一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用
阅读：69发布：2023-02-13
专利汇可以提供一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用。本发明的消毒制剂，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt%， 去污 剂0.01～2wt%，润肤剂0.1～15wt%。本发明的消毒湿巾通过体外杀菌试验，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99%。消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明无毒性。消毒湿巾对SD大鼠 阴道 黏膜刺激试验结果表明，无刺激性。本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸， 皮肤 黏膜的清洁和伤口创面的消毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。特别适宜用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、尿渍、便垢等。，下面是一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种消毒制剂，其特征在于包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂 0.01～2wt％，润肤剂0.1～15wt％，水余量；
抗菌肽GK具有序列表中所列氨基酸序列中的抗菌肽GK-1、抗菌肽GK-2 或抗菌肽GK-3。
2.根据权利要求1所述的消毒制剂，其特征在于所述及的去污剂是非离子表 面活性剂或两性离子表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的消毒制剂，其特征在于所述及的非离子表面活性剂 是20≥亲水亲油平衡值≥6的非离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的消毒制剂，其特征在于非离子表面活性剂为聚山梨 醇酯系列。
5.根据权利要求2所述的消毒制剂，其特征在于所述及的两性离子表面活性 剂是甜菜碱。
6.根据权利要求1所述的消毒制剂，其特征在于所述及的润肤剂是甘油、羊 毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄榄油、十四酸异丙酯、油脂 蜡中的一种或一种以上。
7.一种消毒湿巾，其特征在于由载体和负载于其上的权利要求1～6任一所述 的消毒制剂组成。
8.根据权利要求7所述的消毒湿巾，其特征在于所述载体包括无纺材料或棉 纱布。
9.根据权利要求7所述的消毒湿巾的制备方法，其特征在于包括根据下步骤：
1)按比例称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水进行乳化，获得 乳液；
2)将配制好的溶液喷涂于载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本 发明的消毒湿巾。
10.根据权利要求7或8所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于手，脸和 其它部位的皮肤及黏膜的清洁和消毒。
11.根据权利要求10所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于伤口创面的消 毒。
12.根据权利要求10所述的的消毒湿巾的应用，其特征在于用于婴儿体表的清 洁和消毒。
技术领域
本发明涉及一种消毒制剂和消毒材料，尤其涉及一种含有抗菌肽的消毒制剂和 消毒湿巾。
背景技术
目前国内市场上销售的湿巾、消毒湿巾，其中所含的消毒成分都是化学成分， 如漂粉精、新洁尔灭、碘伏、过氧乙酸或乙二醛等，虽然具有一定的杀菌活性，但 对皮肤有刺激性甚至会有毒性，特别不适于破损皮肤、婴儿娇嫩的的皮肤。如果为 了减少刺激而减少化学消毒成分的含量，又会是湿巾的消毒效果减弱，不能有效的 抑制细菌的生长。同时化学成分的残留又会对环境造成污染。目前迫切需要一种既 能有效的清洁消毒又不会产生刺激和毒副作用的湿巾。
中国专利申请文件93103890.1公开了一种婴儿卫生湿巾，采用一种外用消毒剂 醋酸双氯苯双胍己烷代替常用的含有活性氯及过氧化物的消毒剂作为杀菌活性成 分，该成分杀菌活性强，有效剂量低，减少了对婴儿肌肤的刺激性，但还属于化学 成分，无法彻底克服上述缺陷。
中国专利申请文件93103890.1公开了一种婴儿卫生湿巾，采用一种外用消毒剂 醋酸双氯苯双胍己烷代替常用的含有活性氯及过氧化物的消毒剂作为杀菌活性成 分，该成分杀菌活性强，有效剂量低，减少了对婴儿肌肤的刺激性，但还属于化学 成分，无法彻底克服上述缺陷。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种含有抗菌肽的消毒制剂，以克服现 有技术存在的上述缺陷；
本发明需要解决的技术问题之二是提供一种含有抗菌肽的消毒湿巾。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种消毒湿巾的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题公开所述消毒湿巾的应用。
本发明的发明构思是这样的：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60 个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速 发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止， 在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽， 这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻 击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽 能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。由于抗菌肽是一种生物制 品，在用量非常小的时候，也能产生很强的杀菌活性，对人体的皮肤黏膜刺激和毒 副作用，对环境也不会造成任何影响，故而是制备消毒产品的非常好的成分。
本发明的技术方案是这样的：
一种消毒制剂，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂0.01～2wt％，润肤剂 0.1～15wt％，水余量。
所述及的抗菌肽GK是具有如下序列的一组人工合成抗菌肽：
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′) (A1″-A2″-A3″-A4″)序列为抗菌肽序列的核心结构。其中A1、A1′、A1″为Lys或 Arg中的一种，A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A3、 A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A4、A4、A4″为Lys或Arg 中的一种。(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸，11个氨基酸中第1，3， 6，7位氨基酸为赖氨酸或精氨酸中的一种，11个氨基酸中第2位氨基酸为色氨酸 或苯丙氨酸中的一种，11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为亮氨酸、 异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸中的一种。
抗菌肽GK还包括以上所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D- 型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
抗菌肽GK的制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载 体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种， 宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真 核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可 通过质谱鉴定。
所述及的去污剂包括非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选的为20≥ HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60 或聚山梨醇酯80等以及甜菜碱等，其主要作用是去除污垢，使制剂中的活性成分 充分作用于皮肤表面，有利于防止细菌的生长。
所述及的润肤剂是选自甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄 榄油、十四酸异丙酯、油脂蜡中的一种或一种以上。
可将上述的消毒制剂负载于载体上，制成一种消毒湿巾，载体包括无纺材料或 棉纱布。
所述及的杀菌湿巾的制备方法包括如下步骤：
1、按上述比例称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水，在30C～65℃的条件下， 采用常规的方法进行乳化，获得乳液；
2、将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出， 即获得本发明的消毒湿巾。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸，皮肤黏膜的清洁和伤口创面的消 毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、 尿渍、便垢等。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用 系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备 的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作为举例来进行叙述：
GK-1：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu Lys
GK-2：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg
GK-3：
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters； 437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1为对照，进行 杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽的杀菌活性强于所述两种天然抗菌肽的 杀菌活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、环化衍生物的抗菌肽功能等同物也进行了制备与生 物活性测定，测定结果显示这些多肽的杀菌活性也基本上强于上述的天然抗菌肽的 杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌 肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红 细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白 发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了合成抗菌 肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明合成抗 菌肽的溶血毒性极小。
消毒湿巾通过体外杀菌试验，证明它对一些主要的致病菌：大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常 反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
消毒湿巾对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11 中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强 度的评定。结果表明，消毒湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属 无刺激性。
附图说明
图1为抗菌肽GK-2质谱分析结果。
本发明需要解决的技术问题之二是提供一种含有抗菌肽的消毒湿巾。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种消毒湿巾的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题公开所述消毒湿巾的应用。
本发明的发明构思是这样的：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60 个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速 发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止， 在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽， 这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻 击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽 能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。由于抗菌肽是一种生物制 品，在用量非常小的时候，也能产生很强的杀菌活性，对人体的皮肤黏膜刺激和毒 副作用，对环境也不会造成任何影响，故而是制备消毒产品的非常好的成分。
本发明的技术方案是这样的：
一种消毒制剂，包括抗菌肽GK 0.00001～0.01wt％，去污剂0.01～2wt％，润肤剂 0.1～15wt％，水余量。
所述及的抗菌肽GK是具有如下序列的一组人工合成抗菌肽：
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′) (A1″-A2″-A3″-A4″)序列为抗菌肽序列的核心结构。其中A1、A1′、A1″为Lys或 Arg中的一种，A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A3、 A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A4、A4、A4″为Lys或Arg 中的一种。(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸，11个氨基酸中第1，3， 6，7位氨基酸为赖氨酸或精氨酸中的一种，11个氨基酸中第2位氨基酸为色氨酸 或苯丙氨酸中的一种，11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为亮氨酸、 异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸中的一种。
抗菌肽GK还包括以上所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D- 型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
抗菌肽GK的制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载 体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种， 宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真 核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可 通过质谱鉴定。
所述及的去污剂包括非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选的为20≥ HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60 或聚山梨醇酯80等以及甜菜碱等，其主要作用是去除污垢，使制剂中的活性成分 充分作用于皮肤表面，有利于防止细菌的生长。
所述及的润肤剂是选自甘油、羊毛酯、二甲基硅油、凡士林、乳酸月桂酯、橄 榄油、十四酸异丙酯、油脂蜡中的一种或一种以上。
可将上述的消毒制剂负载于载体上，制成一种消毒湿巾，载体包括无纺材料或 棉纱布。
所述及的杀菌湿巾的制备方法包括如下步骤：
1、按上述比例称取抗菌肽GK、润肤剂，去污剂与水，在30C～65℃的条件下， 采用常规的方法进行乳化，获得乳液；
2、将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出， 即获得本发明的消毒湿巾。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于成人手，脸，皮肤黏膜的清洁和伤口创面的消 毒，保持皮肤滋润，又能防止细菌的生长。
本发明的制剂和消毒湿巾可用于婴儿体表的清洁和消毒，包括擦拭奶渍、汗渍、 尿渍、便垢等。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用 系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备 的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作为举例来进行叙述：
GK-1：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu Lys
GK-2：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg
GK-3：
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters； 437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1为对照，进行 杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽的杀菌活性强于所述两种天然抗菌肽的 杀菌活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、环化衍生物的抗菌肽功能等同物也进行了制备与生 物活性测定，测定结果显示这些多肽的杀菌活性也基本上强于上述的天然抗菌肽的 杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌 肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红 细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白 发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了合成抗菌 肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明合成抗 菌肽的溶血毒性极小。
消毒湿巾通过体外杀菌试验，证明它对一些主要的致病菌：大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、绿脓杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
消毒湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常 反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
消毒湿巾对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11 中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强 度的评定。结果表明，消毒湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属 无刺激性。
附图说明
图1为抗菌肽GK-2质谱分析结果。
具体实施方式
实施例1
抗菌肽的制备及分离纯化
按上述序列制备GK-1，GK-2和GK-3，同时制备cecropin A1和buforin II作为对 照。
cecropin A1的序列(参见Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990， B 95(3)，551-554)：
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp Gly
Leu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leu
buforin II的序列(参见Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218 (1)，408-413)
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
Leu Arg Lys
本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer 多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通 过质谱鉴定。具体试验步骤如下：
1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GK-2为例)
以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK-2多肽序列为
N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
Arg Arg Leu Leu Arg -C
制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一 个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲 酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解 于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶 液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤 直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切：
取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基 硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转 /分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化
称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗 脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定
如图1所示，制备的抗菌肽GK-2经过质谱分析，GK-2在质谱图中显示的分子量 计算如下：(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2
(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3
(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934
计算出GK-2的分子量为2934。由多肽序列计算出的理论值为2932.74。证明制备的多 肽即为设计的GK-2抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GK-1和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用类似于GK-2 抗菌肽的制备方法制备。
实施例2
抗菌肽GK-1基因在大肠杆菌中的表达
首先设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GK-1融合 蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK-1。
实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制 性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品， 寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA 公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分 子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109 培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。 在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)， 所得构建基因的长度为78bp。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计 一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30 秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶 补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明) 与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通 过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用 GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GK-1蛋白序列：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
Lys Leu Leu Lys
编码GK-1的核苷酸序列：
GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAA
ACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG
实施例3
抗菌肽GK-1基因在酵母细胞中的表达
本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制 性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品， 寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA 公司。
设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接， 后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌 DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI， XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株 KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分 子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株 KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1时酵母菌 株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。
采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。 在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子 (TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为84bp，同时在GK-1基因 前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。
GK-1核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK-1核苷酸片断。然后用 PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC 3’。 PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。
编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物
5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’
5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’
用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒； 72℃，60秒；反应30个循环。
扩增片段与质粒的连接：将GK-1的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和 EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST 的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI 酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴 定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段， 与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-gk1，转化大肠杆菌DH5α 后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.， Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性 化重组质粒pPIC9-gst-gk1经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。 将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克 隆。
转化子经过甲醇诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝 血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GST-GK-1融合蛋白序列：
Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu
Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys
Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The Gln
Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala
Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys
Asp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg
Leu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu
Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg
Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly
Trp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Trp
Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu Lys
GST-GK-1核苷酸序列：
TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAA
TATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCT
TATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGT
CCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGAT
TTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTA
AATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCT
TTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGG
CCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTA
TTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT
实施例4
合成抗菌肽的杀菌活性检测
以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽 cecropin A1和buforin II作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GK-1，GK-2 和GK-3的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀 释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一 定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值 (In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大 于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌 生长的最低的浓度)。
表1 五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较 菌株名称 几种抗菌肽的最小抑菌浓度(ug/ml) cecropin A1 buforin II GK-1 GK-2 GK-3 革 兰 氏 阳 性 菌 金黄色葡萄球菌CMCC26003 枯草杆菌DB430 短小芽孢杆菌CMCC63202 溶壁微球菌S1.634 藤黄微球菌CMCC28001 16 12 50 50 30 4 6 6 8 8 0.4 4 0.5 1.0 2 0.2 4 1 0.8 4 0.5 5 0.8 1.2 3 革 兰 氏 阴 性 菌 大肠杆菌ATCC8099 肺炎克雷伯氏菌CMCC46117 乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094 绿脓杆菌CMCC10104 20 16 12 18 16 20 14 20 1 2 4 10 0.5 0.8 1 12 1.6 2 6 1.8 真 菌 白色念珠菌ATCC10231 啤酒酵母ATCC9736 50 50 30 20 8 14 10 12 11 12
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例6
体外溶血活性检测
本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法 合成的抗菌肽cecropin A1和buforinII作为对照。使用的的血样取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的检测步骤是：
4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS： 35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中， 每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清 于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％ TritonX-100。检测结果见表2：
表2 五种抗菌肽溶血活性检测结果 抗菌肽浓度 (ug/ml) 溶血率(％) cecropin A1 buforinII GK-1 GK-2 GK-3 12.5 25 50 100 200 0 0 0 1.2 3 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0.5 0.8 0 0 0 0.2 1.0 0 0 0 0.6 1.1 500 10 1.7 1.5 2 1.9
实施例7
成人用消毒湿巾的制备
1.配制100g用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-1的含量0.001g(0.001wt％)， 聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％) 香精0.1g(0.1wt％)。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶抗菌肽GK-1 0.001g，聚梨山醇酯0.2g，甘油2g， 羊毛酯0.5g，香精0.1g，置于配料桶中，按比例加水97.199g，在60℃下搅拌 乳化形成乳液。
4.将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待 浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
实施例8
婴儿用消毒湿巾的制备
1、配制100用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-2的含量0.0005g(0.0005wt％)， 聚梨山醇酯40含量0.15g(0.15wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，芦荟汁0.5(0.5wt％)， 余量为水。
2、余下步骤参照实施例1完成。
实施例9
消毒湿巾体外杀菌试验
1、试验样品的制备：
(1)杀菌湿巾样品：按实施例1的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01 wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)， 余量为水。
(2)对照湿巾：聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g (0.5wt％)，余量为水。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌CMCC26003，枯草杆菌DB430，大肠杆菌ATCC8099， 肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，绿脓杆菌CMCC10104，白色念珠菌ATCC10231。(以 上菌株来自于中国生物制品检定所)。
3、试验步骤：
(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在 107～108cfu/ml。
(2)将样品湿巾和对照湿巾制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到湿巾上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将湿巾投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡 混匀。
(5)对照湿巾投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果
表3：杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果 试验菌株 杀菌湿巾 对照湿巾 金黄色葡萄球菌 CMCC26003，，， 枯草杆菌DB430 99.92％ 99.98％ 0 0 大肠杆菌ATCC8099 绿脓杆菌CMCC10104 白色念珠菌ATCC10231 99.92％ 99.97％ 99.56％ 0 0 0 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46117 99.46％ 0
实施例10
动物体内急性毒性试验
1、样品的制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)， 聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量 为水。
2、试验动物：采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实 验动物部提供。
3、试验方法：每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。
实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小 白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例11
消毒湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验
1、样品制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)， 聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量 为水。
2、试验动物：SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组， 杀菌湿巾组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌湿巾置动 物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同 样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织， 观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应 强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果：
表3：杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验 组别 动物数(只) 刺激反应评分 红斑 水肿 总分 消毒湿巾组 赋形剂组 6 6 0 0 0 0 0 0 空白对照组 6 0 0 0
杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
序列表
<110>上海高科联合生物技术研发有限公司
<120>一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用
<130>SPI028296
<160>54
<170>PatentIn Version2.1
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa
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5 10 15
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5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213>人工序列
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Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
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Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213>人工序列
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<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>32
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<213>人工序列
<220>
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<400>33
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa
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<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>34
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>35
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>35
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>36
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>36
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>37
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
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<222>(14，18)
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<222>(15，19)
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<400>37
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(15，19，23)
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5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>39
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
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<222>(15，19，23)
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5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>41
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>42
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
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<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>42
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>43
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>44
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>44
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>45
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>46
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>46
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>47
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>47
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>48
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，2l)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Va l或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>48
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>49
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>50
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>50
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>51
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>51
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>52
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>52
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>53
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>53
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>54
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>54
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
抗菌肽的制备及分离纯化
按上述序列制备GK-1，GK-2和GK-3，同时制备cecropin A1和buforin II作为对 照。
cecropin A1的序列(参见Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990， B 95(3)，551-554)：
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp Gly
Leu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leu
buforin II的序列(参见Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218 (1)，408-413)
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
Leu Arg Lys
本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer 多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通 过质谱鉴定。具体试验步骤如下：
1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GK-2为例)
以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK-2多肽序列为
N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
Arg Arg Leu Leu Arg -C
制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一 个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲 酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解 于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶 液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤 直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切：
取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基 硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转 /分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化
称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗 脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定
如图1所示，制备的抗菌肽GK-2经过质谱分析，GK-2在质谱图中显示的分子量 计算如下：(1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2
(2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3
(3)1468×2＝2936，2936-2＝2934
计算出GK-2的分子量为2934。由多肽序列计算出的理论值为2932.74。证明制备的多 肽即为设计的GK-2抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GK-1和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用类似于GK-2 抗菌肽的制备方法制备。
实施例2
抗菌肽GK-1基因在大肠杆菌中的表达
首先设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GK-1融合 蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK-1。
实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制 性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品， 寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA 公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分 子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109 培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。 在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)， 所得构建基因的长度为78bp。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计 一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30 秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶 补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明) 与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通 过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用 GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GK-1蛋白序列：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
Lys Leu Leu Lys
编码GK-1的核苷酸序列：
GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAA
ACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG
实施例3
抗菌肽GK-1基因在酵母细胞中的表达
本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制 性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品， 寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA 公司。
设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接， 后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌 DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI， XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株 KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分 子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株 KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1时酵母菌 株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。
采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。 在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子 (TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为84bp，同时在GK-1基因 前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。
GK-1核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK-1核苷酸片断。然后用 PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC 3’。 PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。
编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物
5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’
5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’
用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒； 72℃，60秒；反应30个循环。
扩增片段与质粒的连接：将GK-1的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和 EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST 的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI 酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴 定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段， 与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-gk1，转化大肠杆菌DH5α 后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.， Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性 化重组质粒pPIC9-gst-gk1经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。 将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克 隆。
转化子经过甲醇诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝 血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GST-GK-1融合蛋白序列：
Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu
Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys
Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The Gln
Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala
Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys
Asp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg
Leu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu
Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg
Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly
Trp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Trp
Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu Lys
GST-GK-1核苷酸序列：
TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAA
TATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCT
TATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGT
CCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGAT
TTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTA
AATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCT
TTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGG
CCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTA
TTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT
实施例4
合成抗菌肽的杀菌活性检测
以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽 cecropin A1和buforin II作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GK-1，GK-2 和GK-3的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀 释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一 定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值 (In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大 于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌 生长的最低的浓度)。
表1 五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较 菌株名称 几种抗菌肽的最小抑菌浓度(ug/ml) cecropin A1 buforin II GK-1 GK-2 GK-3 革 兰 氏 阳 性 菌 金黄色葡萄球菌CMCC26003 枯草杆菌DB430 短小芽孢杆菌CMCC63202 溶壁微球菌S1.634 藤黄微球菌CMCC28001 16 12 50 50 30 4 6 6 8 8 0.4 4 0.5 1.0 2 0.2 4 1 0.8 4 0.5 5 0.8 1.2 3 革 兰 氏 阴 性 菌 大肠杆菌ATCC8099 肺炎克雷伯氏菌CMCC46117 乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094 绿脓杆菌CMCC10104 20 16 12 18 16 20 14 20 1 2 4 10 0.5 0.8 1 12 1.6 2 6 1.8 真 菌 白色念珠菌ATCC10231 啤酒酵母ATCC9736 50 50 30 20 8 14 10 12 11 12
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例6
体外溶血活性检测
本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法 合成的抗菌肽cecropin A1和buforinII作为对照。使用的的血样取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的检测步骤是：
4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS： 35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中， 每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清 于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％ TritonX-100。检测结果见表2：
表2 五种抗菌肽溶血活性检测结果 抗菌肽浓度 (ug/ml) 溶血率(％) cecropin A1 buforinII GK-1 GK-2 GK-3 12.5 25 50 100 200 0 0 0 1.2 3 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0.5 0.8 0 0 0 0.2 1.0 0 0 0 0.6 1.1 500 10 1.7 1.5 2 1.9
实施例7
成人用消毒湿巾的制备
1.配制100g用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-1的含量0.001g(0.001wt％)， 聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％) 香精0.1g(0.1wt％)。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶抗菌肽GK-1 0.001g，聚梨山醇酯0.2g，甘油2g， 羊毛酯0.5g，香精0.1g，置于配料桶中，按比例加水97.199g，在60℃下搅拌 乳化形成乳液。
4.将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待 浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
实施例8
婴儿用消毒湿巾的制备
1、配制100用于消毒湿巾的制剂，其中抗菌肽GK-2的含量0.0005g(0.0005wt％)， 聚梨山醇酯40含量0.15g(0.15wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，芦荟汁0.5(0.5wt％)， 余量为水。
2、余下步骤参照实施例1完成。
实施例9
消毒湿巾体外杀菌试验
1、试验样品的制备：
(1)杀菌湿巾样品：按实施例1的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01 wt％)，聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)， 余量为水。
(2)对照湿巾：聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g (0.5wt％)，余量为水。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌CMCC26003，枯草杆菌DB430，大肠杆菌ATCC8099， 肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，绿脓杆菌CMCC10104，白色念珠菌ATCC10231。(以 上菌株来自于中国生物制品检定所)。
3、试验步骤：
(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在 107～108cfu/ml。
(2)将样品湿巾和对照湿巾制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到湿巾上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将湿巾投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡 混匀。
(5)对照湿巾投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果
表3：杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果 试验菌株 杀菌湿巾 对照湿巾 金黄色葡萄球菌 CMCC26003，，， 枯草杆菌DB430 99.92％ 99.98％ 0 0 大肠杆菌ATCC8099 绿脓杆菌CMCC10104 白色念珠菌ATCC10231 99.92％ 99.97％ 99.56％ 0 0 0 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46117 99.46％ 0
实施例10
动物体内急性毒性试验
1、样品的制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)， 聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量 为水。
2、试验动物：采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实 验动物部提供。
3、试验方法：每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。
实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小 白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例11
消毒湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验
1、样品制备：按实施例7的方法制备，抗菌肽GK-1的含量0.01g(0.01wt％)， 聚梨山醇酯20含量1g(1wt％)，甘油2g(2wt％)，羊毛酯0.5g(0.5wt％)，余量 为水。
2、试验动物：SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组， 杀菌湿巾组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌湿巾置动 物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同 样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织， 观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应 强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果：
表3：杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验 组别 动物数(只) 刺激反应评分 红斑 水肿 总分 消毒湿巾组 赋形剂组 6 6 0 0 0 0 0 0 空白对照组 6 0 0 0
杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
序列表
<110>上海高科联合生物技术研发有限公司
<120>一种消毒制剂和消毒湿巾及其制备方法和应用
<130>SPI028296
<160>54
<170>PatentIn Version2.1
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>23
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>24
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
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<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>24
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>25
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
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<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>25
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>26
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
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<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>26
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(15，19)
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Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<220>
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<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>28
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<223>Xaa＝Lys或Arg
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Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>31
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>31
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>32
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(15，19，23)
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<400>32
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>33
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>33
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>34
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(15，19，23)
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<400>34
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
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<222>(15，19)
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<400>35
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211>23
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<213>人工序列
<220>
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<222>(15，19，23)
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<400>36
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>37
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>37
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>38
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
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<222>(13，17，21)
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<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>38
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>39
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<222>(12，16)
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<222>(13，17)
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<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>39
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>40
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
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<222>(14，18，22)
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<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>40
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>41
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>42
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>42
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>43
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>44
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>44
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>45
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>46
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>46
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>47
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>47
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>48
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，2l)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Va l或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>48
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>49
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>50
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>50
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>51
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>51
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>52
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>52
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210>53
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>53
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210>54
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(12，16，20)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<222>(13，17，21)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(14，18，22)
<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe
<222>(15，19，23)
<223>Xaa＝Lys或Arg
<400>54
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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