一种用于呼吸道细菌16SrRNA基因序列检测的痰液收集方
法
技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物医学领域，特别是一种用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法。
背景技术
[0002] 吸道
微生物群系研究是一个相对较新的领域，16S rRNA基因序列分析是目前常用于鉴定细菌菌种的分子检测技术，已被广泛应用于环境以及临床标本的研究，呼吸道微生物群系研究是一个相对较新的领域。16S rRNA基因是细菌
染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，该技术的基本原理是从微生物样本中获取16S rRNA的基因
片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信息，再与16S rRNA
数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中
位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。因此，相对于传统的细菌培养技术，16S rRNA序列分析能够准确鉴定出细菌的种属，并显示该种细菌在某部位的相对丰度。
[0003] 如何获得高
质量下呼吸道痰液标本，是检测呼吸道16S rRNA基因序列分析的前提。目前，国内还缺乏获取16S rRNA基因序列分析的有效痰液标本的收集方法。漱口后直接咳出痰液，放置于无菌培养瓶中，是目前临床留取痰液、进行细菌培养的常用收集方法，具有容易受到
口腔唾液及口腔细菌污染、标本量少及痰液鳞状上皮细胞较多等缺点。鉴于诱导痰16S rRNA基因序列分析技术的重要性，以及现有获取痰液的固有
缺陷，提供一种有效可靠的用于16SrRNA基因序列检测的痰液收集方法十分必要。
发明内容
[0004] 本发明提供受口腔污染小、简便的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法。
[0005] 本发明提供的技术方案为：一种用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤1：测
基础第一秒
用力肺活量FEV1；
[0007] 步骤2：吸入沙丁胺醇气雾剂；
[0008] 步骤3：擤鼻和0.9％灭菌生理盐
水漱口3次；
[0009] 步骤4：3％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，咳出第一口痰及唾液丢弃，再次以0.9％ 灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0010] 步骤:5：4％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0011] 步骤6：5％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0012] 步骤7：分离出步骤4～6所收集的深部痰的痰栓并低温保存。
[0013] 在此必须要说明的是：用力肺活量(forced vital capacity,FVC)过去称时间肺活量，是指尽力最大吸气后，尽力尽快呼气所能呼出的最大气量。略小于没有时间限制条件下测得的肺活量。该指标是指将测定肺活量的气体用最快速呼出的能力。其中，开始呼气第一秒内的呼出气量为
一秒钟用力呼气容积，又称第一秒用力肺活量(forced expiratory volume in one second,FEV1.0)，其临床应用较广，常以FEV1.0/FVC％表示。
[0014] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤2结束后，还包括：
[0015] 步骤8：15min后检测FEV1和用力肺活量FVC；
[0016] 若FEV1/FVC≧60％，则进行步骤3；
[0017] 若60％>FEV1/FVC≧50％，且FEV1≧1L，则进行步骤9；
[0018] 若FEV1/FVC﹤50％；或60％>FEV1/FVC≧50％，且FEV1<1L，则终止深部痰收集；
[0019] 所述的步骤9为：擤鼻和0.9％灭菌生理盐水漱口3次；0.9％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿。
[0020] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤9结束后，还包括：
[0021] 步骤10：判断步骤9所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0022] 若是，则终止深部痰收集，分离出步骤9所收集的深部痰的痰栓并低温保存；
[0023] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤1中所测得的FEV1,所述的步骤10中所测得的FEV1的降低范围；
[0024] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤3；
[0025] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤9；
[0026] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0027] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤4结束后，还包括：
[0028] 步骤11：判断步骤4所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0029] 若是，则进行步骤7；
[0030] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤8中所测得的FEV1,所述的步骤11中所测得的FEV1的降低范围；
[0031] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤5；
[0032] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤4；
[0033] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0034] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤5结束后，还包括：
[0035] 步骤12：所述的步骤5结束后，判断步骤5所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0036] 若是，则进行步骤7；
[0037] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤1中所测得的FEV1,所述的步骤12中所测得的FEV1的降低范围；
[0038] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤6；
[0039] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤5；
[0040] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0041] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤6结束后，还包括：
[0042] 步骤13：判断步骤6所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0043] 若是，则进行步骤7；
[0044] 若否，则终止深部痰收集。
[0045] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的步骤2中所述的沙丁胺醇气雾剂的用量为200ug。
[0046] 在上述的用于呼吸道细菌16S rRNA基因序列检测的痰液收集方法中，所述的预设值为不少于0.1g。
[0047] 与
现有技术相比，在步骤3、4、5、6以及步骤9中都采用生理灭菌盐水嗽口和擤鼻，降低口腔中的杂质对样品的影响，对于痰液标本鳞状上皮细胞和杂质明显减少、减少口腔杂菌污染、所测试的结果能够充分体现下呼吸道菌群。并且相比于传统的痰液收集方法，本方案采用阶梯浓度雾化盐水提高了实用安全性。
附图说明
[0048] 图1为
实施例中重症哮喘组痰液中细菌DNA
电泳结果；
[0049] 图2为实施例中轻症哮喘组痰液中细菌DNA电泳结果；
[0050] 图3为实施例中健康对照组痰液中细菌DNA电泳结果；
[0051] 图4为实施例中重症哮喘组、轻症哮喘组和健康对照组的痰液中细菌DNA测序结果。
具体实施方式
[0052] 下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0053] 实施例1
[0054] 1、病例收集
[0055] 研究对象共有37例，其中重症哮喘组14例，轻症哮喘组14例，健康对照组9例。重症哮喘的诊断必须符合ATS上的标准：反复存在的症状与急性发作，高剂量的吸入性类固醇不能缓解，需要经常口服
激素。主要排除标准是：①：4周内有感染存在，6周内口服使用过抗生素；②存在吸烟史；③合并存在有意义的肺部
疾病(存在但不限于慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核、囊性
纤维化等)。
[0057]
氯化钠(广州化学试剂厂)；生理盐水(东莞普济药业有限公司)；痰液基因组DNA提取
试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)；
超声雾化器(广州粤华医疗器械公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；
电子天平(德国Sartorius公司)；精密移液器(法国GILSON公司)；肺功能仪(德国Jaeger公司)；2.0
荧光计(美国Invitrogen公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
[0058] 3、深部痰收集和保存
[0059] 对上述37例研究对象按以下步骤进行深部痰收集。
[0060] 步骤1：测基础第一秒用力肺活量FEV1；
[0061] 步骤2：吸入沙丁胺醇气雾剂；
[0062] 在本实施例中，所述的步骤2结束后，还包括：
[0063] 步骤8：15min后检测FEV1和用力肺活量FVC，并判断FEV1/FVC的比值，会出现以下三种情况：
[0064] 情况1：若FEV1/FVC≧60％，则进行步骤3；
[0065] 情况2：若60％>FEV1/FVC≧50％，且FEV1≧1L，则进行步骤9；所述的步骤9为：擤鼻和0.9％灭菌生理盐水漱口3次；0.9％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以
0.9％灭菌生 理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿。
[0066] 步骤10：判断步骤9所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0067] 若是，则终止深部痰收集，分离出步骤9所收集的深部痰的痰栓并低温保存；
[0068] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤1中所测得的FEV1,所述的步骤10中所测得的FEV1的降低范围；
[0069] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤3；
[0070] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤9；
[0071] 若步骤10中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0072] 情况3：若FEV1/FVC＜50％；或60％>FEV1/FVC≧50％，且FEV1<1L，则终止深部痰收集；
[0073] 上述37例实验研究对象，根据上述三种情况分别进行测试，在测试过程中，没有出现终止深部痰收集的情况。
[0074] 步骤3：擤鼻和0.9％灭菌生理盐水漱口3次；
[0075] 步骤4：3％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，咳出第一口痰及唾液丢弃，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0076] 在本实施例中，所述的步骤4结束后，还包括：
[0077] 步骤11：判断步骤4所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0078] 若是，则进行步骤7；
[0079] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤8中所测得的FEV1,所述的步骤11中所测得的FEV1的降低范围；
[0080] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤5；
[0081] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤4；
[0082] 若步骤11中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0083] 步骤:5：4％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0084] 在本实施例中，所述的步骤5结束后，还包括：
[0085] 步骤12：所述的步骤5结束后，判断步骤5所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0086] 若是，则进行步骤7；
[0087] 若否，则再次检测FEV1，并判断相比于步骤1中所测得的FEV1,所述的步骤12中所测得的FEV1的降低范围；
[0088] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围低于10％，则进行步骤6；
[0089] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围介于10％～20％，则重复步骤5；
[0090] 若步骤12中测得的FEV1的降低范围高于20％，则终止深部痰收集。
[0091] 步骤6：5％灭菌盐水雾化诱导10min后停止雾化，再次以0.9％灭菌生理盐水漱口3次，屏住呼吸用力咳出深部痰收集于无菌培养皿；
[0092] 在本实施例中，所述的步骤6结束后，还包括：
[0093] 步骤13：判断步骤6所收集的深部痰的重量是否达到了预设值；
[0094] 若是，则进行步骤7；
[0095] 若否，则终止深部痰收集。
[0096] 步骤7：分离出步骤4～6所收集的深部痰的痰栓并低温保存。
[0097] 在本实施例中，所述的步骤7和步骤10中所述的分离深部痰的痰栓并低温保存的具体步骤为：于生物安全柜内用灭菌尖头
镊子挑取上述无菌培养皿痰液中的黏稠部分，并对痰栓部分在无菌培养皿内进行拖拽以减少唾液污染，最后取0.1-0.3g黏稠痰液，放入灭菌EP管后称重，立即置于-80℃保存，获得37份痰液标本。
[0098] 通过上述操作，收集到的37例研究对象的痰液重量数据如下：
[0099] 表一
[0100]
[0101] 4、痰液基因组DNA的提取：
[0102] 使用QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒按如下步骤提取痰液中细菌基因组DNA。①痰液标本中分别先后加入TE缓冲液及含溶菌酶的工作液；②37℃水浴60min；③分别先后加入蛋白酶K及AL缓冲液；④56℃水浴30min后95℃水浴5min；⑤加入浓度为99.9％的无水酒精后静置；⑥将混悬液转移到Qiagen分离管中；⑦离心，收集滤过的DNA；⑧加入
洗涤剂洗涤DNA；⑨溶解洗涤后的DNA；⑩-20℃保存。
[0103] 分析重症哮喘组、轻症哮喘组和健康对照组中痰液中细菌基因组DNA浓度以及其降解程度，获得的指标将用于评价通过该种诱导痰收集的标本在16S rRNA基因序列分析技术中的可靠性。
[0104] 如图1、图2和图3所示：重症哮喘组、轻症哮喘组和健康对照组中的诱导痰均能够成功提取细菌的基因组DNA，经过DNA浓度分析及琼脂糖电泳判定后质量均为A级，且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品。
[0105] 5、基因组DNA样品进行文库构建
[0106] 上述提取的基因组DNA样品进行文库构建：首先使用融合引物进行PCR扩增，然后使用
磁珠筛选片段，最后，用合格的文库进行EmPCR扩增和通过Roche 454FLX+平台对全部样品进行焦
磷酸测序。待数据下机后进行相应的生物信息分析。
[0107] 如图4所示：结果均表明重症哮喘组、轻症哮喘组和健康对照组的痰液的细菌的DNA均能成功测序，并得出相应的生物信息数据。
[0108] 在本实施例中，所有37例研究对象均成功采集到了有效的深部痰，通过本实施例的梯度浓度灭菌盐水诱导技术可以有效的降低研究对象
风险，对于重度哮喘研究对象，本实施例采用了极低浓度(0.9％)的灭菌盐水开始进行诱导，进一步确保了研究对象的安全性。
[0109] 所采集的37份样品完整，受唾液影响小，在
显微镜中仅存在极少的鳞状上皮细胞，并且测试成功率高，说明受口腔细菌污染小，本方案具有极强的可重复性。
[0110] 以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
