染色试剂盒及其制备方法、染色方法、用途
专利汇可以提供染色试剂盒及其制备方法、染色方法、用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 染色 试剂 盒 及其制备方法、染色方法和在一张 宫颈 刮片上对癌变细胞、红血球、弯曲活菌、 阴道 清洁度、雌 激素 水 平、加德纳氏菌、滴虫、霉菌、淋病双球菌、沙眼衣原体等多个项目的检测中的应用。本发明试剂盒由固定液、染色液、分化液组成，染色方法的步骤是固定、染色、分化、水洗。本发明的优点是，制片速度快，仅需两分钟；准确率高，全诊断准确率可达98％；设备简单操作简便，可在 手术室 现场， 内窥镜 室现场，防癌及性传播 疾病 普查现场进行； 费用 低廉，适合国情，便于推广；染色效果良好，还因用固定脱水剂少，显得细胞较大，伸展良好，形态自然， 变形 轻微，尤其是分化差的 肿瘤 细胞，恶性特征突出，易于诊断。，下面是染色试剂盒及其制备方法、染色方法、用途专利的具体信息内容。
1.一种染色试剂盒，由固定液、染色液、分化液组成，
其中固定液：含50％无水甲醇和50％无水乙醇(体积百分比)，
染色液：含瑞氏粉0.5-1.5g，姬姆萨氏粉0.5-1.5g，天青II0.2-0.6g，甘 油33-100ml，甲醇(AR)600-900ml。
分化液：无水磷酸二氢钾6-7g，无水磷酸氢二钠2.5-3g，蒸馏水1000ml。
2.权利要求1染色试剂盒的制备方法为：
制备固定液：将50％无水甲醇和50％无水乙醇(体积百分比)等量相加后 即可使用，
制备染色液：将0.5-1.5g瑞氏粉和0.5-1.5g姬姆萨氏粉同放于洁净的乳 钵内，加入少量甲醇充分研磨后，吸取上层液，再加入少量甲醇，继续研磨， 再吸上层液，如此连续数次，直至将乳钵内染剂充分研溶洗净，到入棕色玻 璃瓶中，加入天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，补足甲醇至600-900ml。每 日充分摇动一次，共一周，再存放一周后过滤，用棕色磨口玻璃瓶贮存备用。
制备分化液：无水磷酸二氢钾6-7g，无水磷酸氢二钠2.5-3g，加蒸馏水 1000mL，用磷酸盐调整PH值为PH6.4-6.8即可。
3.权利要求1的染色试剂盒的染色方法，其步骤为：
固定：在宫颈刮片上滴固定液7-10滴，固定21-30秒，侧动玻片倒去固 定液。
染色：滴染色液1-4滴，将染液铺盖标本，染5-8秒钟。
分化：立即滴加分化液4-14滴，轻轻转动玻片，使之与染色液混均， 分化30-38秒。
水洗：用细小流水缓缓冲去残液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，湿片镜 检。
4.根据权利要求3所述的染色方法，其步骤为：
固定：在宫颈刮片上滴固定液4-10滴，固定15-30秒，侧动玻片倒去固 定液。
染色：滴染色液2-3滴，将染液铺盖标本，染5-8秒钟。
分化：立即滴加分化液8-12滴，轻轻转动玻片，使之与染色液混均， 分化30-38秒。
水洗：用细小流水缓缓冲去残液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，湿片镜 检。
5.权利要求1的染色试剂盒在一张宫颈刮片上对癌变细胞、红血球、弯 曲活菌、阴道清洁度、雌激素水平、加德纳氏菌、滴虫、霉菌、淋病双球菌、 沙眼衣原体等多个项目的检测中的应用。
(一)技术领域：
本发明涉及一种染色试剂盒及其制备方法、染色方法和在生殖道感染 /性传播疾病的快速多项病原体及细胞学检查中的应用。
(二)背景技术：
传统的染色方法为巴氏及HE，属世界著名的细胞病理学染色法，其固 定时间长，染色时间长，染色步骤多，报告速度慢，工作人员多，日阅片量 少，成本高，操作复杂，费人、费时、费钱。
姬姆萨(Giemsa)快速染色法。Bryon-PA(Patnol Biol 9aris 1996；24(1)：75-9) 曾报告将Giemsa快速染色法用于骨髓涂片检查。1977年Thatcher-RW等又 用于眼结膜细胞学检查，1978年Howell-WM(HumGenet.1978；43(1)：53-6)用 于细胞染色体检查。同年，国内学者金树贞等用于快速细胞学诊断恶性肿瘤， 1981年笔者也用于快速肿瘤细胞诊断。其染色速度快，仅需3分钟，对细胞 核着色较好，但对细胞浆及细胞膜和其中的中性颗粒则染色较差。
甲等胺蓝酒精液快速染色法，1978年国内学者龙净(新医学，1978；(8)： 416)曾用此方法染肿瘤组织印片，对手术中肿瘤进行诊断；1980年唐立吾 (中华医学检验杂志，1980；3(1)：42)亦以该液用于细胞学检查。其染 色快速，仅需3分钟，但分色较差，细胞结构不够清晰。
Diff-Quik快速染色法，1984年Kass LG(NEW York：IGAkusHOIN，1984；15：46)用于穿刺涂片检查。1989年Tollerud DJ{chest、 1989；95(37：494-7)}用于爱滋病患者肺束囊虫鉴定。其染色快速，仅需2分钟， 但价格昂贵。
瑞氏-姬姆萨混合染色(《血液病学》王凤计主编，天津科学技术出版社， 1990年出版)主要用于血涂片检查，染色方法为：选用瑞氏液染色25分钟， 除去瑞氏染液，再用姬姆萨染液染色4分钟。用自来水冲洗后，置空气中自 行干燥即可。瑞氏染液对胞浆着色良好。姬姆萨液则对核着色良好。该法染 色速度较慢，需用30多分钟。
对非淋菌性泌尿道感染，传统的分离培养法耗时过长，微量免疫荧光法 不十分标准化，国际通过SyV2试剂昂贵，均不易推广
(三)发明内容：
本发明的目的在于提供一种快速染色多功能试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种本发明试剂盒的制备方法。
本发明的进一步的目的在于提供一种本发明试剂盒的染色方法。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒在一张宫颈刮片上对癌变细胞、 红血球、弯曲活菌、阴道清洁度、雌激素水平、加德纳氏菌、滴虫、霉菌、 淋病双球菌、沙眼衣原体等多个项目的检测中的应用。以适应生殖道感染/ 性传播疾病的快诊快治，并解决量大面宽的计划生育的“生殖道感染干预工 程”的急切问题，以实现对癌瘤患者早诊早治的技术目标。
本发明的WG法，即将瑞氏(Wright)法与姬姆萨(Giemsa)快速染色 法结合后的方法的简称。
本发明的染色试剂盒，由固定液、染色液、分化液组成，
其中固定液：含50％无水甲醇和50％无水乙醇(体积百分比)，
染色液：含瑞氏粉0.5-1.5g，姬姆萨氏粉0.5-1.5g，天青II0.2-0.6g，甘 油33-100ml，甲醇(AR)600-900ml。
分化液：无水磷酸二氢钾6-7g，无水磷酸氢二钠2.5-3g，蒸馏水1000ml。
本发明的染色试剂盒的制备方法为：
制备固定液：将50％无水甲醇和50％无水乙醇(体积百分比)等量相加后 即可使用，
制备染色液：将0.5-1.5g瑞氏粉和0.5-1.5g姬姆萨氏粉同放于洁净的乳 钵内，加入少量甲醇充分研磨后，吸取上层液，再加入少量甲醇，继续研磨， 再吸上层液，如此连续数次，直至将乳钵内染剂充分研溶洗净，到入棕色玻 璃瓶中，加入天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，补足甲醇至600-900ml。每 日充分摇动一次，共一周，再存放一周后过滤，用棕色磨口玻璃瓶贮存备用。
制备分化液：无水磷酸二氢钾6-7g，无水磷酸氢二钠2.5-3g，加蒸馏水 1000ml，用磷酸盐调整PH值为PH6.4-6.8即可。
本发明的的染色试剂盒的染色方法，其步骤为：
固定：在宫颈刮片上滴固定液7-10滴，优选4-10滴；固定21-30秒， 优选15-30秒；侧动玻片倒去固定液。
染色：滴染色液1-4滴，优选2-3滴；将染液铺盖标本，染5-8秒钟。
分化：立即滴加分化液4-14滴，优选8-12滴；轻轻转动玻片，使之与 染色液混均，分化30-38秒。
水洗：用细小流水缓缓冲去残液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，湿片镜 检。
病理细胞学及病原体诊断，贵在准快，非此难以使生殖感染及癌瘤患者 获得早诊早治，而快速诊断的技术关键，是要有一个快速的染色方法。本发 明WGRS一分钟染色法，达到了快速、准确、简单、廉价、检查项目多的 医学检测方法，它将两个检查重点(癌变细胞+病原体)相结合，形成既用 于防癌普查又能用于生殖道感染性疾病检查的“宫颈刮片快十项”，即可以 在一张宫颈刮片上对癌变细胞、红血球、弯曲活菌、阴道清洁度、雌激素水 平、加德纳氏菌、滴虫、霉菌、淋病双球菌、沙眼衣原体等多个项目的检测。
对WG染色下恶性肿瘤细胞形态学特征，从细胞病理学角度，对各种肿 瘤细胞进行快速定性诊断，已经过手术室、内窥镜室、防癌及性传播疾病普 查现场的13346例的临床检查验证。
对生殖道感染性疾病，在WG染色下，可以清楚显示生殖道感染/性传 播疾病的各种病原体的形态特征，通过12205例宫颈刮片检查结果表明，可 以快速诊断引起生殖道感染的多种疾病。如细菌性阴道炎、淋病性阴道炎、 非淋病性阴道炎、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎等。
下表以巴氏染色12531例，HE染色13746例，WG快速染色10185例 的宫颈刮片作对比观察，其对比结果如附表所示： 比较项目 巴氏(简化) HE(简化) WG快速 固定时间 15分钟 15分钟 半分钟 染色时间 60分钟 30分钟 半分钟 染色步骤 14步，封固后镜检 7步，同左 3步，不封固，湿片镜检 报告速度 约半天 约半天 约2分钟 工作人员 2 2 1 日阅片量 50例左右 50例左右 100例左右 成本比例 20： 10： 1
经过了三万多例的检查验证，证明该方法突出的优点是：1.制片速度快， 仅需两分钟；2.准确率高，全诊断准确率可达98％；3.设备简单操作简便， 可在手术室现场，内窥镜室现场，防癌及性传播疾病普查现场进行；4.费用 低廉，适合国情，便于推广；5.染色效果良好，能清楚地显示子宫阴道上皮 的细胞层次，细胞级别和雌激素水平的影响程度，还因用固定脱水剂少，显 得细胞较大，伸展良好，形态自然，变形轻微，尤其是分化差的肿瘤细胞， 恶性特征突出，易于诊断。
随着本发明的普遍推广应用，将为广大育龄妇女的生殖健康和适应量大 面宽的“生殖道感染干预工程”的实施起到推动作用。
(五)具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任 何方式限制本发明。
实施例1：
取50％无水甲醇和50％无水乙醇(体积百分比)等量相加后作为固定液；
将瑞氏粉1.5g和姬姆萨氏粉1.5g，同放于洁净的乳钵内，加入少量甲醇 充分研磨后，吸取上层液，再加入少量甲醇，继续研磨，再吸上层液，如此 连续数次，直至将乳钵内染剂充分研溶洗净，到入棕色玻璃瓶中，加入天青 II0.6g，甘油100ml，补足甲醇至900ml作为染色液。每日充分摇动一次， 共一周，再存放一周后过滤，用棕色磨口玻璃瓶贮存备用。
取无水磷酸二氢钾7g，无水磷酸氢二钠3g，加蒸馏水1000ml作为分化 液，用磷酸盐调整PH值为PH6.8即可。
试剂盒组成(50人份)，固定液20ML一瓶，染色液10ML一瓶，分化 液20ML二瓶。
实施例2：
在宫颈刮片上滴固定液6滴，固定20秒钟，侧动玻片倒去固定液。滴 染色液2滴，将染液铺盖标本，染5秒钟。立即滴加分化液8滴，轻轻转动 玻片，使之与染色液混均，分化38秒钟。用细小流水缓缓冲去残液及其沉 淀物，擦去玻片背面水分，湿片镜检。
注意：1.用前必须将瓶口用针扎通，以便染液能畅通滴出。2.刮(涂) 片时，位置要适当，标本量要足，手法要轻，涂抹要薄。标本过少往往是漏 诊的主要原因。3.染色时间可根据气温，标本薄厚，适当延长，但不能缩短。 4.试剂盒应置阴凉处，最好是2-8℃冰箱内保存，有效期3-4年。
染色反应：上皮细胞呈紫红色，胞浆呈淡兰色，白细胞核呈紫红色，浆中 嗜碱性颗粒呈紫蓝色，嗜酸性颗粒呈橙红色，嗜中性颗粒微带红色，红血球 为橙红色。滴虫为淡兰色，于头部的梭性核呈淡红色。霉菌菌丝为深棕色， 芽孢显色同菌丝。衣原体为淡黄至深棕色。双球菌及加得纳氏菌为淡灰色。
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