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用于在血浆全血中检测抗凝剂的方法和装置

阅读:52发布:2020-08-09

专利汇可以提供用于在血浆全血中检测抗凝剂的方法和装置专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且描述了用于评价凝血的方法和装置,其包括用于检测抗凝剂或凝血异常的方法和装置。在多个实施方案中,本 发明 的方法和装置测量样品响应于一种或更多种凝血因子的梯度的凝血。可以对这些响应进行评价以准确描述样品的凝血障碍,包括抗凝药物的存在。在多个实施方案中,本发明用可由受过最低限度训练的人员使用的方便的微流控装置提供即时检测或床边检测。,下面是用于在血浆全血中检测抗凝剂的方法和装置专利的具体信息内容。

1.评估血液样品中凝血的方法,其包括:
向所述血液样品的部分添加凝血因子,每个部分接收不同浓度的所述凝血因子;
测量所述样品的每个部分的血形成;以及
确定血块形成对所述凝血因子的浓度的响应。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品是全血血浆
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述样品是全血,并且所述样品的每个部分小于约
1mL。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述样品的每个部分小于约100μL。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述样品的每个部分为约50μL或更少。
6.根据权利要求1所述的方法,其包括确定血块形成对递增浓度的一种或更多种凝血因子的响应,所述凝血因子选自内源性途径、外源性途径和共同途径的因子。
7.根据权利要求6所述的方法,其包括确定血块形成对递增浓度的至少两种凝血因子的响应。
8.根据权利要求6所述的方法,其包括确定血块形成对递增浓度的至少三种凝血因子或至少四种凝血因子的响应。
9.根据权利要求7所述的方法,其中凝血因子选自因子I至XIII,或其活化形式。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述凝血因子包括因子I至XIII中的一种或更多种的活化形式。
11.根据权利要求10所述的方法,其包括确定血块形成对递增浓度的至少因子IIa和因子Xa的响应。
12.根据权利要求11所述的方法,其包括确定血块形成对递增浓度的因子IIa、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII和因子XIIa中的至少四种的响应。
13.根据权利要求6所述的方法,其中至少一种凝血因子是冯·维勒布兰德因子、前激肽释放酶(弗莱彻因子)、高分子量激肽原(HMWK)(菲茨杰拉德因子)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI2)、组织因子途径抑制剂(TFPI)或癌促凝剂。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中将所述凝血因子以0.1ng/mL至10μg/mL的浓度添加至所述样品的部分。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述凝血因子的浓度在所述样品的部分之间相差至少两倍。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述凝血因子的浓度在所述样品的部分之间相差5倍至20倍。
17.根据权利要求14所述的方法,其包括添加至少四个浓度的所述凝血因子。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其包括测量血块形成时间。
19.根据权利要求18所述的方法,其中血块形成是通过图像传感器、测量光吸收度、测量荧光检测或通过超声来测量的。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法,其中血块形成是通过以下中的一项或更多项来测量的:电阻抗、添加珠并量化珠的流量和/或数目、在血块形成部位处的流速和/或压血栓弹力图、使用荧光纤维蛋白原的荧光检测、浊度、红外光谱、使用声和/或光子传感器的检测、流式细胞术以及视觉凝血检测。
21.根据权利要求20所述的方法,其中血块形成是通过成像来测量的。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述成像是明视野成像。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法,其还包括将血块形成时间与一个或更多个参考范围进行比较。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述参考范围包含正常范围和异常范围。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述异常范围包含患有凝血级联异常的个体的凝血时间。
26.根据权利要求24所述的方法,其中一个或更多个参考范围包括包含特定量的凝血抑制剂的样品的测量值。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法,其中使所述部分流过微流控装置的单独通道,所述通道配置成触发和/或定位血块形成。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述通道包含触发流动中的扰动以允许血块形成和/或定位的位置
29.根据权利要求27或28所述的方法,其中所述通道是具有相同几何形状的微通道。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法,其中所述通道包含位于所述装置的近侧的血块形成区域。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法,其中所述装置的每个通道具有独立的样品输入端口。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的方法,其中每个通道或通道的组连接至公共样品输入端口。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法,其中所述通道涂覆有或包含不同量的凝血因子。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述微流控装置包含至少两个系列通道,其中第一系列通道包含第一凝血因子,所述第一凝血因子的量在所述第一系列通道的通道之间递增,并且第二系列通道包含第二凝血因子,所述第二凝血因子的量在所述第二系列通道的通道之间递增。
35.根据权利要求34所述的方法,其中第三系列通道包含以不同的量或浓度并入到所述第三系列的每个通道中的第三凝血因子。
36.根据权利要求27至32中任一项所述的方法,其中在样品输入到所述微流控装置中之前将所述凝血因子添加至所述样品,或者通过一个或更多个所述通道的端口添加至所述样品。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法,其中在固定的时间测量每个所述通道中的血块形成程度。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法,其还包括将添加至所述样品。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法,其中所述样品来自正在接受用抗凝剂治疗的对象。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述抗凝剂是选自FXa抑制剂、FIIa抑制剂、FXI抑制剂、FXIa抑制剂、FXII抑制剂和FXIIa抑制剂的因子特异性抑制剂。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述抗凝剂是利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、达比加群或贝曲沙班。
42.根据权利要求39所述的方法,其中所述抗凝剂是肝素或维生素K拮抗剂。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法,其中:
当凝血时间延长且递增浓度的凝血因子不能使所述凝血时间正常化时,则所述样品在所述凝血因子下游具有凝血抑制或凝血缺陷;或者
当存在凝血因子浓度依赖性的凝血时间减少时,则所述样品具有所述凝血因子的凝血抑制或凝血缺陷。
44.根据权利要求43所述的方法,其中通过添加处于所述抑制或缺陷下游的活化形式凝血因子来确定正常化凝血时间。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法,其中确定所述响应包括检测所述样品中的因子特异性抑制剂,并且还包括向从其获得样品的对象施用逆转剂。
46.根据权利要求1至38中任一项所述的方法,其中所述样品来自患有或怀疑患有以下的对象:血友病A(因子VIII缺乏症),血友病B(因子IX缺乏症),血友病C(因子XI缺乏症),因子I(纤维蛋白原)缺乏症,因子V缺乏症,因子VII缺乏症,因子X缺乏症,因子XIII缺乏症,α
2-抗胰蛋白酶缺乏症,α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh(抗凝血酶III Pittsburgh)缺乏症,任选地选自因子V和VIII以及因子II、VII、IX和X的组合因子缺乏症,或者血小板异常。
47.用于检测凝血的微流控装置,所述装置包含:
在基底中形成的多个通道,每个通道包含血块形成区域,所述血块形成区域具有配置成触发和/或定位血块形成的几何形状,
其中所述多个通道具有相同的几何形状。
48.根据权利要求47所述的微流控装置,其中所述通道的所述血块形成区域位于所述装置的近侧。
49.根据权利要求48所述的微流控装置,其中所述多个通道的所述血块形成区域布置在所述装置的中心区中。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的微流控装置,其中所述装置的每个通道具有独立的样品输入端口。
51.根据权利要求50所述的微流控装置,其中每个通道具有独立的输出端口,并且所述输入和输出端口任选地在所述装置的外围以交替的方式布置。
52.根据权利要求47至49中任一项所述的微流控装置,其中每个通道或通道的组连接至公共样品输入端口。
53.根据权利要求47至52中任一项所述的微流控装置,其中所述通道包含一个或更多个另外的输入端口以接收一种或更多种另外的试剂
54.根据权利要求47至53中任一项所述的微流控装置,其中所述通道涂覆有或包含不同量的凝血因子。
55.根据权利要求54所述的微流控装置,其中所述凝血因子包含选自内源性途径、外源性途径和共同途径的一种或更多种凝血因子。
56.根据权利要求55所述的微流控装置,其中所述一种或更多种凝血因子选自因子I至XIII,或其活化形式。
57.根据权利要求56所述的微流控装置,其中所述一种或更多种凝血因子是活化形式。
58.根据权利要求57所述的微流控装置,其中一种凝血因子是因子IIa并且第二凝血因子是因子Xa。
59.根据权利要求54所述的微流控装置,其中所述凝血因子是冯·维勒布兰德因子、前激肽释放酶(弗莱彻因子)、高分子量激肽原(HMWK)(菲茨杰拉德因子)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI2)、组织因子途径抑制剂(TFPI)或癌促凝剂。
60.根据权利要求54所述的微流控装置,其包含至少两个系列通道,其中第一系列通道包含第一凝血因子,所述第一凝血因子的量在所述第一系列通道的通道之间递增,并且第二系列通道包含第二凝血因子,所述第二凝血因子的量在所述第二系列通道的通道之间递增。
61.根据权利要求60所述的微流控装置,其中第三系列通道包含以不同的量并入到所述第三系列的每个通道中的第三凝血因子。
62.根据权利要求61所述的微流控装置,其中所述凝血因子包含因子II、因子IIa、因子X、因子Xa或其组合中的一种或更多种。
63.根据权利要求61所述的微流控装置,其中一种凝血因子是凝血酶(因子IIa)并且另一种凝血因子是因子Xa。
64.根据权利要求61所述的微流控装置,其中一种凝血因子是因子IIa,第二凝血因子是因子Xa,第三凝血因子是因子XIa或因子XI,并且第四凝血因子是因子XIIa或因子XII。
65.根据权利要求54至64中任一项所述的微流控装置,其中凝血因子的量在组中的通道之间相差至少2倍。
66.根据权利要求65所述的微流控装置,其中凝血因子的量在组中的通道之间相差5倍至20倍。
67.根据权利要求54至66中任一项所述的微流控装置,其中至少一个通道不包含凝血因子。
68.根据权利要求54至67中的任一项所述的微流控装置,其中所述微流控装置在固定的时间测量每个所述通道中的血块形成。
69.根据权利要求68所述的微流控装置,其配置成通过以下中的一项或更多项来测量所述通道中的血块形成:电阻抗、添加珠并量化珠的流量/数目、在血块形成部位处的流速和/或压力、血栓弹力图、使用荧光纤维蛋白原的荧光检测、浊度、红外光谱、使用声和/或光子传感器的检测、流式细胞术以及视觉凝血检测。
70.根据权利要求69所述的微流控装置,其包含用于测量所述通道中的血块形成的成像部件。
71.根据权利要求70所述的微流控装置,其中所述成像是明视野成像。
72.用于检测凝血的微流控装置,所述装置包含:
在基底中形成的多个通道,每个通道包含血块形成区域,所述血块形成区域具有配置成触发和/或定位血块形成的几何形状;
其中所述多个通道涂覆有或包含不同量的凝血因子。
73.根据权利要求72所述的微流控装置,其中所述凝血因子包含选自内源性途径、外源性途径和共同途径的一种或更多种凝血因子。
74.根据权利要求73所述的微流控装置,其中所述一种或更多种凝血因子选自因子I至XIII,或其活化形式。
75.根据权利要求74所述的微流控装置,其中所述一种或更多种凝血因子是活化形式。
76.根据权利要求75所述的微流控装置,其中一种凝血因子是因子IIa并且第二凝血因子是因子Xa。
77.根据权利要求72所述的微流控装置,其中至少一种凝血因子是冯·维勒布兰德因子、前激肽释放酶(弗莱彻因子)、高分子量激肽原(HMWK)(菲茨杰拉德因子)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI2)、组织因子途径抑制剂(TFPI)或癌促凝剂。
78.根据权利要求72至77中任一项所述的微流控装置,其中所述通道的所述血块形成区域位于所述装置的近侧。
79.根据权利要求78所述的微流控装置,其中所述多个通道的所述血块形成区域布置在所述基底的中心区中。
80.根据权利要求72至79中任一项所述的微流控装置,其中所述装置的每个通道具有独立的样品输入端口。
81.根据权利要求80所述的微流控装置,其中每个通道具有独立的输出端口,所述输入和输出端口任选地在所述基底的外围以交替的方式布置。
82.根据权利要求72至79中任一项所述的微流控装置,其中每个通道或通道的组连接至公共样品输入端口。
83.根据权利要求72至82中任一项所述的微流控装置,其中所述通道包含一个或更多个另外的输入端口以接收一种或更多种另外的试剂。
84.根据权利要求72至83中任一项所述的微流控装置,其中所述通道具有相同的几何形状。
85.根据权利要求72至84中任一项所述的微流控装置,其中所述微流控装置包含至少两个系列通道,其中第一系列通道包含第一凝血因子,所述第一凝血因子的量在所述第一系列通道的通道之间递增,并且第二系列通道包含第二凝血因子,所述第二凝血因子的量在所述第二系列通道的通道之间递增。
86.根据权利要求85所述的微流控装置,其中第三系列通道包含以不同的量或浓度并入到所述第三系列的每个通道中的第三凝血因子。
87.根据权利要求72至86中任一项所述的微流控装置,其中所述凝血因子包含因子II、因子IIa、因子X、因子Xa或其组合中的一种或更多种。
88.根据权利要求87所述的微流控装置,其中一种凝血因子是凝血酶(因子IIa)并且另一种凝血因子是因子Xa。
89.根据权利要求87所述的微流控装置,其中一种凝血因子是因子IIa,第二凝血因子是因子Xa,第三凝血因子是因子XIa或因子XI,并且第四凝血因子是因子XIIa或因子XII。
90.根据权利要求72至89中任一项所述的微流控装置,其中凝血因子的量在组或系列中的通道之间相差至少2倍。
91.根据权利要求90所述的微流控装置,其中凝血因子的量在组或系列中的通道之间相差5倍至20倍。
92.根据权利要求72至91中任一项所述的微流控装置,其中至少一个通道不包含凝血因子。
93.根据权利要求72至92中任一项所述的微流控装置,其中所述微流控装置在固定的时间测量每个所述通道中的血块形成。
94.根据权利要求93所述的微流控装置,其配置成通过以下中的一项或更多项来测量所述通道中的血块形成:电阻抗、添加珠并量化珠的流量/数目、在血块形成部位处的流速和/或压力、血栓弹力图、使用荧光纤维蛋白原的荧光检测、浊度、红外光谱、使用声和/或光子传感器的检测、流式细胞术以及视觉凝血检测。
95.根据权利要求94所述的微流控装置,其包含用于测量所述通道中的血块形成的成像部件。
96.根据权利要求95所述的微流控装置,其中所述成像是明视野成像。

说明书全文

用于在血浆全血中检测抗凝剂的方法和装置

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2017年7月28日提交的美国临时申请No.62/538,618和于2018年7月17日提交的美国临时申请No.62/699,665的权益,其全部内容在此通过引用并入。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金No.P41 EB002503、P30 ES002109和P50GM021700的政府支持下完成的。政府在本发明中拥有某些权利。

背景技术

[0005] 凝血系统是出血与血栓形成之间的微妙平衡。存在许多疾病状态包括癌症、自身免疫病、感染、创伤、手术、心脏病和药物,其可能引起这种平衡的破坏并导致患者发生严重甚至危及生命的出血或凝血事件。针对血栓形成性疾病通常开具抗凝药物。常规的抗凝药物,例如肝素,将间接抑制多种凝血级联因子。直接口服抗凝剂(direct  oral anticoagulant,DOAC)的最近引入允许靶向抑制凝血途径。
[0006] 抗凝治疗的最大险是出血的风险提高,并因此,传统上,对服用抗凝药物的患者进行仔细监测以确保他们正在接受适当的剂量。目前可用于评价患者的出血和凝血的临床测试或者是基本的并提供非常模糊的信息,例如凝血酶原时间(prothrombin time,PT)和活化促凝血酶原激酶时间(activated thromboplastin time,aPTT),或者是更详细的但需要昂贵的机器、漫长的训练和小心的处理。后一类包括血栓弹图(thromboelastography,TEG)、血栓弹力测定(thromboelastometry,TEM)、旋转血栓弹力测定(rotational thromboelastometry,ROTEM)、血小板聚集测定(platelet aggregometry)和流式细胞术。目前,尚无针对DOAC的特定测试。已提出的大多数DOAC测定都是测量药物本身的绝对浓度的药代动力学测定,并因此提供的用以支持临床决策的功能信息有限。
[0007] 需要可检测、表征和/或量化凝血中的障碍的凝血测试,其包括在患者样品中检测DOAC以更好地管理处于高的严重出血或凝血风险之中的患者,包括但不限于紧急护理环境。

发明内容

[0008] 描述了用于评价凝血的方法和装置,其包括用于检测抗凝剂或凝血异常的方法和装置。凝血异常包括血形成的异常(例如,血栓形成)和血块降解的异常(例如,纤维蛋白溶解)。在多个实施方案中,本发明的方法和装置测量样品响应于一种或更多种凝血因子的梯度的凝血。可以对这些响应进行评价以准确描述样品的凝血障碍,包括DOAC或传统抗凝药物的存在。在多个实施方案中,本发明用可用由受过最少培训的人员使用的方便的微流控装置提供即时检测(point-of-care testing)或床边检测(bedside testing)。
[0009] 在一些方面,本发明提供了用于评估血液样品中凝血的方法。该方法包括向血液样品的多个部分(例如,等分试样)添加凝血因子,每个部分接收不同浓度的凝血因子,以及测量响应于不同浓度的血块形成或血块形成时间。通过评估响应于不同浓度的一种或更多种凝血因子的凝血,可准确地描述凝血功能,包括DOAC或其他药物对凝血的影响。在一些实施方案中,确定遗传性凝血异常的存在或不存在。可以使用所述的微流控装置来进行本文中所述的方法,其中一个或更多个通道可配置成触发血块的形成和定位(localization)。
[0010] 除非另有描述,否则如本文中使用的“血液样品”是指全血样品或血浆样品。术语血浆包括富血小板血浆(platelet-rich-plasma,PRP)和贫血小板血浆(platelet-poor-plasma,PPP)二者。
[0011] 如本文中使用的术语“凝血因子”意指与凝血级联(内源性、外源性和共同途径)有关的任何因子,包括因子I至XIII、冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor)、前激肽释放酶(弗莱彻因子(Fletcher factor))、高分子量激肽原(HMWK)(菲茨杰拉德因子(Fitzgerald factor))、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI2)、组织因子途径抑制剂(TFPI)和癌促凝剂。凝血因子可以为活化形式或未活化(例如,前体)形式。例如,为了检测样品中凝血因子抑制剂的存在,凝血因子应为活化形式(例如,因子Xa或因子IIa)。在另一些实施方案中,为了检测遗传性凝血异常,凝血因子可以为未活化形式(例如,因子X或因子II)。此外,凝血因子可以来自人、动物(例如、猪或其他),或者可以是合成的或重组的蛋白质
[0012] 在一些实施方案中,本发明提供了检测抗凝剂的方法。抗凝剂是防止或降低血液凝结、延长凝血时间的物质。抗凝剂包括但不限于因子特异性抑制剂(例如FXa抑制剂、FIIa抑制剂、FXIa抑制剂、FXIIa抑制剂)、肝素和维生素K拮抗剂(例如,华法林(warfarin))。在一些实施方案中,它们包括直接口服抗凝剂(DOAC),也称为新型口服抗凝剂(Novel Oral Anticoagulant,NOAC),例如Janssen Pharmaceuticals,Inc.的XARELTO(利伐沙班(Rivaroxaban))、Bristol-Myers  Squibb和Pfizer Inc.的ELIQUIS(阿哌沙班(Apixaban))、Daiichi Sankyo,Inc.的SAVAYSA(依度沙班(Edoxaban))、Boehringer Ingelheim的PRADAXA(达比加群(Dabigatran))和Portola Pharmaceuticals,Inc.的BEVYXXA(贝曲沙班(Betrixaban))。
[0013] 通过测量响应于递增浓度的外源添加的凝血因子的血块形成(例如,血块形成时间),可以确定治疗剂的抑制作用的存在和/或抑制点。例如,当向样品添加抑制剂所靶向的凝血因子时,对凝血抑制剂呈阳性的样品会显示出浓度依赖性的凝血时间减少。同时,与添加抑制点下游的凝血因子后的凝血时间相比,当添加(以递增的量)来自抑制点上游的凝血因子时,凝血时间将保持延长。参见图9至13。
[0014] 在一些实施方案中,可以将患者样品的结果与参考标准进行比较,所述参考标准包括对于正常和/或异常凝血的标准,或者对应于用特定药剂进行抗凝治疗的参考标准。在一些实施方案中,参考标准是对于患者个性化的。
[0015] 在多个实施方案中,可以构建凝血曲线以表征血块形成对浓度或量递增的多种凝血因子的添加的响应。这些凝血曲线允许确定凝血抑制剂的身份和量,从而指导患者护理。在一些实施方案中,然后向患者施用适当的凝血抑制剂逆转剂以根据需要逆转治疗干预。
[0016] 在一些方面,本发明提供了用于在样品中评价凝血的微流控装置。该装置包含在基底中的系列通道,每个通道具有这样的区域,所述区域具有触发和/或定位血块形成的几何形状,以允许评价响应于一种或更多种试剂(例如外源添加的凝血因子的量或浓度)的血块形成。该系列中的通道各自具有相同的几何形状,以触发相同的血块形成特性(当暴露于相同的样品和试剂时)。通过在一种或更多种凝血因子的梯度存在的情况下评价血块形成,本发明允许灵敏且特异性地检测凝血异常或障碍,包括样品中DOAC的存在或活性。
[0017] 在一个实施方案中,用于检测凝血的微流控装置包含在基底中形成的多个通道,每个通道包含血块形成区域,所述血块形成区域具有配置成触发和/或定位血块形成的几何形状。在一些实施方案中,多个通道的血块形成区域可布置在基底的中心区中,以使得可以同时在通道上对凝血特性进行成像或分析。参见图1A至1B、2B。该装置还可包含多个样品输入端口以接收样品(例如,全血或血浆),每个样品输入端口连接至多个通道之一的第一端。参见图1A至1D。在另一些实施方案中,该装置具有与多个通道或系列通道流体连通的单样品输入端口。参见图5A。在一些实施方案中,每个通道具有独立的输出端口,每个输出端口连接至多个通道之一的第二端。在使用独立样品输入端口的一些实施方案中,输入端口和输出端口可以在基底的外围以交替的方式布置。参见图1A至1B、2A。在一些实施方案中,输入端口和输出端口以除交替方式之外的方式布置。
[0018] 如本文中使用的术语“中心区”意指相对于基底的外围位于基底的中心并且可包含偏心定位的区的区。例如,取决于配置,中心区可以是偏心的并且微流控通道中血块开始的区域可以通过通道中的流动模式来控制。
[0019] 在一些实施方案中,多个通道的血块形成区域布置在基底的非中心例如但不限于外围的区中。参见图5A至5B。
[0020] 每个通道还可包含一个或更多个另外的输入端口以接收试剂,例如凝血因子和/或。在一些实施方案中,每个输出端口有多于一个的输入端口(例如,用于引入样品和一种或更多种试剂)。例如,在一个实施方案中,可存在用于样品的一个输入端口以及用于试剂的1至2个输入端口(例如,凝血因子和任选地钙)。参见图1B。在一些实施方案中,存在用于样品的一个公共输入端口,并且每个通道还包含用于试剂的另外的输入端口(例如,1或2个)。
[0021] 在微流控装置中,每个血块形成区域可配置成在流体流中产生停滞或扰动的区域以触发和/或定位血块的形成。在一些实施方案中,每个血块形成区域可配置成产生流动扰动的区域以触发和/或定位血块形成。用于触发和定位血块形成的示例性几何形状示于图2B、3A、5A和5B中。
[0022] 微流控装置的通道可涂覆有、包含或以其他方式包含不同量或浓度的凝血因子。例如,第一组或系列的多个通道可涂覆有、包含或以其他方式包含第一凝血因子,并且第二组或系列的多个通道可涂覆有、包含或以其他方式包含第二凝血因子。此外,在一些实施方案中,多个通道之一是阴性对照通道,例如,可未涂覆有并且可不包含凝血因子。在另一些实施方案中,装置不包含这样的阴性对照通道。
[0023] 在其中一个或更多个通道包含凝血因子的情况下,凝血因子可以为混悬液或溶液,或者为冻干的和非表面结合的。凝血因子可以预先包含在通道中(例如,在制造装置时),可以在将样品放入到装置中之前添加,或者可以与样品同时或在样品之后通过输入端口(或多个输入端口)进入装置中。
[0024] 在包含第一和第二组通道的微流控装置的一些实施方案中(无论这样的实施方案是否还可包含除第一和第二组通道之外的阴性对照通道),第一组的多个通道中的每个通道可涂覆有、包含或以其他方式包含不同量或浓度的第一凝血因子,并且第二组的多个通道中的每个通道可涂覆有、包含或以其他方式包含不同量或浓度的第二凝血因子。在一些实施方案中,微流控装置可包含多于两个组或系列的多个通道,例如三个、四个、五个或更多个组,其中每个组或系列的多个通道涂覆有、包含或以其他方式包含在整个组或系列中量递增的不同的凝血因子(例如,包含四组通道的微流控装置,每组的多个通道中都可涂覆有、包含或以其他方式包含选自因子IIa、Xa、XI、XIa、XII和XIIa的不同凝血因子)。通过测量作为凝血因子梯度的函数的血块形成或凝血时间,可以在凝血途径的数个特定点处对样品的凝血特性进行描述(示于图8中),从而为临床医生提供有关患者的凝血生理学和/或任何治疗干预的状态的详细且具体的信息。
[0025] 第二凝血因子可以在第一凝血因子的凝血级联中的上游。例如,第一凝血因子可以是例如凝血酶原(因子II)、凝血酶(因子IIa)或两者。第二凝血因子可以是例如因子X、因子Xa或两者。
[0026] 微流控装置还可包含检测装置,该检测装置配置成测量每个通道中的血块形成时间以基于所测量的血块形成时间来评估凝血。例如,检测装置可配置成同时对血块形成区域进行成像以测量血块形成时间。在一些实施方案中,在固定的时间量化每个通道中的血块形成程度。例如,与本文中所述的方法和装置有关的检测装置可包括显微镜和图像传感器。对血块形成区域进行成像可包括明视野成像。对于本文中所述的装置和测定,凝血时间还可用其他方法例如基于光吸收度的检测、荧光测量、超声等来测量,并且检测装置可配置成使用这些其他方法中的一种或更多种。检测凝血的方法还包括但不限于基于电阻抗的检测、添加珠并量化珠的流量(flow rate)/数目、在血块形成部位之前和/或之后测量流速和/或压力、血栓弹力图、荧光检测(例如用荧光纤维蛋白原)、浊度磁性、流动动力学(压力或流速)、红外光检测、红外光谱、使用声和/或光子传感器的检测、流式细胞术和视觉血块检测。
[0027] 在一些实施方案中,本文中所述的方法不使用微流控装置,而是使用适合于诱导和测量血块形成的孔或容器。
[0028] 除血块形成时间之外,还可考虑血块形成的其他特征。考虑到,除血块形成时间之外,血块形成的定性测量也可用于例如确定最灵敏的凝血检测模式。例如,除形成血块的时间之外,还可评估血块的特性,例如大小、强度、密度和组成。可以使用与用于检测血块形成时间相同或不同的检测模式评估此类特性。
[0029] 在一些实施方案中,除血块形成之外,还可以评估血块溶解。例如,如果患者正在服用纤维蛋白溶解剂或血栓溶解剂,则可以评价血块形成时的血块以及其随时间的分解。在一个实施方案中,可将本文中所述和本领域已知的检测血块形成的相同方法用于评估随时间的血块溶解。
[0030] 如本文中关于血栓弹力图(TEG)的使用所述的,可以评价血块形成和纤维蛋白溶解二者。这将可用于检测由于纤维蛋白溶解或者纤维蛋白溶解药和血栓溶解药的医源性施用的问题而导致凝固性过低的患者中的凝血异常。参见,例如,C.Mauffrey,等,″Strategies for the management of haemorrhage following pelvic fractures and associated trauma-induced coagulopathy,″Bone Joint J.2014;96-B:1143-54,其相关教导通过引用并入本文。
[0031] 在本文中所述的任何装置和方法中,血液样品可以是全血样品或血浆样品。使用全血对于某些应用例如在患者床边实施的那些可特别有用。
[0032] 所公开的装置和方法可应用于所有个体,包括哺乳动物(例如,人,例如人患者,以及非人哺乳动物)、爬行动物、类和鱼类等,并且可用于研究和兽医学。个体可以是例如成熟的(例如,成体)或未成熟的(例如,儿童、婴儿、新生儿或早产儿)。
[0033] 所公开的装置和方法不仅可用于诊断目的,而且可用于研究和发现以在研究环境中探究凝血级联。例如,这可用于例如在出血性疾病(登革热病毒(Dengue virus)、寨卡病毒(Zika virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)等)的情况下的基础药物发现,了解疾病或病症的病理生理学,并且还可用于监测实验性治疗的不良事件。
[0034] 所公开的装置和方法可用于指导患者的治疗。例如,医生可使用结果确定用药物和程序性干预(侵入性和非侵入性二者)二者的后续治疗。例如,如果患者由于达比加群施用而对因子IIa抑制测试呈阳性,则健康护理提供者可以选择在手术或其他侵入性操作之前施用针对该抑制剂的逆转剂(达司珠单抗(idarucizumab))。同样,如果患者对因子Xa抑制测试呈阳性,则健康护理提供者可以选择施用针对该抑制剂的适当的逆转剂(凝血因子Xa(重组),未活化的zhzo)。健康护理提供者可以选择施用也能克服这些抑制剂的作用的其他药剂,例如4因子凝血酶原复合物浓缩物或活化的凝血酶原复合物浓缩物。
[0035] 通过以下附图和发明详述,本发明的另一些方面和实施方案将变得明显。
[0036] 附图简述
[0037] 本专利或申请文件包含至少一个彩色绘制的附图。在请求并支付必要的费用之后,将由办公软件(Office)提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
[0038] 通过以下对示例性实施方案的更具体描述,如在附图中所示,前述内容将是明显的,在附图中,贯穿不同的视图,相同的附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制,而是将重点放在举例说明一些实施方案上。
[0039] 图1A至1D是根据本发明一些示例性实施方案的使用多个样品端口的微流控装置布局的示意图。
[0040] 图2A是根据一个示例性实施方案的圆形微流控凝血装置的俯视图。
[0041] 图2B是图2A的装置的中央部分的放大视图。图2B示出了血块形成区域的示例性几何形状。
[0042] 图3A至图3C示出了在根据一个示例性实施方案的具有四个通道的微流控装置内使用血浆和荧光标记的纤维蛋白原进行的血块检测。图3A是示例性微流控装置的中央部分的俯视图明视野图像。图3B是使用图3A的装置的血块形成的荧光图像。图3C是显示血块形成区域的放大视图的荧光图像。
[0043] 图4A和图4B是举例说明在根据一个示例性实施方案的使用FXa梯度的平行微流控通道装置中使用全血进行血块检测的明视野图像。图4A不包含抗凝剂。图4B包含未分级肝素。
[0044] 图5A和5B是根据本发明的一些示例性实施方案的使用单端口用于样品输入的微流控装置配置的示意图。
[0045] 图6是根据本发明一些示例性实施方案的测定或方法的流程图
[0046] 图7A是举例说明使用FXa梯度来检测利伐沙班的示例性数据的图。
[0047] 图7B是举例说明使用FXa梯度来检测阿哌沙班的示例性数据的图。
[0048] 图7C是举例说明使用FXa梯度来检测依度沙班的示例性数据的图。
[0049] 图7D是举例说明使用FIIa梯度来检测达比加群的示例性数据的图。
[0050] 图8是举例说明基本的凝血级联的图。
[0051] 图9是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测FXa抑制/缺乏/功能异常的图。
[0052] 图10是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测FIIa抑制/缺乏/功能异常的图。
[0053] 图11是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测和区分样品中的FIIa和FXa抑制的图。
[0054] 图12是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测间接FXa抑制/缺乏/功能异常的图。
[0055] 图13是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测和区分样品中的FXIIa和FXIa抑制的图。
[0056] 图14是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测和区分多种类型血友病的图。
[0057] 图15是举例说明如何通过使用凝血因子梯度来检测纤维蛋白原或FXIII(例如,FXIII缺乏)的问题的图。
[0058] 图16A至16C示出了在不同浓度下的FXa和FIIa抑制剂的凝血曲线评分(Clotting Curve Score,CCS)。
[0059] 图17示出了患者描述性统计的表1(实施例17)。
[0060] 图18A至18C示出了FXa抑制剂(FXa-I)抗凝的凝血酶原时间(PT)(图18A)和国际标准化比率(international normalized ratio,INR)(图18B)的敏感性和特异性的测量。
[0061] 图19A至19G示出了示例性凝血时间数据和比较凝血曲线。
[0062] 图20A至图20E示出了用于检测患者样品中的FXa-I的凝血曲线评分(CCS)分析和CCS利用的评价。
[0063] 图21A和21B示出了示例性功能药物浓度计算。
[0064] 图22示出了针对正在出血或处于高风险之中患者的目前的决策范例。
[0065] 图23示出了使用本发明实施方案的针对正在出血或处于高风险之中患者的改进的决策范例。
[0066] 图24A和24B示出了在添加活化的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)之后通过FXa-I的FXa抑制降低的检测。
[0067] 发明详述
[0068] 本发明一般性地涉及用于检测凝血的方法和装置,包括在血浆和/或全血中检测凝血异常以及检测抗凝剂和血小板抑制剂。
[0069] 在许多医学环境中,获得性凝血病是发病率和死亡率的主要组成部分。个体可因以下而继发内出血的风险提高:药物(例如,氯吡格雷、肝素、华法林或其他维生素K拮抗剂、达比加群或其他直接口服抗凝剂等)、创伤、手术、脓毒症、癌症、器官功能障碍(例如,肝)或先天性异常(例如,血友病)。在谱的另一端,凝血的倾向提高可能是由于自身免疫病、癌症、动脉粥样硬化、早期创伤和脓毒症、器官功能障碍(例如,肾)、不动性、炎症、异物(例如,支架(stent)或假体)、或先天性异常(例如,因子V莱顿血栓形成倾向(Factor V Leidin thrombophilia))。随着最近在药物开发(例如,抗凝剂,包括直接口服抗凝剂或DOAC)方面的创新,现在需要对于止血/凝血分析仪的创新,以充分实现患者的利益,包括在紧急护理环境中。具体地,目前可用于评价患者的出血和凝血的临床测试或者是基本的并提供非常模糊的信息,例如凝血酶原时间(PT)和活化促凝血酶原激酶时间(aPTT),或者是更详细的但需要昂贵的机器、漫长的训练和小心的处理,例如血栓弹力图(TEG)、血栓弹力测定(TEM)、旋转血栓弹力测定(ROTEM)、血小板聚集测定和流式细胞术。当前,尚无针对DOAC的特定测试。已提出的大多数DOAC测定都是测量药物本身的绝对浓度的药代动力学测定,并因此为临床决策提供的功能信息有限。
[0070] 随着DOAC使用的增加,研究和评论发现,尽管这些新药对急性、危及生命的出血事件造成的风险较小,但它们可能与胃肠道(GI)出血率较高有关。另外,发现这些新药在肝和/或肾功能下降的患者中或者同时服用多种药物的患者中具有不同的药代动力学特性,这在老年群体中很常见。在这些情况下,向医生提供功能性临床信息以帮助使抗凝剂组合和剂量个性化对患者将大有益处并可减少后续的相关不良事件。本发明的一些实施方案可用于评价个体内的凝血、纤维蛋白溶解和血小板功能的凝血组中。在一些实施方案中,本文中所述的微流控技术和先进的测定提供了定制的凝血组,由此临床医生可以在床边确定患者的凝血功能。这些实施方案在患者护理方面包括在紧急护理环境中提供了巨大的改进。
[0071] 除这些测定迅速且易于解释之外,它们还可以定制,从而允许针对每个顾客和/或最终使用者部分选择临床相关的凝血和血小板功能测试。由于该测定的实施方案可应用于床边平台,所以它还可用于在接受多种治疗(包括在医院、在抗凝诊和在家)的患者中进行趋势监测。在本发明的一个方面,在将因子的梯度细分到多个组的多个通道、孔或容器中和/或在多个组的多个通道、孔或容器中进行分配之后,将因子的梯度添加至样品,该方法允许在样品内评价凝血功能/抑制以及鉴定和区分多种凝血异常。这意味着本发明的一些实施方案(例如,凝血组、测定等)潜在地可用于在以下患者中评估凝血:医疗依从性差的患者,其中所服用的剂量/时间未知;或无意识的患者,其中医生、外科医生或其他健康护理提供者需要知道该患者的系统中是否有这些药物中的任何一种。此外,一些实施方案可帮助监测抗凝并指导现在变得可用的逆转试剂的施用。
[0072] 基于本发明的一些实施方案的产品或服务的潜在使用者的实例可以从健康护理工作者(例如,临床医生和兽医)到药物研究和开发中的研究者。
[0073] 本发明可以在多种环境中应用于患者护理。在一些实施方案中,患者被安排进行手术或需要侵入性操作,并且本发明的方法和装置可用于临床决策,包括为患者准备该操作以使出血风险最小化。在一些实施方案中,向患者施用影响凝血的药物,并且本发明的方法和装置可用于早期评价药物作用以及用于选择合适的治疗和剂量。在一些实施方案中,患者接受药物或血液制品,并且本发明的方法和装置可用于指导施用和剂量。在一些实施方案中,患者具有或被怀疑具有出血性病毒,或者处于感染出血性病毒的风险之中。在一些实施方案中,患者是新生儿,其中仅少量血液可用于评价凝血(包括用于施用抗凝治疗或用于检测先天性凝血异常)。在一些实施方案中,患者是妊娠的母亲,并且所述方法和装置允许检测先天性凝血异常,或者允许早期诊断导致凝血异常的病症,例如先兆子痫和子痫。
[0074] 在一些实施方案中,患者或对象是兽医或动物患者(例如,如狗、猫或)。在一些实施方案中,患者是非人哺乳动物。兽医患者和实验室动物研究的成本限制和有限的血量导致对于易于使用、需要仅数微升血液并且具有较低间接成本(overhead cost)的凝血诊断的大量需求。
[0075] 由于在新凝血测试平台方面的极大兴趣,本文中所述的血液测试平台(例如,测定、微流控装置和/或其组合)为研究和产品开发提供了巨大的潜力。
[0076] 在一些实施方案中,患者正在接受抗凝治疗,例如肝素或维生素K拮抗剂(例如,华法林)。在一些实施方案中,患者距在接受用直接口服抗凝剂(DOAC)进行的治疗,所述直接口服抗凝剂(DOAC)例如XARELTO(利伐沙班)、ELIQUIS(阿哌沙班)、SAVAYSA(依度沙班)、PRADAXA(达比加群)或BEVYXXA(贝曲沙班)。在一些实施方案中,患者正在接受用针对TFPI的抗体进行的治疗。抗凝药通常用于许多医疗环境中,包括急诊和重症监护、手术、心脏病学和癌症。已经引入了数种新的抗凝剂,但是目前尚无能够可靠地确定患者是否服用了正确剂量的测试。太多的抗凝剂会导致危及生命的出血,而太少的抗凝剂会导致卒中和心脏病发作的风险提高。本发明的一些实施方案可用作床边测试或并入到床边测试中,其可以准确地监测这些新的抗凝剂并提高对这些患者的安全性。可以通过最低限度的训练并以易于解释的格式进行该测试。在一个实施方案中,这些测定可在实验室中在需要小于约1mL、或小于约500μL、或小于约100μL、或小于约50μL(一滴)的新鲜或柠檬酸化的全血的装置中进行,在10分钟内读取结果。
[0077] 直接口服抗凝剂(DOAC)市场目前由选择性地靶向凝血途径内的特定因子(例如,因子IIa或因子Xa)的药物组成。尽管这些药物非常有效,但是由于缺乏可靠或易于使用的诊断和监测测试,与这些药物的使用和施用相关的风险提高,尤其是在重症监护环境中。DOAC使用的主要风险之一是胃肠道出血。这些不良事件不仅导致发病和死亡,而且导致医疗费用增加和住院时间延长。
[0078] 在一些实施方案中,该方法包括检测血液样品中的凝血异常,以及通过比较确定的血块形成时间与例如来自未患有凝血级联异常的个体的凝血因子特异性血块形成参考范围来指出所述凝血异常在凝血级联内发生的位置。在一些实施方案中,参考范围可以使用检测方法在正常对象或例如未患有凝血异常的个体的对象上来确定。在一些实施方案中,参考范围可以基于从其获得测试血液样品的同一个体来确定。例如,参考范围可以在开始个体的医学治疗之前确定,并且测试样品可以在治疗开始之后从同一个体获得。样品还可获自从其获得测试样品的个体的亲戚(例如,父母,兄弟姐妹或后代)。参考范围可调整以适应特定的测定配置(包括微流控装置配置)或取决于特定的测定配置(包括微流控装置配置)。在一些实施方案中,可将每个对象的凝血与测试时间时的“正常”对照或者特定凝血因子或因子组合的先前确定的“正常”参考范围进行比较。在一些实施方案中,测定方法需要确定和/或验证参考范围。
[0079] 在一些实施方案中,参考范围来自特定凝血级联异常的对照或标准,例如来自未患有凝血级联异常的个体。在一些实施方案中,参考范围来自可商购获得的加标(spiked)或耗尽的样品/对照。
[0080] 应理解的是,也可以将来自患有凝血异常的某人的血块形成时间与参考范围进行比较。例如,对于参考区间,通常对于未患有异常的人具有“正常”区间范围,而对于被确认具有该异常的人具有“异常”区间范围。有时,会有介于正常区与异常区之间的灰色区域,这指示需要对该患者样品进行进一步的深入测试以进行明确的诊断。
[0081] 在一些实施方案中,本发明不需要与参考范围或标准进行比较,而是通过评价凝血途径中可疑抑制点上游和下游的凝血因子来提供内部对照。
[0082] 以下是一些示例性实施方案的描述。
[0083] 本文中所述的一些实施方案包括用于在全血或血浆中检测抗凝剂和血小板抑制剂并评估患者凝血状态的快速测定(例如,在一些实施方案中,<30分钟,<20分钟,<15分钟或<10分钟)。这些可定制的凝血组的可用性通过提供快速的床边诊断和药物监测能力满足了在多种凝血测试环境内未满足的需求。
[0084] 在一个实施方案中,该方法包括这样的测定,其中将怀疑被抑制的特定凝血因子以多种浓度或量添加到血液样品(例如,全血或血浆样品)中。例如,可以将凝血因子以2倍至100倍的变化的量添加至样品的分开部分。在一些实施方案中,将凝血因子以在分开部分之间以5倍至20倍(例如,约10倍)递增的浓度添加至样品的分开部分。在一些实施方案中,添加至样品的分开部分的凝血因子的浓度可以为0.1ng/mL至10μg/mL。特定浓度或量(例如,具有不同浓度的梯度或多个样品)的凝血因子的添加使得能够确定:
[0085] a)在凝血级联的这个特定点存在特定异常(例如,通过抗凝剂、自身免疫或遗传(例如在血友病中)诱导的药物);和
[0086] b)在凝血级联的这个特定点抑制凝血功能。
[0087] 该测定的效用的实例包括:
[0088] a)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至10pg/mL;参见,例如图7D、10、11、16)的因子IIa来检测因子IIa(凝血酶)抑制剂并评估因子IIa抑制。
[0089] b)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至10pg/mL;参见,例如图3、4A、7A至7C、9、11、16、19至21)的因子Xa来检测因子Xa抑制剂并评估因子Xa抑制。
[0090] c)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至10pg/mL;参见,例如图13)的因子XI或XIa和/或X或Xa来检测因子XI或XIa抑制剂并评估因子XI或XIa抑制。
[0091] d)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至10pg/mL;参见,例如图13)的因子XII或XIIa和/或XI或XIa和/或X或Xa来检测因子XII或XIIa抑制剂并评估因子XII或XIIa抑制。
[0092] e)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至10pg/mL;参见,例如图4B和12)的因子IIa、Xa或因子的组合来检测所有类型的抗凝剂,包括肝素(分级的、低分子量或其他)。
[0093] f)通过添加多种浓度(例如,10μg/mL至1pg/mL)的多种凝血因子来检测并评估纤维蛋白溶解剂(包括但不限于组织纤溶酶原激活物(tPA))。
[0094] g)通过添加抑制的/异常/不存在的因子来检测其他凝血异常,包括:
[0095] i.通过添加纤维蛋白的纤维蛋白原缺乏血症(afibrinogenemia)/异常纤维蛋白原血症(dysfibrinogenemia)
[0096] ii.通过添加因子V和/或Va的因子V缺乏症
[0097] iii.通过添加因子VIII和/或VIIIa,因子IX和/或IXa的血友病A或B
[0098] iv.通过添加冯·维勒布兰德因子的冯·维勒布兰德因子疾病
[0099] v.通过添加因子II/VII/IX/X和/或IIa/VIIa/IXa/Xa的维生素K依赖性异常(华法林、维生素K缺乏症、肝衰竭)
[0100] vi.通过添加ATIII的抗凝血酶缺乏症(肾脏疾病)。
[0101] 参见,例如图9至图13。
[0102] 本文中所述的方法和装置的一些实施方案可用于使用多种凝血检测技术来评价凝血异常(例如,促血栓形成或抗血栓形成),所述凝血检测技术例如本文中所述的那些,包括:电阻抗、添加珠并量化珠的流量/数目、在血块形成部位之前和/或之后测量流速和/或压力、血栓弹力图、荧光检测(例如用荧光纤维蛋白原)、浊度、磁性、流动动力学(压力或流速)、红外光检测、红外光谱、使用声和/或光子传感器的检测、流式细胞术和视觉血块检测。
[0103] 在多个实施方案中可使用全血和血浆。
[0104] 该测定的一些实施方案可以与ATP-萤光素酶测定组合以同时测量血小板和凝血系统功能。通过在充分活化之后血小板的脱颗粒,这可以提供对凝血级联以及血小板功能的评价。血小板的活化可通过添加本文中列出的凝血因子,或通过添加特定的血小板激动剂而发生,所述血小板激动剂如例如,二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、肾上腺素、胶原蛋白、凝血酶和瑞斯托菌素(ristocetin)。当患者服用血小板抑制剂(例如阿司匹林或氯吡格雷)时,该组合技术可用于评估血小板功能。这些激动剂可作为浓度梯度与凝血因子组合添加。萤光素酶通常通过光吸收度来测量。
[0105] 可检测或分析的凝血异常包括但不限于先天性或遗传性凝血病和获得性凝血病。
[0106] 先天性或遗传性凝血病包括获得性突变和遗传性凝血病,即遗传自父母。
[0107] 先天性凝血病在出生时就存在并且很可能是由于子宫内发生的发育异常所致。先天性凝血病可以是遗传的或者可以不是遗传的。在一些实施方案中,患者可患有或怀疑患有凝血因子缺乏症,这可能是由缺少的凝血因子量的产生引起的,或者凝血因子是由带有降低凝血因子功能的突变的基因编码的。
[0108] 先天性和遗传性凝血病的实例包括但不限于:
[0109] a)血友病A(因子VIII缺乏症)
[0110] b)血友病B(因子IX缺乏症)
[0111] c)血友病C(因子XI缺乏症)
[0112] d)因子I(纤维蛋白原)缺乏症
[0113] e)因子V缺乏症
[0114] f)因子VII缺乏症
[0115] g)因子X缺乏症
[0116] h)因子XIII二缺乏症
[0117] i)α2-抗胰蛋白酶缺乏症
[0118] j)α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh(抗凝血酶III Pittsburgh)缺乏症
[0119] k)组合因子缺乏症(例如,因子V和VIII,因子II、VII、IX和X)
[0120] l)血小板异常(例如,灰色血小板综合征,巨血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome)、血管性血友病(von Willebrand disease)、血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia)、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、氯吡格雷或阿司匹林抗性)。
[0121] 获得性凝血病的原因包括但不限于:器官(例如,肝)功能障碍或衰竭、骨髓功能障碍或衰竭、创伤(例如,车祸)、手术、感染(例如,黄病毒属(flavivirus)、溶血性尿毒症综合征、脓毒症等)、癌症、不动性、药物(例如,抗生素、抗凝剂、纤维蛋白溶解剂、血栓溶解剂、化学治疗、流体等)、类药剂营养品(neutraceutical)/药物、毒性、注毒作用(envenomation)(例如,蛇、蜘蛛等)、食品、自身免疫病(无论是原发性、获得性还是特发性)、植入物(例如,手术)、心血管事件(例如,身体中任何地方的血块,包括卒中、心脏病发作等)、血管炎、输血(例如,全血、浓集的红细胞(packed red blood cell)、血浆、血小板等)、移植物(例如,骨髓、肾、肝等)、妊娠(例如,先兆子痫、子痫、糖尿病等)、内分泌疾病(例如,嗜铬细胞瘤(pheochomocytoma)、库欣病(cushing)、糖尿病等)、慢性炎性疾病(例如,肠易激综合症、烦躁、肠病、结肠炎等)、弥散性血管内凝血和感染。
[0122] 凝血病也可以是医源性的(例如,由医学治疗引起的)或具有特发性原因(例如,癌症治疗例如化学治疗,或骨髓移植)。
[0123] 在一些实施方案中,本发明使用微流控方法。微流控装置包含在基底中的系列通道,每个通道具有这样的区域,所述区域具有触发和/或定位血块形成的几何形状,以允许评价响应于一种或更多种试剂(例如外源添加的凝血因子的量或浓度)的血块形成。系列中的每个通道都具有相同的几何形状,以触发相同的血块形成特性(当暴露于相同的样品和试剂时)。如上所述,通过在一种或更多种凝血因子的梯度存在的情况下评价血块形成,本发明允许灵敏且特异性地检测凝血异常或障碍。
[0124] 使用微流控装置的一些实施方案可包括以下操作:
[0125] a)从患者获得样品;
[0126] b)如本文中所述(在进入微流控装置中之前或在微流控装置内)向患者样品添加一种或更多种激动剂(特定因子),每种激动剂在微流控装置中的整个系列通道中浓度递增;
[0127] c)如果样品是在抗凝剂(例如柠檬酸钠或酸性柠檬酸葡萄糖)中收集的,则添加+/-钙;
[0128] d)然后使样品流过微流控装置,其中在通道内的位置处触发血块的形成;
[0129] e)在该位置测量和/或量化凝血的时间,并随后记录下来;
[0130] f)可将多个浓度的相同激动剂添加至等分样品(在单独的通道中)以确定凝血级联异常的存在和浓度;浓度可以(但不是必须)例如为约0.75ng/mL至约750ng/mL;
[0131] g)可以将多种因子添加至等分样品(在单独的通道中)以鉴定凝血级联中功能异常的部分。通过利用上游和下游因子,例如在DOAC的鉴定中使用因子IIa和Xa,可以鉴定出正常凝血得到恢复的点。另一个示例性实施方案是异常纤维蛋白原血症或纤维蛋白原缺乏血症的鉴定:对于全血样品,在阴性对照泳道(未添加激动剂)中凝血时间可延长;虽然添加凝血因子(例如因子IIa和Xa)将无法恢复正常的凝血时间,但向样品添加纤维蛋白原则可恢复凝血时间,因为该缺失/异常因子正在装置中被替换。
[0132] 用于检测凝血的微流控装置可包含在基底中形成的多个通道,每个通道包含血块形成区域,所述血块形成区域具有配置成触发和/或定位血块形成的几何形状。在一些实施方案中,多个通道的血块形成区域布置在基底的中心区中。在一些实施方案中,该装置还包含多个样品输入端口,每个样品输入端口连接至多个通道之一的第一端。在一些实施方案中,该装置包含多个输出端口,每个输出端口连接至多个通道之一的第二端。输入端口和输出端口可以在基底的外围以交替的方式布置。在一些实施方案中,该装置包含与所有通道或系列通道流体连接的公共样品输入端口。
[0133] 基底可以是例如任何类型的塑料,聚二甲基烷(PDMS)、硅、玻璃或者其他材料或材料的组合。在一个实施方案中,该装置包含与玻璃结合的基底,但是也可使用其他基底,例如玻璃上的玻璃、PDMS上的PDMS、硅、任何类型的塑料或其组合。在一个实施方案中,基底是塑料。基底可以是(但不是必须)透明的以促进血块形成的检测(对于(vis-a-vis),例如,成像)。
[0134] 该装置可包含直径为约50μm、高度为约11μm并且长度为100+μm的微流控通道。可以采用其他通道尺寸。
[0135] 可为每个通道提供用于样品输入的一个进入端口和一个离开端口。或者,装置可为所有通道或为一个或更多个组(或系列)的通道提供单个样品端口。
[0136] 在多个实施方案中,将激动剂(例如,凝血因子)在输入到装置中之前添加至样品,或者在上样之前将激动剂涂覆至装置或预先加载在装置内。在一个或更多个通道包含凝血因子的情况下,凝血因子可以为混悬液、溶液或冻干的,并且可以是表面结合的或不是表面结合的。凝血因子可以预先包含在通道中(例如,在制造装置时),可以在将样品放入到装置中之前添加,或者可以与样品同时或在样品之后通过输入端口(或多个输入端口)进入装置中。
[0137] 在一个实施方案中,将钙在输入到装置中之前添加至样品。钙可通过另外的端口添加到装置内,或者预先加载在通道内。
[0138] 在一个实施方案中,将488-缀合的纤维蛋白原添加至样品以通过检测纤维蛋白原的交联来检测血块形成所花费的时间。
[0139] 在明视野中,还可以通过可视化纤维蛋白的交联并通过阻止样品通过微流控通道的流动来检测血块形成,这可以在有或没有另外的冲洗步骤来冲洗掉与血块不相关的物质的情况下进行。
[0140] 在一个实施方案中,样品通过毛细管作用被加载到装置或微流控盒(cartridge)中。还可以例如通过使用真空、注射或其他合适的手段(在一些实施方案中,包括重力)来迫使样品流过通道。还可以通过毛细管作用来促使样品加载或通过使用改变微流控装置(例如,基底)的表面特性的涂层,例如通过使其亲来促使样品流动。
[0141] 在一个实施方案中,微流控通道的设计包括改变了几何形状的一个区域(包括不同的成度的弯曲和/或直径)以创建一个流动分离和停滞的区域以触发和/或定位血液或纤维蛋白凝块(fibrin clot)的形成。血块形成所花费的时间可以被量化并记录下来。
[0142] 在一个实施方案中,该装置用于检测抗凝血剂例如FXa抑制剂、FIIa抑制剂、肝素和维生素K拮抗剂(例如,华法林)的存在并通过评估形成血块所花费的时间来评估其作用。
[0143] 测量的血块形成时间与样品中由抗凝剂产生的凝血抑制的量相关。该过程也可应用于纤维蛋白溶解药。如本文中所述,该过程还可应用于其他病理状况,包括获得性或先天性原因的异常凝血时间。
[0144] 在一个实施方案中,该装置在相对短的时间段内,例如在约3至10分钟内,并且在特定实例中,在约5分钟内提供读出。
[0145] 示例性微流控装置和测定在以下进行描述并在附图中示出。实施例
[0146] 实施例1
[0147] 图1A至1D是根据本发明一些示例性实施方案的微流控装置布局的示意图。
[0148] 图1A是微流控装置10的圆形布局(其也可以是具有中心点的任何对称多边形)的俯视图,该微流控装置10具有在基底15中形成的一个或更多个连续的微流控通道(例如,微通道)20,每个通道连接至一个进口(输入端口)30和一个出口(输出端口)35。通道的一部分(例如,通道的中心)可具有独特的形状(例如,血块形成/定位区域25)以实现流动分离或扰动、或者样品流的停滞以促进血块形成。取决于所使用的特定测定,在该单装置中可存在两个或更多个这些微流控通道。这种设计可允许同时评价多个样品,例如三个或更多个样品,例如,多至10个样品或多于10个样品。通常,每个样品(或样品的每个等分试样)都需要单独的通道。在图1A中,示出了四个通道,每个通道具有血块形成/定位区域25,其位于微流控装置的近侧,例如位于微流控装置的中心区。样品可通过进口手动地或通过电子分配器进入装置,并将通过施加的压力/真空、毛细管作用、或通过化学相互作用(例如,如果微流控通道涂覆有亲水材料或由其制成)而通过微流控通道。在该示例性设置中,必须将激动剂+/-钙+/-血块检测试剂添加至主进口中、预先混合到样品中,或者必须将其涂覆在进口或微流控通道上。(本文中使用的术语“+/-”意指“有或没有”。)所有血块形成/定位区域都可以以可以为例如2X至10X的放大率在一个单成像视野(包围血块形成区域25的虚线圆50)中查看。
[0149] 图1B是与图1A中类似布局的俯视图,但是图1B具有每个通道20的多个进口端口30、40、42的实例。这允许将激动剂+/-钙+/-血块检测试剂添加至微流控通道内的样品。可存在一个或更多个另外的输入端40、42,并且它们可单独直接连接至主通道20或主输入区域,或者有些可通过至少一个连接至主通道或主输入端口而彼此间接连接。
[0150] 图1C是举例说明了基底15中的通道20的输入端口30和输出端口35的微流控装置布局的侧视图。仅示出了一个通道,但是如图1A中所示,可提供一个或更多个通道。另外,可以为每个通道提供一个或更多个输入端口,如图1B中所示。如图1C中示意性地示出的,可以提供检测装置55以测量每个通道中的血块形成。检测装置55可包含成像传感器以检测血块形成,例如血块形成时间。如本文中所述,成像可以是明视野成像。检测装置可使用本文中所述的任何其他测量/检测方法。
[0151] 图1D是具有可用于多种测定的替代布局的微流控装置110的俯视图。每个样品输入和通道120可以有一个或更多个进口(输入端口)130和一个出口(输出端口)135。在每个通道120中包含形状变化的区域125以刺激血块形成。通道以平行方式布置以允许以可以为例如2X至10X的放大率在一个视野(虚线矩形150)内显现血块形成/定位区域125。每个通道可包含用于激动剂和/或钙添加的一个或更多个区域140和用于混合的区145。在所示的实例中,通道120具有相同的几何形状。
[0152] 图2A和2B示出了根据一个示例性实施方案的圆形微流控凝血装置210。如所示的,该装置包含四个通道220,每个通道包含血块形成/定位区域225,该区域具有触发和/或定位血块形成的几何形状。血块形成区域225布置在中心区中。每个通道220连接至输入端口230和输出端口235。所有通道的输入和输出端口在装置210的外围以交替的方式布置。中心的虚线圆250指示包围所有输入通道的“凝血区域”225的一般视野。图2A中所示的通道的配置是其中发生芯吸毛细流动(wicking capillary flow)的配置,但是也可以是许多其他配置。可以基于一个或更多个标准,例如该配置对制造该装置是否特别有利来选择特定的配置。
[0153] 图2B是图2A的装置210的中央部分的放大视图,图2A示出了视野内的血块形成/定位区域225的实例。血块形成区域可具有有助于形成可量化的血块的配置。血块形成区域可具有旨在引起对于血块形成的流动分离、停滞、流动扰动或其组合的形状,并且可具有旨在引起对于血块形成的流动扰动的形状。在该实例中,血块形成区域具有不同的形状以举例说明可以使用的多种形状。通常,每个通道的形状将相同以确保每个通道中的流动条件相同。图2B中所示的血块形成区域的形状是实例并且不是包括所有可以使用的形状变化。
[0154] 如图2B中所示,每个血块形成区域可配置(例如,成形)成使得迫使流过血块形成区域的样品改变方向至少一次,优选多次。每次方向改变可以为例如约45度至约135度、约60度至约120度、约75度至约105度、或约90度。另外,可以提供用于扰动流动的一个或更多个流动扰动物(disruptor),例如突出物或岛状物。当样品通过血块形成区域时,其会遇到流动扰动物并被迫围绕该扰动物流动。扰动物可包含角或尖锐的边缘,并且可以是三角形、矩形或其他形状的,如图2B中所示。扰动物和其他结构特征的组合或仅其他结构特征可形成循环区,其中圆形方式的样品流会随着其他样品的离开而与进入该区的新样品相互作用。从流体流动的观点看,在扰动物后面的涡流还可能促进凝结,因为样品在涡流区中的流体流动与样品的交点(例如,湍流交点)处与其他样品相互作用。
[0155] 在一些实施方案中,扰动物可包含凹面(concavity)(例如,图3A)。血块形成/定位区域可包含变窄的通道。通过改变样品流动的方向和/或通道的直径、角度和/或形状的改变,和/或迫使样品围绕一个或更多个扰动物流动,血块形成区域引进流动分离和样品流的停滞以促进血块形成。通常,通道和血块形成区域以对称方式布置以为每个通道提供相同的流动特征。
[0156] 实施例2
[0157] 用于进行根据本发明一个实施方案的测定的一般性方案如下:
[0158] a)将样品、激动剂、+/-钙、+/-血块检测剂添加在一起
[0159] i.钙的最终浓度为0.2mM(此浓度特别适合于与3.2%缓冲柠檬酸钠一起使用。如果使用另外的抗凝剂,则钙的浓度可以不是0.2mM。)
[0160] ii.血块检测剂可包括荧光标记的纤维蛋白原、磁体、珠(可以是荧光的或有色的)[0161] b)加载到微流控装置中
[0162] i.对于输入加载配置和顺序的实例,参见例如图1A至1D、2A和2B
[0163] c)温度控制
[0164] i.室温
[0165] ii.可升高至37℃(体温)
[0166] (体温通常为37℃,但是测定运行的温度可根据患者的实际温度进行改变。例如,如果患者发烧,则可以升高测定运行的温度。)
[0167] d)进行血块检测并测量血块形成的时间(例如,4至12分钟)
[0168] e)记录每个样品开始形成血块时的时间
[0169] 实施例3
[0170] 图3A至3C示出了用根据一个示例性实施方案的微流控装置310使用血浆和荧光标记的纤维蛋白原进行的血块检测,所述微流控装置310具有四个通道320和血块形成/定位区域225。该微流控装置类似于图2A和图2B中所示的装置,不同之处在于所有血块形成区域325具有相同的形状。每个血块形成/定位区域325包含用于扰动样品流动的突出物。在该实例中,如图3A中所示,突出物的形状通常为三角形。突出物的两侧是直的并且一侧是凹的。
每个血块形成区域325使流改变方向四次,包括两次90度的方向改变。
[0171] 在一个实例中,血块检测过程可包括以下程序步骤:
[0172] a)将血浆样品预混合以包含:6μL血浆+0.6μL激动剂(10%样品体积)+0.6μL钙(储液2mM,10%样品体积)+0.6μL纤维蛋白原(这可以在浓度方面变化,通常<10%样品体积)。可以调整和改变上述值并且获得相似的结果。
[0173] b)对于每个通道,将预混合样品的等分试样放入通道的输入端口中。
[0174] c)通过毛细管作用将样品等分试样吸入通道中。
[0175] d)在37℃下对通道进行成像10分钟,并记录用于检测血块的时间。
[0176] 图3B中的实例示出了在一个时间点(5分钟)拍摄的微流控通道荧光图像。使用的血浆样品包含250ng/mL的阿哌沙班。将多种浓度(0.75ng/mL FXa、7.5ng/mL FXa和75ng/mL FXa)的激动剂-因子Xa(FXa)或单独的缓冲液(阴性对照)以及钙和488-缀合的纤维蛋白原一起添加至血浆样品。荧光纤维蛋白原的交联指示了交联的纤维蛋白凝块的形成和存在。在图3B中右侧通道中可见的较高浓度的FXa(7.5ng/mL FXa和75ng/mL FXa)导致血块形成早于在图3B中左侧通道中可见的较低浓度的FXa(0.75ng/mL FXa)或阴性对照。图3C是显示交联的纤维蛋白凝块的一个通道的血块形成区域的放大视图。
[0177] 实施例4
[0178] 图4A和图4B是举例说明在根据一个示例性实施方案的平行微流控通道装置410中使用全血进行血块检测的荧光图像。将微流控通道420预先涂覆有多种浓度(7.5ng/mL、75ng/mL、750ng/mL)的激动剂-因子Xa,或单独的缓冲液(阴性对照)。在一个时间点(10分钟)拍摄荧光图像。在使用之前用缓冲液洗涤微流控通道以在微流控通道内留下仅结合的FXa。将新鲜的全血放入每个输入端口中,并通过毛细管作用将血液吸入。使血液流动10分钟并随后用缓冲液轻轻洗涤通道。描绘了所评价的两个样品的明视野图像。图4A中的样品不含抗凝剂(手指刺血),这导致所有4个通道(包括阴性对照)中的血块。图4B中的样品包含未分级肝素(其被添加至手指刺血),这导致血块形成的梯度取决于通道中FXa的浓度。阴性对照中几乎没有细胞黏附,表明血块形成最少。未分级肝素以抗凝血酶III依赖性方式抑制因子IIa和Xa,这就是为什么在适当浓度下添加这些因子可帮助恢复样品的凝血能力的原因。
[0179] 实施例5
[0180] 图5A和图5B示出了微流控装置设计的另外的一些实施方案,其包括以下的特征:(1)每个通道使血液/血浆处于相同的条件下,以及(2)每个通道内都有促进血块的几何形状,在所述通道中优化并进行血块检测。图5A示出了包含围绕并连接至单个样品输入端530的对称通道520的圆形阵列的装置510,其中每个通道具有促进血块和/或定位区域525。通道520还可包含或可不包含一个或更多个激动剂和/或钙添加区域540和/或混合区域545。
图5B示出了利用具有单样品输入端口530的圆柱形设计的装置512的一个替代实施方案,该单样品输入端口530被分成多个对称通道520,其具有血块形成区域525并且具有或不具有激动剂/钙添加区域540和/或混合区域545。这两个装置510、512还可包含具有或不具有吸收性滤器的样品收集储存器560。
[0181] 实施例6
[0182] 图6是根据本发明一些示例性实施方案的评估血液样品中凝血的方法的流程图。血液样品可以是全血样品或血浆样品。根据该方法,将凝血因子添加至血液样品的多个等分试样。每个等分试样可接收不同浓度的凝血因子。所述多个等分试样可施加至微流控装置的多个通道。作为替代或补充,凝血因子可预先涂覆在施加了血液样品的装置上或之中。
在每个通道中测量血块形成时间,并基于所测量的血块形成时间评估凝血。作为替代或补充,在固定的时间测量每个通道中的血块形成程度(任选地,血块溶解程度),并且基于所测量的血块形成程度(任选地,血块溶解程度)来评估凝血。
[0183] 任选地,如图6中所示,可将血块形成时间与参考值或参考范围进行比较。在一个实例中,将血块形成时间与来自未患有凝血级联异常的个体的凝血因子特异性血块形成参考范围进行比较。这可用于例如检测血液样品中的凝血级联异常。在另一个实例中,将血块形成时间与针对来自未患有凝血级联异常的个体的样品测量的血块形成时间进行比较。例如,这也可用于例如检测血液样品中的凝血级联异常。在又一个实例中,将血块形成时间与针对包含已知量的抗凝剂的样品测量的血块形成时间进行比较。这可用于例如检测血液样品中的抗凝剂。
[0184] 用于图6的方法中的微流控装置可以是具有多个通道的本文中所述的任何微流控装置,例如图1A至1D、2A至2B、3A至3C、4A至4B和5A至5B中所示的装置。在一个实施方案中,该装置包含在基底中形成的多个通道,每个通道包含血块形成区域,该区域具有配置成触发和/或定位血块形成的几何形状,多个通道的血块形成区域布置在基底的中心区中;多个输入端口,每个输入端口连接至多个通道之一的第一端;以及多个输出端口,每个输出端口连接至多个通道之一的第二端,输入和输出端口在基底的外围处以交替的方式布置。
[0185] 实施例7
[0186] 图7A至7D示出了多种浓度的多种FXa和FIIa抑制剂的示例性凝血曲线。然后绘制每种组合形成血块所花费的时间。每个浓度的抑制剂的凝血曲线取决于样品中抗凝剂的存在和浓度。这些图示出了当暴露于多种浓度的激动剂时,四(4)种不同DOAC的凝血时间。凝血时间随抑制剂浓度的增加而增加,表明功能性抗凝作用提高。在每个图的X轴上绘制了激动剂(对于图7A至7C为FXa,并且对于图7D为FIIa)的浓度。
[0187] 图7A是举例说明利伐沙班的检测的示例性数据的图。该图示出了不同浓度的抑制剂利伐沙班(0ng/mL、250ng/mL和500ng/mL)的凝血曲线。每条曲线显示了作为激动剂(FXa)浓度(ng/mL;x轴)的函数的平均血块检测时间(分钟;y轴)。图中所示的数据可总结如下:
[0188] 在0ng/mL的利伐沙班浓度下,在激动剂浓度降至7.5ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0189] 在250ng/mL的利伐沙班浓度下,在激动剂浓度降至375ng/mL的情况下,血块形成时间显著长于阴性对照但低于500ng/mL。
[0190] 在500ng/mL的利伐沙班浓度下,降至750ng/mL在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0191] 图7B是举例说明阿哌沙班的检测的示例性数据的图。该图示出了不同浓度的阿哌沙班(0ng/mL、250ng/mL和500ng/mL)的凝血曲线。如在图7A中,每条曲线显示了作为激动剂(FXa)浓度(ng/mL;x轴)的函数的平均血块检测时间(分钟;y轴)。图中所示的数据可总结如下:
[0192] 在0ng/mL的阿哌沙班浓度下,在激动剂浓度降至7.5ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0193] 在250ng/mL的阿哌沙班浓度下,在激动剂浓度降至75ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0194] 在500ng/mL的阿哌沙班浓度下,在激动剂浓度降至938ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0195] 图7C是举例说明依度沙班的检测的示例性数据的图。该图示出了不同浓度的依度沙班(0ng/mL、250ng/mL和500ng/mL)的凝血曲线。如在图7A中,每条曲线显示了作为激动剂(FXa)浓度(ng/mL;x轴)的函数的平均血块检测时间(分钟;y轴)。
[0196] 图7D是举例说明达比加群的检测的示例性数据的图。如在图7A和7B中,图7D的图示出了不同浓度的抑制剂(此处为达比加群(0ng/mL、25ng/mL、250ng/mL和500ng/mL))的凝血曲线。每条曲线显示了作为激动剂(FIIa)浓度(ng/mL;x轴)的函数的平均血块检测时间(分钟;y轴)。图7D的图中所示的数据可总结如下:
[0197] 在<25ng/mL的达比加群浓度下,在激动剂浓度降至71ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0198] 在250ng/mL的达比加群浓度下,在激动剂浓度降至710ng/mL的情况下,在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0199] 在500ng/mL的达比加群浓度下,降至710ng/mL在<2.5分钟内检测到血块形成。
[0200] 可以使用自动化来减少样品与测定之间的差异。
[0201] 实施例8
[0202] 除检测FXa抑制剂的存在和估计其相对浓度之外,这里所述的测定还可以通过选择适当的上游和下游凝血因子以添加至样品来将FXa抑制剂与FIIa抑制剂区分开。
[0203] 图8示出了基本的凝血级联,其可指导合适的凝血因子的选择,如在以下实施例中进一步描述的。如图8中所示,级联包括内源性途径和外源性途径,这两者均可经由级联的共同途径导致交联的纤维蛋白凝块。内源性途径可例如通过表面接触而活化。外源性途径可例如通过组织创伤而活化。
[0204] 实施例9
[0205] 图9是提供了如何检测因子Xa(FXa)抑制/缺乏/功能异常的示意图。例如与下游因子的添加相比,上游(非活性或活化的)凝血因子(包括但不限于FXII、FXI、FIX、FVIII)的添加将显示出凝血时间的延长。或者,可参照对照凝血时间来确定凝血时间的延长。然而,下游(非活性或活化的)凝血因子(包括但不限于FII、FI)的添加将显示出不受影响的(例如,正常的)凝血时间,其可以用作对照。FXa的添加将显示出以浓度依赖性方式的凝血时间延长,并且即使在高的上游因子浓度下,凝血时间也很可能无法达到对照。如图所示,示例性的直接FXa抑制剂包括利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班和贝曲沙班。
[0206] ]实施例10
[0207] 图10是提供了示出如何检测因子IIa(FIIa)抑制/缺乏/功能异常的示意图。上游(非活性或活化)凝血因子(包括但不限于FXII、FXI、FIX、FX、FV、FVIII)的添加将显示出凝血时间的延长。下游(非活性或活化的)凝血因子(包括但不限于FI)的添加将显示出未受影响的凝血时间。FIIa的添加将显示出以浓度依赖性方式的凝血时间延长。如图所示,示例性的直接FIIa抑制剂包括达比加群、比伐卢定(Bivalirudin)和阿加曲班(Argotraban)。
[0208] 实施例11
[0209] 图11是提供了示出如何在样品中检测和区分FIIa和FXa抑制的示意图。在存在FXa和FIIa抑制剂的情况下,上游(非活性或活化)凝血因子(包括但不限于FXII、FXI、FIX、FVIII)的添加将显示出凝血时间的延长。FXa向样品的添加将显示出对FXa和FIIa抑制的以浓度依赖性方式的凝血时间延长。FIIa向样品的添加,在存在FIIa抑制的情况下将显示出以浓度依赖性方式的凝血时间延长,但是在存在FXa抑制的情况下将显示出未受影响的凝血时间。
[0210] 实施例12
[0211] 图12是提供了示出如何检测间接FXa抑制/缺乏/功能异常的示意图。上游(非活性或活化)凝血因子(包括但不限于FXII、FXI、FIX、FVIII)的添加将显示出凝血时间的延长。下游(非活性或活化的)凝血因子(包括但不限于FII、FI)的添加将显示出正常的凝血时间或以浓度依赖性方式的凝血时间轻微延长,取决于存在的抑制剂的类型。FXa的添加将显示出以浓度依赖性方式的凝血时间延长。这是由于通过这样的药物的存在而引起的二次FXa抑制,该药物提高抗凝血酶III(ATIII)对FXa的亲和力/结合,从而对其进行抑制。一些实施方案可包括检测ATIII,从而检测FXa、FIIa或二者的间接抑制。提高ATIII对FXa的结合/亲和力的药物包括肝素,例如,低分子量肝素(LMWH)和未分级肝素(UFH)、依诺肝素和磺达肝素。
[0212] 实施例13
[0213] 图13是提供了示出如何在样品中检测和区分FXIIa和FXIa抑制的示意图。在存在FXIIa抑制剂的情况下,FXIIa的添加将导致凝血时间的浓度依赖性延长。下游添加的因子(包括但不限于FXI、FIX、FVIII、FX、FII、FV)的添加将产生未受影响的凝血时间。在存在FXIa抑制剂的情况下,FXIIa的添加将导致凝血时间的延长。FXIa的添加将导致凝血时间的浓度依赖性延长。下游添加的因子(包括但不限于FIX、FVIII、FX、FII、FV)的添加将产生未受影响的凝血时间。这种方法也可以以多种组合来使用以进行一个全面的组用于检测和区分FXIIa抑制剂、FXIa抑制剂、FXa抑制剂和FIIa抑制剂。
[0214] 实施例14
[0215] 图14是提供了示出如何检测和区分多种类型的血友病的示意图。血友病C会导致在添加FXIIa的情况下凝血时间延长,在添加FXI的情况下浓度依赖性延长,以及在添加FXIa或任何其他下游因子的情况下凝血时间不受影响。血友病B会导致在添加FXIIa和FXIa的情况下凝血时间延长,在添加FIX的情况下浓度依赖性延长,以及在添加FIXa或任何其他下游因子的情况下凝血时间不受影响。血友病A会导致在添加FXIIa、FXIa的情况下凝血时间延长,在添加FVIII的情况下浓度依赖性延长,以及在添加FXa或任何其他下游因子的情况下凝血时间不受影响。
[0216] 对于先天性病症,一些实施方案可以添加非活化因子以用于检测,而非活化因子可用作对照。
[0217] 实施例15
[0218] 图15是提供了示出如何检测纤维蛋白原(即,因子I(FI)或FXIII)问题的示意图。纤维蛋白原缺乏血症或异常纤维蛋白原血症会导致在添加FI上游的所有因子的情况下凝血时间延长,在添加FI的情况下浓度依赖性延长。FXIII缺乏/异常会导致在添加FXIII上游的所有因子的情况下血块强度和血块稳定性随时间变化,在添加FXIII的情况下血块强度和稳定性的时间的浓度依赖性变化。
[0219] 实施例16
[0220] 图16A至16C示出了在不同浓度下的FXa和FIIa抑制剂的凝血曲线评分(CCS)。基于多元统计建模,使用多种浓度下的每种激动剂的凝血时间的原始数据来计算单凝血曲线评分(CCS)。然后可将此CCS用作单个整体的数以将患者分箱(bin)为对特定抑制剂呈阳性或阴性。还可将此CCS用于外推患者样品中药物的功能浓度。功能浓度代表血液样品中药物继发的抗凝作用的量。图16A示出了使用FXa作为激动剂,两种FXa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班)和一种FIIa抑制剂(达比加群)的CCS如何依赖于浓度而变化。图16B示出了使用FIIa作为激动剂,两种FXa抑制剂和一种FIIa抑制剂的CCS如何依赖于浓度而变化。图16C示出了如何将每种激动剂的CCS用于鉴定样品中抑制剂的类型。
[0221] 实施例17
[0222] 图17示出了提供患者描述性统计的表1。从获准进入麻省总医院急诊科(Massachusetts General Hospital Emergency Department)的患者收集柠檬酸化的血浆样品。所有血浆样品均进行了临床医生命令的凝血测试(PT/INR、aPTT、DTT或其他)。使用本文中所述测定的一些实施方案来评价患者样品。审查患者的医疗记录以了解抗凝剂的施用史。所有患者样品均遵循麻省总医院(Massachusetts General Hospital)和麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)二者的机构审查委员会(Institutional Review Board,IRB)批准和规定来收集。
[0223] 实施例18
[0224] 图18A至18C显示凝血酶原时间(PT)和国际标准化比率(INR)对FXa-I抗凝具有敏感性但不具有特异性。比较了对照患者和记录为服用FXa-I的患者的PT和INR二者。异常PT定义为>14秒,并且异常INR定义为>1.2。图18A和18B示出了ROC曲线,其比较了总的对照与服用FXa-I的患者的PT和INR。图18C示出了具有评价的PT和INR结果的患者的描述性统计的表。使用单因素ANOVA来比较正常和异常对照与利伐沙班和阿哌沙班二者。显著性定义为p<0.05。结果表明,与异常对照相比,与FXa-I患者相比没有显著性。
[0225] 实施例19
[0226] 图19A至19G示出了示例性凝血时间数据和比较凝血曲线。比较所有患者组在多种激动剂浓度下的凝血时间以构建凝血曲线。图19A至19D示出了散点图,其示出了对于不同组中的患者在多种激动剂浓度下的凝血时间的平均值和标准误差棒。图19E示出了所有患者组的平均凝血时间和标准误差棒,其在单个图上显示以进行比较。所有三个FXa-I组(阿哌沙班、利伐沙班、FXa-I)都在主观上显示出与对照组非常不同,在存在多个浓度的情况下,对照组与总FXa-I组、利伐沙班组和阿哌沙班组之间存在统计学显著性差异。图19F和19G示出了划分为正常与异常PT或INR患者的对照组的平均凝血时间和标准误差棒,表明这些测试在不同对照组之间没有很大的差异。
[0227] 实施例20
[0228] 图20A至图20E示出了用于检测患者样品中的FXa-I的凝血曲线评分(CCS)分析和CCS利用的评价。图20A示出了具有平均值和标准误差棒的散点图用于患者组之间的CCS比较。CCS为0时的虚线表示用于确定患者样品中是否存在FXa抑制的所选截止值。图20B示出了利用CCS评分来确定患者在其系统中是否具有FXa-I的ROC曲线。图20C提供了不同患者组的CCS的描述性统计。图20D和20E示出了使用CCS来确定FXa-I检测的准确性的评价。
[0229] 实施例21
[0230] 图21A和21B示出了功能药物浓度计算。利用为每个受控加标的利伐沙班样品计算的CCS评分,绘制了将CCS转换为药物浓度的方程的最佳拟合线,如图21A中所示。然后将该方程应用于所评价患者样品的每个CCS值,以得出每个患者样品的功能浓度。将这些浓度直接与每个样品中抗Xa生色测定来源的利伐沙班浓度进行比较。将这两个值相对于彼此作2
图,表明抗Xa浓度与DOAC测试浓度之间具有良好的相关性(R=0.827),如图21B中所示。注意,溶血样品未包括在此直接比较中,因为已知溶血、黄疸和脂血症(lipemic)的血浆样品会对抗Xa生色测定浓度产生负面影响。
[0231] 除鉴定抑制之外,如图21A和21B的实例中所示,一些实施方案可用于量化抑制的量。
[0232] 实施例22
[0233] 图22示出了当患者服用直接口服抗凝剂(DOAC)时的目前的决策范例。
[0234] 当患者处于出血事件高风险之中或具有活跃的出血时,应进行凝血测试。这些测试可包括PT、INR、aPTT、ACT、TEG或其他目前可用的即时检测。目前可用测试的异常凝血结果对于DOAC的存在不具有特异性并且使健康护理工作者猜测哪种治疗最适合患者。如果由于缺乏这些测试的敏感性而凝血时间是正常的,则健康护理工作者可能会漏掉患者样品中DOAC的存在并继续治疗,从而使患者处于提高的出血风险之中。
[0235] 实施例23
[0236] 图23示出了当患者服用DOAC时使用本发明的实施方案的改进的决策范例。双箭头指示可能的迭代过程。例如,如果传统的凝血测试显示出患者具有正常的凝血时间,而根据本发明一个实施方案的DOAC测试显示出异常结果,则可以基于测试结果选择DOAC逆转剂并将其施用于患者。然后可以对患者进行重新测试,并且,如果根据DOAC仍然异常,则任选地在施用修饰的或不同的DOAC逆转剂之后再次进行重新测试。如果传统的凝血测试异常并且DOAC测试也异常,则健康护理工作者可选择DOAC逆转剂或另外的治疗并且在施用试剂之后重新测试。如果传统的凝血测试异常并且DOAC测试对于DOAC的存在呈阴性,则健康护理工作者具有确定可能需要另外的止血治疗所必需的信息。
[0237] 实施例24
[0238] 图24A和24B示出了在添加活化的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC;FEIBA)之后FXa抑制的逆转的检测。FEIBA是被施用以在患者中克服FXa抑制剂的激活因子的组合。另一个实例是Kcentra,其是非活性凝血酶原复合物浓缩物。也有特异性FXa抑制剂逆转剂,例如凝血因子Xa(重组),未活化的zhzo。图24A示出了在添加7.5ng/mL FXa后对于依度沙班的预期凝血时间。图24B示出了用aPCC处理具有500ng/mL依度沙班的血浆样品的凝血时间的变化。该数据表明,根据本发明一个实施方案的测试具有监测这些DOAC的抗凝作用的逆转或克服的效用。
[0239] 本文中引用的所有专利、申请公布和参考文献的教导通过引用整体并入。
[0240] 尽管已经具体示出和描述了一些示例性实施方案,但是本领域技术人员将理解的是,其中在不脱离所附权利要求书所涵盖的实施方案的范围的情况下,可在形式和细节上进行多种改变。
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