技术领域
[0001] 本
发明涉及生物标记物技术领域，尤其涉及一种唾液蛋白质组抑郁症生物标记物。
背景技术
[0002] 抑郁症(depression)是指由心境障碍、遗传因素等多因素引起的，以显著而持久的心境低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退和躯体症状为主要临床特征的心境及情感障碍。抑郁症的发病范围广泛，初期不容易觉察，对于抗抑郁药的疗效存在个体差异，因此，抑郁症的准确诊断和疗效评价不仅是临床上需要解决的关键问题，对于认识该病的物质和病理
基础也具有重要作用。
[0003] 由于目前还没有生物标记物能够成为临床研究的金标准，遗传学、临床表现(问诊)和神经生物学指标是诊断抑郁症的几种主要方法，但临床症状评估为诊断的指标不够稳定，遗传因素发挥作用的条件不够清楚，相比之下，神经生物学指标提供的信息更为准确具体详实，发展前景更为广阔。目前，大多数抑郁症生物标志物都是从血液或尿液中寻找。唾液比血液更易获得，唾液的基本功能是消化，但当
机体出现病变时，异常蛋白有可能从神经系统或血液进入唾液。
发明内容
[0004] 鉴于血液是微创取样，在临床上还是可能给患者带来一
定心理压
力，本发明的目的在于提供一种唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，旨在帮助抑郁症的早期诊断，认识其病理学基础和评价药物疗效。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Cystatin-C，Ig alpha-1chain C region，Cystatin-S， Lysozyme C，Cystatin-D，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2，Phosphoglycerate kinase 1，Carbonic anhydrase 6，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1，Peroxiredoxin-5，Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Keratin， type II cytoskeletal 78，Lamin-B1，Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin，Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E，Calmodulin，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Protein S100-A8，Protein S100-A9，Protein S100-P，Keratin, type II cytoskeletal 5，Protein S100-A7，Keratin和type I cytoskeletal 13中的至少三种。
[0007] 所述的唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Cystatin-C，Ig alpha-1chain C region，Cystatin-S， Lysozyme C，Cystatin-D，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2，Phosphoglycerate kinase 1，Carbonic anhydrase 6，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1和Peroxiredoxin-5。
[0008] 所述的唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1 catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1， Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin，Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E，Calmodulin， Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Protein S100-A8，Protein S100-A9，Protein S100-P，Keratin,type II cytoskeletal 5，Protein S100-A7，Keratin和type I cytoskeletal 13。
[0009] 所述的唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Cystatin-C，Lysozyme C，Protein LEG1 homolog， Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2，Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Calmodulin， Alpha-2-macroglobulin-like protein 1和Protein S100-A8。
[0010] 所述的唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Carbonic anhydrase 6，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3，Apolipoprotein A-I，Profilin-1， Peroxiredoxin-5，Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1 catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1， Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin， Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E。
[0011] 有益效果：本发明提供的唾液蛋白质组是一种简单和无创的抑郁症生物标记物，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到80％以上，利用上述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物作为抑郁症检测
试剂盒可快速有效检测和预测是否患有抑郁症，以对抑郁症进行
预防和延缓。
具体实施方式
[0012] 本发明提供一种唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体
实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0013] 本发明一些实施方式中，提供一种唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Cystatin-C，Ig alpha-1 chain C region，Cystatin-S，Lysozyme C，Cystatin-D，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2， Phosphoglycerate kinase 1，Carbonic anhydrase 6， Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1，Peroxiredoxin-5，Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Keratin， type II cytoskeletal 78，Lamin-B1，Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin，Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E，Calmodulin，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Protein S100-A8，Protein S100-A9，Protein S100-P，Keratin, type II cytoskeletal
5，Protein S100-A7，Keratin和type I cytoskeletal 13中的至少三种。
[0014] 在一些实施方式中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括 Cystatin-C，Ig alpha-1chain C region，Cystatin-S，Lysozyme C， Cystatin-D，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein， Nucleobindin-2，Phosphoglycerate kinase 1，Carbonic anhydrase 6， Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1和Peroxiredoxin-5。本实施例中的蛋白组分在抑郁症患者的唾液中显著低表达，可作为抑郁症的有效生物标记物。利用这些标记物的组合，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到85％
[0015] 在一些实施方式中，所述的唾液蛋白质组抑郁症生物标记物，其中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1，Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin， Periplakin，Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E， Calmodulin，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Protein S100-A8， Protein S100-A9，Protein S100-P，Keratin,type II cytoskeletal
5， Protein S100-A7，Keratin和type I cytoskeletal 13。本实施例中的蛋白组分在抑郁症患者的唾液中显著高表达，也可作为抑郁症的有效标记物。利用这些标记物的组合，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到88％。
[0016] 在一些实施方式中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括 Cystatin-C，Lysozyme C，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2，Aspartate aminotransferase，Vinculin， Calpain-1catalytic subunit，Calmodulin，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1和Protein S100-A8。在本实施例中，所述Cystatin-C，Lysozyme C，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein，Nucleobindin-2 在抑郁症患者的唾液中显著低表达，所述Aspartate aminotransferase， Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Calmodulin， Alpha-2-macroglobulin-like protein 1和Protein S100-A8在抑郁症患者的唾液中显著高表达，本实施例中蛋白组分的组合也可作为抑郁症的有效标记物。利用这些标记物的组合，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到 91％。
[0017] 在一些实施方式中，所述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物包括 Carbonic anhydrase 6，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， Annexin A3，Apolipoprotein A-I，Profilin-1，Peroxiredoxin-5， Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1，Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin，Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E。在本实施例中，所述Carbonic anhydrase 6，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1，Peroxiredoxin-5在抑郁症患者的唾液中显著低表达，所述Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1 catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1， Plastin-2，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin， Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E在抑郁症患者的唾液中显著高表达，本实施例中蛋白组分的组合也可作为抑郁症的有效标记物。利用这些标记物的组合，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到95％。
[0018] 下面以具体的实施例对本发明的检测抑郁症的方法进行详细说明。
[0019] 本实施例采用iTRAQ(同位素标记相对和绝对定量)分组设计方法对对照组和抑郁症组的唾液蛋白进行分析，所述iTRAQ分析包括：FASP酶切、 iTRAQ标记、高pH反相肽段分级、
串联质谱分析四个步骤，具体如下所示：
[0020] 第一步，FASP酶切：
[0021] 1)、每个待测样品取用定量好的50ug蛋白，按照样品体积加入10X DTT，使DTT终浓度为10mM，37℃孵育2小时；
[0022] 2)、将10KDa
超滤管放入收集管，随后将样品加入超滤管14000×g 离心15min弃去滤液。向超滤管中加入100μl含有50mM IAA的BufferA尿素缓冲液，混匀避光孵育20min；
[0023] 3)、使用4000×g离心15min弃去滤液。向超滤管中加入100μl BufferB 尿素缓冲液，使用14000×g离心15min弃去滤液，重复两次；
[0024] 4)、超滤管中加入100μl 50mM TEAB 14000×g离心15min弃去滤液，重复两次；
[0025] 5)、超滤管中加入100μl 50mM TEAB含有1μg胰酶(胰酶蛋白比例为 1:40)震荡1min，转移至新收集管中，37℃孵育16小时；
[0026] 6)、11,000×g离心超滤管15min，酶解消化后的肽段溶液于管底部收集；在超滤管中加入50μL 50mM TEAB，11,000×g再次离心15min，重复一次，使用
真空浓缩仪旋干超滤管底部酶解后的样品。
[0027] 第二步，iTRAQ标记：
[0028] 1)、从-80℃
冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡至室温，将iTRAQ试剂离心至管底；
[0029] 2)、向每管iTRAQ试剂中加入150μL异丙醇，充分涡旋振荡，瞬时离心；
[0030] 3)、50μL 50mM TEAB溶解旋干超滤管底部酶解后的样品，此时TEAB 盐浓度为0.25M；
[0031] 4)、将150μL已活化iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，瞬时离心，室温反应2h；
[0032] 5)、加入100μL超纯
水终止反应，涡旋振荡，瞬时离心，使用真空浓缩仪旋干，体积减小至200ul左右时，将8标的离心管中的液体合并至一管，继续旋干，冷冻待用。
[0033] 第三步，高pH反相肽段分级：
[0034] 1)、将标记合并旋干后的样品用100μL的LC-MS Buffer A重新溶解，涡旋振荡并离心后，吸取装进样瓶；
[0035] 2)、准备15个空白1.5mL离心管，依次标记为1-15，用于收集分离得到的组份；
[0036] 3)、连通高效液相色谱，液相的A、B相分别接入分级缓冲液A和分级缓冲液B，分别5ml/min排气。A相B相轮换一次1ml/min走完整流路清洗机器至215nm吸收峰水平，暂停流速，接入C18反相色谱柱，A相B相轮换一次0.3ml/min至A相215nm吸收峰水平；
[0037] 4)、进样99ul，运行方案如表1所示：
[0038] 表1
[0039]
[0040] 5)、从5min开始接样品，55min停止。每分钟依次收集到1-15号离心管中。
[0041] 6)、将收集的洗脱液用真空浓缩仪旋干。
[0042] 第四步，液相色谱—TripleTOF质谱分析：
[0043] 将上述冻干的多肽样品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中，在线 Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-UltraTM2D系统(AB SCIEX) 进行，溶解后的样品以2μL/min的流速上样到C18预柱上(100μm×3cm， C18,3μm, )，然后保持流速冲洗脱盐10min。分析柱是C18反相色谱柱(75μm x 15cm C18-3μ m ChromXP Eksigent)，实验所用梯度为70min内流动相B由 5％升高至80％。质谱采用TripleTOF 5600系统(AB SCIEX)结合纳升喷雾III离子源(AB SCIEX,USA)，喷雾
电压为2.4kV，气帘气压为30Psi，雾化气压为5Psi，加热
温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA Information Dependent Analysis)，碰撞室
能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(CID)，动态排除设置为11秒。
[0044] 通过本实施例中的实验发现以下蛋白在抑郁症患者唾液中显著低表达：Cystatin-C，Ig alpha-1chain C region，Cystatin-S，Lysozyme C， Cystatin-D，Protein LEG1 homolog，Prolactin-inducible protein， Nucleobindin-2，Phosphoglycerate kinase 1，Carbonic anhydrase 6， Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Annexin A3， Apolipoprotein A-I，Profilin-1和Peroxiredoxin-5，因此这些蛋白可作为抑郁症的有效生物标记物。
[0045] 以下蛋白在抑郁症患者唾液中显著高表达：
[0046] Aspartate aminotransferase，Vinculin，Calpain-1catalytic subunit，Keratin，type II cytoskeletal 78，Lamin-B1，Plastin-2， Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，Periplakin， Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E，Calmodulin， Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Protein S100-A8，Protein S100-A9，Protein S100-P，Keratin,type II cytoskeletal 5，Protein S100-A7，Keratin,type I cytoskeletal 13，这些差异蛋白提示抑郁症与能量代谢和
炎症密切相关，虽然
角蛋白(Keratin)与该病的关系尚不清楚，但由于它们在抑郁症患者唾液中含量增加非常明显，也应该视作生物标记物，以上蛋白或蛋白质的组合可以作为抑郁症的生物标记物。
[0047] 综上所述，本发明提供的唾液蛋白质组是一种简单和无创的抑郁症生物标记物，对抑郁症的特异性和敏感性都可达到80％以上，利用上述唾液蛋白质组抑郁症生物标记物作为抑郁症检测试剂盒可快速有效检测和预测是否患有抑郁症，以对抑郁症进行预防和延缓。
[0048] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附
权利要求的保护范围。
