含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解剂的催化活性专利检索-局部缺血病理专利检索查询-专利查询网

含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解剂的催化活性

阅读：362发布：2020-05-11

专利汇可以提供含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解剂的催化活性专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及具有协同作用的低浓度氙气-氩气混合物氩气，其用于预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法中，其中氙气的体积比是在5％与20％之间；氩气的体积比是在5％与20％之间；并且所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分；所述方法包括包含恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后，将所述气体混合物给予患者。，下面是含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解剂的催化活性专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种包含氙气和氩气的气体混合物的医药组合物，其用于预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法中，其中
氙气的体积比在5％与20％之间，
氩气的体积比在5％与20％之间，并且
所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分，
所述方法进一步包括恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后将所述医药组合物给予患者。
2.根据权利要求1所述使用的医药组合物，其中所述局部缺血性损伤是大脑局部缺血、心脏局部缺血、肾脏局部缺血、视网膜局部缺血，或下肢局部缺血。
3.根据权利要求1或2所述使用的医药组合物，其中血液流动是自发地恢复，或在医学上通过诱导血栓溶解和/或通过血栓切除术来恢复。
4.根据权利要求3所述使用的医药组合物，其中通过给予具有血栓溶解特性的医药剂来诱导血栓溶解。
5.根据权利要求4所述使用的医药组合物，其中具有血栓溶解特性的所述医药剂是血栓溶解剂，例如链激酶、尿激酶、阿替普酶(人重组组织型纤维蛋白溶酶原活化因子或rtPA)、瑞替普酶或替奈普酶。
6.根据权利要求1所述使用的医药组合物，其中所述局部缺血性损伤是由减压事故引起，并且血液流动是通过再加压来恢复。
7.根据权利要求1至6中任一项所述使用的医药组合物，其中
氙气的体积比在10％与20％之间，并且
氩气的体积比在10％与20％之间。
8.根据权利要求1至7中任一项所述使用的医药组合物，其中所述氙气/氩气体积比是在4/1与1/4之间，优选1/1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述使用的医药组合物，其中氙气的体积比是15％，且氩气的体积比是15％。
10.根据权利要求1至9中任一项所述使用的医药组合物，其中所述气体补充部分包含氧气、氮气、氦气、氖气或其混合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述使用的医药组合物，其中所述气体补充部分包含体积比在20％与50％之间的氧气，并且其中所述气体补充部分中的其余气体是氮气、氦气、氢气、氖气或其混合物，优选氦气。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的医药组合物，其中所述医药组合物被预处理为压缩气体混合物。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的医药组合物，其中给予所述患者的所述医药组合物是通过在气体混合器中将氩气、氙气和所述气体补充部分混合来获得的。

说明书全文

含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制

血栓溶解剂的催化活性

技术领域

[0001] 本发明涉及器官保护(尤其是神经保护)领域；以及在局部缺血损伤的治疗和/或预防中用作器官保护剂(尤其是神经保护剂)的气体混合物。

背景技术

[0002] 局部缺血是血液供应受到了限制，这通常归因于血管中的因素，特别是血栓栓塞(血块)，局部缺血通过坏死和细胞凋亡机理导致组织功能异常和细胞死亡。局部缺血是供给器官的血液绝对或相对不足。相对不足意味着就在组织中递送充足的氧气(和葡萄糖)来说，血液供应与血液需求不匹配。组织损伤程度主要取决于局部缺血的水平和持续时间。心脏、肾脏和脑是对血液供应不足最敏感的器官。举例来说，局部缺血性中风(也称为脑中风或急性大脑局部缺血)和心肌梗塞(也称为心脏病发作或急性心脏局部缺血)与癌症一起成为人类死亡的主要病因。据估计，全球心血管死亡数将从一千七百万死亡数增加到2030年的超过二千三百万死亡数，并且在2020-2025年，大脑中风在疾病的全球影响中将占大于6％，其中近25％的男性和20％的女性在达到85岁之前将罹患脑中风。

[0003] 蛋白质水解是一般的催化生理过程，其能够定义为细胞酶(称为蛋白酶)对蛋白质的导向(定向)降解。纤维蛋白溶解是蛋白质水解的一种特定情形。纤维蛋白溶解是其中纤维蛋白凝块(凝血的产物)分解的生理过程。在血管损伤的情况下(例如产生血液(纤维蛋白)凝块)，内皮细胞释放丝氨酸蛋白酶，称为组织型纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)，其将前酶纤维蛋白溶酶原转化为切割纤维蛋白网的纤维蛋白溶酶(纤维蛋白的主要酶)。在健康个体中，这种过程使得过度的凝块形成和局部缺血事故得以避免。在罹患血栓栓塞和局部缺血的患者中，通过给予组织型纤维蛋白溶酶原活化因子的人重组形式(rtPA)能够刺激纤维蛋白溶解。通过药理学方式实现血块的这种分解称为血栓溶解。血栓溶解是治疗局部缺血损伤的主要治疗策略。然而，在某些条件下，血栓溶解疗法与出血性转化和神经元死亡增强的风险有关，原因是纤维蛋白的一般蛋白水解特性。为了避免纤维蛋白溶酶的此类有害副作用，rtPA须在适当周期(称为“治疗窗”)内给予患者，根据当前医疗实践和知识，所述治疗窗典型地是局部缺血发作之后的最多3到4.5小时。

[0004] 急性大脑局部缺血是因脑中的血流减少引起。这导致或多或少的脑功能障碍和损伤以及神经元死亡。脑损伤程度主要取决于局部缺血的水平和持续时间。涉及局部缺血诱发神经元死亡的生理过程是复杂的。简单地说，大脑血流的减少会减少组织能量储存并且导致氧气和葡萄糖的不足。在细胞水平下，这种代谢剥夺的重要结果是细胞内钠浓度的增加。这引起多种神经传递素(其一是谷氨酸)的流出扩大和吸收失败[14]。谷氨酸的过度释放使N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度活化。这导致NMDA受体介导的神经元去极化和神经元内钙流入逾越生理学边界且通过坏死和细胞凋亡机理导致神经元死亡[15、16]。因此，已经寻求到治疗局部缺血性中风的两种策略：通过早期再灌注来限制血管损伤，和/或阻断谷氨酸发起的神经毒性级联。

[0005] 当今，通过rtPA诱导的血栓溶解实现早期再灌注是食品和药物管理局(Food and Drug Administration)以及欧洲医疗机构(European Medical Agencies)批准的针对中风的唯一药学疗法。然而，如上所述，血栓溶解疗法尽管存在有益的作用，但与出血性转化和神经元死亡增强的风险相关[17、18]。

[0006] 专利US 8,435,569由此提出一种治疗和/或预防局部缺血性损伤的方法，所述方法是血栓溶解与神经保护性气体(例如一氧化二氮、氙气、氩气、氦气、氖气和其混合物)的组合。具体地说，专利US 8,435,569公开了至少一种血栓溶解剂(A)(例如rtPA)和至少一种气体(B)用于制备供治疗局部缺血用的组合医药组合物的用途，所述至少一种气体选自由以下组成的组：一氧化二氮、氩气、氙气、氦气、氖气和其混合物。更具体地说，由于一氧化二氮、氩气、氙气、氦气、氖气和其混合物与rtPA相互作用，因此专利US 8,435,569公开了为了不阻断或减少血栓溶解剂(A)的有益血栓溶解作用，应当如何在血栓溶解剂(A)之前、连同血栓溶解剂(A)一起或在血栓溶解剂(A)之后给予这些神经保护性气体。然而，专利US 8,435,569未公开具有成本效益、治疗效率高并且与血栓溶解剂(A)(例如rtPA)不发生相互作用的任何气体或气体混合物。

[0007] 对低氧性局部缺血脑损伤的早先研究已经证明在化学上和代谢上呈惰性的气体氙气和氩气具有神经保护潜力并且缺乏毒性效应[1-7]。

[0008] 在惰性和稀有气体和其他分子当中，浓度高于35-50vol％的氙气因其具有较强的器官保护和神经保护作用而被认为是黄金标准。遗憾的是，氙气也是tPA和rtPA的强抑制剂，由于存在阻断tPA和rtPA的有益血栓溶解效应的风险，因此这种情况妨碍其在rtPA之前使用或连同rtPA一起使用[10]。另外，过多的生产成本进一步限制了其广泛的临床用途。

[0009] 相比之下，氩气是一种有成本效益的气体，其在50vol％和更高的有效神经保护浓度下使用时，对tPA和rtPA的有益血栓溶解特性不展示抑制作用[11]。遗憾的是，氩气在急性局部缺血性中风模型中提供的神经保护作用远不如氙气强[3、6]。

[0010] 因此，迄今仍需要一种有成本效益的、具有器官保护作用(尤其是神经保护作用)的药剂，其尤其可以在血栓溶解剂给予之前、连同血栓溶解剂一起给予或在血栓溶解剂给予之后使用，以任何给予次序均有利。

发明内容

[0011] 本发明人惊人地发现，含有低浓度氙气和氩气的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解，从而允许这些气体混合物在血栓溶解剂给予之前、连同血栓溶解剂一起给予或在血栓溶解剂的给予之后使用。不希望受理论束缚，假设氙气和氩气在低浓度下的协同性神经保护作用起因于其互补的作用模式：虽然氙气被认为是主要通过针对谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)[8](这是脑中的主要激动性受体)的拮抗作用提供神经保护作用，但相信氩气主要通过增强A型γ-氨基丁酸(GABA-A)[9]受体(这是脑中的主要抑制受体)来发挥作用。

[0012] 本发明人确实使用试管内、体外和体内制剂研究含有15(Xe-Ar-15)、25(Xe-Ar-25)和37.5vol％(Xe-Ar-37.5)等摩尔浓度的氙气(Xe)和氩气(Ar)的气体混合物对脑切片中因氧气和葡萄糖剥夺而诱发的细胞损伤、经历脑内注射NMDA的大鼠的脑损伤和rtPA的催化效率(rtPA发挥作用和血栓溶解所依据的基本机理)的影响。具体地说，他们发现，在提供神经保护作用方面，Xe-Ar-15>Xe-Ar-25>Xe-Ar-37.5，而在减少rtPA催化活性方面，Xe-Ar-
15

[0013] 因此，在第一方面中，本发明涉及一种包含氙气和氩气的气体混合物的医药组合物，其用于预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法中，其中

[0014] -氙气的体积比在5％与20％之间，

[0015] -氩气的体积比在5％与20％之间，并且

[0016] -所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分，

[0017] -所述方法进一步包括(自发或医疗)恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后将所述医药组合物给予患者。

[0018] 在第二方面中，本发明涉及包含氙气和氩气的气体混合物的医药组合物用于制造供预防和/或治疗局部缺血性损伤用的药剂的用途，其中

[0019] -氙气的体积比在5％与20％之间，

[0020] -氩气的体积比在5％与20％之间，并且

[0021] -所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分，

[0022] 其中所述方法进一步包括(自发或医疗)恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后将所述医药组合物给予患者。在第三方面中，本发明涉及一种预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法，所述方法包含将有效剂量的包含氙气和氩气气体混合物的医药组合物给予有需要的患者，其中

[0023] -氙气的体积比在5％与20％之间，

[0024] -氩气的体积比在5％与20％之间，并且

[0025] -所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分，

[0026] 其中所述方法进一步包括(自发或医疗)恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后将所述医药组合物给予患者。

[0027] 在本发明中，“患者”具体地说是动物，例如哺乳动物，优选人。本发明因此应用于人和兽医学药品。

[0028] 在预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法中，氙气和氩气的气体混合物用作器官保护剂，尤其是神经保护剂，意味着其提供器官保护作用，更尤其是神经保护作用。

[0029] 在本发明中，“器官保护作用”理解为因初次或二次直接或间接损伤而变得功能异常的器官在细胞结构和功能上得到相对的保持。提供器官保护作用因此旨在通过停止或至少减缓器官细胞死亡来治疗和/或减缓和/或预防疾病进展。在本发明中，“神经保护作用”是器官保护作用的一种特定类型，其理解为神经元结构和/或功能得到相对的保持。提供神经保护作用因此旨在通过停止或至少减缓神经元死亡(或神经元损耗)来治疗和/或减缓和/或预防疾病进展和二次损伤。

[0030] 如本文所用，“医疗”恢复血液流动意思指通过人为干预而非自然地恢复血液流动。相比之下，自发恢复血液流动是在任何人为干预不存在的情况下，具体地说，在不给予任何药学(血栓溶解)药剂的情况下，自然地发生。

[0031] 如本文所用，气体的“体积比”(vol％)是基于气态组合物总体积计算的百分比。适当时，体积比是基于减压的、重配的气态组合物总体积。在下文中，“气体浓度”理解为所述气体的体积比。

具体实施方式

[0032] 本发明涉及一种包含氙气和氩气的气体混合物的医药组合物，其用于预防和/或治疗局部缺血性损伤的方法中，其中

[0033] -氙气的体积比在5％与20％之间，

[0034] -氩气的体积比在5％与20％之间，并且

[0035] -所述医药组合物进一步包含补足到100％体积比的气体补充部分，

[0036] -所述方法进一步包含恢复血液流动以及在血液流动恢复之前、期间或之后将医药组合物给予患者。有利的是，氙气/氩气体积比在4/1与1/4之间，优选在3/1与1/3之间，更优选在2/1与1/2之间，其最优选1/1(即，等摩尔浓度的混合物)。

[0037] 在一个具体实施例中，医药组合物包含氙气和氩气的气体混合物，其中：

[0038] -氙气的体积比在10％与20％之间，并且

[0039] -氩气的体积比在10％与20％之间。在这个实施例中，气体混合物具有等摩尔浓度有利。

[0040] 在一个具体实例中，氙气的体积比是15％，并且氩气的体积比是15％。

[0041] 本发明的医药组合物旨在用于任何适当的给药途径，优选通过吸入给予。本发明的协同组合物因此优选可吸入的协同组合物。其因此包含气体补充部分。典型地，气体补充部分包含氧气、氮气、氦气、氢气、氖气或其混合物。当然，仅考虑稳定的非爆炸性气体混合物。具体地说，在本发明中，当气体补充部分包含氢气和氧气时，这些气体处于稳定的非爆炸比例。

[0042] 优选地，气体补充部分包含氧气，其体积比典型地在20％与50％之间(例如在25％与45％之间或在30％与40％之间，例如氧气的体积比是20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％)，并且气体补充部分中的其余气体有利地是氮气、氦气、氢气、氖气或其混合物，优选的是，气体补充部分中的其余气体有利地是氮气、氦气、氖气或其混合物，甚至更优选地，其是氦气。最优选的是，气体补充部分包含体积比典型地在20％与50％之间的氧气，并且气体补充部分中的其余气体是氦气。

[0043] 在第一实施例中，医药组合物被预处理为压缩气体混合物，并且作为减压的气体混合物给予患者。

[0044] 在第二实施例中，给予患者的医药组合物是通过在气体混合器中混合氩气、氙气和气体补充部分来获得(并且作为减压的气体混合物给予患者)。在这个第二实施例中，氩气、氙气和气体补充部分在个别加压室中被预处理为压缩气体，并且在混合之前或之后减压。值得注意的是，气体补充部分本身可以是气体混合物(典型地包含氧气)，其还可以通过在气体混合器中混合不同气体来获得。因此，在这个第二实施例中，氩气、氙气、氧气和任选存在的其它个别化气体罐连接到气体混合器，它们在一经减压或减压之后，在气体混合器中以期望的体积比混合。每种气体优选地在引入气体混合器之前减压。

[0045] 典型地，局部缺血性损伤是大脑局部缺血、心脏局部缺血、肾脏局部缺血、视网膜局部缺血，或下肢局部缺血。其还可能由减压事故引起(又称为减压病或减压症)。

[0046] 包含氙气和氩气的协同性混合物的本发明组合物的“有效剂量”随多种参数而变，例如待治疗的个体或患者的给药途径和体重、年龄、性别、待治疗的病变的进展，以及敏感性。

[0047] 血液流动可以通过不同方法恢复，所述不同方法是由医师根据局部缺血性损伤的病因来选择，并且也可以依据多种参数，例如待治疗的个体或患者的体重、年龄、性别、待治疗的病变的进展，以及敏感性。

[0048] 在一个具体实施例中，本发明的协同性氙气-氩气气态组合物是在血液流动恢复之前给予，尤其在通过诱导血栓溶解来恢复血液流动时给予。

[0049] 在一个具体实施例中，本发明的协同性氙气-氩气气态组合物是在血液流动恢复之后给予。

[0050] 在一个具体实施例中，本发明的协同性氙气-氩气气态组合物是在血液流动恢复期间给予，尤其在通过诱导血栓溶解来恢复血液流动时给予。

[0051] 血液流动可以自发地或以医疗方法恢复。

[0052] 典型地，在医疗恢复血液流动的情况下，通过血栓溶解和/或通过血栓切除术来恢复血液流动。

[0053] 可以通过给予具有血栓溶解特性的一种或超过一种医药剂(例如血栓溶解剂，例如链激酶、尿激酶、阿替普酶(alteplase)(人重组组织型纤维蛋白溶酶原活化因子或rtPA)、瑞替普酶(reteplase)或替奈普酶(tenecteplase))来诱导血栓溶解。如本文所用，术语“具有血栓溶解特性的医药剂”理解为最初作为血栓溶解剂开发的医药化合物，或即使最初针对其它医疗用途开发但也展示血栓溶解特性的药物，例如N-乙酰基半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸。优选的血栓溶解剂是rtPA。

[0054] 血栓切除术是一种能够去除血液凝块的众所周知的手术程序。

[0055] 在一个有利实施例中，血液流动是通过血栓切除术来恢复，优选伴随血栓溶解。在血栓溶解与血栓切除术均执行的情况下，给予患者具有血栓溶解特性的医药剂，例如血栓溶解剂，例如链激酶、尿激酶、阿替普酶(人重组组织型纤维蛋白溶酶原活化因子或rtPA)，瑞替普酶或替奈普酶(优选rtPA)。血栓切除术典型地在给予患者血栓溶解剂之前或之后执行，优选在其之后。

[0056] 在某些情况下，局部缺血性损伤是由减压事故引起。在这种情况下，有利地通过血栓溶解和/或通过血栓切除术和/或再加压来恢复血液流动。在这种情况下，血液流动恢复优选地包含再加压或由再加压组成。

[0057] 在本发明的一个具体实施例中(无论涉及何种局部缺血性损伤)，血液流动恢复不包含给予具有血栓溶解特性的医药剂，例如血栓溶解剂。附图说明

[0058] 图1.含有15vol％至37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物对通过氧气-葡萄糖剥夺(OGD)所诱导的乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响，所述乳酸脱氢酶释放以OGD前的数值百分比表示。Xe-Ar-15：具有15vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-25：具有25vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-37.5：具有37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物。Xe-Ar-15近似地以类似于50vol％氙气的方式减少OGD诱导的LDH释放。显著性差异用*和#标示。*P<0.0001，相对于OGD切片；#P<0.0001，相对于15vol％或25vol％的单独氙气或氩气。

[0059] 图2.含有15vol％至37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物对通过脑内注射N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)所诱导的脑损伤(用mm3表示)的影响。Xe-Ar-15：具有15vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-25：具有25vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-37.5：具有37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物。Xe-Ar-15近似地以类似于50vol％氙气的方式减少NMDA诱导的脑损伤。显著性差异用*、#或+符号标示。*P<0.0001，相对于OGD切片；#P<0.002，相对于15vol％氙气；++P<0.02，+
相对于15vol％氩气；P<0.05，相对于25vol％氩气。

[0060] 图3.含有15vol％至37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物对组织纤维蛋白溶酶原活化因子催化效率(以空气对照值的百分比表示)的影响。Xe-Ar-15：具有15vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-25：具有25vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物；Xe-Ar-37.5：具有37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物。不同于Xe-Ar-25和Xe-Ar-37.5，Xe-Ar-15不降低rtPA的催化效率。显著性差异用*、#或+符号标示。*P<0.0001，相对于OGD切片；++P<0.0001，相对于25vol％氙气；+P<0.002，相对于
25vol％氙气。*P<0.0001，相对于37.5vol％氙气和37.5vol％氩气。

[0061] 实例

[0062] 通过以下实例说明本发明，所述实例不应理解为以任何方式限制本发明。

[0063] 材料和方法

[0064] 动物

[0065] 所有动物使用程序都根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)执行且属于法国关于生物医学实验使用动物的法规的框架内。使用体重250-280g的成年雄性史泊格-多利大鼠(法国Janvier,Le Genest Saint-lsle)。使用前，在Perspex家用笼中、在21±0.5℃下圈养大鼠，让其自由取食和取水。按照光亮/黑暗交替循环来维持光亮，其中8:00PM至8:00AM为光亮。

[0066] 脑切片的制备和培育

[0067] 通过在氟烷麻醉下摘头来杀死大鼠。去除脑且放入冰冷的人工新制脑脊髓液(aCSF)中。使用组织切片机(Mickie实验室工程公司，英国贡萨尔，萨里(Gomshall,Surrey,UK))切割包括纹状体(前端：距前囟+1.2至+2mm)的冠状面脑切片(400μm厚度)。

[0068] 使用乳酸脱氢酶活性分析量测细胞损伤

[0069] 如此前所述，评估含有氙气和氩气的气体混合物对OGD所诱导的乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响[6]。使用前，将脑切片转移到含有1.3ml新制氧化aCSF的个别瓶中，所述氧化aCSF含有120mMNaCl、2mMKCl、2mM CaCl2、26mM NaHCO3、1.19mM MgSO4、1.18mM KH2PO4、11mM d-葡萄糖和30mM HEPES；并且在室温下回收45分钟。然后，将脑切片在36±0.5℃下放入含有1.3ml新制aCSF的个别瓶中，用100％氧气饱和且连续鼓泡(每个小瓶25ml/min)。30分钟时间段之后，用维持在36℃的氧化aCSF更新aCSF培育溶液，并且然后培育切片1小时以允许记录LDH的基本水平。对照切片在相同条件下再培育20分钟时间段，而对应于局部缺血组的切片则在不含葡萄糖的溶液中培育，用100％氮气饱和且连续鼓泡(OGD切片)。OGD在此20分钟时间段之后，为了模拟再灌注和处理，所有组的培养基都用新制aCSF溶液置换，用医疗空气或含有如下文所述体积比的氙气和氩气的气体混合物饱和且连续鼓泡(参见气体药理学章节；n＝20-36)。

[0070] NMDA诱导的体内神经元死亡

[0071] 如此前所述，评估含有氙气和氩气的气体混合物对tPA催化活性的影响[6]。手术当天，大鼠在麻醉箱中单独用含1.5％氟烷的氧气麻醉，并且固定在立体定向设备上，其中切齿棒设置在低于水平零位的3.9mm处。钻取颅钻孔且将微量移液管(管尖处小于10μm)降入右纹状体(前端，0.6mm；外侧，3.0mm；腹侧，5.8mm，相对于前囟)中，历时2分钟注射含有70nmol NMDA的1μl 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)。再过5分钟时间段之后，移出微量移液管，然后缝合伤口。手术期间，利用反馈控制的恒温加热垫(哈佛设备有限公司(Harvard Apparatus Limited),英国伊甸桥(Edenbridge,UK))使体温保持37±0.5℃。约10分钟之后，动物在其家用笼中醒来，让其自由取食和取水。NMDA给予之后的第六十分钟，用医疗空气或含有氙气和氩气的气体混合物治疗大鼠(参见气体药理学章节)。每组大鼠数目是n＝
7-11。

[0072] 试管内tPA催化活性分析

[0073] 如此前所述，评估含有氙气和氩气的气体混合物对tPA催化活性的影响[6]。人tPA的重组形式( 德国BoehringerIngelheim,Ingelheim am Rhein)和其特异性发色底物甲基磺酰基-D-苯基-甘氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素乙酸酯(XF，产品444；American Diagnostica,康涅狄格州斯坦福德市(Stamford,CT))分别在1.5ml无菌管中的1ml蒸馏水中稀释。如下文所述，使用医疗空气(对照)或含有氙气和氩气的气体混合物，在60-80ml/min的流量下，使含有0.4μM tPA或10μM tPA底物的每个管饱和20分钟(每种浓度n＝9-14)。通过在光谱荧光计微板读数仪装置中在37℃下培育50μl tPA与50μl底物、利用初始速率方法来评估tPA的催化效率。

[0074] 气体药理学

[0075] 氙气、氩气、氮气和氧气购自Air LiquideSante(法国巴黎)。使用计算机驱动的气体质量流量计获得医疗空气，和氙气与氩气混合物，所述医疗空气由75vol％氮气和25vol％氧气构成，并且所述氙气与氩气混合物含有37.5vol％氙气和37.5vol％氩气(Xe-Ar-37.5)、25vol％氙气和25vol％氩气(Xe-Ar-25)，或15vol％氙气和15vol％氩气(Xe-Ar-
15)，且需要时含有25vol％氧气和作为其余部分的氮气；并且用氧气分析仪检查所用气体混合物不缺氧。

[0076] 统计分析

[0077] 数据作为平均值±平均值的标准误差给出。利用Statview 软件(SAS研究所，北卡罗来纳州卡里市(Cary,NC))分析含有氙气和氩气的气体混合物的影响且利用非参数曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U-test)与对照实验和单独的氙气和氩气进行比较。

[0078] 结果

[0079] 首先研究含有15％至37.5％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物对暴露于OGD的脑切片(脑局部缺血模型)和给予NMDA脑内注射的大鼠的神经保护作用。

[0080] 相较于对照切片，OGD诱导LDH释放增加(P<0.0001)。如图1中所示，我们发现在暴露于OGD的脑切片中，在减少LDH(细胞损伤标记物)释放方面，Xe-Ar-15>Xe-Ar-25>Xe-Ar-37.5。Xe-Ar-15以类似于50％氙气的方式减少LDH(P<0.0001，相对于空气处理的OGD切片)。
这导致15vol％的Xe-Ar-15和氙气之间存在显著差异(P<0.0001)，15vol％的氙气本身对OGD诱导的LDH释放没有影响；并且导致15vol％的Xe-Ar-15与氩气之间存在显著差异(P<
0.0001)，15vol％的氩气本身对OGD诱导的LDH释放也没有影响。Xe-Ar-25减少OGD诱导的LDH释放(P<0.0001)，其幅度类似于25-37.5vol％的单独氙气。这导致25vol％的Xe-Ar-25与氩气之间存在显著差异(P<0.0001)，25vol％氩气自身对OGD诱导的LDH释放没有影响，但对于25vol％的氙气而言则不存在显著差异，借此表明Xe-Ar-25的神经保护作用主要是因为气体混合物中存在氙气。与Xe-Ar-15和Xe-Ar-25相比，我们发现Xe-Ar-37.5未能减少OGD切片中的LDH释放。

[0081] 或者，相较于注射生理盐水的空气处理对照组，经空气处理的大鼠脑内注射NMDA诱导脑损伤(P<0.0001)。如图2所示，发现在减少注射NMDA的大鼠的脑损伤方面，Xe-Ar-15>Xe-Ar-25>Xe-Ar-37.5。Xe-Ar-15近似地以类似于50vol％单独氙气的方式减少NMDA诱导的脑损伤(P<0.001)。这导致15vol％的Xe-Ar-15与氙气之间存在显著差异(P<0.002)，15vol％氙气本身对NMDA诱导的脑损伤不起作用；并且导致15vol％的Xe-Ar-15与氩气之间存在显著差异，15vol％氩气本身对NMDA诱导的脑损伤也不起作用。同样，Xe-Ar-25减少NMDA诱导的脑损伤(P<0.02)，其幅度类似于25-37.5vol％的单独氙气。这导致25vol％的Xe-Ar-25与氩气之间存在显著差异(P<0.05)，25vol％氩气本身对NMDA诱导的脑损伤不起作用，但对于25vol％的氙气而言则不存在显著差异，借此表明Xe-Ar-25的神经保护作用主要是因为气体混合物中存在氙气。与Xe-Ar-15和Xe-Ar-25相比，Xe-Ar-37.5对脑内注射NMDA的大鼠未能展示神经保护作用。

[0082] 接下来，由于此前数据已经证明氙气和氩气均与tPA发生相互作用[10、11]，因此研究含有15vol％至37.5vol％等摩尔浓度的氙气和氩气的气体混合物对tPA催化活性的影响。如图3中所示，发现在降低tPA催化效率方面，Xe-Ar-37.5>Xe-Ar-25>Xe-Ar-15。Xe-Ar-37.5降低tPA催化效率(P<0.0001)，其程度类似于75vol％的单独氙气。这导致37.5vol％的Xe-Ar-37.5与氙气之间(P<0.0001)和37.5vol％的Xe-Ar-37.5与氩气之间(P<0.0001)存在显著差异。同样，Xe-Ar-25也降低tPA催化效率(P<0.0001)，其程度类似于50vol％的单独氙气。这导致25vol％的Xe-Ar-25与氙气之间(P<0.0001)和25vol％的Xe-Ar-25与氩气之间(P<0.002)存在显著差异。虽然25vol％的单独氙气对tPA催化效率没有影响，但25vol％氩气使其显著降低，借此表明减少Xe-Ar-25对tPA催化效率的影响主要来自25vol％氩气的影响。相比之下，我们发现Xe-Ar-15对tPA的催化效率没有影响。

[0083] 讨论

[0084] 在本研究中，已经表明含有15vol％(Xe-Ar-15)或25vol％(Xe-Ar-25)低浓度氙气和氩气的各种气体的气体混合物能够提供神经保护作用。具体地说，发现含有Xe-Ar-15的气体混合物减少OGD诱导的细胞损伤和NMDA诱导的脑损伤，其程度类似于50vol％的单独氙气，借此表明Xe-Ar-15具有强效神经保护作用。Xe-Ar-15的这些强效神经保护作用，以及15vol％的单独氙气和15vol％的单独氩气(数据未示出)皆不具有神经保护特性的事实，相信是归因于氙气对NMDA受体[8](脑中的主要激动受体)的抑制作用与氩气对GABA-A受体[9](脑中的主要抑制受体)的活化作用之间的协同效应。由于在提供神经保护作用方面，Xe-Ar-15与50vol％的单独氙气同样的强，并且比任何浓度的单独氩气强许多，因此Xe-Ar-
15发挥作用所依据的机理可能主要是通过NMDA受体介导，所述NMDA受体是氙气的主要神经元目标[10]。与Xe-Ar-15的强效神经保护作用相比，发现Xe-Ar-37.5未能提供神经保护作用。Xe-Ar-37.5的这种作用的缺乏的似乎更合理原因是神经元活性的一般减少太强，这可能相当于体内坏死或麻醉。支持此的是神经保护作为随着所用Xe-Ar浓度减少的事实(Xe-Ar-15>Xe-Ar-25>Xe-Ar-37.5)。进一步支持此的是此前数据，其已经表明氙气在37.5vol％或50vol％的亚麻醉浓度下提供神经保护作用，但在75vol％或更高的高麻醉浓度下则不能提供神经保护作用[5、6]。

[0085] 或者，进一步表明含有Xe-Ar-37.5和Xe-Ar-25而非Xe-Ar-15的气体混合物降低tPA催化效率，其程度类似于75vol％和50vol％高浓度的氙气，借此表明在tPA水平下，氙气与氩气之间存在另一种协同机理[10、11]。有趣的是，结构生物物理学研究已经表明，氙气与氩气均结合至弹性蛋白酶(一种用作tPA模型的丝氨酸蛋白酶)的活性位点[12]。相信这可以解释Xe-Ar-25与Xe-Ar-37.5在抑制tPA诱导催化活性方面的协同效应，所述协同效应主要可以通过氙气介导，因为单独氩气对tPA诱导的催化活性没有影响且以低于氙气的亲和力进一步结合至弹性蛋白酶[12]。

[0086] 大鼠血栓栓塞中风模型的此前数据已经表明局部缺血期间氙气以剂量依赖性方式抑制tPA诱导的血栓溶解且随后抑制局部缺血脑损伤的减轻[10]，借此得到结论：氙气应当仅在tPA诱导的血栓溶解之后，而非在tPA诱导的血栓溶解之前或在tPA诱导的血栓溶解同时给予。为了不利于再阻塞(已显示在10％至15％局部缺血性中风患者在tPA诱导的再灌注[13]之后2-3小时发生的现象)，进一步提出可能需要根据针对患者的收益-风险医疗评估延迟氙气的使用。虽然此类延迟不应显著妨碍氙气的神经保护潜在作用(已表明存在约8小时的可能治疗窗[6])，但一般共识在于时间是治疗局部缺血性中风的关键。因此，由于如本研究中所示，Xe-Ar-15不与tPA发生相互作用且在提供神经保护作用方面与50vol％氙气同样的强，因此Xe-Ar-15有望替代单独氙气成为治疗急性局部缺血性中风的有成本效益的神经保护策略。

[0087] 参考文献

[0088] 1.Ryang YM,Fahlenkamp AV,Rossaint R,Loetscher PD,Beyer C等人，氩气在大鼠体内暂时大脑中动脉阻塞模型中的神经保护作用(Neuroprotective effect of argon in an in vivo model of transient middle cerebral artery occlusion in rats)，《重症监护医学(Crit Care Med)》2011；39:1448-1453.

[0089] 2.Jawad N,Rizvi M,Gu J,Adeyi O,Tao G,Maze M,Ma D.在试管内神经元损伤模型中由一系列稀有气体提供的神经保护作用(和神经保护作用的缺乏)，《神经科学通讯(NeurosciLett)》2009；460:232-236.

[0090] 3.David HN,Haelewyn B,Degoulet M,Colomb DG Jr,Risso JJ,Abraini JH.兴奋毒性或局部缺血性损伤之后给药时由氩气诱导的体外和体内神经保护作用(Ex vivo and in vivo neuroprotection induced by argon when given after an excitotoxic or ischemic insult)，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》2012；7:e30934.[0091] 4.Homi HM,Yokoo D,Ma D,Warner DS,Franks NP,Maze M,Grocott HP.在小鼠暂时大脑中动脉阻塞期间给予氙气的神经保护作用(The neuroprotective effect of xenon administration during transient middle cerebral artery occlusion in mice)，《麻醉学(Anesthesiology)》2003；99:876-881.

[0092] 5.David HN,Leveille F,Chalzaviel L,MacKenzie ET,Buisson A,Lemaire M,Abraini JH.一氧化二氮和氙气减少局部缺血性脑损伤(Reduction of ischemic brain damage by nitrous oxide and xenon.)，《大脑血流与代谢杂志(J Cereb Blood Flow Metab)》2003；23:1168-1173.

[0093] 6.David HN,Haelewyn B,Rouillon C,Lecocq M,Chazalviel L,Apiou G,Risso JJ,Lemaire M,Abraini JH.氙气的神经保护作用：经历暂时大脑局部缺血的大鼠的机会治疗窗(Neuroprotective effects of xenon:a therapeutic window of opportunity in rats subjected to transient cerebral ischemia)，《美国实验生物科学家联合会杂志(FASEB J)》2008；22:1275-1286.

[0094] 7.Dingley J,Tooley J,Porter H,Thoresen M.氙气在缺氧-局部缺血之后给予时向新生儿大鼠提供短期的神经保护作用(Xenon provides short-term neuroprotection in neonatal rats when administered after hypoxia-ischemia)，《中风(Stroke)》2006；37,501-506

[0095] 8.Franks NP,Dickinson R,de Sousa SLM,Hall AC,Lieb WR.氙气如何产生麻醉？(How does xenon produce anesthesia？)，《自然(Nature)》1998；396:324[0096] 9.Abraini JH,Kriem B,Balon N,Rostain JC,Risso JJ.对氮气、氩气和一氧化二氮所产生的坏死的GABA神经医药学研究(GABA neuropharmacologicalinvestigations of narcosis produced by nitrogen,argon,and nitrous oxide)，《麻醉与镇痛(AnesthAnalg)》2003,96:746-749.

[0097] 10.David HN,Haelewyn B,Colloc'h N,Risso JJ,Abraini JH.氙气是组织纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂：在大鼠血栓栓塞性中风模型中的有害和有益作用(Xenon is an inhibitor of tissue-plasminogen activator:adverse and beneficial effects in a rat model of thrombo-embolic stroke)，《大脑血流与代谢杂志(J Cereb Blood Flow Metab)》2010 30:718-728.

[0098] 11.David HN,Haelewyn B,Risso JJ,Abraini JH.稀有气体氩气对组织纤维蛋白溶酶原活化因子的催化和血栓溶解效率的调节(Modulation by the noble gas argon of the catalytic and thrombolytic efficiency of tissue plasminogen activator)，《劳宁施密德伯格药理学档案(NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol)》2013；386:91-95.[0099] 12.Colloc'h N,Marassio G,PrangéT.通过晶体学针对三种酶研究的蛋白质-稀有气体相互作用-牵涉麻醉和神经保护机理(Protein-Noble Gas Interactions Investigated by Crystallography on Three Enzymes-Implication on Anesthesia and Neuroprotection Mechanisms)《，X射线晶体学的当前趋向(Current Trends in X-Ray Crystallography)》，AnnamalaiChandrasekaran博士(编)，ISBN:978-953-307-754-3,InTech.获得于：http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/25143.pdf

[0100] 13.Rubiera M,Alvarez-Sabin J,Ribo M,Montaner J,Santamarina E,Arenillas JF,Huertas R,Delgado P,Purroy F,Molina CA.组织纤维蛋白溶酶原活化因子诱导急性局部缺血性中风再通畅之后的早期动脉再阻塞的预测因子(Predictors of early arterial reocclusion after tissue plasminogen activator-induced recanalization in acute ischemic stroke)，《中风(Stroke)》2005；36:1452-1456.[0101] 14.Dirnagl等人，局部缺血性中风病理学：综合观(Pathobiology of ischaemic stroke:an integrated view)，《Trends Neurosci.(神经科学趋向)》22:391-7,1999.[0102] 15.Choi等人，皮层细胞培养时的谷氨酸神经毒性药理学：NMDA拮抗剂达成的减毒(Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture:attenuation by NMDAantagonists)，《神经科学杂志(J Neurosci.)》1988年1月；8(1):185-96.[0103] 16.Sattler等人，不同的流入途径而非钙负荷决定了神经元容易产生钙神经毒性(Distinct Influx Pathways,Not Calcium Load,Determine Neuronal Vulnerability to Calcium Neurotoxicity)，《神经化学杂志(J.Neurochem.)》71:(6),2349-2364.12 1998

[0104] 17.Tsirka等人，兴奋毒素诱导的神经元变性和癫痫是由组织纤维蛋白溶酶原活化因子介导(Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator)，《自然(Nature)》377:340-344,1995；

[0105] 18.Wang等人，在野生型和tPA缺乏小鼠发生病灶性大脑局部缺血之后，组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)增加神经元损伤(Tissue plasminogen activator(tPA)increase neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice)，《自然·医学(Nature Med.)》4:228-231,1998。

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