一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用
阅读：997发布：2023-03-09
专利汇可以提供一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用。本发明的消毒制剂，包括抗菌肽GK0.00001～0.01wt％， 去污 剂0.01～2wt％，润肤剂0.1～15wt％。本发明的消毒湿巾通过体外杀菌试验，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明无毒性。消毒湿巾对SD大鼠 阴道 黏膜刺激试验结果表明，无刺激性。本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸， 皮肤 黏膜的清洁和伤口创面的消毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。特别适宜用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、尿渍、便垢等。，下面是一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种消毒制剂，其特征在于包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂0.01～2wt％，润肤剂0.1～15wt％，水余量。
2.根据权利要求1所述的消毒制剂，其特征在于所述及的抗菌肽GK具有序列表中所列氨基酸序列中的一种或一种以上。
3.根据权利要求1所述的消毒制剂，其特征在于所述及的去污剂是非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的消毒制剂，其特征在于所述及的非离子表面活性剂是20≥亲水亲油平衡值≥6的非离子表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的消毒制剂，其特征在于非离子表面活性剂为聚山梨醇酯系列。
6.根据权利要求3所述的消毒制剂，其特征在于所述及的两性离子表面活性剂是甜菜碱。
7.根据权利要求1所述的消毒制剂，其特征在于所述及的润肤剂是甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄榄油、十四酸异丙酯、油脂蜡中的一种或一种以上。
8.一种消毒湿巾，其特征在于由载体和负载于其上的权利要求1～7任一所述的消毒制剂组成。
9.根据权利要求8所述的消毒湿巾，其特征在于所述载体包括无纺材料或棉纱布。
10.根据权利要求8所述的消毒湿巾的制备方法，其特征在于包括根据下步骤：1)按比例称取称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水进行乳化，获得乳液；2)将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本发明的消毒湿巾。
11.根据权利要求8或9所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于手，脸和其它部位的皮肤及黏膜的清洁和消毒。
12.根据权利要求11所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于伤口创面的消毒。
13.根据权利要求11所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于婴儿体表的清洁和消毒。
一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种消毒制剂和消毒材料，尤其涉及一种含有抗菌肽的消毒制剂和消毒湿巾。
中国专利申请文件93103890.1公开了一种婴儿卫生湿巾，采用一种外用消毒剂醋酸双氯苯双胍己烷代替常用的含有活性氯及过氧化物的消毒剂作为杀菌活性成分，该成分杀菌活性强，有效剂量低，减少了对婴儿肌肤的刺激性，但还属于化学成分，无法彻底克服上述缺陷。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种消毒湿巾的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题公开所述消毒湿巾的应用。
本发明的发明构思是这样的：抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。由于抗菌肽是一种生物制品，在用量非常小的时候，也能产生很强的杀菌活性，对人体的皮肤黏膜刺激和毒副作用，对环境也不会造成任何影响，故而是制备消毒产品的非常好的成分。
本发明的技术方案是这样的：一种消毒制剂，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂0.01～2wt％，润肤剂0.1～15wt％，水余量。
以所述及的抗菌肽GK是具有如下序列的一组人工合成抗菌肽：Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(Al′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys lle Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)序列为抗菌肽序列的核心结构。其中A1、A1′、A1″为Lys或Arg中的一种，A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A3、A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A4、A4′、A4″为Lys或Arg中的一种。(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸，11个氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸为赖氨酸或精氨酸中的一种，11个氨基酸中第2位氨基酸为色氨酸或苯丙氨酸中的一种，11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸中的一种。
抗菌肽GK还包括以上所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
抗菌肽GK的制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。
所述及的去污剂包括非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选的为20≥HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80等以及甜菜碱等，其主要作用是去除污垢，使制剂中的活性成分充分作用于皮肤表面，有利于防止细菌的生长。
所述及的润肤剂是选自甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄榄油、十四酸异丙酯、油脂蜡中的一种或一种以上。
可将上述的消毒制剂负载于载体上，制成一种消毒湿巾，载体包括无纺材料或棉纱布。
所述及的杀菌湿巾的制备方法包括如下步骤：1、按上述比例称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水，在30℃～65℃的条件下，采用常规的方法进行乳化，获得乳液；2、将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本发明的消毒湿巾。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸，皮肤黏膜的清洁和伤口创面的消毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、尿渍、便垢等。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作为举例来进行叙述：GK-1：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg LysLeu Leu Lys
GK-2：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg ArgLeu Leu ArgGK-3：Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽的杀菌活性强于所述两种天然抗菌肽的杀菌活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、环化衍生物的抗菌肽功能等同物也进行了制备与生物活性测定，测定结果显示这些多肽的杀菌活性也基本上强于上述的天然抗菌肽的杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了合成抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明合成抗菌肽的溶血毒性极小。
消毒湿巾通过体外杀菌试验，证明它对一些主要的致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
消毒湿巾对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。结果表明，消毒湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
实施例1抗菌肽的制备及分离纯化按上述序列制备GK-1，GK-2和GK-3，同时制备cecropin A1和buforin II作为对照。
cecropin A1的序列(参见Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990，B 95(3)，551-554)：Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp GlyLeu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leubuforin II的序列(参见Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218(1)，408-413)Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg LeuLeu Arg Lys本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下：1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GK-2为例)以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK-2多肽序列为N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu LeuArg Arg Leu Leu Arg-C制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切：取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定如图1所示，制备的抗菌肽GK-2经过质谱分析，GK-2在质谱图中显示的分子量计算如下：(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934计算出GK-2的分子量为2934。由多肽序列计算出的理论值为2932.74。证明制备的多肽即为设计的GK-2抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GK-l和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用类似于GK-2抗菌肽的制备方法制备。
实施例2抗菌肽GK-1基因在大肠杆菌中的表达首先设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自AmershamPharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK-l。
实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)，所得构建基因的长度为78bp。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GK-1蛋白序列：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu Lys编码GK-1的核苷酸序列：GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAAACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG实施例3抗菌肽GK-1基因在酵母细胞中的表达本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接，后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI，XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1时酵母菌株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。
采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为84bp，同时在GK-1基因前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。
GK-1核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK-1核苷酸片断。然后用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC3’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。
编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反应30个循环。
扩增片段与质粒的连接：将GK-1的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段，与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-gkl，转化大肠杆菌DH5α后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性化重组质粒pPIC9-gst-gkl经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克隆。
转化子经过甲醇诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GST-GK-1融合蛋白序列：Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu LeuGlu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn LysLys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The GlnSer Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg AlaGlu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp ArgLeu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala LeuAsp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys ArgIle Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln GlyTrp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys TrpLys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu LysGST-GK-l核苷酸序列：TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAATATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGTCCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGATTTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTAAATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCTTTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGGCCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT实施例4合成抗菌肽的杀菌活性检测以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GK-1，GK-2和GK-3的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。
表1 五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例6体外溶血活性检测本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作为对照。使用的的血样取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的检测步骤是：4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS：35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％TritonX-100。检测结果见表2：表2 五种抗菌肽溶血活性检测结果
实施例7成人用消毒湿巾的制备1.配制100g用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-1的含量0.001g(0.001wt％)，聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)香精0.1g(0.1wt％)。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶抗菌肽GK-10.001g，聚梨山醇酯0.2g，甘油2g，羊毛酯0.5g，香精0.1g，置于配料桶中，按比例加水97.199g，在60℃下搅拌乳化形成乳液。
4.将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
实施例8婴儿用消毒湿巾的制备1、配制100用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-2的含量0.0005g(0.0005wt％)，聚梨山醇酯40含量0.15g(0.15wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，芦荟汁0.5(0.5wt％)，余量为水。
2、余下步骤参照实施例1完成。
实施例9消毒湿巾体外杀菌试验1、试验样品的制备：(1)杀菌湿巾样品：按实施例1的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
(2)对照湿巾：聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌CMCC26003，枯草杆菌DB430，大肠杆菌ATCC8099，肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，绿脓杆菌CMCC10104，白色念珠菌ATCC10231。(以上菌株来自于中国生物制品检定所)。
3、试验步骤：(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在107～108cfu/ml。
(2)将样品湿巾和对照湿巾制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到湿巾上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将湿巾投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡混匀。
(5)对照湿巾投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果表3：杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果试验菌株 杀菌湿巾 对照湿巾金黄色葡萄球菌 99.92％ 0CMCC26003，，，枯草杆菌DB430 99.98％ 0大肠杆菌ATCC8099 99.92％ 0绿脓杆菌CMCC10104 99.97％ 0白色念珠菌ATCC10231 99.56％ 0肺炎克雷伯氏菌 99.46％ 0CMCC46117实施例10动物体内急性毒性试验1、样品的制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验动物：采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例11消毒湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验1、样品制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验动物：SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组，杀菌湿巾组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌湿巾置动物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织，观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果：
表3：杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验刺激反应评分组别 动物数(只)红斑 水肿 总分消毒湿巾组 6 0 0 0赋形剂组 6 0 0 0空白对照组 6 0 0 0杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用<130>SPI028296<160>54<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>1Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>2Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>3<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>3Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa 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Xaa20<210>19<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>19Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>20<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>20Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>21Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>22<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>22Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>23<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>23Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>24<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>24Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>25<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>25Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>26<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>26Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>27<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>27Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>28<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>28Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>29<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>29Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>30Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>31<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>31Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>32<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>32Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>33<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>33Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>34Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>35<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>35Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>36<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>36Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>37Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>38<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>38Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>39<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>39Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>40<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>40Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>41<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<22 3>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>41Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>42<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>42Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>43Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>44<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>44Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>45Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>46<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>46Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa XaaXaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>47Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>48<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>48Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>49Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>50<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>50Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>51<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>51Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>52<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>52Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>53Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>54<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>54Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20
中国专利申请文件93103890.1公开了一种婴儿卫生湿巾，采用一种外用消毒剂醋酸双氯苯双胍己烷代替常用的含有活性氯及过氧化物的消毒剂作为杀菌活性成分，该成分杀菌活性强，有效剂量低，减少了对婴儿肌肤的刺激性，但还属于化学成分，无法彻底克服上述缺陷。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种消毒湿巾的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题公开所述消毒湿巾的应用。
本发明的发明构思是这样的：抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。由于抗菌肽是一种生物制品，在用量非常小的时候，也能产生很强的杀菌活性，对人体的皮肤黏膜刺激和毒副作用，对环境也不会造成任何影响，故而是制备消毒产品的非常好的成分。
本发明的技术方案是这样的：一种消毒制剂，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂0.01～2wt％，润肤剂0.1～15wt％，水余量。
以所述及的抗菌肽GK是具有如下序列的一组人工合成抗菌肽：Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(Al′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″ )Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys lle Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)序列为抗菌肽序列的核心结构。其中A1、A1′、A1″为Lys或Arg中的一种，A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A3、A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A4、A4′、A4″为Lys或Arg中的一种。(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸，11个氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸为赖氨酸或精氨酸中的一种，11个氨基酸中第2位氨基酸为色氨酸或苯丙氨酸中的一种，11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸中的一种。
抗菌肽GK还包括以上所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
抗菌肽GK的制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。
所述及的去污剂包括非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选的为20≥HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80等以及甜菜碱等，其主要作用是去除污垢，使制剂中的活性成分充分作用于皮肤表面，有利于防止细菌的生长。
所述及的润肤剂是选自甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄榄油、十四酸异丙酯、油脂蜡中的一种或一种以上。
可将上述的消毒制剂负载于载体上，制成一种消毒湿巾，载体包括无纺材料或棉纱布。
所述及的杀菌湿巾的制备方法包括如下步骤：1、按上述比例称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水，在30℃～65℃的条件下，采用常规的方法进行乳化，获得乳液；2、将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本发明的消毒湿巾。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸，皮肤黏膜的清洁和伤口创面的消毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、尿渍、便垢等。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作为举例来进行叙述：GK-1：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg LysLeu Leu Lys
GK-2：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg ArgLeu Leu ArgGK-3：Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽的杀菌活性强于所述两种天然抗菌肽的杀菌活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、环化衍生物的抗菌肽功能等同物也进行了制备与生物活性测定，测定结果显示这些多肽的杀菌活性也基本上强于上述的天然抗菌肽的杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了合成抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明合成抗菌肽的溶血毒性极小。
消毒湿巾通过体外杀菌试验，证明它对一些主要的致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
消毒湿巾对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。结果表明，消毒湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
实施例1抗菌肽的制备及分离纯化按上述序列制备GK-1，GK-2和GK-3，同时制备cecropin A1和buforin II作为对照。
cecropin A1的序列(参见Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990，B 95(3)，551-554)：Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp GlyLeu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leubuforin II的序列(参见Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218(1)，408-413)Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg LeuLeu Arg Lys本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下：1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GK-2为例)以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK-2多肽序列为N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu LeuArg Arg Leu Leu Arg-C制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切：取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定如图1所示，制备的抗菌肽GK-2经过质谱分析，GK-2在质谱图中显示的分子量计算如下：(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934计算出GK-2的分子量为2934。由多肽序列计算出的理论值为2932.74。证明制备的多肽即为设计的GK-2抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GK-l和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用类似于GK-2抗菌肽的制备方法制备。
实施例2抗菌肽GK-1基因在大肠杆菌中的表达首先设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自AmershamPharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK-l。
实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)，所得构建基因的长度为78bp。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GK-1蛋白序列：Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu ArgLys Leu Leu Lys编码GK-1的核苷酸序列：GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAAACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG实施例3抗菌肽GK-1基因在酵母细胞中的表达本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接，后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI，XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1时酵母菌株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。
采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为84bp，同时在GK-1基因前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。
GK-1核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK-1核苷酸片断。然后用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC3’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。
编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反应30个循环。
扩增片段与质粒的连接：将GK-1的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段，与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-gkl，转化大肠杆菌DH5α后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性化重组质粒pPIC9-gst-gkl经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克隆。
转化子经过甲醇诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GST-GK-1融合蛋白序列：Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu LeuGlu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn LysLys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The GlnSer Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg AlaGlu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser LysAsp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp ArgLeu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala LeuAsp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys ArgIle Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln GlyTrp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys TrpLys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu LysGST-GK-l核苷酸序列：TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAATATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGTCCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGATTTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTAAATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCTTTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGGCCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTATTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT实施例4合成抗菌肽的杀菌活性检测以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GK-1，GK-2和GK-3的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。
表1 五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例6体外溶血活性检测本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin A1和buforin II作为对照。使用的的血样取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的检测步骤是：4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS：35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％TritonX-100。检测结果见表2：表2 五种抗菌肽溶血活性检测结果
实施例7成人用消毒湿巾的制备1.配制100g用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-1的含量0.001g(0.001wt％)，聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)香精0.1g(0.1wt％)。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶抗菌肽GK-10.001g，聚梨山醇酯0.2g，甘油2g，羊毛酯0.5g，香精0.1g，置于配料桶中，按比例加水97.199g，在60℃下搅拌乳化形成乳液。
4.将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
实施例8婴儿用消毒湿巾的制备1、配制100用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-2的含量0.0005g(0.0005wt％)，聚梨山醇酯40含量0.15g(0.15wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，芦荟汁0.5(0.5wt％)，余量为水。
2、余下步骤参照实施例1完成。
实施例9消毒湿巾体外杀菌试验1、试验样品的制备：(1)杀菌湿巾样品：按实施例1的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
(2)对照湿巾：聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌CMCC26003，枯草杆菌DB430，大肠杆菌ATCC8099，肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，绿脓杆菌CMCC10104，白色念珠菌ATCC10231。(以上菌株来自于中国生物制品检定所)。
3、试验步骤：(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在107～108cfu/ml。
(2)将样品湿巾和对照湿巾制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到湿巾上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将湿巾投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡混匀。
(5)对照湿巾投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果表3：杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果试验菌株 杀菌湿巾 对照湿巾金黄色葡萄球菌 99.92％ 0CMCC26003，，，枯草杆菌DB430 99.98％ 0大肠杆菌ATCC8099 99.92％ 0绿脓杆菌CMCC10104 99.97％ 0白色念珠菌ATCC10231 99.56％ 0肺炎克雷伯氏菌 99.46％ 0CMCC46117实施例10动物体内急性毒性试验1、样品的制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验动物：采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例11消毒湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验1、样品制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量为水。
2、试验动物：SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组，杀菌湿巾组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌湿巾置动物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织，观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果：
表3：杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验刺激反应评分组别 动物数(只)红斑 水肿 总分消毒湿巾组 6 0 0 0赋形剂组 6 0 0 0空白对照组 6 0 0 0杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用<130>SPI028296<160>54<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>1Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>2Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>3<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>3Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa 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Xaa20<210>27<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>27Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>28<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>28Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>29<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>29Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>30Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>31<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>31Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>32<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>32Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>33<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>33Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>34Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>35<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>35Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>36<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>36Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>37Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>38<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>38Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>39<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>39Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>40<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>40Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>41<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<22 3>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>41Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>42<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>42Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>43Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>44<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>44Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>45Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>46<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>46Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa XaaXaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>47Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>48<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>48Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>49Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>50<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>50Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>51<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>51Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>52<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>52Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>53Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>54<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>54Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20
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