格尔德霉素（C－3559）在制备治疗尖锐湿疣、疱疹病毒生殖道感染药物及制备抗脊髓灰质炎病毒药物中的应用
阅读：606发布：2023-02-25
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1.格尔德霉素在制备治疗尖锐湿疣药物中的应用。
2.格尔德霉素在制备治疗疱疹病毒生殖道感染药物中的应用。
3.格尔德霉素在制备抗脊髓灰质炎病毒药物中的应用。
技术领域
本发明涉及格尔德霉素(Geldanamycin，GA)在制备治疗尖锐湿疣、 疱疹病毒生殖道感染药物及制备抗脊髓灰质炎病毒药物中的应用。
背景技术
格尔德霉素是由中国医学科学院医药生物技术研究所于湖北省武汉市 珞珈山地区土壤中分离的格尔德霉素产生菌(放线菌C-3559)的发酵液中 分离纯化的具有广谱抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次级代谢产 物。
尖锐湿疣及疱疹病毒(主要为疱疹病毒2型)生殖道感染是全国及全球 性传播疾病，流行广泛，反复发作，治疗困难。2002年全国31个省疫情 报告系统上报，除艾滋病外7种性传播疾病为744 848例，报告发病率为 58.15/10万。其中尖锐湿疣占22.25％(165748例)，为第三位；疱疹病毒生 殖道感染占4.79％(35679例)，为第五位，病例数较2001年有所上升。由 于漏报，实际感染数字远大于报告数字，有报道我国女性的尖锐湿疣感染 高峰在20～29岁之间，感染率为1606.1/10万，35岁以上妇女感染率逐渐 下降。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属乳多空病毒科，为 无包膜的DNA病毒。尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒引起的最常见的性传播疾 病之一，人乳头瘤病毒感染与宫颈癌有关，多种脊椎动物均有乳头瘤病毒 引起的感染。HPV体外培养困难，亦无合适的动物模型，故缺乏特异抗病 毒药物。尖锐湿疣治疗方法较多，有化学治疗及物理治疗，前者有鬼臼树 脂、鬼臼毒素、三氯乙酸、干扰素等；后者有液氮冷冻、激光、手术切除 等。但这些方法的治愈率仅为18.5％～40.1％，且复发率特高(22％～67％)。 这些疗法均为非特异疗法，且有些药物腐蚀性强，易损伤健康皮肤，临床 急需特异抗乳头状瘤病毒药物。疱疹病毒生殖道感染虽有阿昔洛韦(ACV) 等药物，由于现有药物易产生耐药，使治疗迁延，反复发作，患者痛苦不 堪。
尖锐湿疣及疱疹病毒(主要为疱疹病毒2型)生殖道感染是全国及全球 性传播疾病，流行广泛，反复发作，治疗困难。2002年全国31个省疫情 报告系统上报，除艾滋病外7种性传播疾病为744 848例，报告发病率为 58.15/10万。其中尖锐湿疣占22.25％(165748例)，为第三位；疱疹病毒生 殖道感染占4.79％(35679例)，为第五位，病例数较2001年有所上升。由 于漏报，实际感染数字远大于报告数字，有报道我国女性的尖锐湿疣感染 高峰在20～29岁之间，感染率为1606.1/10万，35岁以上妇女感染率逐渐 下降。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属乳多空病毒科，为 无包膜的DNA病毒。尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒引起的最常见的性传播疾 病之一，人乳头瘤病毒感染与宫颈癌有关，多种脊椎动物均有乳头瘤病毒 引起的感染。HPV体外培养困难，亦无合适的动物模型，故缺乏特异抗病 毒药物。尖锐湿疣治疗方法较多，有化学治疗及物理治疗，前者有鬼臼树 脂、鬼臼毒素、三氯乙酸、干扰素等；后者有液氮冷冻、激光、手术切除 等。但这些方法的治愈率仅为18.5％～40.1％，且复发率特高(22％～67％)。 这些疗法均为非特异疗法，且有些药物腐蚀性强，易损伤健康皮肤，临床 急需特异抗乳头状瘤病毒药物。疱疹病毒生殖道感染虽有阿昔洛韦(ACV) 等药物，由于现有药物易产生耐药，使治疗迁延，反复发作，患者痛苦不 堪。
发明内容
本发明的目的是提供一种格尔德霉素在制备治疗尖锐湿疣，疱 疹病毒生殖道感染及脊髓灰质炎病毒感染药物中的应用。
格尔德霉素是由中国医学科学院医药生物技术研究所于湖北省武汉市 珞珈山地区土壤中分离的格尔德霉素产生菌(放线菌C-3559)的发酵液中 分离纯化的具有广谱抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次级代谢产 物。
放线菌C-3559属于链霉菌的吸水类群，黑漆链霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形态特征包括：基丝不断裂，只有气丝形成孢子链， 孢子丝呈紧密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培养特 征包括：孢子成熟后，孢子丝自溶使菌落表面形成黑色粘性湿斑(吸水现 象)。 贝奈特培养基 萄糖天门冬素培养基 气丝 基丝 色素 气 丝 基丝 色素 灰黑 金叶 黄 微量金 叶黄 灰 黑 乳白 无
生理特征包括：1.碳源利用：在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、 阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖和肌醇等碳源的培养基生长良好。2.其它生理 特征：纤维素不利用，牛奶胨化，硝酸盐还原阴性。细胞壁化学特征包括： 含LL-DAP属细胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格尔德霉素的提取、分离方法
1.发酵液过滤后滤液上X5大孔吸附树脂柱，吸附完毕水冲后，用80％ 丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黄色沉淀为格尔德霉素粗品。
2.上述格尔德霉素粗品，再用大孔吸附柱进行第二次层析，用80％丙 酮洗下有效部分，纯度在90％以上，放在冰箱中析出黄色针状结晶，即为 纯度达95％以上的格尔德霉素。再进行二次重结晶，纯度可达98％以上的 格尔德霉素。提取回收率可达30％～35％。
对采用上述方法在放线菌C-3559的发酵液中提取分离的单一有效组 分，即C-3559活性组份理化性质的测定及鉴别
对活性组份进行稳定性、熔点、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及 1HNMR及18CNMR及DEPT谱等波谱的测定，并进行了文献资料的检索， 发现它与苯安沙霉素类中的格尔德霉素相同。
将两者的性质列表比较于下表：
性质 C-3559 格尔德霉素 性状 溶解度 稳定性 熔点 元素分析 分子量 分子式 UV(nm) IR 由 1HNMR， 18CNMR 及DEPT谱 黄色针状结晶 易溶于氯仿，二氯甲 烷等有机溶剂，稍溶 于丙酮、甲醇等，微 溶于水 干品稳定，溶液对热、 酸、碱、光不稳定 253℃--256℃ C62.12H7.08N4.93(025.87) 560(FABM) C29H40N2O9 304 256(甲醇) KBr片 3510 3446 3350 3315 1734 1705 1675 1655 1615 1595 1510 1108 1057CM-1 1.18CNMR谱测得为 29个碳 2.由DEPT看出有 9个季碳11个-CH 2个CH2 7个CH3 黄色针状结晶 易溶于氯仿，二氯乙 烷等，稍溶于丙酮、 乙酸乙脂等，微溶于 水 干品稳定，溶液对 热、酸、碱不稳定 252℃--255℃ 计算值： C61.69H7.16N5.15(025.65) 测定值： C62.13H7.26N5.0(025.68) 560 C29H40N2O9 304 255(甲醇) 石蜡糊 3510 3445 3350 3315 1734 1700 1676 1655 1635 1608 1590 1510 1108 1057CM-1 有29个碳 9个季碳11个-CH 2个CH2 7个CH3
根据上述数据，我们推断活性组分C-3559应有与格尔德霉素相同的结 构。
格尔德霉素在制备治疗尖锐湿疣药物中的应用。
格尔德霉素在制备治疗疱疹病毒生殖道感染药物中的应用。
格尔德霉素在制备抗脊髓灰质炎病毒药物中的应用。
格尔德霉素抗病毒作用机制与现有抗病毒药物不同，抑制病毒DNA合 成，不易产生耐药，与阿昔洛韦无交叉耐药。格尔德霉素抗疱疹病毒活性 强，且有特点。
本发明对格尔德霉素做了对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治疗作用、药物体 外抗病毒活性、药物体内抗疱疹病毒2型(HSV-2)阴道炎药效检测三个 方面的实验，实验结果表明：
1.对格尔德霉素进行的药物对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治疗作用 方面：
在格尔德霉素对犊牛股内侧皮肤的刺激作用实验中，格尔德霉素浓度 为0.5mg/ml及0.25mg/ml时，对犊牛股内侧皮肤无刺激作用。
在药物格尔德霉素对乳牛乳头皮肤纤维瘤治疗实验中，由于格尔德霉 素有抑制病毒DNA复制作用，所以对牛乳头皮肤纤维瘤呈现良好的治疗 效果，可使瘤体在一周内发生萎缩、老化、体积变小；停药后6周内这些 老化的瘤体仍可继续老化，第4、5周分别有老化的瘤体脱落；同时未发现 格尔德霉素对乳头皮肤发生损害。
2.药物体外抗病毒活性方面：
格尔德霉素在细胞培养内有广谱抗病毒作用，对多种DNA、RNA病毒 都有在微摩尔水平的抗病毒活性，其中对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的 治疗指数为3763，对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的治疗指数为230，对 水疱性口炎病毒(VSV)的治疗指数为833，对脊髓灰质炎病毒1型(Polio-1) 的治疗指数为2820，对柯萨奇病毒(Cox B3)的治疗指数为248，对SARS 冠状病毒的治疗指数为88，对人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的治疗指数 为1111。
在体外HSV-1格尔德霉素耐药毒株的训练中，用细胞实验法，将HSV-1 在非洲绿猴肾细胞(VERO)内及一定浓度格尔德霉素条件下连续传41代， 未见产生格尔德霉素的耐药毒株，HSV-1格尔德霉素耐药训练第15代与野 株具有相同的阿昔洛韦敏感性。对细胞无毒浓度格尔德霉素可特异抑制 HSV-1DNA合成。
3.格尔德霉素在小鼠体内抗疱疹病毒2型(HSV-2)阴道炎药效检测 方面：
格尔德霉素在HSV-2阴道感染模型内，可有效抑制HSV-2的复制。疱 疹病毒原液感染时，格尔德霉素可延长HSV-2感染小白鼠的平均生活日； 1/30稀释的疱疹病毒液感染时，可显著降低小白鼠的死亡率，延长感染小 白鼠的平均生活日，并降低小白鼠阴道内HSV-2排出量，与对照相比，差 别显著，效果优于相同剂量的无环鸟苷(ACV)：并且通过对小白鼠体重的 观察，表明格尔德霉素所有剂量组对小白鼠体重增长无影响。
下面是针对本发明格尔德霉的有关实验。
(1)针对本发明格尔德霉素进行的药物对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治 疗作用
上已述及人乳头瘤病毒体外培养困难，亦无合适的动物模型，只能采 用同类病毒牛乳头瘤病毒引起的乳牛乳头皮肤纤维瘤作为模型评价格尔德 霉素治疗乳头瘤病毒感染疗效。
观察药物格尔德霉素(C-3559)对犊牛股内侧皮肤的刺激作用
一.动物：北京黑白花乳牛6日龄公犊1头，牛号97026。
二.药品：C-3559药液，由医学科学院医药生物技术研究所研制提供。 检测单位：中国农业大学动物医学院。
三.实验方法：选临床健康的北京黑白花公犊牛1头。于右后肢股内 侧皮肤上选取3×3cm2面积两块，在每块皮肤上每日两次分别涂以浓度分 别为0.5mg/ml和0.25mg/ml的C-3559药液；左后肢相应部位选取同样大 小的皮肤面积，每日两次涂以C-3559的溶剂(不含药液的10％吐温80)， 作为对照。实验连续进行7天。
四.观察项目：自实验开始前3天，每天两次(上午8:00，下午3:00) 测量受试牛体温，观察用药部位皮肤有无红、肿、热、痛及机能障碍；有 无起疱、破溃、坏死、结痂等病变，逐项做好记录。以确定C-3559药液 对犊牛皮肤的生物学作用。
五.实验结果
1.皮肤颜色及变化：通过7天实验，不论左后肢股内侧对照皮肤还 是右后肢相应部位的皮肤均未发生颜色变化，也未发生起疱、溃疡等，与 未涂药部位皮肤无区别。
2.在实验期内，犊牛采食，饮水及精神状态正常，体温波动于38.8 -39.5℃之间(正常体温为38.0-39.5℃)。
六.小结：
1.连续7天在犊牛股内侧皮肤涂抹0.5mg/ml及0.25mg/ml的C-3559 药液，未见皮肤发生任何病变，说明该药物浓度对犊牛股内侧皮肤无刺激 作用。
2.在实验期内，受试犊牛采食、饮水、体温、呼吸及精神状态均正 常。
药物格尔德霉素(C-3559)对乳牛乳头皮肤纤维瘤治疗实验
一.动物：将临床患病牛随机分为2组，每组6头，其中一组作为实 验组，另一组作为对照组。
二.药品：C-3559药液及其溶剂(10％吐温80)，由医学科学院医药 生物技术研究所研制，提供浓度为0.5mg/ml，溶剂为配制C-3559药液的 溶剂，不含药物成分。
三.实验方法：将牛群中自然发病的乳牛从原有班组调出，集中饲养， 使实验组与对照组条件一致，即：饲养环境、饲养方式、饲草、饲料的数 量与质量基本一致。两组奶牛由同一饲养员、挤奶员负责管理，实行手工 挤奶、乳牛每日上槽三次，在上槽采食的同时进行挤奶，每次挤奶之后立 即将药物和溶剂分别涂抹于实验牛和对照牛乳头皮肤的肿瘤上，为安全起 见所挤牛奶全部废弃，实验连续进行7天。
四.观察与记录：在实验开始前3天，每日两次测量两组牛体温，直 至实验结束。逐日统计受试牛及实验牛病变情况——肿瘤发生的部位、瘤 体大小(用卡尺测量)。性状、颜色，有无脱落迹象等。作好记录。
五.实验结果
表1 C-3559治疗乳牛乳头纤维瘤的效果
*指肿瘤基部直径。
实验表明，C-3559药液有控制乳头纤维瘤生长的作用，能够促使瘤体 老化，面积缩小。在历时7天的实验中，处于生长阶段的纤维瘤不但没有 增大，平均直径反而缩小了12.5％，颜色由原来的皮肤色变为棕色，说明 发生了老化。对照组瘤体颜色无变化，平均直径增加了4.1％，说明瘤体处 于生长阶段，未发生老化。
为了确定C-3559药液对奶牛乳头皮肤纤维瘤的远期疗效，在前期(实 验开始后7天内)观察的基础上，我们对实验组和对照组牛只进行了连续 6周的观察，方法是每周对肿瘤的大小进行测量，对颜色及脱落与否等情 况进行记录，结果如下：
实验组的93084号(实验前瘤体已为棕黑色)、92002号两头奶牛的瘤 体分别于第4周和第5周脱落，其它4头奶牛的瘤体虽未脱落，但直径总 和由原来的14.6mm减少到12.7mm，减少12.3％，其中93070号奶牛的瘤 体由原来的3.1mm缩小到2.4mm，颜色由原来的棕色变为棕黑色。对照组 中除93046号奶牛的瘤体(实验前已为棕黑色)于第5周脱落外，其它5 头奶牛的瘤体颜色均未发生改变，仍为皮肤色，而且瘤体直径的总和由原 来的20.8mm增加到26.4mm，其中93073号奶牛的瘤体直径仍为6.3mm 外，其它4头的瘤体均有不同程度的增大，说明这些瘤体仍处于生长阶段。
以上结果说明，C-3559药液除在连续用药期能使瘤体发生老化外；停 药后6周这些老化的瘤体仍可继续老化(直径缩小)，除了实验组(93084 号)和对照组(93046号)各一头乳牛在实验前已发生老化的瘤体(棕黑 色)脱落外，实验组另一头乳牛(92002号)的瘤体也发生脱落，而对照 组其它乳牛的瘤体不但未老化，仍在继续生长(直径变大)。
六.讨论
牛皮肤纤维乳头状瘤病(Fibropapillomatosis)又名疣(Warts)是由牛 乳头状瘤病毒(Bovine papilloma Virus)引起的一种良性瘤。病毒的基因 组为双股环状DNA。该病为乳牛的常见病、多发病，个别牛群的发病率 可达30％以上。生长于乳头皮肤的瘤体，尤其呈指状生长者，其长度往往 可达1.5——2cm，挤奶时奶牛不适，甚至疼痛。瘤体在遭受继发感染的情 况下，可发生溃疡。该病有瘤体发生、生长、老化、脱落等自然阶段，这 一过程往往需要10个月或更长的时间。
七.小结
由于C-3559药液有抑制病毒DNA复制作用，所以对牛乳头皮肤纤维 瘤呈现良好的治疗效果，可使瘤体在一周内发生萎缩，老化，体积变小。 停药后6周这些老化的瘤体仍可继续老化(直径缩小)，除了实验组(93084 号)和对照组(93046号)各一头乳牛在实验前已发生老化的瘤体(棕黑 色)脱落外，实验组另一头乳牛(92002号)的瘤体也发生脱落，而对照 组其它乳牛的瘤体不但未老化，仍在继续生长(直径变大)。
实验中未发现该种药物对乳头皮肤发生损害。
(2)针对本发明格尔德霉素进行的药物体外抗病毒活性。
一.格尔德霉素的抗病毒谱 研究C-3559在细胞内对单纯疱疹病毒 1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、人免疫缺陷病毒1型、水 疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒(Cox B3)、脊髓灰质炎病毒1型Polio-1、 SARS冠状病毒SARS-coronavirus、流感病毒甲型Influenza A及流感病毒 乙型Influenza B的抑制作用。
材料：
(1)病毒株：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)SM44株、单纯疱疹病毒 2型(HSV-2)333株、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)IIIB株、水疱性口 炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒(Cox B3)、流感甲型病毒A/粤防/243/72株、 流感病毒乙型济防97-13株均为本室保存毒株；脊髓灰质炎病毒1型Polio-1 购自中国生物制品检定所；冠状病毒SARS-coronavirus为非典期间北京分 离的流行株。
(2)细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，狗肾传代细胞(MDCK)，由中 国医学科学院医药生物技术研究所保存；非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)由军 科院五所惠赠。
方法：
(1)毒种制备：
①取出低温冻存的试验病毒毒种，用细胞维持液作10倍稀释，然后接 种于已经长满单层细胞瓶内，置37℃温箱中培养，逐日观察病变， 待3/4细胞出现病变时，收获病毒，-20℃冻存。
②将细胞反复冻融三次，释放病毒。然后离心(3000rpm，10min)去除 细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。分装，冻存于-80℃备用。
(2)细胞传代：在长满细胞的培养瓶内加0.25％胰酶0.2ml，0.02％EDTA 5ml，37℃消化20-25分钟，吸出消化液，加培养液吹打，1∶3传代，置37 ℃培养箱中培养。
(3)C-3559对病毒的抑制实验：
每毫升20-30万个细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃5％CO2培养24小时，弃培养液，加入100TCID50的病毒37℃5％CO2吸附1小 时，弃去病毒液后加入C-3559连续2倍稀释液，同时设细胞对照，病毒 对照，阳性药对照。将培养板置于37℃5％CO2培养箱培养，待病毒对照 组细胞病变达4时(约32小时)，观察细胞病变，完全破坏为4；75％为 3；50％为2；25％为1；无病变为0。按Reed and Muench法计算IC50。
结果：
表2 格尔德霉素在细胞内抗病毒的IC50*值
Virus cell IC50(μM) 治疗指数
TD50#/
CPE PFU p24
IC50
HSV-1 Vero 0.093 3763
HSV-2 Vero 1.52 230
VSV Vero 0.42 833
Polio-1 Vero-E6 0.03 2820
Cox B3 Vero 1.41 248
SARS Vero-E6 0.96 88
HIV-1 0.036 1111
Influ.A MDCK -
Influ.B MDCK -
IC50*：抑制50％细胞病变的药物剂量
TD50#：引起50％细胞毒性的药物剂量
二.体外HSV-1格尔德霉素耐药毒株的训练方法及结果：
同上述细胞实验法，将HSV-1在VERO细胞内及一定浓度GA条件下 连续传41代，未见产生GA的耐药毒株(表3)。
表3 训练HSV-1格尔德霉素耐药毒株情况
耐药训练代数 IC50(μM)
GA耐药训练株 野株
4 0.79 0.79
10 1.19 1.17
15 2.67 2.23
20 1.50 2.00
31 0.69 1.23
36 0.78 1.33
41 2.22 1.24
HSV-1 GA耐药训练第15代与野株具有相同的阿昔洛韦敏感性。
三.格尔德霉素对HSV-1 DNA的抑制作用(Southern blot检测病毒DNA 复制)方法：
Vero单层细胞用HSV-1(1噬斑单位/细胞)感染，吸附1h后用冰冷 的PBS洗去未吸附的病毒，加入含4μM格尔德霉素(GA)或不含GA的 培养基，置37℃，5％CO2培养箱中培养。同时设细胞对照组和溶剂1％ 二甲基亚砜的感染对照组。在感染后12h收集细胞，将药物处理后的细胞 约2×107个，用PBS洗两次，加入500μl细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，1％SDS，500μg/ml蛋白酶K)56℃消 化2小时，加入500μl酚抽提一次，水相用酚∶氯仿∶异戊醇(50∶48∶ 2)抽提一次，水相置于新的离心管，加入50μl 3M NaAc(pH 5.2)和1ml 预冷无水乙醇，-20℃沉淀2小时，4℃10000g离心20分钟，预冷70％ 乙醇洗一次，离心去上清，风干，溶于100μl TE中。每管加入终浓度为100 μg/ml无DNA酶的RNA酶，37℃水浴20分钟，取10μg DNA与1/6体 积6×上样缓冲液混匀，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将其转到 硝酸纤维素膜上，80℃干烤1小时后，在68℃预杂交液(5×SSC，0.1％SDS， 5×Denhardt’液，100μg/ml变性鲑鱼精DNA，and 50％甲酰胺)中预杂 交4hrs，然后在含有5×107cpm 32P脱氧胞嘧啶核苷三磷酸标记的HSV-1 胸腺嘧啶核苷激酶(tk)DNA的预杂交液中42℃杂交24hrs。杂交完毕，硝 酸纤维素膜用洗膜液(0.1×SSC，0.1％SDS)室温洗三次，65℃洗两次， 夹上X光片后-20℃放射自显影。按常规方法显影、定影，最后分析条带。 结果见图1为1细胞对照，2 HSV-1感染对照，3 DMSO对照，4 GA 4μM；
图1说明经4μM GA处理的感染细胞与细胞对照一样，无病毒DNA 条带。
(3)针对本发明格尔德霉素进行的药物体内抗疱疹病毒2型(HSV-2) 阴道炎药效检测报告。
一.目的：研究C-3559体内对小白鼠HSV-2阴道炎的治疗作用：观 察小白鼠的平均生活日和死亡率，并进行病毒分离。
二.动物：昆明鼠雌性，13-15g，购自中国生物制品检定所为中国药 品生物制品检定啮齿类动物养殖中心提供的二级动物(有健康证书)，随 机分组。
三.病毒：疱疹病毒2型(HSV-2)SAV株，本室传代保存，用病 毒原液或1/30病毒原液感染。
四.药物：C-3559由本所化学室提供，纯度大于95％，用少许0.1％吐 温-80 200μl解后加到乳钵中，边研磨边加溶剂，配成4mg/ml，2mg/ml， 1mg/ml，0.5mg/ml的悬液，4℃保存。
五.方法：
1.分组：将体重为13-15g的雌性昆明鼠随机分为C-3559 5.72mg/kg、 2.86mg/kg、1.43mg/kg、0.5mg/ml组及阳性药ACV2.86mg/kg对照组，溶 剂(0.1％吐温-80)对照组，病毒对照组，每组10只小白鼠，以上为感染组； 以C-3559 5.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg、0.72mg/ml组及阳性药ACV 2.86mg/kg对照组，溶剂对照组，正常对照组，每组6只，为非感染组， 观察药物对小白鼠的毒性。
2.给药方式：用微量移液器向小白鼠阴道内注入每浓度20μl药物， 病毒对照组和正常对照组均注入生理盐水，每日三次。
3.感染方式：用微量加样器向感染组小白鼠阴道内注入20μl 1/30稀 释的病毒液或病毒原液，非感染组注入20μl生理盐水进行相同的处理， 然后开始给药。
4.观察指标：
观察死亡率、平均生活日，每日观察，记录死亡，共2周，计算死亡 率及平均生活日。
5.病毒分离实验方法：将体重为13-15g的雌性昆明鼠随机分为C-3559 5.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg组及阳性药ACV 2.86mg/kg对照组，溶 剂对照组，病毒对照组，每组6只小白鼠，用微量加样器向小白鼠阴道内 注入20μl 1/30稀释的病毒液感染，于感染后即刻给药，每日三次，在感染 后48及96小时，将用培养液润湿的棉签插入小白鼠阴道内拭擦，然后将 棉拭放入盛有1ml培养液的小试管中，挤出棉拭中的液体即为标本，在长 满单层Vero细胞的96孔培养板上进行TCID50滴定。
六.结果：
HSV-2的感染导致小白鼠在感染后大约第三天可见发病即阴道红肿并 有分泌液流出，后期也有后肢瘫痪，在第5、6天开始死亡。
第一批实验用病毒原液感染，2.86mg/ml组和ACV组可显著增加小白 鼠的平均生活日(P＜0.05)，结果见表4。C-3559的三个剂量组对小白鼠体 重的增加与正常对照组相比无明显差异，结果见表3。
第二批实验用1/30的病毒液感染，各剂量组和ACV组均能显著延长 感染小白鼠的平均生活日，并能显著提高感染组小白鼠的存活率(P＜0.01)。 结果见表5。给药组小白鼠体重的增加与正常对照组小白鼠体重的增加无 统计学上的差异(P＞0.05)，且1mg/ml剂量组小白鼠体重增加比正常对照 组小白鼠多，二者之间有统计学差异(P＜0.01)。结果见表6及表7。
HSV-2感染后48及96小时，分离小白鼠阴道病毒，滴定TCID50的结 果见表8及表9，结果表明C-3559三个剂量组均可有效降低小白鼠阴道 内HSV-2排出量，与对照组相比有显著差别。
表4 C-3559对HSV-2阴道感染的疗效(病毒原液感染) 组别 每组鼠数 成活数(％) 平均生活日 病毒对照 10 0 5.8 溶剂对照 10 0 6.2 0.72mg/kg 10 0 6.5 1.43mg/kg 10 0 7.1 2.86mg/kg 10 0 7.8* ACV 2.86mg/kg 10 0 7.8*
*P＜0.05
表5 C-3559对HSV-2阴道感染的疗效(1∶30病毒液感染) 组别 每组鼠数 成活数(％) 平均生活日 病毒对照 10 2(20) 7.6 溶剂对照 10 1(10) 7.5 1.43mg/kg 10 8(80)** 12.8** 2.86mg/kg 10 8(80)** 12.7** 5.72mg/kg 10 10(100)** 14** ACV 2.86mg/kg 10 6(60) 11.7*
*P＜0.05，**P＜0.001
表6.非感染组小鼠0day，7days，14days体重结果(第一批试验) 组别 天数 体重(g) 平均 正常对照 0days 15.05 13.28 15.2 14.76 14.96 14.65±0.7 7days 19.48 18.68 21.47 20.92 20.16 20.14±1.0 14days 24.97 26.28 27.76 25.42 28.02 26.49±1.2 ACV 0days 16.15 15.94 13.53 15.95 14.38 15.19±1.1 7days 22.58 18.84 22.23 20.43 20.28 20.87±1.4 14days 24.03 28.03 27.39 24.27 28.46 26.44±1.9 C-3559 0.72 mg/kg 0days 12.55 12.46 12.4 13.47 13.91 12.96±0.6 7days 19.87 20.32 20.97 21.35 21.33 20.77±0.6 14days 28.9 29.88 27.35 24.82 29.86 28.16±1.9 C-3559 1.43 mg/kg 0days 16.03 14.84 15.86 16.65 15.61 15.80±0.6 7days 21.16 22.31 20.93 21.84 20.13 21.27±0.8 14days 29.28 30.78 24.72 26.9 27.96 27.93±2.1 C-3559 2.86 mg/kg 0days 15.89 14.7 16.03 15.06 16.84 15.70±0.8 7days 20.52 22.85 21.97 21.7 18.83 21.17±1.4 14days 26.67 28.12 30.2 26.32 29.17 28.10±1.5
注：7天，14天所有给药组与正常对照组体重相比均无明显差异，无统计学意义。
表7.非感染组小鼠0day，7days，14days体重结果(第二批实验) 组别 天数 体重(g) 平均 正常对照 0days 16.26 14.3 15.22 14.48 14.86 14.84 14.99±0.6 7days 20.92 21.72 22.68 21.05 20.2 20.67 21.21±0.8 14days 27.92 27.16 26.1 29.08 27.63 26.13 27.34±1.0 ACV 0days 14.6 15.6 16.21 17.31 16.96 13.3 15.66±1.4 7days 21.8 22.3 22.41 24.98 20.75 23.35 22.60±1.3 14days 27.17 30.76 24.47 27.67 25.7 26.79 27.09±1.9 C-3559 1.43 mg/kg 0days 15 15.93 14.43 16.74 16.53 15.26 15.65±0.8 7days 20.62 22.66 25.43 22.34 25.16 24.92 23.52±1.8* 14days 29.54 29.28 31.08 32.25 28.62 28.22 29.83±1.4** C-3559 2.86 mg/kg 0days 16.54 13.9 15.48 16.97 15.17 14.17 15.37±1.1 7days 24.43 23.62 21.92 21.14 24.04 21.07 22.70±1.4 14days 28.91 26.2 28.22 27.67 29.02 24.8 27.47±1.5 C-3559 5.72 mg/kg 0days 15.86 16.45 17.27 15.83 14.56 14.75 15.79±0.9 7days 20.82 22.97 21.56 25.84 24.29 20.79 22.71±1.9 14days 27.91 30.38 30.05 26.17 29.73 28.75 28.83±1.5
注：7天，14天所有C-3559高、中给药组和ACV给药组与正常对照组体重相 比均无明显差异，无统计学意义，而C-3559 1mg/ml组比正常对照组体重增加 得多，二者差异显著
(7days P＜0.05，14days P＜0.01)。
表8 HSV-2 SAV株感染小白鼠48hrs后阴道分离病毒结果 组别 病毒原液 -1 -2 -3 -4 -5 TCID50 平均 病毒对照1# 4 4 4 4 10-3.5 10-3.3 病毒对照2# 4 4 4 4 2 10-4 病毒对照3# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照4# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照5# 4 4 4 2 10-3 病毒对照6# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照1# 4 4 4 10-2.5 10-2.9 溶剂对照2# 4 4 2 2 10-2.5 溶剂对照3# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照4# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照5# 4 4 4 4 4 10-4.5 溶剂对照6# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 1# 4 4 4 10-2.5 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 3# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 ACV 2.86mg/kg 5# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 6# 4 4 4 4 10-3.5 C-3559 1.43mg/kg 1# 4 4 4 10-2.5 10-1.3 C-3559 1.43mg/kg 2# 0 C-3559 1.43mg/kg 3# 4 4 4 4 10-3.5 C-3559 1.43mg/kg 4# 0
C-3559 1.43mg/kg 5# 4 4 10-1.5 C-3559 1.43mg/kg 6# 0 C-3559 2.86mg/kg 1# 0 10-1.1 C-3559 2.86mg/kg 2# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 3# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 4# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 5# 4 10-0.5 C-3559 2.86mg/kg 6# 0 C-3559 5.72mg/kg 1# 0 10-0.4 C-3559 5.72mg/kg 2# 0 C-3559 5.72mg/kg 3# 0 C-3559 5.72mg/kg 4# 4 4 4 10-2.5 C-3559 5.72mg/kg 5# 0 C-3559 5.72mg/kg 6# 0
表9 HSV-2 SAV株感染小白鼠96hrs后阴道分离病毒结果 组别 病毒原液 -1 -2 -3 -4 -5 TCID50 平均 病毒对照1# 4 4 4 4 10-3.5 10-3.3 病毒对照2# 4 4 4 2 10-3 病毒对照3# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照4# 4 4 4 10-2.5 病毒对照5# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照6# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照1# 4 4 4 2 10-3 10-3.4 溶剂对照2# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照3# 4 4 4 4 4 10-4.5 溶剂对照4# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照5# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照6# 4 4 4 4 10-3.5 ACV 2.86mg/kg 1# 4 4 10-1.5 10-1.9 ACV 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 3# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 4# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 5# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 6# 4 4 4 10-2.5 C-3559 1.43mg/kg 1# 4 4 10-1.5 10-1.3 C-3559 1.43mg/kg 2# 0 C-3559 1.43mg/kg 3# 4 4 4 4 2 10-4 C-3559 1.43mg/kg 4# 0 C-3559 1.43mg/kg 5# 4 4 4 10-2.5 C-3559 1.43mg/kg 6# 0 C-3559 2.86mg/kg 1# 0 10-1.3 C-3559 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 C-3559 2.86mg/kg 3# 4 4 4 10-2.5 C-3559 2.86mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 C-3559 2.86mg/kg 5# 0 C-3559 2.86mg/kg 6# 0 C-3559 5.72mg/kg 1# 0 10-0.5 C-3559 5.72mg/kg 2# 0 C-3559 5.72mg/kg 3# 0 C-3559 5.72mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 C-3559 5.72mg/kg 5# 0 C-3559 5.72mg/kg 6# 0
结论：
C-3559在HSV-2阴道感染模型内，可有效抑制HSV-2的复制。病毒 原液感染时，延长HSV-2感染小白鼠的平均生活日，有统计意义；1/30稀 释的病毒液感染时，可显著降低小白鼠的死亡率，延长感染小白鼠的平均 生活日，有统计意义，并降低小白鼠阴道内HSV-2排出量，感染后48小 时5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg组与对照组相比病毒排出量分别降 低794，158及100倍；感染后96小时5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg 与对照相比病毒排出量分别降低631，100及100倍，效果优于相同剂量 的ACV。通过对小白鼠体重的观察，表明C-3559所有剂量组对小白鼠体 重增长无影响。
格尔德霉素是由中国医学科学院医药生物技术研究所于湖北省武汉市 珞珈山地区土壤中分离的格尔德霉素产生菌(放线菌C-3559)的发酵液中 分离纯化的具有广谱抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次级代谢产 物。
放线菌C-3559属于链霉菌的吸水类群，黑漆链霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形态特征包括：基丝不断裂，只有气丝形成孢子链， 孢子丝呈紧密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培养特 征包括：孢子成熟后，孢子丝自溶使菌落表面形成黑色粘性湿斑(吸水现 象)。 贝奈特培养基 萄糖天门冬素培养基 气丝 基丝 色素 气 丝 基丝 色素 灰黑 金叶 黄 微量金 叶黄 灰 黑 乳白 无
生理特征包括：1.碳源利用：在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、 阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖和肌醇等碳源的培养基生长良好。2.其它生理 特征：纤维素不利用，牛奶胨化，硝酸盐还原阴性。细胞壁化学特征包括： 含LL-DAP属细胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格尔德霉素的提取、分离方法
1.发酵液过滤后滤液上X5大孔吸附树脂柱，吸附完毕水冲后，用80％ 丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黄色沉淀为格尔德霉素粗品。
2.上述格尔德霉素粗品，再用大孔吸附柱进行第二次层析，用80％丙 酮洗下有效部分，纯度在90％以上，放在冰箱中析出黄色针状结晶，即为 纯度达95％以上的格尔德霉素。再进行二次重结晶，纯度可达98％以上的 格尔德霉素。提取回收率可达30％～35％。
对采用上述方法在放线菌C-3559的发酵液中提取分离的单一有效组 分，即C-3559活性组份理化性质的测定及鉴别
对活性组份进行稳定性、熔点、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及 1HNMR及18CNMR及DEPT谱等波谱的测定，并进行了文献资料的检索， 发现它与苯安沙霉素类中的格尔德霉素相同。
将两者的性质列表比较于下表：
性质 C-3559 格尔德霉素 性状 溶解度 稳定性 熔点 元素分析 分子量 分子式 UV(nm) IR 由 1HNMR， 18CNMR 及DEPT谱 黄色针状结晶 易溶于氯仿，二氯甲 烷等有机溶剂，稍溶 于丙酮、甲醇等，微 溶于水 干品稳定，溶液对热、 酸、碱、光不稳定 253℃--256℃ C62.12H7.08N4.93(025.87) 560(FABM) C29H40N2O9 304 256(甲醇) KBr片 3510 3446 3350 3315 1734 1705 1675 1655 1615 1595 1510 1108 1057CM-1 1.18CNMR谱测得为 29个碳 2.由DEPT看出有 9个季碳11个-CH 2个CH2 7个CH3 黄色针状结晶 易溶于氯仿，二氯乙 烷等，稍溶于丙酮、 乙酸乙脂等，微溶于 水 干品稳定，溶液对 热、酸、碱不稳定 252℃--255℃ 计算值： C61.69H7.16N5.15(025.65) 测定值： C62.13H7.26N5.0(025.68) 560 C29H40N2O9 304 255(甲醇) 石蜡糊 3510 3445 3350 3315 1734 1700 1676 1655 1635 1608 1590 1510 1108 1057CM-1 有29个碳 9个季碳11个-CH 2个CH2 7个CH3
根据上述数据，我们推断活性组分C-3559应有与格尔德霉素相同的结 构。
格尔德霉素在制备治疗尖锐湿疣药物中的应用。
格尔德霉素在制备治疗疱疹病毒生殖道感染药物中的应用。
格尔德霉素在制备抗脊髓灰质炎病毒药物中的应用。
格尔德霉素抗病毒作用机制与现有抗病毒药物不同，抑制病毒DNA合 成，不易产生耐药，与阿昔洛韦无交叉耐药。格尔德霉素抗疱疹病毒活性 强，且有特点。
本发明对格尔德霉素做了对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治疗作用、药物体 外抗病毒活性、药物体内抗疱疹病毒2型(HSV-2)阴道炎药效检测三个 方面的实验，实验结果表明：
1.对格尔德霉素进行的药物对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治疗作用 方面：
在格尔德霉素对犊牛股内侧皮肤的刺激作用实验中，格尔德霉素浓度 为0.5mg/ml及0.25mg/ml时，对犊牛股内侧皮肤无刺激作用。
在药物格尔德霉素对乳牛乳头皮肤纤维瘤治疗实验中，由于格尔德霉 素有抑制病毒DNA复制作用，所以对牛乳头皮肤纤维瘤呈现良好的治疗 效果，可使瘤体在一周内发生萎缩、老化、体积变小；停药后6周内这些 老化的瘤体仍可继续老化，第4、5周分别有老化的瘤体脱落；同时未发现 格尔德霉素对乳头皮肤发生损害。
2.药物体外抗病毒活性方面：
格尔德霉素在细胞培养内有广谱抗病毒作用，对多种DNA、RNA病毒 都有在微摩尔水平的抗病毒活性，其中对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的 治疗指数为3763，对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的治疗指数为230，对 水疱性口炎病毒(VSV)的治疗指数为833，对脊髓灰质炎病毒1型(Polio-1) 的治疗指数为2820，对柯萨奇病毒(Cox B3)的治疗指数为248，对SARS 冠状病毒的治疗指数为88，对人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的治疗指数 为1111。
在体外HSV-1格尔德霉素耐药毒株的训练中，用细胞实验法，将HSV-1 在非洲绿猴肾细胞(VERO)内及一定浓度格尔德霉素条件下连续传41代， 未见产生格尔德霉素的耐药毒株，HSV-1格尔德霉素耐药训练第15代与野 株具有相同的阿昔洛韦敏感性。对细胞无毒浓度格尔德霉素可特异抑制 HSV-1DNA合成。
3.格尔德霉素在小鼠体内抗疱疹病毒2型(HSV-2)阴道炎药效检测 方面：
格尔德霉素在HSV-2阴道感染模型内，可有效抑制HSV-2的复制。疱 疹病毒原液感染时，格尔德霉素可延长HSV-2感染小白鼠的平均生活日； 1/30稀释的疱疹病毒液感染时，可显著降低小白鼠的死亡率，延长感染小 白鼠的平均生活日，并降低小白鼠阴道内HSV-2排出量，与对照相比，差 别显著，效果优于相同剂量的无环鸟苷(ACV)：并且通过对小白鼠体重的 观察，表明格尔德霉素所有剂量组对小白鼠体重增长无影响。
下面是针对本发明格尔德霉的有关实验。
(1)针对本发明格尔德霉素进行的药物对乳牛乳头皮肤纤维瘤的治 疗作用
上已述及人乳头瘤病毒体外培养困难，亦无合适的动物模型，只能采 用同类病毒牛乳头瘤病毒引起的乳牛乳头皮肤纤维瘤作为模型评价格尔德 霉素治疗乳头瘤病毒感染疗效。
观察药物格尔德霉素(C-3559)对犊牛股内侧皮肤的刺激作用
一.动物：北京黑白花乳牛6日龄公犊1头，牛号97026。
二.药品：C-3559药液，由医学科学院医药生物技术研究所研制提供。 检测单位：中国农业大学动物医学院。
三.实验方法：选临床健康的北京黑白花公犊牛1头。于右后肢股内 侧皮肤上选取3×3cm2面积两块，在每块皮肤上每日两次分别涂以浓度分 别为0.5mg/ml和0.25mg/ml的C-3559药液；左后肢相应部位选取同样大 小的皮肤面积，每日两次涂以C-3559的溶剂(不含药液的10％吐温80)， 作为对照。实验连续进行7天。
四.观察项目：自实验开始前3天，每天两次(上午8:00，下午3:00) 测量受试牛体温，观察用药部位皮肤有无红、肿、热、痛及机能障碍；有 无起疱、破溃、坏死、结痂等病变，逐项做好记录。以确定C-3559药液 对犊牛皮肤的生物学作用。
五.实验结果
1.皮肤颜色及变化：通过7天实验，不论左后肢股内侧对照皮肤还 是右后肢相应部位的皮肤均未发生颜色变化，也未发生起疱、溃疡等，与 未涂药部位皮肤无区别。
2.在实验期内，犊牛采食，饮水及精神状态正常，体温波动于38.8 -39.5℃之间(正常体温为38.0-39.5℃)。
六.小结：
1.连续7天在犊牛股内侧皮肤涂抹0.5mg/ml及0.25mg/ml的C-3559 药液，未见皮肤发生任何病变，说明该药物浓度对犊牛股内侧皮肤无刺激 作用。
2.在实验期内，受试犊牛采食、饮水、体温、呼吸及精神状态均正 常。
药物格尔德霉素(C-3559)对乳牛乳头皮肤纤维瘤治疗实验
一.动物：将临床患病牛随机分为2组，每组6头，其中一组作为实 验组，另一组作为对照组。
二.药品：C-3559药液及其溶剂(10％吐温80)，由医学科学院医药 生物技术研究所研制，提供浓度为0.5mg/ml，溶剂为配制C-3559药液的 溶剂，不含药物成分。
三.实验方法：将牛群中自然发病的乳牛从原有班组调出，集中饲养， 使实验组与对照组条件一致，即：饲养环境、饲养方式、饲草、饲料的数 量与质量基本一致。两组奶牛由同一饲养员、挤奶员负责管理，实行手工 挤奶、乳牛每日上槽三次，在上槽采食的同时进行挤奶，每次挤奶之后立 即将药物和溶剂分别涂抹于实验牛和对照牛乳头皮肤的肿瘤上，为安全起 见所挤牛奶全部废弃，实验连续进行7天。
四.观察与记录：在实验开始前3天，每日两次测量两组牛体温，直 至实验结束。逐日统计受试牛及实验牛病变情况——肿瘤发生的部位、瘤 体大小(用卡尺测量)。性状、颜色，有无脱落迹象等。作好记录。
五.实验结果
表1 C-3559治疗乳牛乳头纤维瘤的效果
*指肿瘤基部直径。
实验表明，C-3559药液有控制乳头纤维瘤生长的作用，能够促使瘤体 老化，面积缩小。在历时7天的实验中，处于生长阶段的纤维瘤不但没有 增大，平均直径反而缩小了12.5％，颜色由原来的皮肤色变为棕色，说明 发生了老化。对照组瘤体颜色无变化，平均直径增加了4.1％，说明瘤体处 于生长阶段，未发生老化。
为了确定C-3559药液对奶牛乳头皮肤纤维瘤的远期疗效，在前期(实 验开始后7天内)观察的基础上，我们对实验组和对照组牛只进行了连续 6周的观察，方法是每周对肿瘤的大小进行测量，对颜色及脱落与否等情 况进行记录，结果如下：
实验组的93084号(实验前瘤体已为棕黑色)、92002号两头奶牛的瘤 体分别于第4周和第5周脱落，其它4头奶牛的瘤体虽未脱落，但直径总 和由原来的14.6mm减少到12.7mm，减少12.3％，其中93070号奶牛的瘤 体由原来的3.1mm缩小到2.4mm，颜色由原来的棕色变为棕黑色。对照组 中除93046号奶牛的瘤体(实验前已为棕黑色)于第5周脱落外，其它5 头奶牛的瘤体颜色均未发生改变，仍为皮肤色，而且瘤体直径的总和由原 来的20.8mm增加到26.4mm，其中93073号奶牛的瘤体直径仍为6.3mm 外，其它4头的瘤体均有不同程度的增大，说明这些瘤体仍处于生长阶段。
以上结果说明，C-3559药液除在连续用药期能使瘤体发生老化外；停 药后6周这些老化的瘤体仍可继续老化(直径缩小)，除了实验组(93084 号)和对照组(93046号)各一头乳牛在实验前已发生老化的瘤体(棕黑 色)脱落外，实验组另一头乳牛(92002号)的瘤体也发生脱落，而对照 组其它乳牛的瘤体不但未老化，仍在继续生长(直径变大)。
六.讨论
牛皮肤纤维乳头状瘤病(Fibropapillomatosis)又名疣(Warts)是由牛 乳头状瘤病毒(Bovine papilloma Virus)引起的一种良性瘤。病毒的基因 组为双股环状DNA。该病为乳牛的常见病、多发病，个别牛群的发病率 可达30％以上。生长于乳头皮肤的瘤体，尤其呈指状生长者，其长度往往 可达1.5——2cm，挤奶时奶牛不适，甚至疼痛。瘤体在遭受继发感染的情 况下，可发生溃疡。该病有瘤体发生、生长、老化、脱落等自然阶段，这 一过程往往需要10个月或更长的时间。
七.小结
由于C-3559药液有抑制病毒DNA复制作用，所以对牛乳头皮肤纤维 瘤呈现良好的治疗效果，可使瘤体在一周内发生萎缩，老化，体积变小。 停药后6周这些老化的瘤体仍可继续老化(直径缩小)，除了实验组(93084 号)和对照组(93046号)各一头乳牛在实验前已发生老化的瘤体(棕黑 色)脱落外，实验组另一头乳牛(92002号)的瘤体也发生脱落，而对照 组其它乳牛的瘤体不但未老化，仍在继续生长(直径变大)。
实验中未发现该种药物对乳头皮肤发生损害。
(2)针对本发明格尔德霉素进行的药物体外抗病毒活性。
一.格尔德霉素的抗病毒谱 研究C-3559在细胞内对单纯疱疹病毒 1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)、人免疫缺陷病毒1型、水 疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒(Cox B3)、脊髓灰质炎病毒1型Polio-1、 SARS冠状病毒SARS-coronavirus、流感病毒甲型Influenza A及流感病毒 乙型Influenza B的抑制作用。
材料：
(1)病毒株：单纯疱疹病毒1型(HSV-1)SM44株、单纯疱疹病毒 2型(HSV-2)333株、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)IIIB株、水疱性口 炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒(Cox B3)、流感甲型病毒A/粤防/243/72株、 流感病毒乙型济防97-13株均为本室保存毒株；脊髓灰质炎病毒1型Polio-1 购自中国生物制品检定所；冠状病毒SARS-coronavirus为非典期间北京分 离的流行株。
(2)细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，狗肾传代细胞(MDCK)，由中 国医学科学院医药生物技术研究所保存；非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)由军 科院五所惠赠。
方法：
(1)毒种制备：
①取出低温冻存的试验病毒毒种，用细胞维持液作10倍稀释，然后接 种于已经长满单层细胞瓶内，置37℃温箱中培养，逐日观察病变， 待3/4细胞出现病变时，收获病毒，-20℃冻存。
②将细胞反复冻融三次，释放病毒。然后离心(3000rpm，10min)去除 细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。分装，冻存于-80℃备用。
(2)细胞传代：在长满细胞的培养瓶内加0.25％胰酶0.2ml，0.02％EDTA 5ml，37℃消化20-25分钟，吸出消化液，加培养液吹打，1∶3传代，置37 ℃培养箱中培养。
(3)C-3559对病毒的抑制实验：
每毫升20-30万个细胞接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃5％CO2培养24小时，弃培养液，加入100TCID50的病毒37℃5％CO2吸附1小 时，弃去病毒液后加入C-3559连续2倍稀释液，同时设细胞对照，病毒 对照，阳性药对照。将培养板置于37℃5％CO2培养箱培养，待病毒对照 组细胞病变达4时(约32小时)，观察细胞病变，完全破坏为4；75％为 3；50％为2；25％为1；无病变为0。按Reed and Muench法计算IC50。
结果：
表2 格尔德霉素在细胞内抗病毒的IC50*值
Virus cell IC50(μM) 治疗指数
TD50#/
CPE PFU p24
IC50
HSV-1 Vero 0.093 3763
HSV-2 Vero 1.52 230
VSV Vero 0.42 833
Polio-1 Vero-E6 0.03 2820
Cox B3 Vero 1.41 248
SARS Vero-E6 0.96 88
HIV-1 0.036 1111
Influ.A MDCK -
Influ.B MDCK -
IC50*：抑制50％细胞病变的药物剂量
TD50#：引起50％细胞毒性的药物剂量
二.体外HSV-1格尔德霉素耐药毒株的训练方法及结果：
同上述细胞实验法，将HSV-1在VERO细胞内及一定浓度GA条件下 连续传41代，未见产生GA的耐药毒株(表3)。
表3 训练HSV-1格尔德霉素耐药毒株情况
耐药训练代数 IC50(μM)
GA耐药训练株 野株
4 0.79 0.79
10 1.19 1.17
15 2.67 2.23
20 1.50 2.00
31 0.69 1.23
36 0.78 1.33
41 2.22 1.24
HSV-1 GA耐药训练第15代与野株具有相同的阿昔洛韦敏感性。
三.格尔德霉素对HSV-1 DNA的抑制作用(Southern blot检测病毒DNA 复制)方法：
Vero单层细胞用HSV-1(1噬斑单位/细胞)感染，吸附1h后用冰冷 的PBS洗去未吸附的病毒，加入含4μM格尔德霉素(GA)或不含GA的 培养基，置37℃，5％CO2培养箱中培养。同时设细胞对照组和溶剂1％ 二甲基亚砜的感染对照组。在感染后12h收集细胞，将药物处理后的细胞 约2×107个，用PBS洗两次，加入500μl细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，1％SDS，500μg/ml蛋白酶K)56℃消 化2小时，加入500μl酚抽提一次，水相用酚∶氯仿∶异戊醇(50∶48∶ 2)抽提一次，水相置于新的离心管，加入50μl 3M NaAc(pH 5.2)和1ml 预冷无水乙醇，-20℃沉淀2小时，4℃10000g离心20分钟，预冷70％ 乙醇洗一次，离心去上清，风干，溶于100μl TE中。每管加入终浓度为100 μg/ml无DNA酶的RNA酶，37℃水浴20分钟，取10μg DNA与1/6体 积6×上样缓冲液混匀，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将其转到 硝酸纤维素膜上，80℃干烤1小时后，在68℃预杂交液(5×SSC，0.1％SDS， 5×Denhardt’液，100μg/ml变性鲑鱼精DNA，and 50％甲酰胺)中预杂 交4hrs，然后在含有5×107cpm 32P脱氧胞嘧啶核苷三磷酸标记的HSV-1 胸腺嘧啶核苷激酶(tk)DNA的预杂交液中42℃杂交24hrs。杂交完毕，硝 酸纤维素膜用洗膜液(0.1×SSC，0.1％SDS)室温洗三次，65℃洗两次， 夹上X光片后-20℃放射自显影。按常规方法显影、定影，最后分析条带。 结果见图1为1细胞对照，2 HSV-1感染对照，3 DMSO对照，4 GA 4μM；
图1说明经4μM GA处理的感染细胞与细胞对照一样，无病毒DNA 条带。
(3)针对本发明格尔德霉素进行的药物体内抗疱疹病毒2型(HSV-2) 阴道炎药效检测报告。
一.目的：研究C-3559体内对小白鼠HSV-2阴道炎的治疗作用：观 察小白鼠的平均生活日和死亡率，并进行病毒分离。
二.动物：昆明鼠雌性，13-15g，购自中国生物制品检定所为中国药 品生物制品检定啮齿类动物养殖中心提供的二级动物(有健康证书)，随 机分组。
三.病毒：疱疹病毒2型(HSV-2)SAV株，本室传代保存，用病 毒原液或1/30病毒原液感染。
四.药物：C-3559由本所化学室提供，纯度大于95％，用少许0.1％吐 温-80 200μl解后加到乳钵中，边研磨边加溶剂，配成4mg/ml，2mg/ml， 1mg/ml，0.5mg/ml的悬液，4℃保存。
五.方法：
1.分组：将体重为13-15g的雌性昆明鼠随机分为C-3559 5.72mg/kg、 2.86mg/kg、1.43mg/kg、0.5mg/ml组及阳性药ACV2.86mg/kg对照组，溶 剂(0.1％吐温-80)对照组，病毒对照组，每组10只小白鼠，以上为感染组； 以C-3559 5.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg、0.72mg/ml组及阳性药ACV 2.86mg/kg对照组，溶剂对照组，正常对照组，每组6只，为非感染组， 观察药物对小白鼠的毒性。
2.给药方式：用微量移液器向小白鼠阴道内注入每浓度20μl药物， 病毒对照组和正常对照组均注入生理盐水，每日三次。
3.感染方式：用微量加样器向感染组小白鼠阴道内注入20μl 1/30稀 释的病毒液或病毒原液，非感染组注入20μl生理盐水进行相同的处理， 然后开始给药。
4.观察指标：
观察死亡率、平均生活日，每日观察，记录死亡，共2周，计算死亡 率及平均生活日。
5.病毒分离实验方法：将体重为13-15g的雌性昆明鼠随机分为C-3559 5.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg组及阳性药ACV 2.86mg/kg对照组，溶 剂对照组，病毒对照组，每组6只小白鼠，用微量加样器向小白鼠阴道内 注入20μl 1/30稀释的病毒液感染，于感染后即刻给药，每日三次，在感染 后48及96小时，将用培养液润湿的棉签插入小白鼠阴道内拭擦，然后将 棉拭放入盛有1ml培养液的小试管中，挤出棉拭中的液体即为标本，在长 满单层Vero细胞的96孔培养板上进行TCID50滴定。
六.结果：
HSV-2的感染导致小白鼠在感染后大约第三天可见发病即阴道红肿并 有分泌液流出，后期也有后肢瘫痪，在第5、6天开始死亡。
第一批实验用病毒原液感染，2.86mg/ml组和ACV组可显著增加小白 鼠的平均生活日(P＜0.05)，结果见表4。C-3559的三个剂量组对小白鼠体 重的增加与正常对照组相比无明显差异，结果见表3。
第二批实验用1/30的病毒液感染，各剂量组和ACV组均能显著延长 感染小白鼠的平均生活日，并能显著提高感染组小白鼠的存活率(P＜0.01)。 结果见表5。给药组小白鼠体重的增加与正常对照组小白鼠体重的增加无 统计学上的差异(P＞0.05)，且1mg/ml剂量组小白鼠体重增加比正常对照 组小白鼠多，二者之间有统计学差异(P＜0.01)。结果见表6及表7。
HSV-2感染后48及96小时，分离小白鼠阴道病毒，滴定TCID50的结 果见表8及表9，结果表明C-3559三个剂量组均可有效降低小白鼠阴道 内HSV-2排出量，与对照组相比有显著差别。
表4 C-3559对HSV-2阴道感染的疗效(病毒原液感染) 组别 每组鼠数 成活数(％) 平均生活日 病毒对照 10 0 5.8 溶剂对照 10 0 6.2 0.72mg/kg 10 0 6.5 1.43mg/kg 10 0 7.1 2.86mg/kg 10 0 7.8* ACV 2.86mg/kg 10 0 7.8*
*P＜0.05
表5 C-3559对HSV-2阴道感染的疗效(1∶30病毒液感染) 组别 每组鼠数 成活数(％) 平均生活日 病毒对照 10 2(20) 7.6 溶剂对照 10 1(10) 7.5 1.43mg/kg 10 8(80)** 12.8** 2.86mg/kg 10 8(80)** 12.7** 5.72mg/kg 10 10(100)** 14** ACV 2.86mg/kg 10 6(60) 11.7*
*P＜0.05，**P＜0.001
表6.非感染组小鼠0day，7days，14days体重结果(第一批试验) 组别 天数 体重(g) 平均 正常对照 0days 15.05 13.28 15.2 14.76 14.96 14.65±0.7 7days 19.48 18.68 21.47 20.92 20.16 20.14±1.0 14days 24.97 26.28 27.76 25.42 28.02 26.49±1.2 ACV 0days 16.15 15.94 13.53 15.95 14.38 15.19±1.1 7days 22.58 18.84 22.23 20.43 20.28 20.87±1.4 14days 24.03 28.03 27.39 24.27 28.46 26.44±1.9 C-3559 0.72 mg/kg 0days 12.55 12.46 12.4 13.47 13.91 12.96±0.6 7days 19.87 20.32 20.97 21.35 21.33 20.77±0.6 14days 28.9 29.88 27.35 24.82 29.86 28.16±1.9 C-3559 1.43 mg/kg 0days 16.03 14.84 15.86 16.65 15.61 15.80±0.6 7days 21.16 22.31 20.93 21.84 20.13 21.27±0.8 14days 29.28 30.78 24.72 26.9 27.96 27.93±2.1 C-3559 2.86 mg/kg 0days 15.89 14.7 16.03 15.06 16.84 15.70±0.8 7days 20.52 22.85 21.97 21.7 18.83 21.17±1.4 14days 26.67 28.12 30.2 26.32 29.17 28.10±1.5
注：7天，14天所有给药组与正常对照组体重相比均无明显差异，无统计学意义。
表7.非感染组小鼠0day，7days，14days体重结果(第二批实验) 组别 天数 体重(g) 平均 正常对照 0days 16.26 14.3 15.22 14.48 14.86 14.84 14.99±0.6 7days 20.92 21.72 22.68 21.05 20.2 20.67 21.21±0.8 14days 27.92 27.16 26.1 29.08 27.63 26.13 27.34±1.0 ACV 0days 14.6 15.6 16.21 17.31 16.96 13.3 15.66±1.4 7days 21.8 22.3 22.41 24.98 20.75 23.35 22.60±1.3 14days 27.17 30.76 24.47 27.67 25.7 26.79 27.09±1.9 C-3559 1.43 mg/kg 0days 15 15.93 14.43 16.74 16.53 15.26 15.65±0.8 7days 20.62 22.66 25.43 22.34 25.16 24.92 23.52±1.8* 14days 29.54 29.28 31.08 32.25 28.62 28.22 29.83±1.4** C-3559 2.86 mg/kg 0days 16.54 13.9 15.48 16.97 15.17 14.17 15.37±1.1 7days 24.43 23.62 21.92 21.14 24.04 21.07 22.70±1.4 14days 28.91 26.2 28.22 27.67 29.02 24.8 27.47±1.5 C-3559 5.72 mg/kg 0days 15.86 16.45 17.27 15.83 14.56 14.75 15.79±0.9 7days 20.82 22.97 21.56 25.84 24.29 20.79 22.71±1.9 14days 27.91 30.38 30.05 26.17 29.73 28.75 28.83±1.5
注：7天，14天所有C-3559高、中给药组和ACV给药组与正常对照组体重相 比均无明显差异，无统计学意义，而C-3559 1mg/ml组比正常对照组体重增加 得多，二者差异显著
(7days P＜0.05，14days P＜0.01)。
表8 HSV-2 SAV株感染小白鼠48hrs后阴道分离病毒结果 组别 病毒原液 -1 -2 -3 -4 -5 TCID50 平均 病毒对照1# 4 4 4 4 10-3.5 10-3.3 病毒对照2# 4 4 4 4 2 10-4 病毒对照3# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照4# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照5# 4 4 4 2 10-3 病毒对照6# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照1# 4 4 4 10-2.5 10-2.9 溶剂对照2# 4 4 2 2 10-2.5 溶剂对照3# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照4# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照5# 4 4 4 4 4 10-4.5 溶剂对照6# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 1# 4 4 4 10-2.5 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 3# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 ACV 2.86mg/kg 5# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 6# 4 4 4 4 10-3.5 C-3559 1.43mg/kg 1# 4 4 4 10-2.5 10-1.3 C-3559 1.43mg/kg 2# 0 C-3559 1.43mg/kg 3# 4 4 4 4 10-3.5 C-3559 1.43mg/kg 4# 0
C-3559 1.43mg/kg 5# 4 4 10-1.5 C-3559 1.43mg/kg 6# 0 C-3559 2.86mg/kg 1# 0 10-1.1 C-3559 2.86mg/kg 2# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 3# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 4# 4 4 2 10-2 C-3559 2.86mg/kg 5# 4 10-0.5 C-3559 2.86mg/kg 6# 0 C-3559 5.72mg/kg 1# 0 10-0.4 C-3559 5.72mg/kg 2# 0 C-3559 5.72mg/kg 3# 0 C-3559 5.72mg/kg 4# 4 4 4 10-2.5 C-3559 5.72mg/kg 5# 0 C-3559 5.72mg/kg 6# 0
表9 HSV-2 SAV株感染小白鼠96hrs后阴道分离病毒结果 组别 病毒原液 -1 -2 -3 -4 -5 TCID50 平均 病毒对照1# 4 4 4 4 10-3.5 10-3.3 病毒对照2# 4 4 4 2 10-3 病毒对照3# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照4# 4 4 4 10-2.5 病毒对照5# 4 4 4 4 10-3.5 病毒对照6# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照1# 4 4 4 2 10-3 10-3.4 溶剂对照2# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照3# 4 4 4 4 4 10-4.5 溶剂对照4# 4 4 4 10-2.5 溶剂对照5# 4 4 4 4 10-3.5 溶剂对照6# 4 4 4 4 10-3.5 ACV 2.86mg/kg 1# 4 4 10-1.5 10-1.9 ACV 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 ACV 2.86mg/kg 3# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 4# 4 4 10-1.5 ACV 2.86mg/kg 5# 4 4 2 10-2 ACV 2.86mg/kg 6# 4 4 4 10-2.5 C-3559 1.43mg/kg 1# 4 4 10-1.5 10-1.3 C-3559 1.43mg/kg 2# 0 C-3559 1.43mg/kg 3# 4 4 4 4 2 10-4 C-3559 1.43mg/kg 4# 0 C-3559 1.43mg/kg 5# 4 4 4 10-2.5 C-3559 1.43mg/kg 6# 0 C-3559 2.86mg/kg 1# 0 10-1.3 C-3559 2.86mg/kg 2# 4 4 4 10-2.5 C-3559 2.86mg/kg 3# 4 4 4 10-2.5 C-3559 2.86mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 C-3559 2.86mg/kg 5# 0 C-3559 2.86mg/kg 6# 0 C-3559 5.72mg/kg 1# 0 10-0.5 C-3559 5.72mg/kg 2# 0 C-3559 5.72mg/kg 3# 0 C-3559 5.72mg/kg 4# 4 4 4 2 10-3 C-3559 5.72mg/kg 5# 0 C-3559 5.72mg/kg 6# 0
结论：
C-3559在HSV-2阴道感染模型内，可有效抑制HSV-2的复制。病毒 原液感染时，延长HSV-2感染小白鼠的平均生活日，有统计意义；1/30稀 释的病毒液感染时，可显著降低小白鼠的死亡率，延长感染小白鼠的平均 生活日，有统计意义，并降低小白鼠阴道内HSV-2排出量，感染后48小 时5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg组与对照组相比病毒排出量分别降 低794，158及100倍；感染后96小时5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg 与对照相比病毒排出量分别降低631，100及100倍，效果优于相同剂量 的ACV。通过对小白鼠体重的观察，表明C-3559所有剂量组对小白鼠体 重增长无影响。
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