被切除并
发送用于LC-MS/MS蛋白质鉴定或者指示的DNA文库条带被洗脱，再扩增和测序。鉴定的蛋白
质是表现为在正常样品中上调的那些。
联，并使用链霉亲和素包被的珠拉下。洗脱物在还原条件下通过SDS-PAGE和银染分析。单独
的适体文库(5ng)(泳道1)作为用于文库迁移(第二至底部箭头)的对照加载且来自仅珠样
品(泳道4)的等体积的洗脱物作为用于链霉亲和素对照加载以在严苛洗脱条件下控制链霉
亲和素单体(底部箭头)的潜在浸出。上部箭头(“靶标”)指示用SBED-偶联的文库vs.模拟
DMSO处理对照C6-胺文库鉴定的特异性或更主要的条带。指示的靶标蛋白质条带被切除并
发送用于LC-MS/MS蛋白质鉴定或者指示的DNA文库条带被洗脱，再扩增和测序。鉴定的蛋白
质是表现为在正常样品中上调的那些。
[0769] 表10-17列出了在从银染凝胶切除的8个条带中鉴定的人蛋白质。在所有表格中，蛋白质是在寡聚-SBED蛋白质复合物中鉴定的那些而除去在相应的对照泳道中鉴定的蛋白
质。表格中的条带号指示从凝胶切割的不同条带(图6)。表格中的登录号来自UniProt数据
库(www.uniprot.org)。“GN＝”之后是基因名称。在表10-17中显示的各种蛋白质分类包括
核酸结合蛋白质(NAB)、肿瘤抑制剂(TS)、细胞粘附/细胞骨架(CA/CK)和丰富血浆蛋白
(ABP)。
质。表格中的条带号指示从凝胶切割的不同条带(图6)。表格中的登录号来自UniProt数据
库(www.uniprot.org)。“GN＝”之后是基因名称。在表10-17中显示的各种蛋白质分类包括
核酸结合蛋白质(NAB)、肿瘤抑制剂(TS)、细胞粘附/细胞骨架(CA/CK)和丰富血浆蛋白
(ABP)。
[0770] 表10：条带3
[0771]
[0772]
[0773]
[0774] 表11：条带9
[0775]登录号 类别 蛋白质名称
P61626 溶菌酶C GN＝LYZ
Q9HCK1 NAB DBF4-型含锌指蛋白2GN＝ZDBF2
P61626 溶菌酶C GN＝LYZ
Q9HCK1 NAB DBF4-型含锌指蛋白2GN＝ZDBF2
[0776] 表12：条带1
[0777]登录号 类别 蛋白质名称
P01834 ABP Igκ链C区GN＝IGKC
P01765 ABP Ig重链V-III区TIL
P04003 NAB C4b-结合蛋白α链GN＝C4BPA
P60709 CA/CK 肌动蛋白，胞质1GN＝ACTB
Q5T751 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白1C GN＝LCE1C
P01834 ABP Igκ链C区GN＝IGKC
P01765 ABP Ig重链V-III区TIL
P04003 NAB C4b-结合蛋白α链GN＝C4BPA
P60709 CA/CK 肌动蛋白，胞质1GN＝ACTB
Q5T751 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白1C GN＝LCE1C
[0778] 表13：条带5
[0779]登录号 类别 蛋白质名称
P01860 ABP Igγ-3链C区GN＝IGHG3
O60902 NAB 矮小同源盒蛋白2 GN＝SHOX2
P01860 ABP Igγ-3链C区GN＝IGHG3
O60902 NAB 矮小同源盒蛋白2 GN＝SHOX2
[0780] 表14：条带7
[0781]
[0782]
[0783] 表15：条带15
[0784]登录号 类别 蛋白质名称
P08238 热休克蛋白HSP 90-β GN＝HSP90AB1
P68104 NAB 延伸因子1-α1 GN＝EEF1A1
P02675 ABP 纤维蛋白原β链GN＝FGB
Q8TF72 蛋白Shroom3 GN＝SHROOM3
P0CG05 ABP Igλ-2链C区GN＝IGLC2
P78386 CA/CK 角蛋白，II型表皮的Hb5 GN＝KRT85
Q7Z5Y6 骨形态发生蛋白8A GN＝BMP8A
O14633 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白2B GN＝LCE2B
P08238 热休克蛋白HSP 90-β GN＝HSP90AB1
P68104 NAB 延伸因子1-α1 GN＝EEF1A1
P02675 ABP 纤维蛋白原β链GN＝FGB
Q8TF72 蛋白Shroom3 GN＝SHROOM3
P0CG05 ABP Igλ-2链C区GN＝IGLC2
P78386 CA/CK 角蛋白，II型表皮的Hb5 GN＝KRT85
Q7Z5Y6 骨形态发生蛋白8A GN＝BMP8A
O14633 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白2B GN＝LCE2B
[0785] 表16：条带17
[0786]登录号 类别 蛋白质名称
P02538 CA/CK 角蛋白，II型细胞骨架6A GN＝KRT6A
P01834 ABP Igκ链C区GN＝IGKC
P06702 蛋白S100-A9 GN＝S100A9
P68104 NAB 延伸因子1-α1 GN＝EEF1A1
P01024 补体C3 GN＝C3
P81605 皮离蛋白GN＝DCD
P05109 蛋白S100-A8 GN＝S100A8
Q5T751 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白1C GN＝LCE1C
P02538 CA/CK 角蛋白，II型细胞骨架6A GN＝KRT6A
P01834 ABP Igκ链C区GN＝IGKC
P06702 蛋白S100-A9 GN＝S100A9
P68104 NAB 延伸因子1-α1 GN＝EEF1A1
P01024 补体C3 GN＝C3
P81605 皮离蛋白GN＝DCD
P05109 蛋白S100-A8 GN＝S100A8
Q5T751 CA/CK 晚期角质化包膜蛋白1C GN＝LCE1C
[0787] 表17：条带19
[0788]
[0789]
[0790] 某些蛋白质在多个条带中鉴定。例如，IGLC2在条带3、15和19中鉴定且SHROOM3在条带7、15、19中鉴定。这可能是由于降解产物、异形体等。这些实验鉴定了108个蛋白质(加2个溶菌酶对照)，尤其包含34个核酸结合蛋白(NAB)，其中34个蛋白质中的7个是推定的肿瘤
抑制剂/阻遏剂；37个细胞粘附/细胞骨架(CA/CK)；和14个丰富血浆蛋白(ABP)。所有肿瘤抑
制剂/阻遏剂是DNA/RNA结合蛋白。其它蛋白质包含伴侣蛋白、信号传导分子等。
抑制剂/阻遏剂；37个细胞粘附/细胞骨架(CA/CK)；和14个丰富血浆蛋白(ABP)。所有肿瘤抑
制剂/阻遏剂是DNA/RNA结合蛋白。其它蛋白质包含伴侣蛋白、信号传导分子等。
[0791] 这一实施例中的生物标志物可用于检测指示癌症或非癌症样品的微囊泡。
[0792] 实施例10：通过使用富集寡核苷酸文库的亲和富集和质谱鉴定生物标志物
[0793] 这一实施例在以上实施例基础上继续。蛋白质-蛋白质和核酸-蛋白质复合物通过亲和纯化质谱(AP-MS)的鉴定可能在包含生物组分的复杂混合物的样品(例如，体液，包括
但不限于血液及其衍生物)中受到阻碍。例如，可能希望的是在包含各种可能与特定结合位
点混杂地相互作用的组分(如非特异性地与亲和树脂相互作用的高丰度蛋白质)的复杂环
境中检测低丰度的蛋白质和核酸-蛋白质复合物。AP-MS之前已被用于使用单个DNA或RNA适
体或者特定核酸结合结构域富集预定的目标靶标。在这一实施例中，富集的寡核苷酸探测
文库用作亲和试剂。这一途径与质谱组合使得能够鉴定来自不同疾病状态或细胞扰动的差
异表达的生物标志物而不依赖于目标靶标的先前知识。这样的生物标志物可以包括蛋白
质、核酸、miRNA、mRNA、碳水化合物、脂质靶标、其组合，或者生物系统中的其它组分。
但不限于血液及其衍生物)中受到阻碍。例如，可能希望的是在包含各种可能与特定结合位
点混杂地相互作用的组分(如非特异性地与亲和树脂相互作用的高丰度蛋白质)的复杂环
境中检测低丰度的蛋白质和核酸-蛋白质复合物。AP-MS之前已被用于使用单个DNA或RNA适
体或者特定核酸结合结构域富集预定的目标靶标。在这一实施例中，富集的寡核苷酸探测
文库用作亲和试剂。这一途径与质谱组合使得能够鉴定来自不同疾病状态或细胞扰动的差
异表达的生物标志物而不依赖于目标靶标的先前知识。这样的生物标志物可以包括蛋白
质、核酸、miRNA、mRNA、碳水化合物、脂质靶标、其组合，或者生物系统中的其它组分。
[0794] 该方法包括根据本发明的方法鉴定富集的寡核苷酸探针文库，接着是使用结合的探测文库的亲和纯化和质谱。富集的寡核苷酸探测文库的成员包括亲和标签。生物样品用
寡核苷酸探针文库探测，进行寡核苷酸探针文库通过亲和标签的亲和纯化，其因此将纯化
与探针文库的各种成员复合的生物实体，且用探针文库的成员纯化的靶标的读出使用利用
蛋白质或寡核苷酸靶标(例如，miRNA或mRNA)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)及下一代测
序(NGS)进行。蛋白质靶标的确认使用定量质谱(MS)，例如，使用基于MRM/SRM或SWATH的方
法进行。
寡核苷酸探针文库探测，进行寡核苷酸探针文库通过亲和标签的亲和纯化，其因此将纯化
与探针文库的各种成员复合的生物实体，且用探针文库的成员纯化的靶标的读出使用利用
蛋白质或寡核苷酸靶标(例如，miRNA或mRNA)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)及下一代测
序(NGS)进行。蛋白质靶标的确认使用定量质谱(MS)，例如，使用基于MRM/SRM或SWATH的方
法进行。
[0795] 该实施例的方法适用于各种选项。例如，任何适宜的亲和标签可以用于亲和拉下，包括但不限于反义寡核苷酸、生物素、聚组氨酸、FLAG八肽(即，N-DYKDDDDK-C(SEQ ID
NO.7)，其中N代表氨基末端和C代表羧基末端)、3X FLAG、人流感病毒血球凝集素(HA)-标签
(即，N-YPYDVPDYA-C(SEQ ID NO.8))、myc-标签(N-EQKLISEEDL-C(SEQ ID NO.9))、如本领
域中已知的其它标签及其组合。类似地，除了本文中示例的磁性链霉亲和素珠外，可以使用
任何适宜的富集载体，包括但不限于其它珠系统、琼脂糖珠、平面阵列或柱色谱载体。结论
是各种载体可以与适合于寡核苷酸文库的各种亲和试剂偶联，包括但不限于链霉亲和素、
抗生物素蛋白、抗-His标签抗体、镍等等。不同的亲和标签和载体可以按照需要组合。这一
实施例使用交联，但在某些情况中，这种交联不是必要的且可能甚至是不希望的，例如，对
于鉴定高亲和力亲和复合物的形成。当交联是希望的时，任何适宜的交联可用于进行本发
明，包括BS2G、DSS、甲醛等。其它适宜的交联剂和方法在本文中描述。参见，例如，“适体靶标鉴定”章节。裂解缓冲液和洗涤严格性可以变化，例如，根据复合物是否交联。较低严格的裂解/洗涤条件可以产生更广泛的潜在目标蛋白质复合物，而更严格的裂解/洗涤条件可能有
利于更高亲和力的寡聚体-靶标复合物和/或包含特定蛋白质的靶标(例如，通过与寡聚体
结合的较大复合物的解离)。本领域技术人员进一步理解，定性和/或定量LC-MS/MS可以用
于靶标检测和验证。类似地，代谢标记和无标记的方式可以用于定量MS，包括但不限于光谱
计数、SILAC、二甲基标记、TMT标记、具有SRM/MRM或SWATH的靶向MS等等。
NO.7)，其中N代表氨基末端和C代表羧基末端)、3X FLAG、人流感病毒血球凝集素(HA)-标签
(即，N-YPYDVPDYA-C(SEQ ID NO.8))、myc-标签(N-EQKLISEEDL-C(SEQ ID NO.9))、如本领
域中已知的其它标签及其组合。类似地，除了本文中示例的磁性链霉亲和素珠外，可以使用
任何适宜的富集载体，包括但不限于其它珠系统、琼脂糖珠、平面阵列或柱色谱载体。结论
是各种载体可以与适合于寡核苷酸文库的各种亲和试剂偶联，包括但不限于链霉亲和素、
抗生物素蛋白、抗-His标签抗体、镍等等。不同的亲和标签和载体可以按照需要组合。这一
实施例使用交联，但在某些情况中，这种交联不是必要的且可能甚至是不希望的，例如，对
于鉴定高亲和力亲和复合物的形成。当交联是希望的时，任何适宜的交联可用于进行本发
明，包括BS2G、DSS、甲醛等。其它适宜的交联剂和方法在本文中描述。参见，例如，“适体靶标鉴定”章节。裂解缓冲液和洗涤严格性可以变化，例如，根据复合物是否交联。较低严格的裂解/洗涤条件可以产生更广泛的潜在目标蛋白质复合物，而更严格的裂解/洗涤条件可能有
利于更高亲和力的寡聚体-靶标复合物和/或包含特定蛋白质的靶标(例如，通过与寡聚体
结合的较大复合物的解离)。本领域技术人员进一步理解，定性和/或定量LC-MS/MS可以用
于靶标检测和验证。类似地，代谢标记和无标记的方式可以用于定量MS，包括但不限于光谱
计数、SILAC、二甲基标记、TMT标记、具有SRM/MRM或SWATH的靶向MS等等。
[0796] 参考文献：
[0797] Vickenborg等“Apatmer based affinity labeling of proteins”，Angew Chem Int.51(36)：9176-80(2012).
[0798] Tacheny，M，Arnould，T.，Renard，A“. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids”，Journal of Proteomics 94；89-109(2013).
[0799] Faoro C和Ataide SF.“Ribonomic approaches to study the RNA-binding proteome”，FEBS Lett.588(20)：3649-64(2014).
[0800] Budayeva HG，Cristea，IM，“A mass spectrometry view of stable and transient protein inteeractions.”Adv Exp Med Biol.806：263-82(2014).
[0801] 实施例11：使用寡核苷酸探测文库的亲和捕获的实验方案
[0802] 这一实施例提出了使用以上实施例中给出的寡核苷酸探测文库的亲和捕获方法的详细实验方案。
[0803] 实验方案：
[0804] 寡核苷酸探针文库包括如本文所述的F-TRin-35n-B-8-3s脱硫生物素标记的或者未标记的文库和与正常(即，非癌症)女性血浆结合。寡核苷酸探针文库针对另外描述(例
如，在实施例7中)的血浆样品富集。血浆样品独立地针对脱硫生物素标记的或者未标记的
寡核苷酸文库进行处理。一般参数包括以下：
如，在实施例7中)的血浆样品富集。血浆样品独立地针对脱硫生物素标记的或者未标记的
寡核苷酸文库进行处理。一般参数包括以下：
[0805] 48个正常血浆样品汇合用于各寡核苷酸文库(脱硫生物素标记的或者未标记的)的富集
[0806] 200μl输入血浆/样品
[0807] 超速离心(UC)用于预清洁样品
[0808] 5ng的各适体文库添加到各样品
[0809] 用于所有文库样品的结合竞争剂包括0.01X S1(硫酸葡聚糖)、340ng的tRNA和如本文另外所述的340ng鲑精DNA
[0810] 6％PEG 8000用于样品内微囊泡的沉淀
[0811] 用C1链霉亲和素珠(MyOne Strptavidin Beads C1-65001，2ml批(10mg/ml))进行亲和纯化
[0812] 缓冲液：
[0813] 血浆稀释：2X PBS中6mM MgCl2
[0814] 沉淀洗涤缓冲液：1X PBS，3mM MgCl2
[0815] PEG Ppt缓冲液：1X PBS，3mM MgCl2中的20％Peg8000
[0816] 珠制备缓冲液：包含0.01％Triton X-100的1X PBS
[0817] 裂解缓冲液：制备2X原液，其由100mM Tris-HCl，20mM MgCl2，400mM NaCl，1％Triton X-100，10％甘油，pH 7.5组成。在使用前用水1∶1稀释到1X。
[0818] AP洗涤缓冲液1：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，1％Triton X-100，pH 7.5
[0819] AP洗涤缓冲液2：10mM Tris-HCL，1mM EDTA，2M NaCl，0.01％Triton X-100，pH 7.5
[0820] 生物素洗脱缓冲液1：5mM生物素，20mM Tris，50mM NaCl，pH 7.5
[0821] 1X LDS，1X还原缓冲液2
[0822] 试剂/仪器准备：
[0823] 预冷超速离心机至4℃。
[0824] 蛋白酶抑制：溶解2片“cOmplete ULTRA MINI EDTA-free EASYpack”蛋白酶抑制剂在1100μl的H2O中(20x蛋白酶抑制剂原液)。
[0825] 血浆制备(对于各脱硫生物素标记的或者未标记的寡核苷酸文库)：
[0826] 1.在室温(RT)水浴中添加50μl的蛋白酶抑制剂到各样品(在冷冻血浆的顶部上)。使用20ml的汇合血浆，因此1100μl的抑制剂。
[0827] 2.为除去细胞碎片，在超速离心机中4℃下以7500xg旋转样品20min。
[0828] 3.收集上清液，汇合并测量体积和记录。
[0829] 4.添加等体积的2X PBS，6mM MgCl2到血浆。
[0830] 5.标记低保留eppendorf管1-96。
[0831] 6.基于适当的管图谱转移400μl的各样品到eppendorf管。
[0832] 7.使用电子P200，添加竞争剂：8.6μl的40ng/μl鲑精DNA；8.6μl的40ng/μl tRNA；8.6μl的0.5X S1。
[0833] 8.在RT下伴随端对端旋转孵育10min。
[0834] 9.添加10μL的适宜寡聚体文库，充分混合。保存任何残余的稀释文库用于凝胶对照(参见以下)。
[0835] 10.在RT下伴随端对端旋转孵育1hr。
[0836] 11.使用电子重复P100，添加187μl的20％PEG 8000到样品以对于435.5μl的样品/寡聚体文库获得6％的终浓度。反转几次以混合并在4℃下孵育15min。
[0837] 12.在台式离心机中以10,000xg旋转各样品5min。
[0838] 13.移除上清液并丢弃，添加1ml 1x PBS，3mM MgCl2到沉淀。
[0839] 14.通过温和反转洗涤沉淀。
[0840] 15.移除缓冲液，沉淀重悬在100μl 1X PBS，3mM MgCl2中：在混匀仪上以900rpm在RT下孵育10min以重悬。确保各样品通过吸移充分重悬。
[0841] 16.汇合所有脱硫生物素文库样品到一个50ml falcon离心管中，且未标记的文库到另一falcon离心管中，各自的总体积应当是4800μl。
[0842] 17.取10μL等分用于凝胶的AP样品(添加10μL的2x LDS缓冲液及2X还原剂)中的输入。
[0843] 亲和纯化：
[0844] 18.制备每种条件10μL的MyOne Strep-包被的磁珠到1.5ml eppendorf管中并置于磁珠架上。也具有仅珠的对照(n＝3)。
[0845] 19.移除上清液并用珠缓冲液洗涤1X 500μl。
[0846] 20.丢弃上清液。
[0847] 21.重悬珠在等体积的1X PBS，3mM MgCl2中(与原始取出的等体积＝10μl)。
[0848] 22.直接添加10μl的珠到来自步骤19的4780μL。向仅珠对照添加PBS。
[0849] 23.样品在板振荡仪(压胶的)上与链霉亲和素在RT下孵育1hr。
[0850] 24.置于大的磁性台架上1min并移除上清液。
[0851] 25.添加1.5mL的1X裂解缓冲液到样品(对于每一个进行50mL falcon管的3X 500μl良好冲洗以收集所有珠)并转移到新的eppendorf管组。
[0852] 26.在冰上孵育20min。
[0853] 27.将管置于磁珠架中，使其平衡1min并移除上清液。
[0854] 28.通过涡旋用洗涤缓冲液#1洗涤珠。充分重悬。
[0855] 29.将管置于磁珠架上，使其平衡1min并移除上清液。
[0856] 30.如步骤27-29的洗涤缓冲液#1再洗涤2次(用洗涤缓冲液#1总共3次洗涤)。
[0857] 31.用洗涤缓冲液#2重复步骤27-29再(2)次。
[0858] 32.在最后洗涤期间将珠转移到新的eppendorf管(以降低非特异性结合)。
[0859] 33.进行一次干式旋转以确保所有残留的洗涤缓冲液被除去。
[0860] 34.添加10μl的生物素洗脱缓冲液1到珠。
[0861] 35.在37℃下孵育15分钟。
[0862] 36.置于磁性台架上1min，收集上清液并转移到新的管，添加10μL的2X LDS，2X还原剂到洗脱的样品，保存为洗脱物#1。
[0863] 37.添加10μl的1X LDS样品缓冲液，1X还原缓冲液到磁珠。
[0864] 38.在90℃下煮沸样品15min。沸腾时间是15分钟以保证珠上的链霉亲和素展开并释放生物素化的适体-蛋白质复合物。
[0865] 39.在冰上将样品置于磁性台架上并收集洗脱的样品。这是洗脱物#2。丢弃珠。
[0866] 40.凝胶1布置：
[0867] 泳道1：5ng脱硫生物素文库
[0868] 泳道2：1X LDS
[0869] 泳道3：标志物
[0870] 泳道4：脱硫生物素洗脱物#1
[0871] 泳道5：未标记的洗脱物#1
[0872] 泳道6：仅珠洗脱物#1
[0873] 泳道7：脱硫生物素洗脱物#2
[0874] 泳道8：未标记的洗脱物#2
[0875] 泳道9：仅珠洗脱物#2
[0876] 泳道10：AP的输入(从步骤17保存)
[0877] 运行还原SDS凝胶：
[0878] 从20X MOPS SDS缓冲液制备1X MOPS SDS运行缓冲液。
[0879] 使用10或12孔4-12％Bis Tris凝胶。
[0880] 剥离胶封并置于凝胶盒中。如果需要，插入用于第二凝胶盒的间隔片。
[0881] 用运行缓冲液MOPS(1X)和500ul抗氧化剂填充内腔/上腔。
[0882] 小心地移除梳而不干扰孔。
[0883] 用运行缓冲液清洗孔以移除可能干扰样品运行的储存缓冲液。
[0884] 小心地使用L-20尖端缓慢地加载样品到各孔。
[0885] 用大约600ml的运行缓冲液MOPS(1X)填充外腔/下腔。
[0887] 运行凝胶以使蛋白质迁移。
[0888] 100V恒定以使样品移动通过堆叠(直到所有样品对齐)15min。
[0889] 对于运行提高到150V恒定(直到可见的样品缓冲液来到底部)，～1hr。
[0890] 在运行结束时，关闭电源并从电泳槽移除凝胶盒。
[0891] 通过用胶刀拆解凝胶盒。
[0892] 移除凝胶盒的一侧。修剪掉凝胶脚和孔(避免干燥凝胶)。
[0893] 转移凝胶到填充有Mili Q水的容器中并进行快速洗涤。
[0894] 银染：
[0895] 材料：
[0896] ProteoSilver TMSilver Stain Kit，Sigma目录号PROT-SIL1，批号SLBJ0252V
[0897] 乙醇，Fisher Scientific目录号BP2818-4，批号142224
[0898] 乙酸，Acros organics目录号14893-0025，批号B0520036
[0899] 水，Sigma目录号W4502，批号RNBD1581
[0900] 制备：
[0901] 1.固定液。添加50ml的乙醇和10ml的乙酸到40ml的超纯水。
[0902] 2.30％乙醇溶液。添加30ml的乙醇到70ml的超纯水。
[0903] 3.敏化剂溶剂。添加1ml的ProteoSilver敏化剂到99ml的超纯水。制备的溶液应当在2小时内使用。沉淀可能在ProteoSilver敏化剂中形成。这一沉淀不会影响溶液的性能。
简单地允许沉淀沉降并移除1ml的上清液。
简单地允许沉淀沉降并移除1ml的上清液。
[0904] 4.银溶液。添加1ml的ProteoSilver银溶液到99ml的超纯水。制备的溶液应当在2小时内使用。
[0905] 5.显影剂溶液。添加5ml ProteoSilver显影剂1和0.1ml ProteoSilver显影剂2到95ml的超纯水。显影剂溶液应当在使用前即时(＜20分钟)制备。
[0906] 6.所有步骤应当在柜中进行且废物需要收集在指定的毒性容器中。
[0907] 过程
[0908] A.直接银染
[0909] ·所有步骤在60-70rpm的定轨摇床上在室温下进行。
[0910] 1.固定-在微型聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的电泳后，在柜中将凝胶置于具有100ml的固定溶液的清洁托盘中过夜。紧密覆盖。
[0911] 2.乙醇洗涤-倾析固定溶液并用100ml的30％乙醇溶液洗涤凝胶10分钟。
[0912] 3.水洗涤-倾析30％乙醇溶液并用200ml的超纯水洗涤凝胶10分钟。
[0913] 4.敏化-倾析水并用100ml的敏化剂溶液孵育凝胶10分钟。
[0914] 5.水洗涤-倾析敏化剂溶液并洗涤凝胶两次，每次用200ml的超纯水洗涤10分钟。
[0915] 7.银平衡-倾析水并用100ml的银溶液平衡凝胶10分钟。
[0916] 8.水洗涤-倾析银溶液并用200ml的超纯水洗涤凝胶1-1.5分钟。
[0917] 9.凝胶显影-倾析水并用100ml的显影剂溶液显影凝胶。3-7分钟的显影时间对于大多数凝胶足以产生所需的染色强度。长达10-12分钟的显影时间对于检测具有非常低的
蛋白质浓度(0.1ng/mm2)的条带或斑点可能是需要的。
蛋白质浓度(0.1ng/mm2)的条带或斑点可能是需要的。
[0918] 10.终止-添加5ml的ProteoSilver终止溶液到显影剂溶液以终止显影反应并孵育5分钟。CO2的气泡在混合物中形成。
[0919] 11.储存-倾析显影/终止溶液并用200ml的超纯水洗涤凝胶15分钟。将凝胶储存在新鲜的超纯水中并获取照片用于归档。
[0920] 蛋白质鉴定
[0921] 目标蛋白质条带从剃度凝胶切下并如上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。
[0922] 实施例12：寡核苷酸探针文库表征乳腺癌样品的用途
[0923] 构建包含大约2000个不同探针序列的寡核苷酸探针文库并用于探测大约500个个体乳腺癌和非癌症样品。源自不同筛选实验的探针序列在本文中列于SEQ ID NO.10-2921
中。合成这些表格中所列的寡核苷酸并汇合在一起。样品是来自212名乳腺癌患者、177名活
检确认的非癌症患者和117名正常对照患者(自身报告为非癌症)的血浆样品。血浆样品与
寡核苷酸探针文库接触且微囊泡使用PEG沉淀分离。用微囊泡回收的寡核苷酸被分离。下一
代测序(Illumina HiSeq)用于对于各样品鉴定分离的序列。
中。合成这些表格中所列的寡核苷酸并汇合在一起。样品是来自212名乳腺癌患者、177名活
检确认的非癌症患者和117名正常对照患者(自身报告为非癌症)的血浆样品。血浆样品与
寡核苷酸探针文库接触且微囊泡使用PEG沉淀分离。用微囊泡回收的寡核苷酸被分离。下一
代测序(Illumina HiSeq)用于对于各样品鉴定分离的序列。
[0924] 差异显著性分析鉴定了在比较癌症/正常时p-值低于0.01的18个适体，在比较癌症/非癌症时p-值低于0.001的15个适体，在比较非癌症/正常时p-值低于0.001的28个适
体。
体。
[0925] 多寡核苷酸的组接下来使用交叉验证方法构建。简言之，50个样品从相同的群组随机撤出。单个寡核苷酸区分保留的癌症和非癌症/正常的性能使用逻辑回归方法确定。附
加的寡核苷酸重复地添加且性能使用逻辑回归评价直到使用附加的寡核苷酸不再获得进
一步的性能改善。该方法一般导致大约20-100个不同探针序列的组。构建的组然后用于分
类50个撤出的样品且诊断性能使用接受者操作曲线(ROC)分析和曲线下面积(AUC)的估计
评价。
加的寡核苷酸重复地添加且性能使用逻辑回归评价直到使用附加的寡核苷酸不再获得进
一步的性能改善。该方法一般导致大约20-100个不同探针序列的组。构建的组然后用于分
类50个撤出的样品且诊断性能使用接受者操作曲线(ROC)分析和曲线下面积(AUC)的估计
评价。
[0926] 在大约300轮的交叉验证中，平均AUC是0.6，因此证明平均性能在统计学上好于随机(即，0.5的AUC)且探针文库可以区分乳腺癌和非-乳腺癌/正常患者样品。对于特定的交
叉验证观察到高达0.8的AUC值。图7A-B显示使用训练集(图7A)和测试集(图7B)从一轮交叉
验证产生的模型。AUC是0.803。用于建立这一模型的序列的可变区显示于表18中。另一示例
性的交叉验证轮显示于图7C-D中。AUC是0.678。
叉验证观察到高达0.8的AUC值。图7A-B显示使用训练集(图7A)和测试集(图7B)从一轮交叉
验证产生的模型。AUC是0.803。用于建立这一模型的序列的可变区显示于表18中。另一示例
性的交叉验证轮显示于图7C-D中。AUC是0.678。
[0927] 用于图7A-B的模型中的序列的SEQ ID NO按等级列于表18中。寡核苷酸用可变区侧翼的由序列(5’-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))组成的5’区和由序列(5’-CTGT
CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5))组成的3’区合成。
CTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO.5))组成的3’区合成。
[0928] 表18：寡核苷酸探针可变区
[0929]
[0930]
[0931] 这一实施例中给出的数据证明包含具有SEQ ID NO.10-2921中列出的可变区的成员的寡核苷酸集合，例如，具有表18中列出的可变区的探针的集合，可用于区分来自患有乳
腺癌的个体的血浆与来自非-乳腺癌个体的血浆。
腺癌的个体的血浆与来自非-乳腺癌个体的血浆。
[0932] 实施例13：用于文库开发的单链DNA(ssDNA)寡核苷酸文库制备
[0933] 制备高产率和高质量的ssDNA文库是SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)[1，2]中以及其它生物学应用如DNA芯片和微阵列[3]中，及
单链构象多态性技术(SSCP)[4]的关键步骤。制备ssDNA文库的标准途径包括PCR扩增以首
先生成双链(dsDNA)文库，接着是ssDNA分离和纯化。迄今为止已经开发了ssDNA制备的几种
策略，其各自具有相应的优势和劣势：
单链构象多态性技术(SSCP)[4]的关键步骤。制备ssDNA文库的标准途径包括PCR扩增以首
先生成双链(dsDNA)文库，接着是ssDNA分离和纯化。迄今为止已经开发了ssDNA制备的几种
策略，其各自具有相应的优势和劣势：
[0934] λ核酸外切酶消化[2，5-7]
[0935] dsDNA标准PCR产物接着λ核酸外切酶以消化互补链并留下靶ssDNA。然后进行ssDNA纯化以除去酶和不需要的缓冲液。
[0936] 优势：常规的PCR扩增在产生dsDNA方面具有高产率。
[0937] 劣势：最终ssDNA的纯度受到酶消化效率的限制。而且dsDNA需要在消化之前纯化，以及消化后纯化，具有两次纯化，这导致输入材料的实质损失。消化通常需要至少2小时。消化速率可能不是一致的。
[0938] 不对称PCR[8，9]
[0939] 该过程产生靶ssDNA作为主要产物且产生较少dsDNA产物和非-靶ssDNA。对应于靶ssDNA的条带从原始凝胶切下。
[0940] 优势：最终ssDNA产物潜在地具有高纯度。
[0941] 劣势：链的分离在原始凝胶中是可能的，但产率通常是低的且不能排除非靶标链的存在。产率不能在变性凝胶上提高，因为链具有相同的长度。
[0942] 生物素-链霉亲和素磁珠分离[10，11]
[0943] 非靶PCR引物被生物素化，因此最终PCR产物是生物素化的dsDNA，其可以通过链霉亲和素磁珠捕获并变性以释放非生物素标记的靶ssDNA。
[0944] 优势：最终ssDNA产物具有相对高的纯度。
[0945] 劣势：在大多数情况中，输入文库需要被生物素化，但从链霉亲和素珠替换或释放捕获的靶标链可能是困难的。需要变性后纯化以除去用于中和的NaOH和/或酸。
[0946] 不相等引物长度PCR[12]
[0947] 非靶PCR引物具有化学修饰的间隔区和接着的几个额外的核苷酸。在PCR反应中，DNA聚合酶在间隔区处停止，从而导致PCR dsDNA产物的不相等长度。然后靶ssDNA可以从变
性PAGE凝胶切除。
性PAGE凝胶切除。
[0948] 优势：最终ssDNA产物具有高纯度，因为靶ssDNA不与非靶标链混合。
[0949] 劣势：ssDNA不能在原始凝胶上看到。需要的是耗时的变性PAGE凝胶。可能困难的是使一些dsDNA文库变性，这可能限制最终产率。
[0950] 间接纯化方法[13]
[0951] 间接纯化策略将非对称PCR与生物素-链霉亲和素磁性珠分离结合。简而言之，常规PCR用于产生足够的模板，然后是具有过量靶引物和较少生物素化互补引物的不对称
PCR，接着生物素-链霉亲和素分离。
PCR，接着生物素-链霉亲和素分离。
[0952] 优势：可能提高ssDNA产物的产率和纯度。
[0953] 劣势：可能不能产生生物素化的靶ssDNA文库。该方法相对长和复杂，且可能易于产生原始序列的突变体。
[0954] 本发明提供了针对目标靶标富集寡核苷酸探针文库的方法。由于探针包含ssDNA，该方法可以包括在每轮富集后的PCR扩增，然后转换回ssDNA。在这一实施例中，我们开发了
用于制备ssDNA寡核苷酸文库的策略。目的是开发高效和快速的而同时递送高质量/纯度
ssDNA的方法。我们目的在于将PCR和ssDNA制备组合在一个步骤中，在选择缓冲液、靶标分
子、其它样品组分(例如，对于血浆样品高度丰富的蛋白质)和其它分析组分(例如，可以用
于沉淀微囊泡的PEG沉淀溶液)的存在下保持高效。另外，我们希望的是该方法能够产生具
有任何修饰(包括但不限于生物素)的ssDNA文库。
用于制备ssDNA寡核苷酸文库的策略。目的是开发高效和快速的而同时递送高质量/纯度
ssDNA的方法。我们目的在于将PCR和ssDNA制备组合在一个步骤中，在选择缓冲液、靶标分
子、其它样品组分(例如，对于血浆样品高度丰富的蛋白质)和其它分析组分(例如，可以用
于沉淀微囊泡的PEG沉淀溶液)的存在下保持高效。另外，我们希望的是该方法能够产生具
有任何修饰(包括但不限于生物素)的ssDNA文库。
[0955] 我们使用优化形式的λ外切核酸酶消化方案来制备ssDNA寡核苷酸文库。但是，消化产率限制了总体回收率且在不同的文库制备之间是不一致的。在一些情况中，ssDNA条带
在消化后在凝胶上是很难看得见的。我们也在ssDNA产物中观察到dsDNA的不完全消化。在
这一实施例中，我们开发了可选实验方案，称为“通过不等长引物不对称PCR的ssDNA”或
SUPRA。它不存在以上所列已知方法的劣势，并提供高质量和与之前的方法相比产生ssDNA
寡核苷酸文库的最多高10x的产率。它是相对快速的和技术上便捷的，因为靶ssDNA可以在
凝胶上与非靶DNA区分开。
在消化后在凝胶上是很难看得见的。我们也在ssDNA产物中观察到dsDNA的不完全消化。在
这一实施例中，我们开发了可选实验方案，称为“通过不等长引物不对称PCR的ssDNA”或
SUPRA。它不存在以上所列已知方法的劣势，并提供高质量和与之前的方法相比产生ssDNA
寡核苷酸文库的最多高10x的产率。它是相对快速的和技术上便捷的，因为靶ssDNA可以在
凝胶上与非靶DNA区分开。
[0956] 标准PCR 900和不等长PCR 910的示意性比较显示于图9A中。在常规PCR 900中，正向引物901和反向引物903与适体文库的反向链902杂交。进行PCR反应，从而产生等长度的
正向链904和反向链902。链变性成为等长度的单链905。在不等长PCR 901中，具有延长子
(lengthener)节段和终止子节段的正向引物911及反向引物913与适体文库的反向链912杂
交。进行PCR反应，从而产生不等长的正向链914和反向链912。链变性成为可以通过大小分
离(例如，在变性凝胶上)的不等长单链914和912中。
正向链904和反向链902。链变性成为等长度的单链905。在不等长PCR 901中，具有延长子
(lengthener)节段和终止子节段的正向引物911及反向引物913与适体文库的反向链912杂
交。进行PCR反应，从而产生不等长的正向链914和反向链912。链变性成为可以通过大小分
离(例如，在变性凝胶上)的不等长单链914和912中。
[0957] SUPRA的步骤包括：(i)正规非靶引物用两个Isp9(内部间隔区9；三乙二醇间隔区)作为终止子和32个额外核苷酸(例如，聚-A)作为延长子的修饰。它称为不相等-正向-双
(Unequal-Forward-Double)isp9引物(UF-D9)；(ii)通过以有利于反向引物的比率(例如，1
∶37.5)混合DNA模板、UF-D9和正规靶(反向)引物来进行不对称PCR。PCR程序由于线性扩增
模式(而非对数模式)具有较长的延伸步骤(例如，3min而不是标准的1min)和更多的循环。
PCR产物包含大多数的靶ssDNA和少部分的dsDNA。(iii)1∶1混合PCR反应产物与变性缓冲液
(例如，180mM NaOH和6mM EDTA)并通过加热(例如，70℃，10min)和冷却(例如，在冰上孵育
3min)变性样品；(iv)在用SybrGold染色的琼脂糖凝胶上在变性缓冲液中运行变性的产物。
由于延长子而较长的非靶链呈现为上条带(如果可见)且靶链(强的下条带)被切除和纯化。
该过程可以包括任选的步骤，包括但不限于：(v)称量凝胶块并从凝胶块纯化ssDNA(例如，
使用ssDNA Nucleospin试剂盒等)；(vi)可用于检查最终产物的纯度和产率的产率和原始
凝胶的定量(例如，使用ssDNA Qubit试剂盒等)。
(Unequal-Forward-Double)isp9引物(UF-D9)；(ii)通过以有利于反向引物的比率(例如，1
∶37.5)混合DNA模板、UF-D9和正规靶(反向)引物来进行不对称PCR。PCR程序由于线性扩增
模式(而非对数模式)具有较长的延伸步骤(例如，3min而不是标准的1min)和更多的循环。
PCR产物包含大多数的靶ssDNA和少部分的dsDNA。(iii)1∶1混合PCR反应产物与变性缓冲液
(例如，180mM NaOH和6mM EDTA)并通过加热(例如，70℃，10min)和冷却(例如，在冰上孵育
3min)变性样品；(iv)在用SybrGold染色的琼脂糖凝胶上在变性缓冲液中运行变性的产物。
由于延长子而较长的非靶链呈现为上条带(如果可见)且靶链(强的下条带)被切除和纯化。
该过程可以包括任选的步骤，包括但不限于：(v)称量凝胶块并从凝胶块纯化ssDNA(例如，
使用ssDNA Nucleospin试剂盒等)；(vi)可用于检查最终产物的纯度和产率的产率和原始
凝胶的定量(例如，使用ssDNA Qubit试剂盒等)。
[0958] 第一步骤(i)使用具有高效终止子和延长子的正向引物的特定设计，其产生不等长的非靶标链。用于构建靶标链的DNA聚合酶一旦达到终止子则停止聚合，且延长子促进靶
标和非靶标链之间的区分。在第二步骤(ii)中，两种引物之间的比率朝向反向引物偏移，以
产生大多数的靶ssDNA。但是，该比率不应限制双链模板的产生以保持反应运行。图9B是显
示不对称PCR中正向和反向引物输入的滴定的凝胶。靶标链明显可见的最佳条件是在1∶20-
1∶50 F∶R引物比率范围中。如图中所示，不对称PCR中两种引物之间的比率可以影响最终产物中的dsDNA和ssDNA量。PCR热循环仪程序也被调整以在不对称PCR中提供效率。在第三步
骤(iii)中，可靠的变性方法用于分离靶ssDNA以确保最终产率和高纯度。
标和非靶标链之间的区分。在第二步骤(ii)中，两种引物之间的比率朝向反向引物偏移，以
产生大多数的靶ssDNA。但是，该比率不应限制双链模板的产生以保持反应运行。图9B是显
示不对称PCR中正向和反向引物输入的滴定的凝胶。靶标链明显可见的最佳条件是在1∶20-
1∶50 F∶R引物比率范围中。如图中所示，不对称PCR中两种引物之间的比率可以影响最终产物中的dsDNA和ssDNA量。PCR热循环仪程序也被调整以在不对称PCR中提供效率。在第三步
骤(iii)中，可靠的变性方法用于分离靶ssDNA以确保最终产率和高纯度。
[0959] 按照需要，最终步骤(vi)估计残留dsDNA的比率，例如，使用ssDNA Qubit试剂盒。在其中产率不关键的情况中，变性步骤(iii和iv)可以跳过且PCR产物可以直接在原始凝胶
上运行。将存在dsDNA条带，但较低MW靶ssDNA的条带可以从凝胶区分和纯化。这也是在PCR
后直接可视化靶条带以进行质量检验或纯化而不变性的方式。最终产物的纯度相同但产率
较低。
上运行。将存在dsDNA条带，但较低MW靶ssDNA的条带可以从凝胶区分和纯化。这也是在PCR
后直接可视化靶条带以进行质量检验或纯化而不变性的方式。最终产物的纯度相同但产率
较低。
[0960] 原始凝胶相对于变性凝胶纯化的比较显示于图9C中。探测后寡核苷酸探针文库使用以1∶38的比率(正向/反向)混合的不等长引物进行PCR。在图中，各凝胶上的左泳道是
50bp分子量梯状物且较低条带是反向引物。指示了dsDNA和ss DNA的位置。原始凝胶显示
dsDNA和ssDNA(靶标链)两者的存在(图9C，A图)。此处，反向靶标链的部分在dsDNA中迁移。
因此，使用原始凝胶，可以以中等回收率纯化靶ssDNA。当需要较高产率时，PCR产物可以如
上所述在变性琼脂糖凝胶上运行。这一途径提供最大回收率，其中仅靶标链是可见的，且可
以从凝胶切除和纯化(图9C，B图)。在这种情况中，反向链ssDNA(其是原始凝胶上dsDNA的部
分)(图9C，A图)被变性并与靶ssDNA链的其它游离分子一起迁移，而正向链由于有限的扩增
而变成不可见的。
50bp分子量梯状物且较低条带是反向引物。指示了dsDNA和ss DNA的位置。原始凝胶显示
dsDNA和ssDNA(靶标链)两者的存在(图9C，A图)。此处，反向靶标链的部分在dsDNA中迁移。
因此，使用原始凝胶，可以以中等回收率纯化靶ssDNA。当需要较高产率时，PCR产物可以如
上所述在变性琼脂糖凝胶上运行。这一途径提供最大回收率，其中仅靶标链是可见的，且可
以从凝胶切除和纯化(图9C，B图)。在这种情况中，反向链ssDNA(其是原始凝胶上dsDNA的部
分)(图9C，A图)被变性并与靶ssDNA链的其它游离分子一起迁移，而正向链由于有限的扩增
而变成不可见的。
[0961] 与标准的不对称PCR(其具有相对低的产率且不允许在变性凝胶上区分靶标和非靶标链)相比，SUPRA输送可以在原始凝胶和变性凝胶两者上纯化的不同长度的靶标和非靶
标。与不相等引物长度PCR(其使用冗长的脲-PAGE方案和仅产生dsDNA)相比，SUPRA具有较
少dsDNA且如果产率不是关键的，游离的靶ssDNA甚至可以从原始凝胶切除。
标。与不相等引物长度PCR(其使用冗长的脲-PAGE方案和仅产生dsDNA)相比，SUPRA具有较
少dsDNA且如果产率不是关键的，游离的靶ssDNA甚至可以从原始凝胶切除。
[0962] SUPRA已经用于本发明提供的寡核苷酸探针文库富集方法中。该方法是稳定的。在富集缓冲液、靶标/非靶标分子、蛋白质、外来体/微囊泡、PEG和其它组分存在的情况下，
SUPRA提供ssDNA寡核苷酸文库的高质量和数量。
SUPRA提供ssDNA寡核苷酸文库的高质量和数量。
[0963] 参考文献：
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specificity.Antimicrob.Agents Chemother.2006，50，3019-3027.
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[0976] 13.Indirect purification method provides high yield and quality ssDNA sublibrary for potential apatmer selection.Anal.Biochem.2015，online
available.
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[0977] 实施例14：表征细胞系的寡核苷酸集合
[0978] 在这一实施例中，寡核苷酸文库使用来自不同癌细胞系的细胞的组合来产生癌症特异性的集合并针对非癌症细胞的集合产生。进行富集以鉴定可以用于各种应用中的癌症
特异性的寡核苷酸和寡核苷酸集合，包括但不限于诊断分析、作为药物或用于药物递送。
特异性的寡核苷酸和寡核苷酸集合，包括但不限于诊断分析、作为药物或用于药物递送。
[0979] 未筛选的文库包含围绕随机生成的核苷酸区域的F-Trin-B引物(即，如上所示的5’CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和5’CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ
ID NO 5))。富集使用本文中提出的方法进行。参见以上实施例。详细的实验方案在以下实
施例15和16中。一轮富集由一系列的正向、负向和正向选择组成，之后是通过富集的寡核苷
酸的PCR进行扩增。参见图13，其显示一轮富集的图解。扩增的文库(PCR)用作下一轮富集的
输入。使用的细胞系由表19中列出的九个肺癌细胞系、五个前列腺癌细胞系和九个非癌症
细胞系组成。
ID NO 5))。富集使用本文中提出的方法进行。参见以上实施例。详细的实验方案在以下实
施例15和16中。一轮富集由一系列的正向、负向和正向选择组成，之后是通过富集的寡核苷
酸的PCR进行扩增。参见图13，其显示一轮富集的图解。扩增的文库(PCR)用作下一轮富集的
输入。使用的细胞系由表19中列出的九个肺癌细胞系、五个前列腺癌细胞系和九个非癌症
细胞系组成。
[0980] 表19：细胞系
[0981]
[0982]
[0983] 针对肺癌样品集合进行九轮富集。前五个最多富集序列的可变区显示于表20中。富集的文库由插入在如以上显示为5’CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)-[可变区]-C
TGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)的侧翼序列之间的如表中所示的可变
区组成。序列也被5’生物素化。25ng的起始文库用于富集中。作为对照序列，如表20中所示合成反向互补序列。存在包括侧翼区域的整个寡核苷酸的反向互补序列。S1LCa25-R9S1RC-
5’生物素和S1LCa25-R9S3RC-5’生物素分别是S1LCa25-R9S1-5’生物素和S1LCa25-R9S3-5’生物素的反向互补序列。反向互补序列可以用作阴性对照，因为它们不应特异性地结合富
集的序列的靶标。
TGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)的侧翼序列之间的如表中所示的可变
区组成。序列也被5’生物素化。25ng的起始文库用于富集中。作为对照序列，如表20中所示合成反向互补序列。存在包括侧翼区域的整个寡核苷酸的反向互补序列。S1LCa25-R9S1RC-
5’生物素和S1LCa25-R9S3RC-5’生物素分别是S1LCa25-R9S1-5’生物素和S1LCa25-R9S3-5’生物素的反向互补序列。反向互补序列可以用作阴性对照，因为它们不应特异性地结合富
集的序列的靶标。
[0984] 表20：肺癌富集的寡核苷酸
[0985]
[0986] 也针对前列腺癌样品集合进行九轮富集。各种富集序列的可变区显示于表21中。用于富集中的起始文库的量显示于表格中。文库如上所示由插入在侧翼序列(SEQ ID NO
4-5)之间的如表中所示的可变区组成。在富集后，文库用于探测细胞集合且NGS用于确定结
合的序列的身份和计数。表21显示前列腺癌(PCA)或非-PCA中序列的计数及PCA和非-PCA之
间的倍数变化。探测一式三份地进行。表30中的序列在三个重复探测的标准化计数之间具
有≤20％的变异系数(％CV)及≤0.6或≥1.4的癌症/非癌症倍数变化。平均百分变异(％
CV)对于PCA集合是～11％和对于非-PCA集合是～12％。
4-5)之间的如表中所示的可变区组成。在富集后，文库用于探测细胞集合且NGS用于确定结
合的序列的身份和计数。表21显示前列腺癌(PCA)或非-PCA中序列的计数及PCA和非-PCA之
间的倍数变化。探测一式三份地进行。表30中的序列在三个重复探测的标准化计数之间具
有≤20％的变异系数(％CV)及≤0.6或≥1.4的癌症/非癌症倍数变化。平均百分变异(％
CV)对于PCA集合是～11％和对于非-PCA集合是～12％。
[0987] 表21：前列腺癌富集的寡核苷酸
[0988]
[0989] 以上序列5’生物素化用于捕获。作为对照序列，反向互补序列如表22中所示合成。这些是包括侧翼区域的整个寡核苷酸的反向互补序列。S1PCa5-R9S1RC-5′生物素和
S1PCa25-R9S1RC-5′生物素分别是具有侧翼区域的完整S1PCa5-R9S1-5′生物素和S1PCa25-
R9S1-5′生物素序列的反向互补序列。反向互补序列可以用作阴性对照，因为它们不应特异
性地结合富集的序列的靶标。
S1PCa25-R9S1RC-5′生物素分别是具有侧翼区域的完整S1PCa5-R9S1-5′生物素和S1PCa25-
R9S1-5′生物素序列的反向互补序列。反向互补序列可以用作阴性对照，因为它们不应特异
性地结合富集的序列的靶标。
[0990] 表22：前列腺癌富集的寡核苷酸
[0991]
[0992]
[0993] 如表21中的另外的序列显示于表23中。表23包括％CV＞20％的序列，如所示的。
[0994] 表23：另外的前列腺癌富集的寡核苷酸
[0995]
[0996] 进行如qPCR、细胞酶联分析(ELA)、共焦显微术和细胞活力分析的测定以证实寡核苷酸与细胞的结合和鉴定某些寡核苷酸的潜在细胞杀灭性质。
[0997] 实施例15：富集实验方案
[0998] 原始F-TRin-35n-B寡核苷酸文库的再扩增。
[0999] 用于一轮富集的样品
[1000] 来自前列腺/肺细胞系的集合的900,000个细胞(分割3次，每次300,000个)
[1001] 来自正常细胞系的集合的900,000个细胞(分割3次，每次300,000个)
[1002] 制备
[1003] 在4℃下预冷台式离心机。
[1004] 使用具有3mM MgCl2的1X PBS(138.6ul PBS+1.4ul 300mM MgCl2)将300,000个前列腺/肺细胞达到140ul，添加以下所列的竞争剂并伴随端对端旋转孵育20min。
[1005] 两种竞争剂的混合物：鲑DNA+tRNA。
[1006] 竞争剂鲑DNA：添加800ng的鲑DNA(原液10ug/ul-＞用1X PBS+3mM MgCl2稀释1∶250[40ng/ul]-＞20ul输入)。
[1007] 竞争剂tRNA：添加800ng的tRNA(原液10ug/ul-＞用1X PBS+3mM MgCl2稀释1∶250[40ng/ul]-＞20ul输入)。
[1008] 文库/样品孵育(正向选择)
[1009] 在20ul的具有3mM MgCl2的1x PBS中制备用于第一轮的5、25、50ng和对应于之后轮的5、25、50ng寡核苷酸文库。在加热DNA3min@95C后，将其立即置于冰上5min。添加DNA到阻断的细胞并在RT下伴随端对端旋转孵育30min。
[1010] 旋转细胞
[1011] 以500xg旋转来自步骤II的细胞5min(在4C下旋转)并通过吸出弃去上清液。
[1012] 重悬沉淀于1ml的1X PBS+3mM MgCl2中；涡旋/混合并再次以500xg离心5min(在4C下旋转)。
[1013] 再一次重复洗涤。
[1014] 重悬沉淀于50ul水中。
[1015] 使用步骤IV中的沉淀。
[1016] 寡核苷酸洗脱
[1017] 添加25ul的0.1N NaOH到来自III的细胞，在50C下孵育10min，混匀并以550rpm搅拌10sec-＞添加25ul的0.1N HCl-＞在4C下以12000xg旋转10min-＞进行NucleoSpin
ssDNA纯化以确保使用正确的缓冲液结合(NTC)ssDNA(待鉴定的柱的编号)-＞洗脱，各柱在
20ul水中(洗脱之前的孵育时间为5min)。添加4ul的5X PBS+15mM MgCl2溶液，之后进行到
下一富集。
ssDNA纯化以确保使用正确的缓冲液结合(NTC)ssDNA(待鉴定的柱的编号)-＞洗脱，各柱在
20ul水中(洗脱之前的孵育时间为5min)。添加4ul的5X PBS+15mM MgCl2溶液，之后进行到
下一富集。
[1018] 文库/样品孵育(负向选择)
[1019] 使用具有3mM MgCl2的1X PBS(138.6ul PBS+1.4ul 300mM MgCl2)将300,000个正常细胞达到140ul并如以上步骤I.c中所述与竞争剂的混合物混合(总共40ul)，伴随端对端
旋转孵育20min。然后，添加来自步骤IV的洗脱的寡核苷酸文库(～20ul)(热处理3min@95C，
立即置于冰上5min)并在RT下孵育30min。
旋转孵育20min。然后，添加来自步骤IV的洗脱的寡核苷酸文库(～20ul)(热处理3min@95C，
立即置于冰上5min)并在RT下孵育30min。
[1020] 旋转细胞
[1021] 以500xg旋转来自步骤V的细胞5min(在4C下旋转)并收集上清液。
[1022] 上清液用NucleoSpin ssDNA纯化进行处理。确保使用正确的缓冲液结合(NTC)ssDNA(待鉴定的柱的编号)-＞洗脱，各柱在20ul水中(洗脱之前的孵育时间为5min)。
[1023] 添加4ul的5X PBS+15mM MgCl2溶液，之后进行到下一富集。
[1024] 文库/样品孵育(正向选择)
[1025] 使用具有3mM MgCl2的1X PBS(138.6ul PBS+1.4ul 300mM MgCl2)将300,000个前列腺/肺细胞达到140ul并如以上步骤I.c中所述与竞争剂的混合物混合(总共40ul)，伴随
端对端旋转孵育20min。与来自步骤VI的文库混合(热处理3min@95C，立即置于冰上5min)并
伴随端对端旋转在RT下孵育30min。
端对端旋转孵育20min。与来自步骤VI的文库混合(热处理3min@95C，立即置于冰上5min)并
伴随端对端旋转在RT下孵育30min。
[1026] 旋转细胞
[1027] 以500xg旋转来自步骤VII的细胞5min(在4C下旋转)并通过吸出弃去上清液。
[1028] 重悬沉淀于1ml的1X PBS+3mM MgCl2中；涡旋/混合并再次以500xg离心5min(在4C下旋转)。
[1029] 再一次重复洗涤。
[1030] 重悬沉淀于50ul水中。
[1031] 接着寡核苷酸洗脱(IV)和然后nucleospin纯化以得到20ul水中的ssDNA。
[1032] 水(20ul)中的ssDNA完全地用于PCR扩增。
[1033] 实施例16：富集实验方案
[1034] 用于一轮富集的样品
[1035] 来自前列腺/肺细胞系集合的900,000个细胞(分割三次，各300,000个细胞)。
[1036] 来自正常细胞系的集合的900,000个细胞(分割三次，各300,000个细胞)。
[1037] 对于每个文库输入没有细胞富集。
[1038] 表24：缓冲液
[1039]Exp.ID 缓冲液
B1 PBS+3mM MgCl2
B2 PBS+3mM MgCl2+0.5％F-127+0.5％ PEG4000
B3 PBS+3mM MgCl2+0.5％F-127+1mg/ml HSA
B1 PBS+3mM MgCl2
B2 PBS+3mM MgCl2+0.5％F-127+0.5％ PEG4000
B3 PBS+3mM MgCl2+0.5％F-127+1mg/ml HSA
[1040] 或者具有0.5、1和2％的F-12和HSA-F-127的缓冲液的滴度。
[1041] 细胞可在1X PBS+3mM MgCl2缓冲液中得到且需要转移。
[1042] I.制备
[1043] 在4℃下预冷台式离心机。
[1044] 转移300,000个癌细胞-140ul到3个新鲜的管中。以500xg旋转5min。除去上清缓冲液并添加70ul的缓冲液B2。
[1045] 添加以下所列的竞争剂并伴随端对端旋转孵育20min。
[1046] 两种竞争剂的混合物：
[1047] 竞争剂鲑DNA：添加800ng的鲑DNA(原液10ug/ul-＞用B2稀释1∶125[80ng/ul]-＞10ul输入)。
[1048] 竞争剂t-RNA：添加800ng的tRNA(原液10ug/ul-＞用B2稀释1∶125[80ng/ul]-＞10ul输入)。
[1049] 用90ul的缓冲液B2使体积达到180ul，用于阻断。
[1050] II.文库/样品孵育(正向选择)
[1051] 在20ul的缓冲液B2中制备用于第一轮的5/25/50ng的F-TRin-35n-B起始文库。在加热DNA 3min@95C后，将其立即置于冰上5min。添加DNA到阻断的细胞并在RT下伴随端对端
旋转孵育30min。
旋转孵育30min。
[1052] III.旋转细胞
[1053] 在4C下以500xg旋转来自步骤II的细胞5min并通过吸出弃去上清液。
[1054] 重悬沉淀于1ml的B2中；涡旋并再次在4C下以500xg离心5min。
[1055] 再一次重复洗涤。(附加洗涤)
[1056] 重悬沉淀于30ul的缓冲液B2中。
[1057] 使用步骤IV中的沉淀。
[1058] IV.寡核苷酸洗脱
[1059] 添加10ul的0.25N NaOH到来自III的细胞，在50C下孵育10min，混匀并以550rpm搅拌5-10sec-＞添加10ul的0.25N HCl-＞在4C下以16000xg旋转10min。收集上清液；这用作
下一步骤的文库。
下一步骤的文库。
[1060] V.文库/样品孵育(负向选择)
[1061] 转移300,000个正常细胞-140ul到3个新鲜的管中。以500xg旋转5min。除去上清缓冲液并添加70ul的缓冲液B2。
[1062] 与竞争剂的混合物(10ul的鲑精DNA@80ng/ul+10ul的酵母t-RNA@80ng/ul)混合，使体积达到150ul(添加60ul的缓冲液B2)，伴随端对端旋转孵育20min。然后添加来自步骤
Iv的洗脱的寡核苷酸文库(～50ul)(热处理3min@95C，立即置于冰上5min)并在RT下孵育
30min。
Iv的洗脱的寡核苷酸文库(～50ul)(热处理3min@95C，立即置于冰上5min)并在RT下孵育
30min。
[1063] VI.旋转细胞
[1064] 在4C下以500xg旋转来自步骤V的细胞5min并收集上清液作为用于下一步骤的文库(200ul)。
[1065] VII.文库/样品孵育(正向选择)
[1066] 转移300,000个癌细胞-140ul到3个新鲜的管中。以500xg旋转5min。除去上清缓冲液并添加70ul的缓冲液B2。
[1067] 与竞争剂的混合物(10ul的鲑精DNA@80ng/ul+10ul的酵母t-RNA@80ng/ul)混合，伴随端对端旋转孵育20min。与来自步骤VI的文库混合(热处理3min@95C，立即置于冰上
5min)并在RT下伴随端对端旋转孵育30min(总共290ul)。
5min)并在RT下伴随端对端旋转孵育30min(总共290ul)。
[1068] VIII.旋转细胞
[1069] 在4C下以500xg旋转来自步骤VII的细胞5min并通过吸出弃去上清液。
[1070] 重悬沉淀于1ml的B2中；涡旋并再次在4C下以500xg离心5min。
[1071] 再一次重复洗涤。(附加洗涤)
[1072] 重悬沉淀于50ul的水中；其完全地用于PCR扩增。
[1073] 实施例17：表征细胞系微囊泡的寡核苷酸集合
[1074] 在这一实施例中，寡核苷酸文库使用从各种癌细胞系脱落的微囊泡进行富集。富集如以上实施例14中进行，除了样品包含微囊泡而不是细胞。这一方法可以进行以鉴定疾
病特异性寡核苷酸和寡核苷酸集合，其可以用于各种应用中，包括但不限于诊断分析、作为
药物或用于药物递送。
病特异性寡核苷酸和寡核苷酸集合，其可以用于各种应用中，包括但不限于诊断分析、作为
药物或用于药物递送。
[1075] 未筛选的 文库包含 侧邻随机可变区的F-Trin-B引物(即，5’CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和5’CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID
NO 5))。富集如以下实施例18中进一步所述在来自细胞系的微囊泡上进行。图14A显示在如
图中所示来自VCaP和LNCaP细胞的外来体上的五轮富集的每个种类的拷贝。正向选择在从
VCAP细胞脱落的VCAP微囊泡上进行和负向选择在从LNCaP细胞脱落的LNCaP微囊泡进行。该
图显示随各轮增加的各种寡核苷酸探针种类的拷贝数，表明寡核苷酸探针文库用这些种类
富集。几种富集的寡核苷酸探针的可变区显示于表25中。探针被5’生物素化。这些探针来自用5ng文库在来自VCaP和LnCaP细胞的外来体上进行的富集。表25显示VCaP相对于LNCaP具
有至少4.0-倍提高的倍数变化的九个序列。各序列对于在VCaP外来体上的探测也具有至少
500的平均的标准化计数。倍数变化显示于表格中。图14B显示在使用表格中的九个寡核苷
酸探针探测(实验方案参见以下实施例)后回收的拷贝。也如表格中所示，整个探针序列
(即，包括以上显示的F-Trin-B引物)的反向互补序列用作对照。
NO 5))。富集如以下实施例18中进一步所述在来自细胞系的微囊泡上进行。图14A显示在如
图中所示来自VCaP和LNCaP细胞的外来体上的五轮富集的每个种类的拷贝。正向选择在从
VCAP细胞脱落的VCAP微囊泡上进行和负向选择在从LNCaP细胞脱落的LNCaP微囊泡进行。该
图显示随各轮增加的各种寡核苷酸探针种类的拷贝数，表明寡核苷酸探针文库用这些种类
富集。几种富集的寡核苷酸探针的可变区显示于表25中。探针被5’生物素化。这些探针来自用5ng文库在来自VCaP和LnCaP细胞的外来体上进行的富集。表25显示VCaP相对于LNCaP具
有至少4.0-倍提高的倍数变化的九个序列。各序列对于在VCaP外来体上的探测也具有至少
500的平均的标准化计数。倍数变化显示于表格中。图14B显示在使用表格中的九个寡核苷
酸探针探测(实验方案参见以下实施例)后回收的拷贝。也如表格中所示，整个探针序列
(即，包括以上显示的F-Trin-B引物)的反向互补序列用作对照。
[1076] 表25：寡核苷酸探针的可变区
[1077]
[1078] 图14C与来自LNCaP细胞的外来体相比在七批分离的VCaP外来体中的六批上显示较高的回收率，如通过用表25中的九个单个DNA序列的文库探测看到的。该图也显示用反向
互补序列对照的探测。如预测的，这些序列与具有可变区SEQ ID NO.2953-2961的寡核苷酸
探针序列相比显示外来体的很少回收。
互补序列对照的探测。如预测的，这些序列与具有可变区SEQ ID NO.2953-2961的寡核苷酸
探针序列相比显示外来体的很少回收。
[1079] 几种蛋白质通过用具有可变区5′-TACTTAATTGGGGGGGGGGATTCTGTTTTGTCTCT-3′(即，SEQ ID NO 2959)的适体探测来自VCaP细胞的外来体、接着拉下和通过质谱的分析来
鉴定。方法参见实施例9。示例性的结果显示于表26中。这些实验鉴定了癌症中过表达的调
节外来体生物发生(ESCRT，多配体聚糖结合蛋白(Syntenin))和内吞运输(趋化因子
CXCL11)的关键蛋白质。ESCRT机构(ESCRT-0、I、II和III)参与外来体生物发生且观察到该
蛋白质在人类癌症中过表达。参见，例如，Kowal等，Biogenesis and secrection of
exosomes，Current Opinion in Cell Biology，2014，29：116-125；Hurley和Hanson，
Membrane budding and scission by the ESCRT machinery：it’s all in the neck，Nat Rev Mol Cell Biol，2010 11：556-566；Raiborg和Stenmark，The ESCRT machinery in
endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins，Nature 2009 458：45-52，全
部该蛋白质通过引用全文并入本文中。实验进一步鉴定其miRNA抑制使细胞对化疗剂敏化
的冷休克蛋白质。
鉴定。方法参见实施例9。示例性的结果显示于表26中。这些实验鉴定了癌症中过表达的调
节外来体生物发生(ESCRT，多配体聚糖结合蛋白(Syntenin))和内吞运输(趋化因子
CXCL11)的关键蛋白质。ESCRT机构(ESCRT-0、I、II和III)参与外来体生物发生且观察到该
蛋白质在人类癌症中过表达。参见，例如，Kowal等，Biogenesis and secrection of
exosomes，Current Opinion in Cell Biology，2014，29：116-125；Hurley和Hanson，
Membrane budding and scission by the ESCRT machinery：it’s all in the neck，Nat Rev Mol Cell Biol，2010 11：556-566；Raiborg和Stenmark，The ESCRT machinery in
endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins，Nature 2009 458：45-52，全
部该蛋白质通过引用全文并入本文中。实验进一步鉴定其miRNA抑制使细胞对化疗剂敏化
的冷休克蛋白质。
[1080] 表26：来自用序列7拉下的VCaP外来体的蛋白质
[1081]
[1082]
[1083] 也鉴定了来自以上用5ng文库在来自VCaP和LnCaP细胞的外来体上富集的阴性对照。几种显示于表27中。该表格显示在LNCaP外来体上具有至少4.0高的倍数变化的3个序列
和具有1的倍数变化(表明在VCaP和LNCaP外来体之间没有倍数变化)的2个序列。可变区显
示于表27中。也如表格中所示，整个探针序列(即，包括以上显示的F-Trin-B引物)的反向互
补序列用作对照。
和具有1的倍数变化(表明在VCaP和LNCaP外来体之间没有倍数变化)的2个序列。可变区显
示于表27中。也如表格中所示，整个探针序列(即，包括以上显示的F-Trin-B引物)的反向互
补序列用作对照。
[1084] 表27：寡核苷酸探针的可变区
[1085]
[1086]
[1087] 进行如qPCR、细胞酶联分析(ELA)、共焦显微术和细胞活力分析的测定以证实寡核苷酸与细胞的结合和鉴定某些寡核苷酸的潜在细胞杀灭性质。
[1088] 实施例18：用于微囊泡的富集实验方案
[1089] 样品：
[1090] 实验1：(F98细胞：生物体：褐家鼠(Rattus norvegicus)；细胞类型：成胶质细胞瘤；组织：脑；疾病：未分化的恶性的神经胶质瘤)
[1091] 用于各正向步骤的25ug来自转染的F98细胞(EGFR+)的微囊泡
[1092] 用于各负向步骤的25ug来自亲本F98细胞的微囊泡
[1093] 实验2：(前列腺癌细胞系)
[1094] 用于各正向步骤的25ug来自VCaP细胞的微囊泡
[1095] 用于各负向步骤的25ug来自LnCaP细胞的微囊泡
[1096] 对照：
[1097] 用于各正向和负向步骤的没有微囊泡的反应缓冲液
[1098] 反应缓冲液：1xPBS+3mM MgCl2+0.5％F127+1mg/ml HSA
[1099] 样品制备：制备35ul 1xPBS中的25ug微囊泡并添加35ul的1x PBS+6mM MgCl2+1％F127+2mg/ml HSA以获得70ul的1x PBS+3mM MgCl2+0.5％F127+1mg/ml HSA中的25ug微囊
泡
泡
[1100] 富集方案：
[1101] 第一轮：仅正向步骤
[1102] 第二轮：正向步骤-＞负向步骤-＞正向步骤
[1103] 第三轮：正向步骤-＞负向步骤-＞正向步骤
[1104] 第四轮：正向步骤-＞负向步骤-＞正向步骤
[1105] 各轮以PCR结束，接着凝胶电泳后的ssDNA纯化
[1106] I.制备
[1107] a)在4℃下预冷台式离心机。
[1108] b)添加以下所列的竞争剂到70ul反应缓冲液中的各25ug的转染的F98或VCaP微囊泡，并在混匀仪上伴随500rpm的振摇孵育20min。
[1109] c)两种竞争剂的混合物：
[1110] 竞争剂鲑DNA：添加800ng的鲑DNA(原液10ug/ul-＞用反应缓冲液稀释1∶125[80ng/ul]-＞10ul输入)。
[1111] 竞争剂t-RNA：添加800ng的tRNA(原液10ug/ul-＞用反应缓冲液稀释1∶125[80ng/ul]-＞10ul输入)。
[1112] d)用90ul的反应缓冲液使体积达到180ul，用于阻断。
[1113] II.文库/样品孵育(正向选择)
[1114] 在20ul的反应缓冲液中制备用于第一轮的5ng和50ng的F-TRin-35n-B起始文库。在加热DNA 3min@95C后，将其立即置于冰上5min。添加DNA到阻断的细胞并在RT下伴随端对
端旋转孵育30min。
端旋转孵育30min。
[1115] III.使用6％PEG8000的沉淀实验方案
[1116] a)使用来自步骤II的微囊泡作为样品。
[1117] b)添加200ul的12％PEG8000到200ul的样品。
[1118] c)保持样品在冰上30min。
[1119] d)以16000xg旋转10min并弃去上清液。
[1120] e)重悬沉淀于200ul反应缓冲液中并再次以16000xg离心10min。
[1121] f)重悬沉淀于30ul的反应缓冲液中。
[1122] g)第一轮：直接到PCR。后续轮：转到IV。
[1123] IV.寡核苷酸探针洗脱
[1124] 添加10ul的0.25N NaOH到来自III的细胞，在50C下孵育10min，混匀并以550rpm搅拌5-10sec-＞添加10ul的0.25N HCl-＞在4C下以16000xg旋转10min。收集上清液；这用作
用于下一步骤的文库。
用于下一步骤的文库。
[1125] V.文库/样品孵育(负向选择)
[1126] 向在70ul反应缓冲液中的各25ug的亲本F98或LnCaP外来体添加竞争剂的混合物(10ul的鲑精DNA@80ng/ul+10ul的酵母t-RNA@80ng/ul)，通过添加60ul反应缓冲液使体积
达到150ul并在混匀仪上伴随500rpm的振摇孵育20min。然后添加来自步骤IV的洗脱的寡核
苷酸探针文库(～50ul)(热处理3min@95C，立即于冰上孵育5min)并在室温(RT)下孵育
30min。
达到150ul并在混匀仪上伴随500rpm的振摇孵育20min。然后添加来自步骤IV的洗脱的寡核
苷酸探针文库(～50ul)(热处理3min@95C，立即于冰上孵育5min)并在室温(RT)下孵育
30min。
[1127] VI.使用6％PEG8000的沉淀实验方案(使用来自III的样品)
[1128] a)使用来自步骤V的微囊泡/DNA混合物。
[1129] b)添加200ul的12％PEG8000到200ul的样品。
[1130] c)保持样品在冰上30min。
[1131] d)以16000xg旋转10min并收集上清液。
[1132] VII.文库/样品孵育(正向选择)
[1133] 向在70ul反应缓冲液中的各25ug的转染的F98或VCaP外来体添加竞争剂的混合物(10ul的鲑精DNA@80ng/ul+10ul的酵母t-RNA@80ng/ul)并在混匀仪上伴随500rpm的振摇孵
育20min。然后，添加来自步骤VI的寡核苷酸探针文库(～400ul)(热处理3min@95C，立即置
于冰上5min)并在RT下孵育30min(490ul总体积)。
育20min。然后，添加来自步骤VI的寡核苷酸探针文库(～400ul)(热处理3min@95C，立即置
于冰上5min)并在RT下孵育30min(490ul总体积)。
[1134] VIII.使用6％PEG8000的沉淀实验方案
[1135] a)使用来自步骤VII的微囊泡作为样品。
[1136] b)添加490ul的12％PEG8000到490ul的样品。
[1137] c)保持样品在冰上30min。
[1138] d)以16000xg旋转10min并弃去上清液。
[1139] e)重悬沉淀于200ul反应缓冲液中并再次以16000xg离心10min。
[1140] f)重悬沉淀于30ul的反应缓冲液中。
[1141] g)转到PCR。
[1142] 探测
[1143] 外来体可以用富集的寡核苷酸探针文库探测。对于这些实验，外来体与ssDNA富集的寡核苷酸探针文库接触，用6％PEG8000沉淀，且共沉淀的寡核苷酸探针通过qPCR扩增。
[1144] 实施例19：在HER2+组织样品上的寡核苷酸富集
[1145] 受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2(ERBB2)是通过ERBB2基因编码的蛋白质，该基因也通常称为HER2(人上皮生长因子受体2)或HER2/neu。约20％的乳腺癌过表达HER2基因，其导
致细胞接受不适当的信号以生长和分裂。HER2+癌症倾向于是侵袭性的和快速生长的。对于
患有HER2+乳腺癌的个体，抗-HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(商品名赫塞汀)已经显示急剧降
低复发的风险。
致细胞接受不适当的信号以生长和分裂。HER2+癌症倾向于是侵袭性的和快速生长的。对于
患有HER2+乳腺癌的个体，抗-HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(商品名赫塞汀)已经显示急剧降
低复发的风险。
[1146] 在这一实施例中，我们针对HER2阳性(HER2+)的固定组织样品富集原始F-Trin-B寡核苷酸探针文库。探针文库是如本文所述的，即各成员具有围绕可变区的5’引物
CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和3’引物CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA
(SEQ ID NO 5)。富集如本文中所述使用针对来自患有HER2+侵入性乳腺癌的五名患者
(HER2+群组)和患有HER2-侵入性乳腺癌的六名患者(HER2-群组)的FFPE(新鲜冷冻的石蜡
包埋的)组织的六轮选择进行。HER2状态通过IHC分析确定。在选择过程中使用的阻断缓冲
液包含鲑精DNA、tRNA、F127聚合物和BSA蛋白。富集方案详述于图15A中。如图中所示的，1-3轮仅使用正向选择进行(即，富集对于HER2+样品的结合者)。4-6轮使用针对HER2+样品的正
向选择和针对HER2-样品的负向选择两者。在第6轮结束时的富集文库在进一步的研究中作
为富集的探测文库使用。富集的探测文库的属性显示于图15B中，其中独特的有效序列的数
目针对各序列的拷贝数作图，如通过NGS测定的。富集的探测文库包含3.6 x 107个独特序
列。50个最普遍序列的可变区在SEQ ID NO.2989-3038中按最高普遍性至最低普遍性的顺
序列出。
CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和3’引物CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA
(SEQ ID NO 5)。富集如本文中所述使用针对来自患有HER2+侵入性乳腺癌的五名患者
(HER2+群组)和患有HER2-侵入性乳腺癌的六名患者(HER2-群组)的FFPE(新鲜冷冻的石蜡
包埋的)组织的六轮选择进行。HER2状态通过IHC分析确定。在选择过程中使用的阻断缓冲
液包含鲑精DNA、tRNA、F127聚合物和BSA蛋白。富集方案详述于图15A中。如图中所示的，1-3轮仅使用正向选择进行(即，富集对于HER2+样品的结合者)。4-6轮使用针对HER2+样品的正
向选择和针对HER2-样品的负向选择两者。在第6轮结束时的富集文库在进一步的研究中作
为富集的探测文库使用。富集的探测文库的属性显示于图15B中，其中独特的有效序列的数
目针对各序列的拷贝数作图，如通过NGS测定的。富集的探测文库包含3.6 x 107个独特序
列。50个最普遍序列的可变区在SEQ ID NO.2989-3038中按最高普遍性至最低普遍性的顺
序列出。
[1147] 富集的探测文库用于染色HER2+和HER2-乳腺癌组织。图15C显示在无富集(第0轮，图中的“R0”，左图)后或在六轮富集(第6轮后，图中的“R6”，右图)后HER2+肿瘤样品的代表性染色。如在图中看到的，与原始R0文库相比，对于富集的R6探针文库观察到高得多的染色
量。类似地，图15D显示在无富集(R0，左图)后或在六轮富集(R6，右图)后HER2-肿瘤样品的
代表性染色。如在图中看到的，对于富集的R6探针文库或原始R0文库观察到很少至没有染
色。
量。类似地，图15D显示在无富集(R0，左图)后或在六轮富集(R6，右图)后HER2-肿瘤样品的
代表性染色。如在图中看到的，对于富集的R6探针文库或原始R0文库观察到很少至没有染
色。
[1148] 为鉴定富集的探测文库的结合HER2的特定成员，进行概述于图15E中的实验计划。携带组氨酸标签的重组HER2(“recHer2 His标签”)与磁珠(“Ni磁珠”)偶联。珠与富集的探测文库(“寡核苷酸文库”)混合并允许孵育以允许探针与HER2珠的结合。结合的珠被洗涤且
探针结合剂被回收和通过下一代测序(NGS)鉴定。用阴性对照进行相似的实验以过滤掉结
合分析组分的探针，包括无蛋白质珠和未富集文库。已知的HER2适体用作阳性对照。实验进
行两次并应用多个过滤器，如出现在两个结合实验集中且不结合蛋白质珠的序列。使所有
对照过滤掉，具有404个序列保留。按照普遍性排序的最普遍序列的可变区作为SEQ ID
NO.3039-3061列出。这些序列单独地排序且用于免疫分析形式中以鉴定HER2结合剂。
探针结合剂被回收和通过下一代测序(NGS)鉴定。用阴性对照进行相似的实验以过滤掉结
合分析组分的探针，包括无蛋白质珠和未富集文库。已知的HER2适体用作阳性对照。实验进
行两次并应用多个过滤器，如出现在两个结合实验集中且不结合蛋白质珠的序列。使所有
对照过滤掉，具有404个序列保留。按照普遍性排序的最普遍序列的可变区作为SEQ ID
NO.3039-3061列出。这些序列单独地排序且用于免疫分析形式中以鉴定HER2结合剂。
[1149] 我们接着研究R6文库的靶标。R6文库和未富集的R0文库用生物素-C3-C6-胺引物扩增。文库进行TBE凝胶纯化，与胺反应性双吖丙啶交联剂，磺基-NHS-SS-双吖丙啶(Sulfo-
SDAD)(磺基琥珀酰亚胺基2-[(4，4-azipentanamido)乙基]-1，3′-二硫代丙酸酯)(Thermo
Scientific)并通过HPLC纯化以除去未偶联的寡核苷酸。SDAD偶联的文库然后与用于如上
详述的富集的生物素化文库相比对于染色HER2+或HER2-FFPE组织进行定量。
SDAD)(磺基琥珀酰亚胺基2-[(4，4-azipentanamido)乙基]-1，3′-二硫代丙酸酯)(Thermo
Scientific)并通过HPLC纯化以除去未偶联的寡核苷酸。SDAD偶联的文库然后与用于如上
详述的富集的生物素化文库相比对于染色HER2+或HER2-FFPE组织进行定量。
[1150] 偶联的文库的结合在Ventana Discovery Ultra仪(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ)上在用于HER2+或HER2-组织的选择的相似条件下进行。对于各组织(HER2+或
HER2)的一组载玻片用R6文库、R0文库或无文库染色以评价特异性结合的水平。平行地，每
种条件的九个载玻片在用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Strept-HRP)检测前移除并在冰上
用手持式UV光以365nm在载玻片之上2cm光交联10分钟。载玻片然后刮除到没有添加β-巯基
乙醇的QProteome缓冲液(Qiagen)中并按照制造商的说明进行提取。清洁剂用HiPPR清洁剂
清除柱(Thermo Fisher Scientific)除去且蛋白质浓度然后用BCA分析测定。交联的蛋白
质-适体复合物然后通过在室温下与10μL的 MyOneTM链霉亲和素C1(Thermo
Scientific)孵育30min从200μg的FFPE组织裂解产物亲和纯化，用1X TBS洗涤两次，用高严
格性洗涤缓冲液(10mM Tris，2M NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100)洗涤两次，接着用低严格性洗涤缓冲液洗涤两次以除去NaCl，重悬浮于1X PBS中并通过在具有还原剂的1X月桂基
十二烷基硫酸盐(LDS)中煮沸来洗脱。还原样品使得交联剂从适体转移到蛋白质靶标。还原
的样品在4-12％SDS-PAGE凝胶中在还原条件下以150伏特运行15min。切割整个泳道并进行
凝胶内胰蛋白酶消化。使用碘乙酰胺的烷基化用Iodoacetyl Tandem Mass TagTM(iodoTMT；
Thermo Fisher Scientific)替代以促进通过LC-MS/MS鉴别交联的靶标。
HER2)的一组载玻片用R6文库、R0文库或无文库染色以评价特异性结合的水平。平行地，每
种条件的九个载玻片在用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Strept-HRP)检测前移除并在冰上
用手持式UV光以365nm在载玻片之上2cm光交联10分钟。载玻片然后刮除到没有添加β-巯基
乙醇的QProteome缓冲液(Qiagen)中并按照制造商的说明进行提取。清洁剂用HiPPR清洁剂
清除柱(Thermo Fisher Scientific)除去且蛋白质浓度然后用BCA分析测定。交联的蛋白
质-适体复合物然后通过在室温下与10μL的 MyOneTM链霉亲和素C1(Thermo
Scientific)孵育30min从200μg的FFPE组织裂解产物亲和纯化，用1X TBS洗涤两次，用高严
格性洗涤缓冲液(10mM Tris，2M NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100)洗涤两次，接着用低严格性洗涤缓冲液洗涤两次以除去NaCl，重悬浮于1X PBS中并通过在具有还原剂的1X月桂基
十二烷基硫酸盐(LDS)中煮沸来洗脱。还原样品使得交联剂从适体转移到蛋白质靶标。还原
的样品在4-12％SDS-PAGE凝胶中在还原条件下以150伏特运行15min。切割整个泳道并进行
凝胶内胰蛋白酶消化。使用碘乙酰胺的烷基化用Iodoacetyl Tandem Mass TagTM(iodoTMT；
Thermo Fisher Scientific)替代以促进通过LC-MS/MS鉴别交联的靶标。
[1151] 一个HER2+病例的结果显示于表28中。这些结果被过滤以除去也与未富集的R0文库交联的蛋白质。与R0文库的背景结合表现为在细胞核中是最普遍的。该表表明是否鉴别
的蛋白质报告为与HER2或乳腺癌(BrCa)或临床试验(对于任何适应症)相关，或者已经被使
用或建议为用于任何适应症的药物靶标。参考文献注于括号中。
的蛋白质报告为与HER2或乳腺癌(BrCa)或临床试验(对于任何适应症)相关，或者已经被使
用或建议为用于任何适应症的药物靶标。参考文献注于括号中。
[1152] 表28：对于一个R2+组织样品鉴别的R6的靶标
[1153]
[1154]
[1155] 表28中的参考文献：
[1156] [1]Jeong等，PMCA2 regulates HER2 protein kinase localization and signaling and promotes HER2-mediated breast cancer，PNAS，E282-E290(pub’d
online Jan 4，2016).
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2)：223-8.
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[1158] [3]Liu等，Comprehensive Proteomics Analysis Reveals Metabolic Reprogramming of Tumor-Associated Macrophages Stimulated by the Tumor
Microenvironment.J Proteome Res.2017 Jan 6；16(1)：288-297.
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(2014)5，e1540
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[1160] [5]Pan等，ATP synthase ecto-α-subunit：a novel therapeutic target for breast cancer，Journal of Translational Medicine 2011，9：211
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(Plenty of SH3s)protein.J Biol Chem.2012 Jan 13；287(3)：2247-56.
(Plenty of SH3s)protein.J Biol Chem.2012 Jan 13；287(3)：2247-56.
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[1166] [11]Wang和Guda.Integrative exploration of genomic profiles for triple negative breast cancer identifies potential drug targets.Medicine(Baltimore)
.2016 Jul；95(30)：e4321.
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2015.
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11；17(3)：799-808.
11；17(3)：799-808.
[1169] 这一实施例提供了其中寡核苷酸探针可以使用组织样品输入鉴别的途径。所得寡核苷酸可用于鉴定HER2+组织样品和区分HER2-组织。这一途径的总体应用基因包括但不限
于鉴定预测生物标志物和鉴定药物靶标。在这一特定情况中，鉴定了指示侵袭性表型(即，
HER2+肿瘤已知是侵袭性的)但可以被抗-HER2治疗靶向的寡核苷酸探针。我们也鉴定了
HER2+乳腺癌样品中R6文库的特定靶标且特别地鉴定几种药物靶标。此外，寡核苷酸本身可
用于靶向这些蛋白质，且因此在它们鉴定药物靶标的同时包含药物候选物。
于鉴定预测生物标志物和鉴定药物靶标。在这一特定情况中，鉴定了指示侵袭性表型(即，
HER2+肿瘤已知是侵袭性的)但可以被抗-HER2治疗靶向的寡核苷酸探针。我们也鉴定了
HER2+乳腺癌样品中R6文库的特定靶标且特别地鉴定几种药物靶标。此外，寡核苷酸本身可
用于靶向这些蛋白质，且因此在它们鉴定药物靶标的同时包含药物候选物。
[1170] 这一实施例中的这一途径可用于任何其它适宜生物标志物。
[1171] 实施例20：组织样品上的寡核苷酸富集以鉴定药物响应者
[1172] 这一实施例遵循以上实施例19中给出的工作。任务是开发能够区分对曲妥珠单抗治疗有反应或无反应的乳腺癌(BCa)患者的寡核苷酸文库。虽然通常与各种化疗剂一起施
用，单独的曲妥珠单抗在过表达HER2(如通过IHC分析测定的)的一些患者(＜20％)中显示
出功效。为这一实施例的目的，响应者和非响应者是基于作为响应的代理的各患者的下次
治疗时间(“TNT”或“TTNT”)。图16A显示BCa的治疗方案以及响应者和非响应者之间随时间的区分。如所示的，非响应者在曲妥珠单抗治疗开始的六个月内用另一化疗治疗进行治疗。
所得的寡核苷酸可用于预测反应和对适当患者群体的直接治疗。
用，单独的曲妥珠单抗在过表达HER2(如通过IHC分析测定的)的一些患者(＜20％)中显示
出功效。为这一实施例的目的，响应者和非响应者是基于作为响应的代理的各患者的下次
治疗时间(“TNT”或“TTNT”)。图16A显示BCa的治疗方案以及响应者和非响应者之间随时间的区分。如所示的，非响应者在曲妥珠单抗治疗开始的六个月内用另一化疗治疗进行治疗。
所得的寡核苷酸可用于预测反应和对适当患者群体的直接治疗。
[1173] 方法类似于以上实施例19中描述的方法。用于原始F-trin-35文库的富集的总体方案显示于图16B中(AL＝适体文库)。在图中，响应者显示为对于选择是正向样品，但富集
与对于选择是正向样品的非响应者类似地进行。进行六轮富集。获得17个富集的寡核苷酸
文库，其中八个文库针对非响应者训练和九个文库针对响应者训练。17个文库称为文库A-
S。
与对于选择是正向样品的非响应者类似地进行。进行六轮富集。获得17个富集的寡核苷酸
文库，其中八个文库针对非响应者训练和九个文库针对响应者训练。17个文库称为文库A-
S。
[1174] 文库在20个非响应者和20个响应者的集合上训练。给定这一患者群组，响应者定义为用曲妥珠单抗治疗212天或以上的患者且非响应者定义为用曲妥珠单抗治疗8-119天
的那些患者。图16C显示非响应者和响应者样品使用通过染色强度分选的寡核苷酸探针文
库A的染色。如可以在图中观察到的，染色在非响应者样品中更普遍。总结训练样品染色的
结果，非响应者选择文库A和响应者选择文库M显示于图16D中。文库A中100000个最普遍的
序列的可变区在本文中作为SEQ ID NO.3062-103061包括，其按照普遍性排序。文库M中
100000个最普遍的序列的可变区在本文中作为SEQ ID NO.103062-203061包括，其也按照
普遍性排序。单独地对于各文库生成ROC曲线，且组合的A&M文库显示于图16E中。综合性能
使用逻辑回归确定。没有足够的载玻片的几个非响应者样品从这些数据除去。如图16E中所
示，训练文库A和文库M对于区分响应者和非响应者样品具有优异的性能。作为对照，文库A
用于染色来自未用曲妥珠单抗治疗的乳腺癌病例的载玻片。没有观察到差异的染色模式
(数据未显示)。图16F显示使用训练的文库分类具有如所示的显著AUC值的两个小的测试集
的结果。综合AUC是0.78，其指示了临床效用。
的那些患者。图16C显示非响应者和响应者样品使用通过染色强度分选的寡核苷酸探针文
库A的染色。如可以在图中观察到的，染色在非响应者样品中更普遍。总结训练样品染色的
结果，非响应者选择文库A和响应者选择文库M显示于图16D中。文库A中100000个最普遍的
序列的可变区在本文中作为SEQ ID NO.3062-103061包括，其按照普遍性排序。文库M中
100000个最普遍的序列的可变区在本文中作为SEQ ID NO.103062-203061包括，其也按照
普遍性排序。单独地对于各文库生成ROC曲线，且组合的A&M文库显示于图16E中。综合性能
使用逻辑回归确定。没有足够的载玻片的几个非响应者样品从这些数据除去。如图16E中所
示，训练文库A和文库M对于区分响应者和非响应者样品具有优异的性能。作为对照，文库A
用于染色来自未用曲妥珠单抗治疗的乳腺癌病例的载玻片。没有观察到差异的染色模式
(数据未显示)。图16F显示使用训练的文库分类具有如所示的显著AUC值的两个小的测试集
的结果。综合AUC是0.78，其指示了临床效用。
[1175] 因此，寡核苷酸探针文库可用于鉴定曲妥珠单抗响应者组织而不仅仅是按照目前可用的伴随诊断鉴定的HER2+组织。
[1176] 如在以上实施例19中，鉴定了负责对曲妥珠单抗的反应(或缺乏反应)且可用于开发更有效的治疗的靶标。
[1177] 实施例21：多配体谱分析(polyligand profiling)根据其治疗益处区分癌症患者
[1178] 对于特定治疗的患者反应取决于肿瘤系统状态中可能难以达到的细微差异。高度多重复用的测量技术对于评价这些扰动可能是有利的。在这一实施例中，我们使用利用本
文所述的寡核苷酸探针文库的多配体谱分析来进行这种分析。我们产生两个单链寡脱氧核
苷酸探针文库，其区分来自取得或未取得基于曲妥珠单抗的方案的益处的乳腺癌患者的肿
瘤组织。独立样品集的测试证实了该文库区分患者的能力，如与通过计算与标准HER2-免疫
组织化学评分相比的来自曲线ROC的AUC值而评价的。Kaplan-Meier图确认其结果符合测试
结果：测试阳性患者具有604天的中位曲妥珠单抗治疗持续时间，而测试阴性患者具有129
天的中位曲妥珠单抗治疗持续时间。因此，这一实施例证明多配体谱分析用于分类不同的
临床后果。
文所述的寡核苷酸探针文库的多配体谱分析来进行这种分析。我们产生两个单链寡脱氧核
苷酸探针文库，其区分来自取得或未取得基于曲妥珠单抗的方案的益处的乳腺癌患者的肿
瘤组织。独立样品集的测试证实了该文库区分患者的能力，如与通过计算与标准HER2-免疫
组织化学评分相比的来自曲线ROC的AUC值而评价的。Kaplan-Meier图确认其结果符合测试
结果：测试阳性患者具有604天的中位曲妥珠单抗治疗持续时间，而测试阴性患者具有129
天的中位曲妥珠单抗治疗持续时间。因此，这一实施例证明多配体谱分析用于分类不同的
临床后果。
[1179] 精准肿瘤学寻求使单个癌症患者的治疗适应于各种肿瘤的特定的突变和独特的分子相互作用网络。基础分子印记的基因组复杂性和异质性是巨大的且各种肿瘤可以具有
其独特的特征，甚至在相同的患者内(1-3)。受益于特定治疗方案的患者在仅单一或少数生
物标志物的表达状态之外的特征方面通常与不受益于特定治疗方案的那些患者不同。因
此，精准肿瘤学的当前范例依赖于三个主要支柱：第一，患者的肿瘤中通过DNA/RNA测序鉴
定突变；第二，肿瘤组织中已知生物标志物的定量；第三，新生物标志物和主调节子基因的
鉴定。但是，基于几种最近临床试验的有限成功，精准肿瘤学的前景和潜能最近受到挑战
(4，5)。因此，限制已经变得明显且要求模式转变以帮助鉴别受益或不受益于特定癌症治疗
的患者(6-8)和开发改善的伴随诊断测试(CDx)(9)。因为单一或少数生物标志物可能不总
是充分地预测治疗益处，在这些情况中更有效的CDx同时访问作为药物反应的极其复杂的
和目前大多不可预测的表型的基础的众多错综复杂的分子特征。访问通过肿瘤异质性和由
肿瘤细胞诱导的肿瘤微环境的变化赋予的表型多样性可能需要鉴定基础分子相互作用网
络的细微变异，或者相互作用组(其复杂性估计由几十万或甚至数百万的多分子复合物组
成)(10)。这样的鉴定可能受益于无偏的、无假设途径以访问信息性的和高度复杂的分子特
征，一种可能需要相等或更大数目的潜在检测分子的挑战。
其独特的特征，甚至在相同的患者内(1-3)。受益于特定治疗方案的患者在仅单一或少数生
物标志物的表达状态之外的特征方面通常与不受益于特定治疗方案的那些患者不同。因
此，精准肿瘤学的当前范例依赖于三个主要支柱：第一，患者的肿瘤中通过DNA/RNA测序鉴
定突变；第二，肿瘤组织中已知生物标志物的定量；第三，新生物标志物和主调节子基因的
鉴定。但是，基于几种最近临床试验的有限成功，精准肿瘤学的前景和潜能最近受到挑战
(4，5)。因此，限制已经变得明显且要求模式转变以帮助鉴别受益或不受益于特定癌症治疗
的患者(6-8)和开发改善的伴随诊断测试(CDx)(9)。因为单一或少数生物标志物可能不总
是充分地预测治疗益处，在这些情况中更有效的CDx同时访问作为药物反应的极其复杂的
和目前大多不可预测的表型的基础的众多错综复杂的分子特征。访问通过肿瘤异质性和由
肿瘤细胞诱导的肿瘤微环境的变化赋予的表型多样性可能需要鉴定基础分子相互作用网
络的细微变异，或者相互作用组(其复杂性估计由几十万或甚至数百万的多分子复合物组
成)(10)。这样的鉴定可能受益于无偏的、无假设途径以访问信息性的和高度复杂的分子特
征，一种可能需要相等或更大数目的潜在检测分子的挑战。
[1180] 我们在此报告了实现这一综合目标的一种途径：多配体谱分析。在这一实施例中，我们评价了多配体谱分析区分的取得或未取得特定癌症治疗的益处的患者(其也可以分别
称为响应者或非响应者)的能力。我们然后比较多配体谱分析与HER2的免疫组织化学(IHC)
分析(最成功的和广泛应用的CDx之一)。Her2在15-35％的人乳腺癌中过表达(11，12)。因为
HER2扩增与增加的肿瘤细胞增殖和不良预后相关。患有HER2阳性(HER2+)乳腺癌的患者是
曲妥珠单抗治疗的候选者。但是，仅30％的患有HER2+乳腺癌的患者受益于曲妥珠单抗单一
疗法(13)。曲妥珠单抗(赫赛汀)是结合人上皮生长因子受体2(HER2，ErbB2)且抑制其功能
的单克隆抗体(14-16)。
称为响应者或非响应者)的能力。我们然后比较多配体谱分析与HER2的免疫组织化学(IHC)
分析(最成功的和广泛应用的CDx之一)。Her2在15-35％的人乳腺癌中过表达(11，12)。因为
HER2扩增与增加的肿瘤细胞增殖和不良预后相关。患有HER2阳性(HER2+)乳腺癌的患者是
曲妥珠单抗治疗的候选者。但是，仅30％的患有HER2+乳腺癌的患者受益于曲妥珠单抗单一
疗法(13)。曲妥珠单抗(赫赛汀)是结合人上皮生长因子受体2(HER2，ErbB2)且抑制其功能
的单克隆抗体(14-16)。
[1181] 用于这一实施例中描述的实验的材料和方法提供于以下实施例22中。包括在这一实施例中的患者的临床信息提供在表29-32中。在表格中，“CPP”代表环磷酰胺。所有样品是乳腺癌。
[1182] 表29：患者信息：针对非受益者(NB)训练
[1183]
[1184]
[1185]
[1186] 表30：患者信息：针对受益者(B)训练
[1187]
[1188]
[1189]
[1190]
[1191] 表31：患者信息：测试赫塞汀TTNT
[1192]
[1193]
[1194]
[1195]
[1196]
[1197] 表32：患者信息：测试铂/紫杉烷TTNT
[1198]
[1199]
[1200]
[1201]
[1202] 在这一实施例中，我们使1013个独特的单链DNA寡脱氧核苷酸(ssODNs；其在本文中也可以称为适体或寡核苷酸探针)的文库(17，18)针对优先结合福尔马林固体和石蜡包埋
的(FFPE)肿瘤组织切片(其来自取得或未取得包含曲妥珠单抗的方案的益处的乳腺癌患
者)的序列的亚集进行几轮原位正向和负向选择。我们将这一过程称作文库训练，各患者的
下一治疗时间(TTNT)，即直到基于曲妥珠单抗的治疗改变时过去的时间，定义了患者是否
属于取得包含曲妥珠单抗的方案的益处的组(B)或属于未取得包含曲妥珠单抗的方案的益
处的组(NB)(19)。通过TTNT定义治疗益处(B)和无益处(NB)与当前公布的FDA指南一致
(20)。为文库训练的目的，TTNT大于180天的病例被认为是B和TTNT小于180天的病例被认为
是NB。总之，8个NB病例(参见表29)和9个B病例(参见表30)用于17个不同文库的训练。其中
具有两个最佳表现的训练文库，TL-B和TL-NB(表29-30中的“富集病例ID”)，其用于产生区
分B与NB患者的基于多配体谱分析的预测分析。
的(FFPE)肿瘤组织切片(其来自取得或未取得包含曲妥珠单抗的方案的益处的乳腺癌患
者)的序列的亚集进行几轮原位正向和负向选择。我们将这一过程称作文库训练，各患者的
下一治疗时间(TTNT)，即直到基于曲妥珠单抗的治疗改变时过去的时间，定义了患者是否
属于取得包含曲妥珠单抗的方案的益处的组(B)或属于未取得包含曲妥珠单抗的方案的益
处的组(NB)(19)。通过TTNT定义治疗益处(B)和无益处(NB)与当前公布的FDA指南一致
(20)。为文库训练的目的，TTNT大于180天的病例被认为是B和TTNT小于180天的病例被认为
是NB。总之，8个NB病例(参见表29)和9个B病例(参见表30)用于17个不同文库的训练。其中
具有两个最佳表现的训练文库，TL-B和TL-NB(表29-30中的“富集病例ID”)，其用于产生区
分B与NB患者的基于多配体谱分析的预测分析。
[1203] 图17A-B显示患者选择的基本原理(图17A)和ssODN文库的训练和测试过程的工作流程，包括各步骤中使用的病例数(图17B)。包括在这一过程中的各个患者的临床信息，如
肿瘤解剖学位点、治疗、激素状态等，提供在表29-32中。起始文库使用一个NB病例(1-6轮)
进行正向选择和使用两个B病例(4-6轮)进行负向选择以产生TL-NB，且反过来用于产生TL-
B。在表29-30中，病例分成三元组。例如，正向选择使用NB病例TL-NB+进行，和相同富集中的负向选择使用恰好在以下鉴定为TL-NB-和TL-NB-的两个B病例进行。选择方案和实验方案
的进一步细节参见图17C和实施例22。测试结果是基于来自独立于用于训练的那些病例的
病例的FFPE载玻片的多配体-组织化学(“PHC”)染色。用于训练和测试的所有组织样品在治
疗之前收集以确保文库训练独立于作为治疗的结果发生的肿瘤组织的分子变化。
肿瘤解剖学位点、治疗、激素状态等，提供在表29-32中。起始文库使用一个NB病例(1-6轮)
进行正向选择和使用两个B病例(4-6轮)进行负向选择以产生TL-NB，且反过来用于产生TL-
B。在表29-30中，病例分成三元组。例如，正向选择使用NB病例TL-NB+进行，和相同富集中的负向选择使用恰好在以下鉴定为TL-NB-和TL-NB-的两个B病例进行。选择方案和实验方案
的进一步细节参见图17C和实施例22。测试结果是基于来自独立于用于训练的那些病例的
病例的FFPE载玻片的多配体-组织化学(“PHC”)染色。用于训练和测试的所有组织样品在治
疗之前收集以确保文库训练独立于作为治疗的结果发生的肿瘤组织的分子变化。
[1204] 图17C提供了ssODN文库训练的过程的概述。图17Ci概括了对于鉴定非受益(NB)病例的文库的正向训练步骤：(i)ssODN文库与NB组织一起孵育；(ii)除去未结合的序列；
(iii)解剖肿瘤组织和回收对于NB癌症组织特异性的序列的亚集。SN：上清液。回收的ssODN
通过PCR扩增，转化为ssODN并用于下一训练轮。左侧的载玻片图像显示组织外观：载玻片1)
NB组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘轮廓)；载玻片2)在分割后解剖前
的核固红(NFR)染色组织；载玻片3)在具有结合的ssODN的癌症组织解剖后的剩余正常组
织。图17Cii概括了对于受益(B)病例的具有另外的反选择步骤的训练步骤：(i)ssODN文库
与1st B组织一起孵育；(ii)来自(i)的上清液与2nd B病例一起孵育；(iii)来自(ii)的上
清液与来自A的NB病例一起孵育；(iv)和(v)对应于A中的步骤(ii)和(iii)。左侧的载玻片
图像显示组织外观：载玻片4)1st B组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘
轮廓)；载玻片5)2nd B组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘轮廓)；载玻片
2和3与图17Ci中相同。图17Ciii概括了整个ssODN文库训练，其如图17Ci中所示由三个训练
轮(标示“i)”)构成；接着如图17Cii中所示的三个训练轮(标示“ii)”)。图17Di显示来自在使用未训练文库的选择(第0轮)过程中使用的NB病例的组织的染色，其与训练的TL-NB文库
(第6轮；上图：4×，下图：20×)比较。图17Dii显示来自未在使用未训练文库的选择(第0轮)
过程中使用的NB病例的组织的染色，其文库训练的TL-NB(第6轮；上图：4×，下图：20×)比
较。图17Diii显示来自在使用来自第3轮(左侧)的输出ssODN的TL-NB的训练中用于反选择
的响应者病例的组织的染色，其与来自第5轮(右侧)的输出ssODN比较。
(iii)解剖肿瘤组织和回收对于NB癌症组织特异性的序列的亚集。SN：上清液。回收的ssODN
通过PCR扩增，转化为ssODN并用于下一训练轮。左侧的载玻片图像显示组织外观：载玻片1)
NB组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘轮廓)；载玻片2)在分割后解剖前
的核固红(NFR)染色组织；载玻片3)在具有结合的ssODN的癌症组织解剖后的剩余正常组
织。图17Cii概括了对于受益(B)病例的具有另外的反选择步骤的训练步骤：(i)ssODN文库
与1st B组织一起孵育；(ii)来自(i)的上清液与2nd B病例一起孵育；(iii)来自(ii)的上
清液与来自A的NB病例一起孵育；(iv)和(v)对应于A中的步骤(ii)和(iii)。左侧的载玻片
图像显示组织外观：载玻片4)1st B组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘
轮廓)；载玻片5)2nd B组织的苏木精和曙红(H&E)染色(肿瘤区域以绿色描绘轮廓)；载玻片
2和3与图17Ci中相同。图17Ciii概括了整个ssODN文库训练，其如图17Ci中所示由三个训练
轮(标示“i)”)构成；接着如图17Cii中所示的三个训练轮(标示“ii)”)。图17Di显示来自在使用未训练文库的选择(第0轮)过程中使用的NB病例的组织的染色，其与训练的TL-NB文库
(第6轮；上图：4×，下图：20×)比较。图17Dii显示来自未在使用未训练文库的选择(第0轮)
过程中使用的NB病例的组织的染色，其文库训练的TL-NB(第6轮；上图：4×，下图：20×)比
较。图17Diii显示来自在使用来自第3轮(左侧)的输出ssODN的TL-NB的训练中用于反选择
的响应者病例的组织的染色，其与来自第5轮(右侧)的输出ssODN比较。
[1205] 更详细地，用于非受益患者TL-NB的训练文库通过将起始文库直接与来自曲妥珠单抗NB-患者的FFPE-固定的乳腺肿瘤组织一起孵育获得。在一小时孵育(步骤i)后，非结合
ssODN通过洗涤除去(步骤ii)，接着从正常相邻组织切割肿瘤组织(步骤iii)及与切割的肿
瘤组织结合的ssODN的非对称PCR扩增。参见图17Ci和实施例22。这些正向选择步骤在相同
病例的系列组织切片上进行总共三次(1-3轮：图17Ci，iii)。来自第三轮富集的ssODN-文库
然后通过与来自两个曲妥珠单抗B-患者的FFPE组织一起孵育进行两个连续的反选择步骤。
来自第二反选择步骤的上清液，即耗尽与结合B-肿瘤组织相关的ssODN的文库，转移到来自
原始NB-患者的肿瘤的新的组织切片用于一个如上所述的最终的正向选择步骤，且结合的
ssODN的亚集被PCR-扩增(图17Cii)。负向-负向-正向步骤进行总共三次(SELEX 4-6轮；图
17Ciii)。未选择的文库的染色强度与用于选择的NB病例上的第6轮TL-NB文库的染色强度
的比较显示富集的文库的染色显著增加(图17Di，第6轮)，而对于未选择的文库没有观察到
染色或观察到弱染色(图17Di，第0轮)。类似的染色在未用于文库训练的单独NB病例上观察
到(图17Dii)。非出人意料地，染色强度在来自第3轮的PCR-扩增文库(反选择之前的富集文
库)应用于B病例时也是高的(图17Diii，左图)。但是，在第5轮后，对于应用于相同B病例的
TL-NB观察到染色强度的明显降低，表明反选择步骤是有效的(图17Diii，右图)。因此，TL-
NB在NB组织上显示高染色强度，而它以相当弱的强度染色用于反选择的B-病例。TL-NB因此
适合于独立测试集的PHC染色。
ssODN通过洗涤除去(步骤ii)，接着从正常相邻组织切割肿瘤组织(步骤iii)及与切割的肿
瘤组织结合的ssODN的非对称PCR扩增。参见图17Ci和实施例22。这些正向选择步骤在相同
病例的系列组织切片上进行总共三次(1-3轮：图17Ci，iii)。来自第三轮富集的ssODN-文库
然后通过与来自两个曲妥珠单抗B-患者的FFPE组织一起孵育进行两个连续的反选择步骤。
来自第二反选择步骤的上清液，即耗尽与结合B-肿瘤组织相关的ssODN的文库，转移到来自
原始NB-患者的肿瘤的新的组织切片用于一个如上所述的最终的正向选择步骤，且结合的
ssODN的亚集被PCR-扩增(图17Cii)。负向-负向-正向步骤进行总共三次(SELEX 4-6轮；图
17Ciii)。未选择的文库的染色强度与用于选择的NB病例上的第6轮TL-NB文库的染色强度
的比较显示富集的文库的染色显著增加(图17Di，第6轮)，而对于未选择的文库没有观察到
染色或观察到弱染色(图17Di，第0轮)。类似的染色在未用于文库训练的单独NB病例上观察
到(图17Dii)。非出人意料地，染色强度在来自第3轮的PCR-扩增文库(反选择之前的富集文
库)应用于B病例时也是高的(图17Diii，左图)。但是，在第5轮后，对于应用于相同B病例的
TL-NB观察到染色强度的明显降低，表明反选择步骤是有效的(图17Diii，右图)。因此，TL-
NB在NB组织上显示高染色强度，而它以相当弱的强度染色用于反选择的B-病例。TL-NB因此
适合于独立测试集的PHC染色。
[1206] 为测试是否我们也可以对于优先染色B-病例的ssODN集合来训练随机文库，我们使用用于正向的B-病例和用于反选择的NB-病例以相反的方向完成单独的富集过程。所得
的训练文库，TL-B，与NB-病例或未训练的起始文库相比显示优先的B-病例染色。图17E显示
B和NB组织上文库TL-B的染色。图17Ei显示来自未在未训练文库(第0轮)的选择过程中使用
的B-病例的组织的染色，与训练的文库TL-B(第6轮；上图：4×，下图：20×)比较。图17Eii显示使用在第4轮受益病例(B)上富集的文库通过多配体-组织化学(PHC)的未取得基于曲妥
珠单抗的方案的益处的患者(NB)的组织的染色，其与第6轮后的TL-B比较。
的训练文库，TL-B，与NB-病例或未训练的起始文库相比显示优先的B-病例染色。图17E显示
B和NB组织上文库TL-B的染色。图17Ei显示来自未在未训练文库(第0轮)的选择过程中使用
的B-病例的组织的染色，与训练的文库TL-B(第6轮；上图：4×，下图：20×)比较。图17Eii显示使用在第4轮受益病例(B)上富集的文库通过多配体-组织化学(PHC)的未取得基于曲妥
珠单抗的方案的益处的患者(NB)的组织的染色，其与第6轮后的TL-B比较。
[1207] 总的说来，对于TL-NB和TL-B观察到的PHC染色特征表明足够的选择压力和针对其靶向表型的成功的富集。NB选择富集(文库TL-NB)中100000个最普遍的序列的可变区在本
文中包括为SEQ ID NO.3062-103061，按普遍性排序。B选择富集(文库TL-B)中100000个最
普遍的序列的可变区在本文中包括为SEQ ID NO.103062-203061，也按普遍性排序。
文中包括为SEQ ID NO.3062-103061，按普遍性排序。B选择富集(文库TL-B)中100000个最
普遍的序列的可变区在本文中包括为SEQ ID NO.103062-203061，也按普遍性排序。
[1208] 为评估TL-NB和TL-B对独立于用于训练的那些的病例的性能，我们证实用训练文库获得的组织染色强度的组织学H-评分可以用于病例的定量比较，类似于IHC的标准病理
学实践(21)。胞质和核染色两者的评分由对于患者结果不知情的通过职业验证的病理学家
进行。实验方案在图17F-H和实施例22中找到且评分结果显示于表33-36中。乳腺癌FFPE组
织的胞质和核中范围为0-3的PHC染色强度水平的实例显示于图17F中。也参见图17I-J，其
显示非富集起始文库(R0)及在含曲妥珠单抗治疗的未受益患者(NB)和受益患者(B)上富集
的文库TL-NB和TL-B的多配体组织化学(PHC)染色特征比较。观察区域在各图内文库之间的
各行中匹配。文库R0通常表现出很少或没有染色，而富集的文库评分为1+至3+。文库TL-NB，其针对曲妥珠单抗非受益病例富集，在NB病例上表现出较高强度，除了NB-15。文库TL-B，其针对曲妥珠单抗响应者病例富集，在B病例上表现出较高强度。图17I-J中的放大率是20x。
组织学评分按照标准方法通过测定整个组织上分类为落入胞质和核中的各PHC强度水平内
的细胞百分比来计算。参见图17G和实施例22。为评估染色和评分再现性，我们选择对于TL-
NB显示弱和强染色的病例和然后在技术重复(图17H，第一图：“批内”)、不同操作者(图17H，第二图：“操作者间”)、不同文库批次(图17H，第三图：“批间”)和不同仪器(图17H，第四图：
“仪器间”)之间评分核染色(22)。四个强和弱染色的病例的分类是一致的和在这些变量中
是独立的，表明染色和评分是可再现的。为进一步评价TL-NB和TL-B的PCR扩增形式的技术
再现性，两个文库扩增最多十个PCR-代。参见图17K-L，其显示从不同PCR-代1-5(图17K)和
6-10(图17L)获得的文库TL-NB和TL-B的技术再现性。经20x放大率显示了两个不同病例
(Her2+和Her2-/低)的实例。对于各个PCR代，等份(0.4ng)的各文库代扩增10个PCR循环。
TL-NB和TL-B的各PCR代然后用于来自相同NB患者(用于TL-NB)和相同B患者(用于TL-B)的
结缔组织切片的染色。TL-NB和TL-B的各PCR代用于来自相同NB患者(用于TL-NB)和相同B患
者(用于TL-B)的结缔组织切片的染色。在代之间没有观察到染色的显著差异，表明两个文
库在过度PCR扩增后的高度稳定的性能。
学实践(21)。胞质和核染色两者的评分由对于患者结果不知情的通过职业验证的病理学家
进行。实验方案在图17F-H和实施例22中找到且评分结果显示于表33-36中。乳腺癌FFPE组
织的胞质和核中范围为0-3的PHC染色强度水平的实例显示于图17F中。也参见图17I-J，其
显示非富集起始文库(R0)及在含曲妥珠单抗治疗的未受益患者(NB)和受益患者(B)上富集
的文库TL-NB和TL-B的多配体组织化学(PHC)染色特征比较。观察区域在各图内文库之间的
各行中匹配。文库R0通常表现出很少或没有染色，而富集的文库评分为1+至3+。文库TL-NB，其针对曲妥珠单抗非受益病例富集，在NB病例上表现出较高强度，除了NB-15。文库TL-B，其针对曲妥珠单抗响应者病例富集，在B病例上表现出较高强度。图17I-J中的放大率是20x。
组织学评分按照标准方法通过测定整个组织上分类为落入胞质和核中的各PHC强度水平内
的细胞百分比来计算。参见图17G和实施例22。为评估染色和评分再现性，我们选择对于TL-
NB显示弱和强染色的病例和然后在技术重复(图17H，第一图：“批内”)、不同操作者(图17H，第二图：“操作者间”)、不同文库批次(图17H，第三图：“批间”)和不同仪器(图17H，第四图：
“仪器间”)之间评分核染色(22)。四个强和弱染色的病例的分类是一致的和在这些变量中
是独立的，表明染色和评分是可再现的。为进一步评价TL-NB和TL-B的PCR扩增形式的技术
再现性，两个文库扩增最多十个PCR-代。参见图17K-L，其显示从不同PCR-代1-5(图17K)和
6-10(图17L)获得的文库TL-NB和TL-B的技术再现性。经20x放大率显示了两个不同病例
(Her2+和Her2-/低)的实例。对于各个PCR代，等份(0.4ng)的各文库代扩增10个PCR循环。
TL-NB和TL-B的各PCR代然后用于来自相同NB患者(用于TL-NB)和相同B患者(用于TL-B)的
结缔组织切片的染色。TL-NB和TL-B的各PCR代用于来自相同NB患者(用于TL-NB)和相同B患
者(用于TL-B)的结缔组织切片的染色。在代之间没有观察到染色的显著差异，表明两个文
库在过度PCR扩增后的高度稳定的性能。
[1209] 表33：组织学评分，TL-NB，曲妥珠单抗TTNT
[1210]
[1211]
[1212] 表34：组织学评分，TL-NB，铂/紫杉烷TTNT
[1213]
[1214]
[1215] 表35：组织学评分，TL-B，曲妥珠单抗TTNT
[1216]
[1217]
[1218] 表36：组织学评分，TL-B，铂/紫杉烷TTNT
[1219]
[1220]
[1221] 既然已经具有相互地显示对于B或NB病例的优先染色的两个文库，我们测试PHC评分在45个独立测试病例中用于区分和预测基于曲妥珠单抗的方案的响应者和非响应者的
用途。参见图17A。我们通过接受者操作特征(ROC)曲线评价TL-B和TL-NB的PHC评分，并计算
曲线下面积(AUC)值(图17Mi-ii)。对于TL-NB，0.703的AUC值基于核的评分获得(22)(图
17Mi)，而TL-B基于核和胞质两者的评分产生0.688的AUC值(图17Mii)。来自单个文库的这
些AUC值表明TL-NB和TL-B提供了区分NB和B表型的可靠信息。为利用使用TL-NB和TL-B染色
的PHC评分的多变量方法预测患者对基于曲妥珠单抗的方案的反应，开发了逻辑回归模型。
具体地，受益或非受益状态的双元结果用作因变量，分别TL-NB和TL-B的染色评分作为自变
量处理。我们然后通过ROC曲线分析评价模型的性能。结果，通过组合来自两个文库的数据，AUC-值增加至0.804，表明由于训练方案的互惠特性而导致的改善性能(图17Miii，通过AUC
＝0.804指示)。这一分析的统计学可靠性进一步通过10-倍交叉验证(CV)证实，其导致
0.760的AUC值(图17Miii，通过AUC＝0.760指示)。我们然后将这些PHC-基NB和B分类与通过
相同的45病例测试集的HER2免疫组织化学评分预测的分类比较(图17Miii，通过AUC＝
0.410指示)。HER2IHC结果产生0.410的AUC值，表明TL-NB和TL-B在分类这一群组中的曲妥
珠单抗B和NB病例方面强于常规HER2IHC。
用途。参见图17A。我们通过接受者操作特征(ROC)曲线评价TL-B和TL-NB的PHC评分，并计算
曲线下面积(AUC)值(图17Mi-ii)。对于TL-NB，0.703的AUC值基于核的评分获得(22)(图
17Mi)，而TL-B基于核和胞质两者的评分产生0.688的AUC值(图17Mii)。来自单个文库的这
些AUC值表明TL-NB和TL-B提供了区分NB和B表型的可靠信息。为利用使用TL-NB和TL-B染色
的PHC评分的多变量方法预测患者对基于曲妥珠单抗的方案的反应，开发了逻辑回归模型。
具体地，受益或非受益状态的双元结果用作因变量，分别TL-NB和TL-B的染色评分作为自变
量处理。我们然后通过ROC曲线分析评价模型的性能。结果，通过组合来自两个文库的数据，AUC-值增加至0.804，表明由于训练方案的互惠特性而导致的改善性能(图17Miii，通过AUC
＝0.804指示)。这一分析的统计学可靠性进一步通过10-倍交叉验证(CV)证实，其导致
0.760的AUC值(图17Miii，通过AUC＝0.760指示)。我们然后将这些PHC-基NB和B分类与通过
相同的45病例测试集的HER2免疫组织化学评分预测的分类比较(图17Miii，通过AUC＝
0.410指示)。HER2IHC结果产生0.410的AUC值，表明TL-NB和TL-B在分类这一群组中的曲妥
珠单抗B和NB病例方面强于常规HER2IHC。
[1222] TL-NB和TL-B能够有效地通过具有0.8的AUC值的IHC分类具有低HER2-表达水平的B和NB患者。图17N显示用于使用来自45病例的测试集的文库TL NB和TL B多配体组织化学
(PHC)染色的综合组织学评分区分受益和非受益基于曲妥珠单抗的方案的患者的接受者操
作特征(ROC)曲线，单独地显示于HER2+病例组(A)中和HER2-/低病例组(B)。因此，文库区分
NB与B-病例的能力不仅仅依赖于HER2状态。
(PHC)染色的综合组织学评分区分受益和非受益基于曲妥珠单抗的方案的患者的接受者操
作特征(ROC)曲线，单独地显示于HER2+病例组(A)中和HER2-/低病例组(B)。因此，文库区分
NB与B-病例的能力不仅仅依赖于HER2状态。
[1223] 为确定是否TL-NB和TL-B揭示关于对基于曲妥珠单抗的方案的反应且不仅分类具有有利的预后的患者而无论曲妥珠单抗治疗，我们染色来自用铂/紫杉烷组合而无曲妥珠
单抗治疗的33名患者的独立群组的FFPE肿瘤组织。如同这一研究中的所有其它样品，来自
这一非曲妥珠单抗群组的样品在治疗前收集。组合文库对于独立于测试集的接受铂/紫杉
烷组合疗法而非曲妥珠单抗的33个HER2-病例的AUC是0.302(图17Miii，通过AUC＝0.302指
示)，表明TL-NB和TL-B的性能与确定对于治疗方案中曲妥珠单抗的存在的反应的分子谱相
关。此外，曲妥珠单抗已经报告为在雌激素受体(ER)-阳性乳腺癌中是显著无效的(23，24)，但我们发现加入我们的研究中的所有病例的ER状态没有显示与曲妥珠单抗基疗法的益处
的相关性。参见图17O，其显示在测试的群体中，曲妥珠单抗的益处不与激素状态相关。对于这一实施例中的患者的ER状态显示于表31-32中。总的说来，这些数据表明这些文库应用于
45-病例测试集以高精度分类具有含曲妥珠单抗的治疗的益处的患者与不具有益处的患
者，无论其HER2-状态。
单抗治疗的33名患者的独立群组的FFPE肿瘤组织。如同这一研究中的所有其它样品，来自
这一非曲妥珠单抗群组的样品在治疗前收集。组合文库对于独立于测试集的接受铂/紫杉
烷组合疗法而非曲妥珠单抗的33个HER2-病例的AUC是0.302(图17Miii，通过AUC＝0.302指
示)，表明TL-NB和TL-B的性能与确定对于治疗方案中曲妥珠单抗的存在的反应的分子谱相
关。此外，曲妥珠单抗已经报告为在雌激素受体(ER)-阳性乳腺癌中是显著无效的(23，24)，但我们发现加入我们的研究中的所有病例的ER状态没有显示与曲妥珠单抗基疗法的益处
的相关性。参见图17O，其显示在测试的群体中，曲妥珠单抗的益处不与激素状态相关。对于这一实施例中的患者的ER状态显示于表31-32中。总的说来，这些数据表明这些文库应用于
45-病例测试集以高精度分类具有含曲妥珠单抗的治疗的益处的患者与不具有益处的患
者，无论其HER2-状态。
[1224] 我们接着尝试评估PHC选择受益于基于曲妥珠单抗的方案超过180天的患者部分的能力。图17Pi-ii显示通过多配体谱分析分层的曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者的Kaplan-
Meier曲线。在图17Pi中，ROC曲线至点之间的最短距离(特异性和灵敏度＝100％)确定测试
阳性和阴性的截止值，且在图17Miii中表示为线上由AUC＝0.804指示的点(灵敏度：
66.6％；特异性：86.7％)。“事件”定义为患者从癌症死亡或基于曲妥珠单抗的治疗改变的时间点(天)。益处的中位时间对于测试阳性的患者是604天((图17Pi，上曲线)，n＝22，事件＝11)和对于测试阴性的的患者是129天((图17Pi，下曲线)，n＝23，事件＝18)。HR＝0.320，
95％CI：0.146-0.703，对数秩p＝0.003。小的垂直线标记由于治疗随访数据的不存在而删
掉的病例。参见表32。图17Pii显示通过肿瘤的HER2状态分层的曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患
者的Kaplan-Meier曲线。患者的HER2状态与HER2IHC和HER2ISH测试结果两者按照以下规则
确定。1.HER2阳性，如果任何测试显示阳性结果；否则2，HER2-/低，如果任何测试显示阴性结果；否则3，NA，如果两种测试显示等同的结果。益处的中位时间对于HER2阳性病例是250
天((图17Pii，下曲线n＝25，事件＝16)，和对于HER2-/低病例是369天((图17Pii，上曲线；n＝18，事件＝12)。HR＝1.39，95％CI：0.62-3.13；对数秩p＝0.418。因此，所得Kaplan-Meier曲线显示具有阳性测试结果的病例表现出比测试阴性的那些(图17Pi，下曲线)显著更长的
TTNT(图17Pi，上曲线)。中位无事件时间，即在治疗方案改变之前过去的时间，从测试阴性
的129天增加到阳性测试病例的604天。对于比较，我们基于肿瘤的HER2状态分析预后值，如
通过IHC确定的。在这一情况中，KM-曲线不揭示HER2+或Her2-/低的患者之间TTNT的任何显
著差异(图17Pii)。这些数据表明多配体谱分析可以用于产生区分受益于特定治疗方案的
患者与不受益的那些患者的预测分析。
Meier曲线。在图17Pi中，ROC曲线至点之间的最短距离(特异性和灵敏度＝100％)确定测试
阳性和阴性的截止值，且在图17Miii中表示为线上由AUC＝0.804指示的点(灵敏度：
66.6％；特异性：86.7％)。“事件”定义为患者从癌症死亡或基于曲妥珠单抗的治疗改变的时间点(天)。益处的中位时间对于测试阳性的患者是604天((图17Pi，上曲线)，n＝22，事件＝11)和对于测试阴性的的患者是129天((图17Pi，下曲线)，n＝23，事件＝18)。HR＝0.320，
95％CI：0.146-0.703，对数秩p＝0.003。小的垂直线标记由于治疗随访数据的不存在而删
掉的病例。参见表32。图17Pii显示通过肿瘤的HER2状态分层的曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患
者的Kaplan-Meier曲线。患者的HER2状态与HER2IHC和HER2ISH测试结果两者按照以下规则
确定。1.HER2阳性，如果任何测试显示阳性结果；否则2，HER2-/低，如果任何测试显示阴性结果；否则3，NA，如果两种测试显示等同的结果。益处的中位时间对于HER2阳性病例是250
天((图17Pii，下曲线n＝25，事件＝16)，和对于HER2-/低病例是369天((图17Pii，上曲线；n＝18，事件＝12)。HR＝1.39，95％CI：0.62-3.13；对数秩p＝0.418。因此，所得Kaplan-Meier曲线显示具有阳性测试结果的病例表现出比测试阴性的那些(图17Pi，下曲线)显著更长的
TTNT(图17Pi，上曲线)。中位无事件时间，即在治疗方案改变之前过去的时间，从测试阴性
的129天增加到阳性测试病例的604天。对于比较，我们基于肿瘤的HER2状态分析预后值，如
通过IHC确定的。在这一情况中，KM-曲线不揭示HER2+或Her2-/低的患者之间TTNT的任何显
著差异(图17Pii)。这些数据表明多配体谱分析可以用于产生区分受益于特定治疗方案的
患者与不受益的那些患者的预测分析。
[1225] 在这一实施例中，我们证明具有改善对于癌症疗法的患者分层的潜能的原型多配体谱分析途径。该途径应用于训练文库TL-B和TL-NB以通过TTNT分类曲妥珠单抗反应。多配
体谱分析不限于这一情况且可应用于根据手边的问题及合适样品的可得性区分广泛的表
型。之前的研究已经使用ssODN文库在癌症组织上的基于形态的富集(参见本文，参考文献
25，26)以鉴定新的生物标志物。在这一研究中，为考虑分子组成的异质性和反映肿瘤内和
肿瘤间变异性的复杂相互作用组，合理的是如此处引入的文库训练对于复杂多样的配体富
集。
体谱分析不限于这一情况且可应用于根据手边的问题及合适样品的可得性区分广泛的表
型。之前的研究已经使用ssODN文库在癌症组织上的基于形态的富集(参见本文，参考文献
25，26)以鉴定新的生物标志物。在这一研究中，为考虑分子组成的异质性和反映肿瘤内和
肿瘤间变异性的复杂相互作用组，合理的是如此处引入的文库训练对于复杂多样的配体富
集。
[1226] 在没有优化的情况下，这一实施例中开发的PHC-测试在区分这一群组中受益于基于曲妥珠单抗的治疗的患者与不受益的那些患者方面优于标准的HER2IHC。参见图17M，P及
以上的相关讨论。这些数据表明PHC-测试可以提供CDx，在这种情况中目标在于鉴定不受益
于曲妥珠单抗的50-70％的HER2+患者的一种。相反地，已经报告表达低水平Her2的16-45％
的乳腺癌患者取得联合化疗中的辅助曲妥珠单抗益处(27-29)。图17M，P中显示的数据表明
基于多配体谱分析的CDx也具有从表达低水平Her2的组鉴定受益于含曲妥珠单抗方案的患
者的潜能。
以上的相关讨论。这些数据表明PHC-测试可以提供CDx，在这种情况中目标在于鉴定不受益
于曲妥珠单抗的50-70％的HER2+患者的一种。相反地，已经报告表达低水平Her2的16-45％
的乳腺癌患者取得联合化疗中的辅助曲妥珠单抗益处(27-29)。图17M，P中显示的数据表明
基于多配体谱分析的CDx也具有从表达低水平Her2的组鉴定受益于含曲妥珠单抗方案的患
者的潜能。
[1227] 多配体谱分析允许访问通过构成肿瘤内或肿瘤间细胞相互作用组的极多样性的生物复合物内的扰动反映的分子信息。除了预测具有或不具有给定药物治疗方案的益处的
患者外，PHC途径可以以另外的方式促进精准肿瘤学。例如，当应用于现有疗法以及应用于
临床试验中的新化合物时，多配体谱分析可以减少无效的毒性疗法的施用，且由此可以提
高新药物的成功率。
患者外，PHC途径可以以另外的方式促进精准肿瘤学。例如，当应用于现有疗法以及应用于
临床试验中的新化合物时，多配体谱分析可以减少无效的毒性疗法的施用，且由此可以提
高新药物的成功率。
[1228] 在这一实施例中引用的文献，全部通过引用全文合并于此.
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[1247] 19.TTNT is a FDA-approved clinical endpoint that is robustly captured by electronic medical record systems and therefore is generally available.
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biologics.，http：//www.fda.gov/downloads/Drugs/.../Guidances/ucm071590.pdf
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carcinoma.Cancer 88，1378-1383(2000).
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[1250] 22.TL-NB staining of the cytoplasm was not informative for the differentiation of B and NB cases.
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breast cancers：progress with latest therapeutic strategies.Ther Adv Med Oncol
8，429-449(2016).
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trastuzumab.Cancer Res 73，1635-1646(2013).
trastuzumab.Cancer Res 73，1635-1646(2013).
[1257] 29.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01275677？term＝NSABP+B01275647&rank＝01275671.
[1258] 实施例22：多配体谱分析材料和方法
[1259] 这一实施例提供用于以上实施例21中的材料和方法。
[1260] FFPE组织情况
[1261] 研究由Western Institutional Review Board，45 CFR 46.101(b)(4)批准进行。
[1262] 这一研究包括来自在组织收集后接受基于曲妥珠单抗的一线治疗的患有侵入性乳腺癌的妇女的病例，其具有足够数目的适当固定和包埋的载玻片可得。具有原位癌、不当
固定的或压碎的组织切片的病例未包括在这一研究中。具有不完全染色(即，组织被结合溶
液不充分覆盖)和具有分析性能的其它技术问题的病例从分析中排除。
固定的或压碎的组织切片的病例未包括在这一研究中。具有不完全染色(即，组织被结合溶
液不充分覆盖)和具有分析性能的其它技术问题的病例从分析中排除。
[1263] 具有曲妥珠单抗治疗的下次治疗时间(TTNT)数据的51名乳腺癌患者的系列组织切片用于ssODN文库的训练及TL-NB和TL-B的测试。单独的具有来自铂-紫杉烷治疗的TTNT
数据的33个病例的组用作对照集以评估TL-NB和TL-B对于基于曲妥珠单抗的TTNT的特异
性。包含肿瘤和正常部分的切除的组织被福尔马林固定、石蜡包埋并系列切片(4μm)。苏木
精和曙红(H&E)染色对于每个病例的1-2个载玻片进行并用于初始病理诊断。在富集之前
FFPE组织载玻片的预处理包括在60℃下孵育载玻片1.5h，接着自动脱蜡和在Ventana
UltraView Autostainer(Ventana Medical Systems，Inc.，Tuscon，AZ)上表位修复。具体
地，在72℃下脱蜡24min，通过乙醇脱水，在90℃下36min和在100℃下4min(pH 8)进行表位
修复，接着过氧化物酶抑制(H2O2，1％≤x＜5％)和用清洁剂(Dawn 1-00；P&G
Professional，The Procter&Gamble Company，Cincinnati，OH)洗涤载玻片以除去残留液
体盖玻片。对于富集文库的测试，通过在60℃下孵育1.5小时手动进行脱蜡，接着在PT-
Linker(Dako，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上97℃下20min，pH 9进行表位修
复。
数据的33个病例的组用作对照集以评估TL-NB和TL-B对于基于曲妥珠单抗的TTNT的特异
性。包含肿瘤和正常部分的切除的组织被福尔马林固定、石蜡包埋并系列切片(4μm)。苏木
精和曙红(H&E)染色对于每个病例的1-2个载玻片进行并用于初始病理诊断。在富集之前
FFPE组织载玻片的预处理包括在60℃下孵育载玻片1.5h，接着自动脱蜡和在Ventana
UltraView Autostainer(Ventana Medical Systems，Inc.，Tuscon，AZ)上表位修复。具体
地，在72℃下脱蜡24min，通过乙醇脱水，在90℃下36min和在100℃下4min(pH 8)进行表位
修复，接着过氧化物酶抑制(H2O2，1％≤x＜5％)和用清洁剂(Dawn 1-00；P&G
Professional，The Procter&Gamble Company，Cincinnati，OH)洗涤载玻片以除去残留液
体盖玻片。对于富集文库的测试，通过在60℃下孵育1.5小时手动进行脱蜡，接着在PT-
Linker(Dako，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上97℃下20min，pH 9进行表位修
复。
[1264] 84个病例的治疗和病理诊断可以在表29-32中找到。3个非受益(NB)乳腺癌病例和3个受益(B)乳腺癌病例的亚集选择用于富集。保持于初始指定的曲妥珠单抗疗法至少181
天的患者分类为B；其治疗在181天内改变的患者分类为NB。训练病例的临床信息可以在表
29-30中找到。为富集目的，具有乳腺癌的组织区域用作正向选择靶标，而相邻的非恶性的
组织以及来自具有可选的反应的患者的癌组织用作反选择靶标。
天的患者分类为B；其治疗在181天内改变的患者分类为NB。训练病例的临床信息可以在表
29-30中找到。为富集目的，具有乳腺癌的组织区域用作正向选择靶标，而相邻的非恶性的
组织以及来自具有可选的反应的患者的癌组织用作反选择靶标。
[1265] ssDNA文库设计和用不等长引物非对称PCR的再现
[1266] 随机ssDNA文库(原始F-TRin-35n-B 8-3s文库)包含侧邻恒定区的35个随机核苷酸。具体地，原始文库包含5’区(5′CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))，之后35个核苷酸的随机原始寡核苷酸序列和3’区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID
NO.5))。这一文库在Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，Iowa，USA)处合成，以等摩尔量汇合并PCR扩增以添加生物素到5’-端。文库恒定区与引物互补：反向：5’-
Biosg-CTAGCATGACTGCAGTACGT-3’(SEQ ID NO.4)和正向：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.203062)/iSp9//iSp9/TCGTCGGCAGCGTCA-3’(SEQ ID
NO.203063))，其用于不对称PCR中以产生大部分的靶标链。正向引物的内部间隔区iSp9(内
部三乙二醇间隔区，IDT)阻止互补链的延伸，而聚-A尾的添加导致正向链的更长长度，从而
允许尺寸排阻和从4％变性琼脂糖E-凝胶的凝胶切割后的靶链ssDNA回收及通过凝胶提取
柱(Nucleospin，MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG，Düren，DE)的最后纯化。生物素化的反义文
库用于富集。不对称PCR混合物(100μl)包含5x Q5 PCR缓冲液，0.2mM dNTPs，0.08μM的正向引物，30μM的反向引物，0.01pmol(纯文库的)模板或57μl的包含文库/组织(富集后)的解剖后溶液和2U的Q5 Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，
MA)。PCR程序包括98℃下的初始变性30sec，接着变性、退火(60℃，30sec)和延伸(72℃，
3min)的循环，且最终延伸是在72℃下5min。对于纯文库，进行15个循环的扩增，对于富集过程中的文库，循环数根据回收率在15和30之间变化。不对称PCR产物与变性缓冲液(180mM
NaOH，6mM EDTA)混合，在70℃下加热10min，在冰上冷却3min，加载～20μl在4％琼脂糖
SYBRGold凝胶(E-GEL EX Gels，G401004，Life Technologies)上，分离15min。单链反向链
被切割，凝胶块与NTC缓冲液(Nucleospin，Macherey-Nagel)组合，在50℃下熔融5-10min直
到所有块熔化。700μl的熔融琼脂糖加载到Nucleospin柱上且然后进行标准ssDNA纯化过
程。纯化的DNA然后用30μl的NE缓冲液洗脱。
NO.5))。这一文库在Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，Iowa，USA)处合成，以等摩尔量汇合并PCR扩增以添加生物素到5’-端。文库恒定区与引物互补：反向：5’-
Biosg-CTAGCATGACTGCAGTACGT-3’(SEQ ID NO.4)和正向：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.203062)/iSp9//iSp9/TCGTCGGCAGCGTCA-3’(SEQ ID
NO.203063))，其用于不对称PCR中以产生大部分的靶标链。正向引物的内部间隔区iSp9(内
部三乙二醇间隔区，IDT)阻止互补链的延伸，而聚-A尾的添加导致正向链的更长长度，从而
允许尺寸排阻和从4％变性琼脂糖E-凝胶的凝胶切割后的靶链ssDNA回收及通过凝胶提取
柱(Nucleospin，MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG，Düren，DE)的最后纯化。生物素化的反义文
库用于富集。不对称PCR混合物(100μl)包含5x Q5 PCR缓冲液，0.2mM dNTPs，0.08μM的正向引物，30μM的反向引物，0.01pmol(纯文库的)模板或57μl的包含文库/组织(富集后)的解剖后溶液和2U的Q5 Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，
MA)。PCR程序包括98℃下的初始变性30sec，接着变性、退火(60℃，30sec)和延伸(72℃，
3min)的循环，且最终延伸是在72℃下5min。对于纯文库，进行15个循环的扩增，对于富集过程中的文库，循环数根据回收率在15和30之间变化。不对称PCR产物与变性缓冲液(180mM
NaOH，6mM EDTA)混合，在70℃下加热10min，在冰上冷却3min，加载～20μl在4％琼脂糖
SYBRGold凝胶(E-GEL EX Gels，G401004，Life Technologies)上，分离15min。单链反向链
被切割，凝胶块与NTC缓冲液(Nucleospin，Macherey-Nagel)组合，在50℃下熔融5-10min直
到所有块熔化。700μl的熔融琼脂糖加载到Nucleospin柱上且然后进行标准ssDNA纯化过
程。纯化的DNA然后用30μl的NE缓冲液洗脱。
[1267] 基于FFPE组织载玻片的SELEX
[1268] 根据图17C中的方案进行针对曲妥珠单抗反应的ssODN文库的富集。富集病例的治疗方案可以在表29-30中找到。在每个文库的富集中，前三轮仅在正向病例上进行，接着是
另外三轮，其中具有两个反选择病例和一个正向病例。对于正向选择，400μl的阻断缓冲液
(0.8ng/ul鲑DNA(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，
Massachusetts，USA)，0.8ng/μl tRNA(Life Technologies)，1μg/μl HSA(Sigma)，0.5％F127(Thermo Fisher)和1x PBS中的3mM MgCl2)在Agilent垫片载玻片(Agilent
Technologies，Santa Clara，CA)的顶部上与90μl ssODOD文库溶液(对于第1轮7pmol，后续轮3.5pmol，在1x PBS，3mM MgCl2中)混合。在脱蜡和表位修复后，将FFPE组织载玻片安装在含有结合混合物的垫片载玻片的顶部，并在室温下伴随旋转在Agilent微阵列杂交室中孵
育1小时。孵育后，通过浸入2×750ml洗涤缓冲液(1×PBS，3mM MgCl2)缓冲液中洗涤载玻
片，每个罐中浸3次。接下来，将490μl补充有3mM MgCl2的核固红(NFR)加入载玻片45秒，并通过在750ml洗涤缓冲液中浸渍6次进行洗涤。基于来自相应H&E载玻片的初始病理学诊断，
解剖癌症区域并转移至180μl水中，其用作使用不等长引物的不对称PCR的模板以产生用于
下一轮的单链文库(参见上述实验方案)。剩余的正常组织用于内部反选择。该实验方案重
复3轮。对于负向选择，将结合混合物直接加入反选择载玻片的组织中并在潮湿腔室中孵育
1小时。孵育后，收集最大体积的上清液。另外，应用50μl阻断缓冲液以收集未结合的ssODN。
将合并的上清液加入到第二反选载玻片并孵育1小时。孵育后，以与之前相同的方式收集上
清液，并将其应用于来自正向病例的载玻片上用于再孵育1小时，这次在Agilent微阵列杂
交室中进行。以下步骤，洗涤、染色和PCR，与上述相同。
另外三轮，其中具有两个反选择病例和一个正向病例。对于正向选择，400μl的阻断缓冲液
(0.8ng/ul鲑DNA(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，
Massachusetts，USA)，0.8ng/μl tRNA(Life Technologies)，1μg/μl HSA(Sigma)，0.5％F127(Thermo Fisher)和1x PBS中的3mM MgCl2)在Agilent垫片载玻片(Agilent
Technologies，Santa Clara，CA)的顶部上与90μl ssODOD文库溶液(对于第1轮7pmol，后续轮3.5pmol，在1x PBS，3mM MgCl2中)混合。在脱蜡和表位修复后，将FFPE组织载玻片安装在含有结合混合物的垫片载玻片的顶部，并在室温下伴随旋转在Agilent微阵列杂交室中孵
育1小时。孵育后，通过浸入2×750ml洗涤缓冲液(1×PBS，3mM MgCl2)缓冲液中洗涤载玻
片，每个罐中浸3次。接下来，将490μl补充有3mM MgCl2的核固红(NFR)加入载玻片45秒，并通过在750ml洗涤缓冲液中浸渍6次进行洗涤。基于来自相应H&E载玻片的初始病理学诊断，
解剖癌症区域并转移至180μl水中，其用作使用不等长引物的不对称PCR的模板以产生用于
下一轮的单链文库(参见上述实验方案)。剩余的正常组织用于内部反选择。该实验方案重
复3轮。对于负向选择，将结合混合物直接加入反选择载玻片的组织中并在潮湿腔室中孵育
1小时。孵育后，收集最大体积的上清液。另外，应用50μl阻断缓冲液以收集未结合的ssODN。
将合并的上清液加入到第二反选载玻片并孵育1小时。孵育后，以与之前相同的方式收集上
清液，并将其应用于来自正向病例的载玻片上用于再孵育1小时，这次在Agilent微阵列杂
交室中进行。以下步骤，洗涤、染色和PCR，与上述相同。
[1269] 富集文库的多配体-组织化学(PHC)筛选
[1270] 在Dako Autostainer上进行富集文库的FFPE组织载玻片的染色。将载玻片在60℃下烘烤1.5小时后，表位修复在pH 9，98℃下在Dako PT-Linker上进行22分钟。Dako
Autostainer上的染色包括用450μl溶液的5分钟过氧化物酶抑制，该溶液含有5％＜＝x＜
7％的正磷酸氢二钠、3％＜＝x＜5％的H2O2、1％＜＝x＜2％的磷酸单钠盐一水合物，与
450ul结合混合物(3.5pmol富集文库，0.65ng/μl鲑DNA，0.65ng/μl tRNA，10％BlockAid
(Life Technologies))孵育1小时，与补充有3mM MgCl2的450μl链霉素亲和素聚-HRP孵育
30分钟，用补充3mM MgCl2的DAB溶液染色10分钟，然后用450μl苏木精(2ng/μl终浓度)孵育
5分钟。用1x PBS，3mM MgCl2缓冲液的冲洗在每个步骤之间进行。最后，将染色的载玻片用
乙醇、二甲苯脱水并用盖玻片覆盖以长期储存。在Olympus BX41(Olympus Corporation of
the Americas，Center Valley，PA，USA)上进行显微镜检查。
Autostainer上的染色包括用450μl溶液的5分钟过氧化物酶抑制，该溶液含有5％＜＝x＜
7％的正磷酸氢二钠、3％＜＝x＜5％的H2O2、1％＜＝x＜2％的磷酸单钠盐一水合物，与
450ul结合混合物(3.5pmol富集文库，0.65ng/μl鲑DNA，0.65ng/μl tRNA，10％BlockAid
(Life Technologies))孵育1小时，与补充有3mM MgCl2的450μl链霉素亲和素聚-HRP孵育
30分钟，用补充3mM MgCl2的DAB溶液染色10分钟，然后用450μl苏木精(2ng/μl终浓度)孵育
5分钟。用1x PBS，3mM MgCl2缓冲液的冲洗在每个步骤之间进行。最后，将染色的载玻片用
乙醇、二甲苯脱水并用盖玻片覆盖以长期储存。在Olympus BX41(Olympus Corporation of
the Americas，Center Valley，PA，USA)上进行显微镜检查。
[1271] 核和细胞质两者的染色的组织学评分计算为强度水平(1、2和3)之间的总和乘以具有该特定强度的细胞百分比。
[1272] 统计学分析
[1273] 首先，通过ROC曲线和AUC评估各单个文库分类曲妥珠单抗响应者和非响应者的能力。参见，例如，图17J-K。为了使用来自两个文库TL-NB和TL-B染色的PHC评分的多变量方法预测患者对曲妥珠单抗疗法的反应，开发了逻辑回归模型。具体地，使用响应者/非响应者
的二元结果作为响应变量，并且将文库TL-NB和TL-B的染色评分作为独立变量处理(图17J
(C)，实线标记AUC＝0.804)。进行10倍交叉验证以评估模型预测性能的普遍性，其中数据集
被专门地随机分成10个相等的部分。逻辑回归模型建立在9个部分上，且随后在1个保持部
分进行测试。该过程在整个10个部分中重复，并且仅收集预测的概率用于进一步评估(图
17J(C)，虚线标记AUC＝0.760)。
的二元结果作为响应变量，并且将文库TL-NB和TL-B的染色评分作为独立变量处理(图17J
(C)，实线标记AUC＝0.804)。进行10倍交叉验证以评估模型预测性能的普遍性，其中数据集
被专门地随机分成10个相等的部分。逻辑回归模型建立在9个部分上，且随后在1个保持部
分进行测试。该过程在整个10个部分中重复，并且仅收集预测的概率用于进一步评估(图
17J(C)，虚线标记AUC＝0.760)。
[1274] 下次治疗时间(TTNT)的终点被定义为下一次非曲妥珠单抗治疗或死亡的时间。没有下一次非曲妥珠单抗治疗或死亡信息的患者在最后的接触日期时被删除(参见Kaplan-
Meier曲线中的垂直标记(图17M)。使用肿瘤的HER2状态或PHC测试结果作为自变量拟合
Cox-PH模型。中位生存时间由Kaplan-Meier估计计算。进行对数秩检验以评估组间TTNT存
活的显著性。所有分析均使用“存活率”r软件包进行。
Meier曲线中的垂直标记(图17M)。使用肿瘤的HER2状态或PHC测试结果作为自变量拟合
Cox-PH模型。中位生存时间由Kaplan-Meier估计计算。进行对数秩检验以评估组间TTNT存
活的显著性。所有分析均使用“存活率”r软件包进行。
[1275] 实施例23：替代的寡核苷酸探针分析分类用基于曲妥珠单抗的疗法治疗的乳腺癌患者的后果
[1276] 背景：虽然曲妥珠单抗是高效的靶向治疗，但大约50％的患有HER2+乳腺癌的患者不受益于基于曲妥珠单抗的方案。我们开发了基于多配体适体的方法，其在分类可能从曲
妥珠单抗获益的患者的能力中优于传统的HER2测试。
妥珠单抗获益的患者的能力中优于传统的HER2测试。
[1277] 方法：将1013个生物素化ssDNA寡脱氧核苷酸(ssODN)的文库在根据下次治疗的时间受益(B)或不受益(NB)于基于曲妥珠单抗的疗法的患者的FFPE组织载玻片上孵育。丢弃
未结合的ssODN，并且保留结合的ssODN用于两个后续轮的正向选择。从第4轮开始，将部分
富集的文库应用于代表用于负向选择的可选表型(对于B为NB，且反之亦然)的病例，并且收
集并保留含有未结合的ssODN的上清液。再两轮负向选择后获得的文库用作探针以染色和
通过多配体组织化学(PHC)对30个B和15个NB独立病例进行评分。通过计算来自ROC曲线的
AUC值来评估训练的文库对受益于基于曲妥珠单抗的治疗的患者进行分类的能力。Kaplan-
Meier(KM)曲线图用于比较后果与测试结果。
未结合的ssODN，并且保留结合的ssODN用于两个后续轮的正向选择。从第4轮开始，将部分
富集的文库应用于代表用于负向选择的可选表型(对于B为NB，且反之亦然)的病例，并且收
集并保留含有未结合的ssODN的上清液。再两轮负向选择后获得的文库用作探针以染色和
通过多配体组织化学(PHC)对30个B和15个NB独立病例进行评分。通过计算来自ROC曲线的
AUC值来评估训练的文库对受益于基于曲妥珠单抗的治疗的患者进行分类的能力。Kaplan-
Meier(KM)曲线图用于比较后果与测试结果。
[1278] 结果：两个文库有效地分类B和NB组(ROC AUC为0.8)。相反，标准HER2IHC产生0.4的AUC。曲妥珠单抗治疗的中位持续时间对于测试阳性患者为604天和对于测试阴性患者为
129天(HR＝0.320，95％CI：0.146-0.703；对数秩p＝0.003)，表明PHC评分对于分类不同的
临床结果非常有效。按照单独的HER2状态(IHC)，HER2+病例的曲妥珠单抗治疗中位持续时
间为250天和HER2-/低病例为369天(HR＝1.39，95％CI：0.62-3.13；对数秩p＝0.418)。
129天(HR＝0.320，95％CI：0.146-0.703；对数秩p＝0.003)，表明PHC评分对于分类不同的
临床结果非常有效。按照单独的HER2状态(IHC)，HER2+病例的曲妥珠单抗治疗中位持续时
间为250天和HER2-/低病例为369天(HR＝1.39，95％CI：0.62-3.13；对数秩p＝0.418)。
[1279] 结论：这些结果表明多配体谱分析提供了产生可用于识别或多或少可能受益于靶向疗法如曲妥珠单抗的患者的预测分析的高性能系统生物学方法。
[1280] 实施例24：在来自诊断患有结肠直肠癌且用FOLFOX和贝伐单抗治疗的个体的FFPE组织上适体的选择
[1281] 贝伐单抗是重组人源化单克隆抗体，其通过抑制血管内皮生长因子A(VEGF-A)来阻断血管生成。VEGF-A是在多种疾病，特别是在癌症中刺激血管生成的化学信号。贝伐单
抗，以商品名阿瓦斯丁销售，于2004年2月获FDA批准在与标准化疗治疗(作为一线治疗)和
与用于二线转移性结肠直肠癌的基于5-氟尿嘧啶的疗法一起使用时用于转移性结肠直肠
癌(CRC)。FOLFOX是用于治疗结肠直肠癌的化疗方案，其由三种药物组成：1)FOL-亚叶酸(甲
酰四氢叶酸)；2)F-氟尿嘧啶(5-FU)；3)OX-奥沙利铂(乐沙定)。FOLFOX和贝伐单抗可用作转
移性CRC的一线治疗。
抗，以商品名阿瓦斯丁销售，于2004年2月获FDA批准在与标准化疗治疗(作为一线治疗)和
与用于二线转移性结肠直肠癌的基于5-氟尿嘧啶的疗法一起使用时用于转移性结肠直肠
癌(CRC)。FOLFOX是用于治疗结肠直肠癌的化疗方案，其由三种药物组成：1)FOL-亚叶酸(甲
酰四氢叶酸)；2)F-氟尿嘧啶(5-FU)；3)OX-奥沙利铂(乐沙定)。FOLFOX和贝伐单抗可用作转
移性CRC的一线治疗。
[1282] 目前，没有好的方式来预测FOLFOX与贝伐单抗作为癌症疗法中的治疗的功效。这一实施例的目的是开发可用于预测在诊断患有结肠直肠癌的个体中对FOLFOX/贝伐单抗的
组合疗法的反应的分析的寡核苷酸探针文库。采用的途径类似于上面的实施例19-20。简而
言之，在FFPE CRC组织样品上进行寡核苷酸探针的选择。患者根据他们停留在FOLFOX上的
时间(TNT；下次治疗的时间)分为两个群组：响应者和非响应者。非响应者在FOLFOX上停留
最多124天，而响应者停留在此治疗上至少持续241天。贝伐单抗治疗因患者而异。它可能与
FOLFOX同时或更晚开始，并且与FOLFOX同时、比其更早或更晚结束。在图18A中概述了富集
方案，其中分别在图18B和图18C中示出了正向和负向选择步骤。
组合疗法的反应的分析的寡核苷酸探针文库。采用的途径类似于上面的实施例19-20。简而
言之，在FFPE CRC组织样品上进行寡核苷酸探针的选择。患者根据他们停留在FOLFOX上的
时间(TNT；下次治疗的时间)分为两个群组：响应者和非响应者。非响应者在FOLFOX上停留
最多124天，而响应者停留在此治疗上至少持续241天。贝伐单抗治疗因患者而异。它可能与
FOLFOX同时或更晚开始，并且与FOLFOX同时、比其更早或更晚结束。在图18A中概述了富集
方案，其中分别在图18B和图18C中示出了正向和负向选择步骤。
[1283] 进行了对响应者的7个富集和对非响应者的4个富集的6轮正向选择，产生11个富集寡核苷酸探针集合。在非响应者样品上进行对响应者病例的反选择，反之亦然。示例性载
玻片集显示于图18D-E中，其显示了用H&E染色的富集“M”(图18D)或探针文库M(图18E)中用
于正向选择的FFPE样品的染色。该图显示了癌组织的染色；肿瘤部位：结肠；样本：结肠。载玻片以20X放大率显示。表37显示了所示组织样品用所示探针文库的染色强度的结果。
玻片集显示于图18D-E中，其显示了用H&E染色的富集“M”(图18D)或探针文库M(图18E)中用
于正向选择的FFPE样品的染色。该图显示了癌组织的染色；肿瘤部位：结肠；样本：结肠。载玻片以20X放大率显示。表37显示了所示组织样品用所示探针文库的染色强度的结果。
[1284] 表37：富集的寡核苷酸探针
[1285]
[1286]
[1287] 为了测试富集的文库，将不是富集的部分的一个非响应者病例和5个响应者病例用所有11个文库染色。另外，用于正向选择的病例用相应的文库染色。图18F-G中显示了一
个测试样品(样品2)染色的示例结果。样品特征包括：响应者；肿瘤部位：降结肠；样本：降结肠。图18F显示来自样品2载玻片的癌症样品的染色。文库(A-M)显示在图中的各载玻片上。
如图所示，与其他载玻片相比，在载玻片H-M中观察到略微更暗的染色。图18G显示来自样品
2载玻片的非癌症组织的染色。在这种情况下，所有样品上染色较轻且强度相似。
个测试样品(样品2)染色的示例结果。样品特征包括：响应者；肿瘤部位：降结肠；样本：降结肠。图18F显示来自样品2载玻片的癌症样品的染色。文库(A-M)显示在图中的各载玻片上。
如图所示，与其他载玻片相比，在载玻片H-M中观察到略微更暗的染色。图18G显示来自样品
2载玻片的非癌症组织的染色。在这种情况下，所有样品上染色较轻且强度相似。
[1288] 对包含来自被认为是对贝伐单抗的响应者的个体的肿瘤组织的固定样品进行另一组富集实验。对于正向选择，寡核苷酸探针文库与载玻片上的整个组织结合，但仅癌症组
织从载玻片上刮下，然后从刮下的组织中回收文库并扩增。在三个这样的轮次之后，进行三
轮的两步负向选择(来自两个对阿瓦斯丁无反应的个体的组织)和一个正向选择。第7轮包
括再一个正向选择。对于第8轮，改变富集策略。将癌症组织和非癌症组织刮下并在不同的
管中分离，而不是进行固定在载玻片上的组织的富集。为了在管中进行富集，我们使用100,
000xg的离心以将组织与未结合的文库分离。对刮下的癌症组织进行四轮富集，并在刮下的
非癌症组织上进行反选择。12轮后的文库用于探测和选择与非癌症组织相比对癌症更强结
合的适体。从富集回收的四个序列显示在表38中。该表显示了鉴定的序列的可变区以及具
有围绕可变区的5′区CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和3′区CTGTCTCTTATACACATCT
GACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)的全长序列。这些序列可用于从贝伐单抗的响应者鉴定(例
如，通过染色)癌症组织。在该表中，具有包含“RC”的名称的序列是用作非结合对照的反向互补序列。
织从载玻片上刮下，然后从刮下的组织中回收文库并扩增。在三个这样的轮次之后，进行三
轮的两步负向选择(来自两个对阿瓦斯丁无反应的个体的组织)和一个正向选择。第7轮包
括再一个正向选择。对于第8轮，改变富集策略。将癌症组织和非癌症组织刮下并在不同的
管中分离，而不是进行固定在载玻片上的组织的富集。为了在管中进行富集，我们使用100,
000xg的离心以将组织与未结合的文库分离。对刮下的癌症组织进行四轮富集，并在刮下的
非癌症组织上进行反选择。12轮后的文库用于探测和选择与非癌症组织相比对癌症更强结
合的适体。从富集回收的四个序列显示在表38中。该表显示了鉴定的序列的可变区以及具
有围绕可变区的5′区CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和3′区CTGTCTCTTATACACATCT
GACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)的全长序列。这些序列可用于从贝伐单抗的响应者鉴定(例
如，通过染色)癌症组织。在该表中，具有包含“RC”的名称的序列是用作非结合对照的反向互补序列。
[1289] 表38：结合贝伐单抗响应者癌症组织的寡核苷酸探针
[1290]
[1291] 在以上第9轮之后确定另外的序列。来自响应者癌症(即来自响应患者的癌组织)、响应者非癌症(即来自响应患者的非癌症组织)、非响应者癌症(即来自非响应患者的癌症
组织)和非响应者非癌症(即来自非响应患者的非癌症组织)的组织刮下并对结合的寡核苷
酸进行测序。在来自测序的阅读计数相对于组织大小标准化后计算非响应癌症和其他组织
之间的倍数变化。表39显示了非响应癌症相对于所示的其它三种组织类型的倍数变化。该
表显示所识别序列的可变区。全长序列包含围绕可变区的5′区CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ
ID NO 4)和3′区CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)。可以使用任何合适
的侧翼序列。在表40中，表39中前六个可变区的完整序列以及具有侧翼区的完整序列。这些
序列可用于鉴定(例如，通过染色)来自贝伐单抗的响应者的癌症组织。在一个比较中具有
至少100％的倍数变化的额外序列的可变区列于SEQ ID NO.203114-206478中。在表40中，
名称包含“RC”的序列是反向互补序列序列，并且可以用作非结合对照。表40中的序列进一
步显示用地高辛(DIG)标记。具有高亲和力和特异性的抗-地高辛抗体可用于多种生物免疫
测定中，例如，以可视化如本文所述的寡核苷酸染色。除了任何其它此类有用的标记系统之
外，生物素和地高辛标记均可用于此类应用中。表39中的任何所需数量或组合的序列可用
于产生如表40中的寡核苷酸探针。
组织)和非响应者非癌症(即来自非响应患者的非癌症组织)的组织刮下并对结合的寡核苷
酸进行测序。在来自测序的阅读计数相对于组织大小标准化后计算非响应癌症和其他组织
之间的倍数变化。表39显示了非响应癌症相对于所示的其它三种组织类型的倍数变化。该
表显示所识别序列的可变区。全长序列包含围绕可变区的5′区CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ
ID NO 4)和3′区CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)。可以使用任何合适
的侧翼序列。在表40中，表39中前六个可变区的完整序列以及具有侧翼区的完整序列。这些
序列可用于鉴定(例如，通过染色)来自贝伐单抗的响应者的癌症组织。在一个比较中具有
至少100％的倍数变化的额外序列的可变区列于SEQ ID NO.203114-206478中。在表40中，
名称包含“RC”的序列是反向互补序列序列，并且可以用作非结合对照。表40中的序列进一
步显示用地高辛(DIG)标记。具有高亲和力和特异性的抗-地高辛抗体可用于多种生物免疫
测定中，例如，以可视化如本文所述的寡核苷酸染色。除了任何其它此类有用的标记系统之
外，生物素和地高辛标记均可用于此类应用中。表39中的任何所需数量或组合的序列可用
于产生如表40中的寡核苷酸探针。
[1292] 表39：具有贝伐单抗非响应者和响应者之间的倍数变化差异的序列
[1293]
[1294]
[1295] 表40：结合贝伐单抗响应者癌症组织的寡核苷酸探针
[1296]
[1297]
[1298] 实施例25：背景优化和自动化
[1299] 在这一实施例中，我们优化了用寡核苷酸探针文库的固定组织染色，如在以上实施例中描述的实验中那样。例如，当使用多配体组织化学(PHC)时，进行这种优化以减少使
用富集的寡核苷酸探针文库的非特异性背景染色。某些条件发现解决非特异性背景染色。
染色实验方案中的某些变化显示在表41中。“新”和“新+”改进的实验方案使用Ventana
Discovery平台优化和自动化。在表格中，BA指BlockAid阻断溶液(Thermo Fisher
Scientific)，和PBS指磷酸盐缓冲盐水。如从表中看到的，新和新+实验方案中的阻断条件
更加严格。
用富集的寡核苷酸探针文库的非特异性背景染色。某些条件发现解决非特异性背景染色。
染色实验方案中的某些变化显示在表41中。“新”和“新+”改进的实验方案使用Ventana
Discovery平台优化和自动化。在表格中，BA指BlockAid阻断溶液(Thermo Fisher
Scientific)，和PBS指磷酸盐缓冲盐水。如从表中看到的，新和新+实验方案中的阻断条件
更加严格。
[1300] 表41：背景优化条件
[1301]
[1302] 完整的实验方案如下。遵循对各种组织染色的实例。试剂如表42中所示。该设备是Ventana Discovery Autostainer。
[1303] 表42：原材料
[1304]试剂 供应商 目录#
鲑DNA Life Tech 15632-011
tRNA Life Tech AM7119
BlockAid Life Tech B10710
链霉亲和素聚-HRP Life Tech 21140
MgCl2 Affymetrix 78641
Hyclone PBS V.W.R.International SH30256.01
Sigma PBS Packet Sigma-Aldrich P3813
H2O Sigma-Aldrich W4502
分子级水 Life Tech 10977-015
DAB缓冲液 Dako SM803
鲑DNA Life Tech 15632-011
tRNA Life Tech AM7119
BlockAid Life Tech B10710
链霉亲和素聚-HRP Life Tech 21140
MgCl2 Affymetrix 78641
Hyclone PBS V.W.R.International SH30256.01
Sigma PBS Packet Sigma-Aldrich P3813
H2O Sigma-Aldrich W4502
分子级水 Life Tech 10977-015
DAB缓冲液 Dako SM803
[1305] 试剂制备
[1306] 步骤1：在表位修复之前立即对所有载玻片进行透化。将载玻片完全浸入1x PBS中的0.1％ Triton X 100中，在室温(RT)下孵育10分钟。
[1307] 步骤2：通过在750mL 1X PBS(1升Copling罐)中浸入10x来洗涤载玻片。
[1308] 步骤3：制备竞争剂/阻断/适体文库混合物。表43中，显示了SA-聚HRP混合物。SA-聚HRP是指链霉亲和素聚-HRP偶联物，这是与辣根过氧化物酶的聚合物偶联的生物素-结合
蛋白，其使得能够信号放大和检测生物素化结合剂(例如，抗体或或适体)用于IHC和其他方
法。
蛋白，其使得能够信号放大和检测生物素化结合剂(例如，抗体或或适体)用于IHC和其他方
法。
[1309] 表43：SA-聚HRP混合物
[1310]
[1311] 生物素化寡核苷酸探针文库在添加到表44中所示的竞争剂/Block主混合物中之前与MgCl2混合：
[1312] 表44：阻断/适体主混合物
[1313]
[1314] 染色
[1315] 步骤4：Ventana Discovery自动染色仪上的Aptohistochemistry
[1316] 脱蜡和表位修复
[1317] 所有载玻片：应用相应的阻断/适体溶液150μl(表44)，在室温下孵育1小时(将自动添加300μl的运行缓冲液)。
[1318] 所有载玻片：应用100μl的SA-HRP+MgCl2+19％BA SA-聚HRP混合物(表43)
[1319] 应用DAB缓冲液
[1320] 应用苏木精
[1321] 染色后
[1322] 步骤5：倒掉液体盖玻片，并用纸巾从玻璃边缘吸去残留的油。
[1323] 步骤6：标准盖片。
[1324] 步骤7：评分载玻片染色。
[1325] 组织染色
[1326] 上述方案用于染色来自各种解剖学位置的固定组织，包括来自卵巢、乳腺、胰腺、膀胱、黑色素瘤、头颈部、肾、非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝细胞癌(HCC)和结肠起源的肿瘤样品。使用的寡核苷酸探针文库是实施例19中来自HER2+乳腺组织富集的
R6文库。未富集的文库(R0)用作对照。因此，探针文库没有针对每个组织进行优化，但仍然
在各种组织中提供可辨别的染色，如图19A-K中所示。该图显示了用原始方案和这一实施例
中提供的优化方案的H&E染色的载玻片。图19A显示了卵巢癌样品的结果。用原始方案观察
到所有样品的最暗染色，尽管在不存在任何寡核苷酸探针的无文库样品中观察到可辨别的
棕色染色。使用优化的文库，用R6的染色最明显，并且在无文库样品中没有观察到棕色染
色。不受理论束缚，在不存在探针文库的情况下用原始方案观察到的染色可以源自SA-HRP
的非特异性结合，或者在一些情况中由于内源生物素。用乳腺癌组织(图19B)、胰腺癌组织
(图19C)、膀胱癌组织(图19D)、黑色素瘤组织(图19E)、头颈癌组织(图19F)、肾癌组织(图
19G)、NSCLC组织(图19H)、GBM组织(图19I)、HCC组织(图19J)和结肠癌组织(图19K)观察到
定性上相似的结果。使用黑色素瘤和GBM组织，在优化的无文库样品中观察到轻微染色，但
是与原始无文库样品相比，该染色仍然显著地降低。使用NCSLC和结肠组织，在任何条件集
下在无文库样品中观察到很少的染色。
R6文库。未富集的文库(R0)用作对照。因此，探针文库没有针对每个组织进行优化，但仍然
在各种组织中提供可辨别的染色，如图19A-K中所示。该图显示了用原始方案和这一实施例
中提供的优化方案的H&E染色的载玻片。图19A显示了卵巢癌样品的结果。用原始方案观察
到所有样品的最暗染色，尽管在不存在任何寡核苷酸探针的无文库样品中观察到可辨别的
棕色染色。使用优化的文库，用R6的染色最明显，并且在无文库样品中没有观察到棕色染
色。不受理论束缚，在不存在探针文库的情况下用原始方案观察到的染色可以源自SA-HRP
的非特异性结合，或者在一些情况中由于内源生物素。用乳腺癌组织(图19B)、胰腺癌组织
(图19C)、膀胱癌组织(图19D)、黑色素瘤组织(图19E)、头颈癌组织(图19F)、肾癌组织(图
19G)、NSCLC组织(图19H)、GBM组织(图19I)、HCC组织(图19J)和结肠癌组织(图19K)观察到
定性上相似的结果。使用黑色素瘤和GBM组织，在优化的无文库样品中观察到轻微染色，但
是与原始无文库样品相比，该染色仍然显著地降低。使用NCSLC和结肠组织，在任何条件集
下在无文库样品中观察到很少的染色。
[1327] 实施例26：TUBB3+胰腺癌组织上的寡核苷酸探针富集
[1328] 在这一实施例中，我们使用在上述实施例中开发的FFPE组织富集方案(参见，例如，实施例21-22和25)来针对TUBB3+胰腺癌组织样品富集原始寡核苷酸探针文库。
[1329] 随机ssDNA文库(原始F-TRin-35n-B 8-3s文库)包含侧翼为恒定区的35个随机核苷酸。具体地，原始文库包含5′区(5′CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO.4))，随后是35个核苷酸的随机原始寡核苷酸序列和3′区(5′CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID
NO.5))。样品是胰腺FFPE组织样品，其具有通过常规IHC确认的TUBB3状态。进行了七轮富
集。我们最初使用来自实施例25的完整实验方案进行富集，但未观察到富集。不受理论束
缚，很可能实施例25中的优化实验方案过于严格，因为它被优化用于探测而不是富集。因
此，优化的实验方案适应于如图20A所示的富集过程。在该方案中，根据P-＞P-＞P-＞(N-＞
P)-＞(N-＞P)-＞(N-＞P)-＞P的顺序进行富集，其中“P”(图20A中的“Pos”)是指针对TUBB3+样品的正向选择，而“N”(图20A中的“Neg”)是指针对TUBB3-样品的负向选择。使用如图20A所示的条件，在早期轮中以低严格性进行富集。例如，该图显示洗涤剂(Triton X100)和阻
断剂(BlockAid)的浓度在较晚的富集轮中增加。进一步如图中所示，在较晚的富集轮之后
进行如实施例25中所述的染色以观察富集过程。图20B中显示的实例，其中与阴性样品相
比，在阳性样品中观察到高得多的棕色染色水平。
NO.5))。样品是胰腺FFPE组织样品，其具有通过常规IHC确认的TUBB3状态。进行了七轮富
集。我们最初使用来自实施例25的完整实验方案进行富集，但未观察到富集。不受理论束
缚，很可能实施例25中的优化实验方案过于严格，因为它被优化用于探测而不是富集。因
此，优化的实验方案适应于如图20A所示的富集过程。在该方案中，根据P-＞P-＞P-＞(N-＞
P)-＞(N-＞P)-＞(N-＞P)-＞P的顺序进行富集，其中“P”(图20A中的“Pos”)是指针对TUBB3+样品的正向选择，而“N”(图20A中的“Neg”)是指针对TUBB3-样品的负向选择。使用如图20A所示的条件，在早期轮中以低严格性进行富集。例如，该图显示洗涤剂(Triton X100)和阻
断剂(BlockAid)的浓度在较晚的富集轮中增加。进一步如图中所示，在较晚的富集轮之后
进行如实施例25中所述的染色以观察富集过程。图20B中显示的实例，其中与阴性样品相
比，在阳性样品中观察到高得多的棕色染色水平。
[1330] 在七轮富集之后的最终富集文库被称为TUBB3-R7文库。TUBB3-R7文库用于探测未在富集过程中使用的9个TUBB3+和9个TUBB3-胰腺癌组织载玻片(即，非富集病例)。染色强
度由盲法病理学家确定。H-评分(即，[1x(％细胞1+)+2x(％细胞2+)+3x(％细胞3+)])基于
对于整体载玻片染色和核染色的染色强度计算。结果显示在图20C中，其绘制了所示样品组
(即TUBB3+或TUBB3-)的总(i)或核(ii)H-评分。在每个图下方指明组之间差异的p值。H-评
分也用于产生ROC曲线图并计算ROC AUC值，如图20D中所示。该图提供了总(i)或核(ii)ROC
曲线的图。总(i)的AUC值为0.843，且核(ii)的AUC值为0.889。因此，在两种情况下，TUBB3-R7文库在区分TUBB3+和TUBB3-胰腺癌组织样本方面具有非常高的性能。
度由盲法病理学家确定。H-评分(即，[1x(％细胞1+)+2x(％细胞2+)+3x(％细胞3+)])基于
对于整体载玻片染色和核染色的染色强度计算。结果显示在图20C中，其绘制了所示样品组
(即TUBB3+或TUBB3-)的总(i)或核(ii)H-评分。在每个图下方指明组之间差异的p值。H-评
分也用于产生ROC曲线图并计算ROC AUC值，如图20D中所示。该图提供了总(i)或核(ii)ROC
曲线的图。总(i)的AUC值为0.843，且核(ii)的AUC值为0.889。因此，在两种情况下，TUBB3-R7文库在区分TUBB3+和TUBB3-胰腺癌组织样本方面具有非常高的性能。
[1331] 在实施例19中，我们提出了能够区分HER2+和HER2-乳腺癌样品的寡核苷酸探针文库。类似地，在这一实施例中，我们开发了能够区分TUBB3+和TUBB3-胰腺癌样品的寡核苷酸
探针文库。
探针文库。
[1332] 实施例27：卵巢癌中铂/紫杉烷治疗的TTNT
[1333] 在这一实施例中，我们使用如实施例26中的FFPE组织富集方案来针对考虑为对铂/紫杉烷治疗的响应者或非响应者的卵巢癌组织样品富集原始寡核苷酸探针文库。如实
施例20-22中所述，使用在铂/紫杉烷治疗后的下次治疗时间(TTNT)，也称为无药物间隔
(DFI)，确定响应者(益处)/非响应者(非受益)状态。对于这一实施例，非响应者为DFI＜6个
月的那些和响应者者为DFI＞6个月的那些。
施例20-22中所述，使用在铂/紫杉烷治疗后的下次治疗时间(TTNT)，也称为无药物间隔
(DFI)，确定响应者(益处)/非响应者(非受益)状态。对于这一实施例，非响应者为DFI＜6个
月的那些和响应者者为DFI＞6个月的那些。
[1334] 方法与实施例26中的方法类似，其具有此处描述的修改。富集过程在图21A中概述。根据P-＞P-＞P-＞(2N*-＞P)-＞(2N*-＞P)-＞(2N*-＞P的顺序进行富集，其中“P”(图
21A中的“Pos”)指的是针对响应者组织样品的正向选择，“N”(图21A中的“Neg”)指的是针对非响应者组织样品的负向选择，且*表示两个阴性载玻片平行使用，合并上清液，且探针在
PCR之前用链霉亲和素珠纯化。还进行反向过程，其中正向选择针对非响应者组织样品和负
向选择针对响应者组织样品。如在实施例26中，在较晚的富集轮中使用较严格的条件。富集
条件参见图21A。图21B显示了用六个富集文库染色的实例，三个文库针对非响应者进行训
练和三个针对响应者进行训练，如所示的。图21B中的文库显示了预期的染色模式，其中在
阳性富集病例(这里是响应者中)染色更多。这一文库用于探测如上所述铂/紫杉烷治疗的
受益/响应或非受益/响应的非富集卵巢癌样品。
21A中的“Pos”)指的是针对响应者组织样品的正向选择，“N”(图21A中的“Neg”)指的是针对非响应者组织样品的负向选择，且*表示两个阴性载玻片平行使用，合并上清液，且探针在
PCR之前用链霉亲和素珠纯化。还进行反向过程，其中正向选择针对非响应者组织样品和负
向选择针对响应者组织样品。如在实施例26中，在较晚的富集轮中使用较严格的条件。富集
条件参见图21A。图21B显示了用六个富集文库染色的实例，三个文库针对非响应者进行训
练和三个针对响应者进行训练，如所示的。图21B中的文库显示了预期的染色模式，其中在
阳性富集病例(这里是响应者中)染色更多。这一文库用于探测如上所述铂/紫杉烷治疗的
受益/响应或非受益/响应的非富集卵巢癌样品。
[1335] 实施例28：结合组织样品的寡核苷酸探针的检测
[1336] 类似于上述实施例的实验方案用于针对FFPE肾组织载玻片富集原始F-TRin-35n-B 8-3s文库。使用6轮富集后的生物素化文库探测与实施例25类似的固定肾组织。还用生物
素化的未富集F-TRin-35n-B 8-3s文库作为对照探测载玻片。如上使用链霉亲和素-辣根过
氧化物酶(SA-HRP)，目录号11207733910)可视化寡核苷酸探针结合。尽管使用严格的探测
条件，但对于未富集的文库对照看到明显的背景染色水平。在这一实施例中，我们使用可选
的染色方案来可视化寡核苷酸探针与肾样品的结合。
素化的未富集F-TRin-35n-B 8-3s文库作为对照探测载玻片。如上使用链霉亲和素-辣根过
氧化物酶(SA-HRP)，目录号11207733910)可视化寡核苷酸探针结合。尽管使用严格的探测
条件，但对于未富集的文库对照看到明显的背景染色水平。在这一实施例中，我们使用可选
的染色方案来可视化寡核苷酸探针与肾样品的结合。
[1337] 不受理论束缚，我们检验了SA-HRP与样品的非特异性结合是否可以是负责的并且开发了替代的可视化方法。生物素-抗生物素蛋白/链霉亲和素生物分析具有许多理想的特
性，例如公知的方法和试剂，由于强和特异的生物素-抗生物素蛋白结合而不需要抗体，和
链霉亲和素珠可用于拉下实验/免疫沉淀。然而，在某些情况中，组织中的内源生物素可能
导致有问题的背景结合。在这一实施例中，我们用抗-DIG-HRP抗体检测测试了地高辛(DIG)
修饰的寡核苷酸文库。与生物素不同，地高辛是专门在某些植物的花和叶中发现的类固醇。
性，例如公知的方法和试剂，由于强和特异的生物素-抗生物素蛋白结合而不需要抗体，和
链霉亲和素珠可用于拉下实验/免疫沉淀。然而，在某些情况中，组织中的内源生物素可能
导致有问题的背景结合。在这一实施例中，我们用抗-DIG-HRP抗体检测测试了地高辛(DIG)
修饰的寡核苷酸文库。与生物素不同，地高辛是专门在某些植物的花和叶中发现的类固醇。
[1338] 图22A显示使用指示的DIG修饰的寡核苷酸文库和抗-DIG-HRP抗体检测对肾FFPE载玻片的染色。图22Ai显示无文库对照，图22Aii显示用5ng未富集(R0)文库的染色，图
22Aiii显示用5ng第6轮(R6)文库的染色，图22Aiv显示用50ng未富集(R0)文库的染色和图
22Av显示用50ng的第6轮(R6)文库的染色。所有图像均以20x放大率获取。在图中，无文库对
照(图22Ai)和5ng R0样品(图22Aii)没有观察到棕色染色。用50ng R0样品仅观察到轻微染
色(图22Aiv)。用5ng R6样品观察到更多染色(图22Aiii)，并且当使用50ng R6文库时观察
到强染色(图22Av)。这些数据表明，DIG修饰的寡核苷酸文库在本研究中使用的固定肾组织
样品中有效地消除用生物素修饰的寡核苷酸文库观察到的背景染色。
22Aiii显示用5ng第6轮(R6)文库的染色，图22Aiv显示用50ng未富集(R0)文库的染色和图
22Av显示用50ng的第6轮(R6)文库的染色。所有图像均以20x放大率获取。在图中，无文库对
照(图22Ai)和5ng R0样品(图22Aii)没有观察到棕色染色。用50ng R0样品仅观察到轻微染
色(图22Aiv)。用5ng R6样品观察到更多染色(图22Aiii)，并且当使用50ng R6文库时观察
到强染色(图22Av)。这些数据表明，DIG修饰的寡核苷酸文库在本研究中使用的固定肾组织
样品中有效地消除用生物素修饰的寡核苷酸文库观察到的背景染色。
[1339] 我们还检查了富集期间的孵育时间是否影响富集过程。针对肾组织进行四种不同的富集，其中富集期间的文库孵育时间在30分钟、1小时、2小时和3小时变化。然后，在每种孵育条件下，我们用来自六轮富集的50ng文库进行抗-DIG染色。我们发现孵育时间与染色
强度相关：孵育时间越长，染色越强。参见图22B，其显示来自六轮富集的载玻片，孵育时间为30分钟(图22Bi)、1小时(图22Bii)、2小时(图22Biii)和3小时(图22Biv)。
强度相关：孵育时间越长，染色越强。参见图22B，其显示来自六轮富集的载玻片，孵育时间为30分钟(图22Bi)、1小时(图22Bii)、2小时(图22Biii)和3小时(图22Biv)。
[1340] 实施例29：针对FFPE组织裂解产物的载玻片上寡核苷酸探针的富集
[1341] 在某些情况中，如在上文实施例19-28中所述的实验中，包含肿瘤样品的石蜡块，或包含来自这些块的切片的多个载玻片是可得的。在这样的情况中，来自单一样品的多个
载玻片，包括但不限于来自肿瘤的多个切片，可用于寡核苷酸探针文库富集和/或探测。在
这一实施例中，我们开发了针对FFPE组织裂解产物的载玻片上寡核苷酸探针富集的方法。
将来自FFPE组织载玻片的裂解产物排列到硝酸纤维素膜载玻片上用于富集和分析。在某些
情况中，这样的替代方法可能证明是有益的，例如，在有限的样品可用的情况下，例如每个
患者或肿瘤样品的单个FFPE组织载玻片。
载玻片，包括但不限于来自肿瘤的多个切片，可用于寡核苷酸探针文库富集和/或探测。在
这一实施例中，我们开发了针对FFPE组织裂解产物的载玻片上寡核苷酸探针富集的方法。
将来自FFPE组织载玻片的裂解产物排列到硝酸纤维素膜载玻片上用于富集和分析。在某些
情况中，这样的替代方法可能证明是有益的，例如，在有限的样品可用的情况下，例如每个
患者或肿瘤样品的单个FFPE组织载玻片。
[1342] 方法2300在图23A中概述。如所示的，将1μL的2.5μg/μl FFPE裂解产物排列到硝酸纤维素膜载玻片(AVID膜载玻片+64-孔ProPlate；Grace Bio-Labs，Bend，Oregon)上2301。将载玻片在4℃下风干过夜(O/N)2302.将载玻片在含50μl 1X PBS，3mM MgCl2的洗涤缓冲
液中洗涤六次2303。将本文所述的原始F-Trin文库以各种浓度(0.1/0.5/2.5ng)以20μl加
入到某些孔中，具有包含1X PBS(pH 7.4)，3mM MgCl2，1％HSA，0.5％F127，8ng/μl鲑精DNA和8ng/μl酵母tRNA 2304的阻断缓冲液2304。将文库在膜载玻片上在室温(RT)下以100rpm
振摇孵育1小时。孵育后，将膜载玻片用洗涤缓冲液洗涤五次2305。膜载玻片的孔用移液管
尖端刮下并转移至30μl H2O 2306。在刮擦中回收的寡核苷酸如本文所述通过不对称PCR扩
增，且单链寡核苷酸探针(ssDNA)被纯化2307。对于所需的富集轮数，将阻断溶液中的0.1/
0.5/2.5ng的前一轮的富集文库加入新鲜的薄膜载玻片2308。孵育后，如在第1轮中回收并
扩增与样品结合的寡核苷酸探针2309。在第3轮后使用下一代测序对回收的文库进行测序
2310。
液中洗涤六次2303。将本文所述的原始F-Trin文库以各种浓度(0.1/0.5/2.5ng)以20μl加
入到某些孔中，具有包含1X PBS(pH 7.4)，3mM MgCl2，1％HSA，0.5％F127，8ng/μl鲑精DNA和8ng/μl酵母tRNA 2304的阻断缓冲液2304。将文库在膜载玻片上在室温(RT)下以100rpm
振摇孵育1小时。孵育后，将膜载玻片用洗涤缓冲液洗涤五次2305。膜载玻片的孔用移液管
尖端刮下并转移至30μl H2O 2306。在刮擦中回收的寡核苷酸如本文所述通过不对称PCR扩
增，且单链寡核苷酸探针(ssDNA)被纯化2307。对于所需的富集轮数，将阻断溶液中的0.1/
0.5/2.5ng的前一轮的富集文库加入新鲜的薄膜载玻片2308。孵育后，如在第1轮中回收并
扩增与样品结合的寡核苷酸探针2309。在第3轮后使用下一代测序对回收的文库进行测序
2310。
[1343] 上述过程在排列有用具有各种解剖学起源的来自人受试者的FFPE组织载玻片的裂解产物的薄膜载玻片上进行，包括乳腺、结肠、肾、肺和胰腺。在三轮富集后，如上所述对“Rd3”文库进行测序2310。在所有情况下，在用0.1ng寡核苷酸文库孵育的样品中观察到最
大数量的序列。
大数量的序列。
[1344] 如上所述用乳腺和胰腺FFPE裂解产物进行再三轮的富集。在一个富集组中，方法2300如上所述。由来自乳腺组织的裂解产物上的六轮正向选择产生的文库被称为Br_Rd6_
Lib。在下一富集组中，方法2300如上所述，其中在孵育期间添加竞争剂组织裂解产物2304。
对于第4-6轮中的这一步骤，我们添加了在80μl阻断缓冲液中的来自不同组织的富集的
0.1/0.5/2.5ng的0.1ng Rd3文库。例如，将来自乳腺裂解产物富集的Rd3文库同时与乳腺和
胰腺裂解产物孵育。保留与乳腺裂解产物结合的序列，同时丢弃与胰腺裂解产物结合的序
列。由来自乳腺组织的裂解产物上的六轮正向选择产生的文库，其中最后三轮的富集包括
与来自胰腺组织的裂解产物的竞争，被称为Br_Rd6+_Lib。
Lib。在下一富集组中，方法2300如上所述，其中在孵育期间添加竞争剂组织裂解产物2304。
对于第4-6轮中的这一步骤，我们添加了在80μl阻断缓冲液中的来自不同组织的富集的
0.1/0.5/2.5ng的0.1ng Rd3文库。例如，将来自乳腺裂解产物富集的Rd3文库同时与乳腺和
胰腺裂解产物孵育。保留与乳腺裂解产物结合的序列，同时丢弃与胰腺裂解产物结合的序
列。由来自乳腺组织的裂解产物上的六轮正向选择产生的文库，其中最后三轮的富集包括
与来自胰腺组织的裂解产物的竞争，被称为Br_Rd6+_Lib。
[1345] 在富集后，我们使用Br_Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib以及起始原始F-TRin文库(即Rd0)来染色正常的乳腺、结肠、肾和肺组织载玻片。一般如上文实施例40中所述，每载玻片使用
50ng的文库，载玻片使用SA-HRP系统进行染色。当用Br_Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib寡核苷酸探
针文库探测乳腺组织时，我们观察到比用Rd0原始对照更高水平的染色。代表性的结果如图
23B中所示。在Rd0载玻片中观察到一些背景染色(图23Bi)，但用Br_Rd6+_Lib(图23Bii)和
Br_Rd6_Lib(图23Biii)载玻片染色的水平高得多。
50ng的文库，载玻片使用SA-HRP系统进行染色。当用Br_Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib寡核苷酸探
针文库探测乳腺组织时，我们观察到比用Rd0原始对照更高水平的染色。代表性的结果如图
23B中所示。在Rd0载玻片中观察到一些背景染色(图23Bi)，但用Br_Rd6+_Lib(图23Bii)和
Br_Rd6_Lib(图23Biii)载玻片染色的水平高得多。
[1346] 以上结果显示具有与膜载玻片结合的FFPE组织裂解产物上的选择的寡核苷酸探针文库富集。我们进一步证明富集的适体可以染色FFPE组织载玻片。参见，例如，图23B。如果工作材料的量是有限的，这一途径具有效用，且具有针对多个靶标使用相同文库进行单
键性选择的能力。
键性选择的能力。
[1347] 我们接着从用于正常乳腺组织的载玻片上染色的Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib寡核苷酸探针文库选择某些高丰度和高倍数变化寡核苷酸适体。作为染色实验的对照，我们使用
在可变区中具有互补序列的寡核苷酸。所选择的序列用5′-生物素合成。以10ng/μL的终浓
度合并各组序列。例如，将选自Br_Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib文库的具有高丰度序列的八个探
针组合在单个管中，并将八个相应的反向互补序列寡核苷酸合并在单独的管中。我们将
25ng、50ng或100ng的每个寡核苷酸集合应用于组织载玻片用于染色。将来自与用于裂解产
物制备的那些相同的块的正常乳腺组织载玻片用于染色。将载玻片在0.1％Triton X-100
中预处理10分钟，并在蒸馏水中清洗。表位修复在96℃下进行45分钟。染色实验方案如以上
实施例中所述使用链霉亲和素-HRP系统。所选择序列显示在表45中。该表显示了所鉴定序
列的可变区。全长序列包含围绕可变区的5′区5′-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和
3′区5′-CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)。
在可变区中具有互补序列的寡核苷酸。所选择的序列用5′-生物素合成。以10ng/μL的终浓
度合并各组序列。例如，将选自Br_Rd6_Lib和Br_Rd6+_Lib文库的具有高丰度序列的八个探
针组合在单个管中，并将八个相应的反向互补序列寡核苷酸合并在单独的管中。我们将
25ng、50ng或100ng的每个寡核苷酸集合应用于组织载玻片用于染色。将来自与用于裂解产
物制备的那些相同的块的正常乳腺组织载玻片用于染色。将载玻片在0.1％Triton X-100
中预处理10分钟，并在蒸馏水中清洗。表位修复在96℃下进行45分钟。染色实验方案如以上
实施例中所述使用链霉亲和素-HRP系统。所选择序列显示在表45中。该表显示了所鉴定序
列的可变区。全长序列包含围绕可变区的5′区5′-CTAGCATGACTGCAGTACGT(SEQ ID NO 4)和
3′区5′-CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA(SEQ ID NO 5)。
[1348] 表45：选择用于染色的序列
[1349]
[1350] 我们观察到染色越多，探针的输入越高。因此，用100ng寡核苷酸探针探测产生最高水平的染色，尽管具有最高水平的背景染色。代表性的结果显示在图23C和图23D(均为20
倍放大率)中。图23C显示了用通过丰度选择的8个序列(即表45中的前8个序列)的100ng集
合进行探测的结果，其显示了最高的染色强度。图23D显示了用通过高倍数变化选择的8个
序列(即表45中的最后8个序列)的25ng集合进行探测的结果，其显示较低的染色强度，但也
显示阴性对照的降低的背景。在两幅图中，最左边的图(i)显示用这些寡核苷酸染色的载玻
片，其中右图(ii)显示用它们的反向互补序列的染色。
倍放大率)中。图23C显示了用通过丰度选择的8个序列(即表45中的前8个序列)的100ng集
合进行探测的结果，其显示了最高的染色强度。图23D显示了用通过高倍数变化选择的8个
序列(即表45中的最后8个序列)的25ng集合进行探测的结果，其显示较低的染色强度，但也
显示阴性对照的降低的背景。在两幅图中，最左边的图(i)显示用这些寡核苷酸染色的载玻
片，其中右图(ii)显示用它们的反向互补序列的染色。
[1351] 实施例30：刮除的组织上的寡核苷酸探针富集
[1352] 作为另一可选富集方案，在这一实施例中我们在从FFPE载玻片刮除的组织上在Eppendorf管中进行寡核苷酸探针文库富集。如在实施例29中，这种方法在某些情景中可能
是有益的，包括但不限于有限组织可用时，如单个FFPE载玻片。
是有益的，包括但不限于有限组织可用时，如单个FFPE载玻片。
[1353] 我们用本文所述的原始F-Trin文库开始。正向选择在结肠癌组织样品上进行，和负向选择在来自相同载玻片的非癌症组织上进行。癌症区域和非癌症组织由病理学家确
定。从载玻片上刮下选定的区域，然后放入Eppendorf管中。用针对癌组织的正向选择进行
三轮富集。用针对癌组织的正向选择和非癌症组织的负向选择进行五轮富集。在这些实验
中，通过超速离心进行未结合的文库的分离。例如，正向选择通过将寡核苷酸探针与肿瘤组
织一起孵育，并收集在超速离心过程中与组织共沉淀的寡核苷酸来进行。类似地，通过将寡
核苷酸探针与非癌症组织一起孵育，然后在超速离心后收集上清液进行负向选择。
定。从载玻片上刮下选定的区域，然后放入Eppendorf管中。用针对癌组织的正向选择进行
三轮富集。用针对癌组织的正向选择和非癌症组织的负向选择进行五轮富集。在这些实验
中，通过超速离心进行未结合的文库的分离。例如，正向选择通过将寡核苷酸探针与肿瘤组
织一起孵育，并收集在超速离心过程中与组织共沉淀的寡核苷酸来进行。类似地，通过将寡
核苷酸探针与非癌症组织一起孵育，然后在超速离心后收集上清液进行负向选择。
[1354] 我们使用在八轮富集后的文库(“R8”文库)以染色来自用于富集过程中的四个结肠癌病例的固定组织。我们使用未富集的文库(“R0”)作为对照。如实施例25中使用Ventana Discovery系统采用50ng文库/载玻片和SA-HRP系统进行染色。我们比较了来自单一载玻片
的癌症和非癌症区域的染色强度。参见图24A。该图显示R0对照文库在癌症组织上(i)、R8富
集文库在癌症组织上(ii)、R0对照文库在非癌症组织上(iii)和R8富集文库在非癌症组织
上(iv)的染色。如图中所示，在使用富集的(第8轮)文库的癌症组织中观察到最强的染色。
在使用富集(第8轮)文库的非癌症组织上观察到最小染色。最后，在使用未富集(第0轮)文
库的任何组织上未观察到染色。这些结果表明，富集过程对产生可以区分结肠癌组织的寡
核苷酸探针文库是有效的。
的癌症和非癌症区域的染色强度。参见图24A。该图显示R0对照文库在癌症组织上(i)、R8富
集文库在癌症组织上(ii)、R0对照文库在非癌症组织上(iii)和R8富集文库在非癌症组织
上(iv)的染色。如图中所示，在使用富集的(第8轮)文库的癌症组织中观察到最强的染色。
在使用富集(第8轮)文库的非癌症组织上观察到最小染色。最后，在使用未富集(第0轮)文
库的任何组织上未观察到染色。这些结果表明，富集过程对产生可以区分结肠癌组织的寡
核苷酸探针文库是有效的。
[1355] 我们也使用R8文库染色来自未用于富集过程中的四个结肠癌病例的固定组织。代表性的结果如图24B所示。该图显示R0对照文库在癌症组织上(i)、R8富集文库在癌症组织
上(ii)、R0对照文库在非癌症组织上(iii)和R8富集文库在非癌症组织上(iv)的染色。如图
中所示，在使用富集的(第8轮)文库的癌症组织上观察到最强的染色。对于三个病例，我们
在使用富集的(第8轮)文库的非癌症组织上没有观察到染色，而一个病例显示轻微染色。另
外，我们没有观察到使用未富集(第0轮)文库的任何组织的染色，而在非癌症组织上显示用
R8文库的轻微染色的相同病例也同样显示出使用R0文库的轻微染色。这些结果表明，富集
的寡核苷酸探针文库可以高精度地区分结肠癌组织，因为我们在这一样品集中没有观察到
假阴性和观察到一个潜在的假阳性。
上(ii)、R0对照文库在非癌症组织上(iii)和R8富集文库在非癌症组织上(iv)的染色。如图
中所示，在使用富集的(第8轮)文库的癌症组织上观察到最强的染色。对于三个病例，我们
在使用富集的(第8轮)文库的非癌症组织上没有观察到染色，而一个病例显示轻微染色。另
外，我们没有观察到使用未富集(第0轮)文库的任何组织的染色，而在非癌症组织上显示用
R8文库的轻微染色的相同病例也同样显示出使用R0文库的轻微染色。这些结果表明，富集
的寡核苷酸探针文库可以高精度地区分结肠癌组织，因为我们在这一样品集中没有观察到
假阴性和观察到一个潜在的假阳性。
[1356] 实施例31：使用显微解剖的寡核苷酸探针富集
[1357] 激光捕获显微解剖(LCM)，也称为显微解剖、激光显微解剖(LMD)或激光辅助显微解剖(LMD或LAM)，是用于从组织/细胞/生物体的显微区域分离特定目标细胞的方法。在这
一实施例中，我们使用LCM作为提取组织用于如本文所述的寡核苷酸探针富集的方法。该方
法包括借助于激光在微观尺度上进行解剖。LCM技术可以直接收获感兴趣的细胞，或者可以
通过切除不需要的细胞来分离特定的细胞以得到组织学上纯的富集细胞群体。将激光偶联
到显微镜中并聚焦到载玻片上的组织上。通过激光的移动，切出元件并将其与相邻的组织
分离。
一实施例中，我们使用LCM作为提取组织用于如本文所述的寡核苷酸探针富集的方法。该方
法包括借助于激光在微观尺度上进行解剖。LCM技术可以直接收获感兴趣的细胞，或者可以
通过切除不需要的细胞来分离特定的细胞以得到组织学上纯的富集细胞群体。将激光偶联
到显微镜中并聚焦到载玻片上的组织上。通过激光的移动，切出元件并将其与相邻的组织
分离。
[1358] 提取过程接着切割过程。在一种这样的方法中，将粘性表面压迫到样品上，然后将其撕掉。这提取了所需的区域，但也可能除去表面上的颗粒或不需要的组织。在另一种方法
中，将塑料膜熔化到样品上，然后将其撕掉。用激光加热膜以将其熔化到样品上。该方法也
可能提取不需要的碎片。提取也可以在不接触的情况下进行。在一种这样的方法中，通过激
光压和重力(重力辅助显微解剖)输送样品。在另一种方法中，涂覆有粘合剂的盖子直接定
位在薄切的组织切片上，该切片本身安置在薄膜(例如，聚乙烯萘)上。激光温和地加热盖子
上的粘合剂，将其与下面的组织融合，且另一个激光切过组织和下面的膜。膜-组织实体现
在粘附在帽上，且帽上的细胞可用于下游应用(DNA、RNA、蛋白质分析)。
中，将塑料膜熔化到样品上，然后将其撕掉。用激光加热膜以将其熔化到样品上。该方法也
可能提取不需要的碎片。提取也可以在不接触的情况下进行。在一种这样的方法中，通过激
光压和重力(重力辅助显微解剖)输送样品。在另一种方法中，涂覆有粘合剂的盖子直接定
位在薄切的组织切片上，该切片本身安置在薄膜(例如，聚乙烯萘)上。激光温和地加热盖子
上的粘合剂，将其与下面的组织融合，且另一个激光切过组织和下面的膜。膜-组织实体现
在粘附在帽上，且帽上的细胞可用于下游应用(DNA、RNA、蛋白质分析)。
[1359] FFPE样品通常固定于玻璃载玻片。我们发现并非所有LCM方法都适用于这些样品的寡核苷酸探针富集。例如，在表位修复之后但在添加寡核苷酸探针文库之前的LCM是有问
题的，因为样品在表位修复后不应脱水。如果转移膜在标准热表位修复期间不能保持，则在
表位修复之前的LCM可能对热诱导的表位修复产生问题。例如，我们使用
MaxLCM Caps和来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA)的ArcturusXT显微解剖系统
测试样品提取，并发现标准的加热表位修复条件(95℃)可能会熔化或破坏捕获膜。
题的，因为样品在表位修复后不应脱水。如果转移膜在标准热表位修复期间不能保持，则在
表位修复之前的LCM可能对热诱导的表位修复产生问题。例如，我们使用
MaxLCM Caps和来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA)的ArcturusXT显微解剖系统
测试样品提取，并发现标准的加热表位修复条件(95℃)可能会熔化或破坏捕获膜。
[1360] 为了解决这些问题，我们从本文所述的原始F-Trin文库开始，在粘附到LCM SureCaps的乳房组织上进行了四轮富集，具有75℃下的表位修复。我们使用得到的R4寡核
苷酸探针文库以使用如实施例19中的Dako平台对固定的乳房组织进行染色，在文库添加后
的一至三个洗涤步骤之间具有75℃或97℃下的表位修复。利用75℃下的表位修复和一个洗
涤步骤(即最低严格的洗涤条件)，未观察到染色。97℃下的表位修复和一个洗涤步骤产生
富集文库(R4)的最强染色。在这些条件下，我们用R0文库获得略少的染色和用无DNA对照获
得最小背景。包括97℃下的表位修复和严格的三个洗涤步骤的条件导致用富集的文库(R4)
的最强染色和用R0文库的略少染色。用无DNA对照发现最小背景，但明显低于用一个洗涤步
骤。然后我们针对固定乳房组织的染色测试了Dako和Ventana IHC系统。分别参见实施例19
和25。我们与严格的染色实验方案相结合进行文库输入滴度(Dako：50ng、25ng和12ng；
Ventana：50ng和25ng)，包括文库的中25％BlockAid，SA-HRP中的19％BlockAid，0.01％
Triton X-100和文库添加后的四次洗涤。当使用Dako系统时，我们观察到对于所有文库输
入(即50ng、25ng和12ng)使用R4文库的染色强于未富集的R0文库。代表性的结果显示在图
25A中，其显示用50ng R4文库(图25Ai)或R0对照(图25Aii)染色的样品。当使用Ventana系
统时，我们对于两种文库输入(即50ng和25ng)还观察到R4文库比未富集的R0文库更强的染
色。代表性的结果显示在图25B中，其显示用25ng R4文库(图25Bi)或R0对照(图25Bii)染色
的样品。在这些条件下，R0对照的背景染色最小。
苷酸探针文库以使用如实施例19中的Dako平台对固定的乳房组织进行染色，在文库添加后
的一至三个洗涤步骤之间具有75℃或97℃下的表位修复。利用75℃下的表位修复和一个洗
涤步骤(即最低严格的洗涤条件)，未观察到染色。97℃下的表位修复和一个洗涤步骤产生
富集文库(R4)的最强染色。在这些条件下，我们用R0文库获得略少的染色和用无DNA对照获
得最小背景。包括97℃下的表位修复和严格的三个洗涤步骤的条件导致用富集的文库(R4)
的最强染色和用R0文库的略少染色。用无DNA对照发现最小背景，但明显低于用一个洗涤步
骤。然后我们针对固定乳房组织的染色测试了Dako和Ventana IHC系统。分别参见实施例19
和25。我们与严格的染色实验方案相结合进行文库输入滴度(Dako：50ng、25ng和12ng；
Ventana：50ng和25ng)，包括文库的中25％BlockAid，SA-HRP中的19％BlockAid，0.01％
Triton X-100和文库添加后的四次洗涤。当使用Dako系统时，我们观察到对于所有文库输
入(即50ng、25ng和12ng)使用R4文库的染色强于未富集的R0文库。代表性的结果显示在图
25A中，其显示用50ng R4文库(图25Ai)或R0对照(图25Aii)染色的样品。当使用Ventana系
统时，我们对于两种文库输入(即50ng和25ng)还观察到R4文库比未富集的R0文库更强的染
色。代表性的结果显示在图25B中，其显示用25ng R4文库(图25Bi)或R0对照(图25Bii)染色
的样品。在这些条件下，R0对照的背景染色最小。
[1361] 这些结果证明寡核苷酸探针文库使用显微解剖的FFPE组织样品的富集。如同对于实施例30，这一途径可以提供更纯的样品，例如，通过切割纯癌的细胞用于分析。如同对于
实施例30-31，途径也可以证明在一些情况下如在有限的样品可得时是有益的。且如在实施
例30中，癌症和非癌症样品可以从单一载玻片提取。
实施例30-31，途径也可以证明在一些情况下如在有限的样品可得时是有益的。且如在实施
例30中，癌症和非癌症样品可以从单一载玻片提取。
[1362] 虽然本发明的优选实施方式已经在本文中显示和描述，但本领域技术人员显而易见的是这样的实施方式仅通过举例的方式提供。多种变异、变化和置换现在是本领域技术
人员容易想到的而不脱离本发明，应当理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代方式
可以用于实施本发明。意图的是以下权利要求限定本发明的范围且这些权利要求的范围内
的方法和结构及其等同由此覆盖。
人员容易想到的而不脱离本发明，应当理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代方式
可以用于实施本发明。意图的是以下权利要求限定本发明的范围且这些权利要求的范围内
的方法和结构及其等同由此覆盖。
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