肝素酶冻干制剂、肝素酶杯及其制备方法和用途
阅读：698发布：2020-08-06
专利汇可以提供肝素酶冻干制剂、肝素酶杯及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及体外诊断 试剂 技术领域，具体涉及一种肝素酶 冻干制剂 、肝素酶杯及其制备方法和用途。本发明提供的肝素酶冻干制剂的复溶酶活收率至少为75％。本发明提供的肝素酶杯，包括：杯体和肝素酶冻干制剂，所述杯体内限定出容纳空间；所述肝素酶冻干制剂设置在所述容纳空间中。本发明还提供了一种肝素酶冻干制剂的方法，包括：将含有预定比例的所述肝素酶、所述保护剂、所述缓冲盐和所述 防腐剂 的 水 溶液依次进行预冻处理、 升华 处理和干燥处理，以便获得所述肝素酶冻干制剂。将本发明肝素酶冻干制剂和肝素酶杯应用在 血液样本 的检测过程中，其检出灵敏度高，而且能够显著提升肝素酶在冻干过程中的活性和 稳定性 。，下面是肝素酶冻干制剂、肝素酶杯及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种肝素酶冻干制剂，其特征在于，所述肝素酶冻干制剂的复溶酶活收率至少为
75％；
任选的，所述肝素酶冻干制剂的酶活有效期在12个月以上，所述肝素酶冻干制剂在12个月后的酶活损失在10％以下；
任选的，所述肝素酶为肝素酶I。
2.根据权利要求1所述的肝素酶冻干制剂，其特征在于，所述肝素酶冻干制剂含有：
0.001-0.01重量份的肝素酶；
1-20重量份的保护剂；
0.01-0.1重量份的防腐剂；
可选的，还含有0.5-5重量份的缓冲盐；
所述保护剂包括选自海藻糖、乳糖、甘露醇、牛血清白蛋白和甘油的至少一种；
所述防腐剂包括选自苯钾酸钠、丙酸钙、柠檬酸钾、草酸钾、Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠的至少一种；
可选的，还含有0.5-5重量份的缓冲盐；所述缓冲盐包括选自钠盐、镁盐、钙盐、钾盐、铝盐或铁盐中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的肝素酶冻干制剂，其特征在于，所述肝素酶冻干制剂呈注射剂、粉剂和针剂的至少一种形式。
4.一种肝素酶杯，其特征在于，包括：
杯体，所述杯体内限定出容纳空间；
肝素酶冻干制剂，所述肝素酶冻干制剂设置在所述容纳空间中，
其中，所述肝素酶冻干制剂为权利要求1～3任一项所述的肝素酶冻干制剂；
任选的，所述肝素酶杯进一步包括：
泡罩包装，所述杯体被密封在所述泡罩包装中。
5.一种制备权利要求1～3任一项所述肝素酶冻干制剂的方法，其特征在于，包括：
将含有预定比例的所述肝素酶、所述保护剂、所述缓冲盐和所述防腐剂的水溶液依次进行预冻处理、升华处理和干燥处理，以便获得所述肝素酶冻干制剂；
任选的，所述预冻处理是在-40摄氏度～-70摄氏度的温度下进行的；
任选的，所述升华处理是在-40摄氏度～20摄氏度的温度下进行的；
任选的，所述干燥处理是在20～30摄氏度下进行的。
6.一种制备权利要求4所述的肝素酶杯的方法，其特征在于，包括：
在杯体中设置权利要求1～3任一项所述的肝素酶冻干制剂以便获得所述肝素酶杯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肝素酶冻干制剂是通过在所述杯体中实施权利要求7或8所述的制备肝素酶冻干制剂的方法而形成的。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述杯体封装于泡罩包装中；
任选的，将所述杯体封装于泡罩包装中是通过下列步骤进行的：
将薄膜基材在50～150摄氏度下进行软化处理，所述基材是由选自醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚氯乙烯的至少一种形成的，任选的，所述薄膜基材的厚度为0.46毫米～0.61毫米；
将经过软化处理的所述薄膜基材进行冲压，以便形成泡罩孔；以及
将所述杯体置于所述泡罩孔中，并利用覆盖膜进行密封。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求4所述的肝素酶杯或者权利要求1～3任一项所述的肝素酶冻干制剂。
10.权利要求9所述的试剂盒、权利要求4所述的肝素酶杯、权利要求1～3任一项所述的肝素酶冻干制剂在检测血液样本血栓弹力图中的用途。
肝素酶冻干制剂、肝素酶杯及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
[0002] 肝素酶是一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，肝素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子量肝素、研究肝素的结构。另外，肝素酶可以用于血液样本的生化检测例如血栓弹力图。
[0003] 然而，目前的肝素酶制剂仍有待改进。
发明内容
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够同时满足有效保持酶活、保存效期长且灵敏感高的肝素酶冻干制剂和肝素酶杯，尤其是提供了一种用于血液检测的肝素酶杯的制备方法。
[0005] 血液凝固过程的最终结果是形成血凝块；血凝块的物理性质(血凝时间、速率、血块强度)将决定病人是否具有正常的凝血功能，是否会出血或形成血栓；肝素类药物可增加血液中抗凝血酶的活性，从而起到抗凝作用。本发明的发明人在研究过程中发现，借助于血栓弹力图检测时，普通杯中无肝素酶，因此血凝时间会受到肝素的影响；肝素酶杯中包被有肝素酶，可有效降解血液中的肝素，不受残留肝素影响。通过将普通杯血栓弹力图曲线和肝素酶杯血栓弹力图曲线叠加，对比凝血时间，即可评估肝素治疗前后全血的凝血功能。
[0006] 因此，在肝素酶杯的生产过程中如何在生产过程中保持肝素酶的活性，不造成酶活的严重损失，降低产品成本同时对肝素检出敏感，是一个关键的问题。发明人进行了一系列的实验探索和研究，以期寻找出一种能够同时满足对酶活影响小、显著延长肝素酶杯保存效期对肝素检出敏感的肝素酶冻干制剂，除肝素酶以外，含有保护剂以及防腐剂等成分，而且用于肝素的检测，其检出灵敏度高，能够显著提升肝素酶在冻干过程中的活性和稳定性。
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种肝素酶冻干制剂，所述肝素酶冻干制剂的复溶酶活收率至少为75％。
[0008] 肝素酶能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键，其应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子量肝素、研究肝素的结构。肝素酶是一种很容易失活的酶，可以将其制备成冻干粉提高其稳定性，但因肝素酶比较脆弱，冻干过程酶活损失30％以上，导致肝素酶成本高，限制了其在体外诊断试剂领域的广泛应用。而本发明提供的肝素酶冻干制剂，其复溶酶活收率至少为75％以上，甚至是85％以上，极大的提高了肝素酶的保存活力，可以用于与肝素酶相关的试剂盒的制备中，或者用来制备体外诊断试剂。
[0009] 另外，根据本发明的上述实施例，上述肝素酶冻干制剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0010] 根据本发明的实施例，所述肝素酶冻干制剂的酶活有效期在12个月以上，所述肝素酶冻干制剂在12个月后的酶活损失在10％以下。将本发明提供的肝素酶冻干制剂在2-8℃条件下放置12个月甚至是15个月时，其酶活损失与未放置之前相比，酶活损失在10％以下。放置12个月的酶活损失在6％以下，放置15个月的酶活损失在9％以下，可以极大的满足工业生产的需求。
[0011] 根据本发明的实施例，所述肝素酶为肝素酶I。肝素酶I冻干制剂，可以保留肝素酶I的活性，冻干前后对比肝素酶I的活性，酶活收率在75％以上。
[0012] 根据本发明的实施例，所述肝素酶冻干制剂含有：
[0013] 0.001-0.01重量份的肝素酶；
[0014] 1-20重量份的保护剂；
[0015] 0.01-0.1重量份的防腐剂，
[0018] 采用保护剂和防腐剂可以增强肝素酶的保存时间和减少制剂过程中的酶活损失，其中保护剂在冻干过程中可替代水分子提供给蛋白质有效的支持结构，从而有效的防止冻干过程中蛋白的变性；防腐剂可杀灭或抑制微生物增殖，而防止产品变质，有效延长产品有效期。同时添加防腐剂和保护剂，可以使得肝素酶在保存过程中保持长期的稳定性，在15个月后酶活损失依然较小。而单独加入保护剂或者防腐剂时，肝素酶的酶活保存效果并不好，不适合工业生产的需求。
[0019] 根据本发明的实施例，所述肝素酶冻干制剂还含有0.5-5重量份的缓冲盐，所述缓冲盐包括选自钠盐、镁盐、钙盐、钾盐、铝盐或铁盐中的至少一种。缓冲盐可以保持肝素酶冻干制剂的pH值的稳定性，使得肝素酶在一个稳定的pH环境中，防止pH过低或者过高导致肝素酶失活。
[0020] 根据本发明的实施例，所述肝素酶冻干制剂呈注射剂、粉剂和针剂的至少一种形式。肝素酶冻干制剂可以根据需要呈现出注射剂、粉剂或者针剂的形式，其中，粉剂和针剂保存时间长，注射剂使用时更为方便，生产过程中可以根据需要制备成不同的肝素酶冻干制剂的形式，而不仅仅限于注射剂、粉剂和针剂。
[0021] 根据本发明的另一方面，本发明提出了一种肝素酶杯，包括：
[0022] 杯体，所述杯体内限定出容纳空间；
[0023] 肝素酶冻干制剂，所述肝素酶冻干制剂设置在所述容纳空间中，
[0024] 其中，所述肝素酶冻干制剂为以上任一项所述的肝素酶冻干制剂。
[0025] 另外，根据本发明的实施例，上述肝素酶杯，进一步包括：
[0026] 泡罩包装，所述杯体被密封在所述泡罩包装中。采用泡罩包装，有助于延长产品效期，使用方便，拆包即用。通过泡罩包装，使得本发明的肝素酶杯具备更好的稳定性和更高的灵敏度。
[0027] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备以上实施例所述肝素酶冻干制剂的方法，包括：
[0028] 将含有预定比例的所述肝素酶、所述保护剂、所述缓冲盐和所述防腐剂的水溶液依次进行预冻处理、升华处理和干燥处理，以便获得所述肝素酶冻干制剂。其中，预定比例的所述肝素酶、所述保护剂、所述缓冲盐和所述防腐剂分别为0.001-0.01重量份的肝素酶；1-20重量份的保护剂；0.5-5重量份的缓冲盐和0.01-0.1重量份的防腐剂。
[0029] 根据本发明的实施例，所述预冻处理是在-40摄氏度～-70摄氏度的温度下进行的。本发明实施例中采用预冻处理，不仅是为了保护物质的主要性能不变，而且要获得冻结后样品有合理的结构以利于水分的升华，同时也是为了固定样品，以便在真空下进行升华。在干燥之前在-40摄氏度～-70摄氏度温度下进行预冻处理，可以使得肝素酶迅速冷冻，降低肝素酶在冷冻干燥过程中的酶活损失。
[0030] 根据本发明的实施例，所述升华处理是在-40摄氏度～20摄氏度的温度下进行的。在本发明的实施例中采用升华处理，主要是使样品中冻结的自由水升华逸出。升华过程在预冻过程和干燥过程之间，不会使得肝素酶的温度变化异常剧烈，从而降低肝素酶在冷冻干燥过程中的酶活损失。
[0031] 根据本发明的实施例，所述干燥处理是在20～30摄氏度下进行的。在本发明的实施例中采用干燥处理，主要是去除部分结合水，这部分水主要靠范德华力和氢键吸附在样品上，需要更多的能量才能将其除去。在20～30摄氏度条件下进行干燥处理，不会对肝素酶的酶活损失造成大的影响，最大程度的降低肝素酶在冷冻干燥过程中的酶活损失。
[0032] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备以上实施例所述的肝素酶杯的方法，包括：
[0033] 在杯体中设置以上实施例所述的肝素酶冻干制剂以便获得所述肝素杯。
[0034] 根据本发明的实施例，所述肝素酶冻干制剂是通过在所述杯体中实施以上实施例所述的制备肝素酶冻干制剂的方法而形成的。
[0035] 根据本发明的实施例，进一步包括将所述杯体封装于泡罩包装中。
[0036] 采用泡罩包装，有助于延长产品效期，使用方便，拆包即用。如前所述，目前肝素酶制备方法对肝素酶活性影响巨大，将本发明的肝素酶杯用于血栓弹力图检测试剂盒的生产，可显著减少肝素酶用量，降低产品成本。并且，根据本发明的实施例，本发明的肝素酶杯具备更好的稳定性和更高的灵敏度。
[0037] 根据本发明的实施例，将所述杯体封装于泡罩包装中是通过下列步骤进行的：
[0039] 将经过软化处理的所述薄膜基材进行冲压，以便形成泡罩孔；以及
[0040] 将所述杯体置于所述泡罩孔中，并利用覆盖膜进行密封。
[0041] 利用泡罩包装技术进行包装，可以更好的保护酶活，减少肝素酶酶活性的丧失，将本发明的肝素酶杯用于血栓弹力图检测试剂盒的生产，可显著减少肝素酶用量，降低产品成本。
[0042] 根据本发明的实施例，所述薄膜基材的厚度为0.46毫米～0.61毫米。将一定厚度的薄膜基材包装肝素酶杯，可以对肝素酶杯起到保护和防止酶活失活的功能。
[0043] 本发明另外还提出了一种试剂盒，包括以上实施例所述的肝素酶杯或者以上任一项实施例所述的肝素酶冻干制剂。
[0044] 另外，本发明还提出了以上实施例所述的试剂盒、以上实施例所述的肝素酶杯、以上实施例所述的肝素酶冻干制剂在检测血液样本血栓弹力图中的用途。
[0045] 血栓弹力图是由血栓弹力图仪描绘的血样凝结过程的特殊图形，利用全血样本即可检验，无需特殊处理血样，是一种方便、快捷、准确、床旁即可操作检测的血液流变学检测方法。通过对血栓弹力图的监测和分析，可以评估患者的凝血特性，协助临床医师对患者凝血状况做出准确判断。血栓弹力图提供了由凝血启动到纤维蛋白形成、血小板聚集、纤维蛋白联结至血凝块形成及纤维蛋白溶解的全过程信息，对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估，其作为一种监测凝血全貌的床旁快速检测系统，通过微量血样的检测，广泛应用于临床各科室，主要针对凝血状态的研究，具有真实还原凝血全貌、敏感度高、检测精准、结果直观和数据详细等特点，较常规凝血检查能更灵敏、更快速反映凝血异常。血栓弹力图在抗血小板功能的抑制情况及预测抗血小板药物治疗下的缺血事件能力不亚于金标准比浊法，甚至更优于比浊法同时具有试剂统一、操作标准化、易于推广的优点。通过对比肝素酶杯和普通杯的血栓弹力图的差别，可以实现对于血液样本的检测。
[0046] 通过以上技术方案，本发明所取得的有益效果为：与现有技术相比，本发明通过将普通杯和肝素酶杯血栓弹力图曲线叠加，对比血凝时间，即可评估肝素治疗前后全血的凝血功能。采用本发明的肝素酶杯或者试剂盒对肝素检出灵敏度高达0.07IU/mL，远高于采用活化部分凝血活酶时间(APTT)和激活凝血试验(ACT)等常规检测肝素浓度的方法，同时也可检测低分子肝素，可床旁操作。具体而言，本发明所提供的技术方案具有以下有益效果：
[0047] (1)肝素酶溶液经冻干后，活性收率在75％以上，极大的降低了产品成本；
[0048] (2)冻干后的肝素酶冻干粉具有更高的稳定性，有效期≥12个月；
[0049] (3)不影响后续血栓弹力图测定，降解肝素速度快，可中和≤5IU肝素类药物；
[0050] (4)检测肝素类药物的灵敏度高，≥0.07IU/mL肝素即可检出；
[0051] (5)密封包装便于产品保存、运输，拆包即用；
[0052] (6)测试凝血功能的方法简单快捷，综合比较，使用本发明方法的肝素酶杯在肝素酶液冻干过程中起到显著保护酶活的作用，有效降低产品成本，较肝素酶杯普遍使用的肝素酶液冻干方法具有明显优势。
[0054] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0055] 图1为根据本发明实施例的肝素酶杯检测血液样本血栓弹力图的方法流程示意图；
[0056] 图2为根据本发明实施例的肝素酶杯检测血液样本与普通杯弹力图叠加的示意图，其中曲线1为普通杯弹力图，曲线2为肝素酶杯弹力图；
[0057] 图3为根据本发明实施例的肝素酶杯检测含肝素血液样本与普通杯弹力图叠加的示意图，其中曲线3为普通杯弹力图，曲线4为肝素酶杯弹力图；
[0058] 图4为根据本发明实施例的肝素酶杯检测其灵敏度(含0.07IU/mL肝素血液样本与普通杯弹力图叠加的示意图)，其中曲线5为普通杯弹力图，曲线6为肝素酶杯弹力图。
具体实施方式
[0059] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0060] 本发明的发明人惊奇地发现，在本发明的肝素酶冻干制剂中，添加保护剂以及防腐剂，可以显著提高肝素酶在保存和冻干过程中的活性。在一种实施例中，保护剂包含选自海藻糖、乳糖、甘露醇或者牛血清白蛋白中的至少一种，优选为海藻糖、乳糖、甘露醇或者牛血清白蛋白中的两种以上；盐优选为氯化钠或氯化钙；防腐剂包含选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯钠的至少一种。这几种组分的配伍，可以协同起到提高肝素酶在保存和冻干过程中活性的特定。其中，在本发明的一些实施例中，以重量份计，所述肝素酶冻干制剂包括0.001-0.01重量份的肝素酶，1-20重量份的保护剂，和0.01-0.1重量份的防腐剂。在本发明的一些实施例中，当本发明的肝素酶冻干制剂为液体制剂时，本发明的肝素酶冻干制剂进一步包括0.5-5重量份的缓冲盐，所述缓冲盐包括选自钠盐、镁盐、钙盐、钾盐、铝盐或铁盐中的至少一种。
[0061] 在本发明的一些实施例中，本发明提供了一种肝素酶冻干液，所述肝素酶冻干液中含有质量-体积浓度为0.01‰～0.1‰的肝素酶，质量-体积浓度为1％～20％的保护剂，质量-体积浓度为0.5％～5％的缓冲盐，以及质量-体积浓度为0.1‰～1‰的防腐剂。根据本发明的实施例，所述保护剂为质量-体积浓度为1％～10％的海藻糖、乳糖、甘露醇或者牛血清白蛋白，或者为质量-体积浓度为2％～20％的甘油。根据本发明的实施例，所述保护剂的pH为6.0-8.0。
[0062] 其中，在本文中所述的“质量-体积浓度”＝溶质的质量数(克)/溶液的体积(升)，即1‰＝1克/升。
[0063] 将本发明的肝素酶冻干液冻干后得到冻干粉，经过检测冻干粉完全满足商品化的要求，尤其是能够同时满足快速、灵敏降解血样中残留肝素，同时具有更高的活性和更好的稳定性且不影响后续血栓弹力图的检测。因此，可以利用本发明的肝素酶冻干用组合物或者肝素酶冻干液制备肝素酶杯，血栓弹力图检测用试剂盒，或者肝素检测试剂盒等。
[0064] 本发明还提供了一种肝素酶杯的制备方法，包括将以上所述的肝素酶冻干用组合物或者以上所述的肝素酶冻干液进行冷冻干燥和密封包装，制备得到肝素酶杯。在此基础上，将其与血栓弹力图普通杯(高岭图试剂)配合使用，用于对血液样本的检测。
[0065] 根据本发明的实施例，所述冷冻干燥包括预冻处理、升华处理和干燥处理过程，其中，所述预冻处理是在-40摄氏度～-70摄氏度的温度下进行的，时间为5～20min；所述升华处理是在-40摄氏度～20摄氏度的温度下进行的，时间为10～60min；所述干燥处理是在20～30摄氏度下进行的，时间为15～30h。通过预冻处理，可以保护物质的主要性能不变，而且使得要获得冻结后样品有合理的结构以利于水分的升华，同时也能固定样品，以便在真空下进行升华。然后通过升华处理使样品中冻结的自由水升华逸出。升华过程在预冻过程和干燥过程之间，不会使得肝素酶的温度变化异常剧烈，从而降低肝素酶在冷冻干燥过程中的酶活损失。最后通过干燥处理去除部分结合水，这部分水主要靠范德华力和氢键吸附在样品上，需要更多的能量才能将其除去。通过以上冷冻干燥过程可以最大程度的降低肝素酶在冷冻干燥过程中的酶活损失。
[0066] 根据本发明的实施例，利用本发明的肝素酶冻干制剂制备得到的肝素酶杯，其酶活损失很低，可以在2～8℃条件下至少保存12个月以上，而且在12个月后的酶活损失在10％以下，而且灵敏度高，最低可以检测出0.07IU/mL浓度的肝素。
[0067] 在本发明的一方面，本发明提供了一种血栓弹力图检测用试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的肝素酶杯。在具体实施过程中，借助于血栓弹力图仪，本发明提供了前面所述的肝素酶杯与血栓弹力图普通杯试剂(高岭土试剂)配合使用，在检测人全血的血凝时间指标中的用途。根据本发明的一种优选实施方式中，在本发明肝素酶杯中加入CaCl2试剂，然后加入高岭土试剂与血液样本混合后的孵育物，之后利用血栓弹力图仪检测凝血过程，通过将普通杯和肝素酶杯血栓弹力图曲线叠加，对比血凝时间(R)，即评估肝素治疗前后全血的凝血功能。
[0068] 在本发明的又一方面，本发明提供了一种肝素检测试剂盒，所述肝素检测试剂盒包括以上所述的肝素酶杯。在具体实施过程中，借助于血栓弹力图仪，将所述的肝素酶杯与血栓弹力图普通杯试剂(高岭土试剂)配合使用，半定量检测血液样本中肝素类药物的方法。患者使用肝素类药物后，血栓弹力图普通杯测试的血凝时间都大于正常参考范围的上限值，这是肝素抗凝作用的结果。使用本发明制备得到的肝素酶杯检测可检出≥0.07IU/mL肝素，中和≤5IU肝素类药物，检出限和中和的肝素量均高于市售同类试剂盒，通过将普通杯和肝素酶杯血栓弹力图曲线叠加，对比R值，即可判断肝素类药物药效，或是否存在抵抗、残留等。因此在适用本发明的肝素检测试剂盒检测的过程中，患者使用过量的肝素类药物，超过了肝素杯的中和能力，使肝素酶杯测试结果的R值大于正常参考范围上限，则提示肝素类药物使用过量或使用了鱼精蛋白等非肝素类抗凝药物。
[0069] 根据本发明的实施例，所述肝素类药物的的检测方法包括如下步骤：将高岭土试剂与血液样本混合并进行第一孵育，获得第一孵育混合物；在肝素酶杯中加入CaCl2试剂；将所述第一孵育混合物加至肝素酶杯；利用血栓弹力图仪检测血液样本凝血过程曲线，测得R值。应用该检测方法评估患者凝血功能。对需要长期服用肝素类药物的患者，通过血栓弹力图肝素酶杯检测试剂盒，可评估肝素类药物疗效，保障其用药的有效性和安全性，缩短治疗时间，也快速判断患者凝血状态，有助于医生第一时间评估特别是围手术期的抗凝方案是否合理，同时成本低，结果准确可靠，反映真实凝血过程，重复性好。
[0070] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0071] 其中，液体生物防腐剂(Proclin 300)，含量98％，厂家：Sigma；
[0072] 肝素酶I，≥10IU/mL，艾德豪克国际技术有限公司；
[0073] 牛血清白蛋白，厂家：Proliant Biologicals,Inc；
[0074] 对羟基苯甲酸甲酯钠，含量99％，厂家：阿拉丁；
[0075] 山梨酸钾，含量≥98％，厂家：国药集团化学试剂有限公司；
[0076] 海藻糖，D(+)-无水海藻糖，含量≥99％，厂家：国药集团化学试剂有限公司；
[0077] 甘露醇，D-甘露醇，AR，厂家：国药集团化学试剂有限公司；
[0078] 高岭土试剂，厂家：深圳优迪生物技术有限公司；
[0079] 市购的血栓弹力图检测试剂盒，厂家：北京乐普医疗科技有限责任公司；
[0080] 醋酸纤维素基材，贵州千叶药品包装股份有限公司；
[0081] 聚苯乙烯基材，贵州千叶药品包装股份有限公司；聚氯乙烯基材，贵州千叶药品包装股份有限公司。
[0082] 实施例1
[0083] 分别按照制备例1-3中的步骤制备得到肝素酶冻干液，然后进行冷冻干燥和密封包装，制备得到肝素酶杯。
[0084] 制备例1
[0085] (1)分别称取肝素酶I 0.005g，甘露醇5.0g，牛血清白蛋白3.0g，氯化钙1.5g和Proclin300 0.07g，溶于100mL纯化水中，搅拌使充分溶解，制备得到肝素酶冻干液，用1mol/L的盐酸调节pH为7.20。
[0086] (2)将步骤(1)制备得到的肝素酶冻干液进行冷冻干燥，得到冻干粉。具体包括如下步骤：
[0087] 1)预冻：将步骤(2)制备得到的冻干液在-40℃条件下进行预冻处理，预冻时间为10min；
[0088] 2)升华：将步骤1)预冻后的物质在-20℃条件下进行升华处理，升华处理的时间为20min；
[0089] 3)干燥：将步骤2)升华后的物质进行干燥处理，干燥温度为20℃，干燥时间为20h。
[0090] (3)利用全自动泡罩包装联动机对步骤(2)制备得到的冻干粉进行密封包装，制备得到肝素酶杯。所用到的全自动泡罩包装联动机型号为DPP-80型平板式自动泡罩包装机，厂家为深圳雷粤机械设备有限公司。具体包含以下步骤：
[0091] 1)薄膜放卷：利用醋酸纤维素基材，其厚度为0.46mm，将基材放置于薄膜输送机构；
[0092] 2)加热：将薄膜基材加热至110℃；
[0093] 3)成型：采用模具冲压成型工艺，利用将加热软化的薄膜冲压形成需要的几何形状的泡罩孔，泡罩机配有鼓风装置，在泡罩孔成型的同时充填空气，空气流速控制在0.40m3/min，成型温度为105℃，保证泡罩孔不至变形收缩，同时加速降温成型过程；
[0094] 4)充填：在形成的泡罩随传送带传递的过程中，人工将预先冻干的肝素酶杯体放入形成的泡罩孔内；
[0095] 5)热封：用覆盖膜将成型膜泡罩进行热封，热封温度为160℃，时间2～5秒；
[0096] 6)冲切：将热封好的膜片冲切成规定尺寸的板块成品，冲裁频率为30～40次/min。
[0097] 制备例2
[0098] (1)分别称取肝素酶I 0.005g，甘露醇7.0g，牛血清白蛋白2.0g，氯化钠1.7g和丙酸钙0.1g，溶于100mL纯化水中，搅拌使充分溶解，制备得到肝素酶冻干液，用1mol/L的盐酸调节pH为7.00。
[0099] (2)将步骤(1)制备得到的肝素酶冻干液进行冷冻干燥，得到冻干粉。具体包括如下步骤：
[0100] 1)预冻：将步骤(2)制备得到的冻干液在-60℃条件下进行预冻处理，预冻时间为10min；
[0101] 2)升华：将步骤1)预冻后的物质在-20℃条件下进行升华处理，升华处理的时间为20min；
[0102] 3)干燥：将步骤2)升华后的物质进行干燥处理，干燥温度为30℃，干燥时间为20h。
[0103] (3)利用全自动泡罩包装联动机对步骤(2)制备得到的冻干粉进行密封包装，制备得到肝素酶杯。其中，具体包含以下步骤：
[0104] 1)薄膜放卷：利用聚苯乙烯基材，其厚度为0.61mm，将基材放置于薄膜输送机构；
[0105] 2)加热：将薄膜基材加热至120℃；
[0106] 3)成型：采用模具冲压成型工艺，利用将加热软化的薄膜冲压形成需要的几何形状的泡罩孔，泡罩机配有鼓风装置，在泡罩孔成型的同时充填空气，空气流速控制在0.40m3/min，成型温度为105℃，保证泡罩孔不至变形收缩，同时加速降温成型过程；
[0107] 4)充填：在形成的泡罩随传送带传递的过程中，人工将预先冻干的肝素酶杯体放入形成的泡罩孔内；
[0108] 5)热封：用覆盖膜将成型膜泡罩进行热封，热封温度为160℃，时间2～5秒；
[0109] 6)冲切：将热封好的膜片冲切成规定尺寸的板块成品，冲裁频率为30～40次/min。
[0110] 制备例3
[0111] (1)分别称取肝素酶I 0.007g，甘油15.0g，氯化钙3.0g和丙酸钙0.1g，溶于100mL纯化水中，搅拌使充分溶解，制备得到肝素酶冻干液液，用1mol/L的盐酸调节pH为7.35。
[0112] (2)将步骤(1)制备得到的肝素酶冻干液进行冷冻干燥，得到冻干粉。具体包括如下步骤：
[0113] 1)预冻：将步骤(2)制备得到的冻干液在-50℃条件下进行预冻处理，预冻时间为10min；
[0114] 2)升华：将步骤1)预冻后的物质在10℃条件下进行升华处理，升华处理的时间为20min；
[0115] 3)干燥：将步骤2)升华后的物质进行干燥处理，干燥温度为30℃，干燥时间为20h。
[0116] (3)利用全自动泡罩包装联动机对步骤(2)制备得到的冻干粉进行密封包装，制备得到肝素酶杯。具体包含以下步骤：
[0117] 1)薄膜放卷：利用聚氯乙烯基材，其厚度为0.50mm，将基材放置于薄膜输送机构；
[0118] 2)加热：将薄膜基材加热至120℃；
[0119] 3)成型：采用模具冲压成型工艺，利用将加热软化的薄膜冲压形成需要的几何形状的泡罩孔，泡罩机配有鼓风装置，在泡罩孔成型的同时充填空气，空气流速控制在0.40m3/min，成型温度为105℃，保证泡罩孔不至变形收缩，同时加速降温成型过程；
[0120] 4)充填：在形成的泡罩随传送带传递的过程中，人工将预先冻干的肝素酶杯体放入形成的泡罩孔内；
[0121] 5)热封：用覆盖膜将成型膜泡罩进行热封，热封温度为160℃，时间2～5秒；
[0122] 6)冲切：将热封好的膜片冲切成规定尺寸的板块成品，冲裁频率为30～40次/min。
[0123] 实施例2血栓弹力图的测定
[0124] 1、利用制备例1-3配制获得的本发明的肝素酶液经冻干后制得肝素酶杯，可以根据需要将肝素酶杯设计成任何形状和相应的尺寸，例如可以将肝素酶杯的尺寸设计为：内直径7.83mm，外直径10.90mm，高度14.53mm。然后参照图1所示的方法，分别测定待测血液样本的血栓弹力图指标，具体步骤如下：
[0125] (1)将高岭土试剂与枸缘酸钠全血样本按照100:1的体积比例混合，于室温下孵育1min，以便获得第一孵育混合物；
[0126] (2)将0.2mol/L的CaCl2试剂按照20μL/杯的体积加入到肝素酶杯中；
[0127] (3)将所述第一孵育混合物按照340μL/杯的体积加入到肝素酶杯中，于37℃条件下进行检测，利用血栓弹力图仪描绘出血液样本凝结过程的特殊图形(血栓弹力图)。
[0128] 2、利用本发明的肝素酶杯配合市购的血栓弹力图肝素酶检测试剂盒(试剂盒批号为17SH0212，厂家：北京乐普医疗科技有限责任公司，以下均相同)除肝素酶杯外的其他组分对正常人血液样本和配套质控血浆Level 1进行测定，所得凝血反应曲线如图2所示，对含有0.0033mg/mL肝素钠的质控血浆Level 1用普通杯(曲线1)和肝素酶杯(曲线2)同时进行测试，满足表1中的要求。普通杯各项指标为R1、MA1、Angle1和K1，肝素酶杯各项指标为R2、MA2、Angle2和K2。该凝血反应曲线即为可获得血凝时间(R)等指标的血栓弹力图，其中R(min)指血液置入血栓弹力图仪开始到第一块纤维蛋白凝块形成(描记图幅度达2mm)所需的时间(min)；Angle(deg)是从血凝块形成点至描记图最大曲线弧度作切线与水平线的夹角，反映了血凝块聚合的速率；MA是血栓弹力图上的最大振幅，即最大切应力系数(mm)；K是指从血凝形成点至弹力图振幅所需时间，即血凝块形成的速率。
[0129] 表1质控血浆Level 1测试各项指标要求
[0130]
[0131] 表2质控血浆Level 1测试结果
[0132]
[0133] 从图2和表1以及表2的数据可以看出，图2中各血栓弹力图曲线光滑，各指标测试结果见表2，均在正常参考范围。
[0134] 3、血栓弹力图检测用肝素酶杯有效性检测：
[0135] 利用本发明的肝素酶杯配合市购的血栓弹力图普通杯检测试剂盒对含肝素类药物血液样本进行测定，将普通杯弹力图(曲线3)与肝素酶杯弹力图(曲线4)曲线叠加，对比R值，如图3所示，各项测定的数据值如下表3所示。
[0136] 表3采用普通杯和肝素酶杯检测血液样本的测试结果
[0137]
[0138]
[0139] 从图3以及表3的数据可以看出，图3中普通杯血凝时间R值(8.4min)大于正常值上限(正常值2～8min)，肝素酶杯R值(7.2min)，两者相差大于1min，提示血液中含有肝素，存在抗凝效果。
[0140] 实施例3肝素酶杯配套试剂盒的准确性检测
[0141] 分别用本发明制备得到的深圳优迪生物技术有限公司的血栓弹力图(肝素酶杯)检测试剂盒和市售的血栓弹力图检测试剂盒分别对新鲜的枸橼酸钠全血样本进行测定，将所得结果进行对比，对本发明制备得到的肝素酶杯配套试剂盒的有效性进行检测。其中以制备例2的肝素酶杯结果为例，分别选取不同肝素浓度的5份新鲜枸橼酸钠全血样本按照实施例2步骤1的测定过程进行检测，5份样本的检测结果如表4所示。
[0142] 其中，采用市售的血栓弹力图(肝素酶杯)检测试剂盒作为对比试剂，该试剂盒含普通杯(高岭土试剂)肝素酶杯和CaCl2试剂。按照试剂盒说明书中对应的流程对对比试剂进行操作。
[0143] 表4血栓弹力图R值检测结果
[0144]
[0145] 从表4中，可以看出利用本发明制备得到的血栓弹力图肝素酶杯检测试剂盒和市售的肝素酶杯检测试剂盒的R1值、R2值及△R1-R2结果无显著差异，说明本发明制备得到的试剂盒可有效检测出不同肝素浓度水平样本。
[0146] 实施例4肝素酶杯配套试剂盒的灵敏度检测
[0147] 利用本发明制备得到的血栓弹力图肝素酶杯检测试剂盒对含0.07IU/mL肝素血液样本进行测定，将普通杯弹力图(曲线5)与肝素酶杯弹力图(曲线6)曲线叠加，得到图4，如图4所示，对比R1值(8.8min)、R2值(5.9min)，△R1-R2结果>1min，提示血液中含有肝素，存在抗凝效果，各项测定结果如表5所示。
[0148] 表5采用普通杯和肝素酶杯对血液样本的灵敏度测试结果
[0149]
[0150] 实施例5肝素酶液的冻干保护效果及长期稳定性监测
[0151] 参照实施例1的方法流程，按下表6的成分组成分别配制系列肝素酶液，在相应反应杯中经冷冻干燥后即得本发明的肝素酶杯。
[0152] 表6不同制备例中各个成分的重量
[0153]成分 试剂1(g) 试剂2(g) 试剂3(g)
肝素酶I 0.006 0.006 0.008
甘露醇 5 7 -
牛血清白蛋白 3 2 -
甘油 - - 18.5
氯化钠 1.0 1.7 -
氯化钙 - - 1.5
丙酸钙 0.1 0.06 0.07
pH值 7.20 7.00 7.35
肝素酶I 0.006 0.006 0.008
甘露醇 5 7 -
牛血清白蛋白 3 2 -
甘油 - - 18.5
氯化钠 1.0 1.7 -
氯化钙 - - 1.5
丙酸钙 0.1 0.06 0.07
pH值 7.20 7.00 7.35
[0154] 将冻干的肝素酶I以20μL纯化水复溶，测定酶活力，与冻干前酶活力相比较，计算酶活保留率。
[0155] 其中，测定酶活的具体方法如下：在5mL石英比色皿中加入30℃预热过的2.5mL肝素浓度为l mg/mL的50mM磷酸缓冲液，移取5-20μL酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/mL)。
[0156] 分别对试剂1-3(对照分别为相应未冻干肝素酶液)的冻干粉复溶后进行酶活检测，测试结果如表7。
[0157] 表7肝素酶冻干前后酶活检测结果
[0158]
[0159] 由表7可知，本发明的肝素酶液的各组分组合，其中钙离子是肝素酶的辅基，冻干液中含有一定量的钙离子能够保证酶上钙离子不丢失，从而使酶保持一定的紧密结构而免于失活，保护剂如甘露醇和牛血清白蛋白在冷冻干燥过程中可以防止酶活组分发生变性，同时能防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，替代水分子提供给蛋白质有效的支持结构，从而有效的防止冻干过程中蛋白的变性，钙离子和保护剂协同作用，使得经冷冻干燥后酶活损失不大，酶活收率均≥75％，说明本发明的各组合的肝素酶液在冷冻干燥过程中可显著有效的保护酶活性，比文献报道Daniel等[Daniel etal,(1992)J.Bio.Chem.267(34)24347-24355]高出50％以上。
[0160] 同时检测试剂1-3制备的肝素酶杯产品长期稳定性(按产品要求贮存条件2-8℃)，每月按上述测酶活方法进行酶活性检测，测试结果如表8。
[0161] 表8肝素酶杯酶活长期稳定性检测结果
[0162]
[0163] 由表6可知，本发明的肝素酶杯在15个月内酶活相对偏差≤±10％，具备良好的长期稳定性，满足产品宣称指标。
[0164] 因此通过本发明的方法制备得到的肝素酶杯灵敏度高，而且稳定性强，连续保存15个月后，酶活损失也不高于10％，适合商业上的生产和使用。
[0165] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0166] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
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