利用TRBV家族成员预测曲妥珠单抗新辅助治疗乳腺癌患者疗效试剂盒及其应用
阅读：635发布：2020-05-11
专利汇可以提供利用TRBV家族成员预测曲妥珠单抗新辅助治疗乳腺癌患者疗效试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药领域，公开了TRBV12‑3和/或TRBV12‑5基因在预测曲妥珠单抗与化疗剂 联合 治疗 乳腺癌 患者疗效中的用途。本发明的实验证明疗效pCR患者的TRBV12‑3基因和TRBV12‑5基因在外周T细胞中的基因 频率 和基因表达量显著低于疗效non‑pCR患者，据此可将TRBV12‑3和TRBV12‑5用于开发预测曲妥珠单抗与化疗剂联合治疗乳腺癌患者疗效的产品。本发明还公开了TRBV12‑3和TRBV12‑5基因可作为乳腺癌的治疗靶标。本发明的研究成果为临床医师制定个性化 治疗方案 提供理论 基础 、并且能够为乳腺癌药物的开发提供新的药物靶点。，下面是利用TRBV家族成员预测曲妥珠单抗新辅助治疗乳腺癌患者疗效试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的试剂在制备预测曲妥珠单抗与化疗剂联合治疗乳腺癌患者疗效的产品中的应用；检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的试剂包括检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-5基因频率的试剂，或检测TRBV12-3基因表达水平和/或TRBV12-5基因表达水平的试剂；所述乳腺癌是HR阴性HER2阳性乳腺癌；所述化疗剂是紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇和表柔比星的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-
5基因频率的试剂包括免疫组库测序方法中使用的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组库测序方法中使用的试剂包括特异性扩增CDR3区域的引物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TRBV12-3基因表达水平和/或TRBV12-5基因表达水平的试剂包括能够结合TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的核酸，或者能够结合TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的物质；所述核酸能够检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的表达水平；所述物质能够检测TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸包括实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV12-3基因的引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和/或包括实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV12-5基因的引物，引物序列如 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。
利用TRBV家族成员预测曲妥珠单抗新辅助治疗乳腺癌患者疗
效试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤，GLOBOCAN2012资料显示2012年全球共有170万乳腺癌新增病例，总死亡52.2万例，居女性癌症死因的第二位，因此其疗效预测及改善预后一直是临床科研工作者的研究重点。在局部晚期或高生物学风险的乳腺癌患者中，新辅助治疗用于缩小肿瘤负荷以增加根治性切除率及保乳率并减少疾病复发和死亡的风险。激素受体(HR)(即雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR))阴性表达和HER2过表达是与乳腺癌疾病进展和预后差相关的分子生物学因素。大约20-30％的乳腺癌患者HER2过表达。HER2阳性乳腺癌患者的预后因曲妥珠单抗的应用有了很大的改善。关于新辅助治疗疗效，研究证实疗效达病理完全缓解(pCR)患者无病生存期和总生存期的延长具有显著相关性，预后明显优于非pCR患者。在当前的实践中，有大肿瘤负荷的HR阴性HER2阳性的乳腺癌患者通常受益于曲妥珠单抗联合化疗的新辅助治疗，有近30-50％的患者疗效能够达到pCR。
[0003] 目前仍缺乏有效预测pCR的分子标志物，预测治疗反应是具有挑战性和亟待解决的临床难题。当肿瘤发生后，机体可产生针对肿瘤抗原的适应性免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫占主要地位，体液免疫仅在少数情况下起协同作用。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于肿瘤癌巢内及间质中的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体。近年来，随着肿瘤免疫学的进展，TIL成为乳腺癌研究者关注的焦点，并有较多最新研究结果证实了其在新辅助治疗和辅助治疗疗效和预后预测方面的价值。不同乳腺癌分子分型中，三阴性与HER2阳性乳腺癌病灶中TIL浸润程度较高；这可能与这两种分子分型的乳腺癌细胞具有较强的免疫原性，从而可较大程度地激活机体的免疫反应有关。有研究显示在HER2阳性肿瘤患者人群中，新辅助治疗后TIL水平提高也与更高的pCR率相关。曲妥珠单抗可以通过刺激HER2特异性的毒性T细胞来引发特异性的适应性免疫反应。之前的一项研究表明，曲妥珠单抗新辅助治疗的乳腺癌患者中，针对HER2的T细胞应答与pCR显著相关。
[0004] 以前的大多数研究简单地量化肿瘤组织中T淋巴细胞的数量，但T淋巴细胞是一群极具异质性的免疫细胞群，T细胞受体(TCR)的也存在分子多样性。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条肽链组成，TCR2由α和β两条肽链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2。TCR的每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，最能代表受体库的特异性。TCR是由V、D、J、C四个基因簇编码的，其中V区(可变区)是由V、D、J基因簇通过V-J(TCRα)和V-D-J(TCRβ)片段间的基因重排、剪接等过程编码。在重排时，β链在胚系DNA水平上先进行D-J的重排，而后V与DJ重排连接；β链VDJ基因重排完成后发生α链VJ基因重排。各个基因片段之间的连接处会随机插入丢失一些寡核苷酸片段，在T淋巴细胞的亲和力成熟阶段还会发生高频突变，在这些机制的介导下，产生了数量巨大的TCR库。因此，TCR DNA测序是一个有吸引力和潜力的替代TIL，探索肿瘤抗原特异性T细胞表面特征，并分析TCR基因多态性与治疗敏感性的相关性。在本研究中，申请人通过对新辅助治疗前外周血T细胞中TCRβ链CDR3区域进行高通量二代测序研究了TCRB的基因多态性。本申请的目标是通过对外周血T细胞中TCRβ链CDR3区基因进行高通量二代测序，以期待发现可以预测HER2阳性早期乳腺癌新辅助治疗疗效达pCR的分子标志物。
发明内容
[0005] 本发明利用高通量测序技术筛选出了与曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗对乳腺癌患者疗效相关的差异表达的基因并利用大样本QPCR进行验证，获得了可以用于预测曲妥珠单抗联合化疗治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效达pCR的分子标志物-TRBV12-3和TRBV12-5。使用本发明的分子标志物可在新辅助治疗前即可判断乳腺癌患者对治疗药物的反应性，具体是：当乳腺癌患者血液中TRBV12-3基因频率低或者TRBV12-5基因频率低，或，TRBV12-3基因表达低或者TRBV12-5基因表达低时，即可判断曲妥珠单抗与化疗联合治疗该患者的最佳疗效可达到pCR，患者预后较好，无病生存期和总生存期得以延长；反之，则表明曲妥珠单抗联合化疗治疗疗效较难达到pCR，患者不能从新辅助治疗中获益，预后较差。
[0006] 本发明提供了一种预测曲妥珠单抗联合化疗治疗对乳腺癌患者疗效的产品，所述产品包括能够检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-5基因频率的试剂，和/或能够检测TRBV12-3基因表达水平和/或TRBV12-5基因表达水平的试剂。
[0007] 进一步，所述能够检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-5基因频率的试剂包括免疫组库测序方法中使用的试剂；所述能够检测TRBV12-3基因表达水平和/或TRBV12-5基因表达水平的试剂包括能够结合TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的核酸，或者能够结合TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的物质；所述核酸能够检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的表达水平；所述物质能够检测TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的表达水平。
[0008] 进一步，所述免疫组库测序方法中使用的试剂包括特异性扩增CDR3区域的引物；所述核酸包括实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV12-3基因的引物，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和/或包括实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV12-5基因的引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0009] 进一步，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0010] 本发明的所述试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增TRBV12-3和/或TRBV12-5的引物。所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
[0011] 上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含：25mM KCL，2.5mM MgCL2，200mM(NH4)2SO4。
[0012] 所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增TRBV12-3基因的正向序列5’-AAGTGACTCTGAGATGTA-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-CGTTGTTGTTAAAGTAAATG-3’(SEQ ID NO.2)；扩增TRBV12-5基因的正向序列5’-GACAAGAAGTAACAATGAGATG-3’(SEQ ID NO.3)，反向序列5’-GAAGTAAGCCAGCAACTC-3’(SEQ ID NO.4)；
[0013] 管 家 基 因 优 选 G A P D H ，扩 增 该 基 因 的 正 向 引 物 序 列 为 5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
[0014] 优选地，本发明的试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
[0015] 优选逆转录反应液包含：250mMTris-HCL(pH8.3)、375mM KCL、15mM MgCL2、50mM DTT。
[0016] RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
[0017] 优选地，本发明的试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
[0018] 本发明还提供了检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的试剂在制备预测曲妥珠单抗与化疗剂联合治疗乳腺癌患者疗效的产品中的应用。
[0019] 在本发明的具体实施方案中，本发明所述检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因是指检测外周血T细胞中TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因。
[0020] 进一步，所述检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的试剂包括能够检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-5基因频率的试剂。
[0021] 所述检测TRBV12-3基因频率和/或TRBV12-5基因频率的试剂包括免疫组库测序方法中使用的试剂。
[0022] 优选地，所述免疫组库测序方法中使用的试剂包括特异性扩增CDR3区域的引物。
[0023] 进一步，所述试剂包括能够检测TRBV12-3基因表达或TRBV12-5基因表达的试剂。
[0024] 检测TRBV12-3基因表达的试剂包括检测TRBV12-3mRNA表达量的试剂，和/或检测TRBV12-3蛋白表达量的试剂。检测TRBV12-5基因表达的试剂包括检测TRBV12-5mRNA表达量的试剂，和/或检测TRBV12-5蛋白表达量的试剂。
[0025] 所述能够检测TRBV12-3基因表达水平和/或TRBV12-5基因表达水平的试剂包括能够结合TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的核酸，或者能够结合TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的物质；所述核酸能够检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因的表达水平；所述物质能够检测TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的表达水平。
[0026] 本发明的所述检测TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5蛋白的表达水平的物质包括针对TRBV12-3蛋白和/或TRBV12-5的抗体。
[0027] 优选地，应用于本发明的抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
[0028] 进一步，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0029] 本发明的检测基因mRNA表达的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0030] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0031] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
[0032] 上面所述的核酸包括扩增基因的引物，产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
[0033] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，TRBV12-3基因对应的引物序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。TRBV12-5基因对应的引物序列如SEQ ID NO.3(正向序列)和SEQ ID NO.4(反向序列)所示。
[0034] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
[0035] 本发明的检测蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
[0036] 如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(CDR)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即，通过双硫键相互连接的2个重(H)链以及2个轻(L)链)以及其多聚体(例如IgM)。每个重链含有重链可变区以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链含有轻链可变区以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(CL1)。VH与VL区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其中散布着较保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
[0037] 如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的DNA的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该DNA可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
[0038] 抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型FR3-CDR3-FR4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR域。
[0039] “单克隆抗体”是由单克隆的B-淋巴细胞或由已经将编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染至其中的细胞或其后代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞来进行。这些融合细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。
[0040] “多特异性抗体”可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
[0041] 本发明还提供了一种提高曲妥珠单抗与化疗剂联合治疗乳腺癌患者疗效的药物，所述药物包含TRBV12-3抑制剂和/或TRBV12-5抑制剂。
[0042] 本发明的前面所述的抑制剂包括抑制基因表达的试剂，也包括抑制基因表达产物的试剂。
[0043] 进一步，所述抑制基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制基因表达产物的试剂包括抑制基因mRNA的试剂、抑制蛋白的试剂。所述抑制基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制蛋白的试剂包括抑制蛋白稳定性的试剂、抑制蛋白活性的试剂、抑制蛋白功能的试剂。
[0044] 进一步，抑制基因mRNA的试剂包括针对基因mRNA的双链核糖核酸；抑制蛋白功能的试剂包括抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
[0045] 本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备提高曲妥珠单抗与化疗剂联合治疗乳腺癌患者疗效的药物中的应用。
[0046] 在本发明的具体实施方案中，所述乳腺癌是HR阴性HER2阳性乳腺癌。
[0048] 图1显示利用二代测序检测与曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗乳腺癌患者疗效相关的基因频率统计图，其中，A：TRBV12-3；B：TRBV12-5；
[0049] 图2显示利用QPCR检测基因在non-pCR和pCR组中的差异表达，其中，A：TRBV12-3；B：TRBV12-5。
[0050] 具体的实施方式
[0051] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0052] 实施例1筛选与曲妥珠单抗联合化疗药物治疗乳腺癌患者疗效相关的基因标志物[0053] 1、样品收集
[0054] 1.1纳入标准
[0055] 研究纳入临床经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者26例，平均年龄48岁，患者临床分期为II-III期，21位患者接受4-6个周期的曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂治疗(TCH)新辅助治疗，5位患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)新辅助治疗。
患者既往未因乳腺癌行任何其他抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗及靶向治疗、内分泌治疗)。其中11例患者术后病理疗效达病理完全缓解(pCR)和15例患者为非完全缓解(non-pCR)。
患者既往未因乳腺癌行任何其他抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗及靶向治疗、内分泌治疗)。其中11例患者术后病理疗效达病理完全缓解(pCR)和15例患者为非完全缓解(non-pCR)。
[0056] 1.2样本和临床资料采集
[0057] 取得患者知情同意后，采集患者新辅助治疗前的外周血样本。
[0058] 采集血样本后，于4℃，1600g离心10min，离心后将上清(血浆)分装到1.5mL/2mL离心管中，即得到分离后所需血细胞。血浆样本处理完后，分离得到的血细胞均保存到-30℃冰箱中，避免反复冻融。
[0059] 2、DNA的提取和定量
[0061] Qubit(Invitrogen，the Quant-iT TM dsDNA HS Assay Kit)定量所提取的DNA，要求DNA≥1g，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD2300≥2。
[0062] 3、TCRB的多重PCR扩增
[0063] 使用QIAGEN的多重PCR试剂盒进行TCRB的CDR3的多重PCR扩增。
[0064] 3.1PCR1反应
[0065] 配置PCR1反应体系：2×多重PCR缓冲液25μl，5×Q溶剂5μl，上下游引物各1μl，DNA模板600ng。
[0066] PCR1扩增条件：95℃15min；(94℃30s，60℃90s，72℃30s)×10个循环；72℃5min；4℃保持。
[0067] 使用磁珠(Agencourt No.A63882,Beckman,Beverly,MA,USA)纯化PCR产物的目标片段。
[0068] 3.2PCR2反应
[0069] 对PCR1的扩增产物进行第二轮的PCR扩增：
[0070] 向扩增产物中加入2μl通用引物，25μlphusion master mix，加入无核酸酶水至终体积50μl；
[0071] 反应程序：98℃1min；(98℃20s，65℃30s，72℃30s)×25个循环，72℃5min，4℃保持。
[0072] 4、多重PCR产物目的片段的纯化、构库以及测序
[0073] 1)琼脂糖凝胶电泳检测(400mA/100V,2h)；
[0074] 2)回收200-350bps的目的片段；
[0075] 3)使用QIAGEN公司的QIAquick Gel Purification Kit进行纯化；
[0076] 4)构建cDNA文库；
[0077] 5)使用IlluminaHiSeq 3000平台对样品进行上机测序。
[0078] 5、数据分析
[0079] 1)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
[0080] 2)将1)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；
[0081] 3)对2)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。
[0082] 6、统计学分析
[0083] 使用GraphPad Prism 5.0进行统计学分析，结果数据以mean±SEM、或者中位数和范围；使用Mann-Whitney U检测或非配对t检验对不同组间比例和变量进行比较分析，使用Pearson对单变量间的相关性进行分析。使用双边分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0084] 7、结果
[0085] 结果表明，与非完全缓解组(non-pCR)相比，病理完全缓解组(pCR)中TRBV12-3基因频率和TRBV12-5的基因频率显著降低(如图1A和图1B所示)。
[0086] 实施例2差异基因在大样本中的验证
[0087] 1、样品收集
[0088] 1.1纳入标准
[0089] 研究纳入临床经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者80例，平均年龄47岁，患者处于临床II-III期。32例患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)的新辅助治疗，48例患者接受曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂(TCH)的新辅助治疗。经统计，疗效non-pCR的患者49人，疗效pCR的患者31人。
[0090] 1.2血液总RNA提取
[0091] 取得患者知情同意后，采集患者治疗前的外周血样本。
[0092] (1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。
[0093] (2)加入TRIzol(106-107细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。
[0094] (3)加入氯仿(氯仿：TRIzol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。
[0095] (4)离心，12,000g 15min，4℃。
[0096] (5)小心吸取上清液，转移到新EP管中,加入异丙醇(异丙醇：TRIzol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。
[0097] (6)离心，12,000g 10min，4℃。
[0098] (7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入75％乙醇(乙醇：TRIzol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。
[0099] (8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即RNA略微出现透明时)，加入60μl DEPC水溶解沉淀。
[0100] 2、逆转录
[0101] 用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l OligodT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育
1h，72℃10min，短暂离心。
1h，72℃10min，短暂离心。
[0102] 3、实时荧光定量PCR
[0103] 采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
[0104] 配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。
[0105] 引物序列如下：
[0106] 扩增TRBV12-3基因的正向序列5’-AAGTGACTCTGAGATGTA-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-CGTTGTTGTTAAAGTAAATG-3’(SEQ ID NO.2)；
[0107] 扩增TRBV12-5基因的正向序列5’-GACAAGAAGTAACAATGAGATG-3’(SEQ ID NO.3)，反向序列5’-GAAGTAAGCCAGCAACTC-3’(SEQ ID NO.4)；
[0108] 扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
[0109] 扩增程序：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
[0110] 4、结果
[0111] 结果如图2A显示，与疗效non-pCR组相比，pCR组TRBV12-3基因mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0112] 结果如图2B显示，与疗效non-pCR组相比，pCR组TRBV12-5基因mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0113] 实施例3预测曲妥珠单抗联合化疗药物治疗HER2阳性乳腺癌患者疗效的试剂盒[0114] 根据TRBV12-3基因和TRBV12-5基因与乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的反应性的相关性，可以通过检测TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因表达情况来预测曲妥珠单抗联合化疗药物治疗HER2阳性乳腺癌患者的疗效，据此本发明提供了一种预测曲妥珠单抗联合化疗药物治疗HER2阳性乳腺癌患者疗效的试剂盒，该试剂盒中的组分如下：SYBR Green聚合酶链式反应体系、扩增TRBV12-3基因和/或TRBV12-5基因，和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增TRBV12-3基因的正向序列5’-AAGTGACTCTGAGATGTA-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-CGTTGTTGTTAAAGTAAATG-3’(SEQ ID NO.2)；
[0115] 扩增TRBV12-5基因的正向序列5’-GACAAGAAGTAACAATGAGATG-3’(SEQ ID NO.3)，反向序列5’-GAAGTAAGCCAGCAACTC-3’(SEQ ID NO.4)；
[0116] 扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM MgCL2、200mM(NH4)2SO4。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mMTris-HCL(pH8.3)、375mM KCL、15mM MgCL2，50mM DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
[0117] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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