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一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和应用

阅读：231发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和应用。具体的步骤包括：物料预处理、真空冷冻联合真空微波干燥、物料粉碎以及响应面法提取冰菜D-松醇。该方法通过真空冷冻联合真空微波干燥技术对冰菜进行干燥处理，进而利用响应面法提取冰菜D-松醇，同时以水作为提取溶剂，操作简单，价格低廉，提取率高且能最大限度地保留冰菜中的活性成分。通过上述方法制备的冰菜D-松醇提取物能显著降低糖尿病大鼠餐后血糖，空腹血糖，改善糖耐量，修复受损的胰岛β细胞，具有改善糖尿病综合症的作用。，下面是一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、物料预处理：取冰菜进行清洗，并切成片段；
B、真空冷冻联合真空微波干燥：将步骤A得到的冰菜片段进行冷冻过夜；冷冻后的冰菜移入真空冷冻干燥室进行连续干燥；然后将冷冻干燥后的冰菜转入微波真空干燥机内再次干燥；
C、物料粉碎：将步骤B中干燥后的冰菜粗品进行粉碎，并过50-200目筛得到冰菜干粉，然后于常温环境下保存，用于下一步提取；
D、响应面法提取冰菜D-松醇：将步骤C中的冰菜干粉加入纯水中进行提取，采用响应面法设定提取的变量参数，提取结束后，真空抽滤，得到含有D-松醇成分的提取液。
2.根据权利要求1所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，真空冷冻干燥室的腔内压强为3～4Pa，冷阱温度为-48～-56℃，加热板温度为25℃，连续干燥为8～16小时。
3.根据权利要求2所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，在真空冷冻干燥室内连续干燥10～12小时。
4.根据权利要求1所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，微波强度为6-10W/g，保持8～15min。
5.根据权利要求4所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，在步骤B中，微波强度为8W/g，保持9～10min。
6.根据权利要求1所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程：
Y＝12.19-X1+1.12X2-1.10X3-0.12X1 X2+0.53X1 X3-0.19X2 X3-1.05X12-0.52X22-
0.77X32，
式中：响应值Y为D-松醇提取率，设定的变量参数X1为提取温度，X2为提取时间，X3为料液比；
所述X1为50～90℃，所述X2为60～120min，所述X3为10:1～30:1。
7.根据权利要求6所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，所述X1为53℃，所述X2为119min，所述X3为1:11。
8.根据权利要求1所述的具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，其特征在于，在步骤C中，冰菜粗品进行粉碎后过100目筛。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的提取方法获得的冰菜D-松醇提取物。
10.一种如权利要求9所述的冰菜D-松醇提取物在降血糖上的应用。

说明书全文

一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 冰菜(Mesembryanthemum crystallinum Linn.)，别名冰叶日中花、冰草，属番杏科，分布在非洲、欧洲、亚洲西部等地，在日本、韩国、英国等国家作为一种新兴的绿色健康蔬菜被食用，近年来逐渐传入我国。冰菜叶面底部和茎上附着大量包含着盐类的泡状细胞，自身带微咸味，口感清脆，风味独特，可生食或炒食，具有很高的营养价值。冰菜富含人体所需的多种维生素(维生素A类、维生素K、泛酸)、矿物质(钠、钾、钙、锰、镁、锌)、氨基酸(脯氨酸、色氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸)等，此外，冰菜还含有D-松醇、酚酸等天然活性成分。D-松醇(D-pinitol)是其重要的活性成分，结构式为：

[0003]

[0004] D-松醇具有类胰岛素活性，能够提高胰岛素的敏感性，影响血糖的代谢，使血糖水平更加稳定，可用于糖尿病的治疗。D-松醇可以通过化学合成制得，但反应步骤较多，反应条件难以控制使得化学合成成本昂贵，相对而言从植物中提取获得D-松醇的成本更低。冰菜是提取D-松醇的重要植物资源，但目前对于冰菜的研究主要侧重于其生物学及栽培方面的研究，尚未有以冰菜为资源进行D-松醇提取的报道，且冰菜D-松醇提取物在降血糖方面的功效研究也尚未报道。

发明内容

[0005] 鉴于此，本发明提供一种真空冷冻联合真空微波干燥技术对冰菜进行干燥处理，进而利用响应面法提取冰菜D-松醇，该方法以水作为提取溶剂，操作简单，价格低廉，提取率高且能最大限度地保留冰菜中的活性成分。同时本发明提供的冰菜提取物能显著改善2型糖尿病大鼠的典型症状，降低糖尿病大鼠餐后血糖，空腹血糖，改善糖耐量，修复受损的胰岛β细胞。

[0006] 为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案：一种具有降血糖功效的冰菜D-松醇提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0007] A、物料预处理：取冰菜进行清洗，并切成片段；

[0008] B、真空冷冻联合真空微波干燥：将步骤A得到的冰菜片段进行冷冻过夜；冷冻后的冰菜移入真空冷冻干燥室进行连续干燥；然后将冷冻干燥后的冰菜转入微波真空干燥机内再次干燥；

[0009] C、物料粉碎：将步骤B中干燥后的冰菜粗品进行粉碎，并过50-200目筛得到冰菜干粉，然后于常温环境下保存，用于下一步提取；

[0010] D、响应面法提取冰菜D-松醇：将步骤C中的冰菜干粉加入纯水中进行提取，采用响应面法设定提取的变量参数，提取结束后，真空抽滤，得到含有D-松醇成分的提取液。

[0011] 作为优选，在步骤B中，真空冷冻干燥室的腔内压强为3～4Pa，冷阱温度为-48～-56℃，加热板温度为25℃，连续干燥为8～16小时。冷冻干燥时间过长，干燥冰菜所产生的能耗大；时间过短，D-松醇的提取效率降低。

[0012] 作为优选，在真空冷冻干燥室内连续干燥10～12小时。

[0013] 作为优选，在步骤B中，微波强度为6-10W/g，保持8～15min。干燥时间影响冰菜最终的水分含量，干燥时间短，冰菜最终的水分含量过高，容易腐烂变质；干燥时间过长，D-松醇提取率降低。

[0014] 作为优选，在步骤B中，微波强度为8W/g，保持9～10min。

[0015] 作为优选，所述响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程：

[0016] Y＝12.19-X1+1.12X2-1.10X3-0.12X1 X2+0.53X1 X3-0.19X2 X3-1.05X12-0.52X22-0.77X32，

[0017] 式中：响应值Y为D-松醇提取率，设定的变量参数X1为提取温度，X2为提取时间，X3为料液比；

[0018] 所述X1为50～90℃，所述X2为60～120min，所述X3为10:1～30:1。

[0019] 作为优选，所述X1为53℃，所述X2为119min，所述X3为11:1。

[0020] 作为优选，在步骤C中，冰菜粗品进行粉碎后过100目筛。过50目筛，物料太粗，提取率不高；过200目筛，对粉碎机要求高，粉碎时间长，能耗大。

[0021] 一种如上所述的提取方法获得的冰菜D-松醇提取物。

[0022] 一种如上所述的冰菜D-松醇提取物在降血糖上的应用。

[0023] 综上所述，本发明的有益效果是：

[0024] (1)本发明采用真空冷冻联合真空微波干燥方法制得的冰菜干粉，最大限度的保留了冰菜中的活性成分，所制备的冰菜干粉D-松醇含量为12.9mg/g DWIP，总黄酮含量为1.7±0.05mg/gDWIP，总多酚含量为5.9±0.77mg/gDWIP，与单一的冷冻干燥没有显著差别；
本发明采用的真空冷冻联合真空微波干燥方法的干燥时间为10h，单一的冷冻干燥耗时为
36-40h，大大缩短了干燥时间和耗能；

[0025] (2)本发明采用水作为提取溶剂，并通过响应面法设定的提取变量参数提取温度、提取时间和料液比，以冰菜重要的活性成分D-松醇为响应值，提取冰菜中降血糖成分的效果，实现精准提取。该方法具有操作简单，价格低廉，提取率高的优点；

[0026] (3)本发明制得的冰菜提取物能显著降低糖尿病大鼠餐后血糖，空腹血糖，改善糖耐量，修复受损的胰岛β细胞，具有治疗糖尿病综合症的作用。附图说明

[0027] 图1是本发明的D-松醇提取率(Y)-提取温度和提取时间(X1X2)的相应曲面图；

[0028] 图2是本发明的D-松醇提取率(Y)-提取温度和料液比(X1X3)的相应曲面图；

[0029] 图3是本发明的D-松醇提取率(Y)-提取时间和料液比(X2X3)的相应曲面图；

[0030] 图4是本发明工艺生产的D-松醇提取物对糖尿病大鼠空腹血糖和餐后血糖的影响对比图；

[0031] 图5是本发明工艺生产的D-松醇提取物对糖尿病大鼠糖耐量的影响对比图；

[0032] 图6是本发明工艺生产的D-松醇提取物对糖尿病大鼠胰岛β细胞保护作用对比图。

具体实施方式

[0033] 下面将结合实施例，更具体地说明本发明的内容，显然，本发明的实施并不局限于下面的实施例。基于本发明的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

[0034] 本发明一种具有降血糖功效的冰菜提取制备方法和应用，该方法包括以下步骤：

[0035] A、物料预处理：挑选新鲜未腐烂的冰菜，清洗，切成10mm左右的片段，12小时内进行干燥处理；

[0036] B、真空冷冻联合真空微波干燥：将步骤A得到的冰菜片段置于托盘内并摊成薄层，送入-30℃冷冻库中冷冻过夜；取出后将冷冻的冰菜移入真空冷冻干燥室，腔内压强为3～4Pa，冷阱温度为-48℃，加热板温度25℃，连续干燥10小时，作为优选，在真空冷冻干燥室内连续干燥10～12小时，干燥至水分含量为70％左右，冷冻干燥时间过长，干燥冰菜所产生的能耗大；时间过短，D-松醇提取率降低；参见表1和表3；冷冻干燥后的冰菜，转放入微波真空干燥机内，微波强度6-10W/g，保持8～15min，得到冰菜粗品水分含量为5％以下，作为优选，微波强度为8W/g，保持9～10min；

[0037] C、物料粉碎：将步骤B中干燥后的冰菜粗品进行粉碎，并过50-200目筛得到冰菜干粉，然后于常温环境下保存，用于下一步提取，作为优选，冰菜粗品进行粉碎后过100目筛；过50目筛，物料太粗，提取率不高；过200目筛，对粉碎机要求高，粉碎时间长，能耗大；

[0038] D、响应面法提取冰菜D-松醇：将干燥后的冰菜粉加入纯水中进行提取，以提取温度(X1)、提取时间(X2)和料液比(X3)为变量参数，应用Box-Behnken设计进行实验，运用响应面法分析法，以D-松醇得率(Y)为响应值，对冰菜中D-松醇的提取过程进行优化。提取结束后，真空抽滤，得到含有D-松醇成分的提取液。

[0039] 上述步骤B中的干燥是冰菜初加工最为重要的环节，目的是为了防止冰菜腐烂霉变，且其工艺参数对于提取冰菜降血糖活性物质具有重要影响。表1～3分别列出了不同干燥方式对冰菜干燥时间及耗能、冰菜色度以及冰菜中活性物质的影响。其中，表1～3中的实施例均是通过响应面法确定的最优工艺参数进行提取冰菜D-松醇。

[0040] 表1：不同干燥方式对冰菜干燥时间及能耗率影响

[0041]

[0042] 表2：不同干燥方式对冰菜色度的影响

[0043]

[0044] 表3：不同热风干燥温度对冰菜中活性物质的影响

[0045]

[0046] 注：表3中mg/g DWIP表示为mg/g Dry Weight Ice Plant冰菜干重。

[0047] 通过表1～3的数据分析，以60℃单一热风干燥为对照，对于真空冷冻联合真空微波干燥对冰菜活性物质的保留及干燥效率的影响进行验证。结果表明，本发明利用真空冷冻联合真空微波干燥冰菜的方法中，其中冷冻干燥时间为10小时联合真空微波干燥时间9min，与单一的真空冷冻干燥耗时为36-40h，大大缩短了干燥时间和耗能(参见表1)；本发明采用真空冷冻联合真空微波干燥方法制得的冰菜干粉能较好地保留冰菜的颜色(参见表
2)；本发明采用真空冷冻联合真空微波干燥方法制得的冰菜干粉，最大限度的保留了冰菜中的活性成分，其中，参见表3实施例A6所示，采用真空冷冻干燥(10h)+真空微波干燥(9min)方法所制备的冰菜干粉D-松醇含量为12.9±0.64mg/g DW，总黄酮含量为1.7±
0.05mg/g DW，总多酚含量为5.9±0.77mg/g DW，其对于活性成分的保留效果与单一的真空冷冻干燥没有显著差别(参见表3)，而单一的真空微波干燥方法提取效率较低，参见表3实施例A2～A4。

[0048] 冰菜的水分含量对冰菜的保存具有重要影响，水分过高容易引起冰菜腐败变质。干燥至水分含量5％以下，为物料保存的安全含量，一般来说，若水分含量大于10％，则保存过程中容易引起腐败变质，不利于冰菜D-松醇的提取。

[0049] 采用响应面法提取冰菜D-松醇的具体试验方案及结果见表4。

[0050] 表4：响应面法提取冰菜D-松醇的具体工艺参数

[0051]

[0052] 注：表4中mg/g dwipe表示为mg/g dry weight ice plant extract冰菜提取物干重。

[0053] 将测量出的D-松醇含量输入到Design Expert 软件中进行分析，计算获得回归模型的方程如下：

[0054] Y＝12.19-X1+1.12X2-1.10X3-0.12X1 X2+0.53X1 X3-0.19X2 X3-1.05X12-0.52X22-0.77X32

[0055] 通过方差分析表，根据各个因素的平方值，可以得到三个因素对提取质量的影响显著性依次是提取时间>料液比>提取温度，且三个因素对实验结果的影响均为极显著。p-value小于0.05表示模型为差异显著，而大于0.1表示模型无差异。F-值为10.91表示模型是显著的，且仅仅只有0.24％的概率(p-值＝0.0024)为噪音导致的模型差异。

[0056]

[0057] 根据计算，试验结果以及合成三维响应面曲面图，如图1-3。最终的优化条件为三维图谱的顶点。因此最佳提取工艺为温度53℃,提取时间为119分钟，料液比1:11，采用最佳工艺可获得40.69mg/g dwipe的D-松醇提取率。

[0058] 上述利用响应面提取冰菜D-松醇的方法中，为了更有利于保存，先将提取液先进行减压真空浓缩得到膏状物，后进行真空冷冻干燥除去剩余溶剂得到相应的降血糖提取物。

[0059] 上述具有降血糖功效提取物的D-松醇含量可以采用以下方法测定：

[0060] 标准曲线的制作：

[0061] 分别吸取浓度为20mg/L、60mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/L的D-松醇标准品溶液2mL，冷冻干燥。于各管中加入800μL吡啶，超声溶解，再加入200μL TMSI 硅烷衍生化试剂，超声混匀，90℃水浴反应1小时，冷却，用滴管取出上层清夜进行气相色谱测定。

[0062] 色谱条件：色谱仪为Thermo GC Ultra，色谱柱为HP-5(30m×0.25mm i.d.×0.25μm)，色谱柱升温条件：初始150℃保持3min，5℃/min升温至200℃，10℃/min升温至300℃，保持17min；气化室温度290℃，分流比30:1，FID检测器温度320℃，FID检测器流量：尾吹气30mL/min，氢气40mL/min，空气400mL/min。以峰面积对浓度进行线性回归分析，求得回归方程，y＝73366x+6258.6，相关系数R2＝0.9920。

[0063] 本发明的方法得到的提取物中D-松醇的测定：

[0064] 准确称取一定质量提取物用纯水溶解，定容至50mL，移取2mL溶液，冷冻干燥后加入800μL吡啶，超声溶解，再加入200μL TMSI硅烷衍生化试剂，超声混匀，90℃水浴反应1小时，冷却，用滴管取出上层清夜进行气相色谱测定。根据回归方程计算溶液中D-松醇的浓度C(mg/L)，再按照以下公式计算提取物中D-松醇含量(％)。

[0065]

[0066] 式中：M为提取物质量(mg)；C为溶液中D-松醇浓度(mg/L)。

[0067] 按照本实例方法进行制备的冰菜提取物进行药理药效实验：

[0068] 1、实验目的

[0069] 考察本发明的方法得到的含D-松醇物质的冰菜提取物对大鼠血糖、糖耐量的影响及其对胰岛β细胞的保护作用，为其降血糖作用提供初步的实验依据。

[0070] 2、实验方法

[0071] 2.1实验动物及分组

[0072] SPF级雄性Wistar大鼠及Goto-kakisaki(GK)自发性2型糖尿病大鼠，8周龄，体重(280±20g)，购自上海斯莱克公司实验动物有限责任公司。实验分组：正常组(Wistar-control)，Wistar大鼠，每组10只；糖尿病模型组(GK-control)，GK大鼠，每组10只；冰菜D-松醇提取物干预组(GK-IPE)，GK大鼠，每组10只。GK-IPE组每日灌胃冰菜提取物(剂量400mg/Kg BW,body weight)，Wistar-control组和GK-control组每日灌胃同等体积清水。
连续灌胃8周后，对大鼠进行麻醉，处死，取血及组织。

[0073] 2.2血糖测定实验

[0074] 实验周期为8周，每周测定血糖值。空腹血糖禁食(不禁水)12h后尾部取血，采用血糖仪测定空腹血糖值。餐后随机血糖大鼠进食后，采用血糖仪测定随机血糖值。

[0075] 2.3口服葡萄糖糖耐量实验(OGTT)

[0076] 上述实验大鼠在治疗8周时禁食(不禁水)12h，测定空腹血糖，即给葡萄糖前(0min)的血糖值。各组经口给予葡萄糖2.5g/kg bw，测定各组30、60、120、180min时的血糖值，绘制糖耐量曲线并计算面积。

[0077] 2.4大鼠胰岛β细胞染色

[0078] HE染色：大鼠胰组织石蜡切片5-8μm，经苏木精-伊红染色(HE染色)，脱水封片后，置于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

[0079] 免疫荧光染色：大鼠胰组织石蜡切片脱蜡至水，经BSA封闭，一抗二抗孵育后，DAPI复染细胞核，封片。切片置于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm)。

[0080] 3结果与分析

[0081] 3.1冰菜D-松醇提取物对大鼠血糖的影响

[0082] 实验周期中，各组大鼠的皮毛柔软，有光泽，顺滑，且行动敏捷，精神状态良好，说明冰菜D-松醇提取物干预并未对动物有不良影响。GK糖尿病大鼠具有多饮多尿多食，体重消瘦等典型的糖尿病“三多一少”症状。同正常对照组(Wistar-control)相比，模型对照组(GK-control)大鼠的空腹血糖值极显著性升高(p＜0.01；图4)；同模型对照组相比，经D-松醇灌胃治疗后，大鼠的空腹血糖值显著下降。此外，餐后随机血糖结果表明，同Wistar-control相比，GK-control大鼠的血糖值极显著性升高(20.72mmol/L vs 5.84mmol/L)；同样地，D-松醇对患病大鼠进行治疗8周后，大鼠的随机餐后血糖值显著性降低(10.98mmol/L vs 20.72mmol/L；图4)。

[0083] 3.2冰菜D-松醇提取物对大鼠口服葡萄糖耐量的影响

[0084] 口服给与葡萄糖后，各组大鼠的血糖值均在60min时到达峰值，正常对照组在3h后回到未灌胃葡萄糖之前的水平(图5)。在整个实验过程中，与正常对照组相比，GK-control组的血糖值极显著性升高(p＜0.01)。此外，D松醇干预组大鼠的血糖曲线下面积明显低于模型对照组，并且具有显著性差异(p＜0.01；图5)。

[0085] 3.3冰菜D-松醇提取物对大鼠胰岛β细胞的修复作用

[0086] GK-control组大鼠胰岛β细胞数量减少，发生明显的萎缩，荧光染色表明胰岛素明显减少。本发明获得的冰菜D-松醇提取物对糖尿病大鼠胰岛β细胞具有明显的保护作用，胰岛β细胞数量显著高于GK-control组，荧光染色发现其胰岛素明显提高(图6)。D-松醇具有类胰岛素活性，能够提高胰岛素的敏感性，本发明提供的D-松醇提取物可通过修复糖尿病大鼠胰岛β细胞，提高胰岛素水平，发挥降血糖功效。

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